SE448032B - Alfa-l-antikropp och sett for framstellning derav, vilket motsvarande antigen er knutet till leversjukdomar - Google Patents

Description

448 032 =~ 2 rumet hos patienter som lider av leversjukdomar.CK-L-antigenet har följande egenskaper: 1) Molekylvikt: ca 1 000 000 [det elueras i ungefär samma fraktion som IgM (molekylvikt ca 900 000 - 1 000 000) med en kromatografi- kolonn med Biogel A-1,5 m (varumärke för Biored LaboratoriesL7. 2) Elektrofores-rörlighet: 19-dz globulinomrâde (detta är ett mel- lanliggande värde mellan HBS antigen och M-fetoprotein). 3) Isoelektrisk punkt: PI = 5,04 (aktivitet för oš-L-antigen visa- des inom området 4,22-5,68) genom bestämning med Ampholien-kolonn. 4) Flytdensitet: d = 1,08 g/ml i cesiumkloridlösning och d = 1,03 g/ml i sackaroslösning. 5) Bildning av komplex: med dextransulfat i närvaro av magnesium- klorid bildas ett komplex, som faller ut och visar lipoproteinar- tade egenskaper. 6) Färgning: linjen avíX-L-antigen/antibody utfälld i agargel kan färgas med Sudan black B. 7) Termostabilitet: antigen-egenskaper i serum bibehâlles 30 minu- ter via ss° c. 8) Form (som ett antigen/antibody-komplex): sfärisk partikel med en diameter av ca 300 A. ' Man har undersökt den frekvens, i vilken K-L-antigen och antikropp påvisas i serum hos patienter, som lider av olika leversjukdomar.

HBS antigen-positiv-bärarserum och serum hos normal människa och sambandet mellancfi-L-antigen och antikropp enligt föreliggande uppfinning och de kända antigenerna och antikropparna förbundna med leversjukdomar, dvs HBS antigensystem, e-antigensystem och d- fetoprotein (i det följande betecknat~X-FP). Resultaten är angiv- na i nedanstående tabell. I denna tabell undersöktes HBS antigen medelst IAHA-metod, HBS antikropp undersöktes medelst PHA-metod och de andra undersöktes medelst MO-metod. 448 032 3 Tabell Diagnos Antal a-L Antal HBs e u-FP exempel exempel Ag(+ï_"Ab(+) Ag(+$ Ab(+) Ã$(+) Le As(+) 9 6 o 1 o u cašgg; 39 An(+) 1 o o o o 1 As.Ab(-) 29 15 3 o o 12 Le Ag(+) 6 2 o 0 0 o cíïfifis ss m +> 6 s o o 2 o Ag,Ab(-> 23 16 2 o o o K _ k As(+) 3 1 1 o 1 o rOnlS hepstit “Û ) Û Û Û 0 O g, - 19 1 1 o o As<+) .H 3 o o 1 o Akut hepatit 40 Ab(+) 4 2 1 o 1 o Ag,An(-) 32 15 8 2 u o HB A ( ) As(+) 0 o o o o o s + -- b1°d-g 20 Ab ( 'Ü 1 l 0 0 0 0 d°fla@°P ^s,Ab(~) 19 19 o 0 2 o Nor 1 As(+) o o o o o mängiska 20 Ab(+) 0 0 0 0 0 As,Ab(-) 20 u o o o Det framgår av denna tabell, attiX-L-antigen visar hög positivi- tet gentemot cancer i lever och cirros i lever och förekomsten av flwL-antigen påvisas i kronisk hepatit och akut hepatit. M-L- antigen kan emellertid icke påvisas i HBS antigen-positiv-bloddo- nator och normal människa.*Ä-L-antikroppen visar hög positivitet i levercirros och påvisas även i HBS antikropp-positiv-bloddona- tor. Ungefär 60% av de serum, som är positiva mot J-L-antigen och M-L-antikropp, åtföljes av HBS antigen-antikropp-systemet. Beträf- fande serumet vid levercancer âtföljes ca 45% av serumet, som är positivt motiä-L-antigen, av MPFP. Å andra sidan är ca 25% av se- rumet, som är positivt mot Å-L-antigen helt oberoende av det kän- da antigen-antikropp-systemet.

Följaktligen är=X-L-antigen och OPL-antikr0pp mycket förbundna med leversjukdomar. Pávisandet av dessa 0rL-antigen och 0rL-antikropp 448 032 ,- 4 är användbart för diagnos av leversjukdomar och undersökning av blod för blodtransfusioner.

