SU1122003A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 435,кодирующа синтез ДНК-лигазы фага Т 4.способ ее конструировани и штамм @ . @ ВКМ в-1449-продуцент ДНК-лигазыфага Т4 - Google Patents
Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 435,кодирующа синтез ДНК-лигазы фага Т 4.способ ее конструировани и штамм @ . @ ВКМ в-1449-продуцент ДНК-лигазыфага Т4 Download PDFInfo
- Publication number
- SU1122003A1 SU1122003A1 SU813332486A SU3332486A SU1122003A1 SU 1122003 A1 SU1122003 A1 SU 1122003A1 SU 813332486 A SU813332486 A SU 813332486A SU 3332486 A SU3332486 A SU 3332486A SU 1122003 A1 SU1122003 A1 SU 1122003A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- phage
- dna
- dna ligase
- gene
- ligase
- Prior art date
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 239000006187 pill Substances 0.000 title description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 82
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 claims abstract description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 52
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 51
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 2
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010063905 Ampligase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101710132699 Lysozyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 1
- 102100026848 Lysozyme-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000701980 Phage 434 Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000724762 Salmonella phage 5 Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- -1 adanite Chemical compound 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N keto-D-fructose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate group Chemical group [N+](=O)([O-])[O-] NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 108700026241 pX Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 101150103375 rex gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
1. Рекомбинантна плазмидна ДНК pILL435, кодирующа синтез ДНКлигазы фага Т4, состоит из следующих элементов: -плазмидна ДНК вектора pBR322, размер которой 4,36 тпо, -Hindlll-EcoRI - фрагмент, содержащий часть гена ДНК-лигазы фага Т4
Description
атб, после трансформации клеток E.coli отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу л мбда и из них вьщел ют,рекомбинантную плазмидную ДНК pILL435.
3. Штамм Escherichia coli ВКМ В - 1449Д (Всесоюзна коллекци микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) - продуцент ДНК- лигазы Лага ТА. .
Изобретение относитс к микробиологической промышленности и молекул рной биологии и представл ет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обусловливающую синтез ДНКлигазы фага Т4, способ конструировани данной рекомбинационной плазмидной ДНК и штамм, содержащий эту рекомбинантную плазмиду - суперпродуцент ДНК-лигазы фага Т4.
ДНК-лигаза фага Т4 - один из основны ферментов, используемых в генети ческой инженерии при конструировани гибридных молекул.
Известны рекомбинантные ДНК, определ ющие синтез ДНК-лигазы фага Т4. Описанна в работе плазмида включает ДНК векторной плазмиды pBR313 и фрагмент ДНК фага Т4, содержащий полный ген ДНК-лигазы с собственным промотором. Описанна рекомбинантна плазмида не обеспечивает достаточно высокий уровень лигазной активности (см. табл. 1).
В работе jYj был сконструирован рекомбинантный фаг Д , содержащий полный ген ДНК-лигазы фага Т4.
Эффективный синтез ДНК-лигазы фага Т4, осуществл емый с промотора РП , векторного фага, обусловливал в 300 раз более высокое содержание этого фермента в сравнении с клетками E.coli, инфицированными фагом 14. Однако одновременно в инфицированных клетках рекомбинантный фаг продуцирует сопутствующие ферменты, например Л -экзонуклеазу фермент, который значительно затрун ет очистку основного продукта.
Известный способ конструировани рекомбинантной плазмиды, содержаще ген ДНК-лигазы фага Т4, описанный в работе TQ , состоит в том, что фрагменты ДНК фага Т4, продуцируемые эндонуклеазой рестрикции Hindlll,
объедин ют с мультикопийной векторной плазмой pBR131, предварительно гидролизованной эндонуклеазой рестрикции Hindlll. Гибридными плазмидами трансформируют клетки E.coli lig ts7, у которых при повышенной температуре не функционирует ДНКлигаза . Трансформанты с искомыми рекомбинантными плазмидами выращива )т при температуре, непермиссивной дл роста клеток E.coli lig ts7 Из выросших клеток вьщел ют плазмидную ДНК, структуру которой исследую рестрикционным анализом. Было показано наличие в рекомбинантных плазмидах фрагмента размером 1,9 тпо (тыс ч пар оснований), включающего полный ген ДНК-лигазы фага Т4. Однако содержание этого фермента в клетках в этом случае низкое (см. табл. 1).
К недостаткам данного способа можно отнести также то, что дл конструировани рекомбинантной плазмиды не используют фрагменты ДНК, которые содержат промоторы, обеспечивающие высокий уровень синтеза ДНК-лигазы.
