SE465576B - Phage vector lambda SK9 for preparing gene libraries - Google Patents
Phage vector lambda SK9 for preparing gene librariesInfo
- Publication number
- SE465576B SE465576B SE9001070A SE9001070A SE465576B SE 465576 B SE465576 B SE 465576B SE 9001070 A SE9001070 A SE 9001070A SE 9001070 A SE9001070 A SE 9001070A SE 465576 B SE465576 B SE 465576B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- phage
- dna
- fragment
- vector
- bam
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 74
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 37
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 abstract 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 29
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 11
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 9
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 7
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 5
- 241001135910 Phage M13mp18 Species 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- 241000702192 Escherichia virus P2 Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000702058 Phage 21 Species 0.000 description 2
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L (2-dodecoxy-2-oxoethyl)-[6-[(2-dodecoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]hexyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCCCCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCCCC XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXHQLGLGLZKHTC-CUNXSJBXSA-N 4-[(3s,3ar)-3-cyclopentyl-7-(4-hydroxypiperidine-1-carbonyl)-3,3a,4,5-tetrahydropyrazolo[3,4-f]quinolin-2-yl]-2-chlorobenzonitrile Chemical compound C1CC(O)CCN1C(=O)C1=CC=C(C=2[C@@H]([C@H](C3CCCC3)N(N=2)C=2C=C(Cl)C(C#N)=CC=2)CC2)C2=N1 UXHQLGLGLZKHTC-CUNXSJBXSA-N 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000208202 Linaceae Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000084978 Rena Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100029449 WD repeat-containing protein 61 Human genes 0.000 description 1
- 101710093149 WD repeat-containing protein 61 Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000009264 composting Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
465 576 genom utfällning av "armarna" med isopropanol. Dessa "armar" ligeras sedan med fragment av genom-DNA, som har hydrolyserats med Mbo I (Sau 3 AI). Andelen rekombinanter i den erhållna gen- banken är lätt att bestämma genom färgidentifiering. Rekombinan- terna ger vita hopgyttringar, under det att utgångsfagerna ger ljusblåa hopgyttringar. Den huvudsakliga fördelen med denna vektor är att den möjliggör framställning av genbanker med an- vändning av stammen recA' av E.coli såsom värd. Å andra sidan är det svårt att förutsäga resultatet av användning av Ã.Ch40 i recA+-stammarna, eftersom närvaro av 80 repetitiva enheter däri kan medföra oönskade konsekvenser. Arbetet med denna vektor är dessutom icke ekonomiskt, eftersom det dyrbara restriktions- enzymet Nae I erfordras i 80-faldig mängd för fullständig spjälk- ning av DNA. 465 576 by precipitating the "arms" with isopropanol. These "arms" then ligated with fragments of genomic DNA that have been hydrolyzed with Mbo I (Sheep 3 AI). The proportion of recombinants in the obtained gene the bank is easy to determine by color identification. Recombinant the rats give white aggregations, while the starting phages give light blue swarms. The main advantage of this vector is that it enables the production of gene banks using reversal of strain recA 'of E.coli as host. On the other hand is it is difficult to predict the outcome of the use of Ã.Ch40 in the recA + strains, because of the presence of 80 repetitive units therein may have undesirable consequences. The work with this vector is moreover, not economically, since the costly restriction the enzyme Nae I is required in 80-fold amount for complete digestion. DNA.
Man känner vidare till vektorerna Å_DASH och ÃÄFIX (broschyr från Stratagene, USA). Vektorn Ä DASH är avsedd för framställning av genbanker enligt den "klassiska" metoden. Huvudfördelen med denna vektor i förhållande till Å EMBL3 är att den innehåller ytterligare segment för kloning och utskärning av DNA-insatser och dessutom innehåller promotorerna T3 och T7, som gör det möjligt att markera segment av DNA-insatserna direkt gränsande till fagarmarna med hjälp av RNA-polymeraser. Dessa markerade segment kan användas såsom sonder vid sökande efter fager inne- hållande överlappande insatser ("chromosome walking"). Dessa fördelar är emellertid icke uppenbara, eftersom ytterligare igenkänningssekvenser för restriktionsenzymer i polylänken för framställning av representativa genbanker icke är särskilt vikti- ga, under det att närvaro av en stor mängd repetitiva enheter i DNA hos däggdjur, växter och andra organismer medför hög sanno- likhet för att dessa repetitiva enheter skall bli markerade med promotorerna T3 och T7. Det är klart att de markerade repetitiva enheterna icke är lämpliga att använda vid "chromosome walking".The vectors Å_DASH and ÃÄFIX (brochure) are also known from Stratagene, USA). The vector Ä DASH is intended for production of gene banks according to the "classical" method. The main advantage of this vector in relation to Å EMBL3 is that it contains additional segments for cloning and excision of DNA inserts and in addition, the promoters contain T3 and T7, which do so possible to mark segments of the DNA inserts directly adjacent to the phage arms by means of RNA polymerases. These marked segments can be used as probes when searching for phages contained chromosome walking. These benefits, however, are not obvious, as further recognition sequences for restriction enzymes in the polylinker for production of representative gene banks is not very important ga, while the presence of a large number of repetitive units in DNA in mammals, plants and other organisms carries a high probability of similarity for these repetitive units to be marked with promoters T3 and T7. It is clear that they marked repetitive the devices are not suitable for use in "chromosome walking".
Vektorn Å.FIX är avsedd för framställning av genbanker enligt metoder med partiell ifyllning. I detta fall genomföres emellertid hydrolysen av fag-DNA icke med Sal I utan med restrik- tionsenzymet Xho I, som ger liknande kohesiva ändar. Detta beror på att fagen Ã.FIX (liksom även Å.DASH) har spi-fenotyp, dvs den 465 576 kan icke undergå replikation i celler som är lysogena i förhåll- ande till fagen P2, under det att hydrolys med Sal I förstör denna fenotyp och leder till andra oönskade konsekvenser. Jämfört med,Å EMBL3 innehåller denna vektor liksom Ä DASH ytterligare igenkänningssegment för restriktionsenzymer samt promotorerna T3 och T7 i polylänken. Nackdelarna med riFIX och,Ã DASH är att man icke snabbt kan bestämma andelen rekombinanter i den resulterande genbanken.The vector Å.FIX is intended for the production of gene banks according to methods of partial filling. In this case is carried out however, the hydrolysis of phage DNA not with Sal I but with restriction ion enzyme Xho I, which produces similar cohesive ends. This is because that the phage Ã.FIX (as well as Å.DASH) has a spi-phenotype, ie it 465 576 cannot replicate in cells that are lysogenic in to phage P2, while hydrolysis with Sal I destroys this phenotype and leads to other undesirable consequences. Compared with, Å EMBL3 contains this vector as well as Ä DASH further recognition segments for restriction enzymes and the promoters T3 and T7 in the polylinker. The disadvantages of riFIX and, Ã DASH are that one can not quickly determine the proportion of recombinants in the resulting gene banks.
Huvudändamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma en ny fagvektor, som gör det möjligt att genomföra selektion mot icke-rekombinanta fager, gör det möjligt att undvika superinfek- tering av en genbank, gör det möjligt att införa valfria markörer i ändarna av klonade DNA-segment, och gör det möjligt att snabbt och effektivt överföra en insats till plasmidform eller enkel- strängad form.The main object of the present invention is to achieve a new phage vector, which makes it possible to carry out selection against non-recombinant phage, makes it possible to avoid superinfection of a gene bank, makes it possible to introduce optional markers at the ends of cloned DNA segments, and allows fast and efficiently transfer an insert into plasmid form or single stringed form.
Uppfinningen avser sålunda en fagvektor Ä SK9 för framställ- ning av genbanker, och denna vektor kännetecknas av att den har en längd av 47,7 kb och består av följande fragment: (a) ett cos-Sal I-fragment av vänstra armen av fag Å EMBL3 med en längd av 20,3 kb; (b) ett Sal I-Bgl II-fragment av fasmiden SKZA med en längd av 3,8 kb, vari Eco RI-igenkänningsstället har förstörts; fasmiden SK2A har framställts utgående från vektorn SK18, som är fram- ställd av DNA-fragment av fag Å , fag M13 och kosmid pHC 79; (c) ett Bam I-Bam I-fragment av fag Å_EMBL3 med en längd av 13,7 kb; (d) ett Bam I-Bgl II-fragment av fasmiden SK2A med en längd av 0,7 kb, vari Sal I-igenkänningsstället har förstörts; (e) ett Sal I-cos-fragment av högra armen av fag /LEMBL3 med en längd av 9,2 kb; att den innehåller ställen för eventuell insättning av främmande DNA i igenkänningssekvenser för restriktionsenzymerna Bam I och Eco RI; att den har en vektorkapacitet av 4,4-19,0 kb; och att dess värdspektrum utgöres av följande stammar av Escherichia coli: 465 576 LE392 = F', hsd R514(r§, mä), sup E44, sup F58, lac Yl OZ (lac I ZY)6, gal K2, gal T22, met Bl, trp R55; j.M.109 = recál, Alac pro, end A1, gyr A96, thi-1, hsd R17, sup E44, rel A1, F', tra D36, pro Asif, lac 19 zdMls; Q359 = hsd Rg, hsd Mg, sup F, ø so, P2.The invention thus relates to a phage vector Ä SK9 for producing gene banks, and this vector is characterized in that it has a length of 47.7 kb and consists of the following fragments: (a) a cos-Sal I fragment of the left arm of phage Å EMBL3 with a length of 20.3 kb; (b) a Sal I-Bgl II fragment of the phase mite SKZA having a length of 3.8 kb, in which the Eco RI recognition site has been destroyed; fasmiden SK2A has been produced from the vector SK18, which is made from DNA fragments of phage Å, phage M13 and cosmid pHC 79; (c) a Bam I-Bam I fragment of phage Å_EMBL3 of length 13.7 kb; (d) a Bam I-Bgl II fragment of the phase mite SK2A with a length of 0.7 kb, in which the Sal I recognition site has been destroyed; (e) a Sal I-cos fragment of the right arm of phage / LEMBL3 with a length of 9.2 kb; that it contains places for possible insertion of foreign DNA in recognition sequences of the restriction enzymes Bam I and Eco RI; that it has a vector capacity of 4.4-19.0 kb; and that its host spectrum consists of the following strains of Escherichia coli: 465 576 LE392 = F ', hsd R514 (r§, mä), sup E44, sup F58, lac Yl OZ (lac I ZY) 6, gal K2, gal T22, with B1, trp R55; j.M.109 = recál, Alac pro, end A1, gyr A96, thi-1, hsd R17, sup E44, rel A1, F ', tra D36, pro Asif, lac 19 zdMls; Q359 = hsd Rg, hsd Mg, sup F, ø so, P2.