Enligt uppfinningen avses en(Ä-L-antikropp till användning som rea- gens för bestämning avïÄ-L-antikropp ochl-L-antigen kännetecknad av att den motsvarar4Ä-L-antigen med ovanstående fysikaliska egen- skaper, vilket\Ä-L-antigen kan erhållas genom gradientcentrifuge- ring av serum eller ascites, innehållandeGÅ-L-antigen, uppsamling av en fraktion med en flytdensitet mindre än 1,1 g/ml och rening av fraktionen genom en kombination av utsaltning, elektrofores, gelfiltrering, affinitetskromatografering, isoelektrisk fokusering, ultrafiltrering, Cohn's fraktion, dextransulfatrening eller ett sätt som innefattar tillsättning av antikroppar mot föroreningar andra än|Ã-L-antigen för att avlägsna föroreningarna.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett sätt att framställaGÅ-L-antikroppen, som kännetecknas av att man immunise- rar ett djur, dock ej en människa, medfiä-L-antigen eller'ñ-L-anti- gen/antikropp-komplexet för att uppsamla antiserum från djuret.

Ett ytterligare ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett rea- gens omfattande<Ä-L-antikroppen för påvisande avfä-L-antigenet och ü-L-antikroppen.

N-L-antigenet kan användas i form av 0wL-antigen-positivt serum eller ascites per se eller i en renad form av serumet eller asci- tes medelst ett protein- eller lipoprotein-separeringsförfarande.

Såsom separeringsförfarande användes ett konventionellt förfarings- sätt som användes inom det immunologiska facket. Detta förfarande inkluderar exempelvis sätt för densitetgradientcentrifugering, utsaltning, elektrofores, gelfiltrering, affinitetskromatografe- ring, isoelektrisk fokusering, ultrafiltrering, Cohn's fraktion, dextransulfat-utfällningsförfarande och ett sätt som innefattar tillsättning av antiserum mot föroreningar andra än!Ä-L-antigen för att avlägsna föroreningarna, och andra förfaringssätt.

Man kan erhålla.ørL-antigen/antikropp-komplexet som fällning, exem- pelvis genom att blanda 0rL-antigen-lösningen med 0%L-antikropp- lösningen.

Såsom djur för immunisering kan man exempelvis nämna kanin, mar- svin, get, häst, ko etc. 448 032 Då immuniseringen utföres, så föredrager man för att erhålla an; tiserum med hög antikroppaktivitet att utföra den med detf%-L-an- tigen eller(Ä-L-antigen-antikropp-komplex som emulgerats med an- vändning av Freund complete adjuvant, och att immunisera icke blott en gång utan även ytterligare flera gånger.

Det bildade antiserumet kan renas medelst immun-adsorptionsförfa- rande med användning av serum från normal människa, affinitetkro- matografering etc.

Förutom förfaringssättet avseende¿X-L-antikropp genom att immuni- sera djur såsom angives här ovan, så finns ett förfaringssätt kän- netecknat av att man renar\X-L-antikroppen medelst«Ä-L-antikropp- positivt humanserum. Man kan dock med detta förfarande icke fram- ställa stora mängder av=Ä-L-antikroppen.

Med användning av GPL-antikroppen, som erhållits enligt uppfinnin- gen, kan man påvisacä-L-antigener och-%-L-antikroppar medelst kon- ventionellt förfaringssätt, exempelvis Ouchterlony metod (M0), enkel-radial-immunodiffusionsmetod (SRID), immunoelektrofores (IES, IEP), radioimmuno-bestämningsmetod (RIA), enzymbunden immu- no-lösningsmedelbestämning (ELISA), komplementfixeringsmetod (CF), omvänd passiv hemaglutinationsmetod (RPHA), immun-adherens-hemaglu- tinationsmetoa (IAHA) . ' f Reagenset innehållande ñfL-antikroppen enligt uppfinningen kan an- vändas för konventionellt immunohxfiskt förfarande för påvisande där man använder antigen-antikropp-reaktioner.

I fråga om den enkla radial-immunodiffusionsmetoden (SRID) kan man använda.M-L-antikroppen genom att lösa upp K-L-antikroppen tillsam- mans med bärarmediumet och låta lösningen stelna i form av en plat- ta. Ett dylikt bärarmedium kan exempelvis innefatta agar, agaros, stärkelse, polyakrylamidgel etc. Gelplattan kan erhållas av detta bärarmedium och %-L-antikropp medelst ett konventionellt förfa- ringssätt. Sålunda löser man exempelvis ett bärarmedium med värme i en buffertlösning, sätter därefter W-L-antikropp till lösningen och blandar. Den bildade lösningen hälles därefter på en glasplat- ta eller i ett plastkärl och kyles därefter för att stelna. För att tillföra det serum, som skall undersökas, gör man ett hål i den erhållna gelplattan. 448 032 Ifrâga om passiv hemaglutinationsmetod (PHA) använder manCX-L-an- tikropp, som framställts genom att man bundit.M-L-antikropp till fina partiklar. Såsom fina partiklar kan man använda konventio- nella material. Särskilt föredragna fina partiklar inkluderar erytrocyter från däggdjur och fåglar. Man kan använda partiklar med ca 1-10 pm i diameter av polystyrenlatex, polyesterlatex, po- lyvinylklorid, bentonit, glaspärlor etc. Man kan använda konven- tionella bindemedel för att bindalä-L-antigen till de fina partik- larna. Sådana bindemedel inkluderar exempelvis glutaraldehyd, form- aldehyd, garvsyra, bisdiazoterad benzidin, krom(III)klorid, karbo- diimid etc.

