SK6282000A3 - Physiologically acceptable aqueous solutions and methods for their use - Google Patents

Description

Fyziologicky prijateľný vodný roztok a jeho použitie

Oblasť techniky

Táto prihláška naväzuje na prihlášku číslo .........

podanú 2. júna 1997 (referenčné číslo právneho zástupcu 06537/012001), ktorá naväzuje na prihlášku číslo 08/780,974 podanú 9.

08/364,699, ktorá naväzuje týchto prihlášok

Predmetom januára 1997, ktorá , ktorá naväzuje na na prihlášku sú tu uvedené navrhovaného naväzuje na prihlášku číslo prihlášku číslo 08/253,384, číslo 08/071,533 a závery ako citácie.

vynálezu roztoky slúžiace ako náhrada plazmy Opisované roztoky obsahujú elektrolyt, systém a neobsahujú uplatnenie časť pacientovej roztokom.

onkoticky aktívnu zložku, konvenčné pufry. Opisované v celom rade aplikácií, najmä krvi má byť sú fyziologické a ich použitie, dynamický pufračný pričom roztoky roztoky nájdu v prípade, keď nahradená substitučným

Doterajší stav techniky

Fyziologicky prijateľné roztoky nachádzajú uplatnenie v rade rôznych aplikácií v medicíne, biomedicínskom výskume a príbuzných odboroch. Príkladom môže byť využitie fyziologicky prijateľných roztokov ako náhrada plazmy pri chirurgických zákrokoch, kedy je pacientovi potrebné nahradiť značný objem krvnej plazmy. Ďalšie použitie týchto roztokov je pri náhrade straty krvi spôsobenej chirurgickým zákrokom alebo poranením, alebo ak je treba udržať v hypotermickom alebo zamrazenom stave tkanivo, orgán, skupinu orgánov alebo celý subjekt. Tieto roztoky sú tiež nevyhnutné, pokiaľ pacientova krv prechádza cez externé zariadenie, ako je prístroj pre kardiopulmonárny by-pass, kde v dôsledku pripojenia ďalšieho cirkulačného objemu vzniká prázdny objem, ktorý musí byť vyplnený kompatibilným krvným substituentom, t.j. roztokom, ktorý zvýši objem pacientovej krvi.

Fyziologicky subtituenty plazmy sa neprijateľných zmien precipitátov, ktoré neúmerného množstva zavádzaním látok prijateľné musia v ich roztoky použiteľné ako voľne miešať s zložkách, ako upchávali malé cievy, krvou bez je vznik deštrukcií by krvných zložiek (krviniek, vytvárajúcich vodnú, iónovú alebo nerovnováhu, ktorá by poškodzovala bunky tela a doštičiek) molekulovú tkanív alebo spôsobujúcich vážne fyziologické poškodenie, ako je neúmerné zvýšenie alebo zníženie tepovej frekvencie, funkcie nervov, svalovej činnosti a podobne.

Prvé vyvinuté náhrady krvnej plazmy boli pripravené z krvi cicavcov. Hoci ich používanie bolo úspešné, pretože pochádzajú z prírodného zdroja, môžu tieto deriváty obsahovať rad patogénnych substancii, ako sú vírusové patogény typu HIV, hepatitídy B a ďalšie patogény, napr. prióny, ktorých prítomnosť je asociovaná CruetzfeldtJacobovou chorobou a podobne.

Dnes existuje celý rad syntetických náhrad krvi a plazmy. Napriek tomu, že syntetické náhradky krvnej plazmy sú využiteľné v mnohých aplikáciách, žiadna z nich sa nedá použiť vo všetkých prípadoch.

Preto je stále potrebné vyvíjať nové fyziologicky prijateľné vodné roztoky, použiteľné ako náhrada krvnej plazmy. Konkrétne ide o roztoky použiteľné pri hypotermických chirurgických zákrokoch, ako sú operácie srdca a podobne. Tiež je vhodné, aby tieto roztoky boli tepelne sterilizované.

Rad fyziologicky prijateľných roztokov, najmä krvné náhrady a ich použitie, je opísaných v U.S. patentoch číslo: RE 34 077; 3 937 821; 4 001 101; 4 061 736; 4 216 205; 4 663 166; 4 812 310; 4 908 350; 4 923 442; 4 927 806;

082 831; 5 084 377; 5 130 230; 5 171 526; 5 210 083; 5 274 001; 5 374 624 a 5 407 428.

Ďalšie citácie opisujúce fyziologicky prijateľné roztoky, vrátane krvných náhrad, sú: Bishop et al., Transplantation (1978) 25: 235-239; Messmer et al., Characteristics, Effects and Side-Effects of Plasma Substitutes 51-74; Rosenberg, Proc. 12^th Congr. Int: Soc. Blood Transf. (1969); Spahn, Anesth. Analg. (1994) 78: 1000-1021; Biomedical Advances in Aging (1994) (Plénum Press) Chapter 19; Wagner et al., Clin. Pharm. (1993) 12: 335; ATCC Catalogue of Bacteria & Bacteriophages (1992) p. 486; and 06-3874-R8-Rev. May (1987) Abbott Laboratories, North Chicago, IL 60064, USA.

Ďalšie citácie opisujúce fyziologicky prijateľné roztoky, vrátane hypotermických aplikácií, sú: Bailes et al., Cryobiology (1990) 27: 615-696 (str. 622-623); Belzer et al., Transplantation (1985) 39: 118-121; Collins, Transplantation Proceedings (1977) 9: 1529; Fischer et al., Transplantation (1985) 39: 122; Kallerhoff et al., Transplantation (1985) 39: 485; Leavit et al., FASB J. (1990) 4: A963; Ross et al., Transplantation (1976) 21: 498; Segall et al., FASB J. (1991) Smith; Proc. Royal Soc. (1956) 145: 396; Waitz et. al., FASB J. (1991)5.

Lehninger, Biochemistry (2^nd Ed. 1975), str. 829ff opisuje prehľad krvných zložiek a ich náhrad.

Podstata vynálezu

Predmetom navrhovaného vynálezu sú fyziologické roztoky a ich použitie. Opisované roztoky obsahujú elektrolyt, dynamický pufračný systém a onkoticky aktívnu zložku, pričom tieto roztoky môžu ďalej obsahovať buď cukor alebo bikarbonát a budú obsahovať buď horčík alebo cukor. Opisované roztoky nájdu uplatnenie v celom rade aplikácií, najmä v prípade, že časť pacientovej krvi má byť nahradená substitučným roztokom. Ďalej sú najprv detailne opísané samotné vodné roztoky a potom nasleduje opis reprezentatívnych aplikácií, v ktorých sú tieto roztoky použité.

Pred ďalším opisom treba uviesť, že navrhovaný vynález nie je limitovaný konkrétnymi variantmi vynálezu opisovanými ďalej, lebo možno použiť variant navrhovaného vynálezu, ktorý síce nie je opísaný, avšak napriek tomu spadá do rámca vymedzeného priloženými nárokmi. Je tiež samozrejmé, že terminológia pre opis konkrétnych variantov nemôže byť považovaná za limitujúcu. Predmet a rámec navrhovaného vynálezu je definovaný priloženými nárokmi.

Treba brať do úvahy, že všetky termíny uvádzané v jednotnom čísle berú na seba formu množného čísla, pokial ale nie je výslovne uvedené inak. Tiež pokial nie je výslovne uvedené, technické a vedecké termíny majú svoj obvyklý význam úplne zrejmý každému odborníkovi v súčasnom stave techniky.

Vodné roztoky podľa navrhovaného vynálezu sú fyziologicky akceptovateľné, čo znamená, že môžu byť zavedené do krvného riečišťa pacienta bez toho, aby vyvolali toxickú reakciu.

Tieto roztoky budú mať

PH v rozmedzí od 4 do 10, výhodnejšie od

4,5 do 9 a najvýhodnejšie od 5 do 8,5.

Navrhovaný roztok môže obsahovať rad elektrolytov, vrátane sodných iónov, chloridových iónov, draselných iónov a za určitých okolností aj horečnatých iónov. Koncentrácia sodných iónov sa bude pohybovať v rozmedzí od asi 70 do 160, výhodnejšie od asi 110 do 150 a v niektorých konkrétnych variantoch aj od 130 do 150 mM. Koncentrácia chloridových iónov v roztoku bude v rozmedzí od asi 70 do 170, obvykle však od 80 do 160, výhodnejšie ale od asi 100 do 135 a v niektorých konkrétnych variantoch aj od 110 do 125 mM. Koncentrácia draselných iónov v roztoku bude vo fyziologických koncentráciách a nižších, kde fyziologickou koncentráciou sa mysli od 3,5 do 5, výhodnejšie od 4 do 5 mM a nižšou koncentráciou sa rozumie od 0 do asi 3,5, výhodnejšie od asi 2 do 3 mM, pričom v mnohých konkrétnych variantoch bude množstvo draselných iónov v rozmedzí od 1 do 5, výhodnejšie od 2 do 3 mM. V niektorých konkrétnych variantoch bude množstvo draselných iónov vyššie ako 5 mM a to dokonca vyššie ako

5.5 mM, obvykle však nepresahuje hranicu 5,5 mM. Navrhovaný roztok obsahuje aj vápenaté ióny v koncentráciách z rozsahu od 0,5 do 6,0 mM a vo väčšine prípadov z rozsahu od 0,5 do 4,0 mM, obvykle od 2,0 do 2,5 mM. V niektorých konkrétnych variantoch bude v rozmedzí od 4,0 do 6,0 mM. Navrhované roztoky môžu obsahovať aj ióny horčíka. Pokiaľ sú prítomné, horečnaté ióny sú obsiahnuté v rozmedzí od 0 do 10 mM, výhodne od 0,3 do 3,0 a najvýhodnejšie od 0,3 do 0,45 mM.

V niektorých konkrétnych variantoch budú roztoky podľa navrhovaného vynálezu obsahovať zvýšenú hladinu iónov draslíka aj horčíka. Zvýšenou hladinou sa myslí koncentrácia draselných iónv v rozmedzí od 50 mM do 3,0 M, výhodnejšie od 200 mM do 2,5 M a najvýhodnejšie od 1,0 do

2.5 M a horečnatých iónov v rozmedzí od 40 mM do 1,0 M, výhodnejšie od 0,1 do 0,9 M a najvýhodnejšie od 0,3 do 0,7 M.

Navrhovaný vynález opisuje aj roztoky, ktoré obsahujú zvýšenú hladinu draselných a horečnatých elektrolytov (známe ako supernabité roztoky). Zvýšenou hladinou koncentrácie je myslená koncentrácia draselných iónov v rozmedzí od 50 mM do 3,0 M, výhodnejšie však od 200 mM do

2,5 M a najvýhodnejšie od 1,0 do 2,5 M a horečnatých iónov od 40 mM do 1,0 M, výhodnejšie však od 0,1 do 0,9 M a najvýhodnejšie od 0,3 do 0,7 M. Tieto roztoky potom môžu v niektorých konkrétnych variantoch obsahovať bikarbonát, pričom bikarbonát je prítomný v koncentráciách z rozsahu od 0,1 do 40 mN, výhodnejšie však od 0,5 do 30 mM a najvýhodnejšie od 1 do 10 mM.

