SE448190B - Sett att bestemma fc-dels-bindande bakteriella polypeptider - Google Patents

Description

448 190 uppvisar speciesvariation inom respektive bakteriesläkte.

Under senare är (Inganäs M et al; Scand J Immunol 14 (1981) s 379-88 och Erntell M et al; Scand J Immunol 17 (1983) s 201-9) har det visats, att dessa proteiner förutom den Fc-bindande förmågan även kan ha en alternativ men svag Fab-bindande förmåga (= alternativ reaktivitet). Den senare anses vara oberoende av immunglobulinklass. variationer i bindningsförmága förekommer bl a mellan olika species och mellan Ig härstammande från olika cellkloner. De största variationerna har upptäckts i Fab-bindande förmåga. Den exakta biologiska betydelsen av dessa reaktiviteter är ännu ej känd, men man misstänker, att den kan vara relevant för patogeniciteten (Forsgren A; Infect & Immunity 2 (1970) s 672-3 och Forsgren A; Acta Path Microbiol Scand Sect B 80 (1972) s 564-70).

Praktiskt har man utnyttjat Protein A på många olika sätt, och det anses att andra bakteriella polypeptider med Fc- bindande förmåga potentiellt skall kunna utnyttjas analogt.

För Protein A finns det ett stort antal studier, som visar att perfusion och àterföring av plasma från tumörpatienter (Terman DS et al; N Eng J Med 305 (1981) s 1195-) eller försöksdjur (Terman DS et al; J Immunol 124 (1980) s 795- och Science 209 (1980) s 1257-) över fastfasbunden Protein A kan leda till signifikant regression av tumörer. Eftersom Protein A i sig kan förorsaka starka biologiska reaktioner, är det väsentligt, att man har kontroll på eventuellt Protein A-läckage under en perfusion. Det är således mycket viktigt, att man, med känsliga och specifika metoder, kan bestämma Protein A-föroreningar i preparationer som inne- håller immunglobuliner.

En bestämningsmetod för detta ändamål är tidigare känd (Langone J J et al; J Immunol Meth 63 (1983) s 145-57).

Metoden utnyttjar ett kompetitivt system, i vilket märkt och omärkt Protein A får konkurrera med varandra om höns anti- Protein A antikropp, varefter det bildade immunkomplexet 448 190 fälles med ammoniumsulfat eller F(ab!)2 kanin IgG anti-höns IgG. Metoden ger interferens med serum från djur vars IgG binder starkt till Protein A (exempelvis human- och hund-IgG).

Den är därför olämplig att använda för karaktärisering av preparationer, som innehåller dessa djurs immunglobuliner.

Speciellt stora krav på metoden krävs, om en studerad prepa- ration är avsedd för parenteralt bruk.

Interferensen som nämns ovan beror på att Fc-delen av provets IgG binder till märkt Protein A. Denna bindnings- förmàga finns kvar oberoende av om provet spädes eller ej.

Ett syfte med uppfinningen är att erbjuda en bestämningsmetod, i vilken den ovan nämnda Fc-interaktionen på ett enkelt och praktiskt sätt är minimerad. Ett andra syfte är, att erbjuda en bestämningsmetod som har förbättrad precision, sensitivi- tet och selektivitet. Ett tredje syfte är, att möjliggöra läckagestudier hos en affinitetsadsorbent, vilken, som aktiv substans, har den aktuella polypeptiden. Ett fjärde syfte är, att erbjuda antikroppar, som är specifika för en poly- peptid av den aktuella typen, och som binder till densamma under betingelse vid vilka serumimmunglobuliner (företrädes- vis humant IgG) inte gör det. Ett femte syfte är att erbjuda en bestämningsmetod för sådana immunglobuliner, som via sin Fab-del uppvisar en stark interaktion med den aktuella typen av polypeptid, företrädesvis med en epitop som svarar mot den alternativa reaktiviteten. Med stark interaktion avses att den sker vid pH < 3,5, s k högaffina antikroppar. Ett sjätte syfte är ett förbättrat sätt att binda polypeptiden till Fab-delen av ett mammalíe Ig.

Uppfinningen innebär en förbättring av tidigare kända metoder för att bestämma Protein A.

