SU486514A3 - Способ получени противовирусного комплекса - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к медицинской промышленности .

Сиособ получени  противовирусного комплекса из культуры грибка штамма Sirodesmium diversum С. М. 1.102519  вл етс  новым и состоит в том, что культуру грибка штамма Sirodesmium diversum С. М. 1.102519 вырашивают на среде, содержашей источники углерода и азота, экстрагируют фильтрат культуральной жидкости не смешиваюшимис  с водой органическими растворител ми, например хлороформом, высушивают экстракт и при необходимости фракционируют на активные компоненты.

Штамм грибка Sirodesmium diversum (Кук), получаемый из Государственного микологического института, наход щегос  в Ферри Лейн, Кью, Англи , по каталогу значитс  как С.М. 1.102519.

Культура хорошо произрастает на обычной микологической агаровой среде, и через 6 дней в колонии образуетс  центральный участок спорообразуюшего мицели , окруженный зоной гиф, котора  может быть как воздушной , так и погруженной или первично погруженной . Эта зона неокрашена. Спорообразуюша  область обычно темно-коричневого цвета с несушими споры клетками, возникающими

при росте на агаре или на воздухе. Рост может быть довольно энергичным, например, на солодовом агаре или неравномерным, например , на агаре Чапек-Доке.

Споры, образующиес  из ветвей конидиофор , видны в длинных, редко разветвленных цеп х. Они представл ют собой амероспоры и дидимоспоры (фрагмоспоры встречаютс  редко ), развивающиес  от вершины к основанию.

Зрелые споры довольно толстые, но местами тонкие. Амероспоры шарообразные диаметром 10 (9-11) мм, дидимоспоры почти цилиндрические с сужением около перегородки 18 (15- 22)Х10 (9-15) мм.

Источником усво емого углерода  вл ютс , например, многоатомные спирты - сахароза, глюкоза, лактоза, глицерин или маннит; источник полимеризуемого углевода, например крахмал; природные или синтетические масла

или жиры. Источник углерода содержитс  обычно в среде в количестве от 0,1 до 30% по весу.

Источниками усво емого азота  вл ютс  вещества органического или неорганического

происхождени . Они могут быть в форме нитрата щелочного или щелочноземельного металла или аммонийной соли неорганической или органической кислоты, например, нитрата

натри , кали , кальци  или аммони , тартрата аммоии , сульфата аммони  или фосфата аммони . Они могут быть также в форме аминокислоты , например глицина, в форме муки, например муки из сем н хлопчатника, или жидкости моченой кукурузы, нептона, мочевины , дрожжевого экстракта или м сного экстракта . Можно использовать смеси двух или более указанных выше веществ. Обычно источник азота содержитс  в среде в количестве 0,001-1,0%.

Среда содержит меньшие количества таких элементов, как фосфор (например, в виде первичного кислого фосфата кали  или вторичного кислого фосфата аммони ), магний (например , в виде сульфата или карбоната магни ), сера (например, в виде сульфата) и калий (например, в виде хлорида или карбоната кали ), и ничтожные количества, следы железа , марганца, цинка, молибдена или меди.

В качестве водной питательной среды исиользуют среду под названием Чапек-Доке.

Выращивание ведут при температуре 15- 35°С, предпочтительно при 25°С.

В качестве не смещивающегос  с водой органического растворител  используют, например , хлороформ, этилацетат, толуол или диэтиловый эфир, из которых предпочтительным  вл етс  хлороформ.

Антивирусный комплекс состоит из восьми соединений, обладающих способностью задерживать рост вирусов. Это - Снродесмины А, В, С, D, Е, F, G и Н.

Сиродесмин А имеет структурную формулу , где RI - ацетил, R2 - водород и Н 2:

К,0.

NCH,

СН

Сиродесмин В имеет также структурную формулу I, но RI - ацетил, Ra - водород, а Н 4; у Сиродесмина С Ri - ацетил, Ra - водород, а Н 3.

При обработке комплекса, задерживающего рост вирусов, двуокисью серы образуетс  другое соединение, обладающее тем же свойством - Сиродесмин I.

Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, G, Н и I имеют следующие характеристики.

Сиродесмин А

Найдено, %: С 49,7; Н 5,4; N 5,8; S 12,8.

С2оН2бН2О852.

Вычислено, %: С 49,7; Н 5,4; N 5,8; S 13,2.

Масс-спектр. Отсутствует исходный ион, но

имеетс  сильный пик при (М-82)+. Найдено

м/е 422, 1731; С2оН2бН2О8; требует м/е 422,

1689. При обработке триметилсилилимидазолом (бензол, 60°С, 3 час) образуетс  бис-триметилсилилпроизводное , в масс-спектре которого отсутствует исходный ион, но виден слабый пик. Соответствующие (М.-СНз)+ при 5 м/е 615, 1689; C5H39N2O8S2Si2; требует 615, 1686.

Ацетилирование. При обработке уксусным ангидридом в пиридине в течение недели при температуре 22°С получаетс  бис-ацетат с температурой плавлени  186-189°С. Найдено, %: С 50,5; Н 5,3; N 4,9.

C24H3oN2OioS2.

Вычислено, %: С 50,7; Н 5,2; N 4,9.

Наибольщий пик масс-спектра (М-82) + при м/е 506, 1871. C24H3oN2Oio требует м/е 506, 1901.

При обработке Сиродесмина А уксусным ангидридом в течение 1 час при температуре 22°С получаетс  моноацетат.

Найдено, %: С 49,9; Н 5,3; N 5,3; S 11,7.

C22H27N209S2.

Вычислено, %: С 50,0; Н 5,2; N 5,2; S 12,1.

На масс-спектре виден небольшой пик дл  (М-82)+ при м/е 496 и сильный пик дл  (М-82)+ при м/е 464.

При гидролизе Сиродесмина А 0,1 и. раствором ПС1 в метаноле получаетс  дезацетилсиродесмин А с температурой плавлени  198-201°С.

Найдено, %: С 48,4; Н 5,6; N 6,0; 8 14,3.

Cl8H24N2O782.

Вычислено, %: С 48,8; Н 5,6; N 6,3; 8 14,4.

В масс-спектре отсутствует ион, но виден сильный пик дл  (М-82)+ при м/е 380.

При обработке Сиродесмина А трифенилфосфином в хлороформе получаетс  моносульфид .

Найдено, %: С 52,7; Н 5,7; N 5,8; 8 7,1.

С2оН2бН2О8.

Вычислено, %: С 52,9; Н 5,8; N 6,2; 8 7,0. Молекул рный ион виден при м/е 454.

Сиродесмин В Найдено, %; С 43,4; Н 4,9; N 4,9; 8 22,8.

С2оН2бН2О884Вычислено , %: С 43,6; Н 4,8; N 5,1; S 23,3.

Масс-спектр: исходного иона не видно, но виден сильный пик дл  (М-8з)+ при м/е 422. Спектр практически идентичен спектру Сиродесмина А.

При обработке бис-триметилсилилтрифторацетамидом (бензол, 50°С, 3 час) образуетс  бис-триметилсилилпроизводное. На масс-спектре исходный ион отсутствует, но виден слабый пик, соответствующий (М-СНз)+ при м/е 647, 1445; С25Нз9Н2088з812; требует м/е 647, 1407.

Сиродесмин С

Найдено, %: С 46,3; Н 5,1; N 5,1; 8 18,0.

C2oH26N20883.

Вычислено, %: С 46,3; Н 5,0; N 5,4; 8 18,5. Масс-спектр. Сильный пик, соответствующий (М-8з)+при м/е422.

Сиродесмин D

Молекул рна  формула С2оН2бЫ2О88х, где х 4.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик дл  (М-Sx)+ при м/е 422.

Сиродесмин Е

Молекул рна  формула C2oH26N2O8Sx, где X равен, веро тно, 3. Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик дл  (М-5х)+при м/е 422.

Сиродесмин F

Молекул рна  формула C2oH26N2O8Sx, где X равен, веро тно, 3. Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик дл  (М-5х)+при м/е 422.

