SE512994C2 - Biosensor cell device and its use - Google Patents
Biosensor cell device and its useInfo
- Publication number
- SE512994C2 SE512994C2 SE9803238A SE9803238A SE512994C2 SE 512994 C2 SE512994 C2 SE 512994C2 SE 9803238 A SE9803238 A SE 9803238A SE 9803238 A SE9803238 A SE 9803238A SE 512994 C2 SE512994 C2 SE 512994C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- analyte
- pna
- cell device
- biosensor cell
- interaction partner
- Prior art date
Links
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 41
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 29
- SPSSULHKWOKEEL-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrotoluene Chemical compound CC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O SPSSULHKWOKEEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000002360 explosive Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 239000000015 trinitrotoluene Substances 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108050001605 Galanin receptor Proteins 0.000 description 4
- 102000011392 Galanin receptor Human genes 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000860415 Homo sapiens Galanin peptides Proteins 0.000 description 2
- 101001061554 Homo sapiens Galanin receptor type 1 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 102000050963 human GAL Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- DYSXLQBUUOPLBB-UHFFFAOYSA-N 2,3-dinitrotoluene Chemical compound CC1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1[N+]([O-])=O DYSXLQBUUOPLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710205515 Galanin receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028447 Galanin receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000002002 Neurokinin-1 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010040718 Neurokinin-1 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000012162 RNA isolation reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101001072781 Rattus norvegicus Galanin receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 235000015250 liver sausages Nutrition 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- XYSQXZCMOLNHOI-UHFFFAOYSA-N s-[2-[[4-(acetylsulfamoyl)phenyl]carbamoyl]phenyl] 5-pyridin-1-ium-1-ylpentanethioate;bromide Chemical compound [Br-].C1=CC(S(=O)(=O)NC(=O)C)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC=C1SC(=O)CCCC[N+]1=CC=CC=C1 XYSQXZCMOLNHOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
- G01N29/02—Analysing fluids
- G01N29/022—Fluid sensors based on microsensors, e.g. quartz crystal-microbalance [QCM], surface acoustic wave [SAW] devices, tuning forks, cantilevers, flexural plate wave [FPW] devices
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
- G01N29/02—Analysing fluids
- G01N29/036—Analysing fluids by measuring frequency or resonance of acoustic waves
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
- G01N29/22—Details, e.g. general constructional or apparatus details
- G01N29/222—Constructional or flow details for analysing fluids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/0877—Flow chambers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2291/00—Indexing codes associated with group G01N29/00
- G01N2291/02—Indexing codes associated with the analysed material
- G01N2291/025—Change of phase or condition
- G01N2291/0255—(Bio)chemical reactions, e.g. on biosensors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2291/00—Indexing codes associated with group G01N29/00
- G01N2291/02—Indexing codes associated with the analysed material
- G01N2291/025—Change of phase or condition
- G01N2291/0256—Adsorption, desorption, surface mass change, e.g. on biosensors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2291/00—Indexing codes associated with group G01N29/00
- G01N2291/04—Wave modes and trajectories
- G01N2291/042—Wave modes
- G01N2291/0426—Bulk waves, e.g. quartz crystal microbalance, torsional waves
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
llll 10 15 20 25 30 512 994 2 (Jmf t ex Wang J. et al, Mismatch-Sensitive Hybridization Detection by Peptide Nucleic Acids Immobilized on a Quartz Crystal Microbalance, Anal.Chem.l997,69,5200-5202). llll 10 15 20 25 30 512 994 2 (Cf. e.g. Wang J. et al., Mismatch-Sensitive Hybridization Detection by Peptide Nucleic Acids Immobilized on a Quartz Crystal Microbalance, Anal.Chem.l997.69,5200-5202).
Det är uppenbart att tillämpningen vid rutinanalys med tillgängliga QCA system är komplicerad på grund av det faktum att de inte kan stabiliseras på korta tidsintervaller och därtill att tillgängliga QCA system inte är lämpliga för bärbara detektionssystem.It is obvious that the application in routine analysis with available QCA systems is complicated due to the fact that they can not be stabilized at short time intervals and in addition that available QCA systems are not suitable for portable detection systems.
Kort beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning är inriktad på en ny QCA anordning eller system som är tillförlitlig, stabil, snabb och känslig. Den nya anordningen eller systemet enligt uppfinningen omfattar en sluten testkammarkavitet som är fylld med lösningsmedel/vatten eller buffertlösning, med eller utan analyt, och den är särskilt lämplig för tillämpningar där testkaminarens läge kan variera, såsom vid bärbara detektionssystem.Brief Description of the Invention The present invention is directed to a novel QCA device or system that is reliable, stable, fast and sensitive. The new device or system according to the invention comprises a closed test chamber cavity filled with solvent / water or buffer solution, with or without analyte, and it is particularly suitable for applications where the position of the test chamber may vary, such as in portable detection systems.
Biosensorcellanordningen enligt uppfinningen omfattar en testkammarkavitet och en piezoelektrisk kristall som är belagd, på den yta som vetter mot testkarnmarkaviteten, med en interaktionspartner till en analyt, varvid kristallen är ansluten till en oscillationsenhet och signalbearbetnlngselektronik, vilken anordning ytterligare omfattar en inloppsnål för införande av analyten, vilken nål slutar på ett litet avstånd från änden av, och innanför, en inloppsärm för införande av buffertlösning, vilken slutar i närheten av kristallens aktiva yta, varvid inloppsärmen är ansluten till ett inlopp för buffertlösning, och ett utlopp för överskottsvätska. lnloppsnålen kan vara en automatisk inj ektor eller injektionsspruta.The biosensor cell device of the invention comprises a test chamber cavity and a piezoelectric crystal coated, on the surface facing the test core cavity, with an interaction partner to an analyte, the crystal being connected to an oscillation unit and signal processing electronics, the device further comprising an inlet for an inlet. which needle terminates at a small distance from the end of, and inside, an inlet sleeve for introducing buffer solution, which terminates in the vicinity of the active surface of the crystal, the inlet arm being connected to an inlet for buffer solution, and an outlet for excess liquid. The needle can be an automatic injector or syringe.
Därtill kan den piezoelektriska kristallen vara belagd med två eller flera olika interaktionspartners som var och en interagerar med en olik analyt.In addition, the piezoelectric crystal may be coated with two or two different interaction partners, each interacting with a different analyte.
I ett exempel är interaktionspartnern en antikropp som specifikt binder till analyten (antigen), t ex vald bland narkotika och sprängämnen, såsom 2,4,6-trinitrotoluen (TNT).In one example, the interaction partner is an antibody that specifically binds to the analyte (antigen), eg selected from drugs and explosives, such as 2,4,6-trinitrotoluene (TNT).
I ett annat exempel är interaktionspartnem en peptidnukleinsyra (PNA) oligomer och analyten är en polynukleotid, eller vice versa. Polynukleotiden kan väljas från den grupp som består av RNA, DNA och PNA och PNA polymerer som är kornplementära till PNA oligomeren.In another example, the interaction partner is a peptide nucleic acid (PNA) oligomer and the analyte is a polynucleotide, or vice versa. The polynucleotide can be selected from the group consisting of RNA, DNA and PNA and PNA polymers that are grain complementary to the PNA oligomer.
Biosensorcellanordningen enligt uppfinningen kan användas för både kvalitativ och kvantitativ analys av åtminstone en analyt och/eller dess interaktionspartner.The biosensor cell device according to the invention can be used for both qualitative and quantitative analysis of at least one analyte and / or its interaction partner.
KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA Fig. 1. visar en sidovy av de delar av en biosensor som omfattar en tlödescell/test- kammarkavitet.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1. shows a side view of the parts of a biosensor that comprise a solution cell / test chamber cavity.
