SU584801A3 - Способ получени фермента, окисл ющего холестерин до перекиси водорода и холестенона - Google Patents
Способ получени фермента, окисл ющего холестерин до перекиси водорода и холестенонаInfo
- Publication number
- SU584801A3 SU584801A3 SU7301934663A SU1934663A SU584801A3 SU 584801 A3 SU584801 A3 SU 584801A3 SU 7301934663 A SU7301934663 A SU 7301934663A SU 1934663 A SU1934663 A SU 1934663A SU 584801 A3 SU584801 A3 SU 584801A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- enzyme
- buffer solution
- phosphate buffer
- culture
- atcc
- Prior art date
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N cholest-5-en-3-one Chemical compound C1C=C2CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N 0.000 title claims description 4
- NYOXRYYXRWJDKP-UHFFFAOYSA-N cholestenone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 NYOXRYYXRWJDKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims 4
- HVYWMOMLDIMFJA-UHFFFAOYSA-N 3-cholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 title 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 241001251094 Formica Species 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000001238 wet grinding Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- QIVUCLWGARAQIO-OLIXTKCUSA-N (3s)-n-[(3s,5s,6r)-6-methyl-2-oxo-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-5-(2,3,6-trifluorophenyl)piperidin-3-yl]-2-oxospiro[1h-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3,6'-5,7-dihydrocyclopenta[b]pyridine]-3'-carboxamide Chemical compound C1([C@H]2[C@H](N(C(=O)[C@@H](NC(=O)C=3C=C4C[C@]5(CC4=NC=3)C3=CC=CN=C3NC5=O)C2)CC(F)(F)F)C)=C(F)C=CC(F)=C1F QIVUCLWGARAQIO-OLIXTKCUSA-N 0.000 description 1
- RQNOFUZGXHSHOT-UHFFFAOYSA-N 1-(diethylamino)ethanol Chemical group CCN(CC)C(C)O RQNOFUZGXHSHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000004688 heptahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
1
Изобретение относитс к области микробиологии.
Способ получени фермента, окисл ющего холестерин до перекис;и водорода и холестенона заключаетс в том, что биомассу микроорганизмов-продуцентов экстрагируют буфером, содержащим неионогенное поверхностно-активное вещество и выдел ют целевой прод кт из бесклеточного экстракта, кроме того в качестве продуцента используют культуру ProactijioJnvce eivthropotis штамм NBC 9158. или ЛТСС 17895,или АТСС 42 77,или культуру Bocardioi formica штамм АТСС 14811,
Микроорганизмы разлагают, раствор ют и извлекают с помощью буферного раствора, содержащего неионогенное поверхностно-активнае средство.
Предпочитаекыьда неионогенными поверхностно-активными средствами вл ютс ёьпкиларилэтиленг. и аддукты окисей полиэтилена и полипропилена, в особенностг: их сложные эфиры. Принципиальна концентраци пов ерхностно-активного средства в используемом дл разложени (растворени ) и дл экстрагировани в буферном растворе зависит от примен емого поверхностно-активного средства и может определ тьс с помощью предварительных испытаний. При
годны концентрации 0,01-3%, преимущесвенно 0,1-1%. РН буферного раствора 5-9, предпочтительно 6-8.
Ьсобенно хорошие результаты получаютс , если микроорганизм перед растворением и перед экстракцией в прису ствии поверхностно-активного средства промывают смесью бутанола и воды.
Полученный экстракт, содержащий в растворе Фермент, очищают на ионообменнике .
В качестве ионообменника примен ют анионообменные смолы, в особенности слабобазисные сорта, предпочтительными ионообменниками вл ютс и те, которые несут диэтиламиноэтаноловую группу.
Вымывание ионообменника осуществл ют 0,01-0,2 М буферным раствором с рН 5-9. Концентраци поверхностно-активного средства:преимущественно 0,052% .
Предпочтительно применение 0,03- 0,1 М фосфатного буферного раствора с содержанием 0,2-0,7% поверхностноактивного неионогенного средства.
Из полученного таким путем элюата фермент осаждают с помощью солей или органических растворителей, например сульфата аммокк , метанола и других.
Дл повторного растворени , осажденного фермента примен ют.. буферный раствор, который содержит небольшое количество поверхностно-активного 1гредства.5
Фермент, полученный после и нооб шнного вымывани можно использовать непосредетвенно дл количественного определени холестерина согласно уравнению «О колестёрин (НН) ( О,холестенон4-НаОйАктивность фермента и эффективность предла аемого способа определ ют благодар тому, ЧТО1 образукадуюс фракцию HgO замер ют по известным методам оп- , ределени
Микроорганизмы выращивают на среде из минеральных солей, содержащих пептон; и как только достигают логариф;ьшчвской фазы роста, ;добавл ют водиую эмульсию, которую изготавливают путем мокрого размола водной суспеввчи холестерина и последующей стерилизацией при высокой температу зе.