Vektorn deponerades den 21 juli 1989 hos USSR Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding, där den har fått numret PH 687.The vector was deposited on July 21, 1989 with USSR Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding, where it has been given the number PH 687.
Vektorn enligt uppfinningen är avsedd för framställning av representativa genbanker enligt standardmetoder.The vector according to the invention is intended for the production of representative gene banks according to standard methods.
Vektorn enligt uppfinningen gör det möjligt att genomföra selektion mot icke-rekombinanta fager, något som förbättrar genbankens kvalitet samt sparar tid och material. Vektorn gör det vidare möjligt att bestämma andelen rekombinanta fager en- ligt fenotypiska kännetecken, vilket gör det möjligt att kon- tinuerligt bestämma genbankens kvalitet. Vektorn gör det vidare möjligt att införa en radioaktiv eller annan markör i ändarna av klonade DNA-segment. Det är ytterst viktigt för efterföljande manipuleringar med detta segment, eftersom det gör det möjligt att framställa erforderliga fragment utan ytterligare procedurer, vilket kraftigt minskar den tid som erfordras för erhållande av ett slutresultat vid vetenskaplig forskning. Om så önskas kan denna vektor snabbt och effektivt överföras från fagform till plasmidform utan speciell ytterligare kloning. Vektorn kan också lätt överföras till enkelsträngad form för bestämning av den primära DNA-strukturen enligt Sanger-metoden. Även om de kända kommersiellt tillgängliga vektorerna upp- visar några av de ovan uppräknade egenskaperna, är det endast faktorn enligt uppfinningen som har alla dessa egenskaper.The vector according to the invention makes it possible to implement selection against non-recombinant phages, which improves the quality of the gene bank and saves time and materials. The vector does it is further possible to determine the proportion of recombinant phages phenotypic characteristics, which makes it possible to determine the quality of the gene bank. The vector does it further possible to insert a radioactive or other marker at the ends of cloned DNA segments. It is extremely important for subsequent manipulations with this segment, as it allows to produce the required fragments without further procedures, which greatly reduces the time required to obtain an end result of scientific research. If desired can this vector is rapidly and efficiently transferred from phage form to plasmid form without special additional cloning. The vector can also easily transferred to single-stranded form for determination primary DNA structure according to the Sanger method. Although the known commercially available vectors shows some of the characteristics listed above, it is only the factor of the invention which has all these properties.
Uppfinningen beskrives närmare nedan under hänvisning till den bifogade ritningen, på vilken fig 1 (a, b) schematiskt visar framställning av difasmiden SK18; fig 2 schematiskt visar fram- ställning av difasmiden SK18; fig 3 schematiskt visar framställ- ning av Vektorn ;igES7 utgående från fasmiden gSR; fig 4 schema- tiskt visar framställning av fagvektorn /ÄSK9; och fig 5 schema- tiskt visar framställning av en genbank i,Ã SK9.The invention is described in more detail below with reference to the accompanying drawing, in which Fig. 1 (a, b) schematically shows preparation of the diphasmid SK18; Fig. 2 schematically shows position of the diphasmid SK18; Fig. 3 schematically shows the of the vector; igES7 starting from the phase center gSR; Fig. 4 is a schematic shows the production of the phage vector / ÄSK9; and Fig. 5 is a schematic shows the production of a gene bank in, Ã SK9.
Fagvektorn /ISK9 enligt uppfinningen framställes på nedan 465 576 beskrivet sätt. Först framställes vektorn Å-SK18 (fig la, lb och 2). ' Ur DNA av fag Ml3 mp 18 utskäres ett fragment med en storlek av 1,86 kb med hjälp av restriktionsenzymerna Bal I och Bgl II, och detta fragment renas genom elektrofores i lågsmältande aga- ros. Förutom ori-segmentet av fagen M13 innehåller detta fragment även en operator, en promotor, generna lac i och lac z av ett laktosoperon, en polylänksekvens samt ett segment som är komple- mentärt till en standardoligonukleotid-primer för sekvenserna i fager av mp-serien. Samtidigt hydrolyseras kosmiden pHC79 med restriktionsenzymerna Eco RI och Sal I. Med hjälp av Klenow-frag- mentet av DNA-polymeras I från E.coli utfylles de kohesiva ändar- na av det renade fragmentet, som innehåller ori-segmentet av fagen M13, och de kohesiva ändarna av de resulterande fragmenten av kosmiden pHC 79. Därefter genomföres ligering av fragmenten.The phage vector / ISK9 according to the invention is prepared below 465 576 described manner. First, the vector Å-SK18 (Figs. 1a, 1b and 2). ' From a DNA of phage M13 mp 18, a fragment of one size is excised of 1.86 kb by means of the restriction enzymes Bal I and Bgl II, and this fragment is purified by electrophoresis in low melting agate. Rose. In addition to the ori segment of phage M13, this fragment contains also an operator, a promoter, the genes lac i and lac z of one lactose operon, a polylinker sequence and a segment that is complex mentally to a standard oligonucleotide primer for the sequences in subjects of the mp series. At the same time, the cosmid pHC79 is hydrolyzed with restriction enzymes Eco RI and Sal I. Using the Klenow fragments of the E. coli DNA polymerase I complement the cohesive ends. of the purified fragment, which contains the ori segment of phage M13, and the cohesive ends of the resulting fragments of the cosmid pHC 79. Then ligation of the fragments is performed.
Den ligerade DNA införes enligt standardmetoder i E.coli, stam j.M.l09. DNA isoleras sedan enligt standardmetoder och analyseras med användning av restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I. Den erhållna difasmiden SKI användes för vidare operationer. I syfte att minska storleken hydrolyseras SK1 med restriktionsenzymerna Hind III och Bgl II, varefter man renar det fragment som innehåller den gen som ger ampicillin- resistens. DNA av fagen M13 mp18 behandlas samtidigt med samma restriktionsenzymer, och ett lågmolekylärt fragment isoleras. De båda fragmenten ligeras, och celler av E.coli, stam j.M.l09, transformeras med användning av den sålunda erhållna lösningen.The ligated DNA is introduced according to standard methods into E. coli strain j.M.l09. DNA is then isolated according to standard methods and analyzed using the restriction enzymes Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II and Sal I. The obtained diphasmid SKI was used for further operations. In order to reduce the size is hydrolyzed SK1 with the restriction enzymes Hind III and Bgl II, after which one purifies the fragment containing the gene conferring the ampicillin resistance. DNA of the phage M13 mp18 is treated simultaneously with the same restriction enzymes, and a low molecular weight fragment is isolated. The both fragments are ligated, and cells of E. coli, strain j.M.109, transformed using the solution thus obtained.
De transformerade cellerna utbredes på ett medium innehållande ampicillin, X-gal och IPTG. DNA isoleras och spjälkas med re- striktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I, varefter analys genomföres. Fasmiden SK2 avskiljes och användes i efterföljande steg.The transformed cells were spread on a medium containing ampicillin, X-gal and IPTG. DNA is isolated and digested with the restriction enzymes Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II and Room I, after which analysis is performed. The fasmid SK2 is separated and was used in subsequent steps.
DNA av kosmiden pHC 79 spjälkas med restriktionsenzymet Bgl II, och man isolerar ett fragment innehållande cos-segmentet.DNA of the cosmid pHC 79 is digested with the restriction enzyme Bgl II, and isolate a fragment containing the cos segment.
DNA av SK2 hydrolyseras och ligeras till fragmentet innehållande cos-segmentet. Celler av E.coli, stam j.M.l09, transformeras med den resulterande lösningen, och de transformerade cellerna ut- bredes på ett medium innehållande ampicillin. Avtryck av de odla- 465 576 de kolonierna göres på nitrocellulosafilter, och hybridisering genomföres med fragmentet Bgl II av kosmiden pHC 79 innehållande cos-segment. Genom s k nick-translation genomföres märkning med 32P. Cellerna från kolonier hybridiserade med cos-fragmentet odlas i mediet med ampicillin, och DNA isoleras, spjälkas med restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I och analyseras. En av de isolerade difasmiderna, nämligen difasmiden SK6, användes i efterföljande steg.DNA of SK2 is hydrolyzed and ligated to the fragment containing the cos segment. Cells of E.coli, strain j.M.109, are transformed with the resulting solution, and the transformed cells spread on a medium containing ampicillin. Impressions of the cultivars 465 576 those colonies are made on nitrocellulose filters, and hybridization is performed with the fragment Bgl II of the cosmid containing pHC 79 cos-segment. Through so-called nick translation, marking is performed with 32P. The cells from colonies hybridized with the cos fragment grown in the medium with ampicillin, and DNA is isolated, digested with the restriction enzymes Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II and Room I and analyzed. One of the isolated diphasmids, namely diphasmid SK6, was used in subsequent steps.
