SU513595A3 - Способ выделени орготеина - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОРГОТЕИНА

мер, ацетона, метанола, этанола, буферный раствор с ионной силой, например 0,01-0 ,05М, предпочггительно 0,02-0,ОЗМ. Выделение рекомендуют вести при слаЦ бо щелочной величине рН, наход щейс  в пределах между 7 и 9, предпочтительно между 7,5 и 7,8.

Дл  повышени  ионной; силы экстраген- та в него ввод т хлористый калий, хлор стый натрий, сульфат двухвалентного марганца или другие незабуферивающие соли.

Дл  повышени  избирательности буфернго раствора в него добавл ют растворимы сахариды, например глюкозу, сахарозу и . т.д., что облегчает процесс экстракции.

Смесь суспендированных частиц тkaни и водного экстракта раздел ют путем фильровани  под давлением или в вакууме, или путем центрифугировани .

Дл  осуществлени  способа пригодны растворимые белки красных кров ных клеток , содержащие орготеин и имеющие изоэлектрическую точку, отличающуюс  от изоэлектрической точки ангидразы угольной кислоты, присутствующей в смеси, по меньщей мере, на одну единицу рН. Предпочтительны растворимые белки красных кров шых клеток быков, цыпл т и человека .

Красные кров ные клетки отдел ют от плазмы крови путем центрифугировани , выделенные клетки промывают и повтор ют центрифугирование, удал   остаточную плазму.

Обработанные таким образом клетки подвергают лизису (разрущению клеток) под действием ультразвука.

После удалени  нерастворимых компонентов клеток, на долю которых приходит с   около 2 % по весу консервированных клеток, раствор растворимых белков из подвергшихс  лизису красных кров ных клеток контактируют с хроматографичес- КИМ адсорбентом, дл  того чтобы произошла адсорбци  орготеина. (

Дл  того чтобы уменьщить вли ние растворенных солей на способность орго- теина к адсорбированию на хроматографи- ческом адсорбенте, рекомендуют поддерживать ионную силу исходного раствора, на уровне от 0,ОО1 до 0,005М.

По предлагаемому способу в качестве адсорбентов используют диэтиламиноэтил- целлюлозу (ДЭАЭ), триэтиламиноэтил-ц&ллюлозу (ТЭАЭ), диэтиламиноэтил-сефа- деке и QAE-сефадекс. Такие смолы име- ют адсорбционную емкость, составл ющую примерно от 1,0 до 5 миллиэквивалента на грамм.

Орготеин выдел5пот из ионообменивающей смолы методом избирательоного элю-i

чровани .

Сначала вымывают из колонки весь гемоглобин и другие не подвергшиес  адсорбции белки, а затем осуществл ют избирательное элюирование ор1 отеина из колонки и выделение его из той фракщш элюата, котора  содержит чистый орготёи.

Удаление гемоглобина, миоглобина и других не адсорбировавшихс  белков осуществл ют путем промывани  -колонки водным элюентом , величина рН которого составл ет примерно 6, или же фосфатным буферным раствором .

После удалени  из колонки гемоглобина и других, не подвергщихс . адсорбции, белков , провод т избирательное элюирование орготеина из колонки при помощи водного

элюента, величина рН которого составл ет примерно 6, например находитс  в пределах между 5,7 и 6,3 и с таким варьированием ионной силы, чтобы элюирование адсорбировавшихс  белков происходило после-

довательно. Дл  этого используют буферный раствор с ионной силой около О,001-0,005М дл  элюировани  легко элюирующихс  белковых смесей, примерно 0,02-0,ОЗМ дл  элюировани  орготеина и примерно 0,1 - ,2,ОМ дл  освобождени  колонки от остаточf 1ых белковых примесей.

IHi

Определение фракшш элюата, содержащей чистый орготеин, осуществл ют путем измерени  оптической плотности элюата при

длине волны 28О ммк и 265 ммк. ...

Начало отбора фракции элюата, содержащей существенные количества меди и щшка считают началом отбора фракции орготеина , если в качестве исходного материала примен ют растворимые белки тканей животных .

Окончание отбора фракции орготеина оп- редел ют по резкому снижению содержани  меди и цинка и по резкому повышению оп-. |тической плотности при длине волны 265 или 280 ммк.