I fråga om radioimmunbestämningsmetoden (RIA) använder maníX-L-an- tikropp märkt med isotop. Märkningen kan utföras medelst konventio- 1 5 nellt sätt, exempelvis kloramin T-sättet med användning av 2 I. 131I_ I fråga om enzymbunden immunolösningsmedelbestämning (ELISA) använ- der man W~L-antikropp bunden till enzym. Såsom enzymer kan man exem- pelvis använda glukosoxydas, alkalimetallfosfatas, peloxidas etc.

Såsom bindemedel använder man vanligtvis glutaraldehyd. 7¥L-antigenet och-Ä-L-antikroppen kan påvisas medelst konventio- nellt sätt med användning av de här ovan,nämnda reagenserna inne- hållande drL-antikropp. I de flesta fall använder man för pâvisan- de av~Å-L-antikropp reagenset innehållande H-L-antigen. Detta rea- gens kan även användas för att påvisa 9wL-antikropp genom att man anpassar den inhiberade reaktionen, i vilken G-L-antikropp använ- des, till varje metod. I varje metod kan man lämpligen, om så är nödvändigt, och som tillsats använda andra reaktionskomponenter, t.ex. komplement, erytrocyt, buffertlösning, ä-L-antikropp etc.

Rening avlX-L-antigen kan åstadkommas genom att man underkastar ett material innehållande ÛkL-antigen en täthetsgradientcentrifu- gering och uppsamlar en fraktion med en flytdensitet mindre än 1,1 g/ml, företrädesvis 1,03-1,08 g/ml.

Medelst detta förfarande kan man separera M-L-antigenet från en stor del av icke ren proteinkomponent och andra antigener förbundna 448 032 med leversjukdomar, enär NFL-antigenet har en mycket ringa flyt- densitet.

Såsom ett material innehållande(X-L-antigen, som kan användas en- ligt uppfinningen, kan man nämna varje slag av substanser innehål- lande aklrantigen, exempelviswfl-L-antigenpositivt serum och asci- tes etc.

Sâsom ett medium för densitetgradientcentrifugering är det möjligt att använda konventionella medier, t.ex. cesiumklorid, cesiumbro- mid, kaliumbromid, litiumbromid, litiumklorid, natriumklorid, gly-_ cerol, sackaros etc.

Vid utförandet av sättet för rening enligt uppfinningen kan man i form av en kombination använda andra förfaranden för separering av protein- eller lipoproteinfraktion, t.ex. utsaltningsförfaran- det, elektrofores, gelfiltrering, affinitetkromatografering, iso- elektrisk fokusering, ultrafiltrering, Cohn's fraktion, dextransul- fatreningsförfarande eller ett sätt som innefattar tillsättning av antikroppar mot föroreningar andra än1Ä-L-antigen för att av- lägsna föroreningarna etc, varigenom man erhåller renare VPL-an- tigen.

Förfaringssättet enligt uppfinningen är i synnerhet utmärkt som ett sätt för rening i första hand av Gí-L-antigen från råmaterial, t.ex. serum, ascites etc. Sättet kan även användas för ytterligare rening av ñrL-antigenet, som tidigare renats medelst andra renings- förfaranden.

Följande exempel och försök tjänar till att belysa uppfinningen men uppfinningen begränsas icke genom dessa exempel och försök.

Exempel 1 Man utvinner det överliggande skiktet genom att centrifugera 100 mlIX-L-antigen-positivt serum under 20 minuter med en hastighet av 10 000 varv/minut. Till detta överliggande skikt sättes pulvrise- rad cesiumklorid i ett förhållande av 0,3 g/ml, varvid allt lös- tes upp. Den bildade lösningen underkastas densitetgradientcent- rifugering under 40 timmar vid 40 000 varv/minut. Toppfraktionen med en flytdensitet mindre än 1,1 g/ml uppsamlas och dialyseras över natten med dest. vatten resp. saltlösning. Den bildade lös- 448 032 J' 8 ningen indunstas till ca femdubbla koncentrationen med användning av Amicon niafiow-xm-so' (TM, Amican co.), varvid man erhåller ñ~L-antigen-lösningen. Det erhållna 0+L-antigenet bildar ett komp- lex med WFL-antikroppen och man observerade icke andra antigener förbundna med leversjukdomar, exexpelvis HBS antigen, e-antigen, R-FP etc. medelst MO-metoden.