Difasmiden SK6 hydrolyseras med restriktionsenzymet Eco RI, och de kohesiva ändarna utfylles med hjälp av Klenow-fragment i närvaro av dNTP. Difasmidens linjära form renas och ligeras sedan, och den resulterande lösningen användes för att trans- formera celler av E.coli, stam j.M.109. De transformerade celler- na utbredes på ett medium innehållande ampicillin, X-gal och IPTG. Celler får växa från kolonierna i det ampicillinhaltiga mediet, och difasmid-DNA isoleras. DNA spjälkas med restriktions- enzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I och analyseras därefter. Från de analyserade DNA-molekylerna isoleras difasmiden SKl8, som hydrolyseras med restriktionsenzymet Acc I.The diphasmid SK6 is hydrolyzed with the restriction enzyme Eco RI, and the cohesive ends are filled in using Klenow fragments in presence of dNTPs. The linear shape of the diphasmid is purified and ligated then, and the resulting solution was used to form cells of E.coli, strain j.M.109. The transformed cells spread on a medium containing ampicillin, X-gal and IPTG. Cells are allowed to grow from the colonies in the ampicillin-containing medium, and diphasmid DNA is isolated. DNA is digested with restriction the enzymes Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II and Sal I and then analyzed. From the analyzed DNA molecules are isolated the diphasmid SK18, which is hydrolyzed with the restriction enzyme Acc I.
De kohesiva ändarna av Acc I-segmentet, som befinner sig utanför polylänken, ifylles med användning av Klenow-framgent i närvaro av dATP och dTTP. Preparatet behandlas med DNA-ligas av fag T4 i en buffertlösning, varefter den resulterande lösningen användes för att transformera celler av E.coli, stam j.M.109. De trans- formerade cellerna utbredes på ett medium innehållande ampicil- lin, X-gal och IPTG. Celler får tillväxa på det ampicillinhaltiga mediet, och DNA isoleras samt spjälkas med Acc I och analyseras.The cohesive ends of the Acc I segment, which are outside polylink, is filled in using Klenow-forward in presence of dATP and dTTP. The preparation is treated with DNA ligase of phage T4 i a buffer solution, after which the resulting solution was used to transform cells of E.coli, strain j.M.109. The trans- formed cells were spread on a medium containing ampicile flax, X-gal and IPTG. Cells are allowed to grow on the ampicillin-containing the medium, and DNA is isolated and digested with Acc I and analyzed.
Man isolerar difasmiden SK18, som innehåller endast ett Acc I- -segment.The diphasmid SK18 is isolated, which contains only one Acc I- -segment.
DNA av difasmiden SKl8 hydrolyseras sedan med restriktions- enzymet BglII, varefter självligering genomföres. Den ligerade DNA användes för att transformera celler av E.coli, stam j.M.109, och de transformerade cellerna utbredes på ett ampicillinhaltigt medium. Celler får tillväxa på det ampicillinhaltiga mediet, och ur dessa celler isoleras DNA genom alkalisk lysis. DNA-materialet spjälkas därefter med restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I, Sal I 465 576 och Bgl II samt analyseras. Fasmiden SKZA isoleras från de analyserade fasmiderna.DNA of the diphasmid SK18 is then hydrolyzed by restriction the enzyme BglII, after which self-ligation is performed. It ligated DNA was used to transform cells of E. coli, strain j.M.109, and the transformed cells are propagated on an ampicillin-containing medium. Cells are allowed to grow on the ampicillin-containing medium, and from these cells, DNA is isolated by alkaline lysis. The DNA material then digested with the restriction enzymes Eco RI, Bam I, Sal I 465 576 and Bgl II and analyzed. The fasmid SKZA is isolated from the analyzed the phase mids.
Fasmiden SK2A skiljer sig från fasmiden SK2 genom frånvaro av igenkänningssegment för restriktionsenzymerna Eco RI och Acc I, vilka befinner sig utanför polylänken. Därefter avlägsnas igenkänningssegmentet för restriktionsenzymet Sal I i fasmiden SKZA. För detta ändamål hydrolyseras DNA av fasmiden SKZA med restriktionsenzymet Sal I, och med hjälp av Klenow-fragment av DNA-polymeras I omvandlas de enkeltrådiga ändarna till dubbel- trådiga ändar. Därefter genomföres självligering, och den ligera- de DNA införes i celler av E.coli, stam j.M.l09. Ur kolonierna isoleras DNA enligt standardmetoder och analyseras med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Man avskiljer en fasmid SK2¿1S, som innehåller igenkänningsställen för Eco RI och Bam I men icke innehåller något igenkänningsställe för Sal I.The phase2 SK2A differs from the SK2 phase by absence of recognition segments for the restriction enzymes Eco RI and Acc I, which are outside the polylinker. Then removed the recognition segment for the restriction enzyme Sal I in the phase center SKZA. For this purpose, DNA is hydrolysed by the phase medium SKZA the restriction enzyme Sal I, and using Klenow fragments of DNA polymerase I converts the single-stranded ends into double-stranded threaded ends. Subsequently, self-ligation is performed, and the ligation the DNA is introduced into cells of E.coli, strain j.M.109. From the colonies DNA is isolated according to standard methods and analyzed using the restriction enzymes Eco RI, Bam I and Sal I. One is separated fasmid SK2¿1S, which contains recognition sites for Eco RI and Bam I but does not contain any recognition site for Sal I.
Igenkänningsstället för restriktionsenzymet Eco RI i fasmi- den SK2¿3S avlägsnas därefter. För detta ändamål hydrolyseras DNA av fasmiden SK2¿ÄS med restriktionsenzymet Eco RI, och med hjälp av Klenow-fragment omvandlas de enkeltrådiga ändarna till dubbeltrådiga ändar. Därefter genomföres självligering av DNA- -molekylerna. Den ligerade DNA spjälkas med restriktionsenzymet Eco RI och införes i celler av E.coli, stam j.M.l09. DNA isoleras från kolonierna enligt standardmetoder och analyseras med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Man isolerar en fasmid SK2¿§SR, som innehåller igenkänningsställen för restrik- tionsenzymet Bam I men icke några igenkänningsställen för re- striktionsenzymerna Eco RI och Sal I.The recognition site for the restriction enzyme Eco RI in the phase the SK2¿3S is then removed. For this purpose, hydrolyzed DNA of the phase mite SK2¿ÄS with the restriction enzyme Eco RI, and with using Klenow fragments, the single-stranded ends are transformed into double-stranded ends. Thereafter, self-ligation of DNA molecules. The ligated DNA is digested with the restriction enzyme Eco RI and introduced into cells of E.coli, strain j.M.109. DNA is isolated from the colonies according to standard methods and analyzed using of the restriction enzymes Eco RI, Bam I and Sal I. One is isolated phase center SK2¿§SR, which contains recognition points for restriction Bam I but not any recognition sites for the restriction enzymes Eco RI and Sal I.
Därefter konstrueras rekombinantfasmiden gSR. DNA av fag ,zgtII hydrolyseras med restriktionsenzymet Bam I, varefter en- zymet inaktiveras. De kohesiva ändarna hos fagen /Å sammanhäktas därefter, och det centrala Bam I-fragmentet med en storlek av ca 6,5 kb renas (preparat A). DNA av fasmiden SK2zâSR hydrolyseras med restriktionsenzymet Bam I och ligeras med preparatet A efter inaktivering av enzymet. Den ligerade DNA införes i celler av E.coli, stam j.M.109, och de transformerade cellerna utbredes på L-agar innehållande ampicillin. Avtryck av de odlade kolonierna göres på nitrocellulosafilter, och hybridisering genomföres med 465 576 preparat A, vars DNA märkes med 32P med hjälp av nick-transla- tion. Cellerna av de kolonier som hybridiserar sig med preparat A får tillväxa. Plasmid-DNA isoleras enligt en standardmetod.Thereafter, the recombinant phasmid gSR is constructed. DNA of subjects , zgtII is hydrolyzed with the restriction enzyme Bam I, after which zymet is deactivated. The cohesive ends of the phage / Å are attached then, and the central Bam I fragment with a size of approx 6.5 kb is purified (Preparation A). DNA of the phase medium SK2zâSR is hydrolyzed with the restriction enzyme Bam I and ligated with preparation A after inactivation of the enzyme. The ligated DNA is introduced into cells of E.coli, strain j.M.109, and the transformed cells spread on L-agar containing ampicillin. Impressions of the cultivated colonies is done on nitrocellulose filters, and hybridization is performed with 465 576 Preparation A, the DNA of which is labeled with 32 P by means of nick-translation tion. The cells of the colonies that hybridize with preparations A may grow. Plasmid DNA is isolated according to a standard method.
Analys av den sålunda erhållna DNA med hjälp av restriktions- enzymerna Eco RI, Bam I och Sal I bekräftar kloning av segmentet ;\gt II i fasmiden SK2¿1SR. Den erhållna fasmiden gSR användes i efterföljande steg. Därefter konstrueras fagvektor,2gES7 (fig 3).Analysis of the DNA thus obtained by means of restriction the enzymes Eco RI, Bam I and Sal I confirm cloning of the segment ; \ gt II i fasmiden SK2¿1SR. The obtained phase medium gSR was used in subsequent steps. Next, phage vector, 2gES7 is constructed (Fig. 3).
