SE539268C2 - Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada - Google Patents

Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada Download PDF

Info

Publication number
SE539268C2
SE539268C2 SE1250380A SE1250380A SE539268C2 SE 539268 C2 SE539268 C2 SE 539268C2 SE 1250380 A SE1250380 A SE 1250380A SE 1250380 A SE1250380 A SE 1250380A SE 539268 C2 SE539268 C2 SE 539268C2
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
dna
melting
genotoxicants
dsdna
limited
Prior art date
Application number
SE1250380A
Other languages
English (en)
Other versions
SE1250380A1 (sv
Inventor
C Fussell Karma
E Heck Diane
D Laskin Jeffrey
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Priority to SE1250380A priority Critical patent/SE539268C2/sv
Priority to US13/860,790 priority patent/US8927463B2/en
Publication of SE1250380A1 publication Critical patent/SE1250380A1/sv
Publication of SE539268C2 publication Critical patent/SE539268C2/sv

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
    • C12Q2523/30—Characterised by physical treatment
    • C12Q2523/305—Denaturation or renaturation by physical action

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

Uppfinningen avser ett högeffektivt förfarande för snabbsàllning av ett flertal genotoxiska amnen för att bestammagraden och typen av genotoxicitet, varvid förfarandet inne-fattar följande steg: (a) tillsatta en volym dsDNA till testbrunnarna (b) tillsatta en volym genotoxiska amnen som ska utvarderastill testbrunnarna (c) tillsatta dsDNA-specifikt fargamne och referensfargamnetill testbrunnarna (d) mata detekterbar fluorescent signal som sands ut fråntestbrunnarna under DNA-smaltning med anvandning av en real-tidstermocykler (e) analysera smaltkurvor för initial fluorescens, initial smalthastighet och initial smalttemperatur.Uppfinningen avser vidare en anordning för sàllning av ett flertal genotoxiska amne med anvandning av det beskrivna förfarandet. 1250380-1 (120025SE sv översättn rättzuidocx, 2013-04-18