K-L-antigenets specifika aktivitet ökades ca 30 gånger. Detta=X-L- antigen är användbart som ett reagens.

Exempel 2 Medelst samma förfarande som beskrives i exempel 1 och med använd- ning av 100 ml av'Ä-L-antigen~positiv ascites erhålles 0FL-anti- gen-lösningen. Densitetgradienten inom området 1,05-1,2 g/ml bil- dades dessförinnan i ett cellulosarör med användning av en lösning av cesiumklorid löst i 0,01-molar tris-klorvätesyra-buffertlösning.

M-L-antigen-lösningen tillsattes på rörets toppskikt, varvid fle- ra skikt bildades. Alltsammans underkastades därefter densitet- gradientcentrifugering under 24 timmar vid 40 000 varv/minut. Man uppsamlade JFL-antigen-positiv-fraktionen och dialyserade denna över natten med dest. vatten resp. tris-klorvätesyra-buffertlös- ning. Den bildade lösningen indunstades därpå till ungefär femdub- bel koncentration med användning av Amicon Diaflow-XM-50. Det er- hållna 0ßL-antigenet bildar komplex med ü-L-antikropp och man ob- serverade icke andra antigener förbundna med leversjukdomar, t.ex. mr.

HBS antigen, e-antigen, ñ-FP etc, medelst M0-metoden. JFL-antige- nets specifika aktivitet ökades till ca 100 gånger. Detta ñ-L-an- tigen kan användas som ett reagens.

Exempel 3 Den i exempel 1 framställda'X-L-antigenlösningen emulgeras efter tillsättning av Freund complete adjuvant i ett förhållande av 1:1. 1 ml av denna emulsion injicerades på ryggen av en kanin, uppdelad i en subkutan och en intrakutan injektion och även i fot- dynorna, så att kaninen immuniserades. En vecka efter denna förs- ta immunisering âstadkoms ytterligare en andra immunisering på samma sätt med samma mängd emulsion som i den första immuniserin- gen. En månad efter den första immuniseringen åstadkoms en ytter- ligare tredje immunisering med dubbla mängden av den emulsion som W användes vid den första immuniseringen. En vecka efter den sista 448 032 immuniseringen uppsamlades blod flera gånger och serumet separe- rades från blodet. Till detta serum sattes en ekvivalent mängd serum från normal människa. Blandningen fick stå 1 timme vid 37°C och över natten vid 4°C. Serumblandningen centrifugerades 10 mi- nuter vid 10 000 varv/minut, varefter man uppsamlade det överlig- gande skiktet. Det erhållna serumet innehållande<ñ-L-antikroppen reagerar exceptionellt endast medzx-L-antigen, men reagerar icke fullständigt med andra antigener förbundna med leversjukdomar, t.ex. HBS antigen, e-antigen, W-FP etc. liksom med serum från nor- mal människa.

Antiserumet innehållande denna!X-L-antikropp kan användas såsom reagens för påvisande enligt uppfinningen.

Exempel 4 Freunds adjuvant sattes till en enligt exempel 2 framställd lös- ning av'VrL-antigen i förhållandet 1:1 för att emulgera blandnin- gen. 0,5 ml av emulsionen injicerades i ryggen på ett marsvin, uppdelat i en subkutan och en intrakutan injektion och även i fot- sulorna, så att marsvinet immuniseras. Genom att förfara på samma sätt som i exempel 3 erhåller man antiserumet innehållande(Å-L-an- tikroppen.

Det erhållna antiserumet reagerar exceptionellt med endastAÄ-L-an- tigen men reagerar icke fullständigt med andra antigener förbund- na med leversjukdomar, t.ex. HBS-antigen, e-antigen,~Å-FP etc, liksom med serum från normal människa.

Antiserumet innehållande denna\Ä-L-antikropp kan användas som rea- gens för påvisande enligt uppfinningen.

Exempel 5 Till 25 ml av den i exempel 1 framställda.fi~L-antigenlösningen sattes gradvis S0 ml antiserum innehållande den i exempel 3 fram- ställda<Ä-L-antikroppen. Blandningen omrördes. Den fick därefter stå 1 timme vid 37°c och därpå över natten vid 4°c. Blandningen centrifugerades 20 minuter vid 10 000 varv/minut. Man erhöll=Å-L- -antigen/antikropp-komplexet som fällning. Till fällningen sattes 0,01-molar tris-aminometan/klorvätesyra-buffertlösning, varefter man centrifugerade blandningen för att avlägsna föroreningar ge- nan tvättning. 448 032 10 d-L-antigen/antikropp-komplexet suspenderades i 5 ml saltlösning och suspensionen emulgerades genom tillsättning av en ekvivalent mängd av Freund complete adjuvant. Därefter erhöll man genom att följa samma förfarande som beskrives i exempel 3 antiserumet inne- hållande fÄ-L-antikroppen .