T:\PATENT\29-\29454\svenskmt.doc _ 10 15 20 25 30 512 994 3 Fig. 2. visar delvis ett tvärsnitt av cellen där flödet (pilar) är anordnat att passera över kristallens yta för både inlopp av buffert och testprover.T: \ PATENT \ 29- \ 29454 \ svenskmt.doc _ 10 15 20 25 30 512 994 3 Fig. 2. shows in part a cross section of the cell where the fl fate (arrows) is arranged to pass over the surface of the crystal for both inlet of buffer and test samples.
Fig. 3. A. Analys av 1 pg av 21-mer oligodeoxinukleotiden som är komplementär till 2 l -mer PNA.Fig. 3. A. Analysis of 1 pg of the 21-mer oligodeoxynucleotide complementary to 2-mer PNA.
B. Analys av 1 pg av 21-mer oligodeoxinukleotiden med blandad PNA 21-mer.B. Analysis of 1 pg of the 21-mer oligodeoxynucleotide with mixed PNA 21-mer.
Fig. 4. Analys av 1 pg av pRK8-hGaIRl med komplementären till hGaIRI sekvens PNA 21-mer.Fig. 4. Analysis of 1 pg of pRK8-hGaIR1 with the complementary to hGaIRI sequence PNA 21-mer.
Fig. 5. Analys av totalt RNA från human melanom-cellinje Bowes med PNA 21-mer komplementär till hGaIRI cDNA.Fig. 5. Analysis of total RNA from human melanoma cell line Bowes with PNA 21-mer complementary to hGaIRI cDNA.
A: 18 pg RNA.A: 18 pg RNA.
B: 80 pg RNA.B: 80 pg RNA.
Fig. 6. Analys av dsDNA (348 pg) från human melanom-cellinje Bowes med komplementär till hGaIRI PNA 21-mer.Fig. 6. Analysis of dsDNA (348 pg) from human melanoma cell line Bowes with complementary to hGaIRI PNA 21-mer.
DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Biosensorcellanordningen enligt uppfinningen används vid piezoelektrisk bestämning av en analyt, och den omfattar en flödescell, i vilken lösningsmedlet/vattnet eller buffert- lösningen, med eller utan analyt, passerar över en oscillerande kvartskristallsyta, vilken är belagd med en skiktad struktur som exponerar för lösningen en interaktionspartner till en analyt, t ex ett antikroppkomplex som är aktivt mot analyten, såsom TNT. Interaktions- partnem interagerar med analyten, t ex antikroppar binder till analyten, i lösningen, och viktskillnaden, vid kristallens yta, ger en liten förändring av resonansfrekvensen i den elektroniska kretsen som infórlivar kristallen.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The biosensor cell device of the invention is used in piezoelectric determination of an analyte, and it comprises a fate cell in which the solvent / water or buffer solution, with or without analyte, passes over an oscillating quartz crystal surface coated with a layer coated with a layer. exposes to the solution an interaction partner to an analyte, such as an antibody complex active against the analyte, such as TNT. The interaction partner interacts with the analyte, eg antibodies bind to the analyte, in the solution, and the weight difference, at the surface of the crystal, gives a small change in the resonant frequency in the electronic circuit which incorporates the crystal.
När antalet interaktionspartners, t ex antikroppar, som är tillgängliga för interaktion med eller binder till analyten minskas på grund av komplexbildningen med analyten i testlösningen, kommer känsligheten att sjunka och cellen upphör att fungera. Då ersätts kvartskristallen med en annan som har en ny beläggning.When the number of interaction partners, eg antibodies, available for interaction with or binding to the analyte is reduced due to the complexation with the analyte in the test solution, the sensitivity will decrease and the cell will cease to function. Then the quartz crystal is replaced with another that has a new coating.
I en automatiserad utföringsfonn detekteras denna situation av en signalbearbetnings- enhet, och ett automatiskt eller manuellt utbyte till en ny flödescell äger rum.In an automated embodiment, this situation is detected by a signal processing unit, and an automatic or manual exchange to a new fate cell takes place.
Avtappningsröret från en biosensorflödescell kan direkt anslutas till inloppet hos en annan, varigenom känslighet för en arman analyt tillförs, såsom ett sprängämne eller ett narkotikum, eller kan ett multisensorsystem av parallella biosensorer arrangeras genom delning av inloppet till ett antal flödesceller.The drain tube from one biosensor flow cell can be directly connected to the inlet of another, thereby supplying sensitivity to another analyte, such as an explosive or a drug, or a multisensor system of parallel biosensors can be arranged by dividing the inlet into a number of fate cells.
T:\PATEN1\29-\29454\svenskbtt.doc 10 15 20 25 30 '512 994 4 Uppñnningen kommer nu att belysas med hänvisning till åtföljande ritningar, utföringsformer och exempel. Uppfinningen, är inte avsedd att begränsas till dessa specifika uppgifter.T: \ PATEN1 \ 29- \ 29454 \ svenskbtt.doc 10 15 20 25 30 '512 994 4 The invention will now be elucidated with reference to the accompanying drawings, embodiments and examples. The invention is not intended to be limited to these specific tasks.
Bottendelen (40) är anpassad till den faktiska kristallens (41) utformning. Kristallen hålls på plats av en övre del som omfattar testkammarkaviteten (42), två gummiringar (43) och en förskjutbar yttre låshylsa (44). Den övre delen av cellen bringas i sitt korrekta läge av en styrpinne (46) och två skruvar (45). Cellen har ett inlopp för buffertlösning (47), ett utlopp för överskottsvätska (48) och ett testprovinlopp (49). Testprovinloppet visas med en injektionsspruta för manuell injektion.The bottom part (40) is adapted to the design of the actual crystal (41). The crystal is held in place by an upper part comprising the test chamber cavity (42), two rubber rings (43) and a slidable outer locking sleeve (44). The upper part of the cell is brought into its correct position by a guide pin (46) and two screws (45). The cell has a buffer solution inlet (47), an excess liquid outlet (48) and a test sample inlet (49). The test sample run is indicated by a syringe for manual injection.
De väsentliga detaljerna hos biosensorcellanordningen enligt uppfinningen visas i Fig. 1 och Fig. 2. Bottendelen 40 är anpassad till utformningen av en faktisk piezoelektrisk kristall 41. Kristallen hålls på plats av den övre delen som omfattar en testkammarkavitet 42, två gummiringar 43 och en förskjutbar yttre låshylsa 44. Den övre delen av cellen bringas i sitt korrekta läge av en styrpinne 46 och två skruvar 45. Cellen har ett inlopp för buffertlösning 47, ett utlopp för överskottsvätska 48 och ett testprovinlopp 49. Testprovinloppet visas med en inj ektionsspruta för manuell injektion.The essential details of the biosensor cell device according to the invention are shown in Fig. 1 and Fig. 2. The bottom part 40 is adapted to the design of an actual piezoelectric crystal 41. The crystal is held in place by the upper part comprising a test chamber cavity 42, two rubber rings 43 and a slidable outer locking sleeve 44. The upper part of the cell is brought into its correct position by a guide pin 46 and two screws 45. The cell has an inlet for buffer solution 47, an outlet for excess liquid 48 and a test sample inlet 49. The test sample inlet is shown with a syringe for manual injection .
Den piezoelektriska kristallen 41 är belagd på ytan som vetter mot testkammar- kaviteten 42 med en interaktionspartner till en analyt, och kristallen 41 är ansluten till en oscillationsenhet och signalbearbetningselektronik. Inloppsnålen 49 för införande av analyten slutar på ett litet avstånd från änden av och på insidan om en inloppsärm 50 för införande av buffertlösning vilken slutar i närheten av kristallens 41 aktiva yta. Inloppsärmen är ansluten till ett inlopp 47 för buffertlösning. Anordningen omfattar också ett utlopp 48 för överskottsvätska.The piezoelectric crystal 41 is coated on the surface facing the test chamber cavity 42 with an interaction partner of an analyte, and the crystal 41 is connected to an oscillation unit and signal processing electronics. The analyte insertion needle 49 terminates at a small distance from the end of and on the inside of a buffer solution insertion sleeve 50 which terminates near the active surface of the crystal 41. The inlet sleeve is connected to an inlet 47 for buffer solution. The device also comprises an outlet 48 for excess liquid.
