SU1144619A3 - Способ получени аденозин-5 -трифосфата - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-5 -ТРИФОСФАТА, предусматривающий культивирование продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей субстрат и неоргани1|еский фосфат, представленный ()р.Ю, К,НЮ, и , накопление целевого продукта и его выделение , отличающийс  тем, что, с целью снижени  себестоимости целевого продукта , в качестве продуцирующего микроорганизма используют метанолусваивающие штаммы Protaminobacter methanol АТСС 2 1275, Corynobacterium sp. 21232 ,Bacillus cerus ATCC 14579, Methylomonas probus FERM-P-3139, Methylomonas methylovora ATCC 21369, Pseudomonas methanolira ATCC 21704. Pseudofrranas insueta ATCC 21276, Pseudomonas methanica ATCC 21439 или Protaminobacter ruber ATCC 8457, питательна  среда содержит в качестве субстрата метанол или химическую субстанцию, ил.еющую такой же марщрут метаболизма , как и метанол, и представ ленную метаном, метиламином, формальдегидом, и муравьиной кислотой, а неортанический фосфат используют в количестве 4-35 г/л, рассчитанном относительно радикала фосфорной кислоты . 2. Способ по п. .1, о т л и ч а ю щ и и с   тем, что метанол, н метиламин ввод т в количестве 0,2-4,0 об.%, а муравьиную кислоту и формальдегид-- 0,01-0,1 об.%.

