SE453514B - Sett att bestemma deoxitymidinkinas-dtk-isoenzymnivaer i kroppsvetska eller cellprov och anvendningen av forfarandet for isoenzymtypning - Google Patents
Sett att bestemma deoxitymidinkinas-dtk-isoenzymnivaer i kroppsvetska eller cellprov och anvendningen av forfarandet for isoenzymtypningInfo
- Publication number
- SE453514B SE453514B SE8203041A SE8203041A SE453514B SE 453514 B SE453514 B SE 453514B SE 8203041 A SE8203041 A SE 8203041A SE 8203041 A SE8203041 A SE 8203041A SE 453514 B SE453514 B SE 453514B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- dtk
- isoenzyme
- concentration
- substrate
- serum
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 47
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 16
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 8
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 6
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 5
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 4
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 4
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 4
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003622 anti-hsv Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 2-(3-chlorophenyl)-3-methylmorpholine Chemical compound CC1NCCOC1C1=CC=CC(Cl)=C1 BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000004068 Morbillivirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010037151 Psittacosis Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003602 anti-herpes Effects 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 1
- 238000007449 liver function test Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000901 ornithosis Diseases 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- -1 thymidine anion Chemical class 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
453 514 2 d'l'k-isoenzym- medierad dT-omvandling till dTmp (deoxitymidinmonofosfat), som utövas av dT-analogen Zßdeoxi-.S-joduridin (lUdR), har varit känd sedan lång tid. användning av radioaktivt märkt lUdR direkt som substrat för att ge hög känslighet i bestämningar av virala dTk-enzymer har visats av oss (Gronowitz d: 5 Källander, Infec. immun. 29:425, 1980).
Som nämnts är förekomst *av dTk-F i celler kopplad till cellproliferation och saknas mer eller mindre i den differentierade cellen (Mundi-Petersen å; Tyrsted, Biochim. Biophys. 4789614, 1977). Studier av dTk-aktiviteten i transplan- terbara mustumörer har avslöjat höga d'l'k-aktiviteter med korrelation till 10 tillväxthastigheten (Bresnick et al, Cancer Res. 29:l932, 1969, och Cancer Res. 31943, 197 ). Rapporter på senare tid har visat förhöjt dTk-F i perifera blodlym ocyter hos vissa patienter, som lider av maligna non-Hodgkins lymfom och lymfatisk leukemi (Ellims et al, Cancer Res. 4l:69l och Brit. J. Haematol. 49:479, 1981). Dessa forskare har också visat förhöjda serum dTk-nivåer hos vissa is patienter u: non-Hødgkans-gfuppen (Emm a: al, ßiaoa same, mi). susanna på den använda konventionella dTk-bestämningsmetoden, som utnyttjar 3l-l-d1' i hög koncentration (5xi0'6M), kunde dTk-aktivitet återfinnas endast hos några få patienter med långt framskriden sjukdom. Vidare kunde dTk-aktiviteten endast utvärderas som en prognostisk markör om differentialanalys avseende dTk-VF och 20 dTk-A utfördes.
Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett förfarande, som gör det möjligt att påvisa mycket låga dTk-isoenzymnivåer i kroppsvätskor eller cellprov från människa eller djur. Enligt uppfinningen uppnås detta genom att förfarandet givits de i patentkraven angivna kännetecknen. Förfarandet kan användas som ett 25 instrument för diagnos av vissa virusinfektioner och maligna tumörer, inklusive övervakning av sjukdomarna i olika syften. Uppfinningen erbjuder sålunda ett känsligt bestämningssystem, som är kapabelt att detektera mydret små mängder av i serum, spinalvätska och vesikelvätska och även är utxformat för att minimera bidraget av cellulärt dTk-A. 30 Förfarandet kan bl.a. användas a i samband med tumörsjukdomar för påvisande och prognos b i samband med tumörsjukdomar för kontinuerlig övervakning av ändringar i sjukdomen, terapieffekter och påvisande av återfall c i samband med lungcancer av havrecelltyp vid utvärdering av metastaser 35 d i samband med leukemi för att utgående från närvarande dT k i spinalvätska bestämma om det finns metastaser i det cerebrospinala systemet . e i samband med virala sjukdomar som en gruppspecifik markör för vissa in- fektioner. ' _ '#0 Modifierat genom utbyte av ATP mot CT P och utnyttjande av förinkuba- tion av prov med herpesvirusspecifika dT k-blockerande antisera, kan förfarandet 10 15 20 25 30 35 äflväfldflS för att uppnå specifikt påvisande av herpesvirusspecifika dTk-enzymer som finns i serum eller vesikelvätska.
