SU667154A3

SU667154A3 - Способ получени биомассы

Info

Publication number: SU667154A3
Application number: SU762357451A
Authority: SU
Inventors: Альберт Майерс Филип; Пол Рейнир Энтони
Original assignee: Дзе Бритиш Петролеум Компани Лимитед (Фирма)
Priority date: 1975-05-14
Filing date: 1976-05-14
Publication date: 1979-06-05
Also published as: FR2311091A1; FR2311091B1; NL7605107A; ZA762607B; BE841867A

Description

1

Изобретение относитс к технике получени биомассы на .питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода.

Известен способ получени биомассы , предусматривающий выращивание смешанной культуры бактерий на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, источник азота и необходимые минеральные соли, в услови х аэрировани газообразной смесью,содержащей свободный кислород и метан, с использованием в качестве метан-потребл вощих микроорганизмов бактерий из родов Methy lomonas , Methylobacter, Methylosinus или Methylococcus 1.

Недостатком известного способа вл етс повышенное образование пены в -процессе выращивани .

Целью изобретени вл етс снижение пенообразовани в процессе выращивани микроорганизмов.

Это достигаетс тем, что в предлагаемом способе получени биомассы осуществл ют одновременное выращивание культуры .бактерий, потребл ющих метан, с одной или смесью бактериальных культур из родов Acinetobacter, ,AIcaIigenes, Agrobacteriuirt Mcuraxella

Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Miterocpccus ijJiH Pedigcpcciis не потребл ющих метан и использующих пёнообразующие продукты метаболизма культуры бактерий, потребл ющих метан.

При этом В качестве культуры, потребл ющей мётан, используют бактерии вида Methylococcus capsulatus.

Кроме того, в качестве культуры, Ьотребл ющей метан, исп эльзуют штамм NCIB (110856 M.capsulatus.

Кроме того, в 1 ачестве культуры, потребл ющей метан, используют штамм АТСС №19069 М.Capsulatus. При этом, в качестве культуры,

потребл ющей пенообраэующие-вещества/ используют штамм Moraxella NCIB №11135.

Кроме того, в качестве культуры, потребл ющей пенообразующие вещества, используют штамм Alcaligenes, Agro- .bacterium или Pseudpmonas NCIB «шЗб.

Кроме того, в качестве культуры, потребл ющей пенообразующие вещества, используют штамм Alcaligenes, bacterium или Pseudomonas NClg W11137.