Сиродесмин G Найдено, %: С 49,7; Н 5,4; N 5,7; S 12,6.

C2oH26N2O8S2.

Вычислено, %: С 49,4; Н 5,4; N 5,8; S 13,2.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик дл  (М-82)+ при м/е 422.

Гидролиз. При обработке Сиродесмина С 0,1 Н. раствором НС1 в метаноле образуетс  дезацетилсиродесмин С; температура плавлени  195-196,5°С.

Найдено, %: С 48,4; Н 5,5; N 6,5; S 14,6.

Ci8H24N207S2.

Вычислено, %: С 48,8; Н 5,5; N 6,3; S 14,4.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик дл  (М-82)+ при м/е 380.

Ацетилирование. При обработке Сиродесмина С уксусным ангидридом в пиридине в течение 9 дней при комнатной температуре образуетс  бисацетат Сиродесмина С с температурой плавлени  159-159,5°С.

Сиродесмин Н

Молекул рна  формула С2оН2бН2О85х. Массспектр . Исходный ион отсутствует, по виден сильный пик дл  (М-Sx)+ при м/е 422. Сиродесмин I

Найдено, %: С 49,8; Н 5,5; N 5,5.

С2оН2бМ2О852.

Вычислено, %: С 49,4; Н 5,4; N 5,8.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик дл  (М-S)+ при м/е 422 и слабый пик дл  (М-S)+ при м/е 454.

Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, Н и I и их производные раздел ютс  методом хроматографии в тонком слое на силикагеле.

Сиродесмины, кроме I, выдел ют из комплекса , задерживающего рост вирусов, например , при сочетании колонной хроматографии и препаративной хроматографии в тонком слое.

Комплекс, получаемый при экстракции грибкового бульона, выдел емые из него Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, G, I, дезацетилпроизводные Сиродесминов А и G, моноацетат и моносульфид Сиродесмина А обладают способностью задерживать рост вирусов в присутствии клеток хоз ина, в частности они обладают активностью в отношении реновирусов в присутствии эмбриональных легочных клеток человека, а также в отношении вирусов Кокссаки А и В и Эко-вирусов.

Активность в отношении реновирусов измер ют следующим образом. Легочные эмбриональные клетки человека выращивают обычным способом на минимальной специфической среде Игла с добавлением 1% тел чьей сыворотки в стекл нных трубках при температуре 33°С. Восемь групп (по три в каждой) таких трубок обрабатывают испытуемыми растворами соединений в той же среде, содержащей 200, 50, 12,5, 3.1, 0,8, 0,2, 0,05 и 0,00 мг испытуемого соедитшпи  в 1 мл раствора. Инкубацию производ т при 33°С, и через 24 час в

каждую трубку помещают дозу риновируса, например, типа 2, соответствующую 100-кратной дозе культуры, вызывающей 50% инфекции . После дополнительной инкубации в течение

2 дней при 33°С каждую трубку исследуют визуально лл  определени  наличи  цитопатического эффекта, вызываемого токсичностью соединени , котора  характеризуетс  цитопатическим эффектом на весь слой клеток, а также дл  определени  наличи  цитопатического эффекта, обусловленного ростом вируса и который  вл етс  характерным, фокальным цитопатическим эффектом, легко отличимым от токсичности соединений. «Активной дозой

испытуемого соединени  называетс  концентраци  соединени , котора  защищает 50% клеток от цитопатического эфЛекта, вызываемого ростом вируса. «Токсичной дозой называют кониентращ ю испытуемого соединени ,

котора  обусловливает токсичность соединени  V 50% клеток культур, обработанных при такой концентрации соединени .

Комплекс и соединени  задерживают рост реновируса типа 2 при концентрации, равной

или меньщей 0,25 мг/мл, но в то же плем  не

оказывают заметного токсического эффекта

на клетки ткантт культуры при дозах, в 10 раз

больших паименьщей активной дозы.

