SU1069783A1 - Способ получени туберкулезного диагностикума - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ЦОЛУЧЕЙИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО даАГНОСТИКУMA, включающий культивирование микобактерий туберкулеза , вьвделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента, о т л и ч а ю щ и и с   тем, что, с целью повышени  активности целевого продукта, культивируют микобактерий Dt/St и Valu, после мйтаноловой очистки фосфатидный антиген- выпаривают до по влени  осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4 1 ,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

Description

Ot)

со

00

со

Изобретение относитс  к медицине и может быть использовано дл  получени  антигенного эритроцитарного туберкулезного диагностикума.

Известен способ получени  туберкулбзного диагностикума, включающий культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последукщей сенсибилизацией им каолина СП.

Однако известный способ не позвол ет получить диагностикум с высокой активностью и, кроме того, сложен в исполнении.

Цель изобретени  - повышение активности диагностикума.

Указанна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени туберкулезного диагностикума, включающему культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из ладкробной массы ацетоном и метанолом с последуквдей сенсибилизацией им сорбента , культивируют микобактерий Dt/St и Valu, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпаривают до по влени  осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4-1,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов . ,.

Способ осуществл ют следующим образом.

Г кобактерии туберкулеза- Dt/St и Valu выращивают в отдельных матрицах , заполненных средой Линниковой и Могилевского (,состав среды: вода дистиллированна  200 л, гликокол 1,7 кг, аммоний лимоннокислый однозамещенный 1,0 кг; натрий углекислый безводный 0,6 кг, натрий хлористый 0,4 кг, магний сернокислый 0,2 кг, железо лимоннокислое окисное 0,01 кг; глицерин 14 кг, ортофосфорна  кислота 60-90 мл; калий фосфорнокислый двузамещенный 0,6 кг), в течение 6-8 недель при 38°С. После этого провод т стерилизацию йикробных культур автоклавированием текучим паром в течение 1ч. Затем микробные культуры смешивают в равных объемах,после чего дл  полчени  микробнь1Х тел культуральную жидкость удал ют путем фильтрации через асбестовые пластины.

Полученные микробные клетки высушвают обработкой ацетоном.

Высушенные ацетоном микробные клетки заливают ацетоном из расчета два объема ацетона на один объем микробной массы и помещают в термостат при 38°С на 3 ч,, после чего . ацетон сливают. Эту операцию выполн ют дважды.

Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из .расчета 0,5 л метанола на 50 г клеток и встр хивают в течение 5 ч при 37°С, после чего микробные клетки отдел ют центрифугированием . Эту операцию также провод т два раза.

Кетаноловые экстракты первого и второго извлечени  (по указанной операции) объедин ют и помещают в вакуум-сушильный шкаф, в котором провод т выпаривание метанолового экстракта до по влени  осадка фосфатидного антигена. Выпаривание целесообразно проводить при разрежении 0,8-0,6 кгс/см и температуре 48-52 с. Окончание операции выпаривани  устанавливают либо визуально по выпадению осадка (дл  чего вакуумсушильный шкаф должен иметь прозрачное окно дл  наблюдени ), либо по времени, предварительно установленного в зависимости от используемой аппаратуры и конкретного режима выпаривани  из расчета выпаривани  до 1/3 объема. Выпаривание до 1/3 исходного объема метанолового экстракта достаточно дл  выпадани  осадка фосфатидного антигена без соосаждени  примесей.

Образовавшийс  осадок фосфатидного антигена отдел ют центрифугированием и раствор ют в хлороформе. К этому раствору добавл ют два объема ацетона дл  осаждени  фосфатидного антигена. Осажденный антиген промывают ацетоном и высушивают в вакуум-эксикаторе .

Полученный полуфабрикат (фосфатидный антиген) до проведени  операции сенсибилизации эритроцитов хран т в ампулах, запа нных под азотом, i Навеску фосфатидного антигена расвор ют в метаноле. Этот раствор добал ют по капл м в физраствор, после чего производ т выпаривание метанола при 50°С на магнитной мешалке до первоначального объема физраствора. Таким путем получают рабочий раствор фосфатидного антигена дл  сенсибилизации им эритроцитов, поскольку непосредственно в физрастворе фосфатидный антиген не раствор етс . Объем физраствора при приготовлении фосфатидной эмульсии зависит от требуемой концентрации фосфатидного антигена, обеспечивающей высокий титр противофосфатидных антител в соответствующих иммунных сыворотках и экономное расходование фосфатидного антигена. Целесообразно брать такое количество физраствора, чтобы весова  концентраци  фосфатидного антигена в нем составила 0,4 1 ,0 мЕ/мл. При этом дл  сенсибилизации используют 10%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов в объеме равном объему использованного дл 

