SE446540B - Forfarande for destabilisering av mikrobiellt lope och forfarande for osttillverkning varvid anvendes nemnda lope - Google Patents

Description

10 55 H0 mål. 446 54ø 2 termisk destabilisering. Praktiska försök har visat att den termiska destabiliseringen av det karbamylerade enzymet är allt- för liten för att lösa ovannämnda problem med löpets aktivitet i pastöriserad vassla. En annan lösning omtalas i den belgiska patentansökningen 6/H70H8 inlämnad den 24 december l979, vari~ det föreslås en acylering av enzymet för destabiliseringsända- En lösning, som har samband med utövandet av föreliggande uppfinning, har varit att behandla det míkrobiolla löpet med väteperoxid, antingen som sådan eller bildad in situ. Denna teknik beskrivs i den brittiska patentansökningen 2 02H 828 A, ivilken är publicerad den 16 januari 1980.

Syftet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett ekonomiskt användbart förfarande för termisk destabillsering av mikrobiellt löpe i sådan omfattning att nackdelarna härrörande från kvarvarande aktivitet av mikrobiellt löpe i pastöriserad vassla i huvudsak elimineras.

Enligt uppfinningen har det visat sig att det genom använd- ning av en speciellt utvald kategori av peroxiföreningar, som uppvisar annan kemisk karaktär än de peroxiföreningar som före- slås i den ovan omtalade brittiska patentansökningen, är möjligt att utföra den termiska destabiliseringen med en molär mängd J peroxiförening i förhållande till den totala mängden närvarande pro- teín amlär avsevärt lägre än motsvarande mängd av den i den ovan omtalade brittiska patentansökningen använda väteperoxiden.

Enligt en första aspekt av uppfinningen åstadkommes sålunda ett förfarande för att reducera den tormiska stabiliteten för mikrobiellt löpe genom kemisk modifiering därav, varvid förfaran- det innebär att man behandlar det mikrobiella löpet i vattenba- serat medium med en peroxisyra vald dr gruppen bestående av oer- ganiska peroxisyror och lägre alifatiska peroxisyror, eller sal- ter därav.

I föreliggande beskrivning och krav avser uttrycket "lägre alifatisk peroxisyra" en peroxisyra härledd från en alifatisk karboxylsyra med en rak eller grenad alkylgrupp innehållande- högst 6, ooh företrädesvis högst 4, kolatomer. 9 Som exempel på lägre alifatiska perozisyror kan nämnas: -ïperoxiättiksyra¿'peroximyrsyra, peroxipropionsyra och peroxi- smörsyra.

Som exempel på salter av oorganiska peroxisyror kan föl- IO 20 50 "I H0 5 Åf46 540 I jande nämnas: kalíumperoxisulfat och natriumperoxifosfat.

Under det att behandlingen enligt den tidigare omtalade brittiska patentansökningen utföres med hjälp av H2O2, antingen som sådan eller bildad in situ, antas det att mekanismen för reaktionen enligt föreliggande uppfinning icke involverar H2O2.

Vidare.kan man anta att det är denna skillnad som är orsak till att det enligt föreliggande uppfinning är möjligt att erhålla tillfredsställande termisk destabilisering genom användning av en molär mängd av peroxiföreningen i förhållande till den totala mängden närvarande protein som enbart är en bråkdel, dvs. av stor- leksordningen ungefär en tiondel av motsvarande molära mängd H2Ö¿ använd i den tidigare omtalade brittiska patentansökningen.