Härvid hydrolyseras DNA av fasmiden gSR med restriktionsenzymet Bgl II, varpå enzymet inaktiveras. DNA av fag Ä EMBL3 hydrolyse- ras med restriktionsenzymet Bam I, varpå enzymet inaktiveras. De båda DNA-preparaten blandas i ekvimolära mängder och ligeras.In this case, DNA is hydrolyzed by the phase medium gSR with the restriction enzyme Bgl II, after which the enzyme is inactivated. DNA of phage Ä EMBL3 hydrolysis with the restriction enzyme Bam I, whereupon the enzyme is inactivated. The both DNA preparations are mixed in equimolar amounts and ligated.
Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag QR, och de resulterande fagpartiklarna utbredes på celler av E.coli, stam LE 392, innehållande 0,1% X-gal. En fag utvinnes ur tio blå hop- gyttringar, och DNA isoleras och analyseras med hjälp av restrik- tionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Man avskiljer fagen /lgES7, som användes i efterföljande steg.The ligated DNA is packaged in vitro in proteins of phage QR, and they the resulting phage particles are spread on cells of E. coli strain LE 392, containing 0.1% X-gal. A subject is extracted from ten blue spawning, and DNA is isolated and analyzed by restriction the phage enzymes Eco RI, Bam I and Sal I. The phage are separated / lgES7, which was used in subsequent steps.
DNA av fagen Å EMBL3 hydrolyseras med restriktionsenzymet Bam I, och ett insättningsfragment med en storlek av ca 13,7 kb renas (preparat B). DNA av fagen )lgES7 hydrolyseras med restrik- tionsenzymet Bam I, och "armarna" renas (preparat C). Preparaten B och C blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag' Å, och de sålunda erhåll- na fagpartiklarna utbredes på celler av E.coli, stam LE 392. En fag utvinnes ur sex hopgyttringar, och DNA isoleras och analyse- ras med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I.DNA of the phage Å EMBL3 is hydrolyzed with the restriction enzyme Bam I, and an insertion fragment with a size of about 13.7 kb renas (preparation B). DNA of the phage) IgES7 is hydrolyzed by restriction the ion enzyme Bam I, and the "arms" are purified (preparation C). Preparations B and C are mixed in equimolar amounts and ligated. It ligated DNA is packaged in vitro in phage 'Å proteins, and they are thus obtained The phage particles are spread on cells of E.coli, strain LE 392. A phage are extracted from six agglomerations, and DNA is isolated and analyzed race using the restriction enzymes Eco RI, Bam I and Sal I.
Man isolerar en fag benämnd ,QSK9, vars struktur framgår av fig 4.A phage named, QSK9, is isolated, the structure of which is shown in fig 4.
Den framställda fagvektorn /ISKQ är lämpad för framställning av representativa genbanker enligt den "klassiska" metoden, vil- ket framgår av fig 5.The produced phage vector / ISKQ is suitable for production of representative gene banks according to the "classical" method, shown in Fig. 5.
DNA av fagvektorn ;lSK9 hydrolyseras med 10-faldiga över- skott av restriktionsenzymerna Eco RI och Bam I. DNA-materialet utfälles därefter med isopropanol, varvid en avsevärd del av Eco RI-Bam I-fragmenten stannar kvar i den överstående vätskan.DNA of the phage vector; SSK9 is hydrolyzed with 10-fold supernatants shoots of the restriction enzymes Eco RI and Bam I. the DNA material then precipitated with isopropanol, a substantial portion of The Eco RI-Bam I fragments remain in the supernatant.
Efter upplösning av DNA-fällningen erhålles ändfragment ("armar") av Å.SK9 med kohesiva Bam I-ändar och ett inre fragment med 465 576 kohesiva Eco RI-ändar. Genom-DNA hydrolyseras partiellt med restriktionsenzymet Sau 3A I (eller Mbo I), och fragment med en storlek av 15-20 kb isoleras (med hjälp av gelelektrofores eller centrifugering). Dessa fragment ligeras med fag-DNA som har be- handlats på ovan beskrivet sätt, och den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag 21. De resulterande fagpartiklarna an- vändes för infektering av celler av E.coli. I detta fall utgöres vanligen ca 70% av de odlade fagerna av rekombinanter.After dissolution of the DNA precipitate, end fragments ("arms") are obtained of Å.SK9 with cohesive Bam I ends and an inner fragment with 465 576 cohesive Eco RI ends. Genomic DNA is partially hydrolyzed with the restriction enzyme Sau 3A I (or Mbo I), and fragments with a size of 15-20 kb is isolated (using gel electrophoresis or centrifugation). These fragments are ligated with phage DNA that has been processed in the manner described above, and the ligated DNA is packaged in vitro in proteins of phage 21. The resulting phage particles were used was used to infect E. coli cells. In this case, usually about 70% of the cultured phage of recombinants.
Det bör påpekas att man kan selektera rekombinantafå SK9- -fager, under det att de ursprungliga, icke-rekombinanta Å SK9- -fagerna icke kan undergå replikation i celler av E.coli som är lysogena med avseende på fag P2 (spi-fenotyp-stammar Q359 och NM 539).It should be noted that one can select recombinant from SK9- -phages, while the original, non-recombinant Å SK9- the phages cannot undergo replication in cells of E.coli which are lysogenic with respect to phage P2 (spi-phenotype strains Q359 and NM 539).
DNA-insatsen i,Å SK9 kan lätt omvandlas till plasmidform.The DNA insert in, Å SK9 can be easily converted to plasmid form.
Härvid tillämpas en annan metod än den som användes för Å ZAP.A different method is used than the one used for Å ZAP.
DNA av rekombinant Å SK9 hydrolyseras med restriktionsenzymet Sal I (även Cla I kan användas), varpå enzymet inaktiveras med hjälp av tre cykler av frysning och upptining. Dessa båda re- striktionsenzymer spjälkar eukaryotisk DNA tillräckligt sällan (Sal I har i genomsnitt ett igenkänningssegment per ca 50 kb, och Cla I har i genomsnitt ett igenkänningssegment per ca 20 kb).DNA of recombinant Å SK9 is hydrolyzed with the restriction enzyme Sal I (Cla I can also be used), after which the enzyme is inactivated with using three cycles of freezing and thawing. These two re- restriction enzymes cleave eukaryotic DNA rarely enough (Room I has on average one recognition segment per approx. 50 kb, and Cla I has on average one recognition segment per about 20 kb).
Därefter utspädes DNA och självligeras. Den ligerade DNA införes i kompetenta celler av E.coli, vilka utbredes på L-agar innehåll- ande ampicillin. De odlade kolonierna innehåller en DNA-insats i plasmidform, varvid plasmiden antingen icke alls innehåller nukleotidsekvenser av fag få (vid användning av Sal I) eller innehåller endast en liten del därav (vid användning av Cla I). Överföringen till plasmidform genomföres snabbt (3-4 timmar) och effektivt (0,1 pg rekombinant-DNA ger flera hundra kolonier).The DNA is then diluted and self-ligated. The ligated DNA is introduced in competent E. coli cells, which are propagated on L-agar-containing ande ampicillin. The cultured colonies contain a DNA insert in plasmid form, the plasmid either not containing at all nucleotide sequences of phage few (when using Sal I) or contains only a small portion thereof (when using Cla I). The transfer to plasmid form is carried out rapidly (3-4 hours) and efficiently (0.1 pg of recombinant DNA yields several hundred colonies).
/ISK9 och rekombinanter därav kan också överföras till plasmidform enligt en annan metod. Härvid användes fagen för direkt infektering av celler av E.coli som är resistenta mot lytisk replikation av fag ;i. Denna metod är emellertid mindre lämplig och kan vara användbar endast för speciella experiment./ ISK9 and recombinants thereof can also be transferred to plasmid form according to another method. The subject was used for this direct infection of E.coli cells resistant to lytic replication of phage; i. However, this method is smaller suitable and may be useful only for special experiments.
När fagen M13 användes för superinfektion av celler av E.coli innehållande plasmiden, packas plasmid-DNA i proteinerna av fagen i enkelsträngad form, som är lämplig för sekvensbestäm- 465 576 10 ning av DNA-insatsen i enlighet med den välkända Sanger-metoden.When phage M13 was used for superinfection of cells of E.coli containing the plasmid, plasmid DNA is packed into the proteins of the phage in single-stranded form, which is suitable for sequencing 465 576 10 DNA insert according to the well-known Sanger method.
Kapaciteten av Ä,SK9 är upp till 19 kb, som är alldeles tillräckligt för att man skall kunna framställa representativa genbanker, eftersom en insats vanligen innehåller ca 15 kb.The capacity of Ä, SK9 is up to 19 kb, which is quite sufficient to produce representative gene banks, since an insert usually contains about 15 kb.