приготовлени  фосфатидной эмульсии физраствора. самым обеспечиваетс  сенсибилизаци  эритроцитов, при соотношении ингредиентов: 0,41 ,0 мг фосфатидного антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

Операцию сенсибилизации провод т соединением равных объемов фосфатидной эмульсии и 10%-ныз4 формалинизированных эритроцитов с последующцм вьщерживанием данной смеси в течение 14 ч при 31°С припосто нном перемешивании. Затем производ т центрифугирование и отмывание осадка физраствором. Из осадка отмытых

Титр антител в иммунной кроличьей сыворотке в РИГА с туберкулезными- диагностиками, полученными сенсибилизацией эритроцитов различными дозами. фосфа1:идного аншигенй

сенсибилизированных эритроцитов приготавливают |10%-ную взвесь добавлением защитной среды. В качестве защитной среды может примен тьс  5%-ный раствор сахарозы, сахарозожелатиновый стабилизатор, 5%-ный пептон илим сопептонный бульон (МПБ) с добавлеТ1ием сахарозы и баратнр- нтарного буфера. В выбранной защитной среде целевой продукт подвергают лиофилизации.

Сведени  о предпочтительности режима сенсибилизации эритроцитов и выбора защитной среды прриведены в табл. 1 и 2

Таблица 1

0,1

О

+++

0,2

++

+++

0,3

+++

++

0.4

+++

+++

0,6

+++

+++

Титр антител в иммунной кроличьей сыворотке в РИГА с эритроцитарныг- диагностикумом, лиофилизированным в различных защитных средах

Сахароза

Сахарозо-желатиновый стабилизатор

+++

+++

+++

+++

++rf+++

+++ +++

Таблица 2

1:128 О

1:128 1:32 1:4

1:641:32 1:8

Пептон

25

МПБ.

Сахароза ОстальБаратно- нтарный ное 1:128 буфер

Данные табл. 1 иллюстрируют проведение операции сенсибилизации эритроцитов барана различными дозами фосфатидного антигена. Как видно из табл. 1 оптимальной сенсибилизирующей лозой  вл етс  0,4-0,6 мг/мл, так как меньша  доза не обеспечивает достаточного вы влени  антител, а-большие дозы привод т в неэкономному расходованию антигена.

Как видно из табл. 2, наиболее предпочтительной дл  лиофилизации и хранени  препарата  вл етс  защитна  среда следующего соста;ва:

М сопептонный бульон,

об.%25

Сахароза, вес.% 5

Боратно- нтарный.

буферОстальное

Лиофилизированный в этой среде препарат может хранитьс  3 года, тогда как при использовании других защит , ных сред срок хранени  не более 6 мес.

Используемые в предлагаемом способе штаммы  вл ютс  новыми только по отношению к выбранному прототипу. Они используютс  в указанной технологии получени  туберкулина При этом штамм Dt/St  вл етс  штаммом человеческого типа. Он получен из США (Г.Вашингтон, комисси  земледели ) и хранитс  в коллекции гаск им. Л.А.Тарасебича. Штамм Valu  вл етс  штаммом бычьего типа. Он получен из ЦНИИ туберкулеза и хранитс  в коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича . Ксерокопии паспортов штаммов прилагаютс .

Замена штаммов произведена в сВ зи с тем, что использовавшиес  в способе-прототипе штаммы, особенно ВСУ,приводили к вы влению антител, характеризующих, главным образом, поствакцинальный иммунитет, что снижает специфичность этого серологиПродолжение табл. 2

ческого теста. Кроме того, достигнутое использование одних и тех же штаммов как дл  приготовлени  туберкулина , так и предлагаемого туберкулезного диагностикума, дает возможность осуществить безотходное производство одновременно обоих (препаратов: при -этом в технологической схеме их получени  общей стадией будет культивирование продуцентов после чего из культуральной жидкости извлекают туберкулин, а из микробной массы (котора  ранее  вл лась отходом производства/ выдел ют фосфатидный антиген дл  предлагаемого получени  туберкулезного диагностикума .