Description

Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada Uppfinningens område Förfarande för högeffektiv sàllning (HTS) av genotoxiska am- nen beskrivs, innefattande: exponering av DNA för toxiska am- nen, tillsats av ett lampligt fargamne som specifikt detekte-rar dubbelstrangat DNA och bestamning av smaltegenskaper un-der en temperaturgradient. Ändringar i smalthastigheten, tem-peraturen vid vilken initial smaltning sker och den initialamangden av dubbelstrangat DNA ar direkt proportionerligt tillgraden av DNA-skada. Förfarandet ar lampligt for övervakningav högeffektiv sållning av effekten hos miljöpàverkande fak-torer på DNA, inkluderande toxiska amnen och lakemedel och stràlningskemoterapi.
Uppfinningens bakgrundVid den tidpunkt 1953 då Watson and Crick beskrev strukturenhos DNA var dess strukturförlust vid högt pH eller hög tempe-ratur redan val kand. Dubbelhelixstrukturen gjorde det uppen-bart att DNA kunde öppnas genom att bryta vatebindningarna som håller ihop de två helixarna; detta var mekanismen genomvilken DNA-smaltning skedde. Tidig forskning fokuserad på syntetiska DNA-sekvenser visade att langden på DNA-sekvensenoch procentandelen CG-basparning var direkt proportionerligmot ökningar i smalttemperatur Förutom dess an- (Tm) och pH. vandningar som ett mätt på DNA-langd och % CG-innehåll an-vands idag DNA-smaltkurvor för att klargöra epigena modifie-och för att detektera enkelnukleotid- ringar (DNA-metylering) polymorfismer (SNP) i individuella gener.Dessa framsteg har varit möjliga på grund av anpassning avcellulart DNA-replikationsmaskineri till syntetisk genampli- fiering genom PCR. Denna teknik anvander fluorescenta fargam- nen för att mata ökningar i DNA-koncentration under tempera- turcykling. Nar amplifiering ar slutförd möjliggör dessa far-gamnen verifiering av Tm genom efter-PCR-smaltningskurvor somett test på amplifieringsspecificitet. Eftersom DNA smalter inom ett snavt temperaturområde (några få °C) kraver smalt-kurvackvisition de bildanalys- och temperaturkontrollförmågor som tillhandahålles av en realtidstermocykler.
Sådana DNA-smaltkurvor ar möjliga på grund av att dessa farg-amnen fluorescerar företradesvis då de interkaleras till dub-belstrangat, men inte enkelstrangat, DNA. Nar DNA denaturerarar fargamnet inte langre stabiliserat genom den negativt lad-dade DNA-grundstommen och fluorescensen dampas. Denna mekan-ism ar vanlig i de flesta DNA-bindande fargamnen; graden avdubbelstrangad specificitet ar emellertid en egenskap hosvarje fargamne. Om smaltkurvorna föregås av amplifieringkravs inte någon stor mangd av specificitet eftersom amplifi-eringssteget reducerar vilken icke-specifik bindning somhelst till nivåer lagre an bruströskeln. Om ingen amplifie-ring emellertid genomförs måste detta fargamne vara mycketspecifikt för dubbelstrangat DNA (dsDNA) (mer an lOO-faldigt över enkelstrangat DNA (ssDNA) och RNA)).Hittills har bestamning av genotoxicitet varit extremt lågeffektiv sållning. Många tillgangliga analyser mater an-tingen bakteriell celltillvaxt eller daggdjurscelltillvaxt imedium behandlade med potentiella mutagener. Andra cellbase-rade analyser tar ett geninduktionsbaserat tillvagagångssatt,med anvandning av reporteranalyser för att mata induktion avnyckel-DNA-skadande proteiner i daggdjurscellinjer, såsom re-parerande enzym. Det cellulara maskineriet för att laga DNA-dubbelstrangbrott, -enkelstrangbrott och nukleotidbasskador ar emellertid valdigt olika, vilket framtvingar separata test. Dessutom finns det overhorning mellan vagarna som medi- erar signalinduktion, vilka kan leda till falska positiva ochfalska negativa test. Forsoka att oka sållning av cellbase-rade analyser med anvandning av mikrotiterplattlasare har trasslat till sig eftersom det ar svårt att sakra kvalitetenhos dessa analyser mellan plattor. Befintliga genotoxicitets-test in vitro, såsom kometanalyser och 8-hydroxi-2-deoxi-guanosinframstallning, ignorerar vissa former av DNA-skada,såsom adduktbildande och DNA-strangtvarbindning, till formånfor andra. I slutanden måste multipla analyser utforas ocholika data måste jamforas. Ingen av dessa tekniker låter sigenkelt testa multipla foreningar vid samma tidpunkt och an- vandningen av komprimering ar vital då man testar ett biblio- tek innehållande miljoner foreningar.
Tre grupper har anvant mycket specifika dsDNA-bindande farg-amnen for att kvantifiera DNA-skada genom smaltkurvanalys 1997; 2007;1999).
(Singer et al., Kailasam et al., Rogers et al., 1999; Batel et al. Den forsta gruppen matte andring-arna i graden av dsDNA-denaturering vid hogt pH och korrele-rade detta till strålningsexponering. Denna teknik kraveremellertid att hela DNA:t kommer från samma sekvens och langdoch buffertens pH måste bestammas exakt, vilket gor denopraktisk for anvandning som en hogeffektiv sållningsanalys.Den andra gruppen anvande temperatur for att denaturerastrålningsskadat dsDNA, deras metodologi var emellertidbristfallig. De utforde matningar efter varmning av DNA:ttill endast tre temperaturer i ett vattenbad och kravde attfluorescens av det DNA-bindande fargamnet, i detta fallPicoGreen, skulle bestammas omedelbart innan DNA:t kundeåterhardas. Återigen kraver denna teknik att DNA:t kommerfrån samma sekvens och langd och går inte att koras i en hogeffektiv sållning. Den tredje gruppen matte forlust av fluorescens efter lyckad smaltning och återhardande qPCR-cyk-ler. Denna minskning i fluorescens härstammar från förlustenav små DNA-fragment vilket ar ett resultat från strålnings-skada. Medan denna andpunktsanalys ar den mest hogeffektivasållningen av de tre teknikerna kvantifierar den andå endastDNA-strangbrott eftersom den inte mater hela smaltkurvan,utan endast det initiala vardet på varje cykel. Den kvantifi-erar inte heller DNA-strangbrott felfritt, eftersom de storaDNA-fragmenten som bildats fortfarande kan återhardas (US Pa-tent nr. 4,407,942 10/1983 och 5,863,753 l/1999).I ljuset av det foregående skulle det vara av signifikantfordel for tekniken om ett kvantitativt forfarande for attdetektera genotoxicitet utvecklades som samtidigt kunde goraskillnader på olika former av bildade DNA-skador. Det skullevara en ytterligare fordel om en sådan analys kunde dra nyttaav hogeffektiva sållningstekniska utvecklingar såsom fluidik-automatisering och tata mikrotiterformat for att skapa Ett snabba, korrekta resultat utan att vara arbetsintensiva. sådant forfarande ar beskrivet hari.