Примен емый в работе способ получени рекомбинантной ДНК предусматривает использование ДНК фага NM816 в качестве вектора. Фрагменты ДНК Т4, продуцируемые рестриктазой ЕсоRI при ограниченном гидролизе, ввод т в ДНК этого фага и отбирают фаги , которые размножаютс на E.coli lig ts7 при 37 С и образуют лизоген при 43 С. Были обнаружены рекомбинанты , содержащие ген ДНК-лигазы фага Т4. Эти рекомбинантные фаги получены введением в вектор трех EcoRI - фрагментов ДНК фага Т4, включающих полный ген ДНК-лигазы. Синтез ДНК-лигазы проходил после индукции профага, которую провод т следующим образом: лизогенные клет3
ки подращивают при температуре 30 С до титра 3,510 кл/мл, инкубируют 15 мин при 43°С, затем культивируют клетки при 37°С в течение 3 ч. Однако способ конструировани рекомбинантного фага л мбда с полным ген лигазы не обеспечивает получени штамма E.coli с достаточно высоким содержанием ДНК-лигазы фага Т4.
Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей полный ген ДНК-лигазы фага Т4 и регул торную область фага л мбда, в литературе не описан.
Известны следующие штаммы-продуценты ДНК-лигазы фага Т4 (см. табл. 1)
а)клетки E.coli В, инфицированн фагом Т4 am N82, которые содержат п нашим данным 168 единиц фермента на грамм биомассы;
б)штамм T.coli К802, несущий плазмиду pTFH301 2 с Hindlll фрагментом ДНК фага Т4, включающим ген ДНК-лигазы фага Т4. Штамм имеет низкий уровень синтеза фермента lj;
в)штамм E.coli NM989 вл етс производным от штамма E.coli АА125, лизогенным по фагу -7 с 1857 W am 403 Е am 1100 S amlOO Т4 lig, который несет ген ДНК-лигазы фага Т4 2 и обеспечивает при термоиндукции уровень синтеза ДНК-лигазы фага Т4, равный 4800 единиц на грамм клеток.
Уровень синтеза ДНК-лигазы Т4 в перечисленных штаммах недостаточн высок. Кроме того, перечисленные штаммы (а) и (в) продуцируют сопутствующие ферменты, которые усложн ют способ получени ДНК-лигазы, что увеличивает врем очистки и снижает выход конечного продукта.
Целью предлагаемых объектов изобретени вл етс увеличение содержани ДНК-лигазы фага Т4 в клетках бактерий.
На фиг. 1 изображена схема рекомбинантной плазмидной ДНК pILL 435 с рестрикционной и генетической картами (Р.- - обозначение основных промоторов и направление транскрипции ) ; на фиг. 2 - электрофореграмма фрагментов ДНК рекомбинантной цлазмиды pILL 435, полученных при гидролизе эндонуклеазами рестрикции Bglll (1), EcoRI (2),HindIII (3) и при совместном гидролизе Ват HI и Hpal (4), Hindlll и EcoRV (5), Sail и Hpal (6); электрофореграмма Bam HI - Фрагментов ДНК Ti. (7) ,
20034
EcoRII - фрагментов ДНК pBR 322 (8) , BamHI - Bgl 11 - фрагментов ДНК pIL 203 (9) ; слева приведены размеры фрагментов ДНК рILL 435, справа отмечены J размеры маркеров (в тыс. пар оснований) ; на фиг. 3 - схема конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК pILL 435, обеспечивающей синтез ДНК-лигазы Т4; на фиг. 4 - электро0 фореграмма частично очищенных с помощью фосфоцеллюлозы Р-11 (пример 1) белков из экстрактов клеток: Е. coli АА125/рВР 322 lig 35 (2) Е. coli AAI25 (Т4 lig С1857 5 Wam 403 Eam 1100 Sam 100) (3) Е. coli AA125/pILL 435 (4) Электрофореграмма очищенного фермента ДНК-лигазы Т4(5)
0 и белковых маркеров с обозначенными размерами (1) Рекомбинантна плазмидна ДНК pILL435, кодирующа ДНК-лигазу фага Т4, состоит из следзтощих элемен5 тов:
-плазмидна ДНК вектора pBR322, размер которой 4,36 тпо,
-Hindlll-EcoRI - фрагмент, содержащий часть гена ДНК-лигазы фага Т4 (0,7 тпо) ,
0
-два EcoRI - фрагмента ДНК фага Т4 (0,5 и 0,4 тпо), включающие часть гена ДНК-лигазы Т4 с собственным промотором,
-EcoRI-EcoRV - фрагмент ДНК фага 5 л мбда (1,6 тпо) из района между
26780 и 27800 парами нуклеотидов генома фага .