Föreliggande uppfinning är sålunda baserad på användning av ett nytt bestäm- ningssystem för påvisande av mycket små mängder av dTk-F i kliniska prov, t.ex. serum eller blåssekret. Konventionellt har dTk-aktivitet mätts genom att följa omvandlingen av antingen 3 H- eller wC-märkt d'l' till dTmp med ATP som fosfatgivare. Vi har nyligen utvecklat och optimerat ett dTk-bestämnlngssystem för virala dTk-isoenzymer, vilket utnyttjar 125 i-joddeoxiuridin (iUdR) som substrat (Gronowitz och Källander, infec. immun. 29:425, 1980). Den erhållna höga känsligheten medgav påvisande av dTk från så litet som 25 HSV-infekterade celler. i motsats härtill kräver för enzymbestämning ett test baserat på användning av BH-dT, vid en “normalt använd koncentration av 10", M, minst 050 gånger mera enzym (Gronowitz och Källander, lnfec. immun. 29:425, 1980). Även om det är användbart vid studier av virala dTk-enzymer (Gronowitz och Källander, J. Med. Virol. 8:177, 1981; Gronowitz et al, J. Clin. Microbiol. 13366, 1982; Källander et al, lnfec. immun. 36:30, 1982), var detta bestämningssystem inte lämpligt för långtidsförsök av cellulärt dTk-F, delvis beroende på detta enzyms instabilitet. Metodens oförmåga att påvisa närvaro av mycket små dTk- mängder i serum kan lätt utläsas av studierna av förekomsten av virus-dTk- blockerande antikroppar (dTk) (Gronowitz å: Källander, J. Med. Virol. 8:177, 1981; Källander et al, lnfec. immun. 36:30, 1982). Vid dessa studier undersöktes mer än 275 humansera med avseende på dTk ab, och närvaro av störande serum dTk-aktiviteter återfanns endast i två fall (GK 1981).
De två fallen föranledde uppfinning av ett nytt bestämnlngssystem, som är lämpligt för mätning av serum dTk-nivåer, vilket här beskrivs och patentsöks.
Studierna demonstrerade känsligt påvisande av serum- dTk-nivåer om ett l-lepes- buffertsystem, som saknar reaktiva primära amingrupper och har låg ionstyrka, används. Vidare befanns låg ATP-koncentration och en sammansättning av de övriga komponenterna såsom beskrivs i Tabell i vara optimala. Produktanaiyser vid dTk-test utfördes såsom tidigare beskrivits (Gronowitz å: Källander, lnfec. immun. 29:li25, 1980).
Detta nya bestämningssystem befanns inte endast vara känsligt och reproducerbart för dTk-F-bestäniningar, med linjära resultat under mer än två timmar, utan befanns' också ge 2-6 gånger högre omsättning med de virala dTk- engymerna. En annan viktig fördel, som inte kan uppnås i konventionella bestämningssystem, är den relativt låga omsättningen av dTk-A, beroende på användning av iUdR i låga_ koncentrationer som substrat, vilket ger minimalt bidrag från detta isoenzym vid mätning av dTk-F eller vlralt dTk 1 orenade prov. _ En variant av detta bestämnlngssystem, som använder CTP 1 stället för ATP som fosfatgivare, är användbar för specifik bestämning av herpesviruslndu- 453 ' ~ l0 l5 20 25 30 35 453 514 14 cerat dTk när prov som skall analyseras förinkuberas med antiherpesvirus-dTk- blockerande sera.
Vid förfarandet enligt uppfinningen bör koncentrationen av buffert- substansen vara mindre än 250 mM, företrädesvis mindre än 150 mM, speciellt ca 100 mM, varvid buffertsubstansen är väsentligen fri från reaktiva amino- grupper, särskilt är en HEPES-buffert. pH-värdet bör ligga i området 5-9, företrädesvis mellan 6,5 och 8, särskilt omkring 7,4. Substratet bör vara en radioaktivt märkt tymidinanaiog, företrädesvis en T-deoxi-S-halogenuridin, särskilt T-deoxi-S-joduridin, där märkningen företrädesvis skall vara en radioak- tiv haiogenisotop, särskilt 1251. Den totala substratkoncentrationen skall vara i omradet fran mo” :in sxifßm, företrädesvis meuan mo* een sxia'7M, 7M. Fosfatgivaren skall vara närvarande i en koncentration, som 2+ särskilt ca 10' inte överstiger 20 mM, företrädesvis mindre än 10 mM, särskilt 0,54: mM. Mg skall vara närvarande i åtminstone ekvimolär koncentration relativt fosfat- givaren, företrädesvis 2-8 gånger högre koncentration än fosfatgivaren. Ett reducerande medel såsom ditiotreitol bör också vara närvarande.
Tillämpningen av dessa bestämnihgssystem för att påvisa dTk-aktiviteter i kliniska prov, t. ex. serum eller blåssekret, gav oss ett nytt verktyg för diagnos av vissa virusinfektioner och maligna sjukdomar. Vidare befanns onormala serum- dTk-nivåer (> 10 enheter), erhållna med en enda dTk-bestämning med den beskrivna metoden, vara en utmärkt markör för prognostisk användning, och dTk- värden i serie befanns också vara värdefulla för övervakning av progressionen eller regressionen hos maligna sjukdomar. Vidare befanns hos dessa patienter dTk-nivåerna vara användbara som en markör av återfall och för utvärdering av terapieffekter, allt såsom exemplifieras nedan.
Detta bestämningssystem utnyttjar l25I-iUdR som föredraget substrat, som har visat sig vara en relevant substratanalog för d'i'k-bestämningar (Gronowitz år Källander, Infec. Immun. 29:23, 1980). I motsats till den tidigare beskrivna metoden ger det nya systemet en linjär omsättning av substratet för cellulärt dTk-F under mer än två timmar, och dessutom ökades detekterings- känsligheten dramatiskt, såsom framgår av Fig. i. Detta uppnåddes genom ett nytt och kritiskt buffertsystem, men även andra förändringar gjordes. Siutkon- centrationen av komponenterna i det nya bestämningssystemet ges i Tabell l, som även anger proportionerna av de olika använda lösningarna. I allmänhet består ett dubbelprov av 51,5 ul reaktionslösning som blandas med 6 ul substratlösning omedelbart före användningen. Reaktlonen startas sedan genom tillsats av 2,5 ul enzym. Fran denna standardvolym av totalt 60 ul tas två prov om vardera 25 ul.
