TR201802089T4 - Kanserin tedavisi ve/veya önlenmesi amacına yönelik ilaç bileşimi. - Google Patents

Abstract

Bu buluş, spesifik olarak kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese edilen bir kanser antijenik proteinini hedef alan bir antikor ve bu antikorun kanser hastalıklarına yönelik bir terapötik ve/veya önleyici ajan olarak kullanımını sunar. Daha somut bir dille ifade etmek gerekirse, bu buluş, bir CAPRIN-1 proteiniyle immünolojik reaktiviteye sahip olan ve antikorun SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen tamamlayıcılık belirleme bölgelerini kapsayan bir ağır zincir değişken bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile gösterilen tamamlayıcılık belirleme bölgelerini kapsayan bir hafif zincir değişken bölgesi içerdiği bir antikor ya da onun bir fragmanını ve kanserin tedavisi ve/veya önlenmesi için kullanma amacına yönelik olan ve antikoru ya da onun fragmanını bir etkin madde olarak içeren farmasötik bileşim sunar.

Description

TARIFNAMEKANSERIN TEDAVISI VE/VEYA ONLENMESI AMACINA YONELIK ILAC BILESIMITeknik AlanBu bulus, kanser için bir terapötik ve/veya önleyici ajan gibi bir ilaçta CAPRIN-1°e karsi bir antikorun ya da onun bir fragmaninin yenikullanimiyla ilgilidir.Arka Plan TeknigiKanser, önde gelen ölüm sebeplerinden biridir. Kanserler için günümüzde uygulanmakta olan tedaviler esas olarak radyasyon tedavisi ve/veya kemoterapiyle kombinasyon halinde cerrahi tedavidir. Son yillarda yeni cerrahi yöntemler gelistirilinesine veya yeni anti-kanser ajanlari kesfedilmesine ragmen, bazi kanserler hariç kanserlerin tedavi sonuçlarinda su anda çok fazla gelisme saglanmamistir. Son yillarda moleküler biyoloji veya kanser immünolojisi alanlarinda saglanan gelismeler sayesinde, spesifik olarak kanserlerle reaktif antikorlar, sitotoksik T hücrelerinin tanidigi kanser anti jenleri, bu kanser antijenlerini kodlayan genler ve benzeri tanimlanmistir ve kanser antijenlerini hedef alan spesifik kansertedavilerine yönelik beklentiler artmaktadir (Patent-disi Literatür 1).Kanser tedavisinin advers reaksiyonunu azaltmak için, kanseranti jenleri olarak taninan peptidlerin, polipeptidlerin ya da proteinlerin norinal hücrelerin hemen hemen hiçbirisinde bulunmamasi, fakat spesifik olarak kanser hücrelerinde mevcut olmasi istenir. 1991 yilinda, Boon ve arkadaslari (Ludwig Kanser Arastirma Enstitüsü, Belçika), otolog kanser hücre hatlarini ve kanser-reaktif T hücrelerini kullanarak bir cDNA ekspresyon klonlama yöntemiyle CD8-pozitif T hücreleri tarafindan taninan bir insan melanom anti jeni MAGEl°i izole ettiler (Patent-disi Literatür 2). Müteakip süreçte, bir kanser hastasinin vücudunda otolog kansere cevaben in vivo ortamda üreyen antikorlarin tanidigi tümör anti jenlerinin bir gen ekspresyon klonlama teknigiyle belirlenip tanimlanmasina dayanan bir SEREX (rekombiiian ekspresyon klonlama yoluyla anti jenlerin serolojik tanimlanmasi) yöntemi tanitilmis ve rapor edilmistir (Patent-Disi Literatür 3 ve Patent Literatürü 1). Bu yöntemden istifade edilerek, normal hücrelerde hemen hemen hiç eksprese olniayan fakat kanser hücrelerinde spesifik olarak eksprese olan bazi kanser anti jenleri izole edilmistir (Patent-Disi Literatürler 4-9). Ayrica, kanser anti jenleriyle spesifik olarak reaksiyona giren immünositlerin kullanildigi hücre terapisi ve asilarin kullanildigi kanser-spesifik immünoterapi veya kanser antijenlerine dayanan benzeri tedavi seçenekleri, söz konusu izole edilmis kanser anti jenlerinden bazilarinin hedef alindigi klinikdeneyler çerçevesinde degerlendirilmektedir.Geçtigimiz yillarda, dünya genelinde, kanser