SE433265B - Forfarande for framstellning av ett system av amfotera berare for isoelektriskt fokusering - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 ??14211~5 2 buffertkapaciteten och ledningsförmågan i den bildade pH- gradienten, erfordrar emellertid, att bäraramfolytens olika komponenter föreligger i ungefär lika stor koncentration. Pâ grund därav genomför man efter reaktionen elektrolys i en om- fattande multicellanläggning för separation, varvid efter av- slutad elektrolys motsvarande andelar uttas ur de olika celler- na och av dessa en lämplig bäraramfolytblandning framställs.

Eftersom karboxylsyran vid rumstemperatur praktiskt taget inte reagerar med polyetylenpolyaminen, måste man arbeta vid högre temperaturer, vilket emellertid leder till bireak- tioner och i sista hand till en icke önskad brunfärgning av slutprodukten. För övrigt är aminens reaktion med karboxyl- syran mycket långsam även vid högre temperaturer, så att det kända förfarandet är förknippat med betydande tidsutdräkt.

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för fram- ställning av ett system av amfotera bärare på basis av en orga- nisk förening med minst 2 amino- och/eller iminogrupper och en karboxylsyraförening, som har en kol-kol-dubbelbindning. För- farandet kännetecknas av att man som karboxylsyraförening an- vänder en karboxylsyraester och att den erhållna aminokarboxyl- syraesterblandningen hydrolyseras på känt sätt och eventuellt isoleras.

I stället för en enda amin kan även en aminblandning och i stället för en enda karboxylsyraester även en blandning av olika karboxylsyraestrar, som innehåller en kol-kol-dubbel- bindning, användas.

Förfarandet enligt uppfinningen har framför det känd” förfarandet den fördelen, att karboxylsyraestrarna överraskaáâš nog reagerar väsentligt snabbare med aminen än de motsvarandÉ“ karboxylsyrorna och att förfarandet därför medför en betydande tidsvinst. Dessutom kan förfarandet i princip genomföras vid rumstemperatur eller något höjd temperatur, och det uppträder därvid möjligen en svag gulfärgning av slutprodukten, vilken kan bortskaffas på enkelt sätt genom behandling av syntesproduk- ten i väteatmosfär med användning av en lämplig katalysator, t.ex. en ädelmetallkatalysator.

Förfarandet kan genomföras på vanligt sätt genom att man sätter karboxylsyraestern till hela mängden amin. 10 15 20 25 30 35 7714211-5 3 Företrädesvis genomförs förfarandet emellertid så, att mantill stigande konoentrationer av den ena komponenten sätter fallande koncentrationer av den andra komponenten eller till konstant koncentration av den ena komponenten sätter stigande eller fallande koncentration av den andra komponenten, på sådant sätt, att de vid den kemiska reaktionen bildade olika aminokarboxyl- syraestrarna efter hydrolys till motsvarande aminokarboxylsyror vid stationär elektrolys alstrar en praktiskt taget linjär pH- gradient. Detta sätt att genomföra förfarandet har den fördelen, att de enskilda föreningarna i det amfotera bärarsystemet bil- das direkt i de rätta koncentrationerna och därmed en komplice- rad separation i de enskilda beståndsdelarna undvikes.

Som organiska föreningar kommer sådana föreningar i fråga, vilka har minst två amino- och/eller iminogrupper. Före- trädesvis bör dessa föreningar innehålla minst 4 kväveatomer, till vilka karboxylsyraestrarna kan adderas, enär amfolytbland- ningen därvid omfattar ett större antal olika föreningar och därmed-antalet isoelektriska punkter höjs i motsvarande grad.

De för föreliggande uppfinning lämpliga aminerna bör innehålla enheter av typen -NH-R-NH- varvid kedjan kan förlängas åt vänster och höger med liknande grupper (-R~NH-), varvid föreningen skall ha en molekylvikt av 300 - 500. De mellan -NH-grupperna anordnade grupperna -R- är -C3H6- eller företrädesvis -CZH4-. Företrädesvis är dessa organiska kväveföreningar linjära kedjemolekyler, men de kan t.ex. även vara grenade, alicykliska eller heterocykliska eller inne- hålla aromatiska grupper. Dessutom kan enstaka kväveatomer vara försedda med substituenter, t.ex. lågalkylgrupper med högst 6 kolatomer, såsom metyl- eller etylgrupper. Lämpliga aminer är t.ex. etylendiamin, dietylentriamin, trietylentetraamin och tetraetylenpentamin. Speciellt föredras pentaetylenhexamin.

