TH17635A - อะมิโนเพพติเดสชนิดใหม่ กระบวนการเตรียมอะมิโนเพพ?ติเดสและโปรตีนจากมัน - Google Patents

Abstract

ได้แยกอะมิโนเพพทิเดสชนิดใหม่ออกจากเซลล์เพาะเลี้ยงของStretomyces thermonitrificans และได้ไวด์ไทม์รีคอมบิแ นนท์โปรตีนจากอะมิโนเพพติเดสดังกล่าว

Claims (11)

1.อะมิโนเพพทิเดสชนิดหนึ่งที่แยกจากอาหารเพาะเชื้อ(culture medium) ของ Stretomyces thermonitrificans และมี สมยบัติดังต่อไปนี้ (a) แอกทิวิตี้ (activity) แอกทิวิตี้ของการออกฤทธิ์ต่อเปป ไทด์ หรือโปรตีน ที่มีเอธิโอนีนเรซิดิวอยู่ที่ส่วนปลาย N เพื่อปล่อยเมธิโอนีนตรงปลาย N แบบเลือกสรร (b) ความจำเพาะต่อสับสเทรท แอกทิวิตี้ของอะมิโนเพพทิเดสตาม สับสเทรทตามที่สัดที่ 37 องศาเซลเซียส และพีเอช 8 (Tris บัฟเฟอร์ 100 มิลิโมลาร์): แอกทิวิตี้ของสารต่อเมธิ โอนีน-พาราไนโตรแอนิไลด์จะต่ำเมื่อเทียบกับแอกทิวิตี้ต่ำ มากๆกับ ไกลซีน-โพรลีน-พาราไนโตรแอนไลด์ แอนิลีน-พาราไนโตรแอนิไลด์ ไลซีน-พาราไนโตรแอนิไลด์ ไกลซีน-พาราไนโตรแอนิไลด์ และ ไกลซีน-เฟนิลแอลามีน-พาราไนโตรแอนิไลด์ (c) พีเอชเหมาะสม 7.5 ถึง 9 (d) อุณหภูมิเหมาะสม 30 ถึง 50 องศาเซลเซียส (e) มวลโมเลกุล (ในรูปสถานะถูกรีดิวซ์) ประมาณ 41 ถึง ประมาณ 54 kD, และ (f) มวลโมเลกุล (ในสถานะธรรมชาติ) ประมาณ 36 ถึง ประมาณ 40kD

2.อะมิโนเพพทิเดสตามข้อถือสิทะธิ 1 ซึ่งประกอบด้วยลำดับ กรดอะมิโน Lys-Phe-Ser-Lys-lys-phe-Asn-Glu ที่ปลาย N ของ สารและลำดับกรดอะมิโน Glu-Pro-Gly-Thr-Gly-Ala-Leu-Glu-pro และ Asn-Pro-asp-Ile-Val-Thr ที่บริเวณอื่นๆของสาร

3.กรรมวิธีสำหรับการเตรียมอะมิโนเพพทิเดสที่นิยามในข้อถือ สิทธิ 1 หรือ 2 ที่ประกอบด้วยขั้นตอนการเพาะเชื้อ Stretomyces thermonitrificans ในอาหารเพาะเชื้อ (medium) ที่ประกอบด้วยกาแลคโตสเป็นนแหล่งคาร์บอน และการเก็บเกี่ยว (recovering) อะมิโนเพพทิเดสจากอาหารเพาะเชื้อนั้น

4.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 3 โดยที่ความเข้มข้นของการแลคโตส ในอาหารเพาะเชื้ออยู่ในช่วงตั้งแต่ 1 ถึง 4% โดยน้ำหนัก เมื่อเทียบกับน้ำหนักรวมของอาหารเพาะเชื้อ

5.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 3 หรือ 4 ซึ่งประกอบเพื่มเติม ด้วยขั้นตอน (A) ปั่นแยกหรือเซนตริฟิวจ์เซลล์ Stretomyces thermonitrificans ที่เพาะไว้ และแยกส่วนลอย (supernatant)จากที่นั้น (B) เติมแอมโมเนียมซัเฟตลงในส่วนลอย (C) ดำเนินการแยกแบบสามเฟส (triphase partition) โดยการ เติมเทอร์เชียรีบิวทานอลลงในส่วนลอย และแยกสารละลายใสใน ลักษณะเป็นชั้นที่อยู่ต่ำกว่าของสาร (D) เติมแอมโมเนียมซัลเฟตลงในสารละลายใสและทำขั้นตอน(c) ดังกล่าวซ้ำ แต่แยกชั้นระหว่างกลางระหว่างเทอร์เชียรีบิวทา นอลดังกล่าว และชั้นแอเควียสดังกล่าว (E) นำชั้นระหว่างกลางที่ได้มาในขั้นตอน(D) ดังกล่าวไปผ่าน โครแมโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนแคทไอออน เพื่อทำให้ได้ส่วนที่ บรรจุอะมิโนเพพทิเดส และ (F) ทำ FPLC ต่อลำดับส่วนต่างๆ เพื่อทำให้ได้อะมิโน เพพทิเดส ในระดับขั้นที่มีความบริสุทธิ์อย่างสูง

6.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 5 โดยที่เติมแอมโมเนียมซัลเฟตใน ขั้นตอน (B) และ (D) ดังกล่าวให้ได้ความเข้มข้นอยู่ในช่วง ตั้งแต่ 35 ถึง 50% (น้ำหนัก/ปริมาตร) และตั้งแต่ 80 ถึง 90%(น้ำหนัก/ปริมาตร) ตามลำดับ

7.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 5 โดยที่ทำโครแมโทกราฟีแบบแลก เปลี่ยนแคทไอออนดังกล่าวโดยการใช้คอลัมน์ S-เวฟาโรส (S-sepharose column)

8.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 5 โดยที่ทำ FPLC คอลัมน์โครแมโท กราฟี ด้วยการใช้ FPLC โมโน-S คอลัมน์

9.กรรมวิธีสำหรับการเตรียม ไวลด์-ไทปรีคอมบิแนนท์โปรตีน โดยการกำจัดเอธิโอนีนออกจากN-เมธิโอนิลรีคอมบิแนนท์โปรตีน ที่สร้างขึ้นที่จุลินทรีย์ โดยอาศัยการทำปฏิกิริยา N-เมธิ โอนิลรีคอมบิแนนท์โปรตีน กับอะมิโนเพพทิเดสที่อ้างถึงในข้อ ถือสิทธิ 1 ถฃภายในบัฟเฟอร์ทำปฏิกิริยา

10.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 9 โดยที่รีคอมบิแนนท์โปรตีน เป๋นรีคอมบิแนนท์ฮอร์โมนที่กระตุ้นการเติบโตของมนุษย์ (recombinant human growth hormone)

11.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 9 หรือ 10 โดยที่บัฟเฟอร์ทำ ปฏิกิริยาประกอบด้วย NaCl ที่ความเข้มข้นอยู่ในช่วงตั้งแต่ 0 ถึง 100 มิลลิโมลาร์ และมีพีเอชอยู่ในช่วงตั้งแต่ 7.5 ถึง 9.5 (ข้อถือสิทธิ 11 ข้อ, 3 หน้า, 9 รูป)