Sammanfattning av uppfinningen Denna uppfinning overvinner nackdelarna med de tidigare ge-notoxicitetsanalyserna genom att tillhandahålla en hogeffek-tiv sållningsundersokningsanalys for DNA-skadande agens, i vilket graden och typen av DNA-skada detekteras samtidigt.
Det primara syftet med uppfinningen ar att tillhandahålla en fluorometrisk DNA-smaltanalys in vivo for att identifiera ochkvantifiera många former av genotoxicitet. Denna analys inne-fattar ett dsDNA-specifikt fargamne, ett referensfargamne,dsDNA och det experimentella systemet, varvid namnda dsDNA exponeras for de experimentella genotoxiska amnena, dsDNA och referensfargamnen. Proven forseglas och laddas i en realtids- termocykler for att analysera smaltkurvorna. Kurvor fràn ex-perimentella prov jamfors med de från kontrollprov i tre pa-rametrar. kluderar: l) Potentiella medel att detektera genotoxicitet in-initial fluorescens, eftersom dubbelstrangbrottokar antalet DNA-molekyler medan DNA-interkalerande agenstavlar om DNA-bindning med fargamnet, 2) initial smaltgrad,eftersom strangbrott och monofunktionell alkylering okarmangden tidig DNA-smaltning, medan tymintvarbindning och bi-funktionell alkylering minskar den initiala smaltgraden och3) temperaturen vid vilken initial smaltning sker (Ti), ef-tersom strangbrott och monofunktionell alkylering kommer attDNA- minska Ti, medan bifunktionell alkylering, strangtvarbindning och interkalering okar Ti. Genotoxiska am- nen kan ha mer an en verkansmekanism; t.ex. ar cisplatin ettkemoterapeutika som fungerar både som ett interkalerande amneoch ett bifunktionellt alkyleringsagens. Denna analys ar lamplig for vilken standardiserad mikrotiterplatta som helstfrån Society of Biomolecular Screening och kan enkelt anpas-sas for hogre densitetsformat inkluderande mikrofluidik- och matrisbaserade system.
Ett syfte med foreliggande uppfinning ar att tillhandahållaett hogeffektivt sållningsforfarande for att identifiera nyaantineoplastiska foreningar, antiproliferativa foreningar och antimikrobiella foreningar.
Ett ytterligare syfte ar att tillhandahålla ett hogeffektivtsållningsforfarande for att identifiera potentiella mutagener i farmaceutiska lakemedelsforeningsbibliotek.
Ett ytterligare syfte ar att kvantifiera genotoxiciteten somresulterar direkt eller indirekt från metabolism av vilken forening som helst.
Ett ytterligare syfte år att mata den genotoxiska aktivitetennedströms om vilken kemisk, biologisk, protein, enzym eller signalerande molekyl som helst.
Ett ytterligare syfte ar att identifiera genotoxicitet resul-terande från andringar i det cellulara maskineriet, specielltDNA-reparationsmaskineriet.
Ett ytterligare syfte ar att kvantifiera genetik (enkla nuk- leotidpolymorfismer, muteringar, etc.) eller epigena and- ringar i DNA (overtvinning, metylering etc.).Kort beskrivning av ritningarna Fig. l visar en schematisk ritning av smaltkurvorna for DNAmed representativa typer av DNA-skada.
Fig.2 visar effekten av okade koncentrationer av fenantrenki-non på DNA-smaltkurvor.
Fig.3 visar effekten av okade koncentrationer av hexestrol påDNA-smaltkurvor.
Fig.4 visar effekten av okade koncentrationer av 2-hydrox-iestradiol på DNA-smaltkurvor.
Fig.5 visar bristen på effekt av okade koncentrationer av kamptotecin på DNA-smaltkurvor.
Detaljerad beskrivning av uppfinningen Foreliggande forfarande tillhandahåller ett forfarande foratt soka efter foreningar som modulerar DNA-smaltkurvor.Identifiering av sådana foreningar har signifikans for bådeden farmaceutiska och medicinska industrin. Föreningar somorsakar genotoxicitet ar mutagena och karcinogena och derasterapeutiska anvandning ska undvikas, forutom for anvandning i specifika sjukdomar såsom cancer. Omvant har foreningar med potential för antingen förebyggande eller stimulering av re-paration flera anvandningsområden, inkluderande medicinering av cancer i förebyggande syfte och hjalpterapeutika.
På liknande satt kan förmågan att detektera DNA-skada pålit-ligt och snabb vara anvandbart i vissa diagnostiska procedu-rer; såsom vid detektering av DNA-skada som uppkommit innancancer, genotoxicitet som ett resultat av en speciell terapieller DNA-oskadat tillstånd innan uppmaning av en terapi.Förfaranden för att pålitligt bestamma både typen (eller ty-perna) av DNA-skada och graden av genotoxiciteten i etthögeffektivt sållningssatt har inte varit tillgangligt förran föreliggande uppfinning.
För andamålet att beskriva denna uppfinning ar följande ut- tryck till hjalp och har följande betydelser: Definitioner Uttrycket ”specifik struktur” som det anvands hari avser vil-ken nukleinsyrastruktur som helst som inte kanns igen somdubbelstrangat DNA.
Uttrycket ”DNA” avser deoxiribonukleinsyra. Det kommer attförstås av fackmannen på området att då manipulation beskrivshari som avser DNA går de också att anvanda på andra speci-fika DNA- eller RNA-strukturer. dsDNA avser dubbelstrangadDNA. ssDNA avser enkelstrangad DNA.
Såsom det anvands hari avser uttrycket ”interkalering” infö- rande mellan lagren i DNA-basparstegen.
Uttrycket ”mutationer” avser andringar i sekvensen hos en nukleinsyra av vildtyp eller andringar i sekvensen hos en peptid. Sådana mutationer kan vara punktmutationer såsomovergångar eller tvargångar. Mutationerna kan vara avlags-ningar, inforanden eller dupliceringar.
