SU891776A1 - Способ получени ферментного препарата @ -галактозидазы - Google Patents
Способ получени ферментного препарата @ -галактозидазы Download PDFInfo
- Publication number
- SU891776A1 SU891776A1 SU792874454A SU2874454A SU891776A1 SU 891776 A1 SU891776 A1 SU 891776A1 SU 792874454 A SU792874454 A SU 792874454A SU 2874454 A SU2874454 A SU 2874454A SU 891776 A1 SU891776 A1 SU 891776A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- ultrafiltration
- citrate buffer
- resulting solution
- acetal
- resin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 title description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 title 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 17
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 17
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 5
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 241000223208 Curvularia Species 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 2
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 206010023648 Lactase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- -1 carboxyl cation Chemical class 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Изобретение стноситс к технологии получени ферментного препарата Л-галактозидазы. Препарат предназначен дл лечени лактазной недостаточности . Известен способ получе1а{ фермент ного препарата р-галактозидазы путем фильтрации культуральной жидкости гриба-продуцента Си rvu 1 а г 1 а inaequal i штамм 75, сорбции фермента из полученного нативного раствора на катионообменной смоле, в качестве которой обычно используют карбоксильный катионит КИТ в высокодисперсной форме , представл ющий собой продукт сополимеризации метакриловой кислоты и триазина, с последующей десорбцией фермента цитратным буфером, ультрафильтрацией раствора через ацетатцеллюлозную мембрану и лиофильной сушкой. Конечный продукт обладает активностью 5000-6000 ед/г Однако- известный способ имеет недостаточно высокую активность целевого продукта. Цель изобретени - повышение активности целевого продукта. Указанна цель достигаетс способом получени ферментного препарата )Ь-галактозидазы, который заключаетс в том, что культуральную жидкость гриба-продуцента Curvularia lis штамм 75 подвергают выморажива1нию при (-15) - (-18)с в течение 12-15 ч с последующим оттаиванием, затем ее подвергают фильтрации, полу ченной в результате фильтрации нативный раствор концентрируют перед сорбцией в 10 раз по объему путем ультрафильтрации с помощью мембраны РТНК 00005, после чего провод т сорбцию фермента из сконцентрированного нативного раствора на катионообменной смоле, в качестве которой используют полимер, представл ющий собой продукт сополимеризации метакриловой кислоты и триазина. Предлагаемый способ позвол ет увеличить активность целевого продук та в 2 раза. Введение в технологический процес стадии замораживани и оттаивани культуральной жидкости перед фильтра цией увеличиваетс скорость фильтрации в 1,5-2 раза, за счет увлечени слизистых полисахаридов продуцента разрушенными клетками мицели . Кроме этого, из разрушенных клеток в раствор переходит эндогенна Jb-галактозидаза . Активность раствора повьш1ает с в результате этого на 40%. 1 Так как введение стадии вымораживани -оттаивани культуральной жид-, кости позвол ет освободить нативный раствор фермента от сопутствующих слизистых осадков полисахаридной природы, то возмолсно проводить, концентрирование активности нативного раствора с помощью ультрафильтрации что позвол ет получить продукт более высокого качества. Таким образом, сочетание и указанна последовательность операций при- проведении процесса в строго . определенных услови х (рН, температура , ионна сила растворов, исполь зование иоиита и мембрань заданной струЕстуры) позвол ет получить препа рат высокого качества и чистоты, из которого можно приготовить фермент медицинского назначени . Предлагаемый способ получени ферментного препарата р)-галактозида зы состоит из следующих стадий; 1 . Выг-юраживание культуральной жидкости при (-15)-(18)°С 12-15 ч, оттаивание при комнатной температур 2.Фильтраци культуральной жидкости через фильтр с наполнителем ( HanpiiMept .перлит, кизельгур, инфузорна земл в количестве 0,5 вес.% к объему) . 3.Концентрирование нативного раствора фермента на ультрафильтрац онной установке Millipore (США) на мембране типа РТНК 00005 при ком натной температуре примерно в 810 раз. .4. Сорбци нативного раствора с рН 3,5 высокодисперсным катионитом КИТ. 5. Промьюка смолы ум гченной во , дои с рН 3,5-6,0 дл десорбции балластных белков. 6 . 4 6.