SU1091069A1 - Polyamine determination method - Google Patents
Polyamine determination method Download PDFInfo
- Publication number
- SU1091069A1 SU1091069A1 SU823435633A SU3435633A SU1091069A1 SU 1091069 A1 SU1091069 A1 SU 1091069A1 SU 823435633 A SU823435633 A SU 823435633A SU 3435633 A SU3435633 A SU 3435633A SU 1091069 A1 SU1091069 A1 SU 1091069A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- polyamines
- carried out
- chromatography
- polyamine
- ratio
- Prior art date
Links
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N N,N-Diethylethanamine Substances CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims 1
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical class NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 4
- CYLJJGWXJNNBDU-UHFFFAOYSA-N 2-[2,3-bis(2-aminoethyl)phenyl]ethanamine Chemical compound NCCC1=CC=CC(CCN)=C1CCN CYLJJGWXJNNBDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WBNQDOYYEUMPFS-UHFFFAOYSA-N N-nitrosodiethylamine Chemical compound CCN(CC)N=O WBNQDOYYEUMPFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 description 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 238000012753 partial hepatectomy Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИАМИНОВ путем гомогенизации биологической ткани, данснлировани гомогената, экстрагировани дансилированных полиаминов с последующей тонкослойной хроматографией в системе растворителей , отличающийс тем, что, с целью ускорени способа, хроматографию провод т в системе paci(- ворителей бенэол-триэтиламин в соотношении METHOD FOR DETERMINING POLYAMINES by homogenizing biological tissue, dividing homogenate, extracting danzylated polyamines followed by thin-layer chromatography in a solvent system, characterized in that, in order to speed up the process, chromatography is carried out in the paci system (), the benol-trimethylamine system has been chromatographed ().
Description
3535
;о Изобретение относитс к биохимии и может быть использовано дл определени полиамннов в ткан х животных и человека. Известен способ определени поли аминов и их производных с помо1цью ферментативных реакций tl3 Известен также способ определени полиаминов с использованием флуорес цирующего реагента и последующей.хро матографией в тонком слое 23. Недостатком известного способа вл етс использование нескольких сложных раство4 ителей, что значитель но удлин ет врем проведени анализа Цель изобретени - ускорение способа . Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу определени полиаминов путем гомогенизации биоло гичес«ой ткани, дансилировани гомог ната, экстрагировани дансилированны полиаминов с последующей тонкослойной хроматографией в системе растворителей хроматографию провод т в системе растворителей бензол-триэтиламин в соотношении (5:t)-(5,5:1). Способ осуществл ют следующим обр зом. Дл анализа используют 33%-ный свежеприготовленный гомогеиат печени (соотношение массы ц объема 1:2). Ткань- гомогенизируют в 0,05 мМ фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 0,1 ммоль/л дитиотреитола (Serva, ФРГ) и 0,4 ммоль/л пиридоксальфосфата (Reanal, Венгри ). Все манипул ции с тканью провод т на холоде при . Экстрагирование полиаминов провод т равнь мобъемомО,2М НС1О4. Пробы центрифугируют при 5000 об/мин в тече ние 5 мин.К 0,1 мл супернатанта добавл ют 0,3 мл раствора дансилхлорида (Sch chardt, ФРГ) в ацетоне (4 мг/мл) и Ь мг Na COj-IO HjO. Пробы инкубируют 18-20 ч в темноте при комнатной температуре. Продукты реакции экстра гируют 0,5 мл бензола. Органический слой перенос т в коническую центрифужную пробирку и оставл ют выпариватьс на ночь при комнатной темпера туре а темноте. Осадок раствор ют в 20 мкл бензола и нанос т на пластинки ручного и пррмышленного изготовлени (Каvalier , Чехословаки ). Суспензию готов т с двойным количеством воды из расчета 28 г сухого силикагел марки ЛС 5/40 (Chemapol Чехословаки ) на 1 см2 поверхности. Св зывающим веществом вл етс гипс (5-15%) Пластины высыхает за ночь при комнатной температуре. Активирование провод т при в течение 30 мин. На остывшую пластину нанос т одновременно до .10 проб