Den nya Vektorn 2.SK9 enligt uppfinningen kan användas för framställning av representativa genbanker enligt den "klassiska" metoden. Huvudfördelarna med denna vektor är följande. Vektorn möjliggör framställning av en genbank utan att fagens "armar" behöver underkastas för-rening. Fagen gör det möjligt att genom- föra selektion mot icke-rekombinanta fager. Fagen kan snabbt, effektivt och på reglerat sätt omvandlas till plasmidform fri från "armarna" i fag 21. Fagen kan omvandlas till enkelsträngad form för bestämning av den primära DNA-strukturen enligt Sanger- -metoden. Fagen utesluter möjligheten av superinfektering av genbanken i ÉZSK9 med fag M13. Fagen gör det möjligt att speci- fikt märka 5'-3'-segmentet och andra insättningssegment med an- vändning av kommersiellt tillgängliga, standardiserade preparat.The new Vector 2.SK9 according to the invention can be used for production of representative gene banks according to the "classical" method. The main advantages of this vector are as follows. The vector enables the production of a gene bank without the "arms" of the phage need to be subjected to pre-purification. The subject makes it possible to perform selection against non-recombinant phages. The subject can quickly, efficiently and in a regulated manner is converted to plasmid form free from the "arms" of phage 21. The phage can be converted to single-stranded form for determining the primary DNA structure according to Sanger- method. The subject excludes the possibility of superinfection of the gene bank in ÉZSK9 with subject M13. The subject makes it possible to speci- label the 5'-3 'segment and other insertion segments with use of commercially available, standardized preparations.
Framställning av vektorer enligt uppfinningen och användning därav illustreras i de följande exemplen.Preparation of vectors according to the invention and use of which is illustrated in the following examples.
Exempel 1 Man framställde först difasmíden SKl8 (se fig 1 och 2). Ur 5 pg DNA av fag M13 mp 18 utskars ett fragment med en storlek av 1,86 kb med hjälp av restriktionsenzymerna Bal I och Bgl II (tio aktivitetsenheter av vardera). Fragmentet renades genom elektro- fores i lågsmältande agaros. Förutom ori-segmentet av fag M13 innehåller detta fragment även en operator, en promotor, generna lac i och lac z av laktos-operonet, en polylänk och ett segment komplementärt till en standardoligonukleotid-primer för sekven- serna i fager av mp-serien. 2 pg kosmid pHC 79 hydrolyseras parallellt under standardbetingelser med restriktionsenzymerna Eco RI och Sal I (20 aktivitetsenheter av vardera). Såväl de kohesiva ändarna av det renade fragmentet innehållande ori- -segmentet av fag M13 som de kohesiva ändarna av Eco RI-Sal I- -fragmentet av kosmiden pHC 79 utfylles med hjälp av Klenow- -fragment av DNA-polymeras I från E.coli (fem aktivitetsenheter) i 50 pl av en buffert innehållande 20 mM tris-HCl (pH 7,4), 5 mM 465 576 ll MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM NaCl och 50 pg DNA per ml i närvaro av alla fyra deoxinukleosidtrifosfaterna (15 pM). Frag- mentet innehållande ori-segmentet av fag M13 och fragmentet inne- hållande cos-segmentet av fag /1 ligeras i ekvimolära mängder i 100 pl av en buffert innehållande 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 3 mM adenosintrifosfat, 25 aktivitets- enheter DNA-ligas av fag T4 och totalt 50 pg DNA per ml. Den ligerade DNA införes enligt standardmetoder i E.coli, stam j.M.109. Bakterierna utbredes i Petriskålar på 2-procentig L-agar innehållande 25 pg ampicillin per ml, 0,1% IPTG och 0,1% av färg- ämnet X-gal. Ungefär 10 pg DNA isoleras från 10 ljusblåa kolonier enligt standardmetoder och analyseras med hjälp av restriktions- enzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I. En difasmid SK1 med förutsagt restriktionsmönster (fig la) utvinnes och användes för vidare operationer. För minskning av storleken hydrolyseras 5 pg SK1 med restriktionsenzymerna Hind III och Bgl II (fem aktivitetsenheter av vardera), och det resulterande fragmentet innehållande den gen som ger ampicillinresistens renas genom elektrofores i lågsmältande agaros. 5 pg DNA av fag M13 mp 18 behandlas med samma restriktionsenzymer, och ett låg- molekylärt fragment utvinnnes ur den lågsmältande agarosen efter elektrofores. De båda fragmenten ligeras i 0,1 ml av en lösning innehållande so mM tris-Hcl (pH 7,5), 10 mm Mgclz, 10 mM ditio- treitol, 3 mM adenosintrifosfat och fem aktivitetsenheter DNA- ligas av fag T4 vid en total koncentration av DNA-fragment av 50 pg/ml. 10 pl av den resulterande lösningen användes för att transformera celler av E.coli, stam j.M.109, och de transformera- de cellerna utbredes på L-agar innehållande 25 pg ampicillin per ml, 0,1% X-gal och O,1% IPTG. Celler från de ljusblåa kolonierna odlas i 10 ml L-medium innehållande 100 pg ampicillin per ml, och ungefär 10 pg DNA isoleras genom alkalisk lysis. 0,5 pg DNA spjälkas med restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl III och Sal I och analyseras genom elektro- fores på agarosgel. En fasmid SK2 med förutsagt restriktions- mönster (se fig la) utvinnes och användes i efterföljande steg. 5 pg DNA av kosmiden pHC 79 spjälkas med restriktionsenzymet Bgl II, och det fragment som innehåller cos-segmentet elueras ur 465 576 12 den lågsmältande agarosen efter elektrofores. 2 pg SK2 hydrolyse- ras också.med Bgl II, och det resulterande fragmentet ligeras med fragmentet innehållande cos-segmentet i en buffert innehåll- ande 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 3 mM adenosintrifosfat och fem aktivitetsenheter av DNA-ligas av fag T4 vid ett tvåfaldigt molärt överskott av fragmentet och vid en total DNA-koncentration av 50 pg/ml. 10 ul av den erhållna lösningen användes för transformation av celler av E.coli, stam j.M.109, och de resulterande cellerna utbredes på L-agar inne- hållande 25 pg ampicillin per ml. Avtryck av de framvuxna koloni- erna göres på nitrocellulosafilter, och hybridisering genomföres med Blg II-fragmentet av kosmiden pHC 79 innehållande ett cos- -segment, som märkes med 32P med hjälp av nick-translation.Example 1 The diphasmid SKl8 was first prepared (see Figs. 1 and 2). From 5 pg DNA of phage M13 mp 18 is excised a fragment with a size of 1.86 kb using the restriction enzymes Bal I and Bgl II (ten activity units of each). The fragment was purified by electrophoresis. fores in low-melting agarose. In addition to the ori segment of phage M13 this fragment also contains an operator, a promoter, the genes lac i and lac z of the lactose operon, a polylinker and a segment complementary to a standard oligonucleotide primer for sequencing in subjects of the mp series. 2 pg of cosmid pHC 79 are hydrolyzed in parallel under standard conditions with the restriction enzymes Eco RI and Sal I (20 activity units of each). Both of them cohesive ends of the purified fragment containing ori- segment of phage M13 as the cohesive ends of Eco RI-Sal I fragment of the cosmid pHC 79 is supplemented by Klenow- fragment of DNA polymerase I from E.coli (five activity units) in 50 μl of a buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM 465 576 ll MgCl 2, 10 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl and 50 pg DNA per ml in presence of all four deoxynucleoside triphosphates (15 pM). Frag- the fragment containing the ori segment of phage M13 and the fragment containing holding the cos segment of phage / 1 is ligated in equimolar amounts in 100 μl of a buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2, 10 mM dithiothreitol, 3 mM adenosine triphosphate, units of DNA ligase of phage T4 and a total of 50 pg of DNA per ml. The ligated DNA is introduced according to standard methods into E. coli strain j.M.109. The bacteria are spread in Petri dishes on 2% L-agar containing 25 pg ampicillin per ml, 0.1% IPTG and 0.1% of dye the substance X-gal. Approximately 10 pg of DNA is isolated from 10 light blue colonies according to standard methods and analyzed by means of the enzymes Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II and Sal I. En difasmid SK1 with predicted restriction pattern (Fig. 1a) is recovered and was used for further operations. To reduce the size hydrolyzed 5 pg SK1 with the restriction enzymes Hind III and Bgl II (five activity units of each), and the resulting the fragment containing the gene conferring ampicillin resistance purified by electrophoresis in low melting agarose. 5 pg DNA of phage M13 mp 18 is treated with the same restriction enzymes, and a low molecular fragment is recovered from the low melting agarose after electrophoresis. The two fragments are ligated into 0.1 ml of a solution containing so mM tris-Hcl (pH 7.5), 10 mm Mgclz, 10 mM dithio- treitol, 3 mM adenosine triphosphate and five activity units DNA ligase of phage T4 at a total DNA fragment concentration of 50 pg / ml. 10 μl of the resulting solution was used to transform cells of E.coli, strain j.M.109, and they transform those cells were spread on L-agar containing 25 pg ampicillin per ml, 0.1% X-gal and 0.1% IPTG. Cells from the light blue colonies grown in 10 ml L-medium containing 100 pg ampicillin per ml, and approximately 10 pg of DNA is isolated by alkaline lysis. 0.5 pg of DNA is digested with the restriction enzymes Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl III and Sal I and analyzed by electrophoresis lined on agarose gel. A phase center SK2 with predicted restriction patterns (see Fig. 1a) are recovered and used in subsequent steps. 5 pg of DNA of the cosmid pHC 79 is digested with the restriction enzyme Bgl II, and the fragment containing the cos segment is eluted from 465 576 12 the low melting agarose after electrophoresis. 2 pg SK2 hydrolysis also Bgl II, and the resulting fragment is ligated with the fragment containing the cos segment in a buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2, 10 mM dithiothreitol, 3 mM adenosine triphosphate and five DNA ligase activity units of phage T4 at a two-fold molar excess of the fragment and at a total DNA concentration of 50 pg / ml. 10 μl of the obtained the solution was used to transform cells of E. coli strain j.M.109, and the resulting cells were spread on L-agar containing containing 25 pg ampicillin per ml. Impressions of the emerging colonies are made on nitrocellulose filters, and hybridization is performed with the B1g II fragment of the cosmid pHC 79 containing a cos- segments, which are marked with 32P using nick-translation.