Десорбци фермента со смолы 0,2 М цитратным буферным раствором с рН 4,84:0,5. 7.Концентрирование элюата в 3 раза на ацет: атцеллкшозной мембране УАМ-300 с радиусом пор 100-150 А и последующими двум диафильтраци ми дистиллированной водой кажда в 10-кратном объеме к исходному. 8. Высушивание высококонцентрированных и обессоленных растворов фермента лиофильно известными способами. Пример 1. Культуральную жидкость по окончании ферментации (активность 1,9 ед/мл, рН 4,9) сливают в емкость и замораживают при (-18) (-20)С на 15ч, оттаивают при комнатной температуре, фильтруют с наполнителем на рамном фильтр-прессе. Выход на стадии фильтрации 80%. Нативный раствор с активностью 2,7 ед/мл в количестве 20 л концент рируют в 10 раз ПО объему на ультрафильтрационной установке фирмы Millipore на мембране типа РТНК 00005. Получают 2 л раствора с активностью 26 ед/мл, выход на стадии 96,3%. Полученный раствор подкисл ют 3 н. НС1 при перемешивании до рН 3,5; инактивации не наблюдаетс . Рг-Галактозидазу из раствора сорбируют высокодисперсной формой смолы КМТ (ТУ-6-09-10-456-75) (40-60 мкм в количестве 100 г) на послойной ионообменной колонне, где смола (по 10 г) расположена 1 см - слоем на 10-и последовательно соединенных кольцах. Смолу готов т путем последовательной обработки: 1 н. НС 1 ум гченна вода, 1 н. NaOH в 2 н.-ном растворе NaC1, 1 н.ацетатным буферным раствором с рИ 3,5 с 1 н. NaCI. Скорость фильтрации раствора через смолу 30 мл/ч-см . Выход на стадии сорбции 85%. Затем дл десорбции со смолы балластных белков провод т промывку ум гченной водой с рН 3,5 и нейтральным рН (по 2л). Десорбцию )-галактозидазы осуществл ют 0,2 н. цитратным буферным раствором с рН 4,8 со .скоростью 10 . Собирают 5 фракций по 300 мл, в трех средних содержитс 85% сорбированного фермента со средней активностью 39 ед/мл. Эти фракции концентрируют и деминерализуют с помощью ацетатцеллюлозной мембраны УАМ-200 {ТУ-6-05-221-599-77) в чейки ограниченного объема, получают 250 мл с активностью 135 ед/мл, т.е. выход на стадии 96%. Лиофилизаци концентрата проходит с выходом по активности 75%. Получают 2,12 г препарата с активностью 12 ед/мг. Выход конечного продукта от содержани в культуральной жидкости 38%. Пример 2. Культуральную жид кость по окончании ферментации с активностью 2,2 ед/мл, рН 4,4 подвергают замораживанию. Замораживание повышает активность исходного раство ра до 3,0 ед/мл. Полученный после фильтрации культуральной жидкости (выход 80%) на рамном фильтр-прессе с 0,5% перлита нативньш раствор (25 л по объему) концентрируют на ультрафильтрационной установке Mill роге. Выход на стадии 98,5%, т.е. получают 2,5 л с активностью 29,6 ед/мл. 6« Сорбци подкисленного до рН 3,5 концентрированного нативного раствора проходит с выходом 82%. После промывки смолы в колонне подкисленной и нейтральной ум гченной водой, провод т десорбцию. Получают 1,2 л элюата со средней активностью 42 ед/мл, выход со$Л1авл ет 83%. Элюат деминерализуют и концентрируют ультрафильтрацией до 360 мл, активность полученного концентрата 133 ед/мл, выход на стадии 95%. После лиофилизации концентрата получают, порошок в количестве 3,17 л с активностью П ед/мг. Выход на стадии лиофилизации 73%, общий выход конечного продукта от содержани в культуральной жидкости 37%. В табл. 1 приведены сравнительные данные по очистке -галактозидазы известным и предлагаемым способами, в табл. 2 - характеристика технологического процесса.
О
О
о
о
о
о
Г.
1
гъ
со
CN| СП
1Л го
ONtM
«чfi
- еч
Характеристика технологического процесса
Врем проведени отдельных технологический стадий, чВымораживание и оттдивание культуральной жидкости
Фильтраци культуральной
жидкости
Концентрирование нативного раствораСорбци на смоле КМТ
Ультрафильтраци элюата
Конечный продукт Активность, ед/мг
Удельна активность, ед/мг белка
Claims (2)
1. Способ получени ферментного препарата р-галактозидазы, предусматривающий фильтрацию культуральной жидкос ти гриба-продуцента Curvularia I паequal IS штамм 75, сорбцию фермента из полученного нативного раствора на катионообменной смоле с десорбцией Цитратным буфером, ультрафильтрацию полученного раствора через ацетатцеллкшозную мембрану и лиофильную сушку, отличающийс тем, что, с целью повышени актиапости целевого продукта, культуральную жидкость перед фильтрацией предварительно подвергают вымораживанию при
Способ
I Известный I Предлагаемый
12-15
2-3
1
1
14
10-12 13-14
(-15)-(-18)с в течение 12-15 ч, с последующим оттаиванием, а нативный раствор концентрируют перед сорбцией в 10 раз по объему путем ультрафильтрации с применением мембраны РТНК 00005.
