SU1595902A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к антигену СД38 кортикальных тимоцитов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к гибридомной технологии и может быть использовано дл  определени  иммунологического статуса организма. Цель изобретени  - получение моноклональных антител, вы вл ющих новый эпитоп молекулы CD 38, сильно экспрессированный на мононуклеарных клетках крови и гранулоцитах. Штамм получают путем гибридизации клеток мышиной миеломы РЗ х 63 AG 8653 и клеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных Т-лимфоцитами человека и отбором клонов, продуцирующих монАТ. Штамм ИКО-45 депонирован под номером ВСКК(II) N 314D и продуцирует монАТ, относ щиес  к IG 3 классу. Титр антител в культуральной жидкости 1:50, в асцитической жидкости 1:100000. МонАТ вы вл ют новый эпитоп антигена CD 38 с мол.м. 45 тыс. дальтон.

Description

Изобретение относитс  к гибридом- ной технологии и может быть использовано дл  определеш1  иммунологического статуса организма.

Цепь изобретени  - получение моно- клональных антител, вы вл ющих новый эпитоп молекулыCD38, сильно экспрес- сированный на мононуклеарных клетках крови и гранулоцитах.

Штамм получают следующим образом.

Провод т соматическую гибридизацию клеток мышиной миеломы РЗ бЗ-Ag 8653 и слеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных Т-лймфоци- , тами человека, выделенные по методу Е-розеткообразовани . Провод т п ть Инъекций с интервалами в две неДели. К летки в количестве ЛхЮ ввод т в.

хвостовую вену мьпии. На п тый день после последней иммунизации провод т сли ние клеток селезенки мыши и мышиной миеломы Ag 8653. В стерильных услови х извлекают селезенку иммунизированной мьшга и измельчают ножницами, э затем в гомогенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через два сло  марли. Лимфоциты дважды отмывают средой 199 и сливают с клетками миеломы в соотношении 10:1. Смесь клеток отмывают один раз и помещают в объеме 20 мл среды 199 во флакон объемом 100 мл. В этом фпа- коне клетки центрифугируют 800 об/мин в течение 3 ь«н и инкубируют 20 мин при 37°С. Среду осторожно насухо отсасывают и к клеткам добавл сл

QD СП

дэ

ю

ют 3 мл 30%-ного полиэтиленгликол  с мол.м, 1500. Через 90 с во флакон внос т 20 МП среды 199, Клетки три раза отмывают, не встр хива , и инкубируют при ЗУ С в течение 2 ч в 20 мл среды роста (DMEM), содержащей 20% тел чьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ/мл глютамина и 0,1 мг/мл гента- мйцина. Затем рслетки разливают по 0,2 МП в лунки 96 - луночного плато, ; На следующий день среду мен ют на срецу ГАТ (среда роста, содержаща  0,0136 мг/мл гипоксантина} 0,00091 мг/м

Культивирование in vitro. Дл  выращивани  штамма используют пластиковую или стекл нную посуду. Во флакон объемом 45 см в 5 мл среды заливают по 510 клеток штамма. Пассаж 1 раз в 3-4 дн  той же дозой, Штамм выращивают при на среде КРЖ-1640 или среде MEM в IX модификации Дульбекко, содержащей 15,0% оленьей или тел чьей эмбриональной сыворотки; 2 мМ/мл глютамина; 0,1 мг/мл гентамицина.

Культивирование in vivo,-Дл  выращивани  опухоли из штамма гибридных

аминоптерина; 0,00385 мг/мл тимидина),}5 клеток пригодны мьшги самки линии

BALB/C, -Интактным мьш1ам за 1-7 дней до прививки опухоли ввод т внутри- брюшинно (в/бр) по 0,5 мл вазелиново го масла. Клетки гибридомы ввод т 2Q в/бр по 10 клеток на мьш1ь в 4 мл ср ды. Через 7-10 дней у мьшей возник аю асцитные опухоли. Культуру клеток гибридомы поддерживают серийными пас сажами асцитной опухсиш,

Видимые колонии по вл ютс  на две- н||дцатый день в 95 из 96 лунок, скрининг провод т в непр мой реакции поверхностной иммунофлюоресценции. При обнаружении специфического свечени  провер ют реакцию антител с дру- |ГЯми клетками крови доноров. После тестировани  продуцирующие гибридог ы клонируют методом органических разведений на фидере из клеток селезенки и тимуса мыши в линии BALB/c,

Дл  приготовлени  фидера тимус и селезенку разрушают в стекл нном гомогенизаторе ПотТера, Взвесь клеток

фильтруют через марлевый фильтр, Клет- Q CD38 с мол,м, 45000 дальтон, Специки разливают в среде роста по 0,1 мл в лунки 96-луночного плоскодонного плато. Через 1-7 дней плато используют как {|идер. При клош1ровании клетки из продуцирующей лунки снимают нежным пипетированием. Количество клеток подсчитывают в камере Гор ева и развод т в среде до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл среды роста. Клетки разливают по О,1 мл в лунки на фидер. При этом на две лунки приходитс  одна клетка.