Opisovaný roztok obsahuje aj dynamický pufračný systém, pričom termín dynamický pufračný systém sa používa pre jednu alebo viac látok pracujúcich v kombinácii tak, aby udržali pH roztoku v rozmedzí bežnom pre in vivo systémy. Je lepšie ak sú týmito zložkami normálne biologické látky, ktoré túto funkciu plnia aj v in vivo systémoch. Koncept dynamických pufračných systémov spočíva na objave vynálezcov, že látky bez zrejmej pufračnej kapacity v biologickom rozsahu, ako je kyselina mliečna, octová alebo glukánová, ktoré sú v in vivo systéme metabolizované, spolupracujú s ďalšími zložkami roztokov na udržiavaní biologicky prijateľného pH u živočíchov, dokonca aj pri hypotermických teplotách a v podstate bezkrvných podmienkach. Dynamický pufračný systém podľa navrhovaného vynálezu čiastočne závisí od okysličenia a odstraňovania oxidu uhličitého (C0₂) . Dynamický pufračný systém podľa navrhovaného vynálezu nemá, alebo v podstate nemá, schopnosť fungovať ako pufer mimo biologických systémov, t.j. dynamický pufračný systém podľa navrhovaného vynálezu je schopný udržiavať biologické pH in vivo, ale nie v prostredí bez buniek.

Kritickou zložkou dynamických pufračných systémov podľa navrhovaného vynálezu sú karboxylové kyseliny, ich soli a/alebo estery. Karboxylové kyseliny, ich soli a/alebo estery sú látky všeobecného vzorca RCOOX, kde R je alkyl, alkenyl alebo aryl, rozvetvený alebo nevetvený, obsahujúci 1 až 30 atómov uhlíka, ktoré môžu byť substituované a jeden z atómov uhlíka obsahuje reťazec kyseliny mliečnej, glukónovej, citrónovej, pyruvát alebo iné biologické metabolity, a kde X je vodík alebo sodík alebo iný, biologicky kompatibilný iónový substituent, ktorý môže byť asociovaný na pozíciu kyslíka.

Dynamický pufračný systém môže ďalej obsahovať zdroj bikarbonátu, obvykle bikarbonát sodný (NaHCO₃) . Pokiaľ je prítomný, jeho koncentrácia je v rozmedzí od asi 0,1 mM do

Ί mM, výhodne od 0,5 mM do 30 mM a najvýhodnejšie od 1,0 mM do 10,0 mM.

Roztok podlá navrhovaného vynálezu neobsahuje konvenčný biologický pufer. Termínom konvenčný pufer je myslená látka, ktorá v roztoku in vitro udržiava pH na príslušnej hodnote. Termínom konvenčný biologický pufer sa myslí zložka, ktorá v bezbunkovom systéme udržiava pH v biologickom rozsahu 7 až 8. Príkladmi konvenčných biologických pufrov sú N-2-hydroxyetylpiperazin-N'-2hydroxypropansulfónová kyselina (HEPES), 3-(N-morfolino)propansulfónová kyselina (MOPS), 2-((2-hydroxy-l,1bis(hydroxymetyl)etyl)amino)etansulfónová kyselina (TES), 3-(N-tris(hydroxy-metyl)etylamino)-2-hydroxyetyl)-1-piperazinpropansulfónová kyselina (EPPS), tris(hydroxymetyl) aminometán (THAM) a tris(hydroxymetyl)metylaminometán (TRIS). Konvenčné biologické pufry majú pH vo fyziologickom rozsahu a fungujú najefektívnejšie v tejto oblasti. Tieto pufry fungujú nezávisle od normálnych biologických procesov a sú najúčinnejšie v bezbunkových systémoch.

Neprítomnosť konvenčných biologických pufrov v roztoku podľa navrhovaného vynálezu prináša niekoľko podstatných výhod. Napríklad nižšia koncentrácia pufrov zložených z prirodzených biologických zložiek je nevyhnutná pre udržiavanie in vivo pH, oproti konvečným biologickým pufrom. Konvenčné biologické pufry môžu vďaka svojej toxicite spôsobovať niektoré problémy. Absencia biologických pufrov umožňuje aj konečnú tepelnú sterilizáciu roztokov. Všeobecne, roztoky používané v medicíne je vhodné pred aplikáciou pacientom tepelne sterilizovať, tepelne sterilizovaný alebo nakoniec sterilizovaný, ako sú tu používané, opisujú zohriatia roztoku pri zvýšenom tlaku na asi 120 °C počas 15 minút, t.j. pri takom tlaku a teplote a v priebehu takého času, ktorý zaručuje likvidáciu v podstate všetkých

Termíny tepelne proces baktérii a inaktiváciu v podstate všetkých vírusov v roztoku. Tento proces sa normálne uskutočňuje v autokláve a je označovaný ako autoklávovanie. Dôvodom tepelnej sterilizácie je snaha zlikvidovať všetky možné infekčné činidlá prítomné v roztoku.

niektorých infekčných mikroorganizmoch je známe, že sú schopné prežívať pri teplotách do 100 °C. V súčasnom stave techniky je známe, že zohriatie roztoku pri zvýšenom tlaku na 120 °C počas 15 minút je dostatočné pre dosiahnutie sterility.

Roztok bude obsahovať aj onkoticky aktívnu zložku. Onkoticky aktívnu zložku predstavuje molekula, ktorej veľkosť je dostatočná na to, aby zabránila jej stratám z krvného obehu prestupom do intersticiálneho priestoru tkanív organizmu. Onkoticky aktívne zložky ako skupina môžu byť príkladom náhrad za krvnú plazmu. Látky použiteľné ako onkoticky aktívne zložky v roztoku podľa navrhovaného vynálezu môžu byť prirodzené alebo syntetické a ide o polymérne látky s priemernou molekulovou hmotnosťou aspoň 40 000, výhodne aspoň 100 000 a viac, najvýhodnejšie asi 200 000, pričom môžu byť použité aj onkoticky aktívne činidlá s molekulovou hmotnosťou 300 000 a vyššou. Príkladom onkoticky aktívnych zložiek vhodných na použitie v roztoku podľa navrhovaného vynálezu môžu byť proteínové zložky, ako je albumín, napr. ľudský sérový albumín a prepojený alebo vysokomolekulárny hemoglobín, polysacharidy, ako sú polyméry na báze glukánu a podobne, organické polyméry, napr. PVP, PEG atď., a podobne, pričom neantigénne polysacharidy sú vhodnejšie.

Polysacharidy použiteľné ako onkoticky aktívne zložky v roztoku podľa navrhovaného vynálezu sú hydroxyetylové škroby, hydroxymetyl alfa(1-4) alebo (1-6)polyméry, polyméry D-glukózy, napr. dextrány s alfa (1-6) väzbou, cyklodextríny, hydroxypropyl škroby, hydroxyacetyl škroby a podobne.

Hydroxyetylové škroby sú uvedené v niekoľkých konkrétnych variantoch roztoku podía navrhovaného vynálezu. Priemerná molekulová hmotnosť hydroxyetylových škrobov použiteľných v roztoku podľa navrhovaného vynálezu by mala byť v rozmedzí od 10 000 d do 1 000 000 d alebo vyššia, pričom ich molekulová hmotnosť sa obvykle pohybuje v rozmedzí od 40 000 d do 1 000 000 d, výhodne od 100 000 d do 900 000 d a najvýhodnejšie od asi 200 000 d do 800 000 d.

Najvhodnejšie sú prípravky, ktoré majú molekulovú hmotnosť onkoticky aktívnej zložky vo forme hydroxyetylového škrobu v rozmedzí od 50 000 d do 1 000 000 d, výhodne od 100 000 d do 900 000 d a najvýhodnejšie od asi 200 000 d do 800 000 d. Stupeň substitúcie by mal byť v rozmedzí od 4 do 10, ale v niektorých konkrétnych variantoch môže byť 7 až 10 a inokedy 4 až 5 a niekedy aj 6 až 7. Jedna trieda preferovaných roztokov teda obsahuje hydroxyetylové škroby so 6 až 7 hydroxyetylovými skupinami na každých 10 glukózových jednotiek. Iná trieda preferovaných roztokov potom teda bude obsahovať hydroxyetylové škroby so 4 až 5 hydroxyetylovými skupinami na každých 10 glukózových jednotiek a ešte iná trieda preferovaných roztokov bude obsahovať hydroxyetylové škroby so 7 až 8 hydroxyetylovými skupinami na každých 10 glukózových jednotiek.

V podstate najvhodnejšou onkoticky aktívnou zložkou je Hetastarch (McGaw, Inc.), umelý koloidný roztok odvodený od voskového škrobu, zložený v podstate úplne z amylopektínu s hydroxyetylovými éterovými skupinami, ktoré sú pripojené ku glukózovým jednotkám spojeným alfa (1-4) väzbou a s molárnou substitúciou okolo 0,7 hydroxyetylových skupín na každých na glukózovú jednotku. Koloidné vlastnosti 6 % roztoku (hmotnostné percentá) Hetastarchu zhruba odpovedajú ľudskému sérovému albumínu.

Ďalšou vhodnou onkoticky aktívnou zložkou je Pentastarch s molárnou substitúciou asi 0,45 hydroxyetylových skupín na glukózovú jednotku a priemernou molekulárnou hmotnosťou (merané pomocou HPSEC techniky, ako opisuje PDR 1996) v rozmedzí od asi 150 000 do 350 000 d, s 80 % medzi 10 000 a 2 000 000 d.

Ďalšou vhodnou onkoticky aktívnou zložkou je Hexastarch s molárnou substitúciou asi 0,64 hydroxyetylových skupín na glukózovú jednotku a priemernou molekulárnou hmotnosťou asi 220 000 d.

V niektorých konkrétnych variantoch môžu byť hydroxyetylové škroby vybrané z frakcie pôvodných hydroxyetylových škrobov ako frakcia s konkrétnou veľkosťou, pričom všeobecne touto frakciou bude aspoň jedna z frakcií s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 1 000 000 daltonov alebo frakcia s priemernou molekulovou hmotnosťou vyššou ako 50 000 daltonov. Na prípravu týchto frakcií môžu byť použité konvenčné frakcionovacie postupy.

Koncentrácia onkoticky aktívneho činidla v roztoku je dostatočná na udržanie (pokiaľ je uvažovaná zároveň s chloridom sodným, vápenatým a horečnatým, organickými iónmi z organických solí sodíka a hexózovými cukrami diskutovanými vyššie) koloidného osmotického tlaku v hodnotách blízkych normálnemu ľudskému séru, približne 28 mm Hg. Všeobecne množstvo onkoticky aktívnej zložky v roztoku bude v rozmedzí od 0,5 do 30, obvykle od asi 1 do 25 a najskôr od 2 do 8 %. Pokiaľ je onkoticky aktívnou zložkou hydroxyetyl škrob, množstvo prítomné v roztoku bude v rozmedzí od 1 do 30, častejšie od 2 do 15 a najskôr od 4 do 8 %.