Использование только одного из этих штаммов в предлагаемом способе так же, как и при получении туберкулина , недостаточно дл  полного вы влени  соответствующих антител у больных туберкулезом.

Обработка фосфатидного антигена хлороформом введена дл  растворени  целевого продукта, что позвол ет освободить его от нерастворимых в хлороформе балластных веществ, продуцируемых используемыми штаммами микобактерий туберкулеза. При этом всшным  вл етс  выпа)ивание метанолового экстракта не полностью, а только до по влени  осадка (в котором содержитс  фосфатидный антиген ) . Экспериментально установлено, что в противном случае (т.е. при полном выпаривании метанолового экстракта до получени  сухого осадка ) осадок приобретает темную окраску , что свидетельствует о соосаждении балластных пигментированных веществ, и не поддаетс  растворению в хлороформе. Возможно, что это требование обусловлено использованием названных штаммов. , 1:128 1:12в 1:128 1:64 1:64 Ирпользование в качестве сорбента эритроцитов позвол ет получить препарат в виде эритроцитарного туберкулезного диагностикума, так -как его примен ют не в РКА, а в реакции непр мой гемагглютинации (PHTAJ Кроме того, эритроцитарный диагностикум подлежит лиофилизации, что ув личивает срок его годности. Пример. Матрацы, предварите но простерилизованныё температурной обработкой, емкостью 1,5 л стерильн заполн ют синтетической питательной средой Линниковой и Могилевского из расчета по 600 мл на 1 матрац, рН среды равен 6,У-7,1. Одну поло вину матрацев засевают штаммом Dt/s а другую - штаммом Valu. Выращивани микобактерий туберкулеза в этих мат рацах производ т при 38°С в течение 6-е недель. В течение этого срока ежедневно посевы просматривают дл  вы влени  матрацев с росте посторонней флоры, которые отбраковывают и обеззараживают. Матрацы с 6-8-недельными хорошо выросшими туберкулезными ; культурами помещают в оцинкованные  щики, в которых обеззараживают эти культуры автоклавированием текучим паром в течение 1 ч при 120°С. Обеззара женные культуры смешиваю поштаммно путем сливани  их в 20литровые бутыли в равных объемах дл  каждого штамг а) . Дл  приготовле ни  фосфатидного антигена берут 1012 л смешанной культуры обоих штамMOB . Смешанную культуру фильтруют через асбестовые пластины дл  получени  микробных клеток, которые затем промывают 7 л дистиллированной воды и 3 л ацетона. После этого производит экстрагир вание ацетонорастворимых компонентов путем обработки одного объема микробной массы двум  объемами ацетона при в течение 3 ч, по истечении которых ацетон сливают. Данную операцию провод т дважды. Обработанные ацетоном клетки заливают , метанолом из расчета 0,5 л метанола на 50 г клеток и помещают на шуттель-аппарат в термостат при 37°G, осуществл   встр хивание реак ционной смеси в течение Ъ ч. Осадок отдел ют центрифугированием при фак торе разделени  F 1500 в течение 20 мин, после чего производ т повторное экстрагирование метанолом при тех же услови х. Метаноловые экстракты первого и второго извлечений объедин ют и выпаривают в вакуум-сушильном шкафу при 0,7 кгс/см и 50°С в тече- . ние 5 ч. За это врем  происходит упаривание раствора до 1/3 от перво начального объема, что достаточно дл  выпадени  осадка фосфатидного антигена без соосаждени  примесей. Осадок фосфатидного антигена отдел ют центрифугированием при указанном режиме, затем промывают ацетоном при , вновь центрифугируют и раствор ют в хлороформе из расчета на один объем использованного метанола 0,1 объема хлороформа . К хлороформенному раствору фосфатидного антигена добавл ют двойной объем предварительно охлажденного до ацетона. Выпавший оса- . док фосфатидного антигена отдел ют центрифугированием при том же режиме , промывают 3 раза ацетоном и высушивают в вакуум-эксикаторе при комнатной температуре в течение 48 ч. Выход сухого .фосфатидного антигена составл ет 2-2,5 г из 50 г микробных клеток.Фосфатидный антиген расфасосывают в ампулы по 10 мг и запаивают последние под азотом. Установлено, что в таком виде фосфатидный антиген может хранитьс  5 лет. Дл  сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана вз тую из ампулы навеску фосфатидного антигена Ь,О мг раствор ют в 3,О мл метанола . Этот раствор добавл ют по капл м к 12 мл 0,85%-ного изотонического раствора хлористого натри , после чего производ т выпаривание метанола на магнитной мешалке при 50°С до первоначального объема физраствора (т.е. до 12 МП . Полученные 12 мл фосфатидной , эмульсии соедин ют с 12 мл 10%-ных формалинизированных эритроцитов при посто нном перемешивании. При этом концентраци  фосфатидного антигена составл ет 0,5 мг на 1 мл 10%-ных формалинизированных эритроцитов (барана). Приготовленную смесь выдерживают 1ч в вод ной бане при 37°С и при посто нном перемешивании, Затем производ т центрифугирование взвеси при факторе разделени  F 2000, после чего осадок дважды отмывают от избытка антигена физраствором рН 7,0-7,2. Из осадка отмытых сенсибилизированных эритроцитов приготавливают 10%-ную взвесь добавлением 12 мл защитной средал следующего состава: М сопептонный бульон, : об.%is Сахароза, вес, 5 Боратно- нтарный буферОстальное Полученный жидкий препарат эритроцитарного туберкулезного диагностикума разливают по 1,0 мл в ампулы и замораживгиот до -70 С, после чего препарат лиофилизируют.. При указанном соотношении ингредиентов получают 12 ампул сухого эритроцитарного туберкулезного диагностикума с титрс л в РИГА с иммунной кроличьей сывороткой 1:128. Впервые в мировой практике получен эритроцитарный туберкулезный диагности1сум. Поскольку в насто щее врем  в клинической практике дл  диРезультаты серологичес основным группам обсле

