SU680657A3 - Способ получени антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грамположительных бактерий - Google Patents

Description

Сн тое молоко-агар: обильный рост, морщиниста  поверхность, от оранжевого до светло-коричневого цвета, п тнистые тени. Агар Чапека: обильный рост, моредини та  поверхность, оранжевого ивета. Картофель: скудный рост, морщиниста структура, темно-оранжевого цвета. Желатина: скудный рост, светло-оранжевого цвета. Фиэиолого-биохимически свойства. Усваивает Cj - арабинозу, ксилозу, Cg-глюкозу, фруктозу, манно зу, маннит, инозит, раЯнозу, сахароз лактозу. Не усваивает рафинозу,целлюлозу, специальный салицин. Гидролизует крахмал, казеин, малат кальци . Сероводород образует, меланин не образует, реакци  тирозиназы-отрица тельна . Нитраты восстанавливает. Лакмусовое молоко не коагулирует, но пептонизирует, разжижает желатину .„ Оптимум роста при 30 С в течение 6-14 дней. Дл  получени  нового антибиотика штамм культивируют при анаэробных услови х в водной питательной среде содержащей усваиваемые источники углерода и азота, а также минеральные соли. Обычно культивируют в качалочной колбе до тех пор, пока не образуетс  соответствующее количество антибиотика , после чего культуру пересевают на ферментационную питательную ср ду в вибрационном ферментере. После этого продолжают культивировать при 25-35 0 при анаэробных услови х до тех пор, пока не образуетс  значительное количество антибиотика . Концентрацию антибиотика контролируют в ходе культивировани  микробиологическим путем по методу диффузии в чашке. После отфильтровывани  мицели  антибиотик вьщел ют из ферментационного раствора известным путем, как, например, экстракцией органиче ким растворителем, в котором раство р етс  антибиотик, но который не смешиваетс  с водной средой. Экстра цию производ т после доведени  значени  рН фильтрата до 2-4. При этом в качестве растворителей используют алканолы Ц-С , алкиловые эфи ры низких алифатических кислот или низкие галогенированные углеводороды . Растворитель вьщел ют из фермен тационного раствора путем центрифугировани  при высоких скорост х, ко центрируют его до 1/200-1/400 nei ю начальногр объема, охлаждают и выце живают его до тех пор, пока не обра зуетс  осадок, который потом фильтруют . Он состоит из очень чистого антибиотика. Потом маточные раствор собирают и наливают в избыток инерт ного непол рного растворител , как. например, масло, чем получают-еще определенное количество сырого антибиотика . Сырой продукт раствор ют в смеси метанола с ацетоном и потом осаждают ,из раствора добавлением кислотной воды. Обе фракции соедин ют и очищают путем хроматографии на колонке хлороформом и метанолом в качестве системы растворителей. Затем антибиотик перекристаллизовывают из метанола и этилацетата 1:1. Антибиотик показывает «п vttro о in viv& противобактериальную активность, особенно in vitro, прежде всего против грам-положительных бактерий. Ниже приведена минимальна  ингибирующа  концентраци  (мик), мкг/мл, дл  различных штаммов Sto hyeocpccus dureub АТСС 6538 0,025 btaphy oc6cct/6 aureusTouv 0,025 Streptococcus hoemoEyticus С 203 0,0062 DipEococcus pnetimomaE UC41 0,p0078tEosWdium pertptr ens ISS 50545 0,012 MycopEosffla Ks tftom H21C.Z.В. 0,2. Кроме того, новый антибиотик превосходно действует tn vivo при вызванных экспериментально инфекци х в мышах. Значени  ЭД антибиотика, обнаруженные при экспериментально вызванных инфекци х StophyEococcus aureus, StrqA)coccushaenjo yticu5,T)cocct/s pneumorиae сведены в нижеследующей таблице. ,МГ/КГ, подкожно St ptococcus haemotyticus0,2 StqDhyEococcus aurais10 OipEocQCcus pneumotriae0,4 Новый антибиотик также активен против микроорганизмов, которые устойчивы к обычно употребл емым антибиотикам. Токсичность антибиотика очень низка ( перорально или внутрибрюшинно у мышей 1000 мг/кг). Пример. Штамм JittinopEanes barvepcdK naib C.B.S- 305 76 предварительно культивируют в питательной среде при значении рН 6-10 до тех пор, пока не образуетс  значительное количество антибиотика. Культуру выращивают в качалочной колбе на среде следующего состава, г/л: М сной экстракт 3,0 Триптон5,0 Дрожжевой экстракт 5,0 Глюкоза1,0 Растворимый крахмал 24,0 Карбонат кальци  4,0 Дистиллированна  вода (мл) До 1000. Потом колбы встр хивают в течение суток при 28-30с, после чего 1 л предварительных культур Пересевают на вибрационные ферментеры, содержащие 10 л питательной среды следующего состава, г s

М сной экстракт40

Пептон40

Дрожжевой экстракт10

Хлорид натри 25

Соева  мука100

Глюкоза500

Карбонат кальци 50 Водопроводна  вода (мл) До 10.

Потом с размешиванием анаэробно инкубируют при 28-30 С. В определенных интервалах по методу диффузии в чашке/ микробиологически испытывают активность антибиотика с Stophy ococcus aureus в качестве подопытного организма.Максимальна  активность достигаетс  после 3-4 дней.

