SU1008657A1 - Способ определени урата в плазме и сыворотке крови - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРАТА В ПЛАЗМЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ, предусматривающий контактирование исследуемой пробы с урикаэой и каталазой при рВ 8-8,1, отличающийс  тем, что, с целью повышени  селективности определени  и упрощени  процесса , пробу первоначально ввод т в контакт с каталазой,алэатем с уриказой, иммобилизованными на пористом стекле/ содержащем покрытие из пентоксида ниоби , с последующим определением хемилюминесцентным методом количества выделившегос  пероксида водорода, по которому определ ют количество урата.

Description

Изобретение относитс  к клинической биохимии, а именно к разделу клинического медицинского анализа. Урат принадлежит к числу об зательных компонентов крови, в норме содержание урата в плазме крови соетавл ет 0,02-0,04 г/л. Уровень содержани  урата в крови имеет важное диагностическое -значение, повышенное содержание его характерно, например дл  заболеваний подагрой, резкие кол бани  содержани  урата в крови наблю даютс  при почечнЬ-каменной болезни Известен способ определени  урата в плазме и сыворотке крови, состо щи в том, что анализируемую пробу разбавл ют раствором типа физиологического , подвергают диализу, смешивают диализат с раствором фермента урикаг зы, растворенного в водной буферной смеси с рН 8,5-10, инкубируют полученный раствор при в течение 4 мин, смешивают инкубированный раствор с водным раствором замещенного бензидина или дифенилина, с водным раствором фермента пероксидазы и с водным буферным раствором с рН 5,5-8,5, полученный окрашенный