Sammansättningen av försöksblandningarna för experiment bestående av flera dubbeiprov tagna efter olika inkubationstider bestäms genom att man multiplice- 10 15 20 25 30 35 \ rar volymerna av komponenterna i standardlösningen med det önskade antalet dubbelprover. Bestämningen utförs vid 3700, och alla komponenter förvärms i 2 minuter innan reaktionen startas. Enzymreaktionen avslutas genom pipettering av provet på ett lcmz stycke Whatman DEAE-8l-papper, som hålls vid 90-l00°C. För att uppnå separation av produkten från substratet tvättas papperet fyra gånger i 6 mM ammoniumformiatlösning, en gång i destillerat vatten och slutligen i metanol. Tvättningarna utförs i 1-liters glaskärl med magnetomrörning. 10-15 pappersskivor, som hålls i durkslag, behandlas sam- tidigt. Durkslaget förs till ett nytt tvättbad var femte minut. Slutligen räknas pappersskivorna i en automatisk gammaräknare.
För att eliminera dag-till-dagvariation i dTk-bestämningen omräknades erhållna reaktionshastigheter till enheter. Orsaken till att man använder enheter för att definiera enzymmängder är variationen i initial radiokemisk renhet, kombinerat med det funna biologiska sönderfallet av kommersiellt tillgängligt lzsl-lUdR, som gör total radioaktivitet tillsatt per prov irrelevant för enzym- aktivitetsberäkningar (Fig. 2). I stället inkluderades en intern biologisk kontroll, som mäter tillgänglig radioaktivitet, i varje bestämning. Denna kontroll var - hundra gånger överskott av en HSV-typ 2 dTk-beredning, vilket ger omfattande substratutarmning. Mängden radioaktivitet införlivad i en l-timmas bestämning genom denna kontroll befanns vara ca 8596 av värdena av intakt lzjl-lUdR beräknat från tunnskiktskromatografi. Med beaktande av den funna nivån (8596) för den biologiska kontrollen kommer en enzymenhet att vara den enzymmängd, som omvandlar 2,7xl0'15 betingelserna). Denna relation mellan enhet och approximativ molär omsättning l enhet praktiskt uttrycks som ca 1000 cpm, med den normalt moler substrat per timma (under de beskrivna valdes eftersom använda mängden isotop (Tabell I). En annan fördel isotopkontroll, när den bearbetas likadant som testproven, är att man eliminerar möjliga variationer i enheter beroende på variationer i produktåtervinning.
Proceduren för beräkningen av enheter exemplifieras i Fig. 3.' I Kvantifiering av serum-dTk med denna biologiska Bestämning av serum dTk-aktiviteter. utfördes i mikrotiterplattor. För var 20de serumprov inkluderades bakgrundskon- troller och intern substratkontroll (se ovan), och satsen behandlades sedan som en enhet. Använda serummängder var 5 ul (eller mindre) per 120 ul slutvolym, eftersom mera serum kan vara hämmande (Fig. b). Denna effekt beror troligen på närvaro av nukleotider eller nukleosider, som t. ex. tymidin, tymidintrifosfat, eller kataboliska enzymer, som förekommer i vissa sera. Dubbelprov togs efter 60 och 120 minuter. Medelomsättning, per timma och 25 ul prov, efter korrigering för bakgrund, beräknades från varje dubbelprov separat. Medel- hastighetsvärdet för provtagningen vid 60 och 120 minuter bestämdes sedan och 10 15 20 25 30 35 455 514 användes för ytterligare beräkningar (se ovan), om variationer ¿ 2096 påträffa- des.
Bestämning av dTk-aktiviteter i spinalvätska. Väsentligen samma proce- dur användes som för serum. Den specifika aktiviteten för 125 l-IUdR ökades till ca 320 Ci/mM. Spinalvätskor kan koncentreras före enzymbestämningar.
Kvalitativa bestämningar av dTk-isoenzymer. I princip kliniska prov, t.ex. vesikelvätskor eller serum, innehållande dTk-aktivitet förinkuberades med isoenzymspecifik dTk-blockerande antikropp och kvarstående enzymaktivitet bestämdes enligt det ovan beskrivna tillvägagångssättet.
Praktisk procedur. ATP i försöksblandningen ersattes med CTP, vilket resulterar i uteslutande av dTk-F aktivitet. De prov som skulle undersökas seriespäddes två gånger (vanligen med start vid 1:6) i reaktionslösning och 15 ul överfördes från varje spädning till fyra brunnar i en mikrotiterplatta för att uppnå fyra identiska spädningssatser. Förutspätt VZV- dTk-blockerande serum (25 ul) sattes till en sats, ett HSV typ l dTk-blockerande serum till en andra sats, ett HSV typ 2 dTk-blockerande serum till en tredje brunn och till den sista satsen ett negativt serum. Blandningarna inkuberades vid 37°C i 90 minuter, vilket tillät enzym-antikroppsreaktionerna att ske. Därefter bestämdes de kvarstående enzymaktiviteterna. Reaktionen startades genom tillsats av 20 ul, sammansatt av 6 ul substratlösning blandad med ll: ul reaktionslösning. varje spädning beräknades de erhållna värdena i närvaro av de olika antisera som procent av de värden, som erhölls med det negativa serumet. Exempel på sådana kvarstående enzymaktiviteter, plottade mot zlog-spädningen av proven, visas i Fig. 5. Från hämningsmönstren kan dTk-typen lätt etableras (se även Tabell 2).