Celler från fem kolonier som hybridiserar sig med cos-fragmentet odlas i 10 ml L-medium innehållande 100 ug ampicillin per ml.Cells from five colonies that hybridize to the cos fragment grown in 10 ml of L-medium containing 100 μg of ampicillin per ml.
Ungefär 10 pg DNA isoleras genom alkalisk lysis. 0,5 pg DNA spjälkas med restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I och analyseras genom elektrofores på agarosgel. Alla fem difasmiderna har det förutsagda restriktions- mönstret (se fig lb), och en av difasmiderna, nämligen SK6, an- vändes i efterföljande steg. 5 pg SK6 hydrolyseras partiellt med restriktionsenzymet Eco RI, och difasmidens linjära form renas genom elektrofores i lågsmältande agaros. Det erhållna preparatet behandlas under 20 minuter vid en temperatur av 20°C i 45 ul av en lösning innehåll- ande 20 mM tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgC12, 10 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM NaCl, 50 pM av var och en av de fyra deoxinukleosidtrifos- faterna samt fem aktivitetsenheter av Klenow-fragmentet av DNA- -polymeras I. Till lösningen sättes sedan 5 ul av en buffert innehållande soo mm tris-Hcl (pH 7,5), 1oo mM Mgclz, 1oo mM ditiotreitol, 30 mM adenosintrifosfat och 20 aktivitetsenheter av DNA-ligas av fag T4. Ligering genomföres vid 16°C under 14 timmar. 10 ul av den erhållna lösningen användes för transforma- tion av celler av E.coli, stam j.M.109. De transformerade celler- na utbredes på L-agar innehållande 25 pg ampicillin per ml, 0,l% X-gal och 0,1% IPTG. Celler från fem ljusblåa kolonier odlas i P10 ml L-medium innehållande 100 pg ampicillin per ml, och ca 465 576 13 10 pg DNA av difasmiden isoleras, spjälkas med restriktions- enzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl III och Sal I och analyseras genom elektrofores på agarosgel. Två av fem analysera- de DNA-prover visade sig vara identiska med utgångs-SK6, under det att de andra tre icke innehöll Eco RI-segmentet före tetra- cyklin-promotorn. De har sålunda det förutsagda restriktions- mönstret (se fig lb).Approximately 10 pg of DNA is isolated by alkaline lysis. 0.5 pg DNA digested with the restriction enzymes Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II and Sal I and analyzed by electrophoresis on agarosgel. All five diphasmids have the predicted restriction the pattern (see Fig. 1b), and one of the diphasmids, namely SK6, was reversed in subsequent steps. 5 pg of SK6 is partially hydrolyzed with the restriction enzyme Eco RI, and the linear shape of the difasmid is purified by electrophoresis in low-melting agarose. The preparation obtained is treated for 20 hours minutes at a temperature of 20 ° C in 45 μl of a solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM MgCl 2, 10 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 50 pM of each of the four deoxynucleoside triphosphates and five activity units of the Klenow fragment of DNA polymerase I. To the solution is then added 5 μl of a buffer containing soo mm tris-Hcl (pH 7.5), 100 mM Mgclz, 100 mM dithiothreitol, 30 mM adenosine triphosphate and 20 activity units of DNA ligase of phage T4. Ligation is performed at 16 ° C for 14 days hours. 10 μl of the resulting solution was used for transformation tion of cells of E.coli, strain j.M.109. The transformed cells spread on L-agar containing 25 pg ampicillin per ml, 0.1% X-gal and 0.1% IPTG. Cells from five light blue colonies are grown in P10 ml L-medium containing 100 pg ampicillin per ml, and approx 465 576 13 10 pg of DNA of the diphasmid is isolated, digested with restriction the enzymes Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl III and Sal I and analyzed by agarose gel electrophoresis. Two out of five analyzes the DNA samples were found to be identical to starting SK6, below that the other three did not contain the Eco RI segment before tetra- the cyclin promoter. They thus have the predicted restriction the pattern (see Fig. lb).
Den utvunna difasmiden kallas SKl8'. 0,5 ug SK18' hydrolyse- ras fullständigt med restriktionsenzymet Acc I, och de kohesiva ändarna av Acc I-segmentet, som befinner sig utanför polylänken, utfylles med hjälp av Klenow-fragment i närvaro av dATP och dTTP. Det resulterande fragmentet behandlas med DNA-ligas av fag T4 (fem aktivitetsenheter) i 50 pl av en lösning innehållande 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol och 3 mM adenosintrifosfat vid 16°C över natten. 10 ul av den erhållna lösningen användes för transformation av celler av E.coli, stam j.M.lO9, och de transformerade cellerna utbredes på L-agar inne- hållande 25 ug ampicillin per ml, 0,1% X-gal och 0,1% IPTG.The recovered diphasmid is called SKl8 '. 0.5 μg SK18 'hydrolysis completely with the restriction enzyme Acc I, and the cohesive ones the ends of the Acc I segment, which are outside the polylinker, completed using Klenow fragments in the presence of dATP and dTTP. The resulting fragment is treated with phage DNA ligase T4 (five activity units) in 50 μl of a solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2, 10 mM dithiothreitol and 3 mM adenosine triphosphate at 16 ° C overnight. 10 μl of the obtained the solution was used to transform cells of E. coli strain j.M.109, and the transformed cells were spread on L-agar containing containing 25 ug ampicillin per ml, 0.1% X-gal and 0.1% IPTG.
Celler från sex ljusblåa kolonier odlas i 10 ml L-medium inne- hållande 100 pg ampicillin per ml, och ungefär 10 pg DNA isoleras genom alkalisk lysis. 0,5 pg DNA spjälkas med restriktionsenzymet Acc I och analyseras genom elektrofores på agarosgel. Fyra plas- mider visade sig vara identiska med SK18', under det att två in- nehöll endast ett Acc I-segment. Denna difasmid kallas SKI8 (se fig 2), och den användes i efterföljande steg.Cells from six light blue colonies are grown in 10 ml of L-medium containing containing 100 pg ampicillin per ml, and approximately 10 pg DNA is isolated by alkaline lysis. 0.5 pg of DNA is digested with the restriction enzyme Acc I and analyzed by electrophoresis on agarose gel. Four places mids were found to be identical to SK18 ', while two contained only one Acc I segment. This difasmid is called SKI8 (see Fig. 2), and it was used in subsequent steps.
Difasmiden SKl8 hydrolyseras med restriktionsenzymet Bgl II, och reaktionen avbrytes genom värmning vid 65°C under 15 minuter.The diphasmid SK18 is hydrolyzed with the restriction enzyme Bgl II, and the reaction is quenched by heating at 65 ° C for 15 minutes.
DNA-materialet utspädes trefaldigt, varefter självligering genom- föres. Den ligerade DNA användes för transformation av celler av E.coli, stam j.M.lO9, och de transformerade cellerna utbredes på L-agar innehållande antibiotikumet ampicillin. Celler från tio kolonier odlas i 10 ml L-medium innehållande ampicillin, och DNA isoleras genom alkalisk lysis. 0,5 pg DNA spjälkas med restrik- tionsenzymerna Eco RI, Bam I, Sal I och Bgl II och analyseras genom elektrofores på 1-procentig agarosgel. Sex fasmider har det förutsagda restriktionsmönstret, och en av dessa, kallad SKZA, användes för konstruktion av ÄiSK9. Fasmiden SKZA skiljer 465 576 14 sig från fasmiden SK2 genom frånvaro av igenkänningssegment för restriktionsenzymerna Eco RI och Acc I, vilka befinner sig utan- för polylänken. Sålunda innehåller fasmiden SK2A ett fragment av fasmiden pBR322 med replikationsstartställe och en gen som ger ampicillinresistens samt ett fragment av fag M13 mp 18 med poly- länken, en gen lac z och ett segment som ansvarar för packningen av den enkelsträngade DNA i protoner av fag M13. SKZA har en storlek av ca 4,5 kb.The DNA material is diluted threefold, after which self-ligation is performed. brought. The ligated DNA was used to transform cells of E.coli, strain j.M.109, and the transformed cells spread on L-agar containing the antibiotic ampicillin. Cells from ten colonies are grown in 10 ml of L-medium containing ampicillin, and DNA isolated by alkaline lysis. 0.5 pg of DNA is digested with restriction the enzymes Eco RI, Bam I, Sal I and Bgl II and analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel. Six fasmids have the predicted restriction pattern, and one of these, called SKZA, used for construction of ÄiSK9. The fasmid SKZA differs 465 576 14 from the phase center SK2 due to the absence of recognition segments for the restriction enzymes Eco RI and Acc I, which are outside the for the polylinker. Thus, the phase mite SK2A contains a fragment of the phase mite pBR322 with origin of replication and a gene that provides ampicillin resistance and a fragment of phage M13 mp 18 with poly- the link, a gene lac z and a segment responsible for the packing of the single-stranded DNA in protons of phage M13. SKZA has one size of about 4.5 kb.