Uppfinningen utnyttjar antikroppar mot den aktuella poly- peptiden. Det har under många år varit oklart om sådana kan finnas. Detta har speciellt diskuterats för Protein A (se 448 190 t ex Lind I & Mansa B; Scand J Immunol 3 (1975) s 147-56).

Resultat som vi har erhållit tyder pà, att uppfinningens antikropp företrädesvis binder till polypeptiden via epi- toper, som är identiska eller mycket näraliggande med dem, som utnyttjas i den alternativa reaktiviteten. Sådana antikroppar kan betraktas som immunglobuliner mot vilka polypeptidens alternativa reaktivitet är ovanligt stark.

En aspekt av uppfinningen är en immunologisk bestämnings- metod, vilken i sin generella typ är tidigare känd. Det nya är, att man utför immunreaktionen mellan en epitop hos polypeptiden och en däremot riktad antikropp under beting- elser, vid vilka polypeptidens förmåga att reagera med övriga immunglobuliner i provet är undertryckta (poly- peptid-Fc-interaktionen). Antikroppen som utnyttjas i reaktionen är vald, så att den i reaktionsblandningen enbart via sin Fab-del kan reagera med polypeptiden.

Ett stort antal generella typer av immunologiska bestämnings- metoder ärli och för sig kända och potentiellt användbara i uppfinningen.

Immunologiska bestämningsmetoder utnyttjar immunreaktanter för bildning av ett immunkomplex, vars bildning utgör ett mått på att en immunologisk motpart till en tillsatt reaktant funnits närvarande i ett prov. För att underlätta kvantifi- ering och detektion tillsättes ofta en av reaktanterna i märkt form, d v s försedd med en analytiskt indikerbar grupp. De tillsatta mängderna av reaktanter avpassas, så att mängden märkt reaktant, som inkorporeras i komplexet eller finns kvar i fri icke-komplexbunden form, utgör ett mått på det som skall bestämmas. 448 190 Ett sätt att indela metoderna är i homogena och heterogena metoder. De homogena innebär att märkt reaktant bestämmes utan att komplexbunden märkt reaktant fysiskt separeras från icke-komplexbunden. De homogena metoderna utnyttjar markörer, som förändrar sin aktivitet beroende på om de föreligger i komplexbunden form eller ej, och man kan alltså mäta signalen från en reaktionsblandning, som innehåller markören i båda formerna, och från det så erhållna mätvârdet dra slutsatser om mängden av det som skall bestämmas. De heterogena metoderna innebär att komplexbunden märkt reaktant fysiskt separeras från icke-komplexbunden. I de heterogena metoderna har man ej något krav pâ aktivitetsförändringar i markören. Separa- tionen möjliggörs, genom att den ena av de två formerna av märkt reaktant är bunden eller bindes till en fast eller annan i reaktionsblandningen olöslig fas, vilken lätt kan separeras från vätskefasen. Den analytiskt indikerbara gruppen bestämmes sedan i endera eller båda av de tvâ faserna.

Ett annat sätt att indela metoderna är i kompetitiva och icke-kompetitiva metoder. I en kompetitiv metod arrangeras, så att två reaktanter, som har en gemensam epitop, får tävla om ett underskott av homologa bindningsställen pà en immuno- logisk motpart._Vanligtvis är systemen valda så att kompeti- tionen sker mellan det som skall bestämmas och en märkt eller fast-fasbunden variant därav. Mängden, som bindes till den immunologiska motparten, utgör ett mått på det som skall bestämmas. I en icke-kompetitiv metod väljes reaktanter så att kompetition ej kan ske. Bland icke-kompetitiva metoder märks speciellt de s k “sandwich"-systemen.

Ett tredje sätt att indela metoderna är i fällnings- och icke-fällningsmetoder. I den förra får immunreaktionerna först ske i homogen vätskefas, varefter det bildade immun- komplexet fälles med hjälp av ett precipiterande agens, såsom polyetylenglykol, antiserum eller fast-fasbunden antikropp (varvid tillses att antiserumet eller den fast- fasbundna antikroppen ej är riktad mot den reaktant som är märkt). ' 448 190 Ett fjärde sätt att indela metoderna är enligt markörgruppen och man har då radio-, enzym-, fluorescent-, kemiluminiscent-, enzymsubstratimmunologiska etc metoder.