Чистый орготеин может быть подучен термической обработкой предварительно очищенного на ДЭАЭ-целлюлозе орготеина.

Орготеин экстра-чистоты получают из выделенного на ДЭАЭ целлюлозе орготеина путем последующей термической обработки части элюата, содержащего орготеин, ионы

двухвалентной меди и ионы двухвалентного цинка, например, при температуре 65-75°С в течение 15 мин, при величине рН 5,8 с последующим центрифугированием и диализом , путем повторной ионообменивающё,

{хроматографической очистки на ДЭАЭ-целлюлоэе нли путем обработки протеопитичео КИМ энзимом, i Пример 1, Орготенн из печени бы ка. Печень быка (212г) иарезают на поло ки шириной 2 см, удал ют соединительную ткань и кровеносные сосуды, промывают дл  удалени  крови и гомогенизируют при максимальной скорости в быстроходном см сителе, использу  на 1 кг печени 3,8 мл трис-глициноБого с ней буферного раство ра с рН 7, 5,ОЗМ по сахарозе и О,05М по НС8 , Затем центрифуги)уют при О С 60 мин. Центрифугат отдел ют, производ т диализ верхнего сло  жидкости с использо ванием фосфатного (0,005М) буферного раствора с величиной рН, равной 6,0, Зате снова центрифугируют и фильтруют через микропористый фильтр (версанор) дл  по лучени  прозрачного раствора. Фильтрат внос т непосредственно в ионо о менивающую колонку диэтила1 1иноэтил-це люлозы (около 4Ог, 2,5 см х 40 см). Ко лонку промывают (скорость течени  200 мл/час)- при помощи 1 л фосфатного буфер ного рэаствора (0,О05М, рН 6,0) и затем четырьм  литрами того же буферного раствора , содержащего хлористый натрий в количестве ПОСТО5ШНО и постепенно во,эраста ющем в интервале от О до 7,5х1О М, при скорости течени  200 мл/час. При этом производ т непрерывное измерение оптической плотности А,,, и Арпд элюата и посто нный контроль содержани  меди и шшка с использованием метода адсорбционной спектрофотометрии. После отбора 1 л элюата, не содержащего хлористый натрий, собирают 750 мл элюата, содержащего постепенно возрастающие количества хлористого натри  или хлористого кали , в этот момент времени мол рность постепенно достигает величины 0,О18М, величины оптической плотности Аре- и уменьшаютс  до низких величин , а содержание меди и цинка резко возрастает. После этого собирают элюат и отбор его ведут до тех пор, пока содержание меди снова снизитс  до мршимально- го, а мол рность достигает величины около 2,8x10 М (55О мл элюата,который содержит 240 мг орготеина высокой степени чистоты). Чем меньше фракци , отбираема  из этой порции элюата, тем больше степень чистоты присутствующего в ней и выдел емого из него орготеина и тем меньще его выход. Орготеин наивысшей степени чистоты присутствует в элюате, ионна  сила которого составл ет примерно 0,022А (при общем объеме элюата 950 мл). В этой точке кривые поглощени  меди и цинка имо« ют максимумы. Диализ фракции, наход щейс  в штер& ле объема отбираемого элюата от 750 до 1300 мл, производимый с использованием воды до снижени  проводимости до 0,04М, (фильтрование через микропористый фильтр (и лиофилизаци  проводима  в стерильных услови х, предпочтительно после, смешени , примерно вдвое большим весовым количеством сахарозы (из расчета на орготекн), привод т к получению вьщйле шого полностью активного, неантигенного, пригодного дл  инъекций орготеина, качество которого сравнимо с качеством того же препарата, изготавливаемого е лромышленности дл  исполь зованн  в ветеринарии. Промывание колонки дл  удалени  не адсорбированных или слабо адсорбированных белков до элюировани  орготеина осуществл ют при посто нной ионной силе, со ступенчатым повыщением ионной силы или при непрерывном повышении ионной силы, например путем элюировани  колонки буферным раствором с ионной силой, на эд щимс  в интервале между, примерно, О,012М и, мерно, 0,015М, производимым до тех пор, пока величины оптической плотности Аг 265 не сниз тс  до минимальных значений , с последующим элюированием орготеина при посто нной величине ионной силы, при ступенчатом повышении ионной силы, или при непрерывном повышении ионной силы в пределах между, примерно, 0,О18М и, примерно, О,028М. Затем колонку освобождают от остаточных адсорбированных белков путем повышени  ионной силы элюента до величины около 0,1М или выше. При применении способа, описанного в примере 1, сходные результаты были получены при использовании в качестве адсорбентов ТЭАЭ-целлюлозы и имеющей попе речные св зи декстрановой смолы, содержащей .диэтиламиноэтильные группы, При применении способа, описшшого в примере 1, сходные результаты получены, когда в качестве исходного матер1{ала при-: мен ют растворимые белки, выделен1 ые соответственно , из тканей бычьего мозга, почек , селезенки, легких, семенников, подж&лудочной железы, тимуса, мышц и тех же тканей свш1ей, лошадей, овец и цыпл т. Пример 2. Орготеин из крови. Свежую бычью кровь (87О мл) собирают в 3,8)о-ном растворе цитрата натри  (0,5 объем/объем). Цонтрпфугиру зт корости врашеии  центрифуги, соэ7ветстг(ую