Den drastiska minskningen av den använda mängden reagens innebär åtminstone två fördelar. För det första undvikes den annars obligatoriska inaktiveringen av överskott av reagens. På grund av det faktum att det mikrobiella löpet användes i samband med varor för humankonsumtion, bör för det andra kontaminering därav med extra reagens hållas på lägsta möjliga nivå. Det har visat sig, att det enligt uppfinningen modifierade mikrobiella löpet är signifikant destabiliserat och att destabiliserings- graden är tillräcklig för att kraven avseende vasslaanvändning skall vara uppfyllda, utan att det förekommer någon starkt skad- lig effekt på lagringsstabiliteten vid löpetillverkningen. Det har överraskande befunnits, att det enligt uppfinningen är möj- ligt att erhålla en destabiliseringsnivå (vilken kommer att de- finieras nedan) av minst BOC, företrädesvis 10-1300, vilken inom det föredragna området gör att den termiska stabiliteten för det modifierade enzymet motsvarar stabiliteten för kalvlöpe, vari- genom de gynnsamma egenskaperna hos kalvlöpet kombineras med de gynnsamma egenskaperna hos mikrobiellt löpe. _ Löpeaktiviteten mätes enligt British Standard 362H: 1963 (Method for the determination of milk coagulating power of ren- net). V ' ' Eftersom föreliggande uppfinning hänför sig till reglerad termisk destabilisering av mikrobiellt löpe, ges nedan vissa detaljer vad beträffar teknik för mätning av termisk stabili- iet ouh för kvantifiering av reduktionen av termisk stabilitet, dvs. destabiliseringen, varvid denna destabilisering uttryckes i Oc.

Under ideala betingelser kan ett enzym denatureras vid lämp- Pööxgggggggg i ÛUALIITIY 10 15 20 35 446 549 lig.(hög) temperaturnivå på ett sådant sätt att den kvarvarande aktiviteten för enzymet minskar som en funktion av tiden längs en exponentiellt avtagande kurva, dvs. med en väldefinierad hal- veringstid, varvid halveringstiden är en funktion av tcmpera- a . turen (OC). Halveringstiden Tl/2 kan beräknas enligt formeln: (tg-tl) ln2 Ti/2 : lnA - lnA2 1 där Al är enzymaktiviteten uppmätt efter upphettning till en specificerad temperatur för tiden tl, medan A2 är enzymaktivi~ teten uppmätt efter upphettning till samma specificerade tempe- Halveringstiden är kortare ju högre tempe- För många ratur för tiden t2. raturen är, om alla andra betingelser är desamma. nnfiymnr pävwrknv vn Förändring I pH-värdet för enzymlösninmnn och jonstyrkun samt närvaron av vissa salter halveringstiden väsentligt. Vidare kan en kemisk derivatisering av enzymet för- ändra halveringstiden avsevärt. Om en kemisk derivatisering av ett speciellt enzvm förorsakar termisk destabilisering av en- zymet, sägs graden av destabilisering vara NOC, om det ursprung- liga (icke derivatiserade) enzymet och det derivafiiserade enzymet har samma aktiveringstid vid N00 resp. (N-n)°C{ I Det torde emellertid observeras, att destabiliseringsvärdena i viss grad är approximativa, beroende på den approximativa karak- tären av värdet för halveringstiden. Samtliga destabiliserings- värden i föreliggande beskrivning mätes vid pH 6,0, eftersom re- sultaten av destabiliseringsmätningen är pH-beroende.

Normalt åtföljes behandlingen enligt uppfinningen av en aktivitetsförlust. Det har visat sig, att destabiliseringsreak- tionen av ekonomiska skäl inte bör drivas förbi det steg som motsvarar en därmed sammanhängande aktivitetsförlust av ca 50%, företrädesvis av ca 30%, ännu hellre mindre än 10%. _ I ett typiskt fall tycks en destabilisering av ca 10 eller lloC med en aktivitetsförlust_begränsad till mindre än 10% vara >.:*en lämplig kompromiss mellan ovannämnda motstridiga faktorer.

Peroxisyran bör användes i sådan koncentration att den ön- 'skade graden av destabilisering erhålles på skälig tid, vilket kan vara någonting från några minuter upp till H8 timmar eller t.o.m. en vecka. Förhållandet peroxisyra till totalt protein i enzymprodukten är viktigt för resultaten. Om koncentrationen i Pound ïflUALlTL *i al) lO l5 20 25 50 H0 446 540 av peroxisyran är alltför liten, kommer destabiliseringen ock- så att vara alltför liten, och om koncentrationen av peroxi- syran är alltför hög, kommer på motsvarande sätt aktivitetsför- lusten att bli alltför hög. De optimala koncentrationerna mot- svarar vanligen ett molärt förhållande mellan medlet och den to- tala mängden protein i enzympreparatet av från ca 0,1 till 25 mmol peroxisyra per g totalt protein. Om det mikrobiella löpe- preparatet renas till hög aktivitetsnivå, kan kvantiteten per- oxisyra reduceras till så liten mängd som 0,05 mmol peroxisyra per g totalt protein. _Reaktionstemperaturen är ej kritisk när reaktionstempera- turerna hålles på sådana nivåer, t.ex. under ca-3000, där enzy- mets stabilitet är tillfredsställande. Enzymets stabilitet bör emellertid ökas genom närvaro av kända proteinstabiliserande medel, t.ex. NaCl i en mängd av 5-20% av enzympreparatet, eller sorbitol i de vanliga enzymstabiliserande mängderna. Den före- dragna reaktionstemperaturen ligger inom området 0-3000.