Igenkänningssegmentet för restriktionsenzymet Sal I i fas- miden SK2A avlägsnas därefter. Fasmiden SKZA hydrolyseras härvid med restriktionsenzymet Sal I, och reaktionen avbrytes genom värmning vid 65°C under 15 minuter. De enkeltrådiga ändarna omvandlas till dubbeltrådiga ändar med hjälp av Klenow-fragment av DNA-polymeras I från E.coli i närvaro av alla fyra deoxi- nukleosidtrifosfaterna. DNA-lösningen utspädes sedan trefaldigt, och självligering genomföres. Den ligerade DNA införes i celler av E.coli, stam j.M.109. De resulterande bakterierna utbredes i Petriskålar på 2-procentig L-agar innehållande 25 pg ampicillin per ml, 0,1% IPTG och 0,1% X-gal. DNA isoleras från tio vita kolonier enligt standardmetoder och analyseras med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Man utvinner en fasmid kallas SK2¿lS, vilken innehåller igenkänningssekvenserna för restriktionsenzymerna Eco RI och Bam I men icke innehåller igenkänningssekvensen för restriktionsenzymet Sal I. Denna fasmid användes i efterföljande steg, där igenkänningssekvensen för restriktionsenzymet Eco RI avlägsnas. Härvid hydrolyseras SK2 S med restriktionsenzymet Eco RI, varvid reaktionen avbrytes genom värmning vid 65°C under 15 minuter. De enkeltrådiga ändarna om- vandlas till dubbeltrådiga ändar med hjälp av Klenow-fragment i närvaro av alla fyra deoxinukleosidtrifosfaterna. DNA-lösningen utspädes sedan trefaldigt, och självligering genomföres. Den ligerade DNA spjälkas med restriktionsenzymet Eco RI och införes i celler av E.coli, stam j.M.109. De resulterande bakterierna ut- bredes på L-agar innehållande 25 pg ampicillin per ml. DNA isole- ras från tio kolonier enligt standardmetoder och analyseras med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Den fasmid som innehåller igenkänningssekvensen för Bam I men icke 465 576 15 innehåller igenkänningssekvenserna för Eco RI och Sal I kallas SK2¿1SR, och denna fasmid användes för framställning av en re- kombinantfasmid gSR. DNA av fag Ã_gtII hydrolyseras med restrik- tionsenzymet Bam I, och enzymet inaktiveras genom upphettning.The recognition segment for the restriction enzyme Sal I in phase miden SK2A is then removed. The fasmid SKZA is hydrolyzed in this case with the restriction enzyme Sal I, and the reaction is stopped by heating at 65 ° C for 15 minutes. The single-wire ends converted to double-stranded ends using Klenow fragments of DNA polymerase I from E.coli in the presence of all four deoxy- the nucleoside triphosphates. The DNA solution is then diluted threefold, and self-ligation is carried out. The ligated DNA is introduced into cells of E.coli, strain j.M.109. The resulting bacteria spread in Petri dishes on 2% L-agar containing 25 pg ampicillin per ml, 0.1% IPTG and 0.1% X-gal. DNA is isolated from ten whites colonies according to standard methods and analyzed using the restriction enzymes Eco RI, Bam I and Sal I. One is recovered fasmid is called SK2¿lS, which contains the recognition sequences for the restriction enzymes Eco RI and Bam I but does not contain the recognition sequence for the restriction enzyme Sal I. This phase medium was used in the subsequent steps, where the recognition sequence for the restriction enzyme Eco RI is removed. SK2 S is hydrolyzed with the restriction enzyme Eco RI, the reaction being stopped by heating at 65 ° C for 15 minutes. The single-wire ends converted to double-stranded ends using Klenow fragments in presence of all four deoxynucleoside triphosphates. The DNA solution then diluted threefold, and self-ligation is performed. The ligated DNA is digested with the restriction enzyme Eco RI and introduced in cells of E.coli, strain j.M.109. The resulting bacteria spread on L-agar containing 25 pg ampicillin per ml. DNA isolate from ten colonies according to standard methods and analyzed with using the restriction enzymes Eco RI, Bam I and Sal I. Den phasmid containing the Bam I recognition sequence but not 465 576 15 contains the recognition sequences for Eco RI and Sal I is called SK2¿1SR, and this phase agent was used to prepare a combinatorial fasmid gSR. DNA of phage αgtII is hydrolyzed by restriction. the enzyme Bam I, and the enzyme is inactivated by heating.
De kohesiva ändarna av fag fi sammanhäktas genom att DNA-lösning- en inkuberas vid 42°C under 1 timme. Det centrala Bam I-fragmen- tet med en storlek av ca 6,5 kb renas genom elektrofores i 0,7- -procentig lågsmältande agaros (preparat A). Fasmiden SK2¿ÄSR hydrolyseras med restriktionsenzymet Bam I, och efter inaktive- ring av enzymet genom upphettning ligeras det resulterande frag- mentet med preparat A. Den ligerade DNA införes i celler av E.coli, stam j.M.lO9, och de resulterande cellerna utbredes på L-agar innehållande 25 pg ampicillin per ml. Avtryck av de till- växta kolonierna göres på nitrocellulosafilter, och hybridisering genomföres med preparat A, vars DNA märkes med 329 med hjälp av nick-translation. Cellerna från de kolonier som hybridiserar sig med preparat A odlas i 10 ml L-medium innehållande 100 pg ampi- cillin per ml, och plasmid-DNA isoleras enligt standardmetoder.The cohesive ends of phage fi are bound together by DNA solution one is incubated at 42 ° C for 1 hour. The central Bam I fragment with a size of about 6.5 kb is purified by electrophoresis in 0.7 -percent low-melting agarose (preparation A). The fasmid SK2¿ÄSR hydrolyzed with the restriction enzyme Bam I, and after inactivation heating of the enzyme by heating, the resulting fragment is ligated the ligated DNA is introduced into cells of E.coli, strain j.M.109, and the resulting cells were spread on L-agar containing 25 pg ampicillin per ml. Impressions of the the grown colonies are made on nitrocellulose filters, and hybridization is carried out with preparation A, whose DNA is labeled with 329 using nick-translation. The cells from the colonies that hybridize with preparation A is grown in 10 ml of L-medium containing 100 pg of ampicillin. cillin per ml, and plasmid DNA is isolated according to standard methods.
Analys av den sålunda erhållna DNA med hjälp av restriktions- enzymerna Eco RI, Bam I och Sal I bekräftar kloning av segmentet ÃgtII i fasmiden SK2¿ÄSR. Den erhållna fasmiden, som kallas gSR, användes för framställning av en fagvektor Ã_gES7 (se fig 3). Fasmiden gSR hydrolyseras med restriktionsenzymet Bgl II, och enzymet inaktiveras genom upphettning. Fag /IEMBL3 hydrolyse- ras med restriktionsenzymet Bam I, och enzymet inaktiveras. De båda DNA-preparaten blandas i ekvimolära mängder och ligeras.Analysis of the DNA thus obtained by means of restriction the enzymes Eco RI, Bam I and Sal I confirm cloning of the segment ÃgtII i fasmiden SK2¿ÄSR. The obtained phase mite, which is called gSR, was used to produce a phage vector Ã_gES7 (see Fig 3). The fasmid gSR is hydrolyzed with the restriction enzyme Bgl II, and the enzyme is inactivated by heating. Phage / IEMBL3 hydrolysis with the restriction enzyme Bam I, and the enzyme is inactivated. The both DNA preparations are mixed in equimolar amounts and ligated.
Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag 1%, och de erhållna fagpartiklarna utbredes på ett medium innehållande celler av E.coli, stam LE392, och 0,1% X-gal. Från tio ljusblåa hopgyttringar utvinnes en fag. DNA isoleras och analyseras med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. En av fagerna, som kallas /(gES7, har den förväntade strukturen (se fig 3). Denna fag användes i efterföljande steg.The ligated DNA is packaged in vitro in 1% phage proteins, and they the obtained phage particles are spread on a medium containing cells of E.coli, strain LE392, and 0.1% X-gal. From ten light blue composting is extracted a subject. DNA is isolated and analyzed with using the restriction enzymes Eco RI, Bam I and Sal I. One of the phages, called / (gES7), have the expected structure (see fig 3). This phage was used in subsequent steps.
Fag /LEMBL3 hydrolyseras med restriktionsenzymet Bam I, och ett insättningsfragment med en storlek av ca 13,7 kb renas genom elektrofores på 0,7-procentig lågsmältande agaros (preparat B).Phage / LEMBL3 are hydrolyzed with the restriction enzyme Bam I, and an insertion fragment with a size of about 13.7 kb is purified through electrophoresis on 0.7% low-melting agarose (Preparation B).
Fag Å.gES7 hydrolyseras med restriktionsenzymet Bam I, och 465 576 16 "armarna" renas genom elektrofores på lågsmältande agaros (pre- parat C)- Preparaten B och C blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag,Å , och de resulterande fagpartiklarna utbredes på ett medium inne- hållande celler av E.coli, stam LE392. En fag utvinnes ur sex hopgyttringar, och DNA avskiljes och analyseras med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Den önskade fag- vektorn Å-SK9 isoleras. Denna vektor har den i fig 4 visade strukturen.Phage Å.gES7 is hydrolyzed with the restriction enzyme Bam I, and 465 576 16 the "arms" are purified by electrophoresis on low-melting agarose (pre- Preparations C) - Preparations B and C are mixed in equimolar amounts and ligeras. The ligated DNA is packaged in vitro in proteins of phage, Å, and the resulting phage particles are spread on a medium containing holding cells of E.coli, strain LE392. A subject is extracted from sex agglomerations, and DNA is separated and analyzed using the restriction enzymes Eco RI, Bam I and Sal I. The desired phage the vector Å-SK9 is isolated. This vector has the one shown in Fig. 4 the structure.