De enligt uppfinningen använda karboxylsyraestrarna innehåller en aktiverad kol-kol-dubbelbindning. Företrädesvis använder man sådana karboxylsyraestrar, vilkas dubbelbindningar befinner sig i e-B-ställning. Dubbelbindningen kan emellertid även befinna sig på något längre bort beläget ställe ooh vara aktiverad på annat sätt. Karboxylsyraestrarna bör ha totalt *iïilæ2i1 -5 10 15 20 25 30 35 4 högst 10 - 12 kolatomer, varvid estergruppen bör vara en alkyl- grupp med högst 6, företrädesvis högst 4 kolatomer.

Lämpliga är exempelvis akrylsyraestrar, metakrylsyra- estrar och krotonsyraestrar. Därutöver är även omättade di- karboxylsyraestrar lämpliga, om det är önskvärt med en för- stärkning av pH-gradientens sura sida. Maleinsyraestrar, metylenmalonsyraestrar, etylenmalonsyraestrar, itakonsyraestrar och liknande kommer i fråga. Häri ligger en annan viktig fördel med föreliggande förfarande framför det kända förfarandet, enär de fria omättade dikarboxylsyrorna är mera reaktionströga än monokarboxylsyror och deras addition till aminen tar en mot- svarande längre reaktionstid i anspråk, medan de omättade di- karboxylsyraestrarna reagerar betydligt snabbare. Dessutom möj- liggörs genom föreliggande förfarande användning av metylen- malonsyraester, medan man enligt teknikens ståndpunkt inte kan använda den fria syran, eftersom denna är obeständig.

Estergruppen är företrädesvis en metyl-, etyl-,propyl-, isopropyl-, n-butyl-, sek-butyl- eller t-butylgrupp. Speciellt föredras metylgruppen.

Reaktionen sker företrädesvis i alkohollösning. Före- trädesvis använder man metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, sek-butyl- eller t-butylalkohol, och speciellt föredras metylalkohol. Lämpliga är även andra vattenfria organiska lös- ningsmedel, som är inerta mot de använda utgångsföreningarna, t.ex. dioxan och bensen.

Vid det föredragna genomförandet av föreliggande för- farande, d.v.s. vid målinriktad syntes av en bäraramfolytbland- ning, erfordras uppgifter om den portionsvis skeende blandning- en av utgångskomponenterna. Dessa blandningsförhållanden kan beräknas med god noggrannhet med hjälp av i förväg bestämda fysikaliskt-kemiskaparametrar. Framtagningen av dessa paramet- rar och blandningsförhållandena, som skall beräknas därur, be- lyses av det följande exemplet. Om blandningsförhållandena, som i sista hand leder till den rätta koncentrationen av de oli- ka komponenterna i bäraramfolytblandningen, är kända, blandas utgångsföreningarna företrädesvis i alkohollösning antingen för hand i flera fraktioner, t.ex. 60 fraktioner, eller kontinuer- ligt med hjälp av en gradientformare. Sådana gradientformare 10 15 20 25 30 35 771h211~5 5 kan erhållas i handeln och används i allmänhet för framställ- ning av gradienter för eluering eller centrifugering.

Med användning av en dylik gradientformare (U 11 300 Ultrograd gradient mixer från LKB Produkter AB, Stockholm) pum- pas blandningen, vars sammansättning kontinuerligt ändras, med en slangpump genom en ca 10 - 20 m lång teflonslang, som befin- ner sig i ett termostaterat vattenbad. Temperaturen är inte kri- tisk och ligger i regel mellan 20 och SOOC, företrädesvis mellan 30 och 40oC. På detta sätt förblir de kontinuerligt framställda blandningarna ca 1,5 - 2 timmar vid en temperatur, som säker- ställer 80- till 90-procentig reaktion. Efter genomgången av teflonslangen kan blandningarna uppfångas i flera fraktioner och bringas till fullständig reaktion genom att de får stå vid 30 - 40oC. Därefter sammanförs fraktionerna och avlägsnas lös- ningsmedlet, företrädesvis genom avdrivning i vakuum. Små över- skottsmängder av estern avdrivs därvid samtidigt.