Таким Ьбразом удаетс достичь 100% использовани холестерина в течение 25 односуточного выравнивани культуры (| шкроорганизма) при выходе L-2 г чисгой субстанции сухих клеток. Бульон с купьтуроП добавл ют в таком колидестве , что задают 1-20 г холестерина 30 йа каждый литр в период роста. Загруэку осуществл ют порци ми по мере микроорганизмов.
Небольшое количество холестерина добавл ют в бульон с культурой ещё в ад начале роста, т.е. перед достижением логарифмической фазы роста.
В качестве питательной среде исполь- ауют водный.раствор, содержащий вес.%s 0,1-2 пептона, 0,01-0,2 , 0,05i , 0, гептагидрата суль ата магни , котора содержит следы хлорида железа и хлорида кальци , рН 6-9. Начсшьна загрузка холестерина составл ет 0,01-0,1%.
Удельное содержание фермента до 7 V/r сухой массы бактерий и 1-3,5 г сухой массы бактерий на .каждый литр йигательной среды.
Удельное содержание микроорганизвж в в ферменте удаетс , увеличить благодар тому что лшкроорганизм сна«аала вЕзраашвают на ацетате и затем на холестерине в качестве единственного |йсточника углерода,.
Так, например при выращиваний-мик- роорганизмбв на среде из минеральных солей с указанным выше составом, но при замене пептона ацетатом вколичестве 0,5 вес,% до начала добавлени холестериновой эмульсии достига- Йй ют повышени удельной активности до 24 V/r сухой массы, одновременно увеличиваетс содержание сухой массы до б,5-г/л. Значительное повышение содержани сухой масйы и активности до- g$
ртигают благодар тому, что к водной суспензии холестерина добавл ют в качестве эмульгатора небольшое количестйо 0,02-1, предпочтительно 0,05-0,3 вес.-% дрожжевого экстракта.
Предпочтительна питательна среда состоит из водного раствора с содержанием 0,1-2 вес.% ацетата (ацетата чм мони ), 0,01-0,2 вес,% KgHPO,, 0,051 вес.% , 0,05-0,l вес.% сульфата магни в качестве гептагидрата, следовхлорида железа и хлорида кальци с величиной рН 6-9. При достижении логарифмической $азы роста ацетат эамен ют хо.естерином. Чтобы величина рН в период эьфащивани оставалась посто нной , ttenpeiX:iBHO или порци ми загружают кислоту. Во врем фаз роста с помощью ацетата в качестве источника углерода примен ют уксусную кислоту , как только переход т на холестерин , уксусную кислоту замен ют минеральной кислотой. В этой второй стадии роста npHMeansTt сол ную кислоту дл р«гулирован11Я величины рн. При этом достигают активность до 30V/r сухол ы&ссы,
; Пример 1.2л питательной среды, состо щей из вес.% казеинового пептона, 0,05 вес.% , 0,2 вес,% H KjPOv, 0,02 вес.% гепта-гидрата сульфата магни , следов хлорида железа и хлорида кальци в водопроводной водо и с помощью КОН регулируют величину рН 7,5, засевают в качающейс колбе с 200 мл хорошо вы рсшей предварительной культуры Р г OCSC i 1 по m у с е 5 er-vthropogig ЫВ(СГ Э15Жи сильно вентилируют иа магнитной мешалке. С началом логарифмической фазы роста, определ емой по возникающему увеличению помутнани , в период дальнейшего В1:фащивани периодически загружают приготовленную с помощью мокрого размола, стерилизованную холестериновую эмульсию,таким образом, что в течение 20 ч в колбу загружают 10 г холестерина. Через 5 ч после по- следней загрузки клеточную массу собирают nyteM центрифугировани . Получают 4 г сухой массы бактерий. После расщеплени с помощью ультразвука получают 3V/г фермента.
Пример 2. в сосуде культивируют 15л описанной в примере 1среды вместе с 0,5л хорошо выращенной предварительной культурой PfoactinoTTtTces ervttirpogis АТСС 17895 при сильной аэрации.С самого начала загружают 0,05% холестерина .С началом логарифмического рос та непрерывно загружают cтepилизoвaнt ную холестериновую суспензию в течение дальнейшего выращивани , так что в ферментер загружают в целом 50 г холестерина за 15 ч выращивани . При этом получают бактериальн то массу в 40 г. Из бактериальной массы посредством расщеплени (разложени ) ультразвуком получают 7,1 V /г фермента.
Приме р 3. Как описано в примере 2, в рабочем объеме 60 л культивируют бактерии Prooctinomyces .erylhropofis (ВС 9158) . Приблизительно через 25 ч ввод т свежую питательную среду в сосуд дл выращивани бактерий и забирают раствор с вьфосшей культурой из этого сосуда.