-BamHI-Bglll - фрагмент фага л мбда (1,2 тпо), содержащий Р, промотор
0 и интактный ген N фага л мбда,
-два Bglll - фрагмента (2,4 и
0,6 тпо), содержащие гены регул торов транскрипции с ранних промоторов фага л мбда с мутаци ми с 1857 5 (ts) и его атб и промоторы Р„ , Р,,„,
RE КК RМолекул рна масса гибридной плазмиды pILL435 равна 7,1 Мд (размер 11,1 тпо) (фиг. 1,2).
0 Дл достижени цели используют способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей ДНКлигазу фага Т4, заключающийс в том, что смесь плазмидной ДНК pBR322
5 и ДНК фага i NM816-I подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции Hindlll и EcoRV, образовавшиес фрагменты соедин ют
5
ДНК-лигазой, затем полученной смесью трансформируют клетки E.coli lig ts7, трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших при непермиссивных услови х клонов выдел ют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полный ген ДНК-лигазы фага Т4, затем полученную ДНК гидролиззпот эндонуклеазой рестрикции BamHI, продукты гидролиза с помощью ДНК-лигазы соедин ют с BamHI и BglII-фрагментами ДНК фага Д с 1857 его атб, после трансформации клеток E.coli отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу л мбда и из них вьщел ют рекомбинантнута плазмидную ДНК plLL435 (фиг, 3).
Выбор штамма E.coli lig ts7 обусловлен тем, что клетки E.coli lig ts7, содержащие рекомбинантные плазмиды с интактным геном ДНК-лигазы Т4, способны расти при 43 С в отличие от клеток E.coli lig st7, не содержащих рекомбинантные плазмиды с полным геном ДНК-лигазы фага Т4.
Дл достижени цели используют штамм Escherichia coli ВКМ В-1449Д (Всесоюзна коллекци микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) - продуцент ДНК-лигазы фага Т4.
Штамм-продуцент ДНК-лигазы фага Т4 получен трансформацией клеток E.coli АА125 плазмидой pILL435. Содержание ДНК-лигазы фага Т4 в сконструированном щтамме равно 50000 единиц на 1 г биомассы клето Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ В-1449Д.
Штамм Escherichia coli ВКМ В-1449Д характеризуетс следующими признаками.
Морфологические признаки: клетк пр мые, палочковидной формы 1,21 ,6 X 2,0 X 6,0 мк, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные , неспороносные.
Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на м со-пептонном агаре, питательном агаре Дифко - колонии гладкие, круглые прижаты, блест ш е, серые, край роный , мутные. При росте в жидких средах - м со-пептонном бульоне, LB-бульоне образует ровную интенсивную муть.
220036
Физиолого-биохимические признаки: клетки растут в пределах от 4 до 45°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: d-глюкозу, d-фруктозу, арабинозу, лактозу, трегалозу. Не усваивают ацетат, аданит, галактозу. В ка10 честве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот . -Нитраты восстанавливают до 15 нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют. Уреазна активность не обнарз живаетс .
Устойчивость к антибиотикам: про вл ет устойчивость к ампициллину, 20 обусловленную наличием плазмиды pILL435.
Штамм E.coli ВКМ В-1449Д про вл ет иммунитет к суперинфицирующему фагу л мбда.
П р и ме р 1. Клетки бактерий E.coli К802, содержащие плазменную ДНК pBR322, выращивают в 10 мл бульона до титра 1x10 кл/мл. Клетки
осаждают центрифугированием (5.000g, 5 мин, +4°С) и ресуспендируют в 0,1 мл лизирующего раствора (лизоцим - 2 мг/мл, трис-НС1, рН 8,025 мМ, ЭДТА - 10 мМ, глюкоза - 50 мМ), выдерживают 5 мин при О С. Далее прибавл ют 0,2 мл раствора (ifeOH 0 ,2 N, додецилсульфат натри - 1%) и перемешивают до осветлени лизата. 150 мкл раствора 3 М ацетата натри (рН 4,8) внос т в осветленный лизат,
Q осторожно перемешивают до заметного снижени в зкости раствора, выдерживают 1 ч при +4 С и образовавшийс осадок отдел ют центрифугированием (lOOOg, 5 мин, +4 С). К полученному
. супернатанту добавл ют 2,5 объема охлажденного при -40 С этилового спирта и выдерживают 2 ч при -40 С. Образовавшийс осадок собирают, центрифугированием (5000g, 5 мин, 20 С) и ресуспендируют в 0,2 мл буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).