Den erållna återstoden löses därefter i tillräckligt mycket vatten och kan sedan på olika sätt underkastas hydroly- tisk spjälkning av estergruppen. Detta kan exempelvis ske i en sterilisator vid 0,2 - 0,3 MPa och 120 - 130°c, varvid reak- tionen är avslutad efter ca 1 - 2 timmar. En annan möjlighet är, att man skakar lösningen flera timmar vid 40 - 50OC. Man har konstaterat, att det senare förfarandet är att föredra, när man eftersträvar en slutprodukt med ringare ultraviolettabsorption.

Såsom anges i det föregående, leder förfarandet till bäraramfolytblandningar, som alltjämt kan visa svagt gulaktig färg. Eftersom absorption av slutprodukten i synligt ljus och ultraviolett ljus kan störa vid den senare användningen, bör amfolytblandningen helst vara färglös och vara fri från absorp- tion även i ultraviolettomrâdet. Därför är det fördelaktigt att genomföra en 2 timmar lång behandling av syntesprodukten i väteatmosfär under användning av en för detta ändamål lämplig katalysator. Som katalysator kan man använda exempelvis Raney- nickel, platinaoxld, palladium, palladium på aktivt kol, litium- aluminiumhydrid eller natriumborhydrid. Denna reaktion genom- förs företrädesvis i vattenlösning, men lämpliga organiska lös- ningsmedel kan också användas. 771421145 10 15 20 25 30 35 6 Den riktade syntesen av en med förfarandet enligt upp- finningen framställd bäraramfolytblandning tar beroende på arbetsväg ca 1 - 2 dygn och ger en produkt, vilken under statio- när elektrolys ger en linjär pH-gradient, som visar jämn buffert- kapacitet och ledningsförmâga genom gradienten och minimal ljus- absorption. Vid användning av estrar och alkoholer som lösnings- medel kan man genomföra reaktionen från början till slut vid konstant starkt alkaliskt pH, d.v.s. vid konstant blandnings- mönster för alla kväveatomer i aminkomponenten.

Dessutom har förfarandet enligt uppfinningen den för- delen, att, såsom redan anges i det föregående, borttagning av överskott av karboxylsyraester kan ske mycket lätt genom av- drivning i vakuum, medan däremot borttagning av Överskotts- mängder av fri syra, t.ex. akrylsyra, är förbunden med betydan- de svårigheter.

En annan fördel ligger i att man med hjälp av den rik- tade syntesen har möjlighet att syntetisera pH-gradienter med begränsade pH-intervall på direkt väg. Det är exempelvis möj- ligt att syntetisera pH-intervall av 8 - 10 eller 4 - 7, samti- digt som det maximala spektret sträcker sig från pH 3,5 till10.

För uppnående av bättre upplösning av svårseparerbara proteiner är snäva intervall speciellt viktiga.

Det följande exemplet belyser föreliggande uppfinning utan att begränsa denna.

Exempel Som utgångskomponent använder man dels pentaetylen- hexamin (1-molar lösning i metanol), i det följande betecknad A, dels akrylsyrametylester (4-molar lösning i metanol), i det följande betecknad B.

De i det följande angivna procentuppgifterna avser volymprocent.

Vid användning av pentaetylenhexamin som utgångsamin står till förfogande 6 kväveatomer, vilka maximalt kan addera 8 karboxylsyraestermolekyler. Den enklaste amfolyten bildas därför i en aminkarboxylsyraesterblandning vid ett molförhållan- de av 1:1. Vid användning av de angivna lösningarna A och B föreligger detta förhållande 1:1 vid ett blandningsförhâllande aminlösning till esterlösning av 80:20. Därmed är Lïl 10 15 20 25 30 35 7714211-5 7 blandningsförhâllandet vid syntesens början fastlagt. Slutför- hållandet uppnås följaktligen när man uppnår ett molförhållande av 1:8. Det procentuella blandningsförhållandet är därför35:65.