на рассто нии 2 см от нижнего и боковых краев. Готовые пластины Silufol UV-254 с подложкой из алки4иниевой фольги в качестве сорбента имеют широкопористый силикаг ль по Петри с люминесцентным индикатором. Св зывающим веществом служит крахмал. Однрмерную хроматографию провод т двукра тно в системе бензол-тризтиламин в соотношении 5:1-5 5:1 в течение 45 мин. Дансилпроизводные аминокислот и гидролизованный реактив остаютс на линии -старта. Избыток дансилхлорида не мешает идентификации п тен. П тна дансилполиаминов обнаруживают по желто-зеленому свечению в ультрафиолетовом свете. Идентификацию п тен фракций полиаминов провод т с помощью свидетелей - препаратов сол нокислых производных путресцина , спермидина и спермина (Sewa, ФРГ). Интенсивность флоуресценции измер ют пр мьш сканированием п тен на автоматизированном микроскопе-анализаторе ПРОТВА-С. Дл регистрации интенсивности излучаемого света используют интерференционный светофильтр №4-6 с длиной волны в максимуме пропускани ммк,шириной пропускани в середине максимума 10 ммк и коэффициентом пропускани 22%. Напр жение ФЭУ равно 700 В. Длину волны возбуждени 365 ммк получают с помощью фильтров УФС-6 (толщина 5 мм) и СЭС-24 (толщина 4 мм). В качестве источника света используют лампу ДРШ-250г-2. Концентрации полиаминов рассчитыают по калибровочным графикам и выажают в. нмоль/мг белка. Белок опреел ют; по Лоури. Пример 1. В качестве модели кани с повьш1енным митотическим инексом используют перевивные гепатоны -27 и 46, регенерирующую и мадигниирующую печень. Штамм гепатомы 46 ассируют на самцах мьш1ей линии ЗНА. Штамм гепатомы Г-27 пассируют , а крысах-самцах рандомбредногр разедени . Частичную гепатэктомию пронэвод т по методу Хиггинса и Андерсона . Малигнизацию печени крыс вызывают нитрозодиэтиламином (НДЭА). НДЭА ввод т внутрибрюшинно 1 раз в неделю в течение 2 мес. из расчета 100 мг на 1 кг веса животного. Всего каждому животному введено 154 мг канцерогена.The invention relates to biochemistry and can be used to determine polyamnn in animal and human tissues. A known method of determining polyamines and their derivatives with the aid of enzymatic reactions tl3. A method of determining polyamines using a fluorescent reagent and subsequent chromatography in a thin layer 23 is also known. A disadvantage of the known method is the use of several complex solutions, which significantly extends the time analysis The purpose of the invention is to accelerate the method. This goal is achieved in that according to the method of determining polyamines by homogenizing biological tissue, doping the homogeneous homogenous, extracting the dansylated polyamine followed by thin-layer chromatography in a solvent system, the chromatography is carried out in a solvent system of benzene-triethylamine in a ratio of (5: t) - ( 5.5: 1). The method is carried out as follows. For analysis, 33% freshly prepared liver homogeneity is used (mass ratio c volume is 1: 2). The tissue is homogenized in 0.05 mM phosphate buffer pH 7.2, containing 0.1 mmol / l dithiothreitol (Serva, HGF) and 0.4 mmol / l pyridoxal phosphate (Reanal, Hungary). All manipulations with the fabric are carried out in the cold at. The extraction of polyamines is carried out using an O, 2 M HCO 4 volume. Samples are centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. To a 0.1 ml supernatant, add 0.3 ml of dansyl chloride solution (Sch chardt, HGF) in acetone (4 mg / ml) and L mg of Na COj-IO HjO. Samples incubated for 18-20 h in the dark at room temperature. The reaction products are extracted with 0.5 ml of benzene. The organic layer is transferred to a conical centrifuge tube and allowed to evaporate overnight at room temperature in the dark. The precipitate was dissolved in 20 µl of benzene and applied to manual and industrial plates (Kavalier, Czechoslovakia). The suspension is prepared with a double amount of water at the rate of 28 g of dry silica gel of the brand LS 5/40 (Chemapol Czechoslovakia) per 1 cm2 of surface. The binder is gypsum (5-15%). The plate dries overnight at room temperature. Activation is carried