' Destabiliseringsnivån av minst 800, företrädesvis 1000 till 1300, och därav följande aktivitetsförlust av ej mera än 50%, företrädesvis mindre än l0%, får anses vara gränser för utövan- det av föreliggande uppfinning.

En föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfin- ningen innebär att man behandlar det mikrobiella löpet med per- oxiättiksyra eller peroxipropionsyra. _ En annanföredragen utföringsform av förfarandet enligt upp- finningen innebär att det speciella löpet behandlas med monoper- sulfonsyra. _ Enligt en annan föredragen utföringsform av förfarandet en- ligt uppfinningen är det mikrobiella löpet Mucor miehei-löpe.

Enligt ännu en annan föredragen utföringsform av förfaran- det enligt uppfinningen utföres behandlingen med ett molärt för- hållande i reaktionsblandningen mellan peroxisyran och den to- tala mängden protein i enzympreparatet av mellan 0,1 och 25 mmol peroxisyra/g protein, företrädesvis mellan 0,5 och 5 mmol peroxi- syra7g protein.

Enligt en annan föredragen utföringsform av förfarandet en- ligt uppfinningen har det vattenbaserade mediet ett pH-värde av mellan ? och 0.

Enligt ännu on annan föredragen utföringsform av förfaran- det enligt uppfinningen har det vattenbaserade mediet en tempe- ratur av mellan 0 och 5000.

Póöñ _____ i * QUALITY _10 15 20 25 30 35 ÄO 44e,54o Den andra aspekten av uppfinningen omfattaršïet destabilise- rade mikrobiella löpet framställt medelst förfarandet enligt uppfinningen.

" Den tredje aspekten av uppfinningen innebär ett förfarande för osttillverkning, där det modifierade löpet enligt uppfin- ningen-användes för mjölkkoagulation.

I praktiken har det upptäckts, att användningen av termiskt destabiliserat löpe föredras för framställning av ostar avsedda för lång lagring.

Destabiliseringsprocessen kan, vilket också är det före- dragna, utföras som sista steg vid framställning av det mikro- biella löpet.

I realiteten kan (kommersiellt) rent mikrobiellt löpe eller löpekoncentrat användas vid utövandet av föreliggan- de uppfinning.

Sålunda justeras t.ex. pH-värdet för en stabili- serad mikrobiell löpe-lösning, som i övrigt är färdig för de van- liga slutbehandlingsoperationerna före leverans, till den förut- bestämda behandlingsnivån (t.ex. pH 5), varefter lösningen blan- das under omröring vid rumstemperatur-med en lösning av peroxi- syran, varvid mängden peroxisyra ligger inom ovannämnda område mikrobiella löpelösningen. gera till dess att den önskade destabiliseringsnivån uppnås, t.ex.

Den termiskt destabiliserade enzymprodukten kan ut- iiü timmar. ^ vad beträffar det molära förhållandet till totalt protein i den Blandningen lämnas därefter att rea- sättas för de vanliga slutbehandlingsoperationerna, t.ex. fil- trering, justering av pH och enhetsenzymaktivitet till standar- diserade nivåer etc. 3 Uppfinningen kommer nu att beskrivas mera i detalj genom följande exempel.