щей 40ОО об/мш«, при температуре 0°С. 1 Плазму отбрасывшот и консервированные красные клетки (ККК) промывают 3 порци ми 0,9%-ного физиологического раствора. ККК подвергают лизксу путем п тиминутной обработки ультразвуком при ко /шатной температуре .

После этого провод т диализ, помеща  по другую сторону мембраны сначала дистиллированную воду, а затем - 0,О05М фосфатный буферный раствор с рН 6,0 в течение 24 час при температуре 4 С (четыре замены второй жидкости, объем каждой порции 4 л); увеличение объема соответствует 110%.

Подвергшийс  диализу экстракт внос т в колонку (2,5x30 см) ДЭАЭ-целлюлозы, приведенной в состо ние равновеси  с 0,005М, фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Колонку промывают при скорости течени  240 мл/час при помощи 0,005М фосфатного буферного раствора. Больша  часть гемоглобина по вл етс  при истечении объема элюента, соответствующего объему колонки , а остальную часть удал ют при введении дополнительных ;250 мл элюента (обШий объем 450 мл).

Элюирование оргртеина осуществл ют при помощи 4 литров того же буферного растjaopa с повышающейс  концентрацией хлорисггого натри  в пределах от О до 0,08М.

Измерение содержани  меди и шшка и оптической плотности элюата и A,g производ5гг также,как в примере 1.

Диализ отобранной фракции, содержащей орготеин, провод т, помеща  по другую сторону мембраны депонизированную воду, до установлени  проводимости, равной, приме1 но , 0,3-0,45 мком (обратные микроомы), фильтруют через фильтр с порами в 0,45м и лиофилизируют.

При этом получают примерно 52 мг of)готеина , выход которого составл ет 0,013% из расчета на консервированные красные клетки; активность, из расчета на содазу, составл ет 25ОО единиц/мг, что соответствует 75% общей активности орготеина, как перекисной дисмутазы, первоначально присутств)тошей в продукте лизиса.

Колонку регенирируют дл  пЬвторного применени  путем промывани  ее буферным раствором, ионна  сила которого составл ет , по меньшей мере, 0,1М и доходит до 2М с. последующим ополаскиванием депонизировсшной водой.

При применении способа, описанного в примере 2, чистый орготеин выдел ют из красных кров ных клеток человека, кроликов , крыс и цыпл т.

При применении способа, описгишого в примере 2, сходные результаты лолучены при использовании ТЭАЭ-иеллюлозы и имеющей поперечные св зи декстрановой смолы содержащей диэтиламиноэтильные группы.

Формула Изобретени 

Способ, выделени  орготеина путем хроматографического фракционировани  на ионообменных смолах орготеинсодержащего материала , отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевого продукта , адсорбцию орготеинсодержашего материала осуществл ют на диэтиламиноэтил- и триэтиламиноэтил-целлюлозе при рН 6,0, элюируют буферным раствором с ионной силой не более 0,р2Мс последующей десорбцией целевого продукта градиентным .буферным раствором с ионной силой 0,02-0,ОЗМ с отделением фракций элюата с оптической

плотностью А

или А

содержащее

гйо

265

двухвалентные ионы меди и/или цинка.