hücrelerinin üzerindeki antijenik proteinleri hedef alan ve kanser tedavisi için gelistirilmis olan çesitli antikor-bazli ilaçlar ortaya çikmistir. Bu ilaçlar, kanser- spesifik terapötik ajanlar olarak belirli farmakolojik etkilersergilemelerinden dolayi epey ragbet görmüslerdir. Fakat bu ilaçlarinhedef aldiklari anti jenik proteinlerin birçogu kanser hücrelerinin yani sira normal hücrelerde de eksprese olurlar. Bu sebeple, bu tip antikorlar uygulandiklarinda, kanser hücrelerinin yani sira anti jenleri eksprese eden normal hücreler de hasar alirlar ve dolayisiyla istenmeyen advers reaksiyonlar meydana gelir. Sonuçta, kaiiser hücrelerinin yüzeyinde spesifik olarak eksprese olan kanser anti jenleri belirlenip bu antijenleri hedef alan antikorlar ilaç olarak kullanilacaksa, bu antikor bazli ilaçlarin daha az sayida adversreaksiyonla tedavi saglamalari arzu edilir.Sitoplazmik ve proliferasyon-baglantili protein 1 (CAPRIN-l), dinlenme fazindaki nonnal hücreler aktive olduklarinda ya da hücre bölünmesine ugradiklarinda eksprese olan ve hücrelerde RNA'lar ile birlikte Sitoplazmik stres granüllerini olusturup mRNA'larin aktarimi ve translasyonunun regülasyonunda rol oynayan bir intraselüler protein olarak bilinmektedir. Bu proteinin kanser hücrelerinin yüzeyinde Spesifik olarak ekSprese oldugu teSpit edilmistir ve bu sebeple kanser tedavisine yönelik antikor ilaçlarinin bir hedefi olarakçalisilinaktadir (Patent Literatürü 2 ve 3).Sitasyon ListesiPatent LiteratürüPatent Literatürü 1: ABD Patent No. 5698396Patent Literatürü 2: WO2010/016526 Patent Literatürü 3: W02010/016525Patent-Disi LiteratürPatent-Disi Literatür l: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 551-519 (Japanese Journal of Cancer and Cheinotherapy Publishers Inc., Japan)Patent-Disi Literatür 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643- 1647 (1991)Patent-Disi Literatür 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810- 1 1813 (1995)Patent-Disi Literatür 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997) Patent-Disi Literatür 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998) Patent-Disi Literatür 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998) Patent-Disi Literatür 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999) Patent-Disi Literatür 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996) Patent-Disi Literatür 9: Hum. Mol. Genet. 6: 33-39, 1997Bulusun OzetiTeknik ProblemBu bulusun bir hedefi, spesifik olarak kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese olan CAPRIN-l'i hedef alan ve geleneksel antikorlardan daha iyi bir anti-tümör aktivitesine sahip olan bir antikorüretmek ve bu antikorun kanser hastaliklarina yönelik bir terap'otikve/Veya 'Önleyici ajan olarak kullanimini saglamaktir.Probleme ÇözümBu bulus, asagida belirtilen özelliklere sahiptir:Bu bulus, antikorun veya onun fragmaninin SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen tamamlayicilik belirleine bölgelerini kapsayan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile gösterilen tamamlayicilik belirleine bölgelerini kapsayan bir hafif zincir degisken bölgesi içerdigi bir CAPRlN-l proteinine karsi immünolojik reaktiviteye sahip bir antikor veya antikor fragmani ve bu antikoru veya antikor fragmanini etkin bilesen olarak içeren ve kanserin tedavisi ve/veya önlenmesi amacina yönelik olan birfarmasötik bilesim sunar.Bu bulusun bir yapisinda, kanser hastaligi meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kolorektal kanser, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma,fibrosarkom, mastositom veya melanomdur.