Blandningar av monoklonala antikroppar med olika specifi- citet och olika affinitet kan ge fördelar i immunologiska bestämningsmetoder. Sålunda kan ett ändligt antal, t ex 2 - 5, blandas och användas som ett antikroppsreagens.

I immunologiska bestämningsmetoder kan i vissa fall anti- kroppar och antigener ersättas med andra reaktanter, som uppvisar biospecifik affinitet gentemot varandra.

Med nuvarande kunskaper utnyttjas i uppfinningen helst kompetitiva system av heterogen typ.

Speciellt gäller för uppfinningen, att lämpliga kompetitiva system skall utnyttja konkurrens mellan märkt och omärkt analyt om bindningsställena på den homologa antikroppen, som eventuellt är fast-fasbunden.

Provet på vilket uppfinningen kan appliceras kan vara ett serum- eller plasmaprov. Det kan vara preadsorberat med det som skall bestämmas, taex med Protein A eller G i fastfas- bunden form, såsom i en ektrakorporal shunt, eller med en annan lämplig affinitetsadsorbent. Det kan även vara en immunglobulinpreparation eller annan preparation i vilken man misstänker förekomst av det som skall bestämmas, t ex av polypeptiden eller dess högaffina-antikropp.

Enligt uppfinningen kontaktas provet, eventuellt spädd med lämplig buffert, med minst den ena av märkt analyt eller polypeptidens homologa antikropp. I senare steg kan ytter- ligare immunreaktanter tillsättas, såsom antikroppar riktade mot någon av de först tillsatta reaktanterna. För antikroppar, vilka utnyttjas i uppfinningen, användes lämpligen sådana vars Fc-del i) ej reagerar med polypeptiden (i märkt eller omärkt form) på ett för testet störande sätt 448 190 eller ii) avlägsnats eller inaktiverats. Som antikroppar kan man t ex utnyttja de väldefinierade immunglobulinfragmenten Fab, Fab' eller F(ab')2. Även genom att välja antikroppen från speciella immunglobulinklasser, cellkloner och djurslag kan interaktionen undvikas. Uppfinningens antikroppsprepara- tioner uppvisar en specificitet, affinitet, aviditet och titer som deras användning enligt uppfinningen erfordrar. De kan vara adsorberade för att uppnå önskad specificitet. De kan t ex vara en IgG-preparation av antikroppen. De kan föreligga i torkad form, såsom frys- eller spraytorkad form.

Den kan vara rekonstituerad i en buffert och förpackad tätslutande. En sådan förpackning kan ingå i ett testkit.

En aspekt av uppfinningen är antikroppar med specificitet mot den aktuella polypeptiden, företrädesvis mot epitoper som svarar mot den alternativa reaktiviteten. Dessa kan framställas medelst immunisering på i och för sig känt sätt.

Detta innebär att lämplig polypeptid tillsammans med ett adjuvant injiceras på ett varmblodigt ryggradsdjur. Vanliga djur är fåglar, t ex hönsfâglar som höna, och däggdjur, t ex råtta, kanin, får, hund, häst etc. Efter det att ett immuni- seringsschema utförts, kan man från djurets blod och hos fåglar även ur deras ägg, utvinna antikroppar. Dessa kan IS-renas (immunosorbentrenas) på i och för sig känt sätt, så att man erhåller den renhet som krävs av en planerad bestäm- ningsmetod. I samband med uppfinningen har mycket goda immunsvar erhållits för djurslag, vars immunglobuliner generellt uppvisar en relativt låg reaktivitet (Fab-reak- tivitet) mot en avsedd bakteriell polypeptid. Sålunda är det fördelaktigt att immunisera kanin eller höna, men även andra djur såsom get kan vara användbara. Vi har erhållit speciellt goda resultat, när vi immuniserat med polypeptiden komplex- bunden till ett Ig, vars Fc-del binder starkt till poly- peptiden (t ex Protein A - hund IgG - komplex).