Препарат вирионов фага NM816-1 получают инфекцией экспоненциально растущей культуры E.coli СбОО с множественностью 1 в среде LB (10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта , 10 г NaCl на 1 л воды), содержащей Ю М MgSO. Лизис клеток завершают добавлением в среду хлоро7
форма (1:100). После удалени обломков клеток центрифугированием (бОООо, 30 мин, 4°С) клеточные ДНК и РНК лизата гидролизуют одновременно панкреатическими ДНКазой и РНКаз ( по 10 мкг/мл) при 20 С, 1 ч. Первиную очистку и концентрирование фага провод т с помощью полиэтиленгликол 6000 (Jomamoto К. R. et al., Virology, 40, 734-744, 1970). Окончательную очистку фага провод т равновесным центрифугированием в 4 М CsCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,01 М MgCl2 (Wilson G..G. et al., Моlec .Gen.Genet., 156,203-214, 1977). Очищенный препарат фага NM16-1 диализуют против буфера (10 мМ трисHG1 , рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).
ДНК фага NM816-1 выдел ют фенольным меотодом (Тан шин В. И. и др.. Мол. биол., 6, 803-815, 1974). Концентрацию ДНК фага и плазмиды определ ют спектрофотометрически при 260 нм с использованием коэффициент экстинкции 0,02 . Плазмидную ДНК выдел ют по методу Birnboim К. С Doly J., Nucl.Acids Res., 1979, 7, N 6, 1513-1523.
Полученные препараты ДНК плазмид pBR322 и фага NM816-1 используют дл конструировани рекомбинантной плазмиды pBR322 lig 35 (схема фиг. 3) , которое провод т следующим образом: 0,5 мкг ДНК плазмиды pBR322 смещивают с 3 мкг ДНК фага NN816-1 и инкуби-руют с эндонуклеазами рестрикции Hindlll (5 ед.) и EcoRV (5 ед.) в буфере А (50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2меркаптоэтанол ). Реакцию провод т при 37 С 1 ч. После инкубации смесь прогревают при 65-70 С 10 мин. Анализ полноты гидролиза провод т с помощью электрофореза. Соединение фрагментов ДНК плазмиды и фага провод т в буфере А с добавлением АТФ и дитиотреитола до конечной концентрации 0,5 мМ и 5 мМ соответственно , и ДНК-лигазы фага Т4 (3000 ед/мл из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК 8-10 ч при В С, затем смесь развод т в 10 раз буфером А с повторным добавлением ДНКлигазы фага Т4 и инкубируют смесь 10 ч. Полученную смесь рекомбинантных плазмид используют дл трансформации клеток E.coli lig ts7. Трансформацию провод т следующим образом: 0,1 мл суспензии клеток
03
E.coli lig ts7 внос т в 10 мл питательного бульона LB и выращивают до титра 3x10 кл/мл. После 10-минутного охлаждени () клетки
собирают центрифугированием (5000g, 10 мин, 0°С), суспендируют в 10 мп 0,1 М раствора CaCl2 и вьщерживают 1 ч. Клетки повторно центрифугируют (5000g, 10 мин, О С), затем ресуспендируют в 0,5 мл 0,1 М CaClg
(О С) и используют дл трансформации через 10-15 ч.
Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с компонентными (обработанными СаС) клетками 1 ч при
О С и 10 мин при комнатной температуре (18 - 22 С). После дес тикратного разбавлени бульоном LB трансформированные клетки подращивают 2 ч
и высевают на агаризованную среду LB с ампициллином (20 мкг/мл). Трансформанты отбирают при непермиссивной дл исходных клеток E.coli lig ts7 температуре (43 С). Из
клеток, выросших за 24 ч клонов, выдел ют плазмидную ДНК по методике, описанной выше.
Плазмидную ДНК, содержащую полный ген ДНК-лигазы фага Т4 и обозначенную pBR322 Iig35, использ тот в качестве реципиента при конструировании плазмиды pILL435 (схема фиг . 3). В качестве донора регул торной области фага л мбда используют ДНК фага с 1857 его атб. Препарат вирионов этого фага получают термоиндукцией лизогенной культуры E.coli СбОО (Л с1857 его атб), которую провод т следующим образом: лизогенную культуру подращивают при 30 С до титра 3x10 кл/мл, затем инкубируют при 43 С 15 мин и продолжают выращивание при 37 С 1 ч с эффективной аэрацией . Лизис клеток завершают добавлением в среду хлороформа (1/100). Дальнейшую очистку фага и вьщеление ДНК провод т по методике, описанной в этом примере выще.