Одновременно в ферментатор ввод т холестериновую суспензию; за 1 ч загружают около 3 г холестерина. Таким образом при непрерывном выращивании получеиот 1,2-1,5 г/л бактериальной сухой массы с одинаковой удельной активностью .
Пример4. В ферментаторе емкостью 20 ПК 15 л питательной среды, состо щей из 0,5 вес.% ацетата аммони , 0,05 вес.% вторичного фосфата кали , 0,2 вес.% первичного фосфата аммони , 0,02 вес.% гептагидрата сульфата магни и следов хлориду железа и кальци в водопроводной воде, засеивают 0,5 л хорошо выращенной предварительной культуры бактерий Proactinomjce rythrofotiA ЫВС 9158 и культивир1тот пр сильной аэрации.
Величину рН культуры поддержива от посто нной посредством текущей,загруз ки 20%-ной уксусной кислоты до конценрации биомассы около 1,5 г/л. После достижени этого содержани стерилизованную суспензию непрерывно загружают в ходе дальнейшего выращивани таким образом, что в целом в ферментатор загружают 30 г холестерина в течение 20 ч выргшшвани культуры. Холестеринова суспензи содержит 0,1-0,2% дрожжевого экстракта. Зааем дл нейтрализации культуры вместо уксусной кислоты используют разбавленную сол ную кислоту.
После завершени культивировани биомассу с помс цыо центрифугировани отдел ют от раствора культуры.
Примерз. При двухступенчатом непрерывном способе выращивани комбинируют два ферментатора с рабочими объемами 15 л дл первой и 70 л дл второй ступени таким образом, что при часовом протоке 4 л, описанной в примере 1 питательной средаа получаетс дол протока 0,25-0,30 дл первой ступени и 0,055-0,065 дл второй. К началу культивировани вторую ступень засевают хорошо выращенной предварительной культурой бактерий Prvac-. tinomyces eirithropolis , ATGC 17895 В количестве 1,5 л и вторую ступень засевают такой же предварительной культурой в количестве 0,5 л при сильной; аэрации обеих ступеней, причем первую ступень нейтрализуют с помощью уксусной кислоты, а вторую ступень с по (ющыо сол ной кислоты.
Одновременно во вторую ступень включают систему притока (4 л питательной среды/чар). Величину рН выдерживают 7-7,5. Таким образом за 1 ч получают 4 л бульона с культурой при 7 г/л при активности 30 /г сухой массы. Раствор культуры собирают в охлажденном резервуаре и бактериальную массу выдел ют из него на непрерывно действующей центрифуге. Дл регулировани виличины рН в первой ступени на каждый час требуетс приблизительно 10 г :100%-ной уксусной киспоты .
fipHMepS. 40 мл суспензии с бактери ми Hocapdia erythropofis (около 10 г сухой массы)примешивают к 40 мл 1г -бутанола и в течение нескольких минут перемешивают при комнатной температуре. Смесь центрифугируют и из нее удал ют бутанол и лишнюю водную фазу. Осадок снова примешивают к 40 мл воды и после изготовлени гомогенной суспензии клеток снова при-мешивают к 40 мл п -бутанола, несколко минут-перемешивают и. центрифугиру-t ют. Осадок суспендируют в 40 мл 0,01 ; буферного раствора фосфата (рН 7,0), к которому добавл ют 0,3% неионогенного поверхностно-активного средства (алкиларилполиэтиленгликоль) и перемешивают в течение 30 мик при комнат- ной температуре. Затем центрифугируют и оссщок извлекают. Экстракт содержит около 120 ед. фермента с уделаИой активностью 3 ед/м протеина.
Этот экстракт примешивают к твер- ; дому сульфату аммони до концентра ,ции 1,3 М в сульфате аммони при температуре О С, затем суспензию центрифугируют , осадок собирают на основе очевидной липофильной доли на поверхт ности раствора. Спеченный осадок фил$труют , рас-рвор ют с 0,01 М буферного раствора фосфата, рН 7 и при температуре О С подвергают диализу по отношению к тому же буферному раствору, Диализированный раствор пропускают через уравновешенную с помощью 0,01 М фосфатного буферного, раствора колонну товарного анионита с диэтилЬминоэтаноловыми группами на основе дэкстрана. При этом фермент адсорбируетс . После промывки колонны с помощью того же буферного раствора npoj извод т последовательно промывку растворами с 0,5%, 2% и 5% указанного вы-Ь ше поверхностно-активного средства в воде. При этом вымываютс большие количества загр знений.