Utgående från ett procentuellt blandningsförhållande av 80:20 blandades först tio olika fraktioner, varvid bland- ningsförhållandet varierades stegvis (75:25, 70:30 o.s.v.) tills man nådde slutförhållandet 35:65. De olika fraktionerna förseglades och förvarades vid ca 350C. Reaktionen var avslu- tad efter ca 10 timmar,och fraktionerna upparbetades nu var för sig. Därefter avdrevs lösningsmedlet, och återstoden lös- tes flera gånger i metanol, som därefter avdrevs. Slutligen löstes återstoderna i vatten och infördes i en sterilisator vid 0,2 MPa och 130°C för ca 2 timmar. Vattnet avdrevs där- efter i en rotationsindunstare, och återstoderna löstes på nytt i vatten. pH-mätningar gjordes i de olika fraktionerna och resultatet infördes i ett diagram, såsom visas i fig. 1.

Utefter ordinataxeln är de procentuella blandningsförhållande- na angivna, och de tillhörande pH-värdena är avsatta utefter abskissaxeln. Den erhållna kurvan kan överföras till ett annat diagram, vilket då direkt återger den för gradientformaren nödvändiga schablonen, varvid man emellertid måste ta hänsyn till att aminkoncentrationen mot det sura området av produkten avtar allt efter som esterkoncentrationen stiger. Detta skulle emellertid betyda, att vid kontinuerlig genomföring av för- farandet färre föreningar skulle uppstå under lika stora tid- enheter. Eftersom bäraramfolytblandningens enskilda föreningar skall vara närvarande i lika koncentration, måste denna kurva korrigeras så, att man i sista hand erhåller samma koncentra- tion för de olika komponenterna.

Vid användning av en gradientformare kommer tvâ meto- der i fråga. 1. Med ett styrorgan kan hastigheten för den peristal- tiska pumpen höjas synkront med aminkoncentrationens minskning. 2. Den ur fig. 1 erhållna kurvan, som bestämmer kon- centrationsförloppet för aminen och karboxylsyraestern, modi- fieras sâ, att synkront med avtagande aminkoncentration längre tider för framställning av blandningsförhållandena står till förfogande. 7M4211-5 10 15 20 25 30 35 8 7 I föreliggande fall valde man att gå den andra vägen.

Ur fig. 1 kan de blandningsförhållandena avläsas, som ger amfolyter med pH 10, 9, 8 etc. Ur den per pH-enhet inträffade minskningen av aminen erhålles på enkelt sätt den faktor, med vilken blandningsförloppet i det tillhörande pH-intervallet måste förlängas, för att man skall erhålla en i det närmaste jämn koncentration av de olika amfolyterna i de olika pH- intervallen. Detta betyder att, om exempelvis aminens koncent- ration skulle ha sjunkit till hälften, blandningsförloppet i motsvarighet därtill skulle förlängas till det dubbla. Under användning av de framtagna faktorerna kommer man till fig. 2, vars abskissa samtidigt har indelats i 60 lika stora fraktioner.

Till samma resultat kommernan även på en annan väg, nämligen genom att man till konstanta koncentrationer av amin- komponenten sätter stigande koncentrationer av karboxylsyra- estern. Efter upparbetning av de olika fraktionerna på det i det föregående angivna sättet och efter framtagning av de till- hörande pH-värdena för dessa olika fraktioner kan man genast konstruera en kurva, som är ekvivalent med den i fig. 2 visade kurvan, d.v.s. man erhåller direkt en kurva, som inte erford- rar ytterligare korrektur, enär på grund av de alltid konstanta mängderna av aminkomponenten i samma tidsintervall lika många olika amfolytföreningar bildas.

När man har framtagit den i fig. 2 visade kurvan, kan de olika fraktionerna i de med kurvan fastlagda blandningsför- hållandena blandas för hand, eller också kan denna kurva an- vändas direkt som schablon för gradientformaren.

I det följande beskrivs framställning av en bärar- amfolytblandning med användning av en gradientformare.