Полученные препараты ДНК плазмиды pBR322 Iig35 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI, а ДНК фага с1857 его атб гидролизуют одновременно эндонуклеазами рестрикции BamHI и BgllT. Полученные фрагменты ДНК плазмиды и фага смешивают в соотношении 1:10 и соедин ют ДНК-лигазой фага Т4 по методике, описанной выше (схема фиг. 3). После трансформации компетентных клеток E.coli К802 отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу л мбда. В данном эксперименте используют фаги, перечисленные в табл. 2. Из клеток клонов, обеспечивающи иммунитет- к фагу л мбда, известным методами выдел ют плазмидную ДНК, обозначенную нами pILL435 и содержащую в своем составе три фрагмент области иммунитета фага л мбда, которые образуютс при совместном гидролизе фаговой ДНК эндонуклеаза ми рестрикции BamHI и Bglll (фиг. 1 и 3) . Анализ генетических маркеров в р комбинантных плазмидах провод т сле дующим образом. Резистентность к ампициллину кле ток штамма E.coli lig ts7, содержащих плазмиду pILL 435, анализируют н агаризованной среде с содержанием ампициллина от 10 до 100 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с этой концентрацией ампициллина. Наличие в клетках, содержащих плазму pILL435, репрессора фага л мбда, обусловливающего иммунитет клеток к суперинфицированию гомоим мунными фагами л мбда, устанавливают следующим образом: клетки и отдельных колонов высеваю.т в 1 мл МПБ и после выращивани до титра 210 - 6-10 кл/мл нанос т микробиологической петлей на чашку с твердым агаром в виде полосы; посл 5-минутного подсушивани (20С) аккуратно нанос т петлей суспензию различных фагов с титром 1-5х х10 б.е./мл и затем инкубируют при 6-8 ч. Дл проверки наличи репрессора используют сЬаги 434 imir 7 /vimmZl , Tib, Ас126, / с1857, vir, i 1тат434, а также фаги и Т4 rll. Результ ты исследовани даны в табл. 3. Знаком + отмечены фаги, способные размножатьс на анализируемой куль туре . Из результатов, приведенных в табл. 3, следует, что плазмида pILL435 действительно содержит ген области иммунитета фага л мбда. От сутствие роста фага Т4 rll на штам ме, содержащем плазмиду pILL435, доказывает наличие в плазмиде функ ционирующего гена rex фага л мбда. Дл анализа одновременного присутстви мутаций в генах с1 и его провод т рекомбинацию in vivo меж 0310 ду плазмидами и фагом f с, который образует негативные колонии с мутным центром за счет эффективной лизогенизации. Штаммы, содержащие плазмиды, выращивают в 10 мл бульона до титра 1,6x10 кл/мл, при 30°С инфицируют фагом Л iinm434 с множественностью 0,1, инкубируют при 30 С 4 ч, добавл ют 1/100 часть (об/об) хлороформа и титруют на бактериальных газонах с клетками, содержащими и не содержащими фаг 434 в состо нии профага. Образование рекомбинантов дополнительно указывает на присутствие регул торной области фага л мбда с1 в гибридных плазмидах pILL435. Гибридный фаг, полученный при рекомбинации с плазмидой pILL435, образует на газоне клеток E.coli о С600 при 37 С прозрачные негативные колонии, а при 30 С - мутные, что указывает на наличие термочувствительной мутации в гене с1 плазмиды PILL435. Анализ наличи в гибридных фагах супрессируемой мутации в гене его провод т сравнением эффективности титровани того фага на штаммах E.coli с различными супрессорньми мутаци ми при 30 и 43°С. Результаты анализа (см. табл. 3) указывают на одновременное присутствие в плазмиде pILL435 мутаций в генах его и с1 , а также на различную степень супрессии этих мутаций в зависимости от типа супрессора, присутствующего в штамме (Oppenheiro А., Oppenheim А. В. Virology, 75, 469-476, 1976). Из данных этой таблицы, следует, что гибридна плазмида pILL435 действительно содержит фрагмент ДНК фага л мбда с мутаци ми с 1857 и сгоб. Клетки штамма E.coli lig i:s7 из-за наличи термочувствительной мутации в гене бактериальной лигазы не способны расти при температуре 43°С. Трансформаци клеток E.coli lig ts7 плазмидой pILL435 и последующие проверки роста трансформаторов при 30, 36, 43 С показывают, что клетки штамма E.coli lig ts7, содержащие плазмиду pILL435, приобретают способность расти при 43с. В целом клетки E.coli lig ts7, содержащие рекомбинантные плазмиды
n
pILL435, обладают следующими признаками:
Резистентность к ампициллину;
Иммунитет к фагам J cl 26,, г, 434immA, с 1857;
Не способны поддерживать размножение фагов Т4 rll;
Способны к росту при 43 С.
Определение активности ДНК-лигазы фага Т4,
0,5 г биомассы E.coli БКМ В-1449 суспендируют в 3 мл лизирующего буфера 0,2 М NaCl, 0,05 М трис-НС1 рН 7,5, 0,001 М восстановленного глютатиона, 100 мкг/мл лизоцима, выдерживают при ОС 10 ч, озвучивают ультразвуком 4 раза по 30 с при О С, затем центрифугируют (22300g, 2 ч, О С). Супернатант нанос т на колонки с фосфоцеллюлозой Р11 (0,5 мл), предварительно уравновешенные буфером М (0,2М NaCl, 0,05 трис-НС, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол промывают этим буфером, фракции с активностью ДНК-лигазы злюируют буфером В, содержащим О,7 М NaCl. Элюат собирают по 0,5 мл и в каждой фракции определ ют активность ДНКлигазы .