Exempe12 Kloning av fragment av human-DNA i ÉÄSK9. 3 pg human-DNA spjälkas med restriktionsenzymet Bam I under standardbetingelser, och enzymet inaktiveras genom värmning vid 65°C under 15 minuter. 3 pg ÉLSK9 hydrolyseras med restriktions- enzymerna Bam I och Eco RI, och enzymerna inaktiveras genom upp- hettning. De båda preparaten blandas med varandra (viktförhållan- det mellan DNA-vektorn och human-DNA är 1:1), och ligering genom- föres vid en total DNA-koncentraton av ungefär 250 pg/ml. 0,01 pg ligerad DNA packas in vitro i proteiner av fag /1, och 1/500 av de erhållna fagpartiklarna utbredes på ett medium innehållande E.coli, stam Q359. Celler från sex slumpmässigt valda hopgytt- ringar odlas i 10 ml L-medium med LE392, varpå DNA isoleras. En elektroforetisk analys av DNA visar, att samtliga fager är re- kombinanter innehållande en DNA-insats med storleken 10-15 kb. 0,5 pg av en av dessa fager (fag nr 1) hydrolyseras under 30 mi- nuter med en enhet av restriktionsenzymet Sal I. Enzymet inakti- veras genom trefaldig frysning och upptining. DNA-lösningen ut- bredes och ligeras vid rumstemperatur under 1 timme. 0,1 pg av den ligerade DNA sättes till kompetenta celler av E.coli, stam j.M.109. Blandningen inkuberas vid en temperatur av 0°C under 10 minuter, sedan vid en temperatur av 38°C under 5 minuter och slutligen vid en temperatur av 37°C under 45 minuter efter till- sättning av 1 ml L-medium. 0,2 ml av de resulterande cellerna utbredes på L-agar innehållande 25 pg ampicillin per ml. Celler från tre kolonier odlas i 10 ml L-medium innehållande 50 pg am- picillin per ml, och DNA isoleras genom alkalisk lysis. Elektro- 465 576 17 foretisk DNA-analys visar att plasmiderna innehåller samma DNA- -insats som utgångsfagen nr 1.Example12 Cloning of fragments of human DNA in ÄÄSK9. 3 pg of human DNA is digested with the restriction enzyme Bam I below standard conditions, and the enzyme is inactivated by heating at 65 ° C for 15 minutes. 3 pg of ELSK9 are hydrolyzed with restriction the enzymes Bam I and Eco RI, and the enzymes are inactivated by hood. The two preparations are mixed with each other (weight ratio that between the DNA vector and human DNA is 1: 1), and ligation by carried at a total DNA concentration of approximately 250 pg / ml. 0.01 pg ligated DNA is packaged in vitro in proteins of phage / 1, and 1/500 of the obtained phage particles are spread on a medium containing E.coli, strain Q359. Cells from six randomly selected rings are grown in 10 ml of L-medium with LE392, after which DNA is isolated. One electrophoretic analysis of DNA shows that all phages are re- combinations containing a DNA insert with the size 10-15 kb. 0.5 pg of one of these phages (Phage No. 1) is hydrolyzed for 30 minutes. nuts with one unit of the restriction enzyme Sal I. The enzyme is inactivated caused by triple freezing and thawing. The DNA solution spread and ligated at room temperature for 1 hour. 0.1 pg av the ligated DNA is added to competent cells of E. coli strain j.M.109. The mixture is incubated at a temperature of 0 ° C for 10 minutes minutes, then at a temperature of 38 ° C for 5 minutes and finally at a temperature of 37 ° C for 45 minutes after addition of 1 ml of L-medium. 0.2 ml of the resulting cells spread on L-agar containing 25 pg ampicillin per ml. Cells from three colonies are grown in 10 ml of L-medium containing 50 pg of am- picillin per ml, and DNA is isolated by alkaline lysis. Electro- 465 576 17 Pharmaceutical DNA analysis shows that the plasmids contain the same DNA -input as the starting subject no. 1.
Vektorn Ã,SK9 enligt uppfinningen är avsedd för framställ- ning av genbanker enligt den "klassiska" metoden. Vektorn Ã.SK9 gör det möjligt att lätt avlägsna "armarna" från fag fl, och insatsen kan lätt omvandlas till plasmidform. När celler av E.coli innehållande plasmiden infekteras med hjälpfagen M13, packas plasmiden i proteiner av fag M13 och övergår i enkel- strängad form. Fagen gör det möjligt att med hjälp av en kommer- siellt tillgänglig primer specifikt märka insatsens 5'- och 3'- -ändar, och närvaron av igenkänningssekvenser för nio restrik- tionsenzymer i polylänken underlättar avsevärt strukturbestämning av insatsen.The vector Ã, SK9 according to the invention is intended for gene banks according to the "classical" method. The vector Ã.SK9 makes it possible to easily remove the "arms" from phage fl, and the insert can be easily converted to plasmid form. When cells of E.coli containing the plasmid is infected with the helper phage M13, the plasmid is packed into proteins of phage M13 and undergoes single stringed form. The subject makes it possible to use a commercial commercially available primer specifically label the 5 'and 3' insert of the insert ends, and the presence of recognition sequences for nine restrictions ions enzymes in the polylinker considerably facilitate structural determination of the effort.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884466372A SU1650698A1 (en) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | Phage vector k9 for constructing of genome libraries |
| PCT/SU1989/000204 WO1990001062A1 (en) | 1988-07-28 | 1989-07-27 | PHAGE VECTOR μ SK9 FOR CONSTRUCTION OF GENOME LIBRARIES |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE9001070L SE9001070L (en) | 1990-03-23 |
| SE9001070D0 SE9001070D0 (en) | 1990-03-23 |
| SE465576B true SE465576B (en) | 1991-09-30 |
Family
ID=21392243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE9001070A SE465576B (en) | 1988-07-28 | 1990-03-23 | Phage vector lambda SK9 for preparing gene libraries |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03501331A (en) |
| GB (1) | GB2228938A (en) |
| SE (1) | SE465576B (en) |
| SU (1) | SU1650698A1 (en) |
| WO (1) | WO1990001062A1 (en) |
-
1988
- 1988-07-28 SU SU884466372A patent/SU1650698A1/en active
-
1989
- 1989-07-27 WO PCT/SU1989/000204 patent/WO1990001062A1/en not_active Ceased
- 1989-07-27 JP JP1508623A patent/JPH03501331A/en active Pending
-
1990
- 1990-03-22 GB GB9006475A patent/GB2228938A/en not_active Withdrawn
- 1990-03-23 SE SE9001070A patent/SE465576B/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03501331A (en) | 1991-03-28 |
| SE9001070L (en) | 1990-03-23 |
| GB2228938A (en) | 1990-09-12 |
| SE9001070D0 (en) | 1990-03-23 |
| SU1650698A1 (en) | 1991-05-23 |
| WO1990001062A1 (en) | 1990-02-08 |
| GB9006475D0 (en) | 1990-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Delaroque et al. | The complete DNA sequence of the Ectocarpus siliculosus virus EsV-1 genome | |
| Matthews et al. | The cloning of chromosomal DNA associated with methicillin and other resistances in Staphylococcus aureus | |
| Condit et al. | Isolation, characterization, and physical mapping of temperature-sensitive mutants of vaccinia virus | |
| Méchali et al. | Lack of specific sequence requirement for DNA replication in Xenopus eggs compared with high sequence specificity in yeast | |
| Owen et al. | Characterization of cucumber mosaic virus I. Molecular heterogeneity mapping of RNA 3 in eight CMV strains | |
| Neimark et al. | Isolation and characterization of full‐length chromosomes from non‐culturable plant‐pathogenic Mycoplasma‐like organisms | |
| Cai et al. | Construction and characterization of a bovine bacterial artificial chromosome library | |
| Liu et al. | Use of arbitrarily primed polymerase chain reaction to differentiate Trichophyton dermatophytes | |
| CN110183525B (en) | TXR protein related to wheat stripe rust resistance and its encoding gene and application | |
| Ley et al. | Molecular cloning of African swine fever virus DNA | |
| EP0336412A2 (en) | Synthetic oligonucleotides useful for the determination of Chlamydia trachomatis in a biological sample | |
| Bainbridge | Genetics of microbes | |
| JPH04502107A (en) | Methods for enrichment and cloning of DNA with insertions or corresponding to deletions | |
| Abraham et al. | Cloning and analysis of the Clostridium perfringens tetracycline resistance plasmid, pCW3 | |
| Hong et al. | Construction of a BAC library and generation of BAC end sequence-tagged connectors for genome sequencing of the African malaria mosquito Anopheles gambiae | |
| JPH0527400B2 (en) | ||
| Bloom et al. | Characterization of the Aleutian disease virus genome and its intracellular forms | |
| Grambow et al. | Deletion analysis of a bacteriophage P2 late promoter | |
| US6391631B1 (en) | Bacterial plasmids | |
| Samson et al. | The 5S ribosomal genes in the Drosophila melanogaster species subgroup. Nucleotide sequence of a 5S unit from Drosophila simulans and Drosophila teissieri | |
| CN108842000B (en) | Primer set for identifying DAdV-3 and DAdV-A | |
| US5863730A (en) | Procedure for the polymerization of nucleic acid sequences and its applications | |
| CN116555276A (en) | A method for gene knockout and selection of fkbp10a gene-deleted zebrafish | |
| Yin et al. | Dictyostelium giganteum plasmid Dgp1 is a member of the Ddp2 plasmid family | |
| JP2009514506A (en) | E. Plasmid-free clone of E. coli strain DSM6601 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NAV | Patent application has lapsed |
Ref document number: 9001070-3 Effective date: 19920622 Format of ref document f/p: F |