уриказаУрат + О,

аллантоин + С02 + Н-О. HjOj + этанол Ацетальдегид + где НАД - никотинамидадениндинуклеотид в окисленной формеj НАНД - никотинамидадениндинуклБотид в восстановленной форме. Содержание урата наход т, измер   содержание ионов водорода, образующихс  в последней реакции С23. Иммобилизованные уриказа и альдегидцегидрогеназа позвол ют проводить многократные определени  урата с. одной и тойже порцией фермента, бла годар  чему уменьшаетс  расход ферментов и снижаетс  стоимость анализ Простота регистрации отклика дает возможность автоматизировать определение . Недостатки способа заключаютс  в том, что меша  реакционна  поверхность нейлонового реактора-трубки замедл ет основные реакции, из-за чего возникает много побочных реакций , привод щих к ошибкам в результате анализа. Большой ассортимент бводимых в анализируемый раствор реагентов св  зан с возможностью протекани  разного рода побочных реакций, искажаю щих результат анализа и снижающих селективность определени . Регшизаци  способа усложн етс  также необходимостью введени  в анализируемый раствор фермента каталазы, котора  приводит к необратимым потер м этог каталаза аде тал ьде гид Нг Н2О НАД альдегиддегидрогеназа раствор пропускают через кювету дл  фотометрического анализа, фотометрируют при 420-460 нм l. К недостаткам данного способа относ тс  длительность анализа, так как диализ растворов - процедура крайне длительна , мала  точность определени , так как фотометрированию мешают все содержащиес  в крови окрашенные соединени , большой расход ферментов, из-за чего стоимость анализов высока,-что не позвол ет использовать способ дл  массовых анализов. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности  вл етс  способ определени  урата в плазме и сыворотке крови, заключак цийс  в пропускании исследуемой пробы при рН 8-8,1 через нейлоновый трубчатый реактор, на стенках «которого иммобилизованы уриказа и альдегиддегидрогеназа . Кроме того, в реакционную среду непосредственно вводитс  фермент каталаза . Способ основан на последовательно протекающих ферментативных реакци х ацетат + НАДИ + н фермента, и тем, что никотинамидадениндинуклеотид принадлежит к числу очень дорогих и скоропорт щихс  реактивов , его использование резко удорожает анализ. Кроме того, иммобилизованные на поверхности нейлонового реактора ферменты сравнительно легко вымываютс  ансшизируемым раствором, ферменты тер ютс  и активность реактора уменьшаетс , срок службы такого ферментного реактора не превышает 20 дней. Цель изобретени  - повышение селективности определени  и упрощение процесса. Указанна  цель достигаетс  тем, что согласно способу определени , урата в плазме и сыворотке крови, заключакхцемус  в контактировании исследуемой пробы с уриказой и каталазой при рН 8-8,1, пробу первоначально ввод т в контакт с каталазой, а затем с уриказой, иммобилизованными на пористом стекле, содержащем покрытие из п йтоксида ниоби , с последующим определением хемилюминесцентным методом количества выделившегос  пероксида водорода,по которому определ ют количество урата. Указанна  последовательность стадий процесса, а также применение описанных иммобилизованных форм ферментов обеспечивают возможность максимального устранени  побочных рёакций , что позвол ет повысить селективность определени , а также упростить процесс, поскольку его осуществ ление основано на двух (а не трех) ферментативных реакци х. Кроме того, используемые иммобилизованные фермен ты  вл ютс , стабильными и обеспечивают большую продолжительность использовани . Данный способ дл  реали зацни не требует использовани  НАД Процесс основан на следующей схеме. .Фермент уриказа (уратоксидаза, урат: О- оксидоредуктаза, К.Ф.1.7.3, катализирует реакцию окислени  урата кислородом с образованием аллантоинэ и пероксида водорода Урат + О2 , аллантоин+Н2О2 Количество образовавшегос  пероксида водорода эквивалентно количеству прореагировавшего урата. Насыщение буферного раствора, в котором провод т ферментативную реакцию, кис лородом обеспечивает практически мгновенное протекание этой реакции Фермент катализа разлагает все перекисные соединени , которые могут при сутствовать в анализируемом веществе , с образованием кислорода, и тем самым устран ет возможность с иибки, вызванной взаимодействием этих перекисных соединений с люминесцентным реагентом. При использовании хемилюминесцент ного метода Сз 3 пероксид водорода подвергают реакции с замещенными арилоксалатами, образу  пероксиоксалаты , которые мгновенно распадаютс , причем распад сопровождаетс   ркой хемилюминесценцией,- интенсивность которой пропорциональна KOHW центрации пероксида водорода в растворе . В присутствии флуоресцентных реагентов с сопр женными двойными св з ми типа антрацена или перилена  ркость свечени  резко возрастает, что облегчает регистрацию хемилюминесценции . Способ осуществл ют следующим образом . Пробу анализируемого вещества ввод т в поток насыщенного кислородо фосфатного буферного раствора с рН 8 проход щий последовательно через две колонки с ферментами, иммобилизо ванными на покрытых пентоксидом ниоби  шариках из пеностекла, причем впервой колонке находитс  фермент каталаза , во второй - фермент уриказа, и в выход щем из второй колонки раст воре определ ют содержание пероксида водорода хемилюминесцентным методом 31 по реакции с бис-(3,4,6-трихлорфенил )-окса атом в присутствии 9,10-дифенилантрацена , по найденном содержанию пероксида водорода рассчиты вают содержание урата в анализируемо веществе. Экспериментально установлено,что наилучшие результаты дает применение в качестве хемилюминесиентного реагента бис-(3,4,б-трихлорфенил)-оксалата , а в качестве флуоресцентного реагента 9,10-дифенилантрацена. Эта реакци  дает возможность по интенсивности свечени  определ ть .очень малые количества пероксида водорода , благодар  чему резко снижаетс  требуемый объем анализируемоговещества (дл  единичного определени  достаточно 50 мкл плазмы или сыворотки крови, против 10 мл по обычно используемому методу, т.е. в 200 раз меньше). Введенна  в поток буферного раствора проба ангшизируемого вещества разбавл етс  много раз. при этих: разбавлени х окрашенные компоненты крови не оказывают никакого статистически значимого вли ни  на результат определени . На реакцию пероксида водорода с замещенными арилоксалатами не вли ют белковые вещества, поэтому не требуетс  операци  диализа анализируемого раствора. Измерение хемилюминесценции может проводитьс  в автоматическом режиме. Иммобилизацию ферментов провод т следующим образом. 100 вес.ч. шариков из пеностекла, имеющих средний диаметр 0,25-0,35 мм и средний диаметр пор 200-500 нм высуашвают в вакуумном сушильном шкафу при 150°С и остаточном давлении 0,1 Па. Затем высушенные шарики помещают в кварцевы. стакан, заливают 150 вес.ч. 1%-ного раствора пентахлорида ниоби  в безводном этиловом , стакан устанавливают в вакуумэксикаторе и откачивают воздух до начала :кипени  жидкости в стакане, повтор ют процедуру откачивани  воздуха 5 раз. Далее стакан вынимают из вакуум-эксикатора и при интенсивном перемешивании содержимого стакана , пропеллерной мешалкой вливают в стакан 150 вес.ч. воды. Перемешивают массу в течение 30 мин, дают отсто  тьс , декантируют жидкость и приливают новую порцию 150 вес.ч. воды. Вновь перемешивают 30 мин, отсасывают шарики на воронке Бюхнера, промыва  буферным раствором с рН 10. Промывку повтор ют 3 раза. Промытые шарики готовы к употреблению, их хран т в фосфатном.буферном растворе с рН 8. Дл  иммобилизации раствор ют 1 вес.ч. фермента в 200 вес.ч, буферного раствора с рН 10,5, в.полученный раствор внос т 8 вес.ч. шариков из пеностекла, покрытых пентоксидом ниоби , и оставл ют в растворе на 24 ч при интенсивном перемешивании смеси магнитной машалкой, при 3537®С . Затем шарики отсасывают на воронке Вюхнера, промыва  фосфатным