Реакционна смесь (20 мкл) содержит 5 пикомолей П-АТФ (40 Ки/мМ), 10 CaClg, 50 мМ трис-НС, рН 7,5, 10 мМ дитиотреитола, 1 мМ ЭДТА и от 2 до 15 мкл отдельных фракций, элюированных с колонки. Пробы инкубируют при 20°С 5 мин. Реакцию останавливают перенесением на фильтр Whatman 3 мМ с последующим немедленным погружением фильтра в холодный раствор 5%-ного ТХУ с 1%-ным пирофосфатом натри . После инкубации (15 мин при О С) раствор сливают , замен ют свежим и выдерживают при О С 10 мин. Фильтры промывают последовательно холодной водопроводной водой, спиртом, ацетоном, высушивают на воздухе и просчитывают радиоактивность в сцинтилл ционном счетчике. За 1 единицу фермента принимают количество ДНК-лигазы фага Т4, необходимое дл образовани АМФ-лигазного комплекса с 1 пи
комолем Н-АМФ. При определении активности в штамме фракции, содержащие фермент , объедин ют, развод т пробы и считают активность, учитыва разведение.
Кроме того, уровень синтеза ДНКлигазы фага Т4 анализирзтот электро200312
форетически известными методами (Murray N. Е. et al., J. Mol.Biol., 132, 493-506, 1979) в каждой отдельной и объединенных фракци х г злюата (фиг. 4).
Пример 2. Ппазмиду pILL435 формируют в щтамм E.coli АА125 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм-продуцент ДНК-лигазы
Q фага Т4 с активностью не менее 50000 ед/г биомассы клеток.
Дл сравнени в табл. 4 приведены значени уровней синтеза ДНК-лигазы фага Т4 в различных штаммах E.coli,
. содержащих рекомбинантную плазмидную ДНК pILL435.
Предлагаемые изобретени позвол ют получить штамм E.coli - продуцент ДНК-лигазы фага Т4. Уровень синтеза фермента в предлагаемом
0 штамме E.coli АА125, содержащем рекомбинантную плазмиду pILL435, не менее 50000 единиц на 1 г сырого веса биомассы клеток, что в 10 раз
2 выше уровн синтеза этого фермента в сравнении с лучшим из известных штаммов - E.coli NM989 (базовый объект, описанный в работе Murray N. Е. et al., J. Mol. Biol,, 132, 493, 1979). Полученный положи0 тельный эффект предлагаемых изобретений достигаетс за счет свойств сконструированной новым способом плазмиды pILL435 с полным геном ДНК-лигазы фага Т4. Плазмида pILL435
содержит раннюю область фага
1с1857 его атб, что обеспечивает эффективный регулируемый синтез ДНК-лигазы фага Т4, осуществл емый под контролем раннего промотора
фага л мбда Р, (см. фиг. 1).
В данной плазмиде в отличие от ДНК фага NM989, используемого ранее , отсутствует ген 5 -экзонуклеазы и другие фаговые гены, продукты
5 которых затрудн ют последующую очистку целевого продукта. В СССР и в других лаборатори х мира дл получени ДНК-лигазы до насто щего времени плазмида, определ юща синтез
0 ДНК-лигазы фага 14, не использовалась .
Предлагаемый способ конструировани плазмид дает возможность получить рекомбинантную плазмидную ДНК,
5 обеспечивающую увеличение синтеза ДНК-лигазы фага Т4. Использование Hindlll-EcoRV - фрагмента ДНК фага NM816-1 позвол ет выделить полный
13
ген ДНК-лигазы с собственным промотором и расположить его в непосредственной близости от промотора Р , Регул ци транскрипции с данного промотора осуществл етс генами регул торами с 1857 и его атб, вход щими в состав области иммунитета фага А . Плазмида pILL435 - автономСравнение уровней синтеза ДНК-лигазы бактериофага Т4 в различных штаммах
Штамм-продуцент
E.coli Б, инфицированный бактеТ4 am NB2 риофагом
E.coli 802, содержащий плазмидную pTFN3012 ДНК (1,9 тпо)
E.coli 802, содержащий плазмидную pBR3221ig35 ДНК (2,9 тпо)
E.coli NM989
E.coli АА125, содержащий плазмидpILL435 ную ДНК (ВКМ В-1449Д)
Определение активности ДНК-лигазы проводилось по методу Кнопфа (см. пример 1), Knopf R.W., Eur. J. Biochem., 73, 33-38, 1977.
