SU891774A1 - Способ получени ферментных электродов чувствительных к метаболитам - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к энзимологии , конкретно к получению ферментных электродон, и может быть использовано в цел х анализа, синтеза электрохимическим способом органических соединений или в биотопливных элементах.

Известны способы получени  биоэлектродов , в которых осуи1ествл етс  пр мой обмен электронов между активным центром белков и электродами. Например, цитохром С, адсорбированнь1й на ртути, пластине или золоте, может восстанавливатьс  электрохимическим путем l.

Однако данные системы не содержат биокатализаторов и не могут быть использованы дл  получени  ферментного электрода.

Известен способ получени  лакказного электрода, восстанавливающего кислород, путем адсорбции фермента на углеродист{ х материалах fzl.

Недостатком данного способа  вл етс  то, что онне применим дл  получени  ферментных электродов на основе других ферментов, катализирующих превращение продуктов метаболизма живого организма.

Г1рактически важными  вл ютс  ферментные электроды, чувствительные к метаболитам - глюкозе, лактату, перекиси водорода, мочевой кислоте,

10 аминокислотам, ксантину, холестерину и др. веществам. Использу  такие электроды, создают безреагеитные методы анализа и полностью безреагентные электроды, пригодные дл  анализа

15 метаболитов In vivo, системы электросинтеза соединений, в частности аминокислот, а также биотопливные элементы, которые служат в качестве имплантируемых в организме датчиков

20 и источников тока.