211

68,72

Больные с за ,тикающим туберкулезом Как видно из табл. 3, всего обсле довано с применением получаемого предлагаемым способом препарата 386 чел., а с йрименением туберкулина 1106 чел. При этом РИГА с туберку лином ставили по методу Бойдена. Среди обследов.анных больных туберкулезом легких преобладали наиболее трудно диагностируеьдале клинические фор1/ы: диссеминированный, инфильтративный и очаговый туберкулез. Среди нетуберкулезных больных преобладали .больные с пнеамонн г и, которые имеют дифференциальное значение при диагностике туберкулеза легких. Математическую обработку данных таблицы производили на ЭЦВМ Минск658

54,795Ь ,66 62,45 агностики туберкулеза примен ют, как правило, туберкулин, наиболее принциписшьным  вл етс  сравнение эффективности использовани  полученного препарата с туберкулином. Данные дл  сравнительного анализа приведены в табл. 3. Таблица 3 реакций по ани  22. Достоверность различи  в сопоставл емых группах обследованных не ниже 5%-ного уровн  значимости. В то же врем  обнаружение антифосфатидных антител (что возможно с применением нового препарата) соответственно в основном активному . туберкулезному процессу, в чем и Состоит преимущество получаемого диагностикума перед туберкулином. Эритроцитарный туберкулезный диагностикум примен ют вРИГА, тогда как препарат, получаемый известным способом-, используют в реакции каолиновой агглютинации. Соответствуквдие данные приведены ь табл. 4.

Диагностика туберкулеза постановкой РИГА с эритроцитарным, диагностикумом и РКА по методу Такахаши

Больные aKTHBHfcJM туберкулезом легких

БольныеС затихающим

Как видно из табл. 4, при близкой веро тности диагностировани  туберкулезнойинфекции полученный препарат более чем в 2 раза реже дает положительную реакцию при обследовании больных с нетуберкулезными заболевани ми.

В табл. 5 представлены сведени  об активности получаемого предлагаемым способом промежуточного продук

Содержание антигена,.%

Таблица 4

68,7

70,2

та - фосфатидного антигена. Об активности -фосфатидного антигена можно судить по содержанию фосфора в препарате выделенного антигена. Содержание фосфора в полученном антигене определ ли по методу Чена.

. В табл; 5 приведено содержание фосфора в препаратах фосфатидного антигена, полученного известным и предлагаемым способами.

ТаблицаБ

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА, включающий культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом · с последующей сенсибилизацией им сорбента, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, культивируют микобактерии Dt/St и Valu, после метаноловой очистки фосфатидный антиген· выпаривают до появления осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют’ эритроциты из расчета U,4 1,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

   со

   QO сс >