V jednom variante navrhovaného vynálezu roztok obsahuje dve alebo viac onkoticky aktívnych zložiek s rôznou rýchlosťou vymiznutia z krvného obehu. Roztok podľa navrhovaného vynálezu, ktorý obsahuje dve alebo viac onkoticky aktívnych zložiek s rôznou rýchlosťou vymiznutia z krvného obehu, má ďalšie výhody pri opätovnom vytvorení krvného onkotického tlaku u hypovolemických pacientov v predĺženom časovom intervale, zatiaľ čo sa rozbieha produkcia proteínov krvnej plazmy u poraneného subjektu. Syntetické onkoticky aktívne zložky s dlhým polčasom vymiznutia sú napríklad Hetastarch (molekulová hmotnosť 300 000 až 1 000 000) a Dextran 70, ktoré majú intravaskulárnu perzistenciu približne 6 hodín (Mesmer /1989/ Bodensee Symposium on Microcirculation (Hammersen & Messmer, eds.) Karger, N.Y. str. 59). Syntetické onkoticky aktívne zložky s relatívne krátkym polčasom vymiznutia sú nízko- a stredne- molekulárne frakcie Hetastarchu (priemerná molekulová hmotnosť 40 000 až 200 000) a Dextran 40 s intravaskulárnou perzistenciou približne 2 až 3 hodiny (Mesmer /1989/).

Roztok podľa navrhovaného vynálezu môže obsahovať aj ďalšie voliteľné zložky, ktoré môžu byť do roztoku pridané tak, aby bol vhodný na konkrétne použitie. Jednou z týchto obvykle prítomných zložiek je cukor. Týmto cukrom je obvykle hexóza, ako je glukóza, fruktóza a galaktóza, pričom najvýhodnejšia je glukóza. V niektorých konkrétnych variantoch navrhovaného vynálezu sú použité nutritívne hexózy vo forme zmesi cukrov. Cukry sú obvykle, nie však nevyhnutne, prítomné v roztoku vo fyziologickom množstve. Termínom fyziologické množstvo alebo fyziologická hladina je myslená koncentrácia cukru v rozmedzí od 2 mM do 50 mM, pričom najvýhodnejšia koncentrácia glukózy je 5 mM. Niekedy je potrebné zvýšiť koncentráciu hexóz tak, aby sa znížila retencia kvapalín v tkanivách subjektu. Koncentrácia hexóz potom môže byť zvýšená na 50 mM a viac, väčšinou však nie na viac ako 60 mM, lepšie nie viac ako 55 mM, ak je nevyhnutné predísť u liečeného subjektu edému, okrem situácií, kedy sú použité ako kryoprotektívne činidlo.

Roztok podlá navrhovaného vynálezu môže obsahovať aj zrážadlá, ktoré sú schopné urýchliť alebo iniciovať vytváranie krvnej zrazeniny. Najvýhodnejšie zrážadlá na použitie v roztoku podlá navrhovaného vynálezu sú vitamín

K, faktory I, II,

V, VII, VIII, VIIIC, IX,

X, XI, XII,

XIII, proteín C, von Willebrandov faktor,

Fitzgeraldov faktor,

Fletcherov faktor a inhibitory proteinázy.

Koncentrácia zrážadiel je stanovená odborníkom v súčasnom stave techniky v závislosti od špecifických požiadaviek liečby. Napríklad pri použití vitamínu K treba pacientovi podať 5 až 10 mg.

Roztok podlá navrhovaného vynálezu môže obsahovať aj látku prenášajúcu kyslík a to v takej nízkej koncentrácii, aby nebola pre pacienta toxická. Látka schopná viazať a prenášať kyslík by mala prítomná v takom dostatočnom množstve pre transport kyslíka do tkanív liečeného subjektu, aby výsledkom nebola toxická reakcia. Termín dostatočné množstvo látky viažucej kyslík je množstvo umožňujúce ponechať subjekt bez následných porúch v cirkulácii a fyziológii tak, aby prežil a zotavil sa z traumy, choroby alebo poranenia. U normálnych ľudí a pri normálnej teplote tela je to aspoň 5 až 6 ml O₂/100 ml intravaskulárnej tekutiny. Kyslík viažucou látkou môže byť hemoglobín extrahovaný zo substrátu ľudského alebo zvieracieho pôvodu, rekombinantný hemoglobín, hemokyanín, chlorokruonín a hemerytrín a ďalšie prirodzene sa vyskytujúce respiračné pigmenty, extrahované z prírodných substrátov alebo pripravované pomocou rekombinantnej DNA alebo in vitro technikou. Tieto látky môžu byť modifikované mnohými spôsobmi známymi v súčasnom stave techniky, vrátane chemického zosieťovania alebo kovalentného naviazania na polyetylénglykol. Pokiaľ je touto kyslík viažucou látkou hemoglobín, je vhodné aby jeho koncentrácia bola v rozmedzí od 20 do 200 g/1.

Roztok podľa navrhovaného vynálezu môže obsahovať aj jedno alebo viac kryoprotektivnych činidiel, pričom pod termínom kryoprotektívne činidlo je myslená akákoľvek látka, ktorá chráni štrukturálnu integritu tkaniva v hypotermických podmienkach, napr. pri teplote pod nulou, kde v niektorých konkrétnych variantoch je kryoprotektívnym činidlom látka, ktorá aspoň čiastočne narúša formovanie molekúl vody do kryštálov tak, že teplota mrazu takej zmesi, ktorá príslušné činidlo obsahuje, je nižšia ako teplota mrazu zmesi, ktorá toto činidlo neobsahuje. Kryoprotektívnym činidlom môžu byť alkoholy, najmä nizkomolekulárne alifatické alkoholy, obvykle Ci až C₆ alkoholy, výhodne Ci až C4 alkoholy, ako je metanol, etanol a podobne, polyoly, vrátane lineárnych, rozvetvených a cyklických polyolov, alifatických polyolov, polyolov, ako sú cukry pričom najvýhodnejšími etyléndiol, propándiol, glycerol a pod., cukry, arabinózy, xylózy, výhodne nízkomolekulárnych vrátane diolov, triolov a ďalších (detailnejšie sú opísané polyolmi sú dioly, butándiol, trioly, ako vrátane erytrózy, treózy, ribózy, lyxózy, alózy, atrózy, glukózy, manózy, vyššie), konkrétne je napr.

gulózy, idózy, galaktózy, talózy, erytrulózy, ribulózy, xylulózy, psicózy, disacharidov, najvýhodnej šia dimetylamín, formamid, obsahujúce silikón, ako sú silány a podobne fluorokarbónu a fruktózy, sacharózy, glukóza, napr.

je trimetylaminoxid sorbózy, laktózy, ďalšie (TMAO), dimetylformamid a podobne, ako ale je močovina, látky tagatózy maltózy, látky, DMSO, klatráty, , látky na báze ich deriváty. Kryoprotektívne činidlo môže byť premenené na roztok zvýšeným tlakom a/alebo pomocou vhodnej povrchovo aktívnej látky, ktorej voľba závisí od odborníka v súčasnom stave techniky. Tieto činidlá sú obvykle prítomné v množstve dostatočnom pre dosiahnutie požadovaného kryoprotektívneho efektu, pričom konkrétne množstvo patričného činidla závisí od použitého činidla.

Pokiaľ ide o polyol, napr. diol, všeobecne sa dá povedať, že by mal byť prítomný v množstve od 0,2 M do 1,0 M, alebo od 0 do 30 %. U propándiolu ide o rozsah od asi 0,2 M do 0,6 M, najvýhodnejšia koncentrácia propándiolu je asi 0,4 M. 1,2 propándiol je najvýhodnejší v prípadoch, ak je potrebné použiť nízke teploty na ochranu orgánu darcu a pacienta, možno však použiť aj 1,3 propándiol. Konečná koncentrácia TMAO v roztoku bude v rozmedzí od 0,2 M do 7,0 M. Pokiaľ je použitý glycerol, bude v koncentráciách od 0 do 40 %, výhodne od 5 do 30 % a najvýhodnejšie v koncentráciách od 5 do 20 %. Ak je použité DMSO, bude v koncentrácii od 0 do 40 %, výhodne od 5 do 30 % a najvýhodnejšie v koncentráciách od 5 do 20 %. Pri použití cukru (väčšinou glukózy) bude koncentrácia v rozmedzí 0,6 M až 1,4 M, ale najvýhodnejšia koncentrácia pre niektoré varianty je 1,0 M. V jednej skupine preferovaných variantov bude roztok podľa navrhovaného vynálezu obsahovať aspoň dve zložky z nasledujúcich, horečnaté ióny, cukor, ako je napr. glukóza a stredne až vysoko molekulárny hydroxyetylový škrob.

Varianty roztoku použiteľné podľa navrhovaného vynálezu:

Roztok A

Hetastarch s vysokou molekulovou

hmotnosťou (priemer asi 350 000 až 900 000)	1	až	10 %
Ca++	1	až	6 mM
K++	1	až	5 mM
Mg++	0	až	10 mM
kyselina mliečna	1	až	40 mM
glukóza	0	až	50 mM

Roztok B

Hetastarch s vysokou molekulovou

hmotnosťou (priemer asi 350 000 až 900 000)	1	až	10 %
Ca++	1	až	6 mM
K++	1	až	5 mM
Mg++	0	až	10 mM
kyselina mliečna	1	až	40 mM

glukóza	0 až	50 mM
bikarbonát	5 až	10 mM
Kryoprotektívne roztoky

Roztok I
Hetastarch s vysokou molekulovou
hmotnosťou (priemer asi 350 000 až	900	000)	1	až	10 %
Ca++			1	až	6 mM
K++			1	až	5 mM
Mg+*			0	až	10 mM
kyselina mliečna			1	až	40 mM
glukóza			0	až	50 mM
bikarbonát			5	až	10 mM
glycerol			10	i až	20 %
Roztok II
Hetastarch s vysokou molekulovou
hmotnosťou (priemer asi 350 000 až	900	000)	1	až	10 %
Ca++			1	až	6 mM
K++			1	až	5 mM
Mg++			0	až	10 mM
kyselina mliečna			1	až	40 mM
bikarbonát			5	až	10 mM
glycerol			1C	i až	20 %
Roztok III
Hetastarch s vysokou molekulovou
hmotnosťou (priemer asi 350 000 až	900	000)	1	až	10 %
Ca++			1	až	6 mM
K++			1	až	5 mM
Mg++			0	až	10 mM
kyselina mliečna			1	až	40 mM
glukóza			0	až	50 mM
bikarbonát			5	až	10 mM
glycerol			10	až	20 %
DMSO			5	' až	15 %

Pri príprave roztokov podľa navrhovaného vynálezu môžu byť použité rôzne náhrady, môžu byť zmiešané naraz alebo pridávané postupne, ako sa zdá najvýhodnejšie. Vzniknutý výsledný roztok môže byť nakoniec tepelne sterilizovaný, ako je opísané vyššie. Ako je tiež uvedené vyššie, roztok môže obsahovať aj látky, ktoré sa nedajú tepelne sterilizovať, napríklad zdroj bikarbonátu, pričom bikarbonát je súčasťou dynamického pufračného systému. V tomto prípade bude bikarbonát sodný pridaný ako sterilný roztok do autoklávovanému roztoku. Takisto, ak je potrebné pridať krvné zrážadlo alebo látku prenášajúcu kyslík, sú tieto látky do autoklávovanej základnej zmesi pridávané vo forme sterilného roztoku.

Pre ďalší opis vynálezu je roztok podľa navrhovaného vynálezu uvažovaný vždy vo forme vodného roztoku. Pre nasledujúci opis vynálezu je predpoklad, že každý odborník v súčasnom stave techniky bude schopný použiť túto zmes v suchom stave a stanoviť množstvo chloridu sodného a ostatných organických sodných solí tak, aby bolo dostatočné pre rozpustenie suchej formy vo fyziologickom roztoku, ktorý podľa navrhovaného vynálezu môže byť použiteľným rozpúšťadlom.