Кроме того, в качестве культуры, .потребл ющей пенообразующие вещества. .используют штамм Alcaligenes или P seudpmonas NCIB №11138. Кроме того, качестве культуры, потребл ющей пенообразующие вещества используют штамм AlcaiigenesNCIB №11139. КрЪме того, в качестве культуры, потребл ющей ценообразуюЩйе вещества испол ьзуют штамм Acinetobacter NCIB 7win4o. - --- . - ..,. .- -- ..,....v,.---™-... - А также, кроме ттэго, в качестве .культуры, потребл ющей пенообразую 1цйё йёщества, используют штамм Mcaligenes, Agrobacterium или ,Р seudpmonas NC IB № 11141. Прй этом процесс, выращивани осуществл ют при рН 5,5-7,0 и 305 ,. - . Кроме того, концентрацию ионов ам V мони в питательной среде в процессе выращивани поддерживают 2-50 мг/л. Способ осуществл йт следующим образом . Смешанные культуры бактерий из ро дов Methyioinuhas,MethyIobacter, Methyiosinus или Methylococcus выращивают на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, ист эчник азота и необходи Ше минёрал ьныё с.оли. -- - . Дл снижени пенообразовани в процессе выращивани осущеетйл ют одновременное выращивание культуры бактерий, потребл ющих мётан с одной или смесью бактериальных культур из Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Mbraxella, Pceudomohas , Flavobacterium, Bacillus, Micro coccus или Pediococcus не потребл ю ВДх и использующих пенообр1азую Щйёпродукты метаёолйзйа культуры Вактерий, потр1ебл йщих метан. При этом в качестве культур, потребл ющих метан, используют бактерией вида MethyTocddcus capsubatus, штамм NCIB №10856 M.capsulatus, штамм АТСС №19069 M.capsulatus -; В качестве культур, потребл ющих Г пенЬобр зП йШё веШестваТйГбТГбльзуШ шталш Moraxella NCIS №11135, NCIB . : №11136, NCIB №11137, NCIB №11138 и йТаммы Acinetobacter NCIB №11140, Alcaiigenes NCIB №11139 и штамм NCIB №11141.« Процесс выравнивани осуществл ют при рН 5,5-7,0 и 30-55с, а концентр йомов аммонй в питательной сре де в процессе выращивани ;поддерживают 2-50 мг/л. Процесс провод т в услови х аэри ровани газообразной смесью, содерж щёй св1ободный кислород-и метан, при этомколичество метана обычно равно 16 объемам к 84 объемс1м воздуха, оно может быть также равло от 8 до 40 , объе мовЛк 92-60 объёмам вЬздуха. м е р 1. Смесь бактерий штам АТСС 19069 Methylococcus capsu . latus, потребл ющих метан и элементарный азот, ибактерии, потребл ю .щие пенбобразуюЕцие аещества, образованные ЭТИМИ бактери ми, культивируют в 5 л (рабочий объем) бульона, содержащегос в семилитровом ферментере. Процесс ведут непрёрйвиб не асептически , температуру поддерживают , перемешивание провод т смесителем при скорости вращени 1000 об/мин. К бульону добавл питательную ереду при степени разбавлени 0,18 час .следующего состава, мг; КН.НРО 175 ,0; Nag.HPO. 12 - 150,0; MgS04-7H20 - 85,0; CaCI.(безводный) 20 ,0; CUS04-5H20 - 20,0; ГеЗОд7Н,О 7 ,5; 2пЗОд ,7Н О - 0,5; 0 ,5; CoCl26H2 0 - 0,02; Na«MoO,. 2H2O0 , 2 ; , ; дистиллированна вода до 1 л. рН регулируют 6,4, использу 2,0 н.раствор гидроокиси натри , азот ввод т в виде гидроокиси аммони и воздуха, при этом количество гидроокиси аммони ввод т из расчета удовлетворени потребности в азоте присутствующих бактерий на 95% а оставшиес 5% удовлетвор ют азотом воздуха. Метан подают при скорости 6 об/об«час и возцух -. при скорости 24 об/об час. Ферментаци идет стабильно , при этом получают плотность клеток 3,4 г/л при производительности 0,61 г/л час. . Во всех примерах вес клеток выра-жен через сухой вес. Образование пены бактери лш не обнаруживают. Затем концентрацию водной питательной среды и гидроокиси аммони уДваи- . вают, что приводит к увеличению плотности клеток до 6,5 г/ли производительности до 1,7 г/л час. Пена не образуетс . Бактерии, присутствующие в бульоне состо т 3 85% клеток штамма АТСС 19065, потребл ющих метан и элементарный азот бактерий Methylococcus capsulatus, и из 15% леток смеси, не потребл ющих метан бактерий. Последнйе выдел ют путем разбавлени образца бульона до 10, нанесени разбавленного образца на агар в чашке Петри и инкубировани 48 час при в аэробных услови х в отсутствии метана. Отдельные колонии снимают: с агара .и непрерывно пересевают всвежую среду до получени .чистой культуры. Полученные культуры были внесены в национальную коллекцию промышленных бактерий Аберден; (Шотланди ) под номерами: 11135, 11136, 11137, 11138, 11139,- 11140 и 11141. Затем бактерии идентифицируют в соо.тветствии с существующей классифйкаййей . Данные приведены в табл.1. Смесь- не потребл ющих метан бактерий состоит из 3% клеток неидентифицированных г4)амкшзменчивых бактерий в форме палочек Штамм NCIB №11134 и 12% смеси, состо щей из

штамма MoraxellaNCIB 11135, штамма Alcaligenes, Pseudomonas или Agror bacterium NCIB.iri36, штамма Pseudomonas или Alcaligenes NCIB W11138 штамма Acinetobacter NCIB №11139, ртамма Acinetobacter NCIB №11140, штамма Pseudomonas, Alcaligenes или Ayrobac-terium NCIB №11141.