I föredragna utföringsfonner av biosensorcellanordningen enligt uppfinningen är inloppsnålen 49 en automatisk injektor eller en injektionsspruta.In preferred embodiments of the biosensor cell device of the invention, the inlet needle 49 is an automatic injector or syringe.
Exempel på olika utföringsfonner av uppfinningen är biosensorcellanordningar där den piezoelektriska kristallen 41 är belagd med två eller flera olika interaktionspartners som var och en interagerar med en olik analyt; interationspartner är en antikropp som specifikt binder till analyten (antigen); analyten (analytema) är vald(a) bland narkotika och sprängämnen; sprängämnet är 2,4,6-trinitrotoluen (TNT); interaktionspartnem är en peptidnukleinsyra (PNA) oligomer och analyten är en polynukleotid; interaktionspartnern är en polynukleotid och analyten är en peptidnukleinsyra (PNA) oligomer; och polynukleotiden väljs från den grupp som består av RNA, DNA och PNA polymerer som är komplementära till PNA oligomeren.Examples of different embodiments of the invention are biosensor cell devices in which the piezoelectric crystal 41 is coated with two or two different interaction partners each interacting with a different analyte; interaction partner is an antibody that specifically binds to the analyte (antigen); the analyte (s) are selected from drugs and explosives; the explosive is 2,4,6-trinitrotoluene (TNT); the interaction partner is a peptide nucleic acid (PNA) oligomer and the analyte is a polynucleotide; the interaction partner is a polynucleotide and the analyte is a peptide nucleic acid (PNA) oligomer; and the polynucleotide is selected from the group consisting of RNA, DNA and PNA polymers complementary to the PNA oligomer.
Tï\PATEN'l'\29-\294S4\svensktxt.doc 10 15 20 25 30 512 994 5 En annan aspekt av biosensorcellanordningen enligt uppfinningen är inriktad på dess användning för kvalitativ och kvantitativ analys av åtminstone en analyt och/eller dess interaktionspartner.Another aspect of the biosensor cell device of the invention is directed to its use for qualitative and quantitative analysis of at least one analyte and / or its interaction partner. ../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../ ..
Exemgel på analyter Som föredragna utföringsforrner av detektionsmål for biosensorcellanordningen enligt uppfinningen har två klasser av analyter valts, nämligen sprängämnen och polynukleotider.Examples of analytes As preferred embodiments of detection targets for the biosensor cell device according to the invention, two classes of analytes have been selected, namely explosives and polynucleotides.
Dessa två stora klasser av analyter består i sin tur av många olika substanser. Detektion av dessa med hög känslighet är av enorm betydelse idag, både för välfärden i värden (sprängämnen) och vid biomedícinsk analys (polynukleotider).These two major classes of analytes in turn consist of many different substances. Detection of these with high sensitivity is of enormous importance today, both for the welfare of the host (explosives) and in biomedical analysis (polynucleotides).
TNT analys åstadkommes genom användning av antikroppar som är specifika för TNT fasta på PZ guld(Au) elektroder.TNT analysis is accomplished by the use of antibodies specific for TNT attached to PZ gold (Au) electrodes.
Analys av polynukleotider baseras på bindning av RNA eller DNA polymerer till specifika PNA modifierade PZ elektroder foljt av QCA detektion. RNA/DNA polymerer extraheras från humana vävnadsprover och påtöres på Cys-PNA-elektroden. När massan ökar minskar frekvensen hos PZ elektrodens resonansoscillering. Resultaten erhålls i form av ett diagram där tiden är en funktion av frekvensen. Detekteringen av interaktionen erhålles på några sekunder. Här visar vi detektion av polynukleotider och deras interaktioner med biosensor QCA metoden där interaktionen mellan relativt korta (1 8- till 21-merer) peptidnukleinsyror, PNA, och några komplementära polynukleotider tillämpas. PNA-PNA, PNA-DNA och PNA-RNA interaktioner detekteras med piezoelektriska (PZ) kristaller som analytiska sensoreri kvartskrístallanalys, QCA, systemet.Analysis of polynucleotides is based on the binding of RNA or DNA polymers to specific PNA-modified PZ electrodes followed by QCA detection. RNA / DNA polymers are extracted from human tissue samples and applied to the Cys-PNA electrode. As the mass increases, the frequency of the resonant oscillation of the PZ electrode decreases. The results are obtained in the form of a diagram where time is a function of frequency. The detection of the interaction is obtained in a few seconds. Here we show the detection of polynucleotides and their interactions with the biosensor QCA method where the interaction between relatively short (1-8 to 21-mer) peptide nucleic acids, PNA, and some complementary polynucleotides is applied. PNA-PNA, PNA-DNA and PNA-RNA interactions are detected with piezoelectric (PZ) crystals as analytical sensors in the quartz crystal analysis, QCA, system.
T rinitrotoluen, TNT; som analyt Antikroppar som känner igen TNT användes i exemplen på analyser med användning av biosensorcellanordningen enligt uppfinningen för detektering av pikograrri av ett litet antigen som TNT. v Polynukleotider som analyter eller interaktíonspartners till analyter Detektion av polynukleotider saint deras interaktioner är av avgörande betydelse för biomedícinsk analys och läkemedelsanalys såväl som för forskning. Ett bredare mål för detekteringen är närvaro och interaktioner mellan polynukleotider och PNA oligomerer är att detektera olika genetiskt kopplade sjukdomar/rubbningar. Det är väl känt att många allvarliga sjukdomar såsom tuberkulos, malaria, Alzheimers sjukdom, HIV, cancer, cystisk fibros etc är kopplade till expression av muterade gener eller överexpression av vissa gener vilket leder till överexpression av karakteristiska proteiner. I fråga om förekomsten av till sjukdomar kopplade mutationer eller överexpression när det gäller patienter, kommer de att detekteras T:\PATENT\29-\29454\svensktxt.doc l0 15 20 25 30 512 994 6 genom interaktion med komplementära till mutationerna eller överuttryckta produkt PNA oligomerer kopplade till PZ kristallerna. Tillämpningen av korta PNA polymerer som är komplementära till sjukdomsassocierade mutanta gener kommer att möjliggöra analys av någon mutation av intresse genom enkel design och syntes av en kort komplementär PNA sekvens. En sådan analysmetod kommer att vara mycket flexibel och billig jämfört med de metoder som är tillgängliga idag, särskilt med användning av det snabba och känsliga QCA systemet enligt föreliggande uppfinning.T rinitrotoluene, TNT; as an analyte Antibodies that recognize TNT were used in the examples of assays using the biosensor cell device of the invention to detect pikograrri of a small antigen such as TNT. v Polynucleotides as analytes or interaction partners for analytes Detection of polynucleotides since their interactions are crucial for biomedical analysis and drug analysis as well as for research. A broader goal for detection is presence and interactions between polynucleotides and PNA oligomers is to detect various genetically linked diseases / disorders. It is well known that many serious diseases such as tuberculosis, malaria, Alzheimer's disease, HIV, cancer, cystic isk bros etc. are linked to expression of mutated genes or overexpression of certain genes leading to overexpression of characteristic proteins. In the presence of disease-related mutations or overexpression in patients, they will be detected by interaction with mutations complementary to the mutations or overexpressed product. ../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../../ .. PNA oligomers coupled to the PZ crystals. The application of short PNA polymers that are complementary to disease-associated mutant genes will allow the analysis of any mutation of interest through simple design and synthesis of a short complementary PNA sequence. Such an analysis method will be very flexible and inexpensive compared to the methods available today, especially using the fast and sensitive QCA system of the present invention.