2. Способ по п. I, отличающий с - тем, что в качестве катиог нообменной смолы используют полимер, представл ющий собой продукт сополимеризации метакриловой кислоты и триазина.
Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе
1. Авторское свидетельство СССР №659612, кл. С 12 О 13/10, 1976 (прототип ) .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU792874454A SU891776A1 (ru) | 1979-12-05 | 1979-12-05 | Способ получени ферментного препарата @ -галактозидазы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU792874454A SU891776A1 (ru) | 1979-12-05 | 1979-12-05 | Способ получени ферментного препарата @ -галактозидазы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU891776A1 true SU891776A1 (ru) | 1981-12-23 |
Family
ID=20874274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU792874454A SU891776A1 (ru) | 1979-12-05 | 1979-12-05 | Способ получени ферментного препарата @ -галактозидазы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU891776A1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2309766C1 (ru) * | 2006-03-31 | 2007-11-10 | Некоммерческое партнерство Научно-технический центр "Лекарства и биотехнология" | Средство для коррекции дефицита лактазы |
| WO2023237360A1 (en) * | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Chr. Hansen A/S | Improving filterability of lactase by adding anions selected from malate, tartrate, citrate, gluconate, edta or combinations thereof and sterile filtered lactase product obtained |
-
1979
- 1979-12-05 SU SU792874454A patent/SU891776A1/ru active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2309766C1 (ru) * | 2006-03-31 | 2007-11-10 | Некоммерческое партнерство Научно-технический центр "Лекарства и биотехнология" | Средство для коррекции дефицита лактазы |
| WO2023237360A1 (en) * | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Chr. Hansen A/S | Improving filterability of lactase by adding anions selected from malate, tartrate, citrate, gluconate, edta or combinations thereof and sterile filtered lactase product obtained |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0466455B2 (ru) | ||
| CN112724242B (zh) | 利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法 | |
| CN112480243B (zh) | 一种规模化水蛭素分离纯化生产工艺方法及设备 | |
| JPH0319654A (ja) | ホエー蛋白質を含む出発原料からのラクトグロブリン除去法 | |
| JPH0533239B2 (ru) | ||
| JP5908496B2 (ja) | トランスジェニックイネの子実からヒト血清アルブミンを抽出する方法 | |
| CN102191234A (zh) | 鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法 | |
| SU891776A1 (ru) | Способ получени ферментного препарата @ -галактозидазы | |
| CN110627848B (zh) | 一种去除唾液酸中杂质的方法及其应用 | |
| EP0049801A2 (de) | Saccharose-Mutase, immobilisierte Saccharose-Mutase und Verwendung von dieser immobilisierten Saccharose-Mutase zur Herstellung von Isomaltulose (6-0-alpha-D-Glucopyranosido-D-fructose) | |
| CN100480378C (zh) | 生产乳过氧化物酶的方法 | |
| JPH05505092A (ja) | リゾチーム二量体の製造方法 | |
| Oosten | Ultra filtration of potato juice results in high yield of protein | |
| CN113230892B (zh) | 一种用于超滤纯化胶原蛋白的超滤膜及纯化胶原蛋白的方法 | |
| CN112137071B (zh) | 一种基于膜过滤技术的降低酱油中食盐含量的方法 | |
| JPS6160050B2 (ru) | ||
| CN216404262U (zh) | 一种大豆小分子肽的提取浓缩装置 | |
| Bazinet et al. | Recent patented applications of ion-exchange membranes in the agrifood sector | |
| CN105837685A (zh) | 一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法 | |
| RU2353652C1 (ru) | Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена | |
| JP2683813B2 (ja) | 濾過性の増加を目的とする、多糖類を含む醗酵液の処理方法および石油の二次回収におけるこの液の使用 | |
| SU877934A1 (ru) | Способ выделени цитохрома @ из дрожжей | |
| JPS589686A (ja) | ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼの精製法 | |
| RU96112733A (ru) | Способ промышленного получения и очистки гемоглобина | |
| PL85201B1 (ru) |