Det erhållna antiserumet reagerar exceptionellt med endast4X-L-an- tigener men reagerar icke fullständigt med antigener förbundna med leversjukdomar, t.ex. HBS-antigen, e-antigen,iX-FP etc, liksom med serum från normal människa.

Exempel 6 nu det i exempel 3 framställde entieeïumetg innehållande a-L-enti- kropp sattes en ekvivalent mängd av 0,05-molar fosfat-saltbuffert- lösning (pH 7,5). Till denna lösning sattes en ekvivalent mängd av en mättad vattenlösning av ammoniumsulfat (pH 6,8). Blandningen omrördes. Efter 1 timme centrifugerades lösningen 30 minuter vid 5 000 varv/minut. Den bildade fällningen löstes i fosfat-saltbuf- fertlösning, varvid man erhöll en lösning med samma volym som lös- ningen av det ursprungliga antiserumet. En fjärdedels volym av den mättade vattenlösningen av ammoniumsulfat (pH 6,8) sattes till lös- ningen. Lösningen centrifugerades efter 1 timme under 30 minuter vid 5 000 varv/minut. Ytterligare en fjärdedels volym av den mätta- de ammoniumsulfatlösningen sattes till det bildade överliggandee skiktet, varvid man erhöll en 33-procentig ammoniumsulfatlösning.

Denna lösning centrifugerades efter 1 timme under 30 minuter vid 5 000 varv/minut och fällningen uppsamlades. Fällningen löstes i 0,01 mol tris-aminometan/klorvätesyrabuffertlösning (pH 8,0), var- vid man erhöll en lösning med en proteinkoncentrat'on av 70 mg/ml.

Man gelfiltrerade denna lösning med Sephadex G 50(É)(TM, Pharmacia AB) med användning av denna buffertlösning för att salta ut och buffra den. Den erhållna lösningen koncentrerades och inställdes på en proteinkoncentration av 70 mg/ml med användning av Amicon Diaflow-XM-50. Aktiverad DEAE cellulosa packades i en kolonn med en diameter av 2,6 cm och en längd av 40 cm med användning av tris- -aminometan/klorvätesyrabuffertlösning. Man satte den koncentrera- de lösningen till kolonnen för att adsorbera OPL-antikroppen på den aktiverade DEAE cellulosan. Det absorberade MrL-antigenet elue- rades med 0,1 mol natriumklorid/tris-aminometan/klorvätesyrabuffert- fl! 448 032 11 lösning (pH 8,0), som framställts genom att man tíllfört natrium- klorid till tris-aminometan/klorvätesyrabuffertlösningen. tikropp-positiva fraktionen isolerades och uppsamlades. Denna frak- tion koncentrerades därefter till en proteinkoncentration av 70 mg/ml med användning av Amicon Diaflow-XM-50. Den erhâllnaíÄ-L-an- tikroppen användes som ett reagens.

Exemgel 7 Den i exempel 6 framställdalÄ-L-antikroppen löstes i 0,1 mol bar- bitalbuffertlösning (pH 9,0), varvid man inställde proteinkoncentra- tionen till 10 mg/ml. Till denna lös ing sattes en ekvivalent mängd I ®gel (TM, Pharmacia AB) och blandningen fick reagera 24 timmar vid 4°C.'Det protein, som icke av bromcyanid-aktiverad Sepharos 4B reagerat, avlägsnades genom tvättning med en 0,05-molar fosfat-salt- buffertlösning (pH 7,5). Den erhållna lösningen anbringades däref- ter på en kolonn med en diameter av 15 cm och en längd av 20 cm.

W-L-antigenlösningen enligt exempel 2 sattes till denna kolonn.

Sedan man genom tvättning med fosfat-saltbuffertlösningen avlägsnat den substans, som icke reagerat, tillsatte man 3,5-molar natrium- jodidlösning till kolonnen för att dissociera och eluera ä-L-anti- genet. Man uppsamlade Å-L-antigenlösningen och dialyserade den med dest. vatten för att avlägsna natriumjodid och koncentrerade däref- ter lösningen med användning av Amicon Diaflow-XM-50.

Det erhållna4Ã-L-antigenet kan användas som ett reagens.