Сиродесмип А вводили через нос самкам и

сампам крыс в дозе 0,25 мг/мл в день в течение 14 дней. Все крысы выжили и после их смерти не было обнаружено никаких гистологических ненормальностей. При применении с целью достижептт  антивирусного эффекта в присутствии клеток хоз ина комплекс пли соединение давали хоз ину в концентпапип, близкой к концентрации вируса, от 0.003 до 0.9.5 мг/мл. ДОПУСТИМО применение через нос или горло в дозах от 0,02

до 0.1 мг 3-6 раз в день. Дл  взрослых людей это эквивалентно дневной внутренней дозе от 2 до 20 мг.

Фармацевтические препараты могут быть изготовлены в форме таблеток, лепещек, капсул , носовых капель, жидкостей дл  впрыскивани  в нос пли горло, аэрозолей или жидкостей дл  ингал ции; их можно приготовл ть обычными способами с добавкой обычных индиЛферентных компонентов.

Предпочтительными  вл ютс  композиции, обеспечивающие антивирусную концентрацию комплекса или соединени  в тех органах хоз ина , в которых обычно произрастают риновпрусы , пйпрпмер на слизистой оболочке носа или горла, при непосредственном нанесеНИИ на указанные места или косвенно путем образовани  достаточно высокой концентрации комплекса или соединени  в крови после приема внутрь.

К таким предпочтительным композици м дл  непосредственного нанесени  (например, в форме лепешки, котора  медленно раствор етс  во рту и смачивает рот и св занные с ним пути раствором активного ингредиента) относ тс  композиции дл  ингал ции носа или горла в виде растворов антивирусного комплекса или соединени  в фармацевтически допустимой жидкости, котора  при ингал ции отлагаетс  в носовых проходах и горле, а также композиции дл  приема внутрь, например, таблетки.

Эти таблетки или лепешки содержат от 0,05 до 5 мг антивирусного соединени ; дл  профилактики или лечени  вирусной инфекции таблетки прииимают от 3 до 6 раз в день. Состав дл  впрыскивлии  в нос или горло содержит от 0,01 до 1 мг антивирусного соединени  в 1 мл раствора, и дл  профилактики или лечени  риновирусной итгфекции 0,1 мл такого раствора впрыскивают в нос или горло 3-6 раз в день.

Комплекс, соединени  или композиции можно примен ть профилактически дл  людей, которые могут соприкасатьс  с носител ми риновирусной инфекции.

Пример 1. Готов т питательную среду следующего состава (г): Нитрат натри 2,00

Первичный кислый фосфат кали 1,00

Семиводный сульфат магни 0,50

Хлорид кали 0,50

Семиводный сульфат железа0,01

Декстроза («Церелоза)50,00

Дрожжевой экстракт («Оксоид) 1,00 Концентрат второстепенных элементов1 ,00 Затем готов т концентрат второстепенных элементов, содержащий (г):

Семиводный сульфат железа1,00

П тиводный сульфат меди0,15

Семиводный сульф|ат цинка1,00

Четырехводный сульфат марганца 0,10 Молибдат кали 0,10

Его раствор ют в дистиллированной воде с добавлением концентрированной сол ной кислоты в количестве, достаточном дл  получени  прозрачного раствора, и разбавл ют дистиллированной водой до 1 л.

К питательной среде добавл ют Юн. раствор гидроокиси кали  до рН 5,8 и автоклавируют при давлении 0,7 кг/см 25 мин.

Sirodesmium diversum С.М. 1.102519 выращивают при 25°С в поверхностной культуре в 90 бутылках Томпсона, кажда  из которых содержит 1 л питательной среды. Продукт собирают через 35 дней, и фильтрат культуры (70 л, рН 6,5) экстрагируют толуолом (2 раза по 14 л). Объединенные экстракты высущивают безводным сульфатом натри  и выпаривают при 60°С/20 мм. Остаток (7,1 г) промывают петролейным эфиром (т. кип. 60-80°С, 4 раза по 25 мл), промывную воду отбрасывают и получают антивирусный комплекс.

Пример 2. Антивирусный комплекс двух опытов примера 1 объедин ют (6,52 г) и раздел ют на 2 равные части. Каждую часть отдельно фракционируют на хроматографических колонках.