De följande exemplen är avsedda att ytterligareillustrera uppfinningen, utan ag på något sätt begränsa densamma.
Ett viktigt särdrag för uppfinningen är den dramatiskt ökade bestäm- ningskänsligheten, som tillåter mätning av normala serumnivåer av dTk-F hos friska individer. (Fig. 6). Undersökningar av serumprov från personer, som lider av infektionssjukdomar, leder till upptäckt av 10-40 gånger förhöjda dTk-nivåer i serum från patienter i akuta stadier av vissa virusinfektioner, t. ex. mononucleo- sis infectiosa (Fig. 7), rubella- och morbillivirusinfektioner (Fig. 8). Beträffande herpesvirus indikerar resultaten förhöjda serum-dTk-aktiviteter i samband med primära infektioner. Inga åtföljande ökningar i dTk-aktiviteter (> 10 enheter) återfanns i samband med andra infektioner (Fig. 8). Karaktäriseringen av de funna serumaktiviteterna har hittills demonstrerat närvaro av Varicella Zoster Virus (VZV) specifikt dTk (Tabell 2). Även användningen av virusspecifikt dTk närvarande i vesikelvätskor för snabb diagnos av infektioner demonstreras (Tabell 2). Alla serum-d'l'k-aktiviteter funna i samband med virala infektioner försvann 10 15 20 25 30 35 453 514 7 gradvis och nådde normala nivåer inom 2-6 veckor.
Beträffande patienter, som lider av maligna sjukdomar, visade en begränsad studie förhöjda serum-dTk-nivåer inte endast hos patienter, som led av maligna sjukdomar härrörande från det lymfoproliferativa systemet, men ocksåi sådana, som hade maligna sjukdomar i andra celler med metastaser i det lymfoproliferativa systemet (Tabell 3). Utvidgade studier har utförts med väldefinierade stora serummaterial från patienter lidande av lymfo-proliferativa sjukdomar såsom non-Hodgkins lymfom (NHL), Hodgkins sjukdom (HD) kronisk och aktiverad lymfatisk leukemi (CLL) och myelom. Detaljerade resultat i NHL- gruppen var följande: normalt serum-dTk och förhöjda dTk-nivåer av olika storlek återfanns; dessa dTk-nivåer korrelerade till stadiet av sjukdomen (Fig. 9a), dvs. ju längre framskriden sjukdom desto högre dTk-värde; om dTk-nivåerna relatera- des till maligniciteten hos tumörcellerna (klassificering enligt Kiel-systemet, Fig. 9b) återfanns god korrelation mellan höga dTk-nivåer och grad av malignitet.
Beträffande prognostisk användning av dessa förbehandlings-dTk-nivåer återfanns mycket signifikanta skillnader i överlevnadstid mellan patientgrupper konstruerade genom uppdelning enligt dTk-värden < l0 enheter eller > l0 enheter, både vid användning av endast patienter i stadierna lll-IV (P4 0,001, Fig. l0a,) och vid användning av endast patienter med "hög malignicitet" (p< 0,02, Elg. l0b.) Vidare avslöjade longitudinella studier av serum-dTk-nivåer i NHL- patienter förändringar korrelerade till förändringar i sjukdomen, dvs. lägre värde vid regression av sjukdomen, högre vid progression och oförändrad vid konstant sjukdom (Fig. ll, l2). Detta visar klart möjligheten att övervaka eller följa terapieffekten, och vidare detekteras återfall snabbt, såväl under som efter behandling, som ökande dTk-värden (Fig. ll, l2).
Beträffande de andra ovannämnda lymfo-proliferativa sjukdomarna åter- fanns varierande serum-dTk-nivåer (Tabell 3), t. ex. återfanns normala värden vid kronisk CLL, medan halvaktiverad CLL gav låga men patologiska värden (>l0 enheter) och aktiv CLL höga värden (Tabell 3). Möjliga användningar av dTk- nivåer, såsom exemplifierat för NHL, är också relevanta för CLL, men måste utvärderas ytterligare för de övriga grupperna. Vidare visar studier av spinal- vätska, härledd från patienter med leukemi, närvaro av dTk när leukemiceller finns i det cerebro-spinala systemet (Tabell 3).
Beträffande cancer indikerar resultaten från patienter med lungcancer av havrecelltyp möjlighet att utnyttja serum-dTk-nivåer som en markör av metastaser (Tabell 3), liksom för andra cancertyper.
Givetvis måste man vara medveten om möjlig tillfälligt förhöjd serum- dTk-nivå hos patienter med maligna sjukdomar, beroende på ovannämnda virusinfektioner. Emellertid går dessa virussjukdomar normalt tillbaka i barn- 453 514 domen, medan maligna tumörer vanligtvis förekommer hos vuxna. En ytterligare faktor, som är relevant för användningen av serumdTk-nivâer för de beskrivna syftena, är den sällsynta förekomsten av förhöjda dTk-aktiviteter, som visas i en studie av oselekterat serummaterial, härledd från patienter med odefinierad sjukdom. Studier av medicinska journaler för dessa och andra patienter har visat, att varken patologiska värden i leverfunktionstester eller leukocytos normalt åtföljs av förhöjda serum-dTk-nivåer.