Анализ генетических маркеров в клетках, содержащих и не содержащих рекомбинантную плазмиду pILL435
Плазмида PILL435
Плазмида
pILL435
отсутствует
б.е./мл - бл шкообразующие единицы в мл.
2200314
но реплицирующа с система, не нуждающа с подобно лизогенным фагам в индукции. Поэтому штамм, содержащий данную плазмиду, культивируетс при
5 посто нной температуре и не требует ступенчатого изменени температурных режимов при выращивании биомассы клеток.
Таблица 1 E.coli
Активность, ед/г биомассы
Таблица
Эффективность титровани фагов л мбда с мутаци ми в генах репрессоров в различных услови х
Бактериофаг30/38 АЗ/Зб
W3350 С600 QD 5003 W 3350 С600 QD5003
АС18571,0 1,0 1,0 , 1,0 1,0 1,0
(cl857 его атб 0,05 0,47 - 0,03 0,15 Д1тт434 X pILL435 0,052 0,4 0,08 0,05 0,1 0,01
--- - ----.-- - - -«в ...-,.- -..«..,,.
отношение титров фага при температуре 30 и 38 С; отношение титров фага при температурах 43 и 38 С.
Уровень синтеза ДНК-лигазы фага Т4 в различных штаммах E.coli, содержащих рекомбинантную плазмидную ДНК pTLL435
Но-ШтаммАктивность
меред. Кнопфа
1E.coli QD5003/pILL43510000
2E.coli Sul/pILL43517000
3E.coli 802/pILL43540000
4E.coli C600/pILL43544000
5E.coli AA125/pILL435 BKM В-1449Д50000
Штаммы получены трансформацией плазмиды pILL435 (см. пример 1).
Таблица 4
Фрагменты ДНК
фагаТ4 m ФагаЛЫМ816-1
pBR 322
фага ЛС1857 CROame
Bglil
1234 567S9
щщ;щр§а. 1ШШ111ШШ Ш Ш Й|111|||11Vj „«sif ГЙ m m л
. Vl v.- -
Фиг. 2
iii
1,0
Mt
%i ШШ 0,9
0,6
Ш
Ш
йШг:
-..,.iiv,-4;-U.W:--}-.
teisswi wSS,j;. . ,..Ш:§йад5ж №йг лп:1 й йШ й;йщЩй :5;й-.-Ч-;; Г- г :А л ; 1| S li ifiSSl Li; .«i ,, й ;,4«4йч;-й-й.-ж: .. .Й;| й;:-Ж«й 1. lrS,4.:«S- -;i. :g;-: ;r vMdf.Kf- 5SS5S f: «бл..--.; ;й;;йШ«
2 3
4 5
94К g
67 К
т
43 К
ЗОК i
Ш
5й
Claims (3)
1 . Рекомбинантная плазмидная ДНК pILL435, кодирующая синтез ДНКлигазы фага Т4, состоит из следующих элементов:
- плазмидная ДНК вектора pBR322, размер которой 4,36 тпо,
- Hindlll-EcoRI - фрагмент, содержащий часть гена ДНК-лигазы фага
Т4 (0,7 тпо),
- два EcoRI фрагмента ДНК фага Т4 (0,5 и 0,4 тпо), включающие часть гена ДНК-лигазы Т4 с собственным промотором,
- EcoRI-EcoRV - фрагмент ДНК фага лямбда (1,0 тпо) из района между 26780 и 27800 парами нуклеотидов генома фага лямбда,
- BamHI-Bglll - фрагмент фага лямбда (1,2 тпо), содержащий Рц промотор и интактный ген N фага лямбда,
- два Bglll фрагмента (2,4 и 0,6 тпо), содержащие гены регуляторов транскрипции с ранних промоторов фага лямбда с мутациями cl857(ts) и его атб и промоторы Р^£, Р^м, Р^,
- фрагменты содержат следующие гены: Ъ1а - ген, обеспечивающий синтез β-лактамазы, lig Т4 - ген ДНК-лигазы фага Т4, N - ген фага лямбда - антитерминатор транскрипции, гех - ген, запрещающий размножение rll мутантов фага Т4, cl - репрессор фага лямбда, его - второй репрессор Фага лямбда и промоторы Р^р , Г, , Рг , р р Λ rm’ fiq’
- молекулярная масса рекомбинантной плазмидной ДНК равна 7,1 Мд (размер - 11,1 тпо).
2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pILL435, кодирующей синтез ДНК-лигазы фага 14, заключающийся в том, что смесь плазмидной ДНК pBR322 и ДНК фага ΆΝΜ 816-1 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции HindIII и EcoRV, полученные фрагменты соединяют ДНК-лигазой, затем смесью рекомбинантных молекул трансформируют клетки E.coli lig ts7, трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших при непермиссивных условиях клонов выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полный ген ДНК-лигазы фага Т4, затем полученную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции BamHI, продукты гидролиза с помощью ДНК-лигазы соединяют с BamHI-Bglll фрагментами ДНК фага 2 с 1857 его атб, после трансформации клеток E.coli отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу лямбда и из них выделяют,рекомбинантную плазмидную ДНК pILL435.