Såsom det anvands hari avser ”DNA-skada” eller ”specifik DNA-skada” DNA som inte normalt ar narvarande i en intakt cellunder fysiologiska tillstånd under interfas. Strangbrott pågrundstommen i DNA skapas till exempel inte normalt i en in-terfascell. Strangbrott skapas emellertid av vissa lakemedeloch ultraviolett eller joniserande strålning. For denna upp-finnings syfte anses alla storningar i grundstommen somstrangbrott. Andra DNA-skador kan inkludera den kovalentabindningen av kemiska delar till DNA, baspar-interkalering eller en kombination av DNA-skadetillstånd.
Uttrycket ”genotoxiskt amne” såsom det anvands hari avser en genotoxisk forening, kemikalie, enzym såsom DNAse eller enbiologisk missreglering såsom misslyckad DNA-reparation elleren biologisk process, varvid det genotoxiska amnet resulterarfrån en kemisk, biologisk eller fysikalisk process. Kallanfor det genotoxiska amnet kan variera mycket beroende påundersokningsområdet av intresse.
Uttrycket ”genotoxicitet” avser, såsom det anvands hari,bildandet av DNA-skada eller storningen av normal nukleinsy-rastruktur, vilket kan resultera i DNA-muteringar.
Såsom det anvands hari avser uttrycket ”smaltkurva” denature-ringen eller återhardningen av DNA som svar på andringar itemperatur, pH, jonstyrka, ureakoncentration eller organiskt innehåll.
Såsom det används hari avser uttrycket ”fysiologiska till- stånd” temperatur, pH, jonstyrka, viskositet och liknande bi-okemiska parametrar som ar kompatibla med en livskraftig org-anism och/eller som typiskt existerar intracellulart i en livskraftig odlad jastcell eller daggdjurscell. Exempelvis arde intracellulara betingelserna i en jastcell som odlats un-der typiska laboratorieodlingsbetingelser fysiologiska till-stånd. Lampliga reaktionsbetingelser in vitro for transkript-ionscocktails in vitro ar i allmanhet fysiologiska tillstånd.I allmanhet innefattar fysiologiska tillstånd in vitro 50-200pH 6,5-8,5, 20-45°C och 0,00l-l0 mM diva- Caß) ; mM NaCl eller KCl,(Mg2-f,pH 7,2-7,6, lent katjon foretradesvis omkring 150 mM NaCl eller KCl, 5 mM divalent katjon och inkluderar ofta 0,0l-l,0 procent icke-specifikt protein (t.ex. BSA). En nonjonisk detergent (Tween, NP-40, Triton X-100) kan ofta vara narvarande, vanligtvis vid omkring 0,00l till 2%, ty- piskt 0,05-0,2% (volym/volym). Speciella vattenhaltiga till-stånd som kan valjas av utovaren enligt konventionella forfa-randen.
Uttrycket ”mikrotiterplatta” avser, såsom det anvands hari,den fysiska lanken mellan åtminstone två karl. Oftare inne-fattar en mikrotiterplatta den fysiska lanken mellan flerasåsom 96 karl i ett matrisformat. karl, En mikrotiterplatta kan ha minde, eller mer an 96 brunnar.Uttrycket ”lågdensitetsformat” avser, såsom det anvands hari,anvandningen av individuella testror eller en mikrotiter-platta med 6, 12, 24 eller 48 brunnar. såsom det anvands hari, 384 eller l536 Uttrycket ”hogdensitetsformat” avser, anvandningen av en mikrotiterplatta med 96, brunnar. Ett ultrahogt densitetsformat på en mikromatris el-ler mikrofluidikchip betyder 10 000 eller 100 000 eller fler reaktionskarl per matris.
Realtids-DNA-smältanalysKomponenter i denna analys inkluderar 1) ett reaktionskarlfritt från DNAse och RNAse, 2) ett dsDNA-specifikt fargamne, 3) ett referensfargamne, 4) dsDNA och 5) det genotoxiska am- net eller de genotoxiska amnena. I detta fall ar det dsDNA-specifika fargamnet PicoGreen, referensfargamnet ar ROX,dsDNA kommer från kalvtymus och har modifierats for att upp-visa olika kanda typer av DNA-skada. Nar provet varms i real-tidstermocyklern smalter dsDNA:t och blir enkelstrangat. En-kelstrangat DNA stodjer inte langre PicoGreen-fluorescens,den relativa mangden PicoGreen till ROX-fluorescens minskar således proportionerligt med forlusten av DNA-basparning.
Reaktionskarlen fria från DNAse och RNAse som kan anvandas idenna analys inkluderar en behållare med formåga att hälla vilken volym som helst, tillverkad av konventionella ellerokonventionella material inkluderande till) (men inte begransade polystyren, polyvinylklorid, polykarbonat, metall eller glas. Ytan på reaktionskarlen kan behandlas, derivatiseras eller belaggas. Ofta utgors karlen for hogeffektiva såll-ningsanalyser av mikrotiterplattor. I en utforingsform ardsDNA:t derivatiserat till brunnarna i en mikrotiter-PCR-platta eller ett ultrahogeffektivt sàllningschip. I en annanar PCR-plattor cellodlingsbehandlade for att forsakra cellu- lar vidhaftning.
En kvantitet av dsDNA tillsatts sedan till något tomt reakt- ionskarl. dsDNA:t kan vara från vilken kalla som helst, an- tingen syntetisk, bakteriell, virus, vaxt eller djur; och kan llvara av vilken sekvens eller langd som helst. dsDNA:t kan ti- digare vara skårat, skuret, amplifierat eller bearbetat genom vilken procedur som helst ar kand for en fackman på området.DNA:t behandlas sedan med det genotoxiska amnet, vilket kananvandas oberoende eller administreras tillsammans med någotinkluderande behandlingssystem, (men inte begransat till) vilket metaboliserat enzym, cellfraktion, co-faktor eller organism som helst som andrar, forhojer eller forbattrar po-tentialen hos DNA-skada. Behandling med det gentoxiska amnetkan ske under vilken tidslangd som helst fore, under ellerefter tillsats av fluorescent fargamne (eller fluorescenta fargamnen).
Efter behandling med det genotoxiska amnet tillsatts en cock-tail av dsDNA-specifika fargamnen och referensfargamnen tillreaktionskarlet. Vilken indikator som helst med selektivitetfor dsDNA kan anvandas med eller utan en referensindikator for normalisering. Nar fargamnet har tillsatts forseglas re- aktionskarlet och utsatts for smaltkurvanalys.