Roztok podľa navrhovaného vynálezu je použiteľný v mnohých rôznych aplikáciách. Opisovaný roztok má uplatnenie v situáciách, kedy je potrebné nahradiť aspoň časť pacientovej telovej tekutiny (alebo tkaniva) roztokom.

Aplikáciou môžu byť chirurgický zákrok, vrátane procesov vyžadujúcich zníženie teploty tela pacienta na hodnotu nižšiu ako normálnu, náhrada za krv, udržanie telovej integrity po smrti, ako je ochrana tkanív a orgánov chladom, čiastočná chemoperfúzia a podobne.

Roztok môže byť použitý ako cirkulačný roztok v spojení s kyslíkom alebo hyperbarickým kyslíkom pri normálnej teplote tela alebo počas procesov, kedy teplota pacientovho tela je redukovaná značne pod normálnu teplotu. Napríklad v priebehu chirurgických zákrokov a transplantácií orgánov z mrtvých tiel darcov pri nízkych teplotách môže byť telová tekutina dočasne nahradená podchladeným roztokom podľa navrhovaného vynálezu, pričom tento roztok bude použitý len počas zákroku, aby orgány príjemcu boli ochránené pred poškodením.

Roztok podľa navrhovaného vynálezu môže byť aplikovaný intravenózne alebo intraarteriárne do eutermného subjektu, ktorý sa nachádza pretlaku kyslíka až do 100 %, alebo subjektu podstupujúcemu procesy, počas ktorých je jeho teplota tela značne znížená pod hodnotu jeho bežnej teploty tela, alebo pokiaľ nie je použitý hyperbarický kyslík. Hneď ako je roztok aplikovaný do krvného obehu príjemcu, môžu byť ďalšie látky, napríklad kardioplegiká, pridané priamo do obehového systému subjektu, priamo do myokardu subjektu alebo postupne pridávané s roztokom podľa navrhovaného vynálezu. Tieto látky sú pridávané, aby sa dosiahli požadované fyziologické efekty, ako je udržanie správnej kontraktility srdca, zastavenie fibrilácie srdca alebo kompletná inhibícia kontraktílnej aktivity myokardu alebo srdcového svalu.

Kardioplegiká sú látky, ktoré spôsobujú zastavenie myokardiálnej kontrakcie a pomocou anestetík, ako je lidokain, prokain a nonokain a monovalentných iónov, ako je draslík v príslušných koncentráciách, možno udržať inhibíciu kontrakcií. Koncentrácia draselných iónov dostatočných pre udržanie tohto efektu obvykle nepresahuje 15 mM a horčík môže byť prítomný v koncentráciách nepresahujúcich 0,5 mM.

Počas oživovania subjektu (po perióde subnormálnej teploty alebo kryogénneho zákroku pomocou roztoku podľa navrhovaného vynálezu pre ošetrenie subjektu) môže byť subjektu zavedená infúzia zmesi roztoku podľa navrhovaného vynálezu spolu s už predtým získanou krvou od liečeného subjektu alebo pochádzajúcou od darcu krvi.

Počas zohrievaní subjektu sa mu zavádza celá krv až dokiaľ sa sa nedosiahne normálny hematokryt, obvykle prekračujúci hematokryty o asi 20 %. Po dosiahnutí prijateľného hematokrytu je perfúzia prerušená a subjekt je po dokončení chirurgických zákrokov oživený pomocou štandardných postupov.

Všeobecne sú roztoky podľa navrhovaného vynálezu aplikované pomocou intravenóznej infúzie (pokiaľ je subjekt udržiavaný pri normálnej teplote), podchladenému subjektu sa roztok pumpuje do tela pomocou cirkulačného zariadenia, ako je centrifugačná pumpa, valcová pumpa, peristaltická pumpa alebo iné známe a dostupné cirkulačné zariadenia.

Roztok môže byť použitý mnohými rôznymi spôsobmi a pri rôznych chirurgických zákrokoch. Môže sa použiť v jemnej neurochirurgii, kde dobre viditeľné miesto chirurgického zákroku je podmienkou a redukcia aktivity centrálneho nervového systému je nevyhnutná a udržiavaná počas zákroku na pacientovi, ktorého teplota telového jadra a/alebo cerebrálna teplota boli podstatne znížené.

Roztok môže byť použitý pri udržiavaní subjektu (ktorý má značne znížený objem krvi, napr. 20 % až 98 % jeho krvi) pri normálnych teplotách tela v pretlakovom prostredí, pri zvýšenom obsahu kyslíka nad normálnu atmosférickú hodnotu až do 10 % kyslíka. Objekt je udržiavaný v atmosfére bohatej na kyslík buď nepretržite alebo periodicky, dokial nie je vytvorené dostatočné množstvo krvných komponentov pre to, aby subjekt prežil pri atmosférickom tlaku a normálnej koncentrácii kyslíka. Roztok podľa navrhovaného vynálezu môže byť použitý aj na udržiavanie subjektu pri zníženej teplote tela a redukovanej miere metabolizmu po vážnom smrteľnom zranení, dokial nebude možné uskutočniť príslúšné liečebné alebo chirurgické zákroky. Ďalej môže byť tento roztok použitý u pacientov so vzácnou krvnou skupinou alebo tkanivovým znakom, kým nebude nájdený vhodný darca a krv alebo orgán budú môcť byť nahradené.

Prekvapivo bolo objavené, že je možné nahradiť v podstate všetku krv z krvného obehu cicavcov roztokom podlá navrhovaného vynálezu a udržiavať taký subjekt pri živote bez opätovného zavedenia krvi do jeho obehového systému. V podstate všetka krv cicavčieho subjektu bola nahradená, ak hematokryt subjektu klesol pod 10 %.

Hematokryt môže byť nižší ako 10 %, pokiaľ je subjektu kyslík dodávaný umelo, alebo podstatne nižší ako 10 % v hyperbarickej kyslíkovej komore. Roztok podľa navrhovaného vynálezu môže byť samozrejme použitý aj na udržiavanie pacienta s hematokrytom prekračujúcim 10 %.

Proces nahradenia v podstate všetkej krvi z pacienta môže prebiehať pri jeho štandardnej teplote tela. Ďalej sa tento proces môže uskutočňovať pri postupnom podchladzovani pacienta a redukcii jeho telesnej teploty pod normálnu hodnotu. Podchladzovanie sa môže uskutočňovať napríklad ponorením subjektu do ľadového vodného kúpeľa, do slanej ľadovej drviny alebo pomocou chladiacej prikrývky. Subjekt môže byť ďalej podchladzovaný ochladením roztoku podľa navrhovaného vynálezu pred jeho zavedením do krvného obehu pacienta.

Pri procese nahradenia v podstate celej krvi z krvného obehu cicavčieho subjektu podľa navrhovaného vynálezu je vhodné, aby subjekt bol podchladzovaný pri zavádzaní roztoku do krvného obehu, s použitím arteriálneho katétra, ktorý zavádza roztok podľa navrhovaného vynálezu do krvného obehu pacienta a venózneho katétra, ktorým odchádza krv a perfuzát pacienta. V podstate možno týmto spôsobom odobrať celú krv, čo môže byť stanovené hematokrytom kvapaliny vytekajúcej z venózneho katétra. Hneď ako je všetka krv pacienta odstránená, perfúzia môže byť zastavená. Proces nahradenia v podstate všetkej krvi z krvného obehu cicavčieho subjektu môže prebiehať pri hyperbarickom O₂. Subjekt je umiestnený v hyperbarickej komore natlakovanej kyslíkom s koncentráciami vyššími ako 20 %, výhodnejšie 100 %. Tlak v hyperbarickej komore je väčšinu času udržiavaný v rozmedzí od 0,5 poundu na štvorcový inch nad normálny atmasférický tlak do asi dvojnásobku štandardného atmosférického tlaku. V jednom konkrétnom variante prebieha procedúra na subjekte v hyperbarickej komore pri zvýšenom tlaku od asi 0,07 do 2,0 atmosfér nad normálny atmosférický tlak (0,5 až 30 pound na štvorcový inch /psi/) v 100 % kyslíkovej atmosfére. Ak je to potrebné, tlak v hyperbarickej komore môže byť počas zatvárania rany znížený na normálnu hodnotu. Subjekt je potom ďalej držaný v hyperbarickej komore pri vysokých koncentráciách kyslíka. Tlak je postupne znižovaný na nižšie hodnoty, ale stále je hyperbarický. Výhodné je udržiavať tlak od 10 psi do 5 psi niekoľko hodín až dní. Potom je tlak opäť postupne znížený pod 5 psi, výhodnejšie pod 0,5 psi a na tejto hodnote je udržiavaný dlhší čas, zhruba niekoľko dní.

Roztok môže byť použitý aj na udržiavanie fyziologickej integrity orgánu darcu po mozgovej smrti. Subjekt je podchladený, jeho krv je odstránená a nahradená cirkulujúcou zmesou, ktorá má teplotu nižšiu ako 37 °C alebo podchladeným roztokom podľa navrhovaného vynálezu. Vďaka použitiu tohto roztoku je tak minimalizovaná ischémia živých orgánov. Pomocou udržiavania cirkulujúceho podchladeného roztoku podľa navrhovaného vynálezu v obehovom systéme subjektu pri zníženej teplote a pri alebo bez umiestnenia subjektu do hyperbarickej kyslíkovej komory, môžu byť živé orgány prechovávané pomerne dlhý čas a tým je maximalizované množstvo orgánov, ktoré môžu byť efektívne použité na transplantáciu potencionálnym príjemcom.

V inom variante navrhovaného vynálezu sa zistilo, že pri použití niektorých prísad, ako je propándiol a glukóza s vysokými koncentráciami, možno znížiť teplotu darcovských orgánov, dokonca aj srdce darcu, pod teplotu mrazu vody (0 °C) a udržiavať ich v použiteľnom stave, t.j. schopné pracovať a udržiavať koordinovanú kontraktilitu. Navyše pri použití roztokov podľa navrhovaného vynálezu s týmito prísadami je možné redukovať teplotu tela kompletného cicavčieho subjektu pod teplotu mrazu vody (0 ’C) a prebrať ho zo zmrazeného stavu tak, že je schopný koordinovať srdcové kontrakcie, respiráciu a dokonca vedomé reakcie. U ostatných orgánov sa predpokladá, že si udržia vysoký stupeň biologickej integrity, t.j. zostanú v životaschopnom stave.

Nasledujúce príklady sú uvádzané len na ilustráciu a nemôžu byť brané ako obmedzenie navrhovaného vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady sú uvádzané pre odborníkov v súčasnom stave techniky s kompletnými závermi a opismi ako zaistiť syntézu roztoku podľa navrhovaného vynálezu a nemôžu byť brané ako obmedzenie navrhovaného vynálezu. Pozornosť treba venovať presnosti použitých hodnôt (napr. množstvu, teplote, atď.), ale určitá hodnota experimentálnej chyby a odchýlky je samozrejmá. Pokiaľ nie je uvedené inak, časti sú myslené ako hmotnostné podiely, molekulová hmotnosť je priemerná molekulová hmotnosť, teplota je uvádzaná v °C a tlak je aspoň približne štandardný atmosférický.