Peptidnukleinsyror, PNA, som analyter eller interaktionspartners till analyter.Peptide nucleic acids, PNA, as analytes or interaction partners to analytes.
Nyligen introducerades peptidnukleinsyror (PNA) av Nielsen et al.(Nielsen P.E., Egholm, M., Berg, RH., and Buchardt, O. 1991, Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254:l497-1500) som en ersättning för hela ribos-fosfodiesterryggraden i oligonukleotider med N-(2-aminoetyl)glycin- enheter, till vilka lämpliga nukleobaser är kopplade via karbonylmetylenlinkers. Upptäckten av PNA har gett möjligheten till radikalt olika syntetiska versioner av DNA och RNA.Recently, peptide nucleic acids (PNA) were introduced by Nielsen et al. (Nielsen PE, Egholm, M., Berg, RH., And Buchardt, O. 1991, Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254 : l497-1500) as a replacement for the entire ribose phosphodiester backbone of oligonucleotides with N- (2-aminoethyl) glycine units, to which appropriate nucleobases are linked via carbonylmethylene linkers. The discovery of PNA has provided the opportunity for radically different synthetic versions of DNA and RNA.
Fördelarna med denna kemiska strategi är många. PNA monomererna kan polymeriseras med användning av standardpeptidkopplingskemi, som är flexibel, högt utvecklad och effektiv.The benefits of this chemical strategy are many. The PNA monomers can be polymerized using standard peptide coupling chemistry, which is flexible, highly developed and efficient.
Hybrider mellan sådana PNA-oligomerer och deras komplementära enkelsträngade DNA- oligomerer har visat anmärkningsvärt hög stabilitet (afñnitet) i jämförelse med naturligt förekommande DNA/DNA- och RNA/DNA-hybrider. Sålunda erbjuder PNA-oligomerer stora fördelar i både antisens och antigen tillvägagångssätt för reglering av genexpression.Hybrids between such PNA oligomers and their complementary single-stranded DNA oligomers have shown remarkably high stability (affinity) compared to naturally occurring DNA / DNA and RNA / DNA hybrids. Thus, PNA oligomers offer great advantages in both antisense and antigenic approaches for regulating gene expression.
Därtill är PNA-oligomerema avsevärt stabilare gentemot nukleaser (jämfört med naturliga polynukleotider) på grund av avsaknaden av (deoxihibosryggrad.In addition, the PNA oligomers are considerably more stable against nucleases (compared to natural polynucleotides) due to the lack of (deoxyhibose backbone.
Dessa egenskaper hos PNA kan effektivt utnyttjas för vilket som helst tillväga- gångssätt som kräver icke-nedbrytande högaffinitetspolymerer för RNA/DNA-igenkänning.These properties of PNA can be effectively utilized for any approach that requires non-degrading high-affinity polymers for RNA / DNA recognition.
Hybridisering av PNA-oligonukleotider till komplementära RNA/DNA-sekvenser genom specifik basparning (A-T och G-C) sker genom interaktion med vätebindning. Denna enkla baspaming medger design av PNA-oligonukleotider som målsöker någon gen eller RNA med en känd sekvens. Huvudfördelen med denna strategi är den potentiella speciñciteten hos denna mekanism. Hög specificitet och affinitet hos interaktionema leder till känsligare detekteringsmetoder vid DNA/RNA värderingar.Hybridization of PNA oligonucleotides to complementary RNA / DNA sequences by specific base pairing (A-T and G-C) occurs by interaction with hydrogen bonding. This simple base paming allows the design of PNA oligonucleotides that target any gene or RNA with a known sequence. The main advantage of this strategy is the potential specificity of this mechanism. High specificity and affinity of the interactions lead to more sensitive detection methods in DNA / RNA evaluations.
Oscillatíonsenhet, signalbearbetningselektronik och elektroder Kristallen i biosensom exciteras i en modifierad Pierce oscillator. Standard Pierce oscillatom modifieras med: Tz\PATEN'l\29-\29454\svenskott.doc 10 15 20 25 30 512 994 7 - ett extra buffertsteg i den oscillerande slingan för att kompensera för den höga fuktningen av kristallen med vätskan, _ - en likströmsblockerande kondensator för att eliminera elektrolys av läckström genom buffertvätskesystemet, - ett buffertsteg och en si gnalomvandlare för att galvaniskt separera mätningskretsama från frekvensräknaren och analysdatorn.Oscillation unit, signal processing electronics and electrodes The crystal in the biosensor is excited in a modified Pierce oscillator. The standard Pierce oscillator is modified with: Tz - PATEN'l \ 29- \ 29454 \ svenskott.doc 10 15 20 25 30 512 994 7 - an extra buffer step in the oscillating loop to compensate for the high humidity of the crystal with the liquid, _ - a direct current blocking capacitor for eliminating electrolysis of leakage current through the buffer liquid system, a buffer stage and a signal converter for galvanically separating the measuring circuits from the frequency counter and the analysis computer.
Signalbearbetningselektroniken innehåller elektroniken för drivande av kristallen, mätning av olika parametrar och beslutalgoritmer för utvärdering av resultaten. Elektroniken för drivning av kristallen och mätning av frekvensskift består av en oscillator (Colpitt eller Pierce typ) med kristallen följt av en buffertförstärkare och en snabb precisionsräknare med interpolation. Resultaten från frekvensmätningarna matas till kontrolldatom för utvärdering.The signal processing electronics contain the electronics for driving the crystal, measuring various parameters and decision algorithms for evaluating the results. The electronics for driving the crystal and measuring frequency shifts consist of an oscillator (Colpitt or Pierce type) with the crystal followed by a buffer amplifier and a fast precision counter with interpolation. The results from the frequency measurements are fed to the control computer for evaluation.
Elektrodema som används i exemplen är AT-cut 9 - 10 MHZ piezoelektriska kristaller med guldelektroder, levererade av Quartz Probe, Sverige eller Seiko, Japan.The electrodes used in the examples are AT-cut 9 - 10 MHz piezoelectric crystals with gold electrodes, supplied by Quartz Probe, Sweden or Seiko, Japan.
EXEMPEL PÅ ANALYSER MED ANVÄNDNING AV BIOSENSORCELLANORDNINGEN Reagens och biokemiska metoder Allmänna reagens Bl :Na-HEPES buffert: 0,01 M, pH 7,4.EXAMPLES OF ANALYSIS USING THE BIOSENSOR CELL DEVICE Reagents and Biochemical Methods General Reagents B1: Na-HEPES buffer: 0.01 M, pH 7.4.
HEPES : Fluka 54466, MW 260,30; justera pH med 0,01 M HCl B2 : 0,01 M Na-fosfatbuffert, 0,1 M NaCl, pH 7,4, består av Na;HPO4.l2H2O: 3,58 g/l; NaH2P04.H2O : 1,38 g/l ; NaCl 5,85 g/l. Justera pH med salter Vatten: Avjoniserat kranvatten Tiol- eller disulfidinnehållande modifikationsreagens kan användas med Au-elektrod TN! analys Elektrod-bundna TNT-antikroppar användes. I N I-antikroppama är kommersiellt tillgängliga.HEPES: Fluka 54466, MW 260.30; adjust pH with 0.01 M HCl B2: 0.01 M Na-phosphate buffer, 0.1 M NaCl, pH 7.4, consists of Na; HPO4.l2H2O: 3.58 g / l; NaH 2 PO 4 .H 2 O: 1.38 g / l; NaCl 5.85 g / l. Adjust pH with salts Water: Deionized tap water Thiol- or disulfide-containing modification reagent can be used with Au electrode TN! analysis Electrode-bound TNT antibodies were used. The N I antibodies are commercially available.