Som alternativ kan man efter det att djuret immuniserats isolera dess lymfocyter och utnyttja dem för s k monoklonal teknik (Köhler & Milstein C; Nature 256 (1975) s 495). Man kan på det sättet erhålla s k monoklonala antikroppar med 448 190 lämplig specificitet och affinitet. Sådana antikroppar kan sedan användas antingen som s k enkla monoklonaler eller som sammansatta monoklonaler. Det senare innebär blandningar av två eller flera monoklonala preparationer med specificitet för olika determinanter och/eller med olika affinitet.

Med antikropp enligt uppfinningen avses givetvis den intakta antikroppen, såväl som olika fragment och derivat därav, som uppvisar antikroppsbindande förmåga mot sitt homologa antigen. ' Om antikroppen är riktad mot epitoper på polypeptiden, som ej ingår i den Fc-bindande regionen, kan den korsreagera med icke-Fc-bindande fragment av polypeptiden.

Uppfinningens antikroppar har en affinitetskonstant (uttryckt i mol/lit), som åtminstone är mindre än den som gäller mellan polypeptiden och motsvarande Fc-interagerande immun- globulin i provet. Uttryckes affinitetskonstanten i lit/mol gäller motsatsen. Konstanterna skall givetvis jämföras vid relevanta betingelser, d v s de som gäller för respektive utföringsform av uppfinningen.

Uppfinningens antikropp kan vara märkt med någon av de tidigare nämnda analytiskt indikerbara grupperna.

Uppfinningens antikropp kan användas för att isolera den aktuella polypeptiden eller Fab-reaktiva fragment därav.

Detta kan ske genom s k IS-rening.

För vissa varianter av uppfinningen kan man utnyttja s k fastfasbundna antikroppar. Att binda antikroppar till fasta faser och att använda dem i immunologisk bestämningsmetodik tillhör känd teknik (se t ex Wide L, in Radíoimmunoassay and related Procedures in Medicine Vol I (1978) s 143-54; IAEA).

Som exempel pà fasta faser kan nämnas partikulära hydrofíla och till gel svällbara men vattenolösliga matriser inne- hållande OH- eller NH2-grupper (exempelvis polyamider, 448 190 polysackarider, poly(hydroxyalkylakrylater) och motsvarande metakrylater etc). I sin olösliga form är uppfinningens antikropp kovalent eller adsorptivt bunden till en i vatten olöslig matris.

Immunreaktionen utföres som tidigare nämnts vid sådana be- tingelser att Fc-delen av provets immunglobuliner ej kan binda till polypeptiden eller dess märkta analog. Detta innebär som regel att pH skall ligga under 4, för t ex Protein A och Protein G under 3,5. pH får ej sänkas så att den avsedda antigen-antikroppsbindningen brytes. Detta innebär att pH skall väljas över ca 2,7, företrädesvis över ca 3,0. Lämpliga buffertsystem för pH 2,7-4,0 är de, som har hög buffertkapacitet i intervallet, och som ej stör immun- reaktionen. Som exempel kan nämnas citrat-, glycin-HCl- och citrat-fosfatbuffertar. Detta utesluter inte att även andra agens kan användas, vilka inhiberar den nämnda Fc-interak- tionen. Temperaturen bör som regel väljas i intervallet 10-40 °c.

Olika substanser kan störa i immunologiska testmetoder. Ofta beror detta på, att de har epitoper, som är riktade mot eller är gemensamma med analytens. Sålunda kan polypeptiden, dess högaffina homologa antikropp och motsvarande antiidio- typa antikropp störa varandras bestämning. Fackmannen avgör med försök risken för sådana interferenser. Han kan även avgöra hur det skulle påverka ett givet mätresultat.

Vid bestämning av s k högaffina antikroppar, som är riktade mot epitopen för den alternativa reaktiviteten, kan man som polypeptid använda ett polypeptidfragment, som har den alternativa reaktiviteten men saknar Fc-reaktiviteten.

Betingelserna för en sådan bestämning är i huvudsak desamma, som om en bakteriell polypeptid med båda reaktiviteterna användes. 448 190 10 I sin föredragna utföringsform utföres immunreaktionen mellan polypeptiden och dess antikropp vid ett pH som ligger betydligt under det normala, vilket är pH 6-9. Vid immuno- sorbentrening desorberar man vid pH ca 3 eller därunder, d v s antigen-antikroppsbindningen brytes under pH ca 3.