Príklad 1

Roztok podľa navrhovaného vynálezu

A. Prostriedok s roztokom L

Prostriedok s roztokom L sa skladá z Na⁺ 143,0 mM, Ca⁺⁺

2,5 mM, Mg⁺⁺ 0,45 mM, K⁺⁺ 3,0 mM, kyseliny mliečnej 28,0 mM a glukózy 5,0 mM. Tento roztok sa prefiltruje, aby sa odstránil nerozpustný materiál, prenesie sa do autoklávovateľných nádob a 15 minút sa tepelne sterilizuje pri teplote 120 ’C.

B. Prostriedok HL (BioTime Hextend™ - laktát)

Ide o prostriedok s roztokom L s prídavkom 60 g/1 vysokomolekulárneho Hetastarchu.

C. Prostriedok HLB (BioTime Hextend™ -laktát-bikarbonát)

Ide o prostriedok s roztokom HL s prídavkom 5 ml/1 IM roztoku NaHCCb.

D. Prostriedok HL-DL (BioTime Hetadex™ - laktát)

Ide o prostriedok s roztokom HL, kde namiesto 6 %

Hetastarchu je použitý Dextran 40.

E. Prostriedok AL (BioTime Albextend™)

Ide o prostriedok s roztokom L s prídavkom 50 g/1 albumínu. Prostriedok označovaný ABL je rovnaký ako prostriedok AL s prídavkom 5 ml/1 IM roztoku NaHCO₃.

F. Prostriedok HL-Heme

Ide o prostriedok s roztokom HL s prídavkom 20 až 200 g/1 hemoglobínu.

G. Prostriedok L-Heme

Ide o prostriedok s roztokom L s prídavkom 20 až 200 g/1 hemoglobínu.

Príklad 2

Náhrada krvi s použitím roztoku HL-DL

Samica laboratórneho potkana s hmotnosťou 240 g bola uspaná i.m. injekciou obsahujúcou zmes ketamínu, xylazínu a acepromazínu. Zviera bolo umiestnené na chirurgický stôl a jeho pravá femurálna artéria a žila boli kanylované. Zviera sa izovolemicky perfúzovalo s 10 ml roztoku HL-DL, až kým jeho hematokryt nedosiahol 17,2 %. Kanyla sa odstránila, cievy sa zošili a rana sa uzavrela. Zviera znášalo perfúziu velmi dobre, bolo úplne aktívne a 3 dni po zákroku normálne žralo. Zviera sa celkom zotavilo a v súčasnosti je živé a zdravé.

Príklad 3

Oživenie psa po náhrade krvi v ľadovom kúpeli

Samec psa s hmotnosťou 26,8 kg sa uspal injekciou nembutalu a potom sa intuboval. Bol prenesený do operačného sálu, ventilovaný a katetrizovaný venóznym, Foleyovým, arteriálnym a Swan-Ganzovým katétrom a po i.v. injekcii heparínu boli jeho pravá femurálna artéria a žila kanylované. Bola mu napojená ezofageálna trubica a bol mu podaný antacid. Teplotné senzory boli umiestnené do pažeráka a do análneho otvoru. S použitím i.v. injekcie bol podaný metylprednizol. Po zabalení zvieraťa do chladiacej prikrývky sa začalo s podchladzovaním. Kanyly zvieraťa boli pripojené na bypasový okruh, ktorý sa skladal z vortexovej krvnej pumpy a okysličovača so zabudovaným tepelným výmenníkom, sekundárnym prípojkou pre zavedenie Odobrala sa všetka krv in-line tepelným výmenníkom a a krvných substituentov. ml) a chránila sa pred nahradená HLB roztokom.

krvi (225 prehriatím. Krv bola rýchlo

Bypasový okruh obsahujúci 1,05 smerom do zvieraťa a začalo ochladzovanie roztoku

Vo zvierati bolo postupne vymenených

HLB bol otvorený tepelného jadra. 33 1 roztoku HLB.

Hneď ako bola v podstate všetka krv odstránená, bolo do zvieraťa vpravené dostatočné množstvo krvného 2 M KC1, aby boli zastavené srdcové kontrakcie. Po dosiahnutí teploty mrazu klesol hematokryt pod 1 %. Teplota pažeráka zvieraťa bola 4 hodiny a 5 minút nižšia ako 10 °C, s minimálnym kolísaním teploty o 0,7 °C.

Po hypotermickej perióde bolo zviera zohriate. Hneď ako teplota tela prekročila 10 °C, začala byť zvieraťu vracaná do krvného obehu jeho predtým odobraná krv, zároveň s krvou darcu. Hematokryt stúpal so stúpajúcou teplotou. Zvieraťu bol podaný lidokain a bikarbonát, srdce defibrilovalo a začalo dýchanie. Hneď ako bol tlak krvi a teplota tela na normálnej hodnote, zviera bolo odpojené od by-passu a bol mu podaný protamin a Lasix. Niekolko hodín po zohriatí bolo zviera zdravé a komunikatívne. V súčasnosti je už zviera úplne zdravé.

Príklad 4

Oživenie paviána po náhrade krvi v ľadovom kúpeli

Samec paviána druhu Papio annubis s hmotnosťou 24 kg bol anestetizovaný najprv ketamínom a acepromazínom i.m. a potom pentotalom. Potom bol imobilizovaný pancuronium bromidom. Zviera bolo intubované, ventilované a katetrizované venóznym, Foleyovým a arteriálnym katétrom. Pavián bol zabalený do chladiacej prikrývky a začalo sa povrchové podchladzovanie. Po i.v. injekcii heparínu boli jeho pravá femurálna artéria a bilaterálna femurálna žila kanylované. Teplotné senzory mu boli umiestnené do pažeráka, análneho otvoru a do mozgu. Zviera bolo napojené na EKG, somatosenzoricky vyvolané potenciály (SSEPs) a EEG. Intravenózne mu bol podaný dexometazón.

Kanyly boli napojené na bypasový okruh, ktorý sa skladal z vortexovej krvnej pumpy a okysličovača so zabudovaným tepelným výmenníkom a prípojkou pre rýchle zavedenie krvi a krvných substituentov. Odobrala sa všetka krv (300 ml) a chránila sa pred prehriatím. Krv bola rýchlo nahradená 300 ml fyziologického roztoku. Bypasový okruh obsahujúci 2,0 1 Plasmalytu (komerčne dostupný roztok elektrolytu) bol otvorený smerom do zvieraťa a začalo ochladzovanie tepelného jadra.

Hneď ako teplota hlbokého pažeráka klesla pod 13 °C, pridali sa do obehu ďalšie 2 litre Plasmalytu obsahujúce

12,5 g manitolu, ktoré tak nahradili Plasmalyt prebiehajúci systémom predtým. Táto zriedená krv bola skladovaná pre neskoršie zohrievanie. Okamžite potom bolo pridaných 10 1 HLB, ktorý kompletne nahrádza Plasmalyt. Hneď ako sa dosiahla nulová teplota, hematokryt bol nižší ako 1 %. Hneď ako teplota mozgu zvieraťa klesla na 3,4 ’C a teplota hlbokého pažeráka klesla na 2,8 °C, krvná pumpa bola zastavená a zviera bolo 45 minút udržiavané v podmienkach cirkulačnej zástavy. Po uplynutí tohto času bola cirkulácia obnovená.

Po hypotermickej perióde bolo cez obehový systém zvieraťa prepláchnutých 4,2 1 roztoku HLB a žilný efluent bol zachovaný a zviera bolo postupne zohrievané. Hneď ako teplota tela dosiahla 15 °C, do krvného obehu boli pridané 2 litre Plasmalytu, ktoré nahradili roztok HLB. K Plasmalytu bol do krvného obehu pridaný manitol (6,25 g/1). Potom začal byť vracaný späť do krvného obehu predtým vypláchnutý roztok, ako aj krv pochádzajúca od darcu a čerstvo rozmrazená plazma. Hematokryt zvieraťa stúpal so stúpajúcou teplotou. Hneď po dosiahnutí normálnej rektálnej a pažerákovej teploty srdce fibriluje počas zohrievania a začína normálne tĺcť. Zviera začalo aj normálne dýchať. Hneď po dosiahnutí normálneho krvného tlaku a teploty tela zviera dostalo injekciu protamínu i.v., bolo odpojené od by-passu, kanyly a katétre boli odstránené a rana bola zašitá.

Teplota hlbokého pažeráka pokusného zvieraťa bola 3 hodiny nižšia ako 15 °C, nižšia ako 10 °C počas 2 hodín a 17 minút bola s najnižšou nameranou teplotou 2,8 °C (tabuľka 3). Nasledujúce ráno bolo zviera schopné sedieť vo svojej klietke vzpriamene, zdvíhať a jesť kúsky banánu a piť jablčný džús. Bolo živé a zdravé počas jedného týždňa po experimente, kedy bolo zabité a podrobne histologický vyšetrené.

Príklad 5 Náhrada krvi systémom dvoch roztokov u pacienta podstupujúceho chirurgický zákrok - kardiopulmonárny by-pass

Pacient bol uspaný, kanylovaný a pripravený na kardiopulmonálny by-pass. Potom ho zabalili do chladiacej deky a jeho povrch sa ochladil na 30 °C. Potom bol pacient pripojený na by-pass s okruhom naplneným roztokom ABL. Telo pacienta bolo podchladzované, dokiaľ teplota jeho hlbokého pažeráka nedosiahla 20 °C. Krv sa spolu s roztokom ABL odobrala a ihneď nahradila roztokom HBL. Potom bolo telo ochladzované a udržiavané v stabilných podmienkach, pokiaľ sa na srdci alebo mozgu uskutočňovali chirurgické zákroky. Po nich sa pacient začal zohrievať a roztok HBL sa postupne nahradil roztokom ABL a následne zmesou roztoku ABL a jeho predtým odobranej krvi. Nakoniec mu bolo podaných 5 až 10 mg vitamínu K.

Jednou z výhod použitia roztoku ABL pre pripojenie bypassu a zber krvi je to, že pacientovi je počas zohrievania vrátená jeho vlastná zriedená krv a albumín funguje ako prirodzená zložka, ktorá udržiava onkotickú rovnováhu bez potreby stimulovať pacientove vlastné mechanizmy na syntézu albumínu.

Príklad 6

Pohotovostná náhrada krvi u hemorrhagického subjektu pomocou roztoku HL-Heme

Pacientovi trpiacemu stratou krvi sa zavedie infúzia s roztokom HL, ktorý obsahuje 5 mg/1 zrážacieho faktoru vitamínu K a 30 g/1 hemoglobínu ako látky prenášajúcej kyslík. Krvný tlak pacienta sa stabilizuje a zaistí sa normálny prísun kyslíka do pacientových tkanív. Telo pacienta postupne odbúra Hetastarch, ako bude nahrádzaný vlastným syntetizovaným albumínom a tak zostane onkotický potenciál počas liečenia stabilizovaný. Použitie roztoku obsahujúceho zrážadlá a zložky prenášajúce kyslík môže úplne nahradiť použitie darovanej krvi.