буферным раствором с рН 8, промытые шарики до употреблени  хран т в фосфатном буферном растворе с рН 8 при 4°С.

В колонку дл  проведени  ферментативной реакции загружают шарики с иммобилизованным ферментом с таким расчетом, чтобы высота сло  шариков была в пределах 35-45 мм. Дл  проведени  измерений используют установ- ку 33.

Пример 1, Определение урата в образцах крови.

Анализу на содержание урата подвергают образцы плазьвд и сыворотки донорской крови стандартного консераировани , а также плазму и сыворотку крови больного почечно-каменной болезнью на разных стади х болезни.

Дл  анализа собирают установку З Иммобилизуют ферменты, как описано выше, загружают шарики с иммобилизо ванными ферментами в колонки, устана ливают посто нный поток буферного раствора через систему, включают регистрирующую установку и провод т корректировку нул  измерительного прибора.

Отбирают 200 мкл анализируемого образца (плазмы или сыворотки) в

шприцевый микродозатор и далее последовательно провод т три определени , ввод .в установку по 50 мкл анализируемого образца и измер   интенсивность хемилюминесценции. Содержание урата определ ют по градуировочному графику.

Парёшлельно те же образцы анализируют на содержание урата способомпрототипом с использованием иммобилизованных на поверхности нейлоновой трубки-реактора ферментов уриказы и альдегиддегидрогеназы, также повтор   ансшиз три раза.

Полученные в эксперименте резулЬтаты обрабатывают следующим образом.