Bu bulusun bir alternatif yapisinda, antikor bir insan antikoru, bir hümanize antikor, bir kimerik antikor, bir tek Zincirli antikor veya birmultispesifik antikordur (örnegin bir bispesifik antikor).Bulusun Avantajli EtkileriBu bulusa uygun CAPRIN-l antikoru kanser hücrelerine hasar verir.

Dolayisiyla, söz konusu CAPRIN-l antikoru kanserin tedavisi ve/veya'Önlenmesi amaciyla kullanilabilir.Bulusun Yapilarinin TarifiBu bulusa uygun CAPRIN-l antikoru bir monoklonal antikor ya da bir poliklonal antikor olabilir ve tercihen bir monoklonal antikordur. Bu bulusa uygun CAPRIN-l antikoru, antitümör aktivitesi gösterebilen herhangi bir tipte antikor olabilir ve buna örnek olarak rekoinbinan antikorlar, Örnegin sentetik antikorlar, multispesifik antikorlar (örnegin, bispesifik antikorlar), hümanize antikorlar, kimerik antikorlar ve tek Zincirli tek Zincirli antikorlar (scFv), insan antikorlari ve onlarin antikor fragmanlari, `Örnegin Fab, F(ab')2 ve Fv gösterilebilir. Bu antikorlar ve onlarin fragmanlari, sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerin genel olarak bildikleri yöntemlerle hazirlanabilir. Bir insan denek söz konusu oldugunda, rejeksiyonu önlemek veya baskilamak için bir insan antikoru ya da bir hümanizeantikor istenir.Bu baglamda, "CAPRlN-l proteinine spesifik baglanma" tabiri, antikorun baska proteinlere hemen hemen hiç baglanmaksizin spesifikolarak CAPRIN-l proteinine baglanmasi anlamina gelir.Bu bulusa konu olan CAPRIN-l polipeptidine karsi antikor, daha sonradan açiklanacagi üzere, in vivo ortamda kanser bulunan bir hayvanda tümör büyümesinin inhibisyonu incelenerek ya da antikorunex vivo ortamda polipeptidi eksprese eden tümör hücrelerine karsi birimmünosit- veya kompleman-aracili sitotoksik aktivite sergileyip sergileinedigi incelenerek anti-tümör aktivitesi bakiinindan mercekaltina alinabilir.Bu bulusa uygun terapötik ve/veya önleyici kaiiser tedavisinin uygulandigi denek bir memelidir, örnegin bir insan, bir pet hayvani,bir besi hayvani veya bir spor hayvanidir ve tercihen bir insandir.Bulus asagida daha ayrintili bir sekilde anlatilinakta veaçiklanmaktadir.Bu bulusa uygun CAPRIN-l 'e karsi antikoru elde etmek maksadiyla sensitizasyon antijenleri olarak kullanilan proteinler veya onlarin fragmanlari, aralarinda insanlar, köpekler, sigirlar, atlar, fareler, siçanlar ve tavuklarin bulundugu hayvan türlerinin herhangi birinden elde edilebilirler. Ancak bu proteinler veya onlarin fragmanlari, tercihen hücre füzyonunda kullanilacak ana hücrelerle geçimliliklerine bakilarak seçilirler. Genelde memelilerden elde edilen proteinler tercih edilir. Özellikle de insan menseli proteinler tercih edilirler. Örnegin CAPRIN-l insan CAPRIN-l'i ise, insan CAPRIN-l proteinleri, onlarin kismi peptidleri ya da insan CAPRIN-l'ini eksprese edenhücreler kullanilabilir.Insan CAPRIN-l'inin ve onun homologlarinin nükleotid sekanslari veamino asit sekanslarina örnegin GenBank (NCBI, ABD) üzerinden veBLAST veya FAST algoritmasi kullanilarak erisilebilir (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993 ve Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).Bu bulusta, insan CAPRIN-l 'inin nükleotid sekansi (SEKANS KOD NO.: 1 veya 3) ya da amino asit sekansina (SEKANS KOD NO.: 2 veya 4) iliskin olarak, hedef CAPRIN-l, referans sekansin ORFisinin ya da inatür kisminin iiükleotid sekansi veya amino asit sekansiyla %70 ile %100 arasi, tercihen %80 ile %100 arasi, daha çok tercihen %90 ile %100 arasi, daha da çok tercihen %95 ile %100 arasi bir oranda, 'Örnegin %97 ile %100 arasi, %98 ile %100 arasi, %99 ile %100 arasi veya %99,5 ile %100 arasi bir oranda sekans özdesligi sergileyen sekaiislardaii olusan nükleik asitler ya da proteinlerdir. Bu baglainda, "yüzde cinsinden sekans özdesligi" tabiri, iki sekans arasinda maksimum düzeyde benzerlik (veya özdeslik) saglanabilecek sekilde bosluk sokularak veya sokulmadan hizalama yapildiginda kaydedilen, t0plam amino asit (veya nükleotid bazi) adedine göre özdes amino asit (veya nükleotid bazi) adedinin yüzdesine (%) atifyapar.Her bir CAPRlN-l proteininin fragmani olarak, bir antikorun algilayip taniyabilecegi en küçük birimi teskil eden bir epitopun (veya bir antijenik determinant) bulundugu ve uzunlugu epitopun amino asit uzunlugu ile en fazla proteinin tam boy uzunlugu arasi bir düzeyde olan protein kisimlari kullanilabilir. Epitop, ineinelilerde ve tercihen insanlarda anti jenisite veya immünojenisiteye sahip olan bir polipeptid fragmanina karsilik gelir. En küçük biriini, yaklasik 7 ilâ 12 adetamino asitten, örnegin 8 ilâ l 1 adet amino asitten olusur.Yukarida bahsi geçen insan CAPRIN-l proteinlerini ve onlarin kismi peptidlerini ihtiva eden polipeptid fragmanlari, kimyasal sentez yöntemleriyle, örnegin Finoc (florenilmetiloksikarbonil) ve tBoc (t- bütiloksikarbonil) yöntemleriyle (Seikagaku `Iikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd.