Príklad 7

Použitie krvných zrážadiel u cicavcov so zriedenou krvou

Šesť mladých samíc potkanov (227-262) bolo uspaných, ich pravé femurálne artérie a žily boli kanylované a 40 až 60 % ich krvi bolo nahradených roztokom HL. Hneď ako bol hematokryt znížený na 16 až 22 %, zvieratá boli pomaly injikované i.v. 6 ml Trasylolu® (10 000 KlU/ml). Ich chvosty im boli oddelené 30 mm od končeka. Priemerná strata krvi bola 0,39 ± 0,06 (mean ± SEM) ml a všetky zvieratá, okrem jedného, prežili aspoň jeden deň. Osem kontrolných zvierat bolo podobne perfúzovaných roztokom HL, ale bez injekcie Trasylolu®. Priemerná strata krvi bola 4,8 ± 0,54 ml a len 3 z 8 zvierat prežili. V porovnaní s neošetrenými kontrolami bola mortalita (P < 0,02) a strata krvi (P < 0,002) u HL perfúzovaných zvierat, ktorým nebol podaný Trasylol®, významne vyššia.

Príklad 8

Náhrada krvi u psa roztokom HLB pri nulovej teplote

Pes s hmotnosťou 25 až 30 kg bol pripojený na čiastočný kardiopulmonárny by-pass. Povrch aj teplotné jadro zvieraťa boli ochladené na teplotu blízku 0 °C (1 až 3 °C) . Krv psa bola pri hypotermických podmienkach nahradená roztokom HLB, ako je to opísané v príklade 1. Odobratá krv sa uchovala. Teplota tela zvieraťa bola redukovaná na veľmi nízku hodnotu (asi 4 °C) a potom bolo zviera zohriate. V priebehu zohrievania mu bola opäť postupne vrátená jeho krv a zviera bolo oživené.

Príprava: Pes bol katetrizovaný do pravej radiálnej žily, i.v. mu bol injikovaný pentotal, zaviedli mu endotracheálnu trubicu a bol ventilovaný izofluoranom (alebo Fleterom) v 100 % kyslíku. Bola spustené laktátová infúzia na hodnotu titrovanú pre psí arteriálny krvný tlak (asi 40 ml/h i.v.). Pes bol potom zabalený do podchladzovacej prikrývky a ochladzovaný recirkulujúcou ľadovou vodou. Jeho pravá karotída bola katetrizovaná tak, aby bolo možné monitorovať jeho krvný tlak (CPA). Bol pridaný trojcestný kohút, ktorý umožňoval počas celého zákroku odber krvných vzoriek každých 10 až 60 minút. Pre zbieranie moču bol zavedený Foleyov katéter a počas zákroku bola meraná hladina moču. Potom bol implantovaný 2 lumen, 4F, Swan Ganzov katéter do pravej jugulárnej žily alebo pravej femurálnej žily, ktorá vedie z pravej komory do pulmonálnej artérie. Na meranie pulmonálneho tlaku (PAW) bol použitý distálny koniec, na meranie centrálneho žilného tlaku (CVP) bol použitý proximálny koniec. Ak je to potrebné, centrálny žilný tlak sa môže merať aj katétrom zavedeným do barachiálnej žily. Ľavá femyrálna artéria a žila boli preparované a pripravené pre kanyláciu. Zvieraťu bol podaný heparin (asi 5 000 u). Bola zavedená venózna spätná kanyla Biomedicus (15 až 19 F) do femurálnej žily a arteriálna kanyla Biomedicus (12 až 15 F) do femurálnej artérie. Každých 45 minút bola meraná aktivovaná rýchlosť zrážania krvi (ACT) (dokiaľ nebola krv nahradená) a postupne sa pridával heparin tak, aby táto hodnota neklesla pod 400 sekúnd. Približne do stredu pažerákovej trubice bol pripojený termočlánok a bola vložená jednotka tak, aby trubica vstúpila do žalúdka. Druhý termočlánok bol umiestnený rektálne. Boli pripojené EKG vodiče. Potom bol aplikovaný Solu-Delta-Cortef (Upjohn, veterinárny prednizolonsukcinát sodný), 80 mg pomocou i.v. injekcie. Oči boli zakryté Terrimycinom (alebo Lacrylubom) a pomocou pažerákovej trubice bol pridaný DiGel (alebo Maalox, 20 ml).

Merania: V každej krvnej vzorke bola meraná hladina krvných plynov, pH a hematokryt a v niektorých prípadoch aj hladina iónov, enzýmov a niektorých ďalších látok. Monitorovala sa pažeráková a rektálna teplota, rovnako tak vstupná teplota kvapaliny v artériách a výstupná teplota zo žíl. Ďalej sa meral krvný tlak, pulmonálny tlak, centrálny žilný tlak, EKG a tlak vzduchu.

Teplota bola zobrazená digitálne a uložená ako funkcia času v počítačovom dátovom systéme. Jednotlivé tlaky a EKG môžu byť zobrazené ako vlnovky v reálnom čase alebo ako číselné údaje a uložené v počítači.

Zložky bypasového okruhu: okruh je zložený z centrifugačnej krvnej pumpy Biomedikus a merača prietoku, okysličovača Terumo s membránou z dutých vlákien so zabudovaným výmenníkom tepla, pevného venózneho zásobníka Shiley s filtrom a sekundárneho tepelného výmenníka s integrovaným zachytávačom bublín (Electromedics), umiestneným čo najbližšie k zvieraťu. Odtokový segment je umiestnený vedia prívodu do venózneho zásobníka a je zakončený kontrolným ventilom. To umožňuje rýchlu a účinnú výmenu krv/krvná náhrada. Je tam umiestnený A-V posuvný segment, ktorý umožňuje cirkuláciu, kým nie je pripojený by-pass.

Venózny zásobník môže byť naplnený buď jednolitrovým separačným lievikom cez primárny vstup alebo z duálnych infúznych vakov cez jeden z kardiotomných vstupov. Arteriálne vedenie z okysličovača do arteriálnej kanyly a A-V prepínača je zostavené zo 1/4 palcových rúrok, žilné spätné vedenie, odtok a hlavný prívod pumpy je z 3/8 palcových rúrok. V segmentoch, v ktorých môže dôjsť k určitému napätiu, sú použité hrubostenné rúrky alebo rúrky so špirálovým spevnením.

Slučka vedúca od pacienta je dvakrát omotaná a celý okruh (okrem už v továrni vysterilizovaného zásobníka, sekundárneho výmenníka tepla a okysličovača) je sterilizovaný v parách etylénoxidu v šiestich základných kusoch (hlavná časť pumpy, merač prietoku, centrálna slučka by-passu, vstupný lievik, infúzne vedenie a vedenie vzduchového filtra).

Ďalšie zariadenie bypasového okruhu: ľadová voda pumpovaná z jedného z dvoch 10 galónových izolovaných rezervoárov, je nevyhnutná pre chladenie okysličovača a sekundárneho výmenníka tepla. Ďalej je z rezervoárov zásobená chladiaca prikrývka. Pred začatím chirurgického zákroku cirkuluje voda cez chladiacu prikrývku. Na začiatku by-passu cirkuluje voda izbovej teploty cez výmenníky tepla.

Teplota je postupne znižovaná pridávaním ladu do zásobníkov a to tak, aby bol udržaný 7 až 10 °C rozdiel medzi teplotou pažeráka a teplotou obiehajúcej krvi. Po kompletnom nahradení krvi (t.j. hematokryt klesne pod 4 %) je spustená maximálna cirkulácia ľadovej vody.

Pred predhrievaním je ľad z rezervoárov odstránený a aktivuje sa ohrievač. Teplota ohrievacieho prúdu je limitovaná na hodnotu maximálne o 10 ’C vyššiu, ako je teplota vracajúcej sa krvi; je ovplyvňovaná nastavením teplotného termostatu.

Okysličovač je naplnený sterilným 100 % kyslíkom.

Náhrada krvi: okruh sa naplní 2 litrami roztoku L (príklad 1) a recirkuluje cez A-V segment tak, aby ustálila teplota a rovnováha plynov. Kanyly sú napojené na arteriálne a žilné vedenie bypasového okruhu a vedenie zostáva zavreté. Pacient, ktorý je povrchovo podchladzovaný, je obalený chladiacou prikrývkou, kým teplota hlbokého pažeráka nedosiahne teplotu 35 °C.

Svorky sú odstránené a by-pass otvorený, naplnený roztokom L a riedenou krvou pri izbovej teplote (asi 25 °C). Na začiatku podchladzovania sa zastaví plynová anestézia a pes je udržiavaný v narkóze pomocou 2,5 % pentotalu.

Prúd krvi je dovtedy postupne ochladzovaný, kým pažeráková teplota nedosiahne 20 °C. V tom okamihu je prívod krvi z rezervoára zastavený a infúziou je privádzaný čistý roztok L. Počas tejto výmeny sú do rezervoára pridané ďalšie dva litre roztoku L a hneď ako jeho objem v rezervoári klesne pod 250 ml, pridá sa niekoľkými krokmi asi 6 litrov HLB roztoku, dokiaľ nie je krv úplne odstránená (HTC menej ako 2 %, vizuálne pozorovanie). Asi 4 litre zmesi krv/krvná náhrada sú umiestnené do fliaš a uschované pre reinfúziu. Veľmi zriedená frakcia (asi 5,5 1) sa vyleje.

Po výmene 4 litrov (t.j. po pridaní 2 1 roztoku L a 2 1 roztoku HLB) sa cez uzavierací kohút na sekundárnom tepelnom výmenníku pridá do obehu 20 meq KC1 a tým sa srdce zastaví. Počas výmeny je prítok nastavený tak, že pulmonálny tlak je udržiavaný pod 5 mm Hg a miera odtoku je rovnaká ako prítok, t.j. blíži sa k izovolemickým hodnotám. Na konci výmeny bude objem v rezervoári asi 500 ml, pulmonálny tlak bude nižší ako 5 mm Hg a centrálny žilný tlak bude nižší ako 5 mm Hg. Prietok bude udržiavaný tak, aby bol dodržaný izovolemický prietok (konštantná hladina v rezervoári a vyššie uvedené tlaky, t.j. pulmonálny tlak < ako 5 mm Hg a centrálny žilný tlak < ako 5 mm Hg).

Hneď ako je odstránená temer všetka krv (HCT menej ako 4 %, vizuálne pozorovanie), chladiaci prúd môže byť znížený na 0 °C (naplnením rezervoára ľadom) a pes je rýchlo ochladzovaný na minimálnu teplotu. Pokiaľ je v tejto fáze pozorovaný zvýšený hematokryt, môže byť táto zmes nahradená výmenou za 2 až 4 litre roztoku HLB, rovnako ako bolo uvedené vyššie.

Počas celého zákroku sú odoberané krvné vzorky a je monitorované pH, HCT, niekedy koncentrácia elektrolytov a ďalších krvných zložiek.

Po asi 1 až 2 hodinách nahrádzania krvi a ochladzovania bude teplote psieho tela 1 až 4 °C a začne zohrievanie. Pes bude zohrievaný najprv odstránením ľadu z rezervoára a zohriatím jeho obsahu a súčasne zohrievaním prikrývky. Hneď ako pažeráková teplota dosiahne 15 °C, 4 1 roztoku L s 25 mg manitolu nahradia roztok HLB a ihneď sú nahradené 4 1 odobranej zmesi krv/náhrada. Vyplavený roztok je odstránený.