Smaltkurvanalys utfors typiskt i ett realtidstermocyklerin-strument. Denna anordning har fordelarna med utomordentligtkanslig provtemperaturkontroll liksom aven ett fluorescensde-tekteringssystem. En fackman på området kan emellertid an-vanda vilket lampligt system som helst for att utfora DNA-smaltanalysen. Utdata fràn sådana instrument ar den uppmattautdatan från en eller flera fluorescensovergångar och tempe- raturen vid vilken fluorescensen bestamdes.
I en utforingsform ar den råa dsDNA-specifika fluorescensennormaliserad till motsvarande referensfluorescens vid varje temperaturpunkt for att korrigera for minskad fargfluore- 12 scens, direkt resulterande från den okade losningstemperatu-ren. Denna normaliserade fluorescens plottas sedan som funkt-ion av temperaturen for att skapa smaltkurvan. Initial fluo-rescens från denna kurva anvands for att bestamma omfatt-ningen av dubbelstrangbrott. Den forsta derivatan av dennasmaltkurva plottas sedan och anvands for att bestamma bådeden initiala smalttemperaturen och smalthastigheten over helatemperaturgradienten. Jamforelse av dessa data med negativ kontrolldata (ingen DNA-skada) och positiv kontrolldata (prov med kant gentoxiskt amne) samanalyserade på samma platta av-slojar typen och graden av DNA-skada. Schematisk representat-ion av de typiska smaltkurvorna visas i figur l, varvid DNA-dissociation okar med okat pH, salthalt eller temperatur,vilket resulterar i en minskning i relativ fluorescens. Typenoch kvantiteten av DNA-skada andrar vasentligen kannetecknenfor denna smaltkurva, så att denna analys kan anvandas for att kvalitativt och kvantitativt beskriva den genotoxiska po- tentialen hos okanda foreningar.
Forfarandet enligt denna uppfinning kan exempelvis anvandas idetekteringen av DNA-skada for att kvalificera eller diskva-lificera DNA for ytterligare analys, inkluderande, men intebegransat till: (a) genetisk analys eller genomanalys av en enkel cell elleren population av celler men inte be- hel- (b) gen- eller genomsekvensering, inkluderande, gransat till, målsokande sekvensering, exomsekvensering,NextGen-sekvensering och ChIP-sekvensering de- genomsekvensering, (c) genotypning, inkluderande, men inte begransat till,tektering av enkla nukleotidpolymorfismer eller helgenom-ge-notypning inkluderande, (d) genuttryckningsanalys, men inte begransat till realtids-PCR eller kvantitativ PCR, mikrofluidik-, chip- eller matrisbaserad hogeffektiv uttryckningsanalys l3 (e) reproduktionsnummeranalys, inkluderande, men inte begran- sat till, bestämning av reproduktionsnummervariation mellan individuella celler eller organismer.
Förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan vidare anvan-das i detekteringen av DNA-skada för att kvalificera ellerdiskvalificera DNA för att diagnostiskt testa anvandningar,inkluderande, men inte begransade till:(a) DNA harstammande från helblod, serum eller vilken annanbiologisk kalla som helst (b) friflödande DNA.
Förfarandet enligt någon av de beskrivna utföringsformerna kan anvandas för att identifiera genotoxiska amnen för att utveckla ett förfarande för att behandla ett tillstànd, en sjukdom eller en störning i manniskor eller djur genom att utveckla en DNA-bindande förening innefattande: (a) sållning av föreningar enligt analysen redogjord för i denna ansökan; (b) val av de föreningar som uppvisar störst effektgrad på DNA-smaltning; (c) formulering av en farmaceutisk komposition innefattandeen eller flera av vilka som helst av dessa föreningar; och(d) administrering av den farmaceutiska kompositionen till enindivid i behov av sådan behandling.
Föreningarna namnda i steg (a) kan vara samma genotoxiskaeller kan vara föreningar som namnts i början av paragrafen, andra på grund av att de ar terapeutiska.
En anordning att anvandas i förfarandena beskrivna i dennauppfinning för sållning av ett flertal genotoxiska amnen kan innefatta: l4 (a) ett flertal testbrunnar till vilka en volym dsDNA kantillsattas, och(b) utrustning for overvakning av DNA-smaltning, inklude- rande, men inte begransat till, utrustning anvand for att de- tektera DNA med anvandning av nativ absorption, eller fluore-scenta eller spektrofotometriska DNA-fargamnen,(c) utrustning for analysering av smaltkurvor, foretradesvis en termocykler.
Testbrunnarna i anordningen kan vidare innefatta en behållaremed formàgan att hälla vilken volym som helst, tillverkade avkonventionella eller okonventionella material, inkluderande, men inte begransat till, polystyren, polyvinylklorid, po- lykarbonat, metall eller glas, och varvid testbrunnarna val- fritt ar behandlade, derivatiserade eller belagda.
Exempel Flera farmakologiskt viktiga genotoxiska amnen ar kanda attexistera. Många av dessa genotoxiska amnen anvands som anti-neoplastiska och antiproliferativa terapeutiska amnen, ochskrivs ut som kemoterapeutika och antibiotika. Det ar emel-lertid inte alla kemoterapeutiska och antibiotiska behand-lingar som anvander sina effekter genom en genotoxisk mekan-ism. Test av en genotoxisk analys mot kanda neoplastiska ochantiproliferativa farmakologiska amnen representerar således ett anvandbart bevis for konceptet.
Formàgan att detektera DNA-skadande amnen undersoktes forstunder betingelse under vilka endast det farmaceutiska amnettillats interagera med dsDNA:t. Figurer 2-5 visar exempel påeffekterna av kemikalier som modifierar DNA på DNA- smaltprofiler.
Figur 2 visar effekten av fenantrenkinon på DNA-smaltkurvor. dsDNA (1000 ng/ml), behandlad med okande koncentrationer av det alkylerande amnet fenantrenkinon, inkuberades medPicoGreen och rodamin-ROX-referensfargamnet. Prov analyserademed anvandning av en ABI 7300 realtidstermocykler over etttemperaturomràde av 4°C till 99°C. Data presenteras somPicoGreen-fluorescens normaliserad till ROX. Dessa data visaratt okande dsDNA-alkylering orsakar en okning i den initiala smalttemperaturen.