Description

Од И обрегснис относитс  к технической )биологии н касаетс  способа получени  адено- ин-5 -трифосфата, использующего про;iyuR -iyK )mne бактерии, способные ассимилировать feтa)(()л. Изнсстен ферментативный способ получени  адснозин-5 -трифосфата (АТФ) путем культиви ровани  бактерии Brevibacterium ammoniage- nes АТСС 6871 на питательной среде, содержа щей источник фосфата, аденин или его проиэводные При рН среды 7,0, температура 20-40°С. Выход ЛТФ 3 г/л 1. Известен также способ получени  АТФ, предусматривающий культивирование продуц та Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 на питательной среде, содержащей субстрат и неорганический источник фосфата, представленный (, и KHjTO при З0с рН 6,8, накопление целевого продукта и выделение в количестве 6,2-8,6 мг/мл 2 Недостатком известных способов  вл етс  то, что об зательным условием биосинтеза продудента  вл етс  наличие в среде аденина или его производного, такого как аденозин, используемого в Ka4ectbe субстрата. Цель изобретени  - снижение себестоимост целевого продукта. Поставленна  цель достигаетс  тем, что при способе получени  аденозин-5 -трифосфа1 предусматривающем культивирование продуци рующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей субстрат и неорганический фосфат, представленный () НГО, К,,ИГО и КНлРО, накопление целевого продукта и его выделение, в качестве проду1Щрующего микроорганизма используют метанолусваивающие п;таммы Protaminobacter methane 1 АТСС 21275, Corynobacterium sp. 21232, Bacillus cerus АТСС 14579, Methy 1 omonas probus PERM P-3139, Methylomonas metliylovora ATCC 21369, Pseudomonas methanolica ATCC 21704, Pseudomonas insueta ATCC 21276, Pseudomonas methanica ATCC 21439 или Protaminobacter ruber ATCC 8457, питательна  среда содержит в качестве субстрата метанол или химическую субстанцию, имеющую такой же марщрут метаболизма, как и метан и представленную метаном, метиламином, фор мальдегидом и муравьиной кислотой, а неорг нический фосфат используют в количестве 4- 35 г/л, рассчитанном относительно радикала фосфорной кислоты РО, Метанол и метиламин ввод т в количестве 0,2-4,0 об.%, а муравьиную кислоту и формальдегид - 0,01-0,1 об.%. Сущность изобретени  заключаетс  в том, что один из перечисленных метанолусваиваю щих штаммов культивируетс  в среде, содержащей метанол или химическое вещество. 9 имеющее тот же метаболический путь, ч го и метанол, н Р сорганический фосфат в количестве 4-35 г/л, рассчитанном но числу ГО/. Метанол или указанное химическое вещество используют в качестве источника углерода в среде , однако слишком высока  концентраци  этого вещества в среде неблагопри тно сказываетс  на росте бактерий. Концентраци  указанного вещества в среде обычно должна быть в пределах 0,2-4 об.% в слу ве метанола и метиламина и в пределах 0,01-0,1 об.% в случае муравьиной кислоты и формальдегида. Если используют метан, то его концентраци  соответствует его растворимости. Подобный источник углерода может быть добавлен целиком одновременно в среду в начале культивировани , однако лучший резуль тат по отношению к выходу АТФ получают путем первоначальЕГого поддерживани  в среде 1П13кой концентрации источника углерода и дополнительного добавлени  в среду источника углерода по мере его потреблени  в процессе культивировани . При этом важно иметь неорганический фосфат , содержащийс  в среде в сонцентра лии 4-35 г/л, рассчитанной по числу РО, в дополнение к указанному источнику углерода. Така  концентрагда  неорганического фосфата в среде превыщает в несколько дес тков раз концентра1Шю в обычной бактериальной культуре и  вл етс  совершенно спе1шфической. Если ко}центраци  неорганического фосфата (рассчитанна  по числу РО).) в среде ниже 4 г/л, то не происходит увеличени  выработки АТФ, при концентрации выще 35- г/л рост АТФ-продуцирующей бактерии замедл етс , что приводит к уменьшению выхода АТФ. Неорганический фосфат в высокой концентрации преп тствует секретированию продуцированной АТФ бактериальными клетками и разрушению АТФ фосфотазой. Неорганические фосфаты , используемые в изобретении, прина.утежат к соединени м, обычно примен емым при приготовлении ферментационной среды, и включают, например, (NH)HPO4, , и К„НГОл. Состав, используемый дл  приготовлени  среды, может включать, кроме названн гх источника углерода и неорганического фосфата и неорганическую соль (соль кали , магни , железа , марганца и т. д.) и в некоторых случа х неорганическую соль металла, такого как цинк, кобальт, молибден и других, также как и источник азота (аамиак, соль аммони , мочевина, нитрат и т. д.). Возможно также добавление поверхност}1О-активного вещества, антивспенивател  и других добавок. Состав используемой среды следующий, г/л: (ЫН4)-ПЮ45-45 (3,5-32 по числу 0,5-2,5 (0,35-1,75 по числу Ю) 0,5-2,5 (0,275-1,37 по числу ГО) (NH4)S04 MgSO4 7 HjO 0,5-5,0 7HjO 0,05-0,5 FeS04. CaClj- 2HjO iVlnSO.4H,jO 0-0,2 Источник углерода0,05-2 об.% Культивирование названных ЛТФ-продуцирующих бактерий в указанной среде предпочти-, тельно выполн ют при следующих услови х: рН 5,8-9,0, предпочтительно 6,0-8,0. температу ра 15-50°С, предпочтительно 20-40°С, и урове аэрации 0,5-4,0 V.V.M (объем воздуха, л.