Protein A-IgG-komplex dissocierar vid pH ca 3-4. Uppfin- ningen bygger på att vi lyckats framställa antikroppar, som har specificítet mot polypeptiden och som uppvisar anti- kroppsaktivitet under betingelser vid vilka den aktuella polypeptidens generella Fc-reaktivitet är kraftigt sänkt.

Uppfinningen skall nu belysas med exempel. De tjänar enbart till att illustrera uppfinningen och är på intet sätt avsedda att begränsa densamma. 448 190 11 Exemgel 1 Kompetitiv metod som utnyttjar märkt Protein A och fastfas- bunden antikrogg Framställning av kanin-anti-Protein A.

Tre kaniner immuniserades genom intramuskulär injektion av en blandning av Protein A (Pharmacia AB, Uppsala, Sverige) och hund-IgG (isolerad genom affinitetskromatografi på Protein A Sepharoseø (Pharmacia AB, Sverige) från hundserum); Under en period av sju veckor erhöll varje djur tre injek- tioner med 250 /ug Protein A/IgG-blandning som var emulgerad i lika volym av 50 % CFA/50 % IFA (CFA = Complete Freunds adjuvant, IFA = Incomplete Freunds adjuvant). En bostrings- injektion gavs efter 18 veckor. Kaninerna tappades på blod fr o m 20:e veckan (40 ml blod svarar mot 20 ml serum).

Under de följande åtta veckorna utfördes fem tappningar på varje kanin. Det uppsamlade materialet polades och svarade mot 290 ml anti-Protein A antiserum.

Rening av anti-Protein A 290 ml av anti-Protein A antiserum absorberades på fastfas- kopplad humant IgG och kanin IgG (kolonnvolymerna Sl ml resp 30 ml). Det absorberade antiserumet avsaltades på Sephadexø G-25 (Pharmacia AB, Sverige) och Ig-fraktionen renades med jonbyteskromatografi på DEAE-Sepharose® CL 6B (Pharmacia AB, Sverige) som var jämnviktad med 0,075 M Tris-HCl, pH 8,0.

Den oretarderade fraktionen uppsamlades och koncentrerades med ultrafiltrering till 116 ml x 11,9 mg = 1 380 mg Ig.

Materialet dialyserades sedan mot 0,1 M acetatbuffert pH 4,5 och digererades med pepsin (50:l w/w) i 16 timmar. Fab'2- fragment isolerades med gelfiltreríng på Sephadexß G-100 (Pharmacia AB, Sverige) och gav totalt 757 mg Fab'2 anti- Protein A. Fraktionen av Protein A reaktiva Fab'2-fragment 448 190 12 renades med affinitetskromatografi på Protein A Sepharoseø (Pharmacia AB, Sverige). Efter avsaltning på Sephadexø G-25 (Pharmacia AB, Sverige) bestod det slutliga materialet av 25,4 mg Fab'2 anti-Protein A. Antikroppreparationen preci- piterade i immunelektrofores kommersiellt tillgängligt Protein A (Pharmacia AB, Sverige). Ingen reaktivítet erhölls mot normalsera från människa och hund.

Buffert 1 Som standarddiluent: 0,05 M fosfatbuffert pH 7,4, 0,5 M Nacl, 0,05 a Tween” 20, 0,05 e natriumazid.

Buffert 2 För inkubering, 0,3 M citrat buffert pH 3,2, 0,05 s. Tween” 20.

Standarder Protein A (Pharmacia AB, Sverige) rekonstituerades i l ml destillerat vatten. Vattenlösningen som erhölls späddes med standarbuffert till koncentrationerna 500, 100, 50, 10, 5 och 1 /ug Protein A/1.

Jodering av Protein A Protein A joderades med Kloramin-T-metoden (Hunter och Greenwood; Nature 194 (1962) s 495- ). Den erhållna speci- fika aktiviteten var approximativt 1,94 mBq//ug Protein A.

Koncentrationen 4,5 mg/1.

