TARIFNAME YABANCI DOKU TESPITINDE KULLANILAN BIR ANALIZ YÖNTEMI VE ANALIZ YÖNTEMINDE KULLANILAN BIR PRIMER-PROB SETI Teknik Alan Bu bulus, et ve et ürünlerinde karkas eti disinda bulunabilecek sakatat gibi yabanci doku ya da dokularin tespitinde, her doku ve organin özgünlügünü saglayan protein yapilarinin olusmasinda araci molekül olan mRNA ve/veya ekspresiyonu olan gen dizilerinin etiket bölgeleri (EST(expressed sequence tagli dizilimleri temelli bir moleküler tespit yönteminin kullanildigi bir analiz yöntemi ve analiz yönteminde kullanilan bir primer-prob seti ile ilgilidir. Önceki Teknik Günümüzde et ve et ürünlerine üretim asamasinda maliyet düsürme kaynakli olarak sakatat ve benzeri yabanci doku katilimi gerçeklesmektedir. Et ve et ürünlerine yabanci dokularin katilmasini önlemek için her ülkenin yetkili mercileri kararlar alsa da bu yabanci doku katiliminin tespit edilmesinin zorlugu ve denetimlerin yetersizligi nedeniyle caydirici olmamaktadir. Ülkemizde, Türk Gida Kodeksi Et ve Et Ürünleri Tebligiine bagli olarak çig kirmiz et, kiyma ve hazirlanmis kirmizi et karisimlarinin üretiminde kemik, kikirdak ve sakatat katilmasi yasaklanmistir. Ayni tebligde çig kanatli eti, hindi kiyma ve hazirlanmis kanatli eti karisimlarinin üretiminde kemikli kikirdak ve sakatat katilmasi yasaklanmistir. Söz konusu tebligde et ürünlerinin karkas etinden veya sakatattan hazirlanabilecegi ifade edilmis olup sadece dilli salama karkas eti haricinde sakatat katilabilecegi bildirilmektedir. Et ve et ürünlerine sakatat ve yabanci doku karistirilmasi sadece histolojik analizler kullanilarak tespit edilebilmektedir. Ancak bu analizin verimli bir sekilde uygulanabilmesi için yeterli uzman personel bulunmadigi gibi, yöntemin sayisal çikti olarak degerlendirilememesi sorun teskil etmektedir. Söz konusu yöntemi sadece uzman kisiler uygulayabilmekte ve bu kisiler mikroskop altinda dokularin varligini tespit edebilme yeteneklerine göre sonuçlara ulasilmaktadir. Dolayisiyla sonuç özneldir. Bunun için önceki teknikte kullanilan uygulamalarda olmayan uzmanlik gerektirmeyen, objektif ve kesin sonuç verebilecek sistemlere Ihtiyaç duyulmaktadir. TR201006092 sayili Türk patent dokümaninda et ürünlerinin içerisinde bulunabilecek esek etinin, real-time PCR TaqMan probe teknigi ile tespitinde kullanilan özgün primer-prob seti içeren bir kitten bahsedilmektedir. Söz konusu bulusta et ürünlerinde esek etinin 0,1 pikograma kadar olan kontaminasyonlarinin tespit edilebilmesi saglanmaktadir. Esek türüne Özgün kit ile at, domuz, sigir, koyun, tavuk ve hindi türlerinin 40. döngüye kadar çapraz reaksiyon vermemesi sonucu çig ve isil islem uygulanmis et karisimlarinda esek etinin özgün olarak tespiti saglanmaktadir. özellikle yiyeceklerde bulunan etlerden hayvan dokularinin tespit edilmesini saglayan bir kitten bahsedilmektedir. Et, kiyma, emülsifiye ve isil islem görmüs et ürünlerinde maliyeti düsürmek adina kalitesi düsük hammadde kullanimina gidildigi ve karkas eti disindaki diger doku ve organlar da et ürünlerine katilabildigi için tüketiciye saglikli ve güvenilir gida ulastirilmasi ve üretici firmalar arasinda haksiz rekabetin önlenmesi adina et ve et ürünlerinde yabanci dokularin tespit edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle yabanci doku tespiti için analitik, hizli ve objektif sonuç veren bir yöntem gerekmektedir. Bulusun Kisa Açiklamasi Bu bUIUSun amaci, moleküler biyoloji ve genetik teknikleri kullanilarak et ve et ürünlerinde sakatat gibi yabanci doku tespiti için, mesajci ribonükleik asit (mRNA) ve/veya ekspresyonu olan