Claims (2)
- Затем последовательно, осуществл ют промывку с помощью 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН - 7; 0,05 М фосфатного буферного раствора, рН - 7, 0,2м фосфатного буферного раствора, рН 7, и 0,5 М фосфатгчого буферного раствора рН 7. Затем снова п5юизвод т промывку с помощью 0,05 М фосфатного буферного раствора (рН 7) и фермент с 0,05 М фосфатного раствора, к которому добавл ют 0,05% поверхностно-активного сред ства, вымьгааетс . В элюате наход тс около 80% адсорбированной на колонне ферментной активности в ферменте с удельной активностью 25-30 V/мг протеина. Пример 7. Повторно осуществл ют способ по примеру 6, но промывку во дой с бутанолом не производ т,Таким об разом, получают экстракт дл высг1живани сульфата аммони , который содержит около 120. ед. фермента с удельной активностью в 1ед/мл протеина. Дальнейшее обогащение известным способом приводит к получению продукта с удельиой активностью 8-10 V /мг протеина. Примере. Повтор ют способ по примеру 6, но вымывание анионита осу1гествл ют с помощью водного раствора, кото1илй содержит 5% такого же поверхностно-активного средства в растворенном состо нии. Фермент поглощаетс из внионита (анионообменной смоле). Формула изобретени 1.Способ получени фермента, скисл кидего холестерин до перекиси водорода и холестенона,отличающийс тем, что биомассу микроорганизмовпродуцентов экстрагируют буфером, содержгшшм неионогенное поверхностно-активное вещество и выдел ют целевой продукт из бесклеточного экстракта.
- 2.Способ по п. 1, отличающийс тем, что в качестве проду-, Цента используют культуру Proociinomyoes «r thropotis штамм КВС 9158, или АТСС 17895, или АТСС 4277, или культуру НосалКа formica штамм АТСС 14811
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2224131A DE2224131B2 (de) | 1972-05-17 | 1972-05-17 | Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Cholesterinoxydase, welches Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon und H tief 2 O tief 2 oxydiert |
| DE2224133A DE2224133B2 (de) | 1972-05-17 | 1972-05-17 | Verwendung von bestimmten Mikroorganismen-Stämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxydase, welche Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon + H tief 2 O tief 2 oxydiert |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU584801A3 true SU584801A3 (ru) | 1977-12-15 |
Family
ID=25763267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU7301934663A SU584801A3 (ru) | 1972-05-17 | 1973-05-17 | Способ получени фермента, окисл ющего холестерин до перекиси водорода и холестенона |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU169971B (ru) |
| SU (1) | SU584801A3 (ru) |
-
1973
- 1973-05-16 HU HUBO001437 patent/HU169971B/hu unknown
- 1973-05-17 SU SU7301934663A patent/SU584801A3/ru active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU169971B (ru) | 1977-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4144129A (en) | Cholesteroloxidase and method for its production from microorganisms | |
| CN110218661A (zh) | 一种热带假丝酵母菌及其应用、以及一种长链二元酸的生产方法 | |
| CN112239728B (zh) | 一种适用于蛹虫草菌培养的含有还原型谷胱甘肽的合成培养基、制备方法及应用 | |
| US2576932A (en) | Fermentation process for production of vitamin b12 | |
| US3776816A (en) | Process for producing steroid dehydrogenase | |
| CN110791462A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用 | |
| EP0082114B1 (de) | Mikroorganismen des Genus Hyphomicrobium und Verfahren zum Abbau von Methylgruppen-haltigen Verbindungen in wässrigen Lösungen | |
| Lee et al. | Large-scale production of Azotobacter | |
| CS217986B2 (en) | Method of making the 2-keto-l-gulonic acid | |
| CN105036330B (zh) | 一种结晶型精酮合剂的制备方法 | |
| CN117384770B (zh) | 一种连续流生产单细胞蛋白的方法 | |
| US2951017A (en) | Cobalamin producing fermentation process | |
| JPS59151894A (ja) | グルタチオン高含有酵母の製造法 | |
| CN118389295A (zh) | 一株塔宾曲霉ptn02及其应用 | |
| US3957579A (en) | Method for preparing d-tartaric acid | |
| DE69520829T2 (de) | Herstellung von L - Ascorbinsäure in Mikroorganismen | |
| MÄKINEN et al. | Effect of Xylitol on Some Food‐Spoilage Microorganisms | |
| JPS6279777A (ja) | ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法 | |
| US3986933A (en) | Method of preparing yeasts enriched in l-lysine and capable of excreting organic acids | |
| US2816856A (en) | Improvement in production of vitamin b12 products by propionibacterium freudenreichii | |
| US5792646A (en) | Process for preparing S. cerevisiae containing organically bound germanium | |
| DE1695598C3 (ru) | ||
| US2817624A (en) | Preparation of ergosterol containing yeast | |
| DE1922843A1 (de) | Mikrobiologisches Oxydationsverfahren | |
| US2943983A (en) | Process of obtaining concentrates of vitamins of the b12 group from waste liquors and residual products of industrial fermentation processes |