out for 30 minutes. Up to 10 samples at a distance of 2 cm from the bottom and side edges are applied simultaneously to the cooled plate. Finished Silufol UV-254 plates with an substrate of alkylinear foil as a sorbent have wide-porous Petri silica gel with a luminescent indicator. The starch serves as a binding substance. One-dimensional chromatography was performed two-way in the benzene-triztilamine system at a ratio of 5: 1-5 to 5: 1 for 45 minutes. The dansyl derivatives of amino acids and the hydrolyzed reagent remain on the line of the start. An excess of dansyl chloride does not interfere with the identification of the spots. The spots of dansyl polyamines are detected by a yellow-green glow in ultraviolet light. Identification of polyamine pendent fractions was carried out with the help of witnesses — preparations of the acid derivatives of putrescine, spermidine, and spermine (Sewa, Germany). The intensity of flowrescence is measured by scanning the spots on an automated microscopy analyzer PROTVA-C. To record the intensity of the emitted light, an interference filter No. 4-6 is used with a wavelength at maximum transmission mmc, a transmission width in the middle of the maximum 10 mmc and a transmission coefficient of 22%. The PMT voltage is 700 V. The excitation wavelength of 365 mmk is obtained using filters UFS-6 (thickness 5 mm) and SES-24 (thickness 4 mm). As the light source using the lamp DRSh-250g-2. Concentrations of polyamines are calculated from calibration graphs and planted in. nmol / mg protein. Protein is determined; by lowry. Example 1. As a model of a Kani with augmented mitotic Inex, transplantable hepatons -27 and 46, regenerating and madigniruyusche liver. The hepatoma 46 strain is assayed in males of the pediatric line ALE. The hepatoma strain G-27 is passaged, and male rats are randomly separated. Partial hepatectomy was performed by the Higgins and Anderson method. Malignancy of rat liver is caused by nitrosodiethylamine (NDEA). NDEA is administered intraperitoneally 1 time per week for 2 months. at the rate of 100 mg per 1 kg of animal weight. In total, 154 mg of carcinogen was administered to each animal.
Животных забивают путем декапитации . Печень немедленно извлекают.Animals are slaughtered by decapitation. The liver is immediately removed.
Далее определение полиаминов провод т согласно предлагаемому способу с использованием бензол-триэтиламина в соотношении 4,5:1.Further, the determination of polyamines is carried out according to the proposed method using benzene-triethylamine in a ratio of 4.5: 1.
При этом вы влено: X,.- 0; путресцин - 0,32; Х2 - 0; спермидин - 0,37 и спермин - 0,42, где Х и Х -фракции неиндентифицированных аминов.In this case, it was revealed: X, .- 0; putrescine - 0.32; X2 - 0; spermidine - 0.37 and spermine - 0.42, where X and X are the fraction of non-identified amines.
Пример 2. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бензол - триэтиламин 5:1.Example 2. The definition of polyamines are carried out as in example 1, but with a benzene: triethylamine ratio of 5: 1.
При этом вы влено: Х - 0,22; путресцин - 0,30; Х - 0,37; сперМ1здин - 0,43; спермин - 0,54.In this case, it was revealed: X - 0.22; putrescine - 0.30; X - 0.37; sperm1 = 0.43; spermine - 0.54.
Пример 3. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бенэол-триэтиламин 5,5:1.Example 3. The definition of polyamines are carried out as in example 1, but with a ratio of benol-triethylamine 5.5: 1.
При этом вы влено: Х - 0,23; путресцин - 0,31; 2 - 0,37; спермидин 0 ,44; спермин - 0,53.In this case, it was revealed: X - 0.23; putrescine - 0.31; 2 - 0.37; spermidine 0, 44; spermine - 0.53.
Пример 4. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бензол-триэтиламин 6:1.Example 4. The definition of polyamines are carried out as in example 1, but with a benzene-triethylamine ratio of 6: 1.
При этом вы влено: Хи,- 0} путресцин - 0,32; X2 - 0; спермидин - 0,39; спермин - О,45.At the same time, it was revealed: Chi, - 0} putrescine - 0.32; X2 - 0; spermidine - 0.39; spermine - Oh, 45.