Через верх колонки добавл ют экстракт в минимальном объеме смеси эфира и этилацетата (3:2), и колонку про вл ют той же смесью растворителей до тех пор, пока фронт растворител  не достигнет основани  колонн. Каждую колонку разрезают на щесть равных секций, объедин ют равноценные секции двух колонн и элюируют смесью этилацетата и метанола (97 : 3) 3 раза по 500 мл.

При выпаривании растворителей получают

6 фракций; 1-  фракци  наименее пол рна 

и 6-  фракци  наиболее пол рна . Фракции

1-3 отбрасывают, фракци  4 содержит Сиродесмины А и С совместно с менее пол рным

продуктом, фракци  5 содержит Сиродесмины

А, В и С совместно с нежелательным продуктом; фракци  6 содержит Сиродесмины В

совместно с основным продуктом.

Фракции 4-6 дополнительно раздел ют методом хроматографии в тонком слое на силикагеле G, F. Дл  про влени  используют следующие смеси растворителей: I - этилацетат и толуол (2: 1), II - муравьина  кислота , метанол и хлороформ (1 :4:95). Разделенные продукты выдел ют при элюировании полос смесью этилацетата и метанола (97:3). При разделении хроматографией в тонком слое фракции 4 сухой колонки (780 мг, 8 пластин , растворитель I) получают фракцию (а) 92 мг (главным образом Сиродесмин А) и фракцию (б) 165 мг (главным образом Сиродесмины А и С). При дополнительном разделении фракции (а) тем же методом (одну ПиТастину про вл ют дважды, растворитель II) получают фракцию (в) (43 мг, Сиродесмин А). При дополнительном разделении фракции (б) (2 пластины про вл ют дважды, растворитель II) получают фракцию (г) (36,4 мг, Сиродесмин А и следы Сиродесмина С) и фракцию (д) (65 мг, Сиродесмин С. загр зненный следами Сиродесминов Аи Б), При разделении тем же методом фракции 5 сухой колонки (716 мг, 8 пластин, раствори-, тель I) получают фракцию (е) СЙОб мг, главным образом Сиродесмины А и С), при дополнительном разделении которой (6 пластин, растворитель II) получают фракцию (ж) (63,4 мг, главным образом Сиродесмин А) и фракцию (з) (146 мг, главным образом Сиродесмин С).

Фракции (г) и (ж) объедин ют и дополнительно раздел ют (2 пластины про вл ют дважды, растворитель П) и получают фракцию (и) (37 мг, Сиродесмиц А). Фракции (в) и (и) объедин ют и раствор ют в бензоле (2 мл), а затем по капл м добавл ют

к перемешиваемому раствору дл  осаждени  твердого Сиродесмина А (68 мг).

Фракцию (з) дополнительно раздел ют (1 пластину про вл ют дважды, растворитель II) и получают фракцию (к) (68 мг, Сиродесмин С, загр зненный небольшими следами Сиродесминов А и В). Фракции (д) и (к) объедин ют , раствор ют в этилацетате (2 мл) и выдел ют твердый Сиродесмин С (60 мг) при осаждении петролейным эфиром.

При разделении тем же методом фракции 6 сухой колонки (6 пластин, растворитель П) получают фракцию (л) (193 мг, масло, Сиродесмин В), из которой при обработке смесью бензола и петролейного эфира получают твердый Сиродесмин В (113 мг).

П р и м е р 3. Антивирусный комплекс (2,5 г), полученный из 90 л сброженного продукта, обрабатывают в безводном пиридине (50 мл) хлористым тионилом (5,0 мл) 15 мин при 0°С. Затем добавл ют к смеси льда с водой (500 мл) и выдерживают дополнительно 15 мин. При добавлении 2н. серной кислоты устанавливают рН 2 и экстрагируют хлороформом (3 раза по 500 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натри  и концентрируют до получени  масла (1,43 г), которое высушивают в «сухую колонку силикагел  (430 г), приготовленную следуюш.им образом: колбу емкостью 2 л, содержап1,ую силикагель (1 кг, силикагель М.Г.С. фирмы Хопкин и Виллиам) и воду (120 мл), вращают при комнатной температуре 2 час. Затем добавл ют смесь этилацетата и толуола (2: 1) 112,5 мл, и колбу вращают еще 3 час. Колонку про вл ют смесью винилацетата и толуола (2:1) и раздел ют на 9 частей, каждую из которых элюируют смесью этилацетата и метанола (97 : 3) - 3 раза по 500 мл. Фракции, содержащие Сиродесмин А, объедин ют и раздел ют методом хроматографии в тонком слое (силикагель C.F., этилацетат : толуол 2 : 1) и получают чистый Сиродесмин А в виде масла (218 г).