По табл. 1, в которой приведены результаты изучени  вли ни  концентрации урата в анализируемом растворе на величину интегрального значени  интенсивности хемилюминесценции, возникающей на конечном этапе определени  урата, строитс  градуировочный график в билогарифмических координатах (см. чертеж). В диапазоне содержаний урата в пробе анализируемого раствора 2 10-8- 8-10 моль/л зависимость имеет линейный характер. Методом наименьших квадратов найдено уравнение пр мой, описывахицей эту зависимость

рС 9,5852 - 1,1733 IgQ.,

где рС - отрицательный логарифм мол рной концентрации урата;

Определение урата в образцах крови

Таблица 2

Примечание. видно из табл. 2 предлагаемый способ не уступает по точности опре делени  известным,  вл етс  более простым и селективным. Пример 2. Сравнение удержани  ферментов иа носителе и сохранени  посто нства активности фермент ного реактора при длительном использовании . Собирают установку . Устанав-, ливают посто нный поток буферного раствора через реакторы, по истечении определенного промежутка времеУдерживание фермента на носителе

О 6 SpТаблица 3

24,2

0,04

24,3 24,1 24,4 0,04 среднее содержание урата, относительное стандартное отклонение . ни анализируют один и тот же образец плазмы крови с известным содержанием урата. . Параллельно собирают установку по способу-прототипу с нейлоновым фрубчатым реактором, устанавливают посто нный поток буферного раствора через реактор, равный потоку буферного раствора в способе-прототипе. Через те же cai«ie промежутки времени анализируют тот же сапыв образец плазмы крови. Результаты представлены в табл.3. Предлагаемый способ после 144 ч промлвани  ферментных реакторов буферным раствором показывает одинаковые с исходным результаты;определени  содержани  урата в образце плаз1уы крови. Способ-прототип после 24 ч промывани  реактора буферным раствором дает колеблющиес  результаты, после 48 ч промывани  реактор полностью тер ет активность и определение становитс  невозможным. Пример 3. Вли ние срока хра нени  ферментного реактора с иммобилизованными ферментами на результат определени  урата в плазме крови. Собирают установку СзЗ Иммоби-пизуют ферменты на шариках их пеностек ла, покрытых пентоксидом ниоби , загружают шарики в реакторы, подключают к установке. Полностью готовую к работе установку подключают к термостату,устанавливают темрер Вли ние срока хранени  фе определени  содержани 

Продолжение табл. 3 туру ферментных реакторов равной 4 С и оставл ют при этих услови х на врем . Через заданный промежуток времени включают установку и провод т определение урата в плазме крови, как описано выше. Параллельно готов т ферментный реактор по способу-прототипу, иммобилизу  уратоксидазу и альдегиддегидрогеназу на внутренней стенке нейлоновой трубки. Готовый ферментный реак тор заливают буферным раствором и погружают в нермостат с температурой , хран т в этом термостате. Через заданный промежуток времени реактор вынимают из термостата-, устанавливают температуру реактора равной 37°с и провод т определение, как описано в способе-прототипе. Полученные результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 тного реактора на результат а в плазме крови

Хранение ферментного реактора с ферментами, иммобилизованными на шариках из пеностекла, покрытых пентоксидом Ниоби , в течение года не сказываетс  на активности ферментов и не вли ет на результат анализа, в то врем  как ферментный реактор, изготовленный в соответствии со способом-прототипом , через 4 мес хранени  дает непригодные результаты, а через 6 мес полностью тер ет активность .

Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом состо т в том, что вместо трёх ферменто дл  анализа требуетс  тoлькo два, ферментный реактор служит дольше (не менее 12 мес. против 4 мес, по способу-прототипу ),-затраты времени на айализ в 2 раза меньше, исключаетс  применение дорогих и скоропорт щихс  реактивов типа никотинамидадениндинуклеотида , отсутствуют помехи от окрашенных веществ, определение легко автоматизируетс .

Claims (1)

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРАТА В ПЛАЗМЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ, предусматривающий контактирование исследуемой пробы с уриказой и каталазой при pH 8-8,1, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности определения и упрощения процесса, пробу первоначально вводят в контакт с каталазой,аззатем с уриказой, иммобилизованными на пористом стекле, содержащем покрытие из пентоксида ниобия, с последующим определением хемилюминесцентным методом количества выделившегося пероксида водорода, по которому определяют количество урата.

   >

   QO о

   СП м