Polygukleotidanalys 1. ea ens PNA monomerer : kommersiella, PerSeptive Biosystems, Framingharn, USA Peptidsyntesreagens : beskrivna i Design of chimeric peptide ligands to galanin receptors and substance P receptors. Int. J. Pept. Protein Res. 39, 516-522. (1992) Langel, Ülo., Land, T., and Bartfai, T. i T:\PATENT\29-\29454\svensktxt.doc 10 15 20 25 30 512 994 8 2. Kovalent imrnobilisering avggQys-PNA-oligomerer på elektroder. Preparering av elektroden för mätning Etanol-tvättad och torr elektrod inkuberades i 1 uM lösning av läinplig Cys-PNA 21- mer lösning i B2 under 14-16 h vid rumstemperatur i mörker och i tättslutet rör. Elektroden tvättades med vatten, inkuberades under 5 min i vatten.Polygucleotide Assay 1. even PNA monomers: commercial, PerSeptive Biosystems, Framingharn, USA Peptide synthesis reagents: described in Design of chimeric peptide ligands to galanin receptors and substance P receptors. Int. J. Pept. Protein Res. 39, 516-522. (1992) Langel, Ülo., Land, T., and Bartfai, T. i T: \ PATENT \ 29- \ 29454 \ svensktxt.doc 10 15 20 25 30 512 994 8 2. Covalent immobilization of avgQys-PNA oligomers on electrodes. Preparation of the electrode for measurement Ethanol-washed and dry electrodes were incubated in 1 μM solution of liquid Cys-PNA 21-mer solution in B2 for 14-16 hours at room temperature in the dark and in tightly closed tubes. The electrode was washed with water, incubated for 5 minutes in water.
Den PNA-modifierade elektroden placerades i cellen och tvättades med B2, 100 ml/h, 10 ml, elektroden stabiliserades (förändring är mindre än 2 Hz/ 10 min) under 20 - 60 min. 3. Analys av polgukleotider 30-50 pl av utspädd analyt (21-mer av oligonukleotider, plasmider, RNA eller DNA från celler) injicerades i cellen med PNA-modifierad och preparerad elektrod, och frekvens- förändringen registrerades. 4. PNA-sygtes Syntes av PNA-polymerer utfördes manuellt såsom beskrivits vid användning av t- Boc kemi och monomerer från PerSeptive Biosystems (F ramingham, MA, USA). Tiolenheten infördes i PNA-polymeren som aminosyran Cys i Sïposition hos PNA-oligomerer.The PNA-modified electrode was placed in the cell and washed with B2, 100 ml / h, 10 ml, the electrode was stabilized (change is less than 2 Hz / 10 min) for 20-60 min. 3. Analysis of Polgucleotides 30-50 μl of dilute analyte (21-mer of oligonucleotides, plasmids, RNA or DNA from cells) was injected into the cell with PNA-modified and prepared electrode, and the frequency change was recorded. 4. PNA Synthesis Synthesis of PNA polymers was performed manually as described using t-Boc chemistry and monomers from PerSeptive Biosystems (Framingham, MA, USA). The thiol moiety was introduced into the PNA polymer as the amino acid Cys in the Sposition of PNA oligomers.
Sekvenser av PNA-oligomerer presenteras i enlighet med peptidnomenklaturen (N- terrninalen hos PNA-oligomeren ligger till vänster). 21-mer cPNA, komplementär till regionen 18-38 hos den humana galaninreceptor typ 1: GC GTT GCC CTC GCT GAG GTT C amid 21 -mer blandad PNA: GGC ATG GCT GCT CTC CGT CTG amid 1 -mer cPNA, komplementär till regionen 18-38 hos galaninreceptom typ 1 hos råtta: CC ATT CCC TTC ACT GAG GTT C arnid 5. Separation av DNA Celler återsuspenderades i l vol av digestionsbuffert. Proverna inkuberades under skakning vid 50°C i 12-18 h och extraherades med lika volym av fenol/kloroforrn/isopropanol följt av centrifugering i 10 min vid 1700 x g i en rotor med svängande provhållare.Sequences of PNA oligomers are presented according to the peptide nomenclature (the N-terminal of the PNA oligomer is on the left). 21-mer cPNA, complementary to region 18-38 of the human galanin receptor type 1: GC GTT GCC CTC GCT GAG GT GTT C amide 21 -mer mixed PNA: GGC ATG GCT GCT CCT CGT CTG amide 1 -mer cPNA, complementary to region 18 -38 of the galanin receptor type 1 in rat: CC ATT CCC TTC ACT GAG GTT C arnide 5. Separation of DNA Cells were resuspended in vol of digestion buffer. The samples were incubated with shaking at 50 ° C for 12-18 hours and extracted with equal volume of phenol / chloroform / isopropanol followed by centrifugation for 10 minutes at 1700 x g in a rotor with swinging sample holder.
Det vattenhaltiga (topp) skiktet överfördes till ett nytt rör och V2 vol av 7,5 M ammoniumacetat samt 2 vol av 100% etanol tillsattes. Pelleten sköljdes med 75% etanol, etanolen dekanterades och pelleten torkades. DNA återsuspenderades i TE buffert tills den var löst.The aqueous (top) layer was transferred to a new tube and V2 vol of 7.5 M ammonium acetate and 2 vol of 100% ethanol were added. The pellet was rinsed with 75% ethanol, the ethanol was decanted and the pellet was dried. DNA was resuspended in TE buffer until dissolved.
T:\PATENT\29-\29454\svensktxt.doc 10 15 20 25 30 512 994 6. e aration av RNA Celler lyserades genom tillsats av UltraspecTM RNA. 0,2 ml kloroforrn per l ml UltraspecTM RNA tillsattes och skakades vid 4°C i 5 min. Homogenatet centrifugerades vid 12000 x g (4°C) i 15 min. Den vattenhaltiga fasen överfördes försiktigt och en lika volym isopropanol tillsattes; proverna inkuberades under 10 min vid 4°C. Supematanten avlägsnades och RNA-pelleten tvättades två gånger med 75% etanol genom virvling och efterföljande centrifi1gering i 5 min vid 7500 x g vid 4°C. Pelleten torkades under vakuum i 5-10 min.T: \ PATENT \ 29- \ 29454 \ svensktxt.doc 10 15 20 25 30 512 994 6. e aration of RNA Cells were lysed by the addition of UltraspecTM RNA. 0.2 ml of chloroform per 1 ml of UltraspecTM RNA was added and shaken at 4 ° C for 5 minutes. The homogenate was centrifuged at 12,000 x g (4 ° C) for 15 minutes. The aqueous phase was carefully transferred and an equal volume of isopropanol was added; the samples were incubated for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was removed and the RNA pellet was washed twice with 75% ethanol by vortexing and subsequent centrifugation for 5 minutes at 7500 x g at 4 ° C. The pellet was dried under vacuum for 5-10 minutes.