Однако адсорбци  ферментов, ката- лизирующих превращение перечисленных метаболитов на углеродисплх материаi Лих, не обеспечивает создание ферментных электродов, вследствие чего перенос электронов с активных центро флавин- и гем- и металлсодержащих (за исключением.Си-содержащих) ферментов на углеродные электроды не протекает. Известны способы получени  фермен ных электродов, чувствительных к метаболитам , на основе глгакозооксидазы лактатдегидрогеназы, оксидазы L- и D-аминокислот, уреазы и др., сущност которых сводитс  к иммобилизации фермента в геле, нанесению гел  на злектрод и снабжению его диализной пленкой дл  предотвращени  диффузии фермента в раствор 31. Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ получени  ферментного электрода на основе глюкозооксида зы, закхпочающийс  в том, что фермент -иммобилизованный в геле, нанос т .на платиновый электрод и покрывают диализной (целлофановой) плешсой .4 и 5. Недостатком известных способов  вл етс  сложность технологии получе ни  ферментных электродов, а также то,что в аналитических реакци хопределени  метаболитов, полученные таким способом, ферментные электроды могут использоватьс  только при наличии особых веществ-медиаторов, служа|.щ-1х дл  переноса электронов с активного центра фермента -на проводник - Pt электрод. Таким образом, генераци  тока в системе и работа электрода возможны лишь в присутствии медиаторов, в качестве таковых обычно используютс  бензохинон, феррицианид или кислород. Поскольку два первых  вл ютс   довитыми веществами ,- то работа с электродами данного типа требует использовани  опас ных дл  лшзни веществ и, кроме того, Невозможна в анаэробной среде. Цель изобретещш - упрощение процесса получени  и улучшение свойств ферментных электродов. Указанна  цель достигаетс  способом получени  ферментных электродов заключагацимс  в том, что фермент адсорбируют на органическом электроде , представл ющем собой комплекс орган1гческих катионов - метилированных производных феназина, акридина, хинолииа, пиридина, дипиридина и анион-радикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана , и процесс провод т в 4. 4 растворе при концентрации фермента 10-10 моль/л, температуре и рН 7,0-7,2 в течение 0,5-15 ч. В качестве ферментов используют гем-)флавин- и металлсодержащие ферменты: глюкозооксидазу, пероксидазу, лактатдегидрогеназу, оксидазу D- и L-ot-аминокислот, ксантиноксидазу, диафоразу, уриказу и холестериноксидазу . Электролиз приводитс  в интервале потенциалов от 0,6 до 0,05 В (относительно насыщенного серебр ного электрода). Это обеспечивает возможность создани  новьк ферментных электродов с использованием гем-, металл- и флавинсодержащих ферментов . Используемые органические комплексы обладают не полупроводниковой, а металлической электропроводностью. Предлагаемьш способ позвол ет изготовить электроды, генерирующие ток в присутствии глюкозы, лактата, аминокислот, мочевой кислоты и др. метаболитов и обладающие селективкостью только к этим в.еществам. Па чертеже показана схема ферментного электрода. - . Схема содер;кит органический металл 1 с адсорбированным ферментом, тефлоновый корпус 2, медна  (А) или платинова  (Б) проволока 3, эпоксид- . ный компаунд 4, эвтектический припой 5, платиновый, титановый или стеклоуглеродный токоотвод щий электрод 6, диализна  мембрана 7, резиновое кольцо 8, Способ осуществл ют следующим образом . - 0 ,1 г соли метилированного производного одного из угсазанных ароматических соединений раствор ют в 520 мл гор чего абсолютного этилового спирта и к нему добавл ют гор чий раствор 0,1 г (0,05 М) литиевой соли анионрадикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана в 10 мл этилового спирта . Выпавший осадок промывают эфиром и высуцшвают в вакуум-эксикаторе. Полученные порошки черного цвета прессуют под давлением 10 т. К полученным таблеткам 02 мм, толщиной 0,5-1 мм припаивают токоотвод щий электрод и монтируют их в тефлоновый корпус таким образом, чтобы с электролитом контактировал только органический проводник (чертеж. А). Подготовленный электрод погружают в раствор высокоочшценного фермента,- кон -в-1 П-Гк центраци  которого 1 О -1 0 моль/л (0,004-1,5 мг/мл) в 0,1 М фосфатном буфере рН- 7.,2 и выдерживают в течение 0,5-15 ч при 15-20°С. После этого электроды промывают тем же буферным раствором (4-20 мл). При изготовлении других ферментных электродов 1,0-1,2 мг комплекса добавл ют в 3-4 моль/л раствора фермента , содержащего 0,1 мг болка. Суспензи  захватьшаетс  на токоотвод щем электроде, изготовленном из платины, стеклоуглерода или титана, при помощи диализной мембраны (чертеж , Б). Измерение тока электрода проводитс  в трехэлектродной схеме в анаэробных услови х в том же буфере . В основе механизма присоединени  фермента к органическому комплексу лежит адсорбци  белка на гетерогенных поверхност х, обусловленна  ионньми и 1зандервальсовскими силами взаимодействи . Адсорбци  фермента на органическом комплексе протекает практически необратимо. Пример 1. Электрод, изготов ленный из 24 мг комплекса N-метилфеназина (ММФ) и анион-радикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана (ТЦХМ), погружают в 2 мл раствора кристаллической глюкозооксидазы Реп.vitale в 0,1 М фосфатном буфере. Концентраци  фермента 10 моль/л (15 мг/мл). Электрод выдерживают в растворе фермента при комнатной температуре ( 15-20°С ) в течение 15ч. Промывают электрод ф осфатным буфером по 20 мл и подключают к пол рогр фу. Определ ют стационарньй анодный ток электрода, который устанавливает с  в течение 1 мин при разных концентраци х глюкозы. Зависимость анодного тока окисле .ни  глюкозы адсорбированной на , комплексе ШФ ТЦХМ глюкозооксидазы ;(рН 7,2 0,1 М фосфатный буфер, 25°С) приведена в табл.1. Электрод сохран ет высокую стабильность во времени. Зависимость тока глюкозооксидазного электрода при непрерывной его работе в течение продолжительного времени (концентраци  глюкозы 2,55 мМ др., услови  как в табл.1) приведена в табл.2. Чувствительность электрода в начале увеличиваетс  и в дальнейшем сохран етс  на посто нном уровне в

7891774

Продолжение табл. 2

8 Продолжение табл.3

Пример 2. Электрод изготавливают из 26 мг комплекса состава ЧМФ ТЦХМ и погружают в раствор высокоочищенной пероксидазы из хрена в 0,1 М фосфатном буфере. Концентраци  фермента 10 моль/л (4-10 мг/мл). Адсорбци  проводитс  в течение 2530 мин при . Ферментный электрод пропитывают фосфатньм буфером и провод т определение тока электрода в зависимости от концентрации перекиси водорода.