Exemgel 8 Den i exempel 1 framställda 0vL-antigenlösningen löstes i 0,1-mo- lar barbitalbuffertlösning (pH 9,0) och proteinkoncentrationen in- ställdes till 10 mg/ml. Denna lösning sattes till en ekvivalent mängd av bromcyanid-aktiverad Sepharose 4B gel och blandningen bringades att reagera 24 timmar vid 4°C. Man avlägsnade icke-rea- gerat protein genom tvättning med 0,05-molar fosfat-saltbuffertlös- ning (pH 7,5). Den erhållna produkten anbringades i en kolonn med en diameter av 1,5 cm och en längd av 20 cm. Till denna kolonn sat- tes det enligt exempel 3 framställda antiserumet innehållande ?FL- -antikroppen. Man avlägsnade den substans som icke reagerat genom tvättning med fosfat-saltbuffertlösning, varefter man till kolonnen satte 3,5-molar natriumjodidlösning för att dissociera och eluera W-L-antigenet. Man uppsamlade den bildade Ä-L-antigenlösningen och 448 032 s-. 12 dialyserade den med dest. vatten för att avlägsna natriumjodid, varefter man koncentrerade lösningen med användning av Amicon Dia- flow-XM-50. Det erhållna W-L-antigenet kan användas som ett rea- gens. 2 Exempel 9 Blod från ett får uppsamlades i ett centrifugrör och blodet centri- fugerades 5 gånger vid 2 000 varv/minut under 10 minuter med an- vändning av en saltlösning för att tvätta erytrocyter. Till dessa erytrocyter satte men 0,15-molar fosfat-saltbuffertlösning (pH 7,5) för att inställa erytrocytlösningens koncentration till 5%. Till lösningen, i vilken erytrocyterna flöt, sattes en femtedels volym glutaraldehydlösning, som inställts till en koncentration av 2,5% medelst fosfat-saltbuffertlösningen. Reaktionen utfördes vid rums- temperatur under ca.5 timmar med omrörimgför att binda erytrocyter- na. Man erhöll genom centrifugering av denna suspension de bundna erytrocyterna, som man därefter tvättade flera gånger genom cent- rifugering med användning av saltlösning. Man suspenderade dessa bundna erytrocyter medelst fosfatbuffertlösningen till en 5%-ig suspension och satte därefter till suspensionen en ekvivalent mängd garvsyralösning som med fosfat-saltbuffertlösningen inställts till 3 mg/dl, varefter man fortsatte omröringen 15 minuter. Man erhöll genom centrifugering av denna suspension erytrocyter, som behand- lats med garvsyra. De erhållna erytrocyterna tvättades flera gånger genom centrifugering med användning av saltlösning. Till de erhåll- na erytrocyterna som behandlats med garvsyra satte man därefter en fosfatbuffertlösning för att framställa en suspension innehållande erytrocyterna i en mängd av 5%.

Till suspensionen innehållande erytrocyterna satte man samma mängd av en lösning, i vilken man inställt den i exempel 6 framställda %rL-antikroppen till en proteinkoncentration av.1 mg/ml medelst fosfat-saltbuffertlösning. Man blandade därefter lösningen. Den bildade suspensionen omrördes 30 minuter vid rumstemperatur för m Sensüfilisaüng. Man centrifugerade suspensionen och tvättade där- efter de erhâllna samibïüsemxæ erytrocyterna flera gånger genom centrifugering medelst saltlösning. Till de erhållna sensibilisera- de erytrocyterna satte man en fosfat-saltbuffertlösning för att framställa en 7,5%-ig suspension. Till suspensionen satte man en W ringa mängd tymelosal som antiseptikum och lösningen förvarades 448 032 ,- 13 vid 4°C. De(X-L-antikroppsensibiliserade erytrocyterna från får kan användas som ett reagens i RPHA-metoden.

Exempel 10 Man upprepade samma förfaranden, som de som beskrives i exempel 9, med undantag av att suspensionen innehållande erytrocyterna blan- dades med en ekvivalent mängd av en lösning, som man framställt genom att ställa in det i exempel 2 framställda(Ä-L-antigenet till en proteinkoncentration av 100 pg/ml medelst fosfat-saltbuffert- lösning och därefter de sensibiliserade erytrocyterna. De ñ-L-anti- gen-sensibiliserade erytrocyterna från får kan användas som ett reagens i PHA-metoden.