объе раствора культуры л/мин), перемешивание при 40-600 об/мин, в течение 2-9 дней. Дл  доведени  рН среды культуры могут быть использованы щелочное вещество (аммиак), кислое вещество (серна  кислота), буферный агент (фосфатный буфер) пли другие пригодны вещества, такие как мочевина, углекислый кальций и т. д. В случае использовани  щелочного вещества наибольщее предпочтение отдает с  аммиаку, поскольку он может служить источником азота. Если указанные бактерии форментируют При указанных услови х культи вировани  согласно изобретению, АТФ накапливаетс  в среде в высокой концентрадаи 2-12 г/л. После заверщени  ферментации микробы удал ют и продуцированную АТФ отдел  ют и вьщел ют известным способом. Например после удалени  бактериальных клеток из ферментационной среды (бульон) супернаган подвергают комбинации фракционировани  и концентрировани -осаждени  путем адсорбции и элюции с использованием активированного угл  и анионообменной смолы, в результате че го происходит выделение продуцированной АТФ Согласно изобретению АТФ продуцируетс  и накапливаетс  в среде культуры в высокой концентрации свыще 2 г/л без добавлени  в среду аденина или его дериватов. Количество продуцированной АТФ в случае каждом примере определ ют путем использова ни  принципа реакции между АТФ и люциферингЛЮ1шферазой , который выражаетс  следующим образом: 1)Люциферин+люцифераза+АТФ - -аденизлюциферин-пирофосфат; -. 2)Аденил -люциферин - - аденИл-оксилюци ферин. Интенсивность свечени  флюоресцирующего продукта второй реакции в интервале длин вол нм измер ют в течение данного периода времени с использовагчем CHEM--GLOW PHOTOMETER J4-7141 (American Instrument Со-) и полученный результат соотнос т с предварительно полученной калибровочной кривой стандарт1Ш1х растворов АТФ, в результате чего определ ют количество АТФ в растворе культуры . Пример 1. Основна  среда готовитс  pacTBopeimeM 7,0 г (NH4)2HPO4, 1,0 г 1,0 г , 1,0 г MgSO. .и 1,0 г в 1 л ионообменной воды; 100 мл этой остювной среды отмер ют пипеткой в каждую из 300-маплилитровых Эрленмейеровских колб, после стерилизации в каждую колбу добавл ют 1,6 г метанола, В приготовленную таким образом среду засевают Methylomones probus PERM-Р-3199, кыорый предварительно культивируютна скощенном агаре с указанным составом, после чего колбы встр хивают при .ЯО С. На 4-й дейь после засева среды в растворе культуры продуцировано и накоплено 2,8 г/л АТФ. 1 л этого раствора культуры подвергают нагреваиню при 80 С в течение 5 мин, и после охлаждени  центрифугированию дл  осаждени  бактериальных клеток, после чего супернатант, довсде П1ый до рН 3,5 3 н. сол ной кислотой, обраба)ывают активированным углем пд  адсорбции АТФ и затем адсорбированную на активированном угле АТФ элюируют 50%-ным раствором алкогол , содержащим 1,4% аммиака. Это эпюат концентрируют при пониженном давлении н при низкой температуре дл  удале}1и  избытка аммиака, довод  рН до 8,0. Затем концентрированный раствор пропускают через колонку сильноосновиой анионообменной смолы Dowex ( trade mark) 1-Х2(С Г ) котора  предпарнтслыю доведена .до смолы СЬтипа, в результате чего АТФ адсорбируетс  на колонке. Адсорбат промывают ионообменной смолой и элюируют смесью сол ной кислоты и хлористого натри (0.2 М раствор NaCl, полученный растворением 0,2 М раствора НС1 рН 1,7), в NaCl) и ,, фракцию АТФ отдел ют. Этот эЛюат нейтрализуют едким натром, пропускают через колонку, набитую активированным углем, злюируют 15 г-ной аммиачной водой и полученный злюат концентрируют при нагревании отгонки аммиака. Путем добавлени  метанола к этому конценгр 1рова}пюму раствору получают 2,2 г крис галлов натриевой соли АТФ. Пример 2. 20 л , 1Григотовленной растворением 7,0 г (NH)jHPO4, 1,0 г КН РО, 1,0 г К2НЮ4, 2,0 г MgSO . и 0,2 и 0,2 мл антивсиенивател  ; К-66 в 1 л ионообменной воды загружают в i

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-5 -ТРИФОСФАТА, предусматривающий культивирование продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей субстрат и неорганический фосфат, представленный (NH₄)_jlPO₄, К_гНРО₄ и КН_гРО₄, накопление целевого продукта и его выделение, отличающийся тем, что, с це лью снижения себестоимости целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют метанолусваивающие штаммы Protaminobacter methanol АТСС 2 1275, Согупоbacterium sp. 21232 ,Baci1 lus cerus ATCC 14579, Methylomonas probus FERM—P—3139, Methylomonas methylovora ATCC 21369, Pseudomonas methanol ica ATCC 21704, Pseudomonas insueta ATCC 21276, Pseudomonas methanica ATCC 21439 или Protaminobacter ruber ATCC 8457, питательная среда содержит в качестве субстрата метанол или химическую субстанцию, имеющую такой же маршрут метаболизма, как и метанол, и представленную метаном, метиламином, формальдегидом, и муравьиной кислотой, а неорганический фосфат используют в количестве 4—35 г/л, рассчитанном относительно радикала фосфорной кислоты РО₄.

2. Способ по п. .1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что метанол и метиламин вводят в количестве 0,2-4,0 об.%, а муравьиную кислоту й формальдегид0,01-0,1 об.%.

ί 11446)19