Sephadexw med därtill bunden antikropp Ultrafin Sephadexø G-25 (Pharmacia AB, Sverige) med en partikelstorlek av 1-10 /um aktiverades med BrCN (enligt Axên R et al; Nature 214 (1967) s 1302-1304. Till 100 mg aktiverad Sephadex G-25 kopplades 100 /ul antiserum (0,39 mg 448 190 13 Fab'2 anti-Protein A) (enligt den metod som beskrivits av Wide L; Acta Endocrinologica suppl 142 (1969) s 207-221).

Testproceduren Till vart och ett av teströren sattes 0,2 ml märkt Protein A (1 ng 1251 -Protein A), 0,05 ml Protein A standardlösning eller 0,05 ml ospätt patientserum och 0,2 ml av antikropp- suspensíonen som innehöll 100 mg/1 av Sephadexø med därtill bunden antikropp. Antikroppssuspensionen såväl som den märkta Protein A-preparationen var spådd i citratbufferten.

Alla proven (rören) kördes i duplikat. Rören skakades i fyra timmar eller över natt vid rumstemperatur. Partiklarna tvättades tre gånger med 0,9 % NaCl genom centrifugering och avsugning.

Beräkning av resultat Medelvärdet counts för standard utan Protein A (Bo) beräk- nades. Antalet counts (Bx) för varje standard med Protein A uttrycktes sedan i procent av Bo. Standardkurvan kunde sedan konstrueras genom att man semilogaritmiskt avsatte antalet counts för standarderna som procent av Bo mot Protein A- koncentrationerna. Medelvärdet counts för varje okänt prov uttrycks sedan som procent av Bo och koncentrationen av Protein A kan således läsas från standardkurvan. (Bx/Bo) x 100 för respektive standard redovisas i tabell 1A. Ur standardkurvan kan en nedre detektionsgräns för Protein A på 1 /ug Protein A/l definieras.

Den exemplifierade testvariantens funktion i närvaro av humant IgG Kända mängder Protein A sattes till human plasma och testades i den nyss exemplifierade varianten av uppfinningen. Resultat se tabell IB. Inga signifikanta skillnader erhölls i stan- dardkurvans lutning eller i sensitivitet vilket indikerar att närvaron av stora mängder normal humant Igq ej påverkar testets karakteristika vid pH 3,2. 448 190 14 Testet utfördes vid olika pH. Under pH 3,0 skedde ej någon immunreaktion. Vid pH över 3,5 interagera: det märkta 0 snabbt sjunker till noll (jämför J Immunol 63 (1983) s 145-57).

Protein A:et med serum immunglobuliner så att B Plasma från blodgivare adsorberades till Protein A Sepharose® (Pharmacia AB, Sverige) varefter adsorberat IgG frisattes från adsorbenten genom stegvis sänkning av eluentens pH (4,5, 4,0, 3,5, 3,0 och 2,7-2,8). I plasmafraktionen som eluerades vid pH 2,7-2,8 men ej över pH 3,0 kunde en faktor som verkade inhiberande i testvarianten detekteras för 50 % av blodgivarna. Att faktorn verkade inhiberande innebar att den resulterade i för höga Protein A-värden. Allt tyder på att det är fråga om en anti-Protein A antikropp med hög affinitet. Den bör ej förekomma i IgG-preparationer eller andra plasmafraktioner som frisatts från eller fått passera Protein A adsorbenter vid ett pH som ligger över dissocia- tions-pH för Protein A-IgG. I andra testvarianter behöver faktorn ej inhibera reaktionen mellan Protein A och dess antikropp. Detta gäller bl a sådana system som utnyttjar överskott av anti-Protein A antikropp (t ex "sandwich"- system).