Tabell l. Buffertsammansättning för dTk-bestämning.
Komponent Provblandning Slutkoncentrationa ”Haves o,iM ssmM MgClz l7mM l5mM KC! 20mM l7mM NaF l,2mM l ,OmM ATP lß,6mM 3,9mM Ditiotreitol 2,7mM 2,3mM Bovint albumin 0,33mg/ ml 0,28mg/ ml Glycerol 6,696 5, 796 iudn - 1,1x1o'7M pH 7,4 7,4 __, ___ __-~___--.-.__«__-------_-- aProportionerna i ett dubbelprov är: 51,5 ul provblandning, 6 ul substratlösning (slutkoncentration av 125 I-lUdR lxl0'7M, 130-160 Ci/mM) och 2,5 ul enzymlös- ning, t. ex. serum (tillsätts vid start av reaktionen), vilket ger en slutvolym av 60 ul. bN-Z-hydroxietylpiperazin-N'-2-etansulfonsyra. 453 514 .oëcåu oNn >N .vzwfixm xšuvaw ...o E.. m3: nuo >oä .an >u wšcucuïcm E> .E23 tšwuo: noE 2223.... >o..& :obcox No.. Nuzàtïø u N NN N.. .E x N.N N >m..._ . NN .. NN NE x N.. . >mz 5.3.3.
N.. NE, N .E x N... >N> 5.2....
NN ... NN. NE x N.. <5... ...Paâx NN=NUIN> >N> .. .E x ...N ..NNN.N NN=NutN> >N> E .E x N... ENN NN=NUIN> >N> NN _... N. .E x ...N å.
NN=NUIN> >N> NN NN N NE x N.. NN NN=NutN> >N> N. NE x N.. NN-..
NN__N2._N> >N> . E .E x ...N NN... 2:..
:Eäuøw 9 ...SNS NNBN... UNENEENU >N> NN NN E NE x N.. ...NNNN NN=NutN> >N> E. NE N NE x N... NNNEN ...N=NU.._N> >N> .N NN N NE x ...N NSEN >N> E. NN E .E x N.. NNNEN NzzNeoä ...Nazi . >wx NN ._ NE NE x N.N NNE ...N33 Nää... >N> ..E NN. .. NE x N.. N.ENN NNEN... .BENQ N >NI N NN .E .E x ...N NE.
NN=NutN> >N> NE NN. N NE x Nx.. .NNNNN NNEN.. .BENQ N >NI N NN NN .E x ...N EE Emgo _~.:> :oc NBBNN; .. .. | .. | N22..
~N=N¥ä> >N> NE N.. N NE x ...N N32...
.NES Nää... ..>N> ...N E. N NE x ..._ 2.5.... .zzNQNJNQLNI >N> NN. NN N. NE x N.N NNNNNN 22.... -.9_.$> VE. ä N... N ä: _ ä... >N> .N-Exs..u.
, Nocwm... xflczx xflwxxocaêë. 9.3 nu... ccwmnaxc. NuNWw.. mNuNÉÉm uoxštm .šïoi ucšncm ...Nïflxmcšncv vucøflrë>z .8 ...SN ...VEÉN . .8.>.c_~..._,... .ES ä 9.2.5 ...ö Nëëüfæ.. .N ._33 Tabell 3. dTk-nivåer i sera från patienter med olika tumörsjukdomar.
Typ av sjukdom Status dTk-aktivitet (enheter/ul) Lungcancerd inga metastaser 5 Lungcancer inga metastaser 2 Lungcancer metastaser 163 Lungcancer metastaser 19 HD metastaser 108 HD metastaser 28 HD inga metastaser 4 HD inga metastaser 3 NHL -\_ framskridet stadium 333 NHL framskridet stadium 11+ NHL tidigt stadium 3 NHL tidigt stadium 5 Adenocarcinom aktivt 72 Leukemi akut 40 Leukemi akut 185 B-cell-leukemi aktivt 52 ) cm. aktiv: asoo a CML aktivt 45 CLL aktivt 62 CLL aktivt 18 _ CLL halvaktivt l l CLL halvaktivt 12 b) CLL inaktivt 2,8 c) Friska individer 2,1: e) Akut leukemi inga metastaser 0,07 e) Akut leukemi inga metastaser 0,20e) Akut leukemi metastaser 1,3 e) Akut leukemi metastaser 1,6 a) Terapi två dagar tidigare. b) Medelvärde från 6 patienter; värden varierar mellan 0,5 och 5,l+. c) Se tidigare avsnitt. d) Alla lungcancrar i denna studie var av havrecelltyp. e) Bestämning av dTk-aktivitet i spinalvätska, 5ul ospädd spinalvätska användes per 120111 slutvolym i provet. ' Använda förkortningar: HD; Hodgkins sjukdom NHL; non-Hodgkins lymfom CML; kronisk myeloisk leukemi CLL; kronisk lymfatisk leukemi 10 15 20 25 30 35 453 514 ll Figurbeskrivnirß Jämförelse mellan metoden enligt uppfinningen och metoden enligt Gronowitz 6: Källander, InfecJmmun. 29:l+25 1980 för dTk-bestämningar. A: två sera innehållande humant dTk-F från patienter med leukemi. B: HSV typ 2 dTk av cellkulturursprung. -o-o-o= nytt buffertsystem, -A -A -= känt buffertsystem. rutan riugängiig mx-iudn var ssox1o"3 cpm.
