SU1138412A1 - Способ получени гибридных клеток - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, включающий сли ние клеток, элиминацию родительских клеток, последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, отличающ и и с   тем, что, с целью упрощени  способа и сокращени  во времени, элиминащоо родительских клеток провод т поеледов1ательным использованием интерферонов и цитоцидных вирусов.

Description

Изобретение относитс  к медицине, «5иЬлогии, сельскому хоз йству, иммунологии , в частности к генетике соматических клеток. Метод гибридизации соматических клеток в последние годы приобрел ирключительно важное значение при решении практических и теоретических задач биологии, медицины к сельского хоз йстба. Он используетс  дл  ка тировани  локализации генов в хромосомах , дл  анализа регул ции генов в клетках эукариотов, изучени  механизмов контрол  роста и дифферен цировки клеток в процессах развити  зародьшей, заживлении ран, образовании опухолей. Пр именение этого метода в медицинской практике расшир ет возможности генетического консультировани , вы влени  латентных опухолеродных вирусов, проверки опухолевы клеток на присутствие в них онкогенных вирусов. Наконец, гибридизаци  клеток лежит в основе получени  гибридом продуцирующих моноклональные актитела, которые наход т разнообраз ное применение в иммунологии и биоХШ4ИИ . Известен способ получени  гибридных клеток, в котором используетс  селективна  система, характеризующа  с  тек, что в.ней маркируетс  одна родительска  клетка, представл юща  собой двойной мутант, устойчивый как к тиогуанину, и к уабаину (Уа). При сли нии такой мутантной клетки с но1 1альной клеткой, чувствительной к уабаину ГГФРТ, Уа), образуютс  гибриды, способные ; расти в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, так называемой среде ТАТ, в которую также добавлен уаба н. Родительские клетки в этих услови х элимини , руютс  О. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату  вл етс  способ получени  гибридных клеток с помощью выращивани  мутантных клеток, устой чивых к азагуанину (АГ) (в клетках отсутствует фермент ГГФРТ) и бромдезоксиуридину (БУдР) (в клетках отсутствует фермент тимидинкиназа ТК ), их сли ни  с применением полиэтиленгликол  (ПЭГ) или вируса Сендай и выращивани  на селективной среде ГАТ, где родительские мутантные клетки погибают, а гибридные выживают С2j. Недостатками известных способов  вл ютс  необходимость получени  и выращивани  мутантных клеток, длительность процесса получени  и изучени  мутантных клеток, необходимость использовани  дорогосто щих биологически активных веществ. Цель изобретени  - упрощение способа и сокращение во времени. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  гибридных клеток, включающему сли ние клеток, элиминацию родите1п ских клеток , последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, элиминацию родительских клеток провод т последовательным использованием интерферонов и цитоцидных вирусов. Способ осуществл ют следующим образом . Родительские клетки скрещивают, вьфащивают на питательной среде до моносло , состо щего из смеси родительских и гибридных клеток, удал ют из культурапьных флаконов клетки сначала одного родител , а затем другого и культивируют оставшиес  клетки до .образовани  колоний . Дл  скрещивани  используют интерферончувствительные клетки родительских линий. Удаление родительских клеток производ т путем последовательной обработки сначала интерфероном, специфическим дл  одного ввда родительских клеток, и заражени  цитоцидным вирусом, элиминйфу  таким образом родительские клетки другого ввда, и далее, после отмывани  культуры, внесением в нее интерферона , специфического дл  второго вида клеток, заражением цитоцидным вирусом, который элиминирует родительские клетки первого вида, в результате чего сохран ютс  лишь гибридные клетки. / Пример. Выделение гибридных клеток при скрещивании в суспензии перевиваемых клеток мыши L и перевиваемых человеческих клеток J... Дл  сли ни  используют культуру человеческих клеток J-96, чувствительную к человеческому лейкоцитарному интерферону, и линию мышиных клеток Laja чувствительную к действию мышиного интерферона. Сли ние провод т с: помощью 50%-ного раствора ПЭГ-1550. Сн тые трипсином и отмытые клетйи J-96 в количестве 6 10 и Uj29 количестве 9-10 перемешивают, центрифугируют 10 14ин при 250jg;-, надосадок отсасывают и . на клетки наслаивают 1 мл раствора ПЭГ, перемешивают легким потр хиванием 80 с, кваащы промывают средой . 199 с последуюпщм центрифугированием и высевают во флаконы или чашки Петри из расчета 310 клеток/мл с 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС), через 2 ч мен ют среду на свежую того же состаЬа. .

Полученна  в результате сли ни  смесь клеток состоит из родительских клеток обоих вцдов и двух групп много дерных клеток: гомокарионов, содер ащих  дра одного типа клеток, и гетерокарионов (или гибридных клеток ), содержащих  дра обоих родительских типов. Дл  избирательного выделени  и размножени  гибридных клеток необходимо добитьс  гибели всех названных типов клеток, кроме гетерокарионов . Через 18 ч среду замен ют на среду 199 с 2% эмбриональной сыворотки КРС с добавлением мьш1иного интерферона из расчета 50 ед/мл. Через 6 ч ввод т вирус везикул рного

.стоматита (BBC) из расчета 2-10 Через 18 ч, т.е. после- гибели человеческих клеток и гомокарионов, не несущих рецепторов к мышиному интерферону, клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаютс  от вируса введением антисыворотки ) . Заливают среду 199 с 20% эмбриональной сыворотки КРС с добавлением человеческого лейкоцитарного интерферона из расчета 80 МЕ/мл. После б ч ввод т вирус ВВС из расчета 2 -10 . Через 18 ч клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаютс  от вируса введением антисыворотки) и запивают средой 199 с 20% эмбриональной сыворотки

|КРС с добавлением глютамина.Колонки гибридных клеток, по вл ютс  через 2 недели, их реклонируют и размножают 11редлагаемый способ позвол ет получить гибриды соматических клеток.

.Метод применим как дл  получени  межвидовых гибридных клеток, когда родительские культуры чувствительны к интерферону, так и дл  получени  внутривидовых гибридов в случае,

.если один из родительских партнеров не чувствителен к интерферону .

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, включающий слияние клеток, элиминацию родительских клеток, последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, отличающ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и сокращения во времени, элиминацию родительских клеток прово дят последовательным использованием интерферонов и цитоцидных вирусов.

   1 1138412