Zvieraťu je infúziou zavedená krv z autotransfúzie alebo darcovská krv, opatrne zohrievaná s rozdielom nepresahujúcim 10 °C, nikdy 40 °C. Srdce začne spontánne tĺcť alebo je defibrilované. Hneď ako teplota tela (pažeráková a rektálna) dosiahne asi 35 °C, fyziologické pomery sa stabilizujú a zviera môže byť odpojené.

Príklad 9

Koncentrované vodné roztoky horčíka a draslíka na ochranu srdca

Tu opisovaný vynález je novým produktom, ktorým sú predovšetkým vodné roztoky obsahujúce vysoké koncentrácie K⁺ a Mg²⁺, použité v kombinácii s ľadovým HLB roztokom, ktorý nahrádza krv u subjektov podstupujúcich chirurgický zákrok pri zníženej teplote, u subjektov podstupujúcich kardioplégiu alebo u darcov orgánov pre lepšiu ochranu orgánov, ako je srdce, pred transplantáciou.

Tieto roztoky môžu byť použité pri hypotermickom totálnom preplachovaní tela teplotách, aby bola zaistená jeho zástavy. Tento roztok roztokom HLB pri nízkych lepšia ochrana srdca počas môže byť použitý aj ako kardioplegické činidlo zároveň s roztokom HLB pri štandardných chirurgických zákrokoch, ktoré neovplyvňujú celé telo, aalebo na ochranu srdca pre transplantáciu po totálnom prepláchnutí tela ľadovým roztokom HLB.

Na prípravu roztokov s vysokou koncentráciou Mg a K sú použité ich soli, MgSO₄ a KC1. Tieto látky sú v súčasnosti dostupné vo forme schválenej na použitie u ľudských pacientov od US FDA. MgCl₂ môže samozrejme nahradiť MgSO₄ a KOH je použiteľný pre zaistenie zásaditého pH asi 7,8 (v rozsahu 7,2 až 8,4). Ďalšími látkami použiteľnými na prípravu roztokov s vysokou koncentráciou Mg a K sú KHCO3, K₂PO₄, laktobionát draselný, citrát draselný, octan draselný a glukonát draselný, tak isto môže byť do roztoku obsahujúceho vysoké koncentrácie K⁺ a Mg⁺⁺ pridaný NaHCO3.

Výsledkom je v každom prípade roztok obsahujúci 1,5 M draslíka a 0,5 M horčíka. Najprv je pripravený roztok obsahujúci 50 mM KC1 a 10 mM MgSO₄ v roztoku HLB. Asi 1 až 2 ml tohto roztoku sa i.v. aplikuje do žily alebo artérie tak, aby vyvolal zástavu srdca u malých podchladených škrečkov s krvnou náhradou. Tento objem odpovedá asi 30 až 50 % celkového objemu krvi škrečka. Experimentálne bolo potvrdené, že pokial je tento roztok podaný intravaskulárne tesne po premytí organizmu, indukuje zastavenie srdca. Zistilo sa, že asi 9,5 ml 50 % roztoku MgSO₄.H₂O (t.j. asi 2M) a 27 ml KC1 podaného intraarteriárne podchladenému psovi (hmotnosť 25 kg, zistený objem krvi asi 2,8 1), ktorého krv bola nahradená HLB, značne zlepšuje ochranu jeho srdca, v porovnaní s prípadmi, kedy je K a Mg podávané dodatočne, alebo pokial je použitý zriedený roztok (t.j. po prvom zriedení koncentrovaného K/Mg roztoku asi 500 ml roztoku HLB v okysličovači a ďalším riedením roztoku v okruhu obsahujúcom ďalších 850 ml HLB, čím vzniká roztok obsahujúci 6,2 mM Mg⁺⁺ a 17,4 mM K⁺) .

Roztok obsahujúci asi 37 ml roztoku 0,55 M MgSO₄.H₂O a 1,48 M KC1 bol podaný do časti bypasového okruhu (tepelný výmenník) , ktorý bol priamo pripojený k femurálnej artérii subjektu. Vzhľadom na tento experiment so psom, dá sa predpokladať, že použitie tohto roztoku u pacientov zlepší ochranu ich srdca počas doby, kedy je ich krv nahradená HLB pri nízkych teplotách. Rovnako tak, ak je škrečkovi podaných 0,1 ml roztoku s vysokou koncentráciou K⁺ a Mg⁺⁺ intraarteriárne, efektívne to zaistí ochranu jeho srdca, len pokiaľ je použitý okamžite po hypotermickej náhrade jeho krvi roztokom HLB.

Vynález opisuje použitie roztokov obsahujúcich extrémne vysoké koncentrácie K⁺ a Mg⁺⁺, ktoré môžu byť podávané bezpečne a efektívne tak, aby chránili srdce pacienta, zároveň s jeho podchladením a náhradou krvi za roztok HLB. Aplikované koncentrácie K⁺ a Mg⁺⁺ sú viac ako

ΙΟχ vyššie (pre oba ióny), ochranných roztokoch.

ako v predtým používaných

1. Oživenie škrečka s použitím HLB a koncentrovaného roztoku Mg/K

Samica škrečka s hmotnosťou 55 g, vytrávená cez noc, bola uspaná 0,03 ml (100 mg/ml) ketamínu a pokrytá drveným ľadom tak, aby rektálna teplota klesla na asi 13 °C. Potom bolo zviera prenesená na chirurgickú podložku pod stereomikroskop. Do karotídy a jugulárnej žily boli zavedené kanyly. Roztok HLB bol zavedený do artérie a odtok zo žily sa zbieral. Krv bola nahradená ľadovým roztokom HLB. Hneď ako bolo odstránených asi 65 % krvi, teplota zvieraťa sa znížila na 1 °C. Ventilácia zvieraťa so 100 % kyslíkom začala hneď ako teplota klesla pod 10 °C. Asi 7 ml alebo dva objemy krvi sú potrebné pre nahradenie kompletnej krvi v obehovom systéme. Po zastavení perfúzie bolo aplikovaných 0,2 ml (i.v.) 0,5 M KC1 s 0,1 M MgSOij. Srdce sa okamžite zastavilo. Zviera bolo udržiavané pri zastavení srdca 5 hodín a 30 minút. Potom bolo perfúzované 3 ml roztoku HLB a krvou darcu. Počas zohrievania sa obnovila normálna činnosť srdca a pľúc. Po precitnutí zviera normálne reagovalo na stimuly, ako je ľahké stlačenie brucha alebo tlapiek.

2. Škrečok s hmotnosťou 70 g, vytrávený cez noc, bol uspaný 0,03 ml (100 mg/ml) ketamínu a pokrytý drveným ľadom tak, aby rektálna teplota klesla na asi 13 °C. Potom bolo zviera prenesená na chirurgickú podložku pod stereomikroskop. Do karotídy a jugulárnej žily boli zavedené kanyly. Roztok HLB (s prídavkom 50 mM glukózy a 5 mM NaHCO₃) bol zavedený do artérie a odtok zo žily sa zbieral. Krv bola nahradená ľadovým roztokom HLB. Hneď ako bolo odstránených asi 65 % krvi, teplota zvieraťa sa znížila na 1 °C. Ventilácia zvieraťa so 100 % kyslíkom začala hneď ako teplota klesla pod 10 °C. Asi 7 ml alebo dva objemy krvi sú potrebné pre nahradenie kompletnej krvi v obehovom systéme.

Roztok obsahujúci 0,02 ml 1 M MgSC>4 a 0,1 M KC1 je zriedený 0,1 ml HLB. Výsledný roztok, 0,22 ml, je podaný

i.v. To odpovedá podaniu zmesi 0,5 M KC1 s 0,09 M MgSC>4. Po 5 hodinách zástavy srdca je zviera perfúzované 3 ml HLB a krvou darcu. Počas zohrievania sa obnovila normálna činnosť srdca a plúc.

Pred objavením roztoku s vysokou koncentráciou Mg/K nebolo možné opakovane oživiť škrečka po 5 hodinách srdcovej zástavy.

3. Samica škrečka s hmotnosťou 70 g, vytrávená cez noc, bola uspaná 0,03 ml (100 mg/ml) ketamínu a pokrytá drveným ľadom tak, aby rektálna teplota klesla na asi 13 °C. Potom bolo zviera prenesená na chirurgickú podložku pod stereomikroskop. Do karotídy a jugulárnej žily boli zavedené kanyly. Roztok HLB bol zavedený do artérie a odtok zo žily sa zbieral. Krv bola nahradená ľadovým roztokom HLB. Hneď ako bolo odstránených asi 65 % krvi, teplota zvieraťa sa znížila na 1 °C. Ventilácia zvieraťa so 100 % kyslíkom začala hneď ako teplota klesla pod 10 °C. Asi 5 ml je potrebných pre nahradenie kompletnej krvi v obehovom systéme. Potom bolo intraarteriárne aplikovaných 0,2 ml 0,5 M KC1 s 0,09 M MgSO₄. Potom bola aplikovaná injekcia 1 ml HLB, aby nasledovala kardioprotektant do obehového systému a do tkanív. Zviera bolo 1 hodinu udržiavané pri zástave srdca. Potom bola zahájená perfúzia 4 ml HLB a krvou darcu a zviera sa postupne zohrievalo. Počas zohrievania srdce začalo spontánne pracovať, vykazovalo normálny EKG signál, nasledovala normálna funkcia pľúc, odpovede zvieraťa, normálna pohyblivosť a dlhodobé prežitie.

Bez použitia roztoku obsahujúceho vysoké koncentrácie Mg/K bolo predtým pri tomto type experimentu pozorované dlhodobé prežitie len zriedka.

Príklad 10

Použitie roztoku HLB pri občasnej perfúzii ďalším bikarbonátom

Počas podchladenia na veľmi nízku teplotu a pri náhrade krvi v priebehu zástavy obehu trvá obnovenie niektorých neurologických funkcií dlhšie ako v prípade, keď roztok HLB pomaly cirkuluje neustále. Pokusmi so škrečkami sa zistilo zlepšenie pokiaľ sa striedali perfúzia s HLB obsahujúcim bikarbonát a čistým roztokom HLB, ktorý redukoval acidózu. Toto tiež zabraňuje meravosti a zlepšuje obnovenie mozgových funkcií, ako bolo preukázané na škrečkoch po dlhej zástave srdca.

Je tiež opísané, že pomalá perfúzia ľadovým roztokom

HLB umožňuje predĺžiť u psa periódu srdcovej zástavy, v porovnaní s úplným zastavením obehu.

U škrečkov sa zistilo, že 5,5 mM ďalšieho bikarbonátu je vhodných po dlhodobej zástave obehu na redukciu acidózy.

1. Škrečok s hmotnosťou 70 g, vytrávený cez noc, bol uspaný 0,03 ml (100 mg/ml) ketamínu a pokrytý drveným ľadom tak, aby rektálna teplota klesla na asi 13 ’C. Potom • bolo zviera prenesená na chirurgickú podložku pod stereomikroskop. Do karotídy a jugulárnej žily boli zavedené kanyly. Roztok HLB (s prídavkom 50 mM glukózy a 5 mM NaHCCh) bol zavedený do artérie a odtok zo žily sa zbieral. Krv bola nahradená ľadovým roztokom HLB. Hneď ako bolo odstránených asi 65 % krvi, teplota zvieraťa sa znížila na 1 °C. Ventilácia zvieraťa so 100 % kyslíkom začala hneď ako teplota klesla pod 10 ’C. Asi 7 ml alebo dva objemy krvi sú potrebné pre nahradenie kompletnej krvi v obehovom systéme. Pridanie 5 mM NaHCO₃ upraví výsledné pH na 8,5. Po perfúzii je srdce zastavené 0,5 ml 50 mM KC1 a mM MgSO₄. Po 4 hodinách a 40 minútach bolo zviera reperfúzované 2 ml HBL a následne krvou darcu. Zviera sa nepodarilo oživiť.