Separation av batcher av kommersiellt erhållen 125 I-lUdR pä tunnskikts- kromatografi med användning av förbelagda silikagelplattor (Merck 60 F34), 1596 metanol, 8596 kloroform som elueringsmedel.
A: profiler på leveransdagen, indikerande 6296 radiokemisk renhet.
B: samma batch efter 150 dagar i kylskåp. initialt angavs > 9096 radiokemisk renhet av tillverkarna.
Ett exempel som illustrerar hur beräkningar av enzymaktiviteter i enheter utfördes med användning av en intern substratkontroll. Värden visas både för prov (-o-o-) och kontroll (-A-A-). A är värdet för den interna kontrollen i cpm, vilket är proportionellt mot det totalt tillgängliga radiomärkta substratet. B är värdet för produkt bildad genom det undersökta provet uttryckt som cpm per fimme- Enheter (U) = B x (S) x v _15 , där (S) är substratkoncentrationen A x 3,1 x 10 (M) och v provvolymen (liter).
Exempel på inhiberingseffekter av höga serumkoncentrationer i dTk- försök. dTk-aktiviteter bestämdes genom provtagning vid 120 minuter. Enzyrn- aktivitet plottades mot serumkoncentration per 60 ul prov. (-o-o) serum från en patient som lider av NHL, (-A -A-) serum från en patient som lider av aktiv CLL.
Typning av viralt dTk i kliniska prov. Den kvarstående aktiviteten efter inkubation med anti-VZV dTk-serum (A-A), anti-HSV typ l dTk-serum (o-o-) och anti-HSV typ 2 serum (-o-o-) i relation till kontrollinkubering med negativt serum. Resultaten är plottade mot olika spädningar av följande prov: A = vesi- kelvätska från en patient ndivid som lider av infektion av HSV typ 2; B = vesikel- vätska från en patient som lider av en VZV-infektion; C = vesikelvätska från en patient som lider av HSV typ 1 infektion; D = serum från en patient med VZV- infektion.
Fördelning av dTk-aktivitet funnen i sera från 99 blodgivare (ofyllda kolumner) och 25 gravida kvinnor i den första trimestern (skuggade kolumnen).
Medelvärdet är 2,4 enheter/ ul med en standardavvikelse av 1,25. dTk-aktivitet/ul i sera från patienter med infektiös mononukleos relaterad till tid efter insättande av sjukdomen. Symboler märkta med samma bokstav anger sera från samma patient, och den streckade linjen anger normalvärdet. 10 15 20 25 453 514 12 dTk-aktivitet/ul i akut (o) och konvalescens (o) sera från patienter, som lider av olika virusinfektioner, mycoplasma pneumoniae, och psittacosis. Den streckade linjen anger ett värde, som är 14 gånger normalvärdet.
Pig. 9a. s-dTk hos 155 obehandlade patienter med NHL korrelerat till sjukdomsstadiet.
Fig. 9b. s-dTk hos l0l NHL-patienter i stadierna lll-IV uppdelade i tre malignitetsstadier.
Fig. l0a. Överlevnadssannoiikhet för NHL-patienter i stadierna IlI-lV med s-dTk före behandling 10 enheter -o-o-, n=5l. (Antal inom parentes anger återstående individer vid observation efter 32 månader).
Fig. l0b. Överlevnadssannolikhet för NHL-patienter i stadierna Ill-IV med "high grade" tumörmalignitet. dTk före behandling 10 enheter -o-o-, n=27. (Tal inom parentes anger kvarstående individer vid observation efter 32 månader).
Fig. ll. s-dTk hos NHL-patienter med olika kliniskt förlopp, A) patienter med progressiv sjukdom, B) två patienter behandlade till partiell remission, C) fyra patienter behandlade till fullständig remission.
Fig. 12. s-dTk följt longitudineilt hos patienter, där både progressiv sjukdom (a) och remission (b) uppträder, A) två patienter med progressiv sjukdom, som efter ändring av terapi behandlades till partiell remission innan sjukdomen åter progresserade, B) tre patienter behandlade till remission (AJ-l. och E.L till partiell och G.E. till fullständig remission). Alla fick återfall senare. A.H. svarade under kort tid ännu en gång på terapLW
Claims (5)
1. Sätt att bestämma dTk-isoenzymnivåer i en kroppsvätska eller cellprov hos människa eller djur, företrädesvis vid diagnos av sjukdomar dominerade av ATP-medierad dTk-aktivitet, såsom cancrar, tumörer och vissa virus, diagnos av sjukdomar karaktäriserade av CTP-medierad dTk-aktivitet såsom HSV typ l, typ 2 och VZV-infektioner, vilket omfattar stegen att låta provet reagera med ett substrat för nämnda isoenzym i närvaro av en fosfatgivare och ett buffertsystem och mäta mängden fosforylerad produkt som bildats, vilken mängd eller vid är proportionell mot nämnda isoenzymnivå, varvid man använder ett buffert- system vid ett pH från 5 till 9, ett substrat bestående av Zßdeoxi-S-halouridin, av vilket en del har en radiomärkt 5-halogen och vilket är närvarande i en koncentration från 2 x 10-9 - 5 x l0_6M och fosfatgivaren är närvarande i en koncentration, som inte överstiger 20 mM, k ä n n e t e c k n a t av att buffertsystemet är närvarande i en koncentration av högst 250 mM och är väsentligen fri från reaktiva primära aminogrupper.
2. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda pH är från ca 6,5 - 8, nämnda substrat- koncentration är från 5 x 10-7 - IO-BM, och nämnda fosfatgivarkoncentration är från ca 0,5 - 14 mM.
3. Förfarande enligt patentkravet l. eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda fosfatgivare är ATP eller CTP.
4. Förfarande enligt patentkravet l, 2 eller 3, av att det omfattar steget att bestämma tillgängligt som innefattar dTk- kännetecknat radiomärkt substrat genom att införliva en kontroll, isoenzym i ett överskott tillräckligt för att orsaka substratutarmning, varvid nämnda kontroll behandlas på samma sätt som nämnda prov före mätning av radioaktiviteten hos nämnda fosforylerade produkt.
5. Användning av förfarandet enligt något av patentkraven 1-4 för dTk- isoenzymtypning, k ä n n e t e c k n a d av att det omfattar steget att förinkubera nämnda prov med dTk-isoenzym-typspecifika blockerande antikroppar.
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8203041A SE453514B (sv) | 1982-05-14 | 1982-05-14 | Sett att bestemma deoxitymidinkinas-dtk-isoenzymnivaer i kroppsvetska eller cellprov och anvendningen av forfarandet for isoenzymtypning |
| US06/576,375 US4637977A (en) | 1982-05-14 | 1983-05-10 | Method of determining dTk isoenzyme activity and the use thereof |
| JP58501735A JPS59500796A (ja) | 1982-05-14 | 1983-05-10 | ｄＴｋアイソザイム活性の測定法とその利用 |
| EP83850122A EP0094923B1 (en) | 1982-05-14 | 1983-05-10 | A method of determining dtk isoenzyme activity and the use thereof |
| PCT/SE1983/000190 WO1983004054A1 (en) | 1982-05-14 | 1983-05-10 | A method for determination of deoxythymidine kinase (dtk) isoenzyme activity and use thereof for the diagnosis of diseases |
| AT83850122T ATE33504T1 (de) | 1982-05-14 | 1983-05-10 | Verfahren zur feststellung der dtk isoenzymaktivit|t und anwendung des verfahrens. |
| DE8383850122T DE3376272D1 (en) | 1982-05-14 | 1983-05-10 | A method of determining dtk isoenzyme activity and the use thereof |
| AU15540/83A AU551176B2 (en) | 1982-05-14 | 1983-05-10 | A method for determination of deoxythymidine kinase (dtk) isoenzyme activity and use thereof for the diagnosis of diseases |
| ES522376A ES8402876A1 (es) | 1982-05-14 | 1983-05-13 | Procedimiento para determinar el nivel de isoenzima dtk en una muestra de fluido corporal o celular humana o animal. |
| CA000428172A CA1199858A (en) | 1982-05-14 | 1983-05-13 | Method of determining dtk isoenzyme activity and the use thereof |
| DK016384A DK167692B1 (da) | 1982-05-14 | 1984-01-13 | Fremgangsmaade til bestemmelse af deoxythymidinkinase (dtk)isoenzymniveauer samt anvendelse af fremgangsmaaden |
| FI840134A FI77895C (sv) | 1982-05-14 | 1984-01-13 | Förfarande för bestämning av deoxithymidinkinas-isoentsymaktivitet och dess användning för diagnosis av sjukdomar. |
| NO840117A NO165599C (no) | 1982-05-14 | 1984-01-13 | En metode for bestemmelse av dtk isoenzym-aktivitet og anvendelse av denne for in vitro diagnostisering av sykdommer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8203041A SE453514B (sv) | 1982-05-14 | 1982-05-14 | Sett att bestemma deoxitymidinkinas-dtk-isoenzymnivaer i kroppsvetska eller cellprov och anvendningen av forfarandet for isoenzymtypning |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8203041L SE8203041L (sv) | 1983-11-15 |
| SE453514B true SE453514B (sv) | 1988-02-08 |
Family
ID=20346817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8203041A SE453514B (sv) | 1982-05-14 | 1982-05-14 | Sett att bestemma deoxitymidinkinas-dtk-isoenzymnivaer i kroppsvetska eller cellprov och anvendningen av forfarandet for isoenzymtypning |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4637977A (sv) |
| EP (1) | EP0094923B1 (sv) |
| JP (1) | JPS59500796A (sv) |
| AT (1) | ATE33504T1 (sv) |
| AU (1) | AU551176B2 (sv) |
| CA (1) | CA1199858A (sv) |
| DE (1) | DE3376272D1 (sv) |
| DK (1) | DK167692B1 (sv) |
| ES (1) | ES8402876A1 (sv) |
| FI (1) | FI77895C (sv) |
| SE (1) | SE453514B (sv) |
| WO (1) | WO1983004054A1 (sv) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4816410A (en) * | 1986-10-29 | 1989-03-28 | Coulter Corporation | Control slide for immunoassay kit and method of making same |
| DE60217665T2 (de) * | 2002-07-27 | 2007-10-11 | Diasorin Ab | Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Thymidinkinase-1 und dessen Verwendung |
| DK1856275T3 (da) * | 2005-02-25 | 2009-12-07 | Roennerbol Internat Ab | Fremgangsmåde og kit til bestemmelse af thymidinkinase-aktivitet og anvendelse deraf |
| US20220221456A1 (en) * | 2019-05-06 | 2022-07-14 | Arocell Ab | Respiratory infection detection and classification |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4302535A (en) * | 1979-09-27 | 1981-11-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Assay for mutagenesis in heterozygous diploid human lymphoblasts |