Зависимость катодного тока восстанов )1ени  перекиси водорода адсорбированной на комплексе МНФ Ти;ХМ пер .оксидазой (20Рс, ,0,; 0,1 М фосфатный буфер) показана в табЛ.З. , Злектрод сохран ет работоспособ ность в течение суток Когда на комплексе захватываетс  раствор пер .оксидазы (0,1 мг/мл) при помощи диализной мембраны, электрод сохран ет активность более, чем в течение мес ца.

Таблица 3

Ток

Концентраэлектци  перерода , киси водомкА рода, мМ

3

2

275б

оГГ

4,72

1,0 6,32 1,5 7,52 2.0 8,80

2,5

3.0 9,60

3,5

10,32 Пример 3. 1мл комплекса со става ММФ ТЦХМ добавл ют в 3 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,2 и температуре , содержащего 0,1 мг цитохрЬма Ь активностью 70 ед/мг, вьщеленной из дрожжей Hansenuia anoma,la. Полученную суспензию нанос т на токоотвод щий электрод (плати новый или из стеклоуглерода) и закры вают полупроницаемой мембраной. На электрод подаетс  потенциал в интервале 0,3-0,4 В (относительно Ag/AgC1 электрода сравнени ) и измер етс  зависимость стационарного ток после 1 мин при добавлении D-, L-лак тата. Зависимость тока анодного окислени  лактата адсорбированного на комп лексе N№)TUXM цитохрома Ь (2G°C, рН 7,2, 0,1 М фосфатного буфера) при ведена в табл.4. Таблица Ток электКонцентраПотенциал аноци  D-, Lрода , мкА Да,Б -лактата, мМ 0,05 0,15 . 0., 34 0,64 0,93 1,52 О Пример 4. 1,2мг комплекса состава (ТЦХМ) добавл ют в 4 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН которого 7,2 при , содержащего 0,1 мг цитохрома bj.. Другие операции аналогичны примеру 3. тока анодного окисдсорбированного на )2 цитохрома bz ,1 М фосфатный буфер), л.5. Таблица5 КонцентраТок электци  D-, Lрода , мкА -лактата, мМ 0,08 0,24 0,68 1,20 . ,68 2,12 2,48 тока ферментного охром Ь (ТЦХМ )1 (потенциал анода аци  D-, L-лактата осфатный буфер), при . Таблица 6

11

Продолжение табл.6

Пример 5. Таблетку прессуют из 12 мг комплекса ЙМР ТШФГ диаметром 2 мм и толпщной около 0,5 ммдвыкладъизают на торец электрода, изготовленного из впа нной в стекло и отшлифованной титановой проволоки.

Комплекс прижимают к электроду при помощи капроновой сетки (толщина нитей 0,1 мм, 160 меш). На сетку нанос т Ojl мм раствора глюкозооксидаз ( 1,3 мг/мл) и раствор закрывают целлофановой мембраной. Определ ют токэлектрода в присутствии глюкозы.

Зависимость разностного анодного тока глюкозоокс1здазного электрода, в качестве токоотвод щего электрода в котором служит титанова  проволока

891774. 12

(комплекс ММФ ТЦХМ, рИ 7,2, 0,1 М фосфатный буфер, , потенциал

0,2

llpOAOJDKeune табл,8

Пример 7.0,10-0,12 мг лиофилизированного порошка оксидазы L-аминокислоты (или уриказы, или колестериноксидазы) раствор ют в О,I мл фосфатного буфера и раствор нанос т на поверхность электрода N-метилхинолиний ТЦХМ. Раствор покрывают диализной мембраной. Электрод погружают в фосфатный буферный раствор и выдерживают в течение 0,51 ,5 ч при 25°С. Определ ют ток электрода в зависимости от концентрации субстрата.