Dessa data visar att okad dsDNA-alkylering orsakar en okningi den initiala smalttemperaturen. Detta betyder att okning iinitial smalttemperatur jamfort med kontroll indikerar dub-belstrangad DNA-alkylering.
Figur 3 visar effekten av hexestrol på DNA-smaltkurvor. dsDNA(1000 ng/ml), behandlad med okande koncentrationer av det in-terkalerande amnet hexestrol, inkuberades med PicoGreen ochrodamin-ROX-fargamnet. Proven analyserades med anvandning avABI 7300 realtidstermocykler over ett temperaturomràde av 4°Ctill 99°C. Data presenteras som PicoGreen-fluorescens norma-liserad till ROX. Dessa data visar att okande dsDNA-interka-lering orsakar en minskning av den initiala smalttemperatu- IGÛ.
Dessa data visar att okande dsDNA-interkalering orsakar enminskning i fluorescens. Detta betyder att det finns enminskning av den initiala smalttemperaturen for dsDNA och in- dikerar narvaron av ett interkalerande amne.
Figur 4 visar effekten av 2-hydroxiestradiol på DNA- smaltkurvor. dsDNA (1000 ng/m), behandlad med okande koncent- rationer av det DNA-strangklippande agenset 2-hydroxiestra- diol, inkuberades med PicoGreen och rodamin-ROX- 16 referensfargamnet. Prov analyserades over ett temperaturom-råde av 4°C till 99°C med anvandning av en ABI 7300 realtids-termocykler. Data presenteras som PicoGreen-fluorescens nor-maliserad till ROX. Dessa data visar att okande dsDNA-klipp-ning orsakar en okning i initial smalttemperaturlutning på grund av enkelstrangbrott. Då enkelstrangbrott befinner sig inara anslutning till varandra kan foljden bli dubbelstrang-brott. Detta visas ovan som en okning i initial fluorescens.Figur 5 visar effekten av kamptotecin på DNA-smaltkurvor. dsDNA (1000 ng/ml) behandlades med icke-genotoxiska koncent-rationer av kamptotecin och inkuberades med PicoGreen och rodamin-ROX-referensfargamnet. Prov analyserades med anvand-ning av en ABI 7300 realtidstermocykler over ett temperatur-område av 4°C till 99°C. Data presenteras som PicoGreen-fluo-rescens normaliserad till ROX. Dessa data visar att det icke- genotoxiska kamptotecinet inte andrar DNA-smaltning.
For en fackman på området kan foreliggande uppfinning appli-ceras som en sållning av nya antineoplastiska, antiprolifera-tiva och antimikrobiella terapeutika. Dessa foreningar uppvi-sar ofta sina antineoplastiska, antiproliferativa och antimi-krobiella egenskaper via ett genotoxiskt verkningssatt. Fore-liggande uppfinning kan anvandas som en hogeffektiv sàllningfor att identifiera potentiella nya antineoplastiska, anti-proliferativa och antimikrobiella terapier från lakemedels-bibliotek innehàllande många miljoner foreningar. Medan for-màgan att skada DNA kan vara en viktig egenskap for dessaspeciella lakemedelsklasser, ar mutagenicitet i allmanhet an-sedd som en oonskad egenskap hos en lakemedelskandidat. Muta-gener avancerar ofta till dyra prekliniska tester innan dessaegenskaper identifieras och lakemedlet avlagsnas från kandi- deringen; det ar darfor extremt onskvart att identifiera då- l7 liga ledande föreningar tidigare i lakemedelsutvecklingspro-cessen. För en fackman på området kan föreliggande uppfinninganvandas för att söka i hela bibliotek med föreningar för attidentifiera potentiella mutagener eller föreningar som meta-boliserar till mutagener innan de går in i preklinisk ut-veckling. I det senare fallet kan föreningar placeras i ana-lysen efter att de har behandlats med enzym som kan göra demmetaboliserade. Exempelvis kan föreningar först behandlas medmikrosomala fraktioner som ar kanda att mediera metabolismeller cytokrom P450-enzymer. Föreningarna kan sedan tillsat-tas till analyserna för att utvardera DNA-skada. I en utfö-ringsform för den högeffektiva sàllning kan enzymer som medi-erar metabolism tillsattas direkt till reaktionskarlen samti-digt med DNA:t vilket sedan kan analyseras för dess fluore- scensegenskaper.
På liknande satt kan föreliggande uppfinning utstrackas tillvilken DNA-kalla som helst, inkluderande den som kan isolerasfrån celler eller vavnader. Det skulle darför vara enkelt fören fackman på området att utstracka föreliggande uppfinningtill att detektera DNA-skada resulterande från behandlingenav dessa celler och vavnader. Denna analys kan darmed anvan-das för att detektera genotoxicitet resulterande från and- ringar i cellulart maskineri, eller vilken sådan aktivitetsom helst nedströms om vilken kemisk, biologisk, protein, en-zym eller signalerande molekyl som helst, eller slutligen re-sulterande från vilken genetisk eller epigenetisk andring i DNA:t som helst.
Referenser Singer YL, Jones LJ, Yue ST, Haugland RP., “Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-basedsolution assay for double-stranded DNA quantitation.”, Anal Biochem. 249:228-238 (l997). l8 Kailasam S, Rogers KR., “A fluorescence-based screening assay for DNA damage induced by genotoxic industrial chemicals.”, Chemosphere. 66:l65-l7l (2007).
Rogers KR and Apostol A, “Detection of low dose radiation in- duced DNA damage using temperature differential fluorescence assay”, Anal Chem 7l: 4423-4426 (l999).
Batel et al., “A microplate assay for DNA damage determina- tion (fast micromethod) in cell suspensions and solid tis- sues”, Anal. Biochem. 270:l95-200 (l999).
US-patent nr. 4,407,942 l0/1983 US-patent nr. 5,863,753 l/1999 Wittwer CT., “High-resolution DNA melting analysis: advance- ments and limitations.”, Hum Mutat. 30:857-859 (2009).
Garritano et al., “Determining the effectiveness of High Res- olution Melting analysis for SNP genotyping and mutation scanning at the TP53 locus.”, BMC Genet. l0:5, (2009).
Shi MM., “Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technolo- gies.”, Clin Chem. 47:l64-l72 (200l).
US-patent med publiceringsnummer US 2006/0078911 Al, Molecu- lar Probes: The Handbook, Parts l-3 (2009).
Persil O et al., “Harnessing DNA intercalation”, Trends Bio- technol., 25:433-436 (2007).