Дл сравнени процесс провод т при культивировании в асептических .услови х в присутствии микроорганизмов , потребл ющих метан и элементарный азот, Methylococcus capsulatus АТСС 1 19069. Процесс провод т непрерывно при скорости разведени 0, при плотности клеток, на-пример 3,3 г/л, и производительности 0,59 г/л час.

Ферментаци идет нестабильно изза образовани пены культурой, что приводит к трудност м регулировани уровн в ферментере и достижени стабильности проведени процесса. Пена уменьшает также объемную проnyqKHyro способность так, что не обеспечиваетс посто нный вывод получаемого вещества

Затем концентрацию питательной среды удваивают, что приводит к увеличению плотности клеток до 5,5 г/л и обильному образованию пены с последующим прекращением процесса. Характеристики штаммов приведены в табл.1.

Характеристики других штаммов приведены в табл.2.

Таблица 1

Микроскопи Морфологи ГДСА Окрашивание Граму Ме Ме О/Ф глюкоза Подвижность Аргенин Аммонийные с.ахар- маль Аммонийные сахар-этано

Твин 80 гидролизный Палочки 0,35-0,5 х 1l ,25ju скругленные концы, кра параллельные , некоторые слегка изогнуты, единичные , некоторые цепочки содержат до 8 клеток. Круглые, гладкие, блест щие , диаметр закругленного выступа 2-3 мм, край с,ш1ошной, бежевые с желтсэватой серединой. Как ГДСА, НС иолупрозначные с серыми вкраплени ми. Палочки О,35-0,5 х ,25-1,5/J параллельные стороны, единичные. Круглые, глгшкие, блест щие, мала изогнутость при уколе иглой, край сплошной, полупрозрачные светлокоричневые , обширные колонии на агаре. Как ГДСА, но диаметром 1 мм.

Таэжижение желатина ОНГ1Г Оксидаэа-чашка фильтровальна бума Рост наагаре Мак-Конка Малонаг

Рост в цианистом калии

Уреаза Каэеиназа Каталаза

Т:ёрс водород Индол Ацетйлметилк арби нол

Врсстановление а

Чувствительность к нициллину 2,5 иммун единиц

Анаэробный рост ГДС

Mf агар + 0,2% глюк

Рост на araps C в 50%-ном метане

Рост на агаре МС в парах бутанола

|« 11 в парах ацетона

-I «. « | в парах метанола

|1 1 в парах ;эт;анрла . . .|| «t в парах

- -- -

„I - в Ларах

формальдегида

Рост на агаре МС в Гмуравьиной кислоты

«. агар 0,2% (в глюкозы

667154

8

Продолжение табл.1

+ f

+ +

--в жидкой МС без добавок

-- плюс 0,2% глюкозы

плюс 0,2% арабинозы

-- плюс0,2% галактозы

-- плюс0,2% лактозы

-- плюс0,2% ксилозы

-- плюс0,2% сукрозы

--плюс0,2% маннитола

-- плюс0,2% глицерина

-- плюс0,2% салицина

-- плюс0,2+ лаквулозы

Наличие Flagella

(электронномикроскопиЧески )

Спорул ци в марганцевой среде Микрбско- Палочки Палочки 0,35-0,5х 0,5 л IfS 0,5 х 1,5пкческий х1,25, скругленные единичные вид. скругленконцы , па- или спараллельныв ренные, ные конкра несколько цы, единичные . или спаренные

Круглые, гладкие, блест и щие , мала выпуклость 1-2 мм, диаметр 2-3 мм, кра

сплсшные, бежебые

Н Н НИ

1 бокова

iT а б л и ц а 2 Палочки короткоцепрчных Пдеоморфные Плеоморф ые Палочки палочки, 0,35 х палочки, 1скругленны х 1,75 концы округлые, . стороны кра не ч параллель- шараллельстороны параллельныеные ные, еди ичные

11

Нерегул р- Переменное ные п тна окрашивание , бипол рно

темное

щел

щёл

( + )

.

+

667154

12

Продолжение табл.2

ПеременноеПеременное

нерегул р-окрашиваное окра-ние шивание

ПеременноеПеременноеПеременное нерегул р-нерегул р-нерегул рное окра-ное окра-ное окрашиваниешиваниешивание

щел

( + )

+ +

Сероводород

Индол

Ацетилметилкарбинсш

Восстановление нитрата

Чувствительность к пенициллину в 2,5 имунные единицы

Анаэробный рост ГДСА

МС агар + 0,2% глюкозы

Рост-на агаре МС в 50%-ном метане.