| US4317877A (en) * | 1980-06-05 | 1982-03-02 | Sloan Kettering Institute | Process for detecting the presence of malignant and pre-malignant cells in humans |
| IE64317B1 (en) * | 1989-10-26 | 1995-07-26 | Walbro Corp | Fuel metering method and apparatus |
-
1982
- 1982-05-14 SE SE8203041A patent/SE453514B/sv not_active IP Right Cessation
-
1983
- 1983-05-10 AU AU15540/83A patent/AU551176B2/en not_active Ceased
- 1983-05-10 EP EP83850122A patent/EP0094923B1/en not_active Expired
- 1983-05-10 WO PCT/SE1983/000190 patent/WO1983004054A1/en not_active Ceased
- 1983-05-10 JP JP58501735A patent/JPS59500796A/ja active Granted
- 1983-05-10 DE DE8383850122T patent/DE3376272D1/de not_active Expired
- 1983-05-10 US US06/576,375 patent/US4637977A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-05-10 AT AT83850122T patent/ATE33504T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-13 ES ES522376A patent/ES8402876A1/es not_active Expired
- 1983-05-13 CA CA000428172A patent/CA1199858A/en not_active Expired
-
1984
- 1984-01-13 FI FI840134A patent/FI77895C/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-01-13 DK DK016384A patent/DK167692B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK167692B1 (da) | 1993-12-06 |
| FI840134A0 (fi) | 1984-01-13 |
| FI840134A7 (fi) | 1984-01-13 |
| US4637977A (en) | 1987-01-20 |
| DK16384D0 (da) | 1984-01-13 |
| DK16384A (da) | 1984-01-13 |
| FI77895B (fi) | 1989-01-31 |
| AU1554083A (en) | 1983-12-02 |
| CA1199858A (en) | 1986-01-28 |
| DE3376272D1 (en) | 1988-05-19 |
| AU551176B2 (en) | 1986-04-17 |
| ES522376A0 (es) | 1984-03-01 |
| ES8402876A1 (es) | 1984-03-01 |
| FI77895C (sv) | 1989-05-10 |
| EP0094923A2 (en) | 1983-11-23 |
| SE8203041L (sv) | 1983-11-15 |
| EP0094923B1 (en) | 1988-04-13 |
| ATE33504T1 (de) | 1988-04-15 |
| EP0094923A3 (en) | 1985-07-24 |
| WO1983004054A1 (en) | 1983-11-24 |
| JPS59500796A (ja) | 1984-05-10 |
| JPH051000B2 (sv) | 1993-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230272476A1 (en) | Nano46 genes and methods to predict breast cancer outcome | |
| EP1996940B1 (en) | Detection of cancer by elevated levels of bcl-2 | |
| Maloney et al. | Distribution of suboptimally induced β-D-Galactosidase in Escherichia coli: the enzyme content of individual cells | |
| Viscidi et al. | Molecular diagnosis of infectious diseases by nucleic acid hybridization | |
| EP2315858A2 (en) | Gene expression profiling for predicting the survivability of prostate cancer subjects | |
| Goldstein et al. | Cystathionine synthase activity in human lymphocytes: induction by phytohemagglutinin | |
| Bartram et al. | Monitoring MRD in ALL: methodologies, technical aspects and optimal time points for measurement | |
| WO2009061890A1 (en) | Methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia | |
| CN105648058A (zh) | 一种评估肝癌预后的试剂盒 | |
| Zhong et al. | Gross elevation of TT virus genome load in the peripheral blood mononuclear cells of cancer patients | |
| Sprouse et al. | T-Cell Clonality Determination Using Polymerase ChainReaction (PCR) Amplification of the T-Cell Receptorgamma-Chain Gene and Capillary Electrophoresis ofFluorescently Labeled PCR Products | |
| US20160115551A1 (en) | Methods to predict risk of recurrence in node-positive early breast cancer | |
| Hong et al. | Detection of herpes simplex and varicella‐zoster virus in clinical specimens by multiplex real‐time PCR and melting curve analysis | |
| de la Iglesia-San Sebastián et al. | Digital PCR improves sensitivity and quantification in monitoring CAR-T cells in B cell lymphoma patients | |
| WO2007089880A2 (en) | Method to detect breast cancer cells | |
| US10191048B2 (en) | Fluorometric immunoassay for detection of anti-dsDNA antibodies | |
| CN104109716A (zh) | 一种人类hla-b27基因分型试剂盒 | |
| Fox et al. | Sensitivity of leukemic human null lymphocytes to deoxynucleosides | |
| Nakamichi et al. | Correlation between promoter hypermethylation of GSTP1 and response to chemotherapy in diffuse large B cell lymphoma | |
| CN102634572A (zh) | 一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒 | |
| US20160046997A1 (en) | Biomarkers for cervical cancer | |
| EP0094923B1 (en) | A method of determining dtk isoenzyme activity and the use thereof | |
| Rosano et al. | Evaluation of adenosine 5'-monophosphate and fluoride as adenylate kinase inhibitors in the creatine kinase assay. | |
| CN104195255A (zh) | 一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒及其检测方法 | |
| Yu et al. | Thymidylate synthase predicts for clinical outcome in invasive breast cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8203041-2 Effective date: 19910123 Format of ref document f/p: F |