Exempel 11 Det enligt exempel 7 framställda Ä-L-antigenet löstes i 0,04-molar fosfatbuffertlösning (pH 7,4) och man ställde in den bildade lös- ningen till en proteinkoncentration av 1 mg/ml. Till 104nl av lös- ningen sattes 504pl av 1 mc 1251 -Na. 10 pl av en lösning, i vil- ken kloramin T lösts upp i fosfatbuffertlösning i ett förhållande av 1,5 mg/ml sattes till ovanstående lösning och den bildade lös- ningen omrördes 30 sekunder. Därefter tillsattes 1004pl av en fos- fatbuffertlösning, i vilken man löst natriummetabisulfit i ett förhållande av 2 mgyml, varvid reaktionen stoppades. Till denna reaktionslösning sattes 100 pl av en fosfatbuffertlösning, i vil- ken kaliumjodid lösts upp i ett förhållande av 10 mg/ml. Man under- kastade omedelbart den bildade lösningen en gelfiltrering med an- vändning av Sephadex G-50 för att separera 125I-märkttä-L-antigen och 1251. Den specifika radioaktiviteten hos det bildade 1251- märktatä-L-antigenet var 80 pcfiflg.

Det 1251-märkta<Å-L-antigenet kan användas som ett reagens i RIA- metoden. Området för påvisande av G-L-antigen varierar mellan 10 ng - 600 ng/ml och området för påvisande avñ¿L-antikropp varierar mellan 30 ng - 1 000 ng/ml.

Exempel 12 Man löser G-L-antikroppen enligt exempel 8 i 0,04-molar fosfat- buffertlösning (pH 7,4) och ställer in den bildade lösningens proteinkoncentration till 1 mg/ml. Till 10 pl av denna lösning sat- 125I tes 50Åpl av 1 mc -Na. Till lösningen sattes 10 pl av en lös- 448 032 14 ning, i vilken man löst upp kloramin T i fosfatbuffertlösningen i ett förhållande av 1,5 mg/ml och den bildade lösningen omrördes 30 sekunder. Till lösningen sattes 100 ul av en fosfatbuffertlös- ning, i vilken man löst upp natriummetabisulfit i ett förhållande av 2 mg/ml, varvid reaktionen kan stoppas. Till denna reaktions- lösning sattes en fosfatbuffertlösning, i vilken man löst upp ka- liumjodid i ett förhållande av 10 mg/ml. Man underkastade den bil- dade lösningen en gelfiltrering med användning av Sephadex G-50 för att separera 125I-märkt Å-L-antikropp och 125 aktiviteten för den erhållna 125 pcfipg.

I. Den speöifika radio- I-märkta M-L-antikroppen var 70 Denna 125I-märkta N-L-antikropp kan användas som ett reagens för pâvisande i RIA-metoden. Reagenset visade att området för påvisan- de av M-L-antigen varierar mellan 10 ng - 600 ng/ml och att omrâdet för pâvisande av M-L-antikropp varierar mellan 30 ng - 1 000 ng/ml.

Exempel 13 Agaros löstes med värme i en 0,01-molar tris-klorvätesyrabuffert- lösning med ett pH-värde av 7,5 (inkluderande 0,15 M natriumklorid och 0,1% natriumnitrid), så att lösningen innehöll 1,2% agaros. 80 ml av agaroslösningen kyldes till ca 56°C och tillsattes med om- röring 20 ml av M-L-antikropplösningen enligt exempel 3. Lösningen hälldes i plastkärl och fick därefter svalna, varvid man erhöll en agarosgelplatta med en tjocklek av 1 mm, som innehöll Kñ-L-anti- kropp. Pâ denna platta anbringades hål med en diameter av 3 mm med regelbundna mellanrum för prover. Den bildade produkten kan använ- das som ett reagens för pâvisande i SRID-metoden.

Exempel 14 Man upprepade samma förfaranden som de som beskrives i exempel 13 med undantag av att man använde det i exempel 2 framställda ü-L- -antigenet i stället föreÄ-L-antikropplösningen, varvid man erhöll en agarosgelplatta med en tjocklek av 1 mm innehållande M-L-anti- gen.

Den bildade produkten kan användas som ett reagens för pâvisande i SRID-metoden.

(Ip 448 032 Försök 1 Försök utfördes för pâvisande avfï-L-antigen från serum vid olika leversjukdomar, HBS antigen-positiva bloddonatorer och normal människa. Detta påvisande utfördes medelst MO-metoden med använd- ning av den i exempel 3 framställda.H-lfantikroppen och medelst SRID-metoden för användning av det i exempel 13 framställda reagen- set.

Resultaten är angivna i följande tabell.

Antal Antal exempel, i vilka4Z-L- sjukdoms- antigen påvisades Diagnos exempel M0-metod SRID-metod Levercancer 39 9 24 Levercirros 35 6 10 Kronisk hepatit ' 40 3 3 Akut hepatit 40 4 10 HBS antigen-positiv bloddonator 20 0 O Normal människa 20 0 0 Försök 2 Försök utfördes för att påvisa Ä-L-antikropp i serum vid olika le- versjukdomar eller normala människor medelst SRID-metoden med an- vändning av det i exempel 14 framställda reagenset och medelst M0- metoden med användning av det i exempel 1 framställda reagenset.