Desorptionsförsöket ovan visar att anti-Protein A anti- kroppar kan finnas som binder till Protein A vid pH ca 2,75. Även sådana kan användas enligt uppfinning. 19) m 448 190 15 Tabell 1 A och B Standardkurva för Protein A i serum och buffertsystem (pH 3,2) i omrâdet 1-500 ,uq/l A B Buffertsystem Serum Protein A ( gå ) % ( EE ) % (/ug/1) Bo Bo 1 98,3 98,0 5 95,1 89,5 10 89,0 83,5 50 _ 61,2 55,5 100 41,4 38,5 500 9,6 11,5 448 190 16 Exempel 2 f! Dubbel antikropp fast fas metod (DASP) för bestämning av Protein A 9,1 Antikroppen med specificitet för Protein A (Fab'2 anti- Protein A), Buffert l, Buffert 2, standarder och jodmärkt Protein A från Exempel 1 användes. 2A 2B Koppling av får-anti-kanin-IgG antikroppar till BrCN- aktiveras agaros Agarospärlor (0,5-5 /u, Pharmacia AB) BrCN aktiverades (enligt Axén R et al; Nature 214 (1967) s 1302-1304) och sögs av på flasfiltertratt. 8 g aktiverad gel blandades med 4 mg får-anti-kanin-antikroppar i 36 ml 0,1 M NaHCO3 och inkuberades på skak över natt i +4 OC varefter reaktionsblandningen centrífugerades 10 min i 2000 x g och supernatanten sögs av. Därefter tvättning med 40 ml 0,1 M Trisbuffert + 1 M NaCl, pH 8,1 i 10 min centrifugering och avsugning. Inkubering med 40 ml acetatbuffert + 1 M NaCl, pH 4,0 i 10 min centrifuge- ring och avsugning. Inkubering med 40 ml 1 M etanolamin -HCl, pH 9,0 i 1 timme centrifugering och avsugning.

Ovan beskrivna Trisbuffert och acetatbuffert tvättar upprepades 2 ggr. 40 ml 0,05 M fosfatbuffert + 1 M NaCl + 0,01 M EDTA + 0,05 % Tween 20 tillsattes och inkube- rades 10 min. Därefter följde centrifugering och avsugning. Fosfatbufferttvätten upprepades 2 ggr. Gelen späddes upp till 0,3 g/ml i fosfatbuffert och ultra- ljudbehandlades.

Bestämning av Protein A m Till vart och ett av teströren sattes 0,2 ml märkt Protein A (enligt 1) spådd 1000 ggr i buffert 2. fr! 448 190 17 0,05 ml av standardlösningarna innehållande 500, 100, 50, 10, 5 och 1 /ug/1 spädda i human plasma sattes till rör 1-12 och till ett antal rör sattes ospätt patient- serum. 0,2 ml av antikroppen spådd 10000 ggr i buffert 2 sattes till alla rör. Blandningen inkuberades på skak i 4_timmar. 2 ml av den spädda gelen från 2A spädd 60 ggr till- sattes och inkuberades stillastående vid rumstemperatur 1 timme. Centrifugering 10 minuter vid 3000 v/min.

Dekantering. Rören placeras i gammaräknare. Antalet counts per tídsenhet för standardlösningarna beräknas i % av Bo provet och införes i lin log diagram från vilket mängden Protein A i ett okänt testprov kan beräknas.

Tabell ZA ¿ Standardkurva för Protein A i plasma (pH 3,2) i området 1-500 /ug/l.

Protein A (/ug/1) (Bx/Bo)x % 500 36,1 100 61,0 50 73,2 10 89,9 5 93,0 1 99,2 Uppfinningen framgår av bifogade patentkrav som utgör en del av beskrivningen. |\

Claims (1)

1. 448 190 18 Patentkrav »z Sätt vid immunologisk bestämning av i) en bakteriell polypeptid med förmåga att binda till Fc-delen av ett immunglobulin och/eller ii) polypeptidens högaffina 41 homologa antikropp k ä n n e t e c k a t av a) att man använder en antikropp, som är riktad mot polypeptiden och som uppvisar antíkroppsaktivitet vid ett pH-värde som är lägre än 4,0, varvid Fc-delen väsentligen ej binder till polypeptiden, samt b) att man utför immun- reaktionen mellan antikroppen och motsvarande poly- peptid vid ett sådant pH-värde. Sätt vid immunologisk bestämning enligt krav 1, k ä n n e t e-c k n a t av att man använder en anti- kropp som är riktad mot en polypeptid vald ur gruppen Protein A och Protein G. Sätt vid immunologisk bestämning enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att man utför immunreak- tionen vid ett pH som ligger under ca 3,5. Sätt vid immunologisk bestämning enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av att en kompetitiv immunologisk bestämningsmetod utnyttjas. Sätt vid immunologisk bestämning enligt något av kraven

1. - 4, immunologisk bestämningsmetod utnyttjas. k ä n n e t e c k n a t av att en heterogen m.