Utgångsmaterialet i följande exempel är ett löpekoncentrat framställt i enlighet med "2. Pilot plant experiment" i den brittiska patentskriften l 108 287, varvid dock kulturvätskan koncentrerades till en aktivitet som approximativt motsvarar en 1%-ig lösning av det rena enzymet (Comptes Rendus des Travauz du Laboratoire Carlsberg, (1970) Vol. 37, No. lä, 301-325).

För enkelhets skull kommer detta koncentrat i fortsättningen att benämnas "RENNILASE ÄÖÜ. approximativt 50.000 löpe-enheter/ml (eller 50.000 S-enheter/ml).

EXEMPEL l Aktiviteten för koncentratet är 5 ml RENNILASE 46 spädes till 15 ml under tillsats av NaCl till en koncentration av 12% i blandningen.

Därefter tillsättes xíl 10 20 7 446 540 50 /ul 57% peroxiättiksyra (innehållande 5,8% H2O2), varigenom samtidigt pH-värdet justeras till 2,5 med Ä N HCl. reaktionstid på l timme vid 2500 neutraliseras blandningen till pH 7,0 med U.N NaOH. -Aktivitetsutbytet ligger kring 20%, och halveringstiden vid 5500 och vid de tidigare omtalade betingel- Efter en serna ligger under 5 minuter, vilket motsvarar en destabilise- ring av minst 1300.

EXEMPEL 2 150 ml RENNILASE H6 späddes med 150 ml vatten och uppdela- des i tre 100 ml portioner, vars pH-värden justerades till 3, 5 resp. 7. Vid rumstemperatur och under kraftig omröring sattes 500 /ul av en kommersiell 25%-lg peroxiättiksyra (l mmol) till var och en av tre portionerna, och pH-värdet justerades samti- digt på nytt genom tillnatn av H N Na0H. Proverna lagrades över natten vid H00 innan de analyserades. Försöket upprepades, men denna gång mínskades doseringen av peroxiättiksyran till 0,5 mmol genom tillsats av 750 /ul av en 5%-ig peroxiättiksyra- lösning.

Resultaten framgår av följande tabell. pH íi Dosering I Ahtivitets- Halveršngs- Dçstabilíse- ; mmol _ [_ utbyte % tid 55 C, ring 3 peroxi- 1 pd 6,0 oc ! attiksyra 1 š minuter '. ' l 5 f 0,5 É 105 4,9 15 5 § 0,5 106 5,6 15 7 i 0,5 É 84 7,4 12 3 i i 86 3,0 14 5 l 1 å 105 3,0 . 14 7 1 ';_ 84 5,7 14 - 1 EXEMPEL B 150 ml RENNILASE H6 späddes med l50 ml vatten och uppdela- des i tre 100 ml portioner, vars pH-värden justerades till 3, 5 resp. 7. Vid rumstemperatur och under omröring tillsattes l ml l M kaliummonoporsulfat till var och en av de tre portionerna, och pH-värdet justerades på nytt. Proverna lagrades över natt vid HOC innan de analyserades.

Försöket upprepades, men denna gång sattes 2 ml av l M ka- liummonopersulfatlösningen till varje portion. “ïä Püíï f QUALÉY 10 046 500 8 Resultaten framgår av följande tabell. pH Dosering Aktivitets-_ ,Halverings- Destabili- mmol utbyte % tig vid . sering KHS05 55 C, pH 1 2 oc - 6,0, minuter 3 l -105 _ 53 8 5 -1 112 58 8 -7 1 103 H1 8 5 2 102 - 32 9 '5 2 106 ' 50 g 9 7 2 , 97 16 ' 2 ' 10 EXEMPEL U Sex portioner om 50 ml RENNILASÉ 06 späddes med 50 ml vat~ ten, och pH-värdet justerades till 5. Därefter tillsattes 75, 150, 300, 050, 600 resp. 750 /01 ev en 5%-ig perätniksyre (med O,6% HZO2) till de ovan angivna sex portionerna under kraftig omröring, och samtidigt justerades pH-värdet på_nytt till 5 med 0 N Na0H. för analys.

Resultaten framgår av följande tabell.