Resultaten är angivna i följande tabell.

Antal Antal exempel, i vilka.fi-L- sjukdoms- antigen påvisades Diagnos exempel MO-metod SRID-metod Levercancer 39 1 2 Levercirros 35 6 7 Kronisk hepatit 40 0 2 Akut hepatit 40 4 6 Normal människa 40 1 3 448 032 "_ 16 Försök 3 Försök utfördes för pâvisande avïí-L-antigen i serum vid olika leversjukdomar eller normala människor medelst SRID-metoden med användning av det i exempel 13 framställda reagenset och medelst IES-metoden med användning av det i exempel 3 framställda reagen- set.

Resultaten är angivna i följande tabell.

Antal Antal exempel, i vilka.ä-L- sjukdoms- antigen pâvisades Diagnos! exempel SRID-metod IES-metod Levercancer 40 21 19 Levercirros 52 15 14 Kronisk hepatit 78 15 15 Akut hepatit 441- 17 13 Normal människa 50 0 0

Claims (8)

1,-, 448 032 _âEšBLEšš!

1. d-L-antikropp till användning som reagens för bestämning av a-L-antikropp och d-L-antigen k å n n e t e c k n a d av att den motsvarar u~L-antigen med följande fysikaliska egenskaper 1) Molekvlviktz ca 1 000 000 [det elueras i ungefär samma frak~ tion som Igß (molekylvikt ca 900 000 - 1 000 000) med en kromatografikolonn med Biogel A-1.5 m (varumärke för Biored Laboratoríes)]. 2) Elektrofores-rörlighet: ß-az globulinområde (detta är ett mellanliggande värde mellan HBs antigen och a-feto- protein). 3) Isoelektrisk punkt: PI = 5,04 (aktivitet för a-L-antigen visades inom området 4.22 » 5.68) genom bestämning med en Ampholíen-kolonn. 4) Plvtdensitet: d = 1.08 g/ml i cesiumkloridlösning och d = 1.03 g/ml i sackaroslösning. 5) Bildning av komplex: med dextransulfat i närvaro av magne- 5 siumklorid bildas ett komplex. som faller ut och visar lipo- - ' proteinartade egenskaper. 6) Färgning: precipitationslinjen av m-L-antigen/antibody i agargel kan färgas med Sudan black B. 7) Termostabilitet: antigen-egenskaper i serum bibehålles 30 minuter vid 56°C. 8) Form (som ett antigen/antibody~komplex): sfärisk partikel med en diameter av ca 300 A. vilket a-L-antigen kan erhållas genom gradientcentrifugering av serum eller ascites. innehållande d~L-antigen. uppsamling av en fraktion med en flytdensitet mindre än 1.1 g/ml och rening av fraktionen genom en kombination av utsaltning. elektrofores, gelfiltrering. affinitetskromatografering, iso- elektrisk fokusering. ultrafiltrering. Cohn's fraktion, dextransulfatrening eller ett sätt som innefattar tillsättning av antikroppar mot föroreningar andra än u-L~antigen för att avlägsna föroreningarna. 448 032 18

2. Sätt'att framställa u~L-antikropp. som motsvarar ett a-L-antigen med följande fysikaliska egenskaper 1) Holekylviktz ca l 000 000 [det elueras i ungefär samma frak- tion som IgH (molekylvikt ca 900 000 - 1 000 000) med en kromatografikolonn med Biogel A-1.5 m (varumärke för Biored Laboratories)]. 2) Elektrofores-rörlighet: B-az globulinområde (detta är ett mellanliggande värde mellan Hßs antigen och a-feto- protein).

3. ) Isoelektrisk punkt: PI = 5.04 (aktivitet för a-L-antigen visades inom området 4,22 - 5,68) genom bestämning med en Ampholien-kolonn.

4. ) Flytdensitet: d = 1.08 q/mt i cesiumkloridlösning och d = 1.03 q/nl i sackaroslösning.

5. ) Bildning av komplex: med dextransulfat i närvaro av magne- siumklorid bildas ett komplex. som faller ut och visar lipo- proteinartade egenskaper.

6. ) Färgning: precipitationslinjen av a-L-antigen/antibody i agargel kan färgas med Sudan black B.

7. ) Termostabilitet: antigen~egenskaper i serum bibehålles 30 minuter vid 56°C.

8. ) Form (som,ett antigen/antibody-komplex): sfärisk partikel med en diameter av ca 300 Å. k ä n n e t e c k n a t av att man immuniserar ett djur. dock ej människa. med a-L-antigen eller a-L-antigen I a-L- -antikropp-komplex och uppsamlar antiserum från djuret. fb”