Выделение и очистка антибиотика.

80 л ферментационной жидкости фильтруют 1%-ным CEarcel(вес./об.) в качестве вспгалогательного средства дл  фильтровани . Мицелий выбрасывают и после подкислени  отфильтрованного раствора 10%ной сол ной кислотой до рН 2,5 его экстрагируют два раза этилацетатом, количество которого соответствует приблизительно 50% объема раствора.

Органическую фазу отдел ют от водной центрифугированием при высоких скорост х, сушат ее NajSO, концентрируют при 45-50°С при вакууме до 1/300 первоначального объема, и охлаждают до 0-10 С.

Сырой осадок собирают на фильтре, лромывают значительным количеством этилацетата и сушат в вакууме при . Таким образом получают 1,140г антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью чистоты 70%.

Остающиес  после фильтрации маточные растворы наливают в 20 об./ч. легкого масла и получают еще 2,550г антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью частоты 20-25%. Это вещество суспендируют в незначительном количестве метанола и ацетона (9:1). Нерастворимые составные отфильтровывают, после чего разбавл ют водой. Размешиванием 10%ной Сол ной кислотой значение рН раствора довод т до 2,5. Таким образом полученный осадок собирают центрифугированием и раствор ют в минимальном количестве бутанола при температурах 45-50 С. Раствор концентрируют в вакууме до 1/5 первоначального объема и охлаждают до 4 С. Полученный осадок собирают и .сушат в вакууме, получают (0,450 г) антибиотика с полученной спсктрофотометрическим путем степенью чистоты 80%. Полученные продукты потом продолжают очищать. Дл  этого их раствор ют в минимальном

количестве хлороформа и метанола (85 15) и хроматографИРУют предварительно активированной при ЮОс колонкой Sitica -ceEite (1 : 1 061/06. и промывают смесью хлороформа/метанола .

Элюирование и тонкослойную хроматографию фракций производ т той .же самой смесью. По данным тонкослойной хроматографии собранные фракции концентрируют в вакууме до незначительного объема. После добавки диэтилового эфира образуетс  осадок, состо щий из антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степень чистоты 95 %. Осадок раствор ют в метаноле и этилацетате (1:1), нагревают до 45°С и фильтруют. После охлаждени  до 4 с и .вьщерживани  в течение ночи при той же самой температуре получают чистый антибиотик в виде светло-желтых игол,

Химико-Физические свойства антибиотика .

Антибиотик представл ет собой порошок светло-желтого цвета, кристаллической структуры и кислотного характера. Анализ кислотного гидролизата антибиотика в 6 н.сол ной кислоты в герметически запа нной трубке при показал 4 аминокислоты , три из которых в аминокислотном автоанализаторе были определены как аспарагинова  кислота, треонин и глицин. Точка плавлени  антибиотика 210°С.

Элементарный анализ, %:

С 51,35; Н 5,05; N 10,50; S 11,05;

О (при помощи разности) 22,05.

В ультрафиолетовой области видимые

спектры поглощени :

1%

,кc

ь

Е1 (см) 360 103 290 (плечо) 237 326

Ультрафиолетовые спектры поглощени  устанавливают с помощью ультрафиолетового спектрофотометра в растворах с буфером метилцеллозольва (1:1) при различных значени х рН.

Антибиотик содержит сильно флуоресцирующий хромофор. Раствор активированного при 240 нм продукта в 0,1 н растворе едкого натра показывает эмиссионный спектр с максимумами при 355 и 490 нм.

Спектр флуоресценции был установлен с помощью спектрофотометра флуоресценции .

Характерные полосы поглощени  в ньюелв были установлены при следующи частотах (см ) «

3400 (плечо), 3350 (сильно), 3200 (плечо), 3100 (сильно), 2930 и 2870 (ньюель), 2800-2400, .2380 (атмосферна  двуокись углерода), 1750 (сильно), 1670 (сильно), 1620 (сильно), 1540 (сильно), 1480 (сильно), 1460 и 1380 (ньюель), 1420 (сильно), 1340 (сильно), 1320 (сильно), 1280 (сильно), 1240 (сильно), 1195 (сильно), 1170 (сильно), 1145 (сильно), 1120 (сильно), 1075 (широко), 1015 (сильно), 990 (сильно), 935 (сильно), 920 (широко), 900 (сильно), 865 (сильно), 840 (сильно), 800 (сильно), 770 (сильно), 755 (сильно), 740 (сильно), 20 (ньюель). Инфракрасный спектр был установлен с помощью спектрофотометра. Удельное вращение:

25

125 (,8% в метаноле

М.

хлороформе 1:1).

Соединение раствор етс  в диметилсульфоксиде , диметилформамиде и смес х хлороформа и метанола, мало раствор етс  в хлороформе, метаноле смес х метанола и этилацетатаг ворах NaHCOj и лед ной уксусной кислоте, не раствор етс  в воде и остальных общеприн тых органических .растворител х.

ПредлагаегФий способ обеспечивает получение антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грам-положительных бактерий.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ полх чени  антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грам-положительных бактери заключающийс  в том, что штамм ctinopEpnes sarveparenSls C.B.S- 30576 выраврвают в аэробных услови х на toJTaTепьной среде,содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим вищелением целевого продукта.