Рост на агаре МС в парах бутанола - - в парах ацетона

- - в парах метанола

-- в парах этанола

-- в парах этана

-- в парах формальдегида

Рост на МС в парах муравьиной кислоты

15

:гт-: ;

плюс

0,2% арабинозы

- плюс ,0,2% га .лактозы

-.««.

плюс

о ,2% лактозы

0,2% ксилбзы I

плюс 0,2% сукрозы .

- Ч «.

плюс

0,2% маннитола

ПЛЮС

о,2«глицерина

плюс Of2% салицина

-.««

плюр

0,2% левелозы

667154

16

Продолжение табл.2

f

о-ф- окисление/ферментаци

ГДСА глюкоэо-дрожжевой сыпучий агар: глюкоза - 5 г, пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, ;сычужныйфермент - 10 г, агар - 20г, дистиллированна вода - 1000 мл

Автрклавирование при iS f№H.

ПИ - питательный агар (оксоид СМЗ)

МС - минеральна среда (жидка или тверда ) при JO с на скошенном питательном агаре. Основание жидкого скошенного агара помещают в стерильную дистилли рованную воду. Рост культуры после инкубации оценивают на поверхности раздела воздух-вода при помощи фаэово-концентрационной- микроскопии. Марганцева среда дл спорул ции чашки со скошенным питательным агаро в который добавл ют 2 мг/мл ионов Мп в виде сульфата марганца. Культуры инкубируют до 14 дней при 30°С а затем инокулируют спорами. Культуры также оценивают на зйГзнеспособность После воздействи температуры 80°С 10 мин. Пример 2. В cTepH bHSft epo дИльный чан емкостью 7 л помещают 4500 мл стерильного водного питатель ного раствора. Состав водной питатёЛьнЬй среды, как описано в прйМере 1, с добавлением;1,770 г/л азотной кислоты. В бродильный чан ввод т 500 мл активно растущей культуры микроорга низмов Methylococcus capsulatus АТСС №19069, использующей метан и элементарный азот, обеспечивают его периодическую работу в асептических услови х со скоростью перемешивани 500 об/мин, скоростью аэрации 10 об/об час, расходом метана 10 об/об час, рН поддерживают на уровне 6,5 добавлением 1,0 г/л раст вора гидроокиси натри или 3,6 н. раствора серной кислОты в з аВйсймЬс ти от условий. При достижении клетками плотности 1,0 г/л скорость перемешивайи повышают до 1000 об/мин Затем работу чана перевод т на непрерывный режим при скорости разбав лени 0,05. Через 12 ч непреры ной работы скорость разбавлени повышают до . о./об час, а расход метана -: О .:. рб/Ьб. час. Eirie через 15 час ;скбЕ)Ост% .разбавлени повьлшаю до 0,18часг ; В1хЗтность клеток составл е -й; 3 iv, а скорость образованийг-Йзйшлерно 0,59 г/л -час. р.ежим.,% аботы нестабильный из-за пены, ,р;4рЬ.зующейс при росте культу ры. Пена преп тствует стационарному режиму работы. На этой стадии асепт ческие услови нарушаютс , а через двэ часа неасептичёской работы Ьбрэ jaaHHe пены снижаетс и в культуре обн аруживают некоторые виды бактерий. Через 24 час. режим работы устана ливаетс при плотйрсти клеток 3,4 г/л,- а скорость образований сос тавл ет 0,61 г/л«час. Образование пены больше не наблюдаетс .при анализе бульонной культуры обнаруживают бактериальную культуру как в примере 1. Пример 2 показывает, что пенообр зование можно эффективно снизить в присутствии смеси микроорганизмов. При.мер 3. В семилитровый бродильныйчан помещают 4,5 л водной питательной среды следующего состава , мг: HNGj - 3500,0; КН,РО.- 350,0; NajHPQ,} 12Н20 - 300,0; MgSO. 7Н20 170 CaCEj(безводный) - 40,0; -4,0; FeSO. CuSO -Л j 2 1 f -f, i: t: j 7 H 15,0; ZnS047H20 - 1,0; СоСегбН.О - 0,04; Мп304-Нз,О - 1,0; Na2MoO -2H2O - 0,4; дистиллированна вода до 1 л. рН среды довод т до 6,4 добавлением 2,0 н.