Вторую партию промытого петролейным эфиром толуольного экстракта из 90 л перебродившего бульона обрабатывают таким же способом, и два образца Сиродесмина А (всего 505 МГ1 объедин ют и раствор ют в бензоле (5 мл). Твердый Сиродесмин А (358 мг) выпадает в осадок из раствора при добавлении по капл м петролейного эфира (т. кип. ).

Пример 4. Сиродесмин В (50 мг) в безводном пиридине (1,0 мл) обрабатывают хлористым тионилом (0,1 мг) в течение 12 мин при 0°С, добавл ют смесь льда с водой (25мл) и выдерживают 15 мин. При добавлении 2 н. серной кислоты устанавливают рН 2 раствора , который затем экстрагируют хлороформом (3 раза по 20 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натри , концентрируют до получени  масла (29,4 мг), состо щего в основном из Сиродесмина А, но содержащего следы Сиродесминов В и С. Сырой продукт

очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле C.F. (растворитель муравьина  кислота - метанол - хлороформ 1 :4 :95) и получают Сиродесмин А в виде масла (12,5 мг).

Пример 5. Сиродесмин С (5,0 мг) в безводном пиридине (0,1 мл) обрабатывают хлористым тионилом (0,01 мл) в течение 10 мин при 0°С, добавл ют к смеси льда с водой

(5 мл) и выдерживают 15 мин. При добавлении 2н. серной кислоты устанавливают рН 4 и экстрагируют хлороформом (3 раза по 5 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натри , концентрируют и получают Сиродесмин А в виде масла (4,3 мг).

Пример 6. Провод т реакцию Сиродесмииа А (250 мг) с уксусным ангидридом (6,25 мл) в безводном пиридине при комнатной температуре в отсутствии света в течение

1 недели, а затем реакционную массу обрабатывают водой (1,25 мл) в течение 1 час при температуре 5°С. При добавлении 2 н. серной кислоты устанавливают рН 2, разбавл ют водой и экстрагируют этилацетатом (4 раза по

50 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натри  и концентрируют до получени  масла (280 мг), которое очищают на силикагеле методом хроматографии в тонком слое (растворитель муравьина  кислота - метаНОЛ - хлороформ 1 : 4 : 95).

Полученный основной компонент дважды перекристаллизовывают из смеси этилацетата и петролейного эфира и получают бисацетат Сиродесмина А в форме игл светло-желтого цвета (127 MrV, т. пл. 186-189°С.

Пример 7. Раствор Сиродесмина А (50 мг1 и серы (15 мг) в пиридине (2 мл) выдерживают при комнатной температуре в темноте 24 час, а затем выпаривают досуха при температуре 35°С. Сиродесмины А, В и С получают при хроматографии - в тонком слое остатка (1 пластина силикагел  C.F., 40Х20Х XI см, растворитель этилацетат - толуол 2:1).