RNA-pelleten löstes i 50-100 pl UltraspecTM DEPC behandlat vatten. 7. Plasrnid Mammalievektorn pRK8, som härstammar från vektorn pRK5, användes som en hGaIR1 cDNA-sekvensinnehållande konstruktion. Den humana galaninreceptor cDNA, hGalR1, från den humana melanom Bowes-cellinjen, PCR-klonades och infördes i EcoRl och Notl klyvd pRK8. Den insatta receptom som har 21-mer homolog region med iPNA-proben, användes i preliminära experiment för att visa speciñcitet och selektivitet hos PNA-biosensor genom interaktion med PNA-elektrod. 8. Oligonukleotidgr Sekvenser av komplementära DNA-oligomerer GIBCOBRL, Bl958Bl1, MW 6834 pg/pmol användes till den 21-mer homologa regionen med 21-mer cPNA komplementär till region 18-38 hos galaninreceptor typ 1 hos råtta.The RNA pellet was dissolved in 50-100 μl of UltraspecTM DEPC treated water. Plasnid The mammalian vector pRK8, derived from the vector pRK5, was used as a hGaIR1 cDNA sequence-containing construct. The human galanin receptor cDNA, hGalR1, from the human melanoma Bowes cell line, was PCR-cloned and inserted into EcoR1 and NotI digested pRK8. The inserted receptor, which has a 21-mer homologous region with the iPNA probe, was used in preliminary experiments to demonstrate the specificity and selectivity of the PNA biosensor by interaction with the PNA electrode. 8. Oligonucleotide Sequences of Complementary DNA Oligomers GIBCOBRL, B1958B11, MW 6834 pg / pmol was used for the 21-mer homologous region with 21-mer cPNA complementary to region 18-38 of rat galanin receptor type 1.
Sekvens hos 21-mer CR DNA: GAACCTCAGTGAAGGGAATGG Sekvens hos 21-mer cPNA: CTTGGAGTCACTTCCCTTACC 9. Regenerering av elektroden för vidare användning Regenerering av elektroden åstadkommes genom tillsättning av RNAser eller DNAser som bryter ned de specifikt bundna RNA respektive DNA. Ett annat sätt att preparera den en gång använda PNA-elektroden vid nästa tillämpning är att tvätta de specifikt bundna polynukleotiderna genom tvättningen av cellen med buffertar av olika jonstyrka och vatten.Sequence of 21-mer CR DNA: GAACCTCAGTGAAGGGAATGG Sequence of 21-mer cPNA: CTTGGAGTCACTTCCCTTACC 9. Regeneration of the electrode for further use Regeneration of the electrode is accomplished by the addition of RNAs or DNAs that degrade the specifically bound RNA and DNA, respectively. Another way to prepare the once used PNA electrode for the next application is to wash the specifically bound polynucleotides by washing the cell with buffers of different ionic strength and water.
IQ. Kinetik hos duplex- eller gjplexbjldning Jämvikten av bindningar av oligonukleotider till PNA-elektroder uppnås inom 100- 200 s, den tid som är lämplig för bestämning av interaktionskinetiken utan ytterligare utrustning. Följaktligen är metoden användbar för mätning av kinetiken hos interaktionen mellan PNA och analyserade RNA eller DNA monomerer eller dimerer.IQ. Kinetics of duplex or gjplex imaging The equilibrium of bonds of oligonucleotides to PNA electrodes is reached within 100-200 s, the time suitable for determining the interaction kinetics without additional equipment. Accordingly, the method is useful for measuring the kinetics of the interaction between PNA and analyzed RNA or DNA monomers or dimers.
Tz\PATE"N'l'\29-\29454\svcnskbct.doc 10 15 20 25 30 .512 994 10 11. Immobilisegng av biotigyl-PNA-polflier till strgptavidinbelagd elektrod Det är möjligt att helt enkelt koppla biotinylenhet till den lämpliga sekvensen hos PNA-polymeren. Det är också möjligt att belägga QCA-elektroden med avidin eller streptavidin, och att använda den belagda elektroden till att binda biotinyl-PNA. Denna metod är ett altemativ till kopplingen av PNA-polymerer till elektrodema genom reaktion mellan SH-grupper och guldyta (jmf. ovan). 12. Cellkulturer Rin m5F-celler från råtta odlades i RPMI 1640 (Gibco 041-01870), utökat med 5% fetalt kalvserum, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 ng/ml streptomycin.Tz \ PATE "N'l '\ 29- \ 29454 \ svcnskbct.doc 10 15 20 25 30 .512 994 10 11. Immobilization of biotigyl-PNA polymers to stripped ptavidin-coated electrode It is possible to simply link biotinyl moiety to the appropriate sequence It is also possible to coat the QCA electrode with avidin or streptavidin, and to use the coated electrode to bind biotinyl PNA. This method is an alternative to the coupling of PNA polymers to the electrodes by reaction between SH groups and gold surface (cf. above) 12. Cell cultures Rat R5 m5F cells were grown in RPMI 1640 (Gibco 041-01870), augmented with 5% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 ng / ml streptomycin.
Cellema odlades under 3 dagar till ca 50% sammanflytning i vävnadsodlingskolvar.The cells were cultured for 3 days to about 50% surface area in tissue culture flasks.
SHSY-celler från råtta odlades i minimalt essentiellt medium med Earles salter (MEM), utökat med 10% fetalt kalvserum, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 ng/ml streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror. Cellema odlades under 3 dagar till ca 50% sarnmanflytning i vävnadsodlingskolvar.Rat SHSY cells were grown in minimal essential medium with Earle's salts (MEM), supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 ng / ml streptomycin, 1% non-essential amino acids. The cells were cultured for 3 days at about 50% surface area in tissue culture flasks.
RESULTAT A. TNT analys Användning av piezoelektriska (PZ) kristaller som analytiska sensorer, i kvartskristall mikrovåg (QCM), har beskrivits i vår patentansökan PCT/EP98/03531, vars innehåll här införlivas genom referens, vid detektering av små mängder av TNT i lufiprover uppsamlade från jord som antagligen innehåller minor, följt av koncentrering.RESULTS A. TNT analysis The use of piezoelectric (PZ) crystals as analytical sensors, in quartz crystal microwave (QCM), has been described in our patent application PCT / EP98 / 03531, the contents of which are incorporated herein by reference, in the detection of small amounts of TNT in air samples. collected from soil that probably contains mines, followed by concentration.
I den allmänna metoden i dessa studier användes 9-10 MHz, elektroden, QA-A9M- Au, Seiko eller Quartz Probe, Sverige som hade elektrodbundna TNT-antikroppar. Frekvens- förändringen hos elektroden på grund av antikropp-antigen interaktion registreras i tid.In the general method in these studies, 9-10 MHz was used, the electrode, QA-A9M-Au, Seiko or Quartz Probe, Sweden which had electrode-bound TNT antibodies. The frequency change of the electrode due to antibody-antigen interaction is recorded in time.
Drift av QCA med kommersiell mätenhet är mycket känslig för elektriska och fysikaliska störningar, t ex rekommenderas att inte använda radio i samma rum med QCA; pumpvibrationerna stör mätningarna signifikant. Därför är det starkt rekommenderat att betingelserna för mätningarna definieras väl. Systemets stabilitet varierar från dag till dag och till och med från elektrod till elektrod, och ibland beter sig till och med olika sidor av elektroderna olika.Operation of QCA with commercial measuring unit is very sensitive to electrical and physical disturbances, for example it is recommended not to use radio in the same room with QCA; the pump vibrations significantly interfere with the measurements. Therefore, it is strongly recommended that the conditions for the measurements be well defined. The stability of the system varies from day to day and even from electrode to electrode, and sometimes even different sides of the electrodes behave differently.
I tre olika experiment har vi använt samma elektrod (båda sidor) i både ett kommersiellt system och i systemet enligt uppfinningen på följ ande sätt. Effekten av TNT mättes först i ett kommersiellt, Seikos, system och ingen effekt av TNT erhölls. En annan sida av elektroden användes i systemet enligt uppfinningen och effekten av TNT erhölls. I två olika experiment har vi använt samma elektrod (båda sidoma) i båda systemen på motsatt sätt.In three different experiments we have used the same electrode (both sides) in both a commercial system and in the system according to the invention in the following way. The effect of TNT was first measured in a commercial, Seikos, system and no effect of TNT was obtained. Another side of the electrode was used in the system according to the invention and the effect of TNT was obtained. In two different experiments we have used the same electrode (both sides) in both systems in the opposite way.