Utgångslösningarna A och B befann sig i 100 ml för- rådskärl, som var direkt förbundna med ett elektriskt styrt ventilsystem. Med hjälp av en slangpump sögs lösningarna A och B i de i fig. 2 visade blandningsförhållandena in i en bland- ningskammare och blandades grundligt. Blandningen, som ändrade sig kontinuerligt med avseende på sammansättningen, pumpades därefter med samma slangpump genom en 20 m lång och ca 1 mm vid teflonslang, som befann sig i ett på 40°C inställt termo- staterat vattenbad. När blandningen lämnade teflonslangen, 7714211-5 9 uppfångades den i 60 fraktioner på vardera 2 ml. Slangpumpens matningskapacitet var ca 0,5 ml/min. Därvid förbrukades ca 70 ml av lösningen A och ca 60 - 70 ml av lösningen B. Frak- . ._ . _ H _ _ o “ tlonerna forseglades och flex sta lö timmar vld 35 C. Darefter H .örenades de, lösningsmedlet-aväxevs och återstoden löstes LH S- flera gånger i metanol, som äter avdrevs. Efter vanlig hydrclys och hydrering återstod 35 - 40 g av en färglös eller ytterst svagt gulaktig fast återstod, som under elektroføres gav en linjär pH-gradient med pH~intervallet 3,5 - 10.

Claims (13)

”TiM-NVS 10 15 20 25 3U 35 10 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett system av amfotera bärare för isoelektrisk fokusering på basis av åtminstone en organisk förening med minst två amino- och/eller imino- grupper och åtminstone en karboxylsyraförening, som innehåller en kol-kol~dubbelbindning, k ä n n e t e c k n a t som karboxylsyraförening använder en karboxylsyraester och av att man att man på känt sätt hydrolyserar och eventuellt isolerar den erhållna aminokarboxylsyraesterblandningen. É.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k- n a t av att man till den ena reaktionskomponenten i stigande koncentration sätter den andra reaktionskomponenten i fallande koncentration eller till den andra komponenten i konstant koncentration sätter den andra komponenten i stigande eller fallande koncentration på så sätt att de vid den kemiska reak- tionen bildade olika aminokarboxylsyraestrarna efter hydrolys till motsvarande aminokarboxylsyror vid stationär elektrolys ger en praktiskt taget linjär pH-gradient.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n n e- t e c k n a t av att reaktionen genomförs i ett vattenfritt, företrädesvis alkoholiskt lösningsmedel. R.

4. Pörfarande enligt något av patentkraven 1 - 3, k ä n n e- t e c k n a t av att man som organisk förening använder etylendiamin, dietylentriamin, trietylentetraamin, tetra- etylenpentamin eller företrädesvis pentaetylenhexamin,

5. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - H, k ä n n e- t e c k n a t av att man som omättad ester använder en akryl- syraester, metakrylsyraester, metylenmalonsyraester, etylen- malonsyraester, krotonsyraester, maleinsyraester eller itakon- syraester.

6. Pörfarande enligt något av patentkraven 1 - 3, k ä n n e- t e c k n a t av att man som alkoholkomponent i ester använder metylalkohol, etylalkohol, propylalkohol, isopropylalkohol, n-butylalkohol, sek-butylalkohol eller t-butylalkohol.

7. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 6, k ä n n e- t e c k n a t av att man i stället för en enda amin använder en blandning av olika aminer. 7714211-5 11

8. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 7, k ä n n e- t e C k n a t av att man i stället för en enda karboxylsyra- ester använder en blandning av olika karboxyl°yraestrar,

9. 3. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 8, k ä n n e- t e e k n a t av att efter blandning av de båda reaktionskom- ponenterna blandningarna uppfângas portionsvis i flera frak- ioner medelst en läm lig anordning och portionsvis brineas till , 1.2 fi'

10. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 9, k ä n n e- t e e k n a t av att man som lösningsmedel använder metylalkohol, etylalkohol, propylalkohol, isopropylalkohol, n-butylalkohol, sek-butylalkohol eller t~butylalkonol.

11. ll. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 8, k ä n n e- t e c k n a t av att reaktionen av aminen och karboxylsyra- estern genomförs vid temperaturer av 20 - SOOC, företrädesvis av so - uuoc.

12. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 9, k ä n n e- t e c k n a t av att den efter den hydrolytiska spjälkningen er- hållna blandningen behandlas med katalytiskt aktiverat väte i ett lämpligt organiskt lösningsmedel eller företrädesvis i vatten.

13. Förfarande enligt patentkravet 12, k ä n n e t e c k- n a t av att man som katalysator för den katalytiska hydre- ringen använder Raney-nickel, platinaoxid, palladium, palladium pa aktivt kol, litiumaluminiumhydrid eller natriumborhydrid.