Таким образом, оптимальным дл хроматографического разделени указан ных полиаминов следует считать 5:15 ,5:1 интервалы соотношений компонен тов используемого растворител , при лтом из фракций дансилпроизводных полиаминов удал ютс загр зн ющие их вещества XL, и Х, а врем анализа сокращаетс в 4 раза по сравнению с известным способом.Thus, the optimum ratio for the chromatographic separation of the polyamines should be 5:15, 5: 1 intervals of the ratios of the components of the solvent used, with contaminants of the dansyl-derived polyamines removed, contaminants XL and X are removed, and the analysis time is reduced to 4 times compared with the known method.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU823435633A SU1091069A1 (en) | 1982-03-29 | 1982-03-29 | Polyamine determination method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU823435633A SU1091069A1 (en) | 1982-03-29 | 1982-03-29 | Polyamine determination method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1091069A1 true SU1091069A1 (en) | 1984-05-07 |
Family
ID=21010927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU823435633A SU1091069A1 (en) | 1982-03-29 | 1982-03-29 | Polyamine determination method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1091069A1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102650628A (en) * | 2012-05-18 | 2012-08-29 | 中国农业大学 | Method for quickly detecting biogenic amine |
| CN102788857A (en) * | 2012-08-03 | 2012-11-21 | 上海海洋大学 | Method for measuring biogenic amine in fresh chilled beef |
-
1982
- 1982-03-29 SU SU823435633A patent/SU1091069A1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Bachrach U. - Ital. J. Biochem, 1976, v 25, p. 77. 2. Seller N.. Askar A. - J.Chromatograf, 1971. v. 62. p. 121. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102650628A (en) * | 2012-05-18 | 2012-08-29 | 中国农业大学 | Method for quickly detecting biogenic amine |
| CN102650628B (en) * | 2012-05-18 | 2014-10-29 | 中国农业大学 | Method for quickly detecting biogenic amine |
| CN102788857A (en) * | 2012-08-03 | 2012-11-21 | 上海海洋大学 | Method for measuring biogenic amine in fresh chilled beef |
| CN102788857B (en) * | 2012-08-03 | 2014-04-09 | 上海海洋大学 | Method for measuring biogenic amine in fresh chilled beef |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abraham et al. | The distribution of homocarnosine in mammals | |
| EP0957365A4 (en) | FLUORESCENCE POLARIZATION PROCESS | |
| MX23524A (en) | METHOD FOR THE DETERMINATION OF AN ANALYSIS COMPOUND. | |
| DE2618419A1 (en) | HETEROGENIC SPECIFIC BINDING METHOD FOR DETERMINING A LIGAND IN A LIQUID MEDIUM AND MEANS OF PERFORMING IT | |
| ATE241140T1 (en) | METHOD FOR PREPARING A SAMPLE IN A SCANNING CAPILLARY FOR IMMUNOFLUORESCENCE STUDY | |
| DK314987D0 (en) | PROCEDURE FOR SPECIFIC DETERMINATION OF SERUM FRUCTOSAMINE CONTENT AND ITS SUITABLE REAGENT MIXTURE | |
| EP0423632B1 (en) | Substrates for hydrolases | |
| CN109187455B (en) | A kind of kit for detecting sulfite content in food and its application | |
| SU1091069A1 (en) | Polyamine determination method | |
| Susor et al. | [15] Fructose-diphosphate aldolase, pyruvate kinase, and pyridine nucleotide-linked activities after electrophoresis | |
| Wang et al. | Dual-enzyme assay of glutamate in single cells based on capillary electrophoresis | |
| US4716110A (en) | Composition for assaying hydrogen peroxide | |
| von Studnitz | Occurrence, isolation and identification of 3-methoxy-4-hydroxyphenylalanine | |
| Rowsell | [94b] Transaminases in animal tissue homogenates | |
| Solcia et al. | Indole nature of enterochromaffin substance | |
| Unemoto et al. | Studies on Polyamines. I. A New Fluorometric Determination of Spermine and Spermidine. | |
| Sibatani | Feulgen reaction and quantitative cytochemistry of desoxypentose nucleic acid V. Chemical determination of colour intensity of the reaction in situ | |
| RU2403551C1 (en) | Method to determine food value of worm-infested fishes | |
| EP0230762A1 (en) | Use of dry analytical elements to determine electrically separated analytes | |
| Budowle et al. | An alternative, effective substrate for erythrocyte acid phosphatase phenotype determinations | |
| RU2402763C1 (en) | Method for assessment of slaughter products quality | |
| GB2043244A (en) | A process for the determination of two or more components in a liquid sample and a reagent kit for carrying out such a photometric determination | |
| DE60036584T2 (en) | A PERMANENT FLUORESCENCE TEST PROCEDURE | |
| SU1129515A1 (en) | Method of qualitative determination of aminoethanol acid | |
| SU518702A1 (en) | Method for quantitative determination of ribonucleoside derivatives |