Tz\PATEN'l\29-\29454\svenskbtt.doc 10 15 20 25 30 512 994 ll Effekten av TNT mättes i systemet enligt uppfinningen först och effekten av TNT erhölls. En annan sida av elektroden användes i Seikos system och effekten av TNT erhölls inte. Seikos elektronik kunde värma upp elektroden under mätningarna och därför förorsaka försvinnande av effekten av TNT.Tz \ PATEN'l \ 29- \ 29454 \ svenskbtt.doc 10 15 20 25 30 512 994 ll The effect of TNT was measured in the system according to the invention first and the effect of TNT was obtained. Another side of the electrode was used in Seiko's system and the effect of TNT was not obtained. Seiko's electronics could heat the electrode during the measurements and therefore cause the effect of TNT to disappear.
Konstruktionen hos biosensorcellen enligt uppfinningen tillåter Stabilisering av systemet på 1-2 min eller snabbare. Metoden med TNT-detekteringen genom användning av specifika antikroppar på QCA resulterade i detektering av TNT vid den låga nivån av 10 pg TNT.The design of the biosensor cell according to the invention allows stabilization of the system in 1-2 minutes or faster. The method of TNT detection using specific antibodies to QCA resulted in the detection of TNT at the low level of 10 pg TNT.
B. Polynukleotídanalys De ursprungliga analogema av olika PNA hör till de komplementära cDNA- härstarnrnande sekvenserna av human- och rått-hjämgalaninreceptor (jmf. ovan). 21-meren från human galaninreceptor cDNA tjänstgör som vägledande sekvenser på grund av deras visade höga speciñcitet i preliminära experiment.B. Polynucleotide Assay The original analogs of various PNAs belong to the complementary human and rat brain galanine receptor cDNA sequencing sequences (see above). The 21-mer from the human galanin receptor cDNA serves as guiding sequences due to their high specificity shown in preliminary experiments.
I preliminära experiment kopplades dessa 21-merer av PNA till PZ-elektroder, varpå kopplingen följdes av förändring av 500-1000 Hz i frekvens. De modifierade elektrodema exponerades sedan för följande källor av oligonukleotider och polynukleotider. l. Komplementära DNA 21-merer, sekvenser jfr. ovan. 2. Plasmid med komplementära DNA-regioner införlivade. 3. Totalt cellulärt RNA från cellinjer som uttrycker respektive galaninreceptorer. 4. Dubbelsträngat DNA från cellinj er som uttrycker respektive galaninreceptorer.In preliminary experiments, these 21-mers of PNA were coupled to PZ electrodes, after which the coupling was followed by a change of 500-1000 Hz in frequency. The modified electrodes were then exposed to the following sources of oligonucleotides and polynucleotides. l. Complementary DNA 21s, sequences cf. above. Plasmid with complementary DNA regions incorporated. Total cellular RNA from cell lines expressing respective galanin receptors. 4. Double-stranded DNA from cell lines expressing the respective galanine receptors.
Genom registrering av förändringen i frekvens registrerades interaktionen av immobiliserat PNA med cellulärt RNA eller DNA. Resultaten visas i Fig. 3 till Fig. 6. Som en kontrollinj ektion till varje analys injicerades 30-50pl buffertlösning.By recording the change in frequency, the interaction of immobilized PNA with cellular RNA or DNA was recorded. The results are shown in Fig. 3 to Fig. 6. As a control injection for each assay, 30-50 μl of buffer solution was injected.
Som negativa kontroller utnyttjades två olika angreppssätt. 1. Elektroder immobiliserades med rått- och human-PNA 21-merer exponerades för RNA från cellinjer som inte uttrycker galaninreceptorema, SHSY. 2. En elektrod-irnmobiliserad blandad PNA 21 -mer sekvens (järniört med komplementära sekvenser) exponerades för galaninreceptor som uttrycker cellulära RNA och DNA.Two negative approaches were used as negative controls. Electrodes were immobilized with rat and human PNA 21 mers were exposed to RNA from cell lines that do not express the galanin receptors, SHSY. An electrode-immobilized mixed PNA 21 -mer sequence (iron herb with complementary sequences) was exposed to galanin receptor expressing cellular RNA and DNA.
I samtliga fall registrerades ingen förändring av frekvens vid kontrollanalys.In all cases, no change in frequency was registered during control analysis.
Känslighet Data beträffande analys av DNA, RNA, DNA 21-merer och plasmider presenteras i Tabell 1. Man kan se att relativt små mängder av polynukleotidema kunde analyseras.Sensitivity Data regarding analysis of DNA, RNA, DNA 21-mers and plasmids are presented in Table 1. It can be seen that relatively small amounts of the polynucleotides could be analyzed.
Mängden av 30-50 ng av 21-mer DNA, 160-200 pg plasmid, 1 pg RNA och 12-18 pg DNA analyserades effektivt med PNA-QCA-metoden. Den lägre gränsen beträffande mängd för Tz\PATEN'l\29-\29454\svenskut.doc 512 994 12 RNA- och plasmidanalys kunde vara till och med lägre, men denna analys har emellertid inte ännu utförts.The amount of 30-50 ng of 21-mer DNA, 160-200 pg plasmid, 1 pg RNA and 12-18 pg DNA was effectively analyzed by the PNA-QCA method. The lower limit on the amount of RNA and plasmid assays could even be lower, but this assay has not yet been performed.
Kemiska modifikationer av Au-PZ-elektroder med olika Cys-PNA för att analysera med QCA specifikt bindande RNA eller DNA polymerer extraherade från humana vävnadsprover, är en relativt enkel metod. PZ 9-10 MHz-elektroder är kommersiellt tillgängliga. QCA-utrustningen som presenteras i föreliggande ansökan är mycket känsligare och tillfórlitligare än de kommersiella systemen.Chemical modifications of Au-PZ electrodes with different Cys-PNAs for analysis with QCA-specific binding RNA or DNA polymers extracted from human tissue samples are a relatively simple method. PZ 9-10 MHz electrodes are commercially available. The QCA equipment presented in the present application is much more sensitive and reliable than the commercial systems.
T:\PATEN'l\29-\29454\svenskmt.doc 20 512 994 13 Tabell 1. Analys med PNA-QCA av olika mängder av olika polynukleotider Interaktion mellan PNA Frekvensfórändring Frekvensfórändring och (Högre koncentration) (Lägre koncentration) Totalt DNA -103 Hz (18 Hg) -8 Hz (1,2 pg) -230 Hz (12 pg) Totalt RNA -134 Hz (3,2 pg) -37 Hz (1 pg) -69 Hz (3,2 pg) 21-mer oligonukleotid -l7 Hz (30 ng) -2 Hz (15 ng) -13 Hz (50 ng) -1 Hz (10 ng) Plasmid _36 Hz (200 ng) _31 Hz (ss ng) -34 Hz (160 pg) Förkortningar t-Boc: tert-butyloxikarbonyl cDNA: komplementär DNA DEPC : dietylpyrokarbonat DNA: deoxiribonukleinsyra DNT: dinitrotoluen EcoRl : ett restriktionsendonukleas från E. coli RYl3 hGal R1 : human galaninreceptor typ 1 Notl : ett restriktionsendonukleas från Nocardia otítidis-cavarium PCR: polymeras kedjereaktion PNA: pRK8: mammalievektor som härstammar från vektom pRKS PZ : piezoelektrisk QCA : (quartz crystal analysis) kvartskristallanalys RNA: ribonukleinsyra TE: tris-EDTA TNT: trinitrotoluen peptidnukleinsyra UltraspecTM : DNA och RNA isoleringsreagens, innehåll : fenol, guanidinsalter, urea, buffertmedel, detergent and stabiliseríngsmedel.T: \ PATEN'l \ 29- \ 29454 \ svenskmt.doc 20 512 994 13 Table 1. Analysis with PNA-QCA of different amounts of different polynucleotides Interaction between PNA Frequency change Frequency change and (Higher concentration) (Lower concentration) Total DNA - 103 Hz (18 Hg) -8 Hz (1.2 pg) -230 Hz (12 pg) Total RNA -134 Hz (3.2 pg) -37 Hz (1 pg) -69 Hz (3.2 pg) 21 -mer oligonucleotide -17 Hz (30 ng) -2 Hz (15 ng) -13 Hz (50 ng) -1 Hz (10 ng) Plasmid _36 Hz (200 ng) _31 Hz (ss ng) -34 Hz (160 pg ) Abbreviations t-Boc: tert-butyloxycarbonyl cDNA: complementary DNA DEPC: diethylpyrocarbonate DNA: deoxyribonucleic acid DNT: dinitrotoluene EcoR1: a restriction endonuclease from E. coli RYl3 hGal R1: human galanin receptor type 1 R chain reaction PNA: pRK8: mammalian vector derived from the vector pRKS PZ: piezoelectric QCA: (quartz crystal analysis) quartz crystal analysis RNA: ribonucleic acid TE: tris-EDTA TNT: trinitrotoluene peptide nucleus monoacid UltraspecTM: DNA and RNA isolation reagents, content: phenol, guanidine salts, urea, buffering agent, detergent and stabilizer.