Зависимость анодного тока окислени  L-лизина, адсорбиропа.киой на .комплексе оксидазой L-аминокислот от концентрации субстрата при 0,048 В относительно н.с.э. (рН 7,2, 0,1 М фосфатный буфер, 25 С, анаэробный раствор), приведена в табл.9.

Таблица 9

Примечани . 1.В случае мочевой кислоты и холестерина калиб,- . ровка выполнена до 0,63 мМ субстратов. Величины токов близки по значению к току электрода на основе оксидазы аминокислот.

2. Сравнительно небольшие токи электродов обусловлены низкой актив- . ностью используемых ферментов. Активности которых t)aBHbi.O,05J 0,12, 0,8 ед/мг соответственно дл  холестериноксидазы , уриказы и оксидазы .-аминокислот.

Пример 8. 55i«n раствора диафоразы, вьоделенной из митохондрий и обладающей НАДН-окиелительной способностью (0,2 ед/мг), захватьшают в приэлектродном слое комплекса N-метилпиридиний-ТЦХМ и провод т определени  тока электрода в зависимости от концентрации субстрата .

Зависимость тока окислени  НАДНц адсорбированной на комплексе НМПИ ТЦХМ диафоразой от концентрации субстратов (потенциал анода 0,072 В относительно н.с..э., рН 7,2, 0,1 М фосфатный буфер, 25°С, анаэробный раствор), приведена в .табл.10.

5891774

Таблица 10

НАДН,

Ток электрода, . мкА

Пример 9. 10мл раствора глюкозооксидазы (69 мМ) захватьшают при помощи диализной мембраны на поверхности электрода из комплекса метилзиологен - ТЦХМ, определ ют ток электрода в зависимости от концентрации глюкозы.

Зависимость тока окислени  глзокозы адсорбированной на МБ ТЦХМ глюкозооксвдазой от концентрации субстрата (0,048 В относительно н.с.э., другие услови , как в табл.З), приведена в табл.11.

Таблица 11

Claims (5)

1.Способ получени  ферментных электродов, чувствительных к метаболитам , отличающийс  тем, что, сцелью упрощени  процесса и улучшени  свойств целевого продукта , адсорбируют :на органическом электроде, представл ющем собой комплекс органических катионов метилированных производных феназина, акридина, хинолина, пиридина, дипиридина и аиион-радикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана , и процесс провод т в растворе, содержащем фермент в концентрации 1(Р-10 моль/л, при 4-25°С и рН 7,0-7,2 в течение 0,5-15 ч.

2.Способ по п.1, о т л и ч а и и с   тем, что в качестве ферментов используют гем-, флавин- и металлосодержащие .ферменты: глюкозооксидазу , пероксидазу, лактатдегидро геназу, оксидазу О-о и L-«i-аминокислот , ксантиноксидазу, диафоразу, уриказу и холестериноксидазу.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1.S.R.Betso, M.H.Klapper, .Anderson, J.Amer. Chem. Sec,, V, 94, 1972, p. 8197.

2.Авторское свидетельство СССР по за вке № 2791581/23-26,

кл. С 25 В П/12, 1979.

3.Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В.Березина, В.К.Антонова, К.Мартинека. М., МГУ, 1976, т. 2,

с. 169-176.

4. Wniiams O.L., A.R. Jr., KorosI A. Electrochemical Enzymatic Analysis of Bloo.d. Glucose and Lactate, - Anal. Chem. v. 42 1970 p. 118-121 (прототип).

5. L.Russell Melby. Canadian J, of Chemistry, v. 43, 1965, p. 1448.

i

/5

g

.