TH17655Y - ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์ ดังกล่าว และกรรมวิธีการผลิตโปรตีนเป้าหมายแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วย เมธานอลด้วยผลิตภัณฑ์ดังกล่าว - Google Patents

Abstract

------22/10/2563------(OCR) การประดิษฐ์นี้เป็นการพัฒนาผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์ เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์ดังกล่าว และ กรรมวิธีการผลิตโปรตีนเป้าหมายแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอลด้วยผลิตภัณฑ์ดังกล่าว ที่ซึ่ง ผลิตภัณฑ์ดังกล่าว ประกอบด้วย เซลล์ยีสต์ Ogataea thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน และ พลาสมิดพาหะที่มีความเหมาะสมในการใช้งานควบคู่กับเซลล์ยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทน ร้อน โดยประกอบด้วยส่วนสำคัญในการแสดงออกยีนคือโปรโมเตอร์ชนิดเหนี่ยวนำด้วยเมธานอลที่แยกได้จาก O. thermomethanolica โดยผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนตามการประดิษฐ์นี้ สามารถควบคุมการ แสดงออกของยีนเป้าหมาย โดยที่โปรโมเตอร์ AOX จาก O. thermomethanolica นั้น สามารถทำงานได้ที่อุณหภูมิสูง อีกทั้งการเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างโปรตีนลูกผสมภายใต้การทำงานของโปรโมเตอร์ AOX นี้โปรตีนลูกผสมจะเริ่มสร้างในขณะที่เลี้ยงเซลล์ยีสต์ด้วยกลีเซอรอล ซึ่งเป็นช่วงของการเจริญเติบโตของเซลล์ก่อนจะเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อไปเป็นเมธานอล และหลังจากที่เซลล์ยีสต์ถูกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเมธานอลซึ่งจะเป็นสภาวะของการเหนี่ยวนำ โปรตีนลูกผสมจะถูกสร้างได้ในระดับที่สูง ซึ่งทำให้การใช้O. thermomethanolica เป็นเซลล์เจ้าบ้านร่วมกับการใช้โปรโมเตอร์ AOX จาก O. thermomethanolicaนั้น สามารถผลิตโปรตีนลูกผสมได้ตั้งแต่ขั้นตอนของการใช้กลีเซอรอลไปจนถึงขั้นตอนการใช้เมธานอลทำให้ได้โปรตีนในปริมาณที่เพิ่มมากขึ้น ในเวลาที่สั้นลง นอกจากนี้ ยังมีข้อดีเพิ่มเติมอื่นๆ อาทิ โปรตีนลูกผสมที่ผลิตได้สามารถผลิตออกนอกเซลล์เป็นโปรตีนหลักโดยที่ไม่มีโปรตีนของเซลล์เจ้าบ้านปะปนหรือมีในปริมาณน้อย ทำให้ง่ายต่อการนำไปทำให้บริสุทธิ์ในขั้นต่อไป และในกรณีที่โปรตีนเป้าหมายคือเอนไซม์ ยังพบว่า ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนนี้ทำให้ได้เอนไซม์ที่มีกิจกรรมสูงอีกด้วย ------------

Claims (1)

------22/10/2563------(OCR) 1. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทน ร้อนแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ได้แก่ พลาสมิดพาหะสำหรับการแสดงออกยีนเป้าหมายที่มี ส่วนประกอบของลำดับเบสที่สำคัญต่อการแสดงออกของยีนในทิศทางจากปลาย 5’ ไปยังปลาย 3’ ดังนี้ ก. ลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน ข. ลำดับเบสของแอลฟา-แฟกเตอร์ซีครีชั่นซิกนอล ซึ่งเป็นส่วนนำโปรตีนออกนอกเซลล์ ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica ค. ลำดับเบสที่เป็นตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิล ซึ่งมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ EcoRI, KpnI, SacI, NsiI, ApaI, SalI, PmeI, BamHI, NheI ง. ลำดับเบสที่เป็นทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัด แยกได้จาก O. thermomethanolica จ. ยีนต้านยาปฏิชีวนะนีโอมัยซินสำหรับใช้คัดแยกเซลล์ที่มีพลาสมิดลูกผสม ที่ถูกควบคุมด้วย โปรโมเตอร์ 2 ชนิดที่เชื่อมต่อกัน ได้แก่ โปรโมเตอร์ TEF1 ที่แยกได้จาก O. thermomethanolica และโปรโมเตอร์ L-ldh ที่แยกได้จาก L. plantarum BCC9546 ฉ. ทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนสที่ คัดแยกได้จาก O. thermomethanolica ช. จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (pUC origin of replication, pUC ori) สำหรับใช้ในการเพิ่ม จำนวนใน E. coli2. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อน แบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ยีนเป้าหมายที่ใช้กับผลิตภัณฑ์สำหรับการ แสดงออกยีนดังกล่าว คือยีนที่คัดแยกได้จากสิ่งมีชีวิตกลุ่มโปรคาริโอต หรือ ยูคาริโอต อย่างใดอย่างหนึ่ง3. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทน ร้อนแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ตามข้อถือสิทธิ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง ยีนเป้าหมายที่ใซ้ผลิตภัณฑ์ สำหรับการแสดงออกยีนดังกล่าว คือ ยีนที่ประมวลรหัสเป็นโปรตีนที่มีศักยภาพการใช้งานทางการแพทย์ หรือ ทางอุตสาหกรรม อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างรวมกัน4. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทน ร้อนแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง ยีนเป้าหมายที่ใช้ กับผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนดังกล่าว คือ ยีนที่ประมวลรหัสเป็นเอนไซม์ในกลุ่มย่อยองค์ประกอบ เซลล์พืซจำพวกลิกโนเซลลูโลส หรือเฮมิเซลลูโลส หรือ กลุ่มฮีสทิดีนแอซิดฟอสฟาเทส อย่างใดอย่างหนึ่ง หรือหลายอย่างรวมกัน5. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารซีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทน ร้อนแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ตามข้อถือสิทธิ 4 ที่ซึ่ง ยีนที่ประมวลรหัสเป็นเอนไซม์ในกลุ่ม ย่อยองค์ประกอบเซลล์พืซจำพวกลิกโนเซลลูโลส หรือ เฮมิเซลลูโลส หรือ กลุ่มฮีสทิตีนแอซิดฟอสฟาเทส ดังกล่าว เลือกได้จากยีนทีประมวลรหัสเป็นเอนไซม์เบต้ากลูโคซิเดส หรือ เบต้าไซโลซิเดส หรือ ไฟเตส อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างรวมกัน6. เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ ยีสต์ทนร้อนแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง เซลล์ดังกล่าว ประกอบด้วย (1) เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ Ogataea thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน (2) พลาสมิดพาหะสำหรับการแสดงออกยีนเป้าหมายที่มีส่วนประกอบของลำดับเบสที่สำคัญต่อการ แสดงออกของยีนในทิศทางจากปลาย 5' ไปยังปลาย 3’ ดังนี้ ก. ลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน ข. ลำดับเบสของแอลฟา-แฟกเตอร์ซีครีซั่นซิกนอล ซึ่งเป็นส่วนนำโปรตีนออกนอกเซลล์ ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica ค. ลำดับเบสที่เป็นตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิล ซึ่งมีตำแหน่งของเอนไซม์ดัดจำเพาะ ได้แก่ EcoRI, KpnI, SacI, NsiI, ApaI, SalI, PmeI, SomHI, NheI ง. ลำดับเบสที่เป็นทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัด แยกได้จาก O. thermomethanolica จ. ยีนต้านยาปฏิชีวนะนีโอมัยซินสำหรับใช้คัดแยกเซลล์ที่มีพลาสมิดลูกผสม ที่ถูกควบคุมด้วย โปรโมเตอร์ 2 ชนิดที่เชื่อมต่อกัน ได้แก่ โปรโมเตอร์ TEF1 ที่แยกได้จาก O. thermomethanolica และโปรโมเตอร์ L-ldh ที่แยกได้จาก L. plantarum BCC9546 ฉ. ทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนสที่ คัดแยกได้จาก O. thermomethanolica ช. จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (pUC origin of replication, pUC ori) สำหรับใช้ในการเพิ่ม จำนวนใน E. coli7. เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีน ตามข้อถือสิทธิ 6 ที่ซึ่ง เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน เจริญเติบโตได้ดีในช่วงอุณหภูมิ 30 ถึง 40 องศาเซลเซียส และไม่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะนีโอมัยซิน8. เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีน ตามข้อถือสิทธิ 6 หรือ 7 ที่ซึ่ง เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน คือ ยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ TBRC6569. กรรมวิธีการผลิตโปรตีนเป้าหมายแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ด้วยผลิตภัณฑ์สำหรับการ แสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนเป้าหมาย ตามข้อถือสิทธิ 1 - 5 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง กรรมวิธีดังกล่าว ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก. การสร้างพลาสมิดลูกผสมเพื่อการแสดงออกของยีนเป้าหมายที่ต้องการ โดยการเชื่อมยีนเป้าหมายเข้า กับพลาสมิดพาหะที่ตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิลที่เหมาะสมกับยีนเป้าหมายและเพิ่มจำนวน พลาสมิดลูกผสมดังกล่าวในเซลล์ E. coli ข. การเตรียมพลาสมิดลูกผสมจากข้อ ก. เพื่อให้มีความเหมาะสมต่อการถ่ายโอนและเกิดการสอดแทรก เข้าสู่โครโมโซมเมื่อเข้าไปอยู่ในเซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน โดย ทำการสกัดพลาสมิดลูกผสมออกจาก E. coli และตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะในบริเวณของลำดับเบส ที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดสซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica ค. การสร้างเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanolica เพื่อการแสดงออกของยีนเป้าหมาย โดยการ ถ่ายโอนพลาสมิดลูกผสมที่เตรียมได้จากข้อ ข. เข้าสู่เซลล์ยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ ทนร้อน และคัดเลือกเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanolica ที่ได้รับพลาสมิดลูกผสมบนอาหาร เลี้ยงเชื้อแข็งที่มียาปฏิชีวนะนีโอมัยซิน ง. การผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ต้องการด้วยการเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanolica เพื่อการแสดงออกของยีนเป้าหมาย จากข้อ ค. ในสภาวะการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมดังนี้ เริ่มจากการ เพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ลูกผสมในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่อุณหภูมิ 25 - 40 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้ อากาศ ทำการถ่ายเชื้อลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวอีกครั้งและเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 25 - 40 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ เตรียมเซลล์ให้เข้มข้นด้วยการตกตะกอนเซลล์ที่เลี้ยงได้และ ละลายเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว ที่ประกอบด้วยเมธานอลความเข้มข้นที่ 1 - 3 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นผลิตโปรตีนเป้าหมายโดยเพาะเลี้ยงเซลล์ต่อในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวดังกล่าวที่ช่วงอุณหภูมิ 25 - 40 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ โดยทำการเติมเมธานอลที่ 1 - 3 เปอร์เซ็นต์ ทุกวัน10. กรรมวิธีการผลิตโปรตีนเป้าหมายแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ด้วยผลิตภัณฑ์สำหรับการ แสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนเป้าหมาย ตามข้อถือสิทธิ 9 ที่ซึ่ง สภาวะที่เหมาะสมที่สุดในการผลิต โปรตีนเป้าหมายที่ต้องการด้วยการเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanolica เพื่อการ แสดงออกของยีนเป้าหมาย คือ การเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ลูกผสมในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลววายพีดี ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ เป็นเวลา 18 - 24 ชั่วโมง แล้วทำการถ่ายเชื้อลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ เหลวบีเอ็มจีวายและเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ เป็นเวลา 18 - 24 ชั่วโมง หรือจนกระทั่งวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 600 นาโนเมตร ได้เท่ากับ 8 - 12 จากนั้น เตรียมเซลล์ให้เข้มข้นด้วยการตกตะกอนเซลล์ที่เลี้ยงได้และละลายเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว บีเอ็มเอ็มวาย ที่ประกอบด้วยเมธานอลความเข้มข้นที่ 2 เปอร์เซ็นต์ โดยใช้อาหารเลี้ยงเชื้อเหลว บีเอ็มเอ็มวายในปริมาตรที่ลดลงจากอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวบีเอ็มจีวายก่อนหน้านี้ 10 เท่า จากนั้นผลิต โปรตีนเป้าหมายโดยเพาะเลี้ยงเซลล์ต่อในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวบีเอ็มเอ็มวายดังกล่าวที่ช่วงอุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ เป็นเวลารวมทั้งสิ้น 48 ชั่วโมง โดยทำการเติมเมธานอลที่ 2 เปอร์เซ็นต์ ทุกวัน ------------ แก้ไข 26/10/2561 ข้อถือสิทธิ

1. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทน ร้อนแบบอาศัยการเหนี่ยวนำด้วยเมธานอล ได้แก่ พลาสมิดพาหนะสำหรับการแสดงออกยีนเป้าหมายที่มี ส่วนประกอบของลำดับเบสที่สำคัญต่อการแสดงออกของยีนในทิศทางจากปลาย 5' ไปยังปลาย 3' ดังนี้ (ก) ลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica สายพันธ์ทนร้อน (ข) ลำดับเบสของแอลฟา-แฟกเตอร์ซีครีชั่นซิกนอล ซึ่งเป็นส่วนนำโปรตีนออกนอกเซลล์ ซึ่งคัดแยก ได้จาก O. themomethanolica (ค) ลำดับเบสที่เป็นตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิล ซึ่งมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ EcoRl, Kpnl, Sacl, Nsil, Apal, Sall, Pmel, Bamhl, Nhel (ง) ลำดับเบสที่เป็นทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัด แยกได้จาก O. thermomethanolica (จ) ยีนต้านยาปฏิชีวนะนีโอมัยซินสำหรับใช้แยกเซลล์ที่มีพลาสมิดลูกผสม ที่ถูกควบคุมด้วย โปรโมเตอร์ 2 ชนิดที่เชื่อมต่อกัน ได้แก่ โปรโมเตอร์ TEF1 ที่แยกได้จาก O. thermomethanolica และโปโมเตอร์ L-ldh ที่แยกได้จาก L. plantarum BCC9546 (ฉ) ทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนสที่ คัดแยกได้จาก O. thermomethanolica (ช) จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (pUC origin of replication, pUC ori) สำหรับใช้ในการเพิ่ม จำนวนใน E. coli -----------