T:\PATENT\29-\29454\svensktxt.docT: \ PATENT \ 29- \ 29454 \ svensktxt.doc
Claims (11)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9803238A SE512994C2 (en) | 1998-09-24 | 1998-09-24 | Biosensor cell device and its use |
| AU64916/99A AU6491699A (en) | 1998-09-24 | 1999-09-22 | Biosensor cell device and its use |
| PCT/SE1999/001658 WO2000016903A1 (en) | 1998-09-24 | 1999-09-22 | Biosensor cell device and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9803238A SE512994C2 (en) | 1998-09-24 | 1998-09-24 | Biosensor cell device and its use |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE9803238D0 SE9803238D0 (en) | 1998-09-24 |
| SE9803238L SE9803238L (en) | 2000-03-25 |
| SE512994C3 SE512994C3 (en) | 2000-03-25 |
| SE512994C2 true SE512994C2 (en) | 2000-06-12 |
Family
ID=20412700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE9803238A SE512994C2 (en) | 1998-09-24 | 1998-09-24 | Biosensor cell device and its use |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU6491699A (en) |
| SE (1) | SE512994C2 (en) |
| WO (1) | WO2000016903A1 (en) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2220227B1 (en) * | 2003-05-30 | 2006-02-16 | INSTITUTO NACIONAL DE TECNICA AEROESPACIAL "ESTEBAN TERRADAS" | METHOD AND APPARATUS FOR THE DETECTION OF SUBSTANCES OR ANALYTICS FROM THE ANALYSIS OF ONE OR SEVERAL SAMPLES. |
| US7943388B2 (en) | 2003-11-14 | 2011-05-17 | 3M Innovative Properties Company | Acoustic sensors and methods |
| US7402678B2 (en) | 2004-12-17 | 2008-07-22 | 3M Innovative Properties Company | Multifunctional amine capture agents |
| EP1700107B1 (en) * | 2003-12-30 | 2011-09-14 | 3M Innovative Properties Company | Acoustic sensors and methods |
| US7342082B2 (en) | 2004-12-17 | 2008-03-11 | 3M Innovative Properties Company | Soluble polymers as amine capture agents and methods |
| US7544755B2 (en) | 2005-09-30 | 2009-06-09 | 3M Innovative Properties Company | Crosslinked polymers with amine binding groups |
| US7544754B2 (en) | 2005-09-30 | 2009-06-09 | 3M Innovative Properties Company | Crosslinked polymers with amine binding groups |
| US7544756B2 (en) | 2005-09-30 | 2009-06-09 | 3M Innovative Properties Company | Crosslinked polymers with amine binding groups |
| FR2948767A1 (en) * | 2009-07-28 | 2011-02-04 | Commissariat Energie Atomique | Electrochemical cell for measurement assembly, has support comprising window and mounted opposite to side opening, so that liquid is in contact with element through side opening and window |
| CN104407150B (en) * | 2014-11-12 | 2016-03-30 | 浙江大学 | For the biological nano transducer production method that 2,4,6-TNT detects |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5468605A (en) * | 1993-10-15 | 1995-11-21 | Molecular Devices Corp. | Transverse flow plungers for microphysiometers |
| US6143247A (en) * | 1996-12-20 | 2000-11-07 | Gamera Bioscience Inc. | Affinity binding-based system for detecting particulates in a fluid |
| IL114692A (en) * | 1995-07-21 | 1999-10-28 | Yissum Res Dev Co | Determination of an analyte in a liquid medium |
| DE19548376A1 (en) * | 1995-12-27 | 1997-07-03 | Behringwerke Ag | Mass sensitive biosensors |
-
1998
- 1998-09-24 SE SE9803238A patent/SE512994C2/en not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-09-22 AU AU64916/99A patent/AU6491699A/en not_active Abandoned
- 1999-09-22 WO PCT/SE1999/001658 patent/WO2000016903A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE9803238D0 (en) | 1998-09-24 |
| SE9803238L (en) | 2000-03-25 |
| WO2000016903A1 (en) | 2000-03-30 |
| AU6491699A (en) | 2000-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| O'Sullivan | Aptasensors–the future of biosensing? | |
| US20100167290A1 (en) | Molecule attachment to nanoparticles | |
| JP5597633B2 (en) | A device for the rapid identification of nucleic acids that specifically bind to chemical targets | |
| SE512994C2 (en) | Biosensor cell device and its use | |
| SE512994C3 (en) | Biosensor cell device and its use | |
| HK1204063A1 (en) | Nanostructured microelectrodes and biosensing devices incorporating the same | |
| US20090130650A1 (en) | Methods for the production of highly sensitive and specific cell surface probes | |
| US8871921B2 (en) | Design, synthesis and use of synthetic nucleotides comprising charge mass tags | |
| US20100261287A1 (en) | Method and apparatus for match quality analysis of analyte binding | |
| CN116338174B (en) | Methods for determining the presence or absence of a target analyte comprising the use of a polynucleotide reporter molecule and a transmembrane pore | |
| US10233442B2 (en) | Method for affinity purification | |
| WO2009016770A1 (en) | Hybridization method and apparatus | |
| CN102321616B (en) | Method for screening nucleic acid aptamers of proteins using microfluidic chip | |
| Simon et al. | Star-shaped flexible arm multivalent aptamers for largely improved virus binding affinity | |
| Tombelli | Piezoelectric biosensors for medical applications | |
| CN102435730A (en) | High-flux detection method based on nucleic acid address coding and biochip | |
| US20230375496A1 (en) | Dna-based assays | |
| EP1947197A1 (en) | Method for the amplification of at least one nucleic acid | |
| JP2022525340A (en) | Methods and Systems for Processing or Analyzing Oligonucleotide Encoding Molecules | |
| WO2024010907A1 (en) | Molecular tension sensor with nucleic acids and huh-tags | |
| CN115838805A (en) | Method for high-throughput characterization of biomolecule species and quantity and application thereof | |
| KR20130032128A (en) | Dna aptamers for porcine reproductive and respiratory syndrome(prrs) virus | |
| WO2016022696A1 (en) | Method of isolating aptamers for minimal residual disease detection | |
| KR101297417B1 (en) | Novel aptamer screening method based on graphene without target immobilization and the Nampt specific aptamers obtained from the above method | |
| KR20160097881A (en) | Non-Amplification Method for DNA Detection Using Gold Nanoparticle and Magnetic Bead Particle |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |