SU1605914A3 - Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами - Google Patents
Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами Download PDFInfo
- Publication number
- SU1605914A3 SU1605914A3 SU833571944A SU3571944A SU1605914A3 SU 1605914 A3 SU1605914 A3 SU 1605914A3 SU 833571944 A SU833571944 A SU 833571944A SU 3571944 A SU3571944 A SU 3571944A SU 1605914 A3 SU1605914 A3 SU 1605914A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- factor
- activity
- globulin
- protamine
- tumor
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к медицине и касаетс способа стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами. Способ осуществл етс добавлением к фактору некроза опухоли в концентрации 102-108 Ед/мл альбумина человеческой сыворотки в количестве 10 мкг - 50 мг на 1 мл водного раствора указанного фактора. 3 табл.
Description
S
(Л
Изобретение относитс к медицине и касаетс способа стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы кролика, индуцированного липополисахаридами.
Получение высокоочищенногс фактора некроза опухоли.
Самкам кроликов, кажда из которых имеет массу от 2 до 3 кг, внутривенно вводили 75 мл клеток Propionib.ac- terium acnes (Corynebacterium parvum Wellcome Research Labr England), убитых формалином. Спуст 8 дней каждому из кроликов внутривенно вводили 100 мг эндотоксина (липополи- сахарид, полученньй из E.coli 0,26:В6) От каходого кролика получали кровь пункцией сердца через 2 ч после инъекции эндотоксина и полученную таким образом кровь смешивали с небольшим количеством гепарина. Эту кровь подвергали центрифугированию в течение 15 мин при скорости 3000 об/мин. В результате получена плазма, содержаща некротический фактор опухоли, имеющий активность, равную 2500 ед/мл.
Полученную таким образом плазму или сыворотку (10 л), содержащую некротический фактор опухоли, разбавл ли 5 л 0,03 11 фосфатного буферного раствора, рН 7,8. Разбавленную плазму вносили в колонку размером см с DEAE-сефарозой CL-6B, Pharmacia Fine Chemicals АВ, Sweden, уравновешенную О,ОЗМ фосфатным буферным раствором, рН 7,8, содержащим 0,13 М хлористого натри . Эту колонку промывали 2,5 л 0,03м фосфатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,13 М хлористого натри , и сорбированный некротический фактор опухоли разбавл ют раствором хлорида ната о ел
со
Ь ы
ри при линейном изменении его кон- цер1траиии в количестве, от 5 л 0,ОЗМ фосфатного буЛера, рН 7,8, содержащего 0,15 М хлористого натри , до 5,0 л 0,03Мфосфатного буфера, имею- ш,его рН 7,8, содержащего 0,03 М хлорида натри . Фракции, обладающие активностью фактора некроза опухоли , сливали вместе, подвергали диализу в течение 12 ч с применением 0,03 М трис-НС1буфера, рН 7,2, содержащего 0,13 М хлористого натри ,
Диализованный раствор некротического фактора опухоли подвергали повторному хроматографит- Ованию на колонке типа DEAE-Sepharose CL-бБ (размером см), урав}ювешенную 0,03 М трис-HCl буфером, рН 7,2, содержащим 0,15 М хлорида натри . Адсорбированньш некротический фактор опухоли подвергали элюирова- нию при линейном изменении концентрации хлорида натри , раствором, содержащим 500 мл уравновешивающего буферного раствора, и 500 мл 0,03 М трис-НС буферным раствором, рН7,8 содержащим 0,3 М хлорида натри .
Полученный концентрат подвергали гель-фильтрации через колонку типа Sepharose S-200, размером 5X100 см, фирмы Pharmacia, уравновещенную с помощью 5 Ml I фосфатного буферного раствора, рН 7,0, содержащим 0,15 М хлорида натри . Элюирование осуществл ли с помощью буферного уравнове- шивайщего раствора. Скорость подачи составила 80 мл/ч„ Фракции с активностью некротического фактора опухоли сливали вместе и подвергали концентрированию посредством ультрафиль рации.
Полученный таким образом некротический фактор некроза опухоли характеризовалс характерной активностью , равной 5,0.10 ед/мг белка и имел чистоту в 10000 раз более высокую , чем чистота плазмы.
Полученный таким образом раствор некротического фактора опухоли подвергали повторномгу рехроматографи- рованию на той же сймой колонке Sepharose с использованием того же самого буферного раствора и в результате был получен раствор некротического фактора некроза опухли , имеющий характерную активность, равную 1,0-10 ед/мг белка.
0
5
0
5
W
45
50
55
Пример 1. Некротический фактор некроза опухоли кроликов, .обладающий характерной активностью, равной 5,010 ед/мл, полученный как указано выше, разбавл ли 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 7,0, содержащим О,15 М хлорида натри , с получением в результате раствора некротического фактора опухоли с активностью 1200 ед/мл. К этому раствору некротического фактора опухоли добавл ли альбутиин человеческой сыворотки (USA) в количестве 0,1 мг/мл и 1,0 мг/мл USA- фракци альбумина человеческой сыво- ротк1 (Cohu-, фракци V), фирмы Sigmc Cenr Compary.
Дл каждого из полученных в результате растворов производилось определение остаточной активности по отношению к: образпам, соответственно подвергнутым хранению в течение 2, 7 и 30 дней при 4°С, образцам, подвергнутым 1-му и 3-м циклам замораживани при -70 С и оттаиванию, образпам, подвергнутым замораживанию при -70°С, л офилизацип и хранению Б течение 7 дней при 25 С. При проведении таких испытаний раствор некротического фактора опухоли, к которому не добавл ли стабилизирующий агент, использовали как контрольный раствор. Что касаетс лио- филизованной композиции, то эту композицию подвергали растворению в стерильной дистиллированной воде и затем подвергали анализу дл определени активности по некротическому фактору опухоли.
Остаточную активность определ ли in vitro и in vivo.
In vivo активность фактора некроза опухоли определ ли измерением ци- тотоксической активности против L-У- клеток: в качестве емкостей дл культур использовали 96- чеечные микро- титровальные пластины, клетки выращивали в минимальной среде Игла, содержащей прогретую фетальную сыворотку теленка. Образец некротического фактора опухоли объемом 0,1 мл последовательно разбавл ли средой и L-M суспензию клеток (0,1 мл, 1140 клеток) перемешивали в каждой из чеек пластинок, пластинки выдерживали при в течение 48 ч в атмосфере с содержанием 5% двуокиси углерода. В конце периода выращива
ни добавл ли 20%-иый впдмьш раствор глутарового альдегида (20 мл) дл фи . сации клеток. После фиксации пластины промывали дистиллированной водой, высушивали и затем окрашивали клетки 0,05%-Hbtt i красителем Метилен голубой . Пластины тщательно промывали дистиллированной водой дл удалени избыточного количества красител и высушивали. Затем в каждую чейку добавл ли 0,2 мл 3%-ной сол ной кислоты дл вымывани красител из окрашенных клеток. Поглощение каждой чейки :измер ли при: длине вол- ны 665 нм с помощью прибора Titertek Mactiobon фирмы Flow Laboratories Inc. Поглощение вл етс пропорциональным количеству видимых клеток. Активность некротического фактора опухоли, выраженна в единицах на миллиметр, измер ли, как обратную величину разведени некротического фактора опухоли, котора вызывает 50%-ную цитотоксичность и которую можно вьгоазить графически между разбавлением и поглощением. In vitro остаточную активность определ ли в процентах и рассчитывали по экспериментальным данным и в соответствии
со следующим уравнением:
д Остаточна активность - х/од,
где А - активность по некротическому
фактору опухоли образца по- еле хранени или физической обработки,
В - активность образца по некротическому фактору опухоли перед хранением или физической обработкой.
В соответствии с методом in vivo каждый образец раствора подвергали концентрированию с получением концентраций , которые в 20 раз выше, че первоначальные.
Далее 0,5 мл кажд.ого из полученных таким образом концентрированных растворов некротического фактора опухоли вводили инъекцией в хвостовую вену, каждой из мышей с опухолью, разбитых на группы по 5 мьш:ей. Активность некротического фактора.опухоли анализировали спуст 24 ч в соответствии с критери ми, указанными в табл,1, где (-) - нет изменений; (+) - незначит.ельный геморагический некроз;
5
59
5 0 5 0
0
5
0
5
146
(2 + + ) - умеренные геморагический некроз (центральный некроз, охпаты- вающий примерно 50% поверхности опухоли ) ; (++ + ) - значительны; геморагический некроз (массовьп некроз).
Пример 2, Некротический фактор опухоли, имеющий характерную активность, равную 1,0у10 ед/мг, полученный в соответствии с описанньши ранее, подвергали разбавлению с помощью 0,1 М фосфатного раствора, имеюшего величину водородного показател , равную 7 ед. рН и содержа- ш,его 0,15 М хлорида натри . В результате бьши полл чены растворы некротического фактора опухоли, соответственно имеющие активности по некроти
ческому фактору опухоли, равные 1vIO, 1 ЛОЗ, 1 Ю, 140, 1 ПО, 1 ИО и 1x10 - ад/мл. К эликвотным дол м каждого из приготовленных таким образом растворов производилось добавление USA в таком количестве, чтобы обеспечить получение в результате раствора, имеющего концентрацию, равную 1,0 мг/мл. Каждьш из полученных таким образом растворов некротического фактора опухоли подвергали хранению в течение 7 дней при 4 С и затем производилс анализ этих растворов на активность некротического фактора опухоли в соответствии с методом in vitro. «. Остаточна активность по некроти- ческому фактору опухоли бьша рассчитана по той же методике, что и в примере 1. В качестве контрольной бьша вз та друга аликвотна дол каждого из растворов некроти геского фактора оп гколи, в который не вводили USA, и эти контрольные аликвотные доли также подвергали анализу на определение активности некротического фактора.
Полученные результаты представлены в табл. 2о
Стаб шизирующий эффект различных концентраций USA при концентрации фактора некроза опухоли 1,210 ед/мл представлен в табл.3.
Из результатов табл.3 следует, что стабилизирующ1гй эффект на активность фактора некроза опухоли вы влен в концентрации от 10 до 50000 мкг/мл раствора фактора.
Claims (1)
- Формула изобретениСпособ стабилизации высокооч1пцен- ного фактора некроза опухоли изплазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами, путем добавлени к водному раствору, содержащему укп нньй фактор в конТаблица 2Остаточна активность по некротическому фактору опухоли,%, при концентрации USA, мг/млКонцентраци USA, мкг/мл16059148центрами ед/мл, альбумина человеческой сыворотки в количестве 10 мкг - 50 мг на 1 мл водного раствора.ТаблицаТаблица 3Остаточна активность некротического фактора опухоли, хранение при 4 С в течение 7 дней
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57129560A JPS5920225A (ja) | 1982-07-27 | 1982-07-27 | ガン壊死因子の安定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1605914A3 true SU1605914A3 (ru) | 1990-11-07 |
Family
ID=15012508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU833571944A SU1605914A3 (ru) | 1982-07-27 | 1983-04-05 | Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5920225A (ru) |
| SU (1) | SU1605914A3 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2629000B2 (ja) * | 1986-07-18 | 1997-07-09 | 中外製薬株式会社 | 安定な顆粒球コロニー刺激因子含有製剤 |
| KR102940220B1 (ko) * | 2021-02-08 | 2026-03-17 | 주식회사 대웅 | 장기 저장이 가능한 보툴리눔 독소 동결건조 제형 조성물 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55108821A (en) * | 1979-02-14 | 1980-08-21 | Kanebo Ltd | Preparation of antitumor agent |
-
1982
- 1982-07-27 JP JP57129560A patent/JPS5920225A/ja active Granted
-
1983
- 1983-04-05 SU SU833571944A patent/SU1605914A3/ru active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5920225A (ja) | 1984-02-01 |
| JPH0375530B2 (ru) | 1991-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR860000842B1 (ko) | 종양 괴사 인자의 안정화 방법 | |
| US4824938A (en) | Water-soluble dry solid containing proteinaceous bioactive substance | |
| JP2512453B2 (ja) | 天然のコロニ−促進因子―１の精製 | |
| US3637640A (en) | Orgotein stabilized with saccharide process and products | |
| EP0090892B1 (en) | Process for the purification of physiologically active substance having antitumour activity | |
| JPS59137417A (ja) | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 | |
| JPH03505334A (ja) | 凍結乾燥されたペプチド製剤 | |
| JPS6019719A (ja) | 抗腫瘍活性を有する蛋白質 | |
| JPS63165328A (ja) | 組織タンパクｐｐ４含有医薬 | |
| SU1605914A3 (ru) | Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами | |
| JPH0713026B2 (ja) | 血友病ａ抑制患者の治療のための製剤及び該製剤の製造方法 | |
| US3579495A (en) | Isolation of orgotein from blood | |
| JP2566919B2 (ja) | α−インタ−フエロンの製造方法 | |
| JPS62185027A (ja) | 組換えインタ−ロイキン−２組成物およびその製造方法 | |
| JPH0222233A (ja) | スーパーオキシドディスムターゼ組成物 | |
| EP0539408A1 (en) | STABILIZED COMPOSITION CONTAINING A FIBROBLAST GROWTH FACTOR. | |
| KR970009890B1 (ko) | 혈소판감소증치료제 | |
| Kim et al. | Immobilization of urokinase on agarose matrices | |
| JPS5959625A (ja) | ガン壊死因子を安定化する方法 | |
| JPH04198195A (ja) | Ｃｐｂ―ｉの安定化方法及び製剤組成物 | |
| JPH0375529B2 (ru) | ||
| JPH04187640A (ja) | 経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮免疫機能促進剤 | |
| EP0134247A1 (en) | Protein with oncostatic effect, process for its preparation, and oncostatic drug containing it | |
| EP0891778A2 (en) | Agents for the prevention and/or treatment of radiation-induced disorders | |
| US5023320A (en) | Process for the purification of physiologically active substance having antitumor activity |