2. Bol uskutočnený rovnaký experiment ako v prípade 1, len s tým rozdielom, že 2 hodiny a 30 minút po zastavení obehu bola minút praktizovaná prerušená perfúzia bikarbonátu.

Škrečok s hmotnosťou 70 g, vytrávený cez noc, bol uspaný 0,03 ml (100 mg/ml) ketaminu a pokrytý drveným ľadom tak, aby rektálna teplota klesla na asi 13 °C. Potom bolo zviera prenesená na chirurgickú podložku pod stereomikroskop. Do karotídy a jugulárnej žily boli zavedené kanyly. Roztok HLB (s prídavkom 50 mM glukózy a 5 mM NaHCO₃) bol zavedený do artérie a odtok zo žily sa zbieral. Krv bola nahradená ľadovým roztokom HLB. Hneď ako bolo odstránených asi 65 % krvi, teplota zvieraťa sa znížila na 1 °C. Ventilácia zvieraťa so 100 % kyslíkom začala hneď ako teplota klesla pod 10 °C. Asi 7 ml alebo dva objemy krvi sú potrebné pre nahradenie kompletnej krvi v obehovom systéme. Potom prebehla perfúzia s roztokom HLB (obsahujúcim naviac 50 mM glukózy) a 5 mM NaHCC>3, čo upraví výsledné pH na 8,5. Po perfúzii bolo srdce zastavené 0,5 ml 50 mM KC1 a 10 mM MgSO₄. Po 2 hodinách a 30 minútach bola 15 minút aplikovaná perfúzia roztokom HLB (t.j. 2 ml HLB). Po 4 hodinách a 40 minútach bolo začala perfúzia 2 ml HBL a potom krvou darcu a zviera bolo zohrievané. Zviera úplne obnovilo svoje fyziologické funkcie. Srdcová zástava trvala dlhšie ako 5 hodín.

Príklad 11

Kryoprotektívny roztok

1. Príprava roztoku

a) Spôsob 1:

Pri príprave 50 ml 10 % glycerolu v HLB sa 45 ml HLB prenesie do reakčnej nádoby. Potom sa pridá 50 ml 100 % glycerolu. Roztok sa mieša a nakoniec prefiltruje cez 0,2 a menší mikrónový filter.

b) Spôsob 2:

Na 1 liter 15 % roztoku glycerolu v HLB zmiešať: HES 60 g/1, NaCl 6,72* g/1, rozpustiť v polovici konečného objemu, t.j. v 500 ml deionizovanej vody. Potom za stáleho miešania postupne rozpustiť 0,09 g/1 MgCl₂, 0,37 g/1 CaCl₂, 0,22 g/1 KC1, 0,9 g/1 glukózy, 4,03 ml/1 laktátu sodného (60 % sirup), 0,42 g/1 alebo 0,84 g/1 NaHCO3 (ďalší bikarbonát môže prispieť k zníženiu acidity). Pridať 850 ml deionizovanej vody. Pridať 150 ml 100 % glycerolu. Prefiltrovať cez 0,2 mikrónový filter.

množstvo pridaného NaCl je upravené podlá hodnoty NaCl uvedenej u škrobu poznámka: v prípade s 50 mM extra glukózou treba pridať za stáleho miešania 9 g/1 glukózy

2. Kryoprotektívny roztok 10 % glycerolu v HLB umožňujúci oživenie čiastočne zamrazených škrečkov

Samica škrečka s hmotnosťou 60 g, vytrávená cez noc, bola uspaná 0,03 ml (100 mg/ml) ketamínu a pokrytá drveným ľadom tak, aby rektálna teplota klesla na asi 13 °C. Potom bolo zviera prenesená na chirurgickú podložku pod stereomikroskop. Do karotídy a jugulárnej žily boli zavedené kanyly. Roztok HLB bol zavedený do artérie a odtok zo žily sa zbieral. Krv bola nahradená ľadovým roztokom HLB s 10 % glycerolom. Hneď ako bolo odstránených asi 65 % krvi, teplota zvieraťa sa znížila na 1 °C. Ventilácia zvieraťa so 100 % kyslíkom začala hneď ako teplota klesla pod 10 °C. Po perfúzii asi 5 ml kryoprotektívneho roztoku bolo srdce zastavené pomocou 1,5 ml 50 mM KC1 s 10 mM MgSO₄ aplikovaného intravenózne. Potom bolo zviera prenesené v plastikovom vrecku a ponorené do chladiaceho kúpela s teplotou -15 °C. Po 30 minútach rektálna teplota klesla na

-2,2 ’C.

Potom bolo zviera zohrievané až kým sa neroztopilo, perfúzované HBL a potom krvou darcu. Po zohriati sa objavilo normálne EKG, nasledovalo dýchanie a normálne reakcie zvieraťa. Množstvo extenzívnych lézií (mikrohemorhagických) bolo pozorovaných v mozgu po nekropsii, ktorá demonštrovala, že mozog bol za týchto podmienok v podstate zmrznutý. Napriek tomu sa podarilo zviera oživiť a to reagovalo.

3. Kryoprotektívny roztok obsahujúci 10 % glycerolu a 10 % DMSO

Samica škrečka s hmotnosťou 60 g, vytrávená cez noc, bola uspaná 0,03 ml (100 mg/ml) ketamínu a pokrytá drveným ľadom tak, aby rektálna teplota klesla na asi 13 ’C. Potom bolo zviera prenesená na chirurgickú podložku pod stereomikroskop. Do karotídy a jugulárnej žily boli zavedené kanyly. Roztok HLB bol zavedený do artérie a odtok zo žily sa zbieral. Krv bola nahradená 1,5 ml ľadového roztoku HLB a potom kryoprotektívnym roztokom HLB s 10 % glyceroloma 10 % DMSO. Hneď ako bolo odstránených asi 65 % krvi, teplota zvieraťa sa znížila na 1 °C. Ventilácia zvieraťa so 100 % kyslíkom začala hneď ako teplota klesla pod 10 °C. Po perfúzii asi 6,5 až 7,0 ml kryoprotektívneho roztoku bolo srdce zastavené pomocou 1,5 ml 50 mM KC1 s 10 mM MgSO₄ aplikovaného intravenózne. Potom bolo zviera prenesené v plastikovom vrecku a ponorené do chladiaceho kúpeľa s teplotou -15 °C. Po 30 minútach rektálna teplota klesla na -1,5 ’C.

Potom bolo zviera zohrievané až kým sa neroztopilo, perfúzované HBL a potom krvou darcu. Po zohriatí sa objavilo normálne EKG, nasledovalo dýchanie a normálne reakcie zvieraťa. Množstvo extenzívnych lézií (mikrohemorhagických) bolo pozorovaných v mozgu po nekropsii, ktorá demonštrovala, že mozog bol za týchto podmienok v podstate zamrznutý. Napriek tomu sa podarilo zviera oživiť a to reagovalo.

Všetky tu uvedené publikácie a patentové aplikácie sú priložené ako referencie, kde je každá z nich jednotlivo uvedená ako citácia. Citácie vzťahujúce sa na publikácie opisujúce súčasný stav techniky pred dátumom podania navrhovaného vynálezu sú dôkazom toho, že navrhovaný vynález nie je uvedený v súčasnom stave techniky.

Napriek tomu, že navrhovaný vynález bol opisovaný v niektorých prípadoch velmi detailne, každému odborníkovi musí byť jasné, že ide len o návody a ilustrácie a že je možné aplikovať rad zmien a modifikácií bez toho, aby bol prekročený rámec navrhovaného vynálezu.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Fyziologicky prijateľný vodný roztok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

   elektrolyty, dynamický pufračný systém a aspoň jednu onkoticky aktívnu zložku, pričom tento roztok obsahuje aspoň dve zložky z nasledujúcich, horčík, cukor v množstve nie vyššom ako asi 50 mM a stredne alebo vysoko molekulárnu, onkoticky aktívnu zložku a zároveň tento roztok neobsahuje biologický pufer.
2. 2. Fyziologicky prijateľný vodný roztok obsahujúci: elektrolyty, dynamický pufračný systém a aspoň jednu onkoticky aktívnu zložku, vyznačuj úci sa t ý m, že touto onkoticky aktívnou zložkou je stredne alebo vysoko molekulárny hydroxyetylový škrob.
3. 3. Roztok podľa nárokov la 2, vyznačujúci sa tým, že dynamický pufračný systém obsahuje karboxylové kyseliny, ich soli a estery.
4. 4. Roztok podľa nárokov 1, 2a3, vyznačuj úci sa t ý m, že dynamický pufračný systém obsahuje ďalej bikarbonát.
5. 5. Roztok podľa všetkých predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje kryoprotektívnu zložku.
6. 6. Roztok podľa všetkých predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že onkoticky aktívnou zložkou je polysacharid.
7. 7. Roztok podľa všetkých predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že tento polysacharid je hydroxyetylový škrob.

   8. Roztok podľa nároku 7, vyzná č u j ú c i sa t ý m, že tento hydroxyetylový škrob je hydroxyetylový škrob so strednou molekulovou hmotnosťou. 9. Roztok podľa nároku 7, vyzná č u j ú c i sa t ý m, že tento hydroxyetylový škrob je hydroxyetylový

   škrob s vysokou molekulovou hmotnosťou.
8. 10. Roztok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že tento hydroxyetylový škrob obsahuje 6 až 7 hydroxyetylových skupín na každých 10 monomérnych jednotiek a je prítomný v koncentrácii okolo 6 %, pričom tento roztok neobsahuje viac ako 50 mM glukózy.
9. 11. Roztok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že tento hydroxyetylový škrob obsahuje 4 až 5 hydroxyetylových skupín na každých 10 monomérnych jednotiek a je prítomný v koncentrácii okolo 6 %, pričom tento roztok neobsahuje viac ako 50 mM glukózy.
10. 12. Roztok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že tento hydroxyetylový škrob obsahuje 7 až 8 hydroxyetylových skupín na každých 10 monomérnych jednotiek a je prítomný v koncentrácii okolo 6 %, pričom tento roztok neobsahuje viac ako 50 mM glukózy.
11. 13. Roztok podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, vyznačujúci sa tým, že elektrolyty obsahujú sodík, draslík, vápnik, chloridové ióny a horčík.

    14 . Roztok podľa ktoréhokoľvek predchádzaj úceho nároku, v y znač u j ú c i sa t ý m, že ďalej obsahuje zrážadlo. 15. Spôsob podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, v y znač u j ú c i sa t ý m, že pri zavedení do

    obehového systému pacienta alebo jeho časti, použitie fyziologicky prijateľného vodného roztoku podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, ako náhrady krvnej plazmy, prináša zlepšenie.
12. 16. Fyziologicky prijateľný roztok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená onkoticky aktívna zložka je nízko alebo stredne molekulárna, onkoticky aktívna zložka.