gen dizilerinin etiket bölgelerinin (EST) dizilimlerinin temel alinarak sirasiyla RNA izolasyonu, ters-transkriptaz polimeraz Zincir (PCR) reaksiyonu ve RT- (gerçek zamanli (real-time)) PCR analizlerinin yapildigi bir analiz yöntemi gerçeklestirmektir. Bulusun diger amaci karkas dokularinda bulunmayan ancak tespiti hedeflenen yabanci dokularda ortak olarak bulunan mRNA"larin seçilmesi ile bir ya da birden fazla sayida mRNA dizisinin veri tabanlari yardimiyla bulunarak et ürünlerinde olmasi istenmeyen dokularin tespit edildigi bir analiz yöntemi gerçeklestirmektir. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bulus konusu yabanci doku tespitinde kullanilan bir analiz yöntemi, -yabanci doku tespiti yapilacak örnek disinda kalan yabanci dokulara özgü mRNA ve/veya EST"lerin (expressed sequence tag) seçilmesi, -yabanci doku tespiti yapilacak örnekten RNA izolasyonunun yapilmasi, -izole edilen RNA°larin ters transkripsiyon PCR reaksiyonu ile cDNAlya dönüstürülmesi, -seçili mRNA,ya özgü primer-prob seti ile cDNAllarin RT-PCR yöntemi kullanilarak çogaltilmasi ve çogaltma reaksiyonu sirasinda alinan sinyalin incelenerek, çogalma egrisinin olusmasi durumunda hedef dokunun var olduguna karar verilmesi adimlarini içermektedir. Bulus konusu analiz yönteminde, et ve et ürünlerinde sakatat ve yabanci doku tespiti için ilk olarak hayvan türlerine ait gen indekslerine bakilmakta ve et ürünlerinde kullanilmasi istenmeyen dokularda ekspresyonu olan gen dizilerinin etiket bölgeleri (EST) belirlenmektedir. Bulus konusu analiz yönteminde kullanilan ESTsler (ekspresyonu olan gen dizilerinin etiket bölgeleri) mRNAilarin komplementer sekanslari ya da cDNA olarak veri tabanlarinda bulunmaktadir. Gen Indeksinde bir dokuya ait EST"lere bakildiginda ayni bölgenin baska hangi dokularda ekspresyonun oldugu gösterilmekte ve bu sayede her bir doku için ayri bir EST seçmeye gerek kalmamaktadir. Bulus konusu analiz yönteminde et ve et ürünlerinde yabanci doku tespiti için kas ve yag doku disindaki dokulari kapsayan en az bir EST tespit edilmektedir. Tercihen et ve et ürünlerinde yabanci doku tespiti saglamak için tercihen kas ve yag dokusu disinda kalan dokularda yüksek konsantrasyonda sentezlenen EST°ler seçilmektedir. Tercih edilen bir diger uygulamada ise analiz yönteminde düsük konsantrasyonlu EST,ler seçilerek de sonuç alinabilmektedir. Bulus konusu analiz yöntemin tercih edilen uygulamasinda et ve et ürünlerinde sakatat ve yabanci dokularin tespiti için her bir hayvan türüne ayri olarak yapilabilecegi gibi farkli hayvan türlerinde ayni EST,lerin bulunmasi durumunda birden fazla hayvan türünde sakatat ve/veya yabanci doku tespiti yapilabilmektedir. Bulus konusu analiz yönteminde EST seçiminin ardindan islenmis ya da islenmemis et ürünü olan, üzerinde yabanci doku tespiti yapilacak örnek üzerinde toplam RNA veya mRNA izolasyonu yapilmaktadir. Toplam RNA üzerinde bulunan mRNAilar veya izole edilmis mRNA,lar ters-transkriptaz PCR reaksiyonunda ters-transkriptaz enzimi ile komplementer DNA,ya (cDNA) çevrilmektedir. Bulusun tercih edilen uygulamasinda analiz yönteminde kullanilan primer-prob seti ya da setleri, et ve et ürünlerinde yabanci doku tespiti için kas ve yag doku disindaki dokulan kapsayan EST,lere yönelik termodinamik kurallara göre, EST veri tabanlari kullanilarak tasarlanan, RT-PCR analizi yapabilecek nitelikte olan setlerdir. Bulus konusu analiz yönteminde kullanilan primer-prob seti ya da setleri, analiz sonucunda yabanci dokunun varliginin tespiti için tercih edilen uygulamada ayni boya ile etiketlenmektedir. Tercih