Efter l timma vid rumstemperatur uttogs l ml prover iDosering Utbyte Halverings- -Destabili- I 2 lperättiksyra 7 tig vid ^ sering ¿mmol ” 55 , pH °C É minuter I š . E š 0,05 100 1.005 § 0,1 106 6 513 ~- 0 I f 0,2 0 105 05 ~ 8 ¿ § "0,5 §- 0106 10 . 711 š § 0,0 f 102 8 ' _'12 § 0 0,5 102 § 6 - 13 ; i ' | f !É9¶fl¥fi;_2 Tre portioner om 50 ml RENNILASE H6 späddes med 50 ml vat- ten, och pH+värdet justerades till 5. Till en portion sattes 0,55 ml, och till den andra portionen sattes l,lO ml av en approx- imativt 0,06 M permyrsyra (0,1 M_H O) under kraftig omröring och 2 Puon e % .fl.UA1LITl\f._.e L". 10 15 i Reagens Dosering Utbyte T¿_vid Destabili- mmol % -o sering approx 55 C” PH o ' 6,0 c minuter ¿ l i 'perpropionsyra l 88 < 5 >lH i pwvprnpïwnnyrn _ neutral l lut <,5 ylü ä persmörsyra ¿ l 82 <3 >lH i 'persmörsyra i I § neutral å 1 102 I < 5 >1l4 I 9 446 540 samtidig justering av pH-värdet till 5 med U N NaOH. Till den tredje portionen sattes 2,2 ml av en approximativt 0,H5 M per- myrsyra, som neutraliserats med kall H N NaOH.

Efter 2 l/2 timmar vid rumstemperatur uttogs l ml prover för analys.

Resultaten visas i följande tabell.

!Dosering Utbyte Halverings- É Destabili- ¿permyrsyra % gšgcvid sering lmmo o j pH 6:0 ! C ; minuter i ï . g ä 0,25 (sur) 86 8,8 § 12 § 0,5 (sur) 70 3,4 I lü , : - 1 É 1,0 (neutralfl 9? ä 15 i EXEMPEL 6 Två portioner 50 ml RENNILASE H6 späddes med 50 ml vatten och pH-värdet justerades till 5. Till en portion sattes 5 ml av en approximativt 0,2 M perpropionsyra (0,1 M H2O2) med sam- tidig pH-justering med H N NaOH. tes 5 ml av den approximativt 0,2 M perpropionsyran, vilken hade neutraliserats i förväg.

Försöket upprepades, varvid dock 5 ml portioner av en approximativt 0,2 M persmörsyra (0,1 M HQO2) användes som rea- gens. 5 Efter 2 timmar vid rumstemperatur uttogs l ml prover för analys.

Resultaten framgår av följande tabell. .ï/FÖOR uuAuw Till den andra portionen sat- .._ -_._...._<.

Claims (6)

446 540 PATENTKRAV

1. Förfarande för att reducera den termiska stabiliteten för mikrobiellt löpe genom kemisk modifikation därav, k ä n-n e t e c k n a t av att man behandlar det mikro- biella löpet i ett vattenbaserat medium vid ett pH-värde av_mellan 2 och 9 med en oorganisk peroxisyra eller en peroxi- syra härledd från en alifatisk karboxylsyra med en rak eller grenad alkylgrupp, som innehåller högst 6 kolatomer, eller ett salt därav, med användning av mellan 0,1 och 25 mmol peroxísyru per g totalprotein i enzympreparntet. 7

2. Förfarande av att peroxisyran är

3. Förfarande 1 av att peroxisyran är

4. Förfarande t e'c k n a t av att

5. Pörfarande t"e c k n a t av att enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t peroxiättiksyrn eller poroxipropionsyra. enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t monopersvavelsyra. ' enligt något av kraven 1-3, k ä n n e - det mikrobiella löpet är Mucor mieheilöpe. enligt något av kraven IF4, k ä n n e - man använder mellan 0,5-och 5 mmol peroxisyra per g totalprotein i enzympreparatet.

6. Förfarande enligt något av kraven 1-5, k ä n - nde t e c k n a t av att det vattenbaserade mediet har en temperatur av mellan O och 3006. 7; Förfarande för osttillverkníng,. k ä n noe t e c k - n a t av att ett löpe framställt medelst förfarandet enligt något av kraven 1-6 användes för mjölkkoagulation. ;PO0R r auAuTv :x