Claims (18)

PATENTKRÄV
1. l. Högeffektivt förfarande för snabb sàllning av ett flertalgenotoxiska ämnen för att bestämma graden och typen av ge-notoxicitet, innefattande stegen att: (a) tillsätta en volym dsDNA till testbrunnar (b) tillsätta en volym genotoxiska ämnen som ska utvärderastill testbrunnarna (c) tillsätta dsDNA-specifikt färgämne och referensfärgämnetill testbrunnarna (d) mäta detekterbar fluorescent signal utsänd från testbrun-narna under DNA-smältning med användning av en realtidstermo-cykler eller annan lämplig värme-, pH- eller salthaltskälla(e) analysera smältkurvor för initial fluorescens, initial smälthastighet och initial smälttemperatur.
2. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvidtillsatsen av genotoxiska ämnen i steg b) görs tillsammansmed ett annat behandlingssystem, vilket behandlingssystem kanvara vilken metaboliserande enzym, cellfraktion, cofaktor,organism som helst som ändrar, ökar eller förbättrar potenti-al för DNA-skada, och/eller varvid exponeringen av det ge-notoxiska ämnet inkluderar användningen av epigena regulato- rer eller modulatorer.
3. Förfarande enligt krav l eller 2, varvid de genotoxiskaämnena är (a) en eller flera kemiska produkter, antingen syntetiskaeller naturliga; eller (b) ett biologiskt ämne, antingen protein, lipid, kolhydrat,nukleinsyra eller en kombination av dessa; eller(c) en fysikalisk eller kemisk process; eller (d) ett bibliotek av genotoxiska föreningar; eller (b), (C) OCh (d)- vilken kombination som helst av (a), 1250380-1, (l60420 Nya patentkrav versiun 2), 2016-04-20
4. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid åtminstone ett av stegen utförs med hjälp av robot.
5. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varviddsDNA:t härstammar från vilken källa eller form som helst, syntetisk eller naturlig.
6. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvidgenotoxiciteten är ett direkt eller indirekt resultat av enbiologisk ändring eller process, inkluderande de som resulte- rar från syntetisk manipulering.
7. Förfarande enligt något av de föregående kraven, utfört iantingen låg- eller högdensitetsformat, innefattande enklarör, mikrotiterplattor, chip och mikrofluidikmatriser.
8. Förfarande enligt något av de föregående kraven, antingen föregånget eller följt av DNA-amplifiering.
9. Förfarande enligt något av de föregående kraven, med an-vändning av vilket cellulärt, biologiskt eller syntetiskt DNAsom helst, med eller utan lys- eller reningssteg som källan för dSDNA.
10. Förfarande enligt något av de föregående kraven, medanvändning av DNA isolerad från celler eller vävnader expone- rade eller oexponerade för genotoxiska ämnen.
11. ll. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvidfärgämnet eller någon komponent i förfarandet är kovalenteller icke-kovalent bunden till vilken yta, analyskomponent eller molekyl som helst. 1250380-1, (160420 Nya patentkrav version 2), 20l6-04-20
12. Förfarande enligt något av de föregående kraven varvid envärme-, DNA:t. pH- eller salthaltskälla används för att smälta
13. Användning av ett förfarande enligt något av de föregå-ende kraven för att söka efter farmakologiska aktiviteterinkluderande, men inte begränsat till, antineoplastiska ochantiproliferativa aktiviteter och/eller antimikrobiella akti-viteter; såsom antibakteriella, antiprotozoala, antisvamp-, antivirala och antihelmintiska egenskaper.
14. Användning av ett förfarande enligt något av kraven l-12för detekteringen och regleringen av genotoxiska ämnen inne-fattande de som återfinns i mat, vatten, luft, pesticider, konsumentprodukter och vilka andra bostads-, jordbruks-, miljö- eller industritillämpningar som helst.
15. Användning av ett förfarande enligt något av kraven l-12för detekteringen av DNA-skada för att kvalificera ellerdiskvalificera DNA för ytterligare analys, inkluderande, meninte begränsat till: (a) genetiska analyser eller genomanalyser av en enkel celleller en population av celler (b) gen- eller genomsekvensering inkluderande, men inte be-gränsat till, målsökande sekvensering, exomsekvensering,helgenomsekvensering, NextGen-sekvensering och ChIP-sekvensering (c) genotypning inkluderande, men inte begränsat till, detek-tering av enkelnukleotidpolymorfismer eller helgenomgenotyp-ning (d) genuttryckningsanalys inkluderande, men inte begränsattill, realtids-PCR eller kvantitativ PCR, mikrofluidik-, chip- eller matrisbaserad högeffektiv uttryckningsanalys 1250380-1, (160420 Nya patentkrav version 2), 2016-04-20 (e) reproduktionsnummeranalys, inkluderande, men inte begrän-sat till, bestämning av reproduktionsnummervariation mellan individuella celler eller organismer.
16. Användning av ett förfarande enligt något av kraven 1-12för detekteringen av DNA-skada för att kvalificera ellerdiskvalificera DNA för diagnostiska testappliceringar, inklu-derande men inte begränsat till: (a) DNA härstammande från helblod, serum eller vilken annanbiologisk källa som helst (b) friflödande DNA.
17. Användning av ett förfarande enligt något av kraven 1-12för identifiering av genotoxiska ämnen för att skapa nyamolekylära samlingar inkluderande, men inte begränsat till fluorescenta nanomärkningar.
18. Användning av ett förfarande enligt något av kraven 1-12för identifiering av genotoxiska ämnen för att utveckla ettförfarande för behandling av ett tillstànd, en sjukdom elleren störning i människor eller djur genom att utveckla en DNA-bindande förening innefattande: (a) sållning av föreningar enligt någon av analyserna be-skrivna i de föregående kraven; (b) välja de föreningar som uppvisar den största effektgradenpå DNA-smältning; (c) formulering av en farmaceutisk komposition innefattandeen eller flera av vilka som helst av dessa föreningar; och(d) administrering av den farmaceutiska kompositionen till en individ i behov av sådan behandling. 1250380-1, (160420 Nya patentkrav version 2), 2016-04-20
SE1250380A 2012-04-16 2012-04-16 Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada SE539268C2 (sv)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1250380A SE539268C2 (sv) 2012-04-16 2012-04-16 Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada
US13/860,790 US8927463B2 (en) 2012-04-16 2013-04-11 Sensitive high throughput method for DNA damage and repair

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1250380A SE539268C2 (sv) 2012-04-16 2012-04-16 Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE1250380A1 SE1250380A1 (sv) 2013-10-17
SE539268C2 true SE539268C2 (sv) 2017-06-07

Family

ID=49325616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE1250380A SE539268C2 (sv) 2012-04-16 2012-04-16 Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada

Country Status (2)

Country Link
US (1) US8927463B2 (sv)
SE (1) SE539268C2 (sv)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4407942A (en) 1981-01-29 1983-10-04 Atomic Energy Of Canada Limited Fluorescent detection of DNA damage
US5658751A (en) 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability

Also Published As

Publication number Publication date
SE1250380A1 (sv) 2013-10-17
US8927463B2 (en) 2015-01-06
US20130274130A1 (en) 2013-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5837466A (en) Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples
Booth et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine
Diehl et al. Digital quantification of mutant DNA in cancer patients
US20120237936A1 (en) Methods and related devices for single molecule whole genome analysis
Sina et al. DNA methylation-based point-of-care cancer detection: challenges and possibilities
JP4617403B2 (ja) 配列の相違を検出する方法
JP3752466B2 (ja) 遺伝子検査方法
EP3105324B1 (en) Ngs systems control and methods involving the same
JP2022110152A (ja) 診断方法及び組成物
Yu et al. Quantitative investigation of methylation heterogeneity by digital melting curve analysis on a SlipChip for atrial fibrillation
US20060194229A1 (en) Cancer markers and detection methods
Deng et al. Microfluidic epigenomic mapping technologies for precision medicine
El-Hashemite et al. Single cell detection of beta-thalassaemia mutations using silver stained SSCP analysis: an application for preimplantation diagnosis.
Lei et al. Early Monitoring Drug Resistant Mutation T790M with a Two-Dimensional Simultaneous Discrimination Nanopore Strategy
KR20010051353A (ko) 변동된 종결 분석에 의한 핵산 서열의 변형 검출 방법
Thyagarajan et al. New approaches for genotyping paraffin wax embedded breast tissue from patients with cancer: the Iowa women’s health study
Majewska et al. Transcriptomic profiling during myogenesis
SE539268C2 (sv) Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada
Bhardwaj et al. Neonatal hemoglobinopathy screening: molecular genetic technologies
CN1847852B (zh) 单核苷酸多态性试纸条快速检测方法及其试纸条
Deharvengt et al. Molecular assessment of human diseases in the clinical laboratory
Moldovan et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification–a short overview
Bhattacharya Application of genomics tools in meat quality evaluation
RU2200762C2 (ru) Способ детекции варианта последовательности нуклеиновой кислоты с помощью анализа терминации со сдвигом
Teh et al. The use of Taqman genotyping assays for rapid confirmation of β‐thalassaemia mutations in the Malays: accurate diagnosis with low DNA concentrations