Пример 8. Культуру, выращенную, как описано в примере 1, собирают через 28 дней и фильтрат (70 л) экстрагируют хлороформом (2 раза по 14 л), высушивают над безводным сульфатом натри , выпаривают при пониженном давлении и получают антивирусный комплекс. Взболтав толуол, метанол, хлороформ и воду при объемном соотношении 9:9:4:4, получают двухфазную систему (верхнюю и нижнюю). Полученный ранее

комплекс (15 г) раствор ют в нижней фазе (300 мл), и этот раствор, а затем две дополнительные порции (300 мл) нижней фазы взбалтывают с верхней фазой (2 раза по 100 мл). Объединенные нижние фазы (900мл)

выпаривают досуха и остаток раствор ют в нижней фазе (100 мл) второй двухфазной системы, приготовленной при взбалтывании иетролейного эфира (т. кип. 60--80°С), толуола , метанола и воды при объемном соотношении 2:3:4: 1. Этот раствор и вторую порII

цию нижней фазы второй двухфазной системы (100 мл) взбалтывают с верхней фазой (2 раза по 100 мл), и объединенные нижние фазы (200 мл) выпаривают досуха. Остаток (10 г) хроматографируют на дезактивном силикагеле (850 г), и элюированные фракции дополнительно очищают многократной хроматографией в тонком слое на силикагеле C.F.

Пример 9. К раствору очищенного комплекса (11 г), полученного как описано в примере 8, при разделении растворител ми в пиридине (30 мл), добавл ют холодный раствор двуокиси серы в пиридине. После выдержки в течение /2 час при комнатной температуре реакционную смесь выливают на лед и при добавлении 2 н. сол ной кислоты (410 мл) устанавливают рН 2. Смесь экстрагируют хлороформом , экстракт промывают, высущивают и выпаривают. Получают остаток (8,9 г), который хроматографируют на дезактивном силикагеле .

Фракцию 2 очищают хроматографией в тонком слое на силикагеле C.F., вначале примен   хлороформ - метанол - муравьиную кислоту (95:4:1) в качестве растворител  дл  выделени  фракций с высоким и низким R(.

Фракции с низким Rf дополнительно очищают хромотографией в тонком слое, примен   этилацетат-хлороформ (7:3) в качестве растворител , и получают Сиродесмин I.

Фракции с высоким Rf очищают хроматографией в тонком слое с применением в у.а честве растворителей хлороформа-метанола- муравьиной кислоты (95:4:1), а затем толуол-метилацетат (1:2) дл  получени  Сиродесмина G.

Фракции 5 ц 6 объедин ют, хроматографируют на колонке дезактивированного силикагел  (288 г) хлороформом и получают Сиродесмин А.

Пример 10. Остаток из хлороформенного экстракта, описанный в примере 9, (4,46 г) раствор ют в метаноле (400 мл), содержащем концентрированную сол ную кислоту (4 мл), и раствор выдерживают 40 час при комнатной температуре. Затем этот раствор выпаривают до 35 мл и добавл ют воду (35 мл). Смесь экстрагируют смесью петролейного эфира (т. кип. 60-80°С) и толуола (2:3, 2 раза по 20 мл). Экстракты и часть нерастворимого вещества отбрасывают. Остальную водную фазу экстрагируют хлороформом, хлороформ испар ют и остаток раздел ют на равные части.

Одну часть (1,15 г) хроматографируют на дезактивированном силикагеле. Остаток 3 фракции перекристаллизовывают из ацетона и получают дезацетилсиродесмин А, т. пл. 199-201°С. Другие части сырого продукта кристаллизуют из ацетона и получают дезацетилсиродесмин с температурой плавлени  198-20 ГС.

Пример 11. К питательной среде, приготовленной , как онисано в примере 1, добавл ют гидроокись кали  в виде 10 н. раствора

12

до рН 5,6 и автоклавируют при давлении 0,7 кг/см 25 мин. Sirodesmium diversum С. М. 1.102519 выращивают при температуре 25°С в конических колбах, содержащих по 150 мл среды, на вращающемс  устройстве. Через 4 дн  12 мл бульона используют дл  инокул ции дополнительного количества колб, содержащих такое же количество той же среды . Через 12 дней роста в указанных услови х

собирают урожай. Установив рН 6,0, фильтрат (50 мл) дважды экстрагируют половинным объемом хлороформа. Объединенные экстракты выпаривают и получают антивирусный комплекс.

Пример 12. Sirodesmium diversum С.М. 1.102519 выращивают при температуре 25°С на вращающемс  приспособлении; кажда  колба содержит 1 л питательной среды, приготовленной , как онисано в примере 11.