После первого клонировани  клоны п бридных клеток по вл ютс  на четырнадцатый день в 25 из 96 лунок, Про- вод т тестирование гибридом на Т-клет- ки человека и из положительной лун- км гибридому вновь клонируют. Колонки возникают на двенадцатый день в 58 из 96 лунок. Провод т скрининг на Т-клетках, Позитивные клоны после к.(1онировани  составл: ют 100% (58 из 58),

ПолученньпЧ штамм обозначен ИКО-45. Штамм гибридных клеток депонирован под номером BCKK(II) № 3 UD и характеризуетс  следующи1Ж признаками,

Культуралыше свойства.

35

40

45

50

фичность моноклональных антител опре дел ют в непр мой реакции поверхност ной иммунофпюоресценции по стандартной методике, Титр антител в культу- ральной жидкости 1:50, титр антител в асцитической жидкости 1:100000, Срок хранени  моноклональных антител при минус 1 год. Стабильность продуциров ани  антител сохран етс  н прот жении 25 пассажей ин витро, 15 пассажей ин виво.

Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 20% тел чьей эмбриональной сыворотки, к су пензии клеток добавл ют 10% диметил- сульфоксида (ДМСО) до конечной кон- центр.ации 10%, Количество клеток на 1 ампулу объемом 1 мл составл ет 10- -20x10 , Замораживание провод т при

-70 С в течение 2

ч, 3 ат ем ампулы с -

55

клетками помещают в Ж1 сдкий азот, Раз моражива1ше провод т при в тече ние 70 с. Ампулы с клетками центрифу гируют при 1500 об/мин 2 мин. Затем клетки, наход щиес  в осадке, перено с т во флакон объемом 45 см, содержащий 7 мл среды RPMI 1640 с 15% тел чьей эмбриональной сыворотки.

клеток пригодны мьшги самки линии

BALB/C, -Интактным мьш1ам за 1-7 дней до прививки опухоли ввод т внутри- брюшинно (в/бр) по 0,5 мл вазелинового масла. Клетки гибридомы ввод т в/бр по 10 клеток на мьш1ь в 4 мл среды . Через 7-10 дней у мьшей возник ают асцитные опухоли. Культуру клеток гибридомы поддерживают серийными пассажами асцитной опухсиш,

Характеристика полезного продукта,

Гибридома продуцирует монокпональ- ныё антитела IgG 3 класса, Специфич- -ность - моноклональные антитела ШКО-45 вы вл ют новый эпитоп антигена

CD38 с мол,м, 45000 дальтон, Специ

фичность моноклональных антител определ ют в непр мой реакции поверхностной иммунофпюоресценции по стандартной методике, Титр антител в культу- ральной жидкости 1:50, титр антител в асцитической жидкости 1:100000, Срок хранени  моноклональных антител при минус 1 год. Стабильность продуциров ани  антител сохран етс  на прот жении 25 пассажей ин витро, 15 пассажей ин виво.

Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 20% тел чьей эмбриональной сыворотки, к суспензии клеток добавл ют 10% диметил- сульфоксида (ДМСО) до конечной кон- центр.ации 10%, Количество клеток на 1 ампулу объемом 1 мл составл ет 10- -20x10 , Замораживание провод т при

-70 С в течение 2

ч, 3 ат ем ампулы с -

клетками помещают в Ж1 сдкий азот, Раз- моражива1ше провод т при в течение 70 с. Ампулы с клетками центрифугируют при 1500 об/мин 2 мин. Затем клетки, наход щиес  в осадке, перенос т во флакон объемом 45 см, содержащий 7 мл среды RPMI 1640 с 15% тел чьей эмбриональной сыворотки.

51595902

2 мМ/мл глютамина 0,1 мг/мл гентамицина . Жизнеспособность клеток после размораживани  по включению трипано- вого синего составл ет 6Cf%.