edilen bir diger uygulamada ise primer-prob seti veya setleri farkli set ya da setlerden gelen sinyaller ile farkli dokularin tespiti için farkli Analiz yönteminde primer-prob seti ya da setleri kullanilarak RT-PCR analizi yapilmasi ile et ürününde tespit edilmesi planlanan yabanci dokular bulunmaya çalisilmaktadir. Analiz yönteminde, et ürününde karkas eti disinda bir yabanci doku bulunmasi halinde her bir primer-prob seti karsilik geldikleri EST bölgesine baglanarak yabanci dokulardan herhangi biri ya da birilerinin bulunup bulunmadigina dair sinyal vermektedir. Analiz yöntemi, primer-prob setlerinin ayni boya ile etikenlendigi ve analiz sonucunda sinyal elde edildigi durumda yabanci doku varligini tespit etmektedir. Analiz yöntemi, primer-prob setlerinin farkli boyalar ile etiketlendigi ve analiz sonucunda sinyal elde edildigi durumda farkli primer-prob setlerinden gelen farkli sinyalleri inceleyerek hangi yabanci dokularin var oldugunu tespit etmektedir. Analiz yönteminin örnek bir uygulamasinda www.ncbi.nlm.q0v/uniqene web sitesi kullanilarak Bos taurus (sigir) mRNA (EST) veri tabani taranarak kas ve yag dokusu disinda kalan sakatat ve yabanci dokularin yüksek konsantrasyonda bulundugu mRNA,lar seçilmektedir. Söz konusu veri tabani mRNAllarin her bir dokuda sentezlenme oranlarini göstermektedir. Örnek olarak, veri tabaninda özellikle et ürünlerine katilarak tagsis yapilmasi mümkün dokularda sentezlenen fakat kas ve yag dokusunda sentezlenmeyen IGLLl ve CSN2 mRNAllari seçilmistir. Seçilen ESTllerin sekanslan veri tabanindan çekilerek farkli hayvan türleri ile ve sigir türü içerisindeki diger EST sekanslari ile kiyaslanarak özgün oldugu düsünülen bir bölgeye uygun bir primer-prob seti olusturulmaktadir. Tercihen primer tasarimlari WWW.nCbi.nIm.nih.q0v/toolS/primer-blast/ sitesi uyarinca, prob tasarimlari ise WWW.idtdna.C0m sitesi kullanilarak yapilmaktadir. Et ve et ürününden toplam RNA izole edildikten sonra toplam RNA içerisinde bulunan mRNA7lar polyA primerleri kullanilarak ters transkriptaz enzimi ile cDNA"ya çevrilmektedir. Ömekte seçilen mRNA,1arin her bir dokudaki ekspresyonlari ve norrnalize edilmis mRNA miktarlari Tablo llde yer almaktadir. tasarlanmaktadir. IGLLl ve CSN2 EST sekanslarina göre tasarlanan primer-prob setleri kullanilarak, mRNA seçimi ardindan üç kisi tarafindan farkli günlerde analiz yöntemi üçer kere tekrarlanarak RT-PCR analizlerinin validasyonunda kullanilmistir. Gerçek zamanli (Real-time) PCR analizi sonucunda 35. döngünün (CT) altinda elde edilen degerler dokunun tespit edildigini göstermektedir. (Söz konusu tabloda yer alan CT degeri RT-PCR analizinde tekrarlanan döngü sayisini göstermektedir.) Kas ve yag dokularinda 35. Crlden önce çogalma egrisine rastlanilmamaktadir. Analizin üç farkli kisi tarafinda vaIIde edilmesi dogrulugunu ortaya koymaktadir. Geçerlilik çalismasinda kullanilmak üzere, veteriner kontrolünde mezbahaneden yabanci dokular temin edilmistir. Karkas etine oranla %1 sakatat ve yabanci doku içeren örnekler hazirlanmistir. Ömeklerden akciger, beyin, dalak, dil, kalp, karaciger, mide (sirden-bagirsak), meme, ovaryum ve uterus dokularinin tespit edildigi kanitlanmaktadir. Analiz yöntemi ile kalp dokusu hariç diger dokularin %1 tespit Iimitine kadar tespit edilebilmektedir. Ayrica dokular, %1 tespit limitine kadar olan karisimlar dahil olmak üzere, sodyum tuzu, potasyum tuzu, seker ve baharat eklenerek 72 °C,de yaklasik 3 saat isil isleme tabi tutuldugunda da sonuçlarda bir degisiklik olmamakta, sakatat ve yabanci dokular tespit edilmektedir. TR TR TR TR TR TR TR