Через 3 дн  3 л бульона используют дл  инокул ции 30 л питательной среды следующего состава (г):

Глицерин40,00

Питрат натри 2,21

Первичный кислый фосфат кали  5,00 Семиводный сульфат магни 1,00

Дистиллированна  водаДо 1,00 (л)

Питательную среду автоклавируют при давлении 1,05 кг/см в течение 25 мин, рН среды

не устанавливают; рН стерилизованной среды - 4,9.

Среда содержитс  в стекл нном и из нержавеющей стали бродильном чане. В последний подают стерильный воздух со скоростью

15 л/мин, и содержимое перемещивают турбкнной мещалкой со скоростью 380 об/мин бе  применени  перегородок. При необходимости добавл ют противовспениватель пропилен - гликоль 750.

Через 15 дней устанавливают рН 6,0 (вм сто бывшего 6,7), фильтрат бульона экстрагируют хлороформом, затем хлороформ испар ют и получают антивирусный комплекс. Пример 13. Раствор Сиродесмина А

(0,083 г) в метаноле (100 мл), содержащий концентрированную сол ную кислоту (1 мл), выдерживают в темноте при комнатной температуре 4 дн , а затем выпаривают досуха при температуре ниже 20°С. К остатку добавл ют метанол, и раствор выпаривают до удалени  следов HCL Остаток очищают хроматографией в тонком слое на силикагеле C.F., примен   хлороформ-метанол-муравьиную кислоту (95:4:1) в качестве растворител , и

после перекристаллизации из смеси этилацетата и петролейного эфира получают дезацетилсиродесмин А с температурой плавлени  198-201°С. Пример 14. Раствор Сиродесмина А

(0,15 г) и трифенилфосфина (0,078 г) в хлороформе выдерживают 4 час при комнатной температуре и выпаривают досуха. Остаток очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле С.Р., примен   хлороформ - метанол - муравьиную кислоту в качестве растворител , и получают моносульфид Сиродссмина в форме гел . При осаждении его из раствора в этилацетате петролейным эфиром получают бесцветный порошок. Пример 15. Сиродесмин С (0,1 г) раствор ют в метаноле (100 мл), содержащем концентрированную сол ную кислоту (1 мл), и раствор выдерживают в течение 3 дней при комнатной температуре в темноте. Остаток, полученный после отгонки растворител , очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле C.F., примен   метанол-хлороформ в качестве растворител  дл  про влени , и после перекристаллизации из ацетона получают дезацетилсиродесмин С с температурой плавлени  ,5°С. Пример 16. Сиродесмин G (0,044 г) раствор ют в смеси пиридина (2 мл) и уксусного ангидрида (1 мл), и раствор выдерживают в темноте при комнатной температуре 9 дней. Затем раствор охлаждают на соленом льду, добавл ют холодную воду (0,4 мл), и смесь выдерживают 4 час. После добавлени  3 н. серной кислоты (60 мл) смесь экстрагируют этилацетатом (3 раза по 25 мл), и объединенные экстракты промывают водой (50 мл), 5%-ным раствором бикарбоната натри  (2 раза по 50 мл) и снова водой (50 мл). Органический слой выпаривают, остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетата и петролейного эфира и получают бисацетат Сиродесмина G; т. пл. 159-159,5°С. Пример 17. Приготавливают раствор дл  пульверизации в полость носа, содержащий следующие компоненты (мг): Сиродесмин А6 Тимерозал2 Метиловый эфир параоксибензойной кислоты80 Пропиловый эфир параоксибензойной кислоты20 Фосфат натри 500 Динатриева  соль ЭДТК5 Дистиллированна  вода (без пирогенов)До 100 (мл) Предмет изобретени  Способ получени  противовирусного комплекса , отличающийс  тем, что культуру грибка штамма Sirodesmium diversum С. М. 1.102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода и азота, экстрагируют фильтрат культуральной жидкости не смешивающимис  с водой органическими растворител ми , например хлороформом, высушивают экстракт и при необходимости фракционируют на активные компоненты.