Контаминаци ,

Бактерии и грибок при длительном культивировании и посевах на гшта- телЬные среды в культиваторе не обнаружены . Заражение микоплазмой не вы влено.

Использование моноклональных антител (монАТ), продуцируекых гибридо- мой, иллюстрируетс  следующими примерами ,.

Пример 1, Использование моноклональных антител ИКО-45 дл  определени  иммунологического статуса у бальных раком молочной железы.

Содержание ИКО-45 положительных клеток в крови исследовано у 14 больных раком молочной железы II-III степени . Было обнаружено, что у 10 из 14 бальных процент ИКО-45 положительных клеток статистически значимо снижен по сравнению с контролем - 29,3+3,9 и 50,3+12,5 соответственно, , Через 1-3 недели после операции -процент ИКО-45 положительных клеток не

П р и м е р 2. Использование моноклональных антител ИКО-45 дл  определени  иммунологического статуса у , доноров крови.

Обследовано 12 доноров крови. Обнаружено , что у доноров крови процент ЖО-45 положительных клеток колеблетс  от 35 до 70%. У одного донора кро- 10 ви процент ИКО-45 положительных кле- : ток резко снижен (20%). Применение других монАТ (ОКТ4, ОКТ8, ОКТЗ, ИКО-1 1) подтвердило состо ние иммунитета у зтого донора.

Таким образом, по проценту ИКО-45 положи тел клеток можно судить о . состо нии иммунной систекы человека,

МонАТ ИКО-45, полученные с помощью гибридомы, определ ют антиген на одно дерных клетках крови, по процентному содержанию которых можно судить о состо нии иммунной системы организма ,

) Преимущество использовани  монокло- 25 нальных антител ИКО-45 по сравнению. с прототипом ИКО-20 состоит в том, на люминесцентном жкроскопе ИКО-45 определ ют в норме 50% антйтел-по15

20

свидетельствующие о состо нии иммунной системы организма.

.-,., „ :ложительных клеток, а ИКО-20 - 5%

изменилс . Однако через 3-4 мес после 30 Это позвол ет за4иксировать измене- операции количество ИКО-45 положи-ни  антиген-папожительных клеток

тельных клеток возвратилось к норме,

Параллельное использование других монАТ, рутинно используемых дл  определени  иммунологического статуса (ОКТ4, ОКТ8, ИКО-П), подтвердило им- мунодепрессивное состо ние у этих б ольных до лечени  и через 1-3 нед

после операции и восстановление пока-, ,....,, .. .,„, „.„.„..н д. по- .затепей иммунитета 3j-4 мес пос- 40 лучени  моноклональных антител к анти- ле операции,гену CD38 кортикальных тимоцитов.

35

Claims (2)

1. Формула из

   обретени 

   Штамм гибридных культивируемих клеток животных Mus musculus L. |BCKK(II) № 3I4D, используем гй дл  поП р и м е р
2. 2. Использование моноклональных антител ИКО-45 дл  определени  иммунологического статуса у , доноров крови.

   Обследовано 12 доноров крови. Обнаружено , что у доноров крови процент ЖО-45 положительных клеток колеблетс  от 35 до 70%. У одного донора кро- 0 ви процент ИКО-45 положительных кле- : ток резко снижен (20%). Применение других монАТ (ОКТ4, ОКТ8, ОКТЗ, ИКО-1 1) подтвердило состо ние иммунитета у зтого донора.

   Таким образом, по проценту ИКО-45 положи тел клеток можно судить о . состо нии иммунной систекы человека,

   МонАТ ИКО-45, полученные с помощью гибридомы, определ ют антиген на одно дерных клетках крови, по процентному содержанию которых можно судить о состо нии иммунной системы организма ,

   ) Преимущество использовани  монокло- 5 нальных антител ИКО-45 по сравнению. с прототипом ИКО-20 состоит в том, на люминесцентном жкроскопе ИКО-45 определ ют в норме 50% антйтел-по5

   0

   свидетельствующие о состо нии иммунной системы организма.

   Это позвол ет за4иксировать измене- ни  антиген-папожительных клеток

   35

   Формула из

   обретени 

   ,....,, .. .,„, „.„.„..н д. по- лучени  моноклональных антител к анти- гену CD38 кортикальных тимоцитов.

   Штамм гибридных культивируемих клеток животных Mus musculus L. |BCKK(II) № 3I4D, используем гй дл  по