3. Штамм Escherichia coli ВКМ В - 1449Д (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) - продуцент ДНК- лигазы Фага Т4. .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU813332486A SU1122003A1 (ru) | 1981-08-06 | 1981-08-06 | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 435,кодирующа синтез ДНК-лигазы фага Т 4.способ ее конструировани и штамм @ . @ ВКМ в-1449-продуцент ДНК-лигазыфага Т4 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU813332486A SU1122003A1 (ru) | 1981-08-06 | 1981-08-06 | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 435,кодирующа синтез ДНК-лигазы фага Т 4.способ ее конструировани и штамм @ . @ ВКМ в-1449-продуцент ДНК-лигазыфага Т4 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1122003A1 true SU1122003A1 (ru) | 1985-12-15 |
Family
ID=20974793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU813332486A SU1122003A1 (ru) | 1981-08-06 | 1981-08-06 | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 435,кодирующа синтез ДНК-лигазы фага Т 4.способ ее конструировани и штамм @ . @ ВКМ в-1449-продуцент ДНК-лигазыфага Т4 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1122003A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2413767C1 (ru) * | 2009-10-16 | 2011-03-10 | Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН | Термостабильная днк-лигаза из археи рода acidilobus |
-
1981
- 1981-08-06 SU SU813332486A patent/SU1122003A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Velten J., Abelson J. J. Nol. Biol., 1980, 137, 235-248. Wilson G. G., Murray N. E. J. Mol. Biol., 1979, , 471-492. Panet A. et al., Biochemistry, 1975, 12, 5045-5050. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2413767C1 (ru) * | 2009-10-16 | 2011-03-10 | Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН | Термостабильная днк-лигаза из археи рода acidilobus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lindgren et al. | An ice nucleation reporter gene system: identification of inducible pathogenicity genes in Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. | |
| DK175477B1 (da) | Fremgangsmåde til integration af et gen eller en DNA-sekvens i en bakteries chromosom eller episom samt bakterie frembragt ved fremgangsmåden | |
| Buckel et al. | Expression of Pseudomonas fluorescens D-galactose dehydrogenase in E. coli | |
| JPS6143989A (ja) | 組み換えｄｎａプラスミドとその保持細菌 | |
| KR100312456B1 (ko) | 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자 | |
| EP0057976B1 (en) | a process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| Eriani et al. | Isolation and characterization of the gene coding for Escherichia coli arginyl-tRNA synthetase | |
| Duncan et al. | Transformation of Bacillus subtilis and Escherichia coli by a hybrid plasmid pCD1 | |
| Takeda et al. | Synthetic ColE1 Plasmids carrying genes for penicillin-binding proteins in Escherichia coli | |
| US4374200A (en) | Broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| Dardonville et al. | Characterization of malT mutants that constitutively activate the maltose regulon of Escherichia coli | |
| KR100262258B1 (ko) | 고도로 정제된 재조합 역전사효소 | |
| Scott et al. | Non-Mendelian inheritance of macronuclear mutations is gene specific in Paramecium tetraurelia | |
| SU1122003A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 435,кодирующа синтез ДНК-лигазы фага Т 4.способ ее конструировани и штамм @ . @ ВКМ в-1449-продуцент ДНК-лигазыфага Т4 | |
| Szabó et al. | Sub-terminal sequences modulating IS30 transposition in vivo and in vitro | |
| CN114525293B (zh) | 新型CRISPR-Cas9抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法 | |
| Friedberg et al. | A new hybrid plasmid capable of transforming Escherichia coli and Anacystis nidulans | |
| US5565333A (en) | Plasmid replication origin increasing the copy number of the plasmid containing the said origin | |
| EP1127943A2 (en) | Means and methods for the expression of homologous and heterologous proteins in strains of Rhodococcus | |
| Winteler et al. | Anaerobically controlled expression system derived from the arcDABC operon of Pseudomonas aeruginosa: application to lipase production | |
| US4376164A (en) | Process for preparing broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| SK278079B6 (en) | Microorganism of race escherichia coli or pseudomonas putida, method of its growing and recombinant dna | |
| US4418194A (en) | DNA Fragments for forming plasmids | |
| de Mendoza et al. | One-step gene amplification by Mu-mediated transposition of E. coli genes to a multicopy plasmid | |
| JP2009514506A (ja) | Ｅ．コリ株ｄｓｍ６６０１のプラスミド不含のクローン |