водного раствора гидроокиси натри , затем в бродильный чан ввод т 500 мл выращенной в асептических услови х культуры Methylococcus capsuIatus АТСС №19069 и обеспечивают его работу по периодическому режиму со скоростью перемешивани 1000 об/мин при 45С, расходе воздуха - 10 об/час и метана - 10 об/обчас. ч рН среды поддерживают на уровне 6,4 добавлением 2,0 н.водного раствора гидроокиси натри или 3,6 г раствора серной кислоты, использу устройство дл автоматического титровани . По достижении плотности клеток 2,0 г/л режим работы перевод т на непрерывный, ввод водную питательную среду HenpejjfcJBHo в бульонную культуру и отвод ее со скоростью, обеспечивающей посто нство рабочего объема в бродильном чане объемом 5 л. Начальна скорость разбавлени составл ет 0,05 час. По мере повышени плотности клеток скорость перемешивани , расход мётана и расход воздуха постепенно повышают и через 36 час, скорость разбавлени составл ет 0,18 час, скорость перемешивани - 2.000 об/мин, расход воздуха - 48 об/об.час и расход метана - 12 об/об«час. На этой стадии к водному раствору, не содержащему азотной кислоты, добавл ют водную-питательную среду. Новый раствор имеет следующий состав, мг: - 700; На НРОд12Н,0 600; - 340; CaCIj Гбезводный ) - 80; СиЗбд. - 8; ,jO- 30; - 2; МпЗОд НзО 2; CoCl2 6Hj,0 - 0,8; Ка2МоОд2НдО 0 ,8; дистиллированна вода до 1 л. К бульонной культуре отдельно добавл ют азот з виде гидроокиси аммони в количестве 95% дл роста микроорганизмов . СКОРОСТЬ введени определ ют, устанавлива плотность клеток растущей культуры (методом оптической плотности) и использу плотность клеток дл измерени скорости св зывани азота биомассой. Остальные 5% азота ввод т вместе с элементарным азотом воздуха, подаваемого в бродильный чан. Еще через 60 час достигают стационарного состо ни при плотности клеток 11,67 г (сух.вес) на литр и скорости образовани 2,1 г/л час. При росте культуры пенообразовани не 21 |наблюдаетс . Бактериальный анализ бульонной культуры показывает наличие того же вида, как-в примере 1. Пример 4. Полностью повтор ют методику, как описано в примере но используют штамм Methylococcus capsulatus NCIB №10856. Новый выдел ют из образца грунта. Стационарное состо ние процесса достигают при плотности клеток 13,14 г (сух. вес) на л/час, что соответствует ск рости образовани 2,4 г/л час. Образовани пены не наблюдают вид бактерий аналогичен виду примера 1, за исключением того, что использующим метан видом микроорганизмов вл етс Methylococcus capsulatus NCIB №10856.

Концентраци биомассы в бульонной культуре, поступающей в центрифугу, г.веса сухих клеток на литр

Концентраци биомассы в потоке, выход щем из центрифуги, г.веса сухих клеТок на литр

Количество биомассы из 1 л бульонной культуры, г.веса сухих клеток на

Из результатов табл.3 видно, что биомасса эффективно извлекаетс при центрифугировании бульонной культуры , содержащей новый вид микроорганизма Methylococcus capsulatus NCIB №10856, тогда как из бульонной культуры , содержащей известный штамм .АТСС №19069, извлекаетс только 97,5% биомассы.

Из представленных данных также видно, что при равных услови х производительность в случае использовани нового штамма NCIB №10856 3ittaчительно выше по сравнению с известным штаммом АТСС №19069.

Кроме того, новый вид штгилма имеет более высокий выход по метану по сравнению с известным.

10,50

12,90

13,14

0,0015

0,0015 0,26

Новый вид Methylococcus capsulatus NCIB №10856 образует меньшее 50 .количество капсулированных полисахаридных материалов на единицу веса биомассы по сравнению с известными видами. - - - 55

Claims

1. Способ получени биомассы, предусматривающий выращивание смешанной культуры бактерий на питательной

60 среде,содержащей метан в качестве источника углерода,источник азота и нербходимле минеральные соли,в услови; х аэрировани газообразной смесью, содержащей свободный кислород и метан , с использованием в качестве

65 Выращенную в стационарных услови х бульонную из бродильного чана помещают в центр1 фугу непрерывного действи (Шарплесс тип 16) с загрузкой 17 кг, центрифугирование осуществл ют при двух различных расходах5571 мл/мин и 774 мл/мин. Концентрацию бйом ссы ТГ пбтЬкёТ выход щем из центрифуги измер ют в пересчете на вес сухих клеток на литр. Затем на основе веса сухих клеток определ ют вес биомассы, выход щей из центрифуги. Сравнительные данные центрифугировани культур, содержащих штаммы Methylococcus capsulatus АТСС №19069 (пример 3) и штс1мм Methylococcus Capsulatus NCIB W10856 (пример 4) приведены в табл.3. Та б л и ц

метан-потребл ющих микроорганизмов бактерий из родов Methylomonas, l ethyiobacter, Methylosinus или MethylQcoccus, отличают и йс тем, что, с целью снижени пенообразовани в процессе выраадвани , осуществл ют олновременное выращивание культуры бактерий, потребл ющих метан, с одной или смесью бактериальных культур из родов Acinetobacter , Alcaligenes, Agrobacterium, Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium . Bacillus, Mibrocqccus или Pediococcus не потребл ющих метан й й сп5льэующих пенообразующие продукты метаболизма культуры бактерий, потребл ющих метан,

2.Способ по n.i, о т ли чающий с тем, что8 качестве культуры , потребл ющей метан, используют бактерии вида Methylococcus capsulatus .

3.Способ по пп. 1,2, отличаю щ и и с тем, что в качестве культуры, потребл ющей метан, используют штамм NCIB 1 10856 M.capsulatus

4.Способ по пп. 1,2, отличающийс тем, что в качестве культуры потребл ющей метан, используют штамм АТСС 19069 M.capsulatus.

5.Способ по пп. 1-4, о т л и ч ающий с тем, что в качестве культуры, потребл ющей пеиообразующие вещества, используют штамм Moraxella NCIB №11135.

6.Способ по пп. 1-4, о т л и

ч а ю щ и и с тем, что в качестве культуры, потребл ющей пенообразуюцдаё вещества, используют штамм Alcaligenes, Agrobacteriuin или Pseudomonas NCIB 11136.

,

7. Способ по пп. 1-4, о т л ич а ю щ и и с тем, что в качестве

культуры, потребл ющей пенообрйзующие вещества, используют штамм Alcaligenes, Agrobacterium или Pseudomonas NCIB №11137.

8.Способ по пп. 1-4, отличающийс тем, что в качестве культуры, потребл ющей пенообразующие вещества, используют штамм Alcaligenes или Pseudomonas NCIB №11138.

9.Способ по пп. 1-4, о т л и ч а ю Щи и с тем, что в качестве культуры, потребл ющей пенообразую .щие вещества, используют штамм Alcaligenes NCIB №11139.

IP. Способ по пп. 1-4, о т л и ч и ю щ .и и с тем, что в качестве культуры, потребл ющей пенообразующие вещества, используют штамм Acinetobacter NCIB №11140.

11.Способ по пп; 1-4, отличаю щи и с тем, что в качестве культуры, потребл ющей пенообразующие вещества, используют штамм Alcaligenes, Agrobacterium или Pseudomonas NCIB №11141.

12.Способ по пп. 1-11, от л и ч а ю щ и и с тец, что процесс выращивани Осуществл ют при рн 5,5-7,0.

13.Способ по пп. 1-12, отличающийс тем, что процесс выращивани осуществл ют при 30-55

14.Способ по пп. 1-13, о т л и ч ающий тем, что концентрацию ионов аммони в питательной среде в процессе выращивани поддерживают 2-50 мг/л.

Источники информации, прин тые в внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР №421199, кл. С 12 D 13/06, 1974.