(Japan), 1981) sentezlenebilirler. Bu polipeptidler ayrica ticari piyasada mevcut bulunan çesitli peptid sentezleyiciler kullanilarak geleneksel yöntemler çerçevesinde de sentezlenebilirler. Alternatif olarak, sektörde bilinen genetik mühendislik yaklasimlarina (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A coinpendiuin of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; ve benzeri) basvurularak bu polipeptidleri kodlayan polinükleotidler hazirlanabilir ve hazirlanan polinükleotidler ekspresyon vektörlerine yerlestirilip bu vektörler daha sonra konakçi hücrelere sokularak polipeptidlerin konakçi hücrelerde üremeleri saglanabilir. Ilgili insan CAPRIN-l proteinleri veya onlarin polipeptid fragmanlari bu yolla daelde edilebilirler.Polipeptidleri kodlayan polinükleotidler, ticari piyasada mevcut bulunan nükleik asit sentezleyiciler kullanilarak geleneksel yöntemlerle veya sektörde bilinen genetik mühendislikyaklasimlariyla kolayca hazirlanabilirler. Örnegin, insan CAPRlN-l10geninin nükleotid sekansini içeren bir DNA, bir sablon olarak bir insan kromozoinal DNA veya cDNA kütüphanesi ve SEKANS KOD NO.: 1”de gösterilen nükleotid sekansini amplifiye edebilecek sekilde tasarlanan bir primer çifti kullanilarak PCR yöntemiyle hazirlanabilir.

Bu PCR'de tatbik edilecek reaksiyon kosullari usulüne uygun sekilde tayin edilebilir. Reaksiyon kosullarina örnek olarak, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, termostabil DNA polimeraz (örnegin Taq polimeraz, Pfu poliineraz veya benzeri) ve Mg2+ içeren bir PCR tamponu kullanilarak 30 saniye boyunca 94°C sicakligin (denatürasyon), 30 saniye ilâ 1 dakika boyunca 55°C sicakligin (tavlama) ve 2 dakika boyunca 72°C sicakligin (elongasyon) uygulandigi reaksiyon basainaklari 30 defa tekrarlanip ardindan 7 dakika boyunca 72°C sicakligin uygulandigi bir reaksiyon gösterilebilir. PCR yaklasimi, reaksiyon kosullari ve benzeri konular hakkinda bilgi alinak için ömegin "Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons"(özellikle de Bölüin 15) eserine bakilabilir.Ayrica, CAPRIN-l geninin nükleotid sekanslari ve CAPRIN-l proteinlerinin ainino asit sekanslari hakkinda bilinenler temelinde uygun problar veya prinierler hazirlanabilir ve örnegiii istenen DNA'nin izole edilmesi ainaciyla bir insan cDNA kütüphanesinde yürütülen tarama çalismasinda kullanilabilirler. Bu gibi bir cDNA kütüphanesi tercihen CAPRIN-l proteinlerini eksprese eden hücreler, organlar veya dokulardan üretilir. Bu hücrelere veya dokulara verilebilecek örnekler arasinda, lösemi, meme kanseri, lenfoma, beyintümörü, akciger kanseri, pankreas kanseri ve kolorektal kanser gibi llkanserler veya tüinörlerden ya da testisten elde edilen hücreler ve dokular sayilabilir. Problarin veya primerlerin hazirlanmasi, bir cDNA kütüphanesinin yapimi, cDNA kütüphanesinin taranmasi ve ilgili genin klonlanmasiyla ilgili islemlerin nasil yürütülecegi sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca bilinir ve bu islemler Örnegin "Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989)" eseri ile Ausubel ve arkadaslarina ait eserde (yukarida atif yapilan eser) açiklanan yöntemlere göre gerçeklestirilebilirler. Bu sayede elde edilen DNA'lardan insan CAPRIN-l proteinlerini ve onlarin kismi peptidlerini kodlayan DNA'lar elde edilebilir.Ekspresyon vektörlerinin sokulduklari konakçi hücreler, yukarida bahsi geçen polipeptidleri eksprese etme kabiliyetine sahip olan herhangi bir hücre olabilirler. Prokaryotik hücre örnekleri arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin E. coli hücreleri bulunur.

Okaryotik hücre örnekleri arasinda ise, yine sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, memeli hücreleri, örnegin maymun böbrek hücreleri COSl ve Çin hamsteri yumurtalik hücreleri CHO; bir insan embriyonik böbrek hücre hatti olan HEK293; fare embriyonik deri hücre hatti NIH3T3; tomurcuklanan inaya hücreleri ve bölünerek çogalan maya hücreleri gibi maya hücreleri; ipekböcegi hücreleri veXenopus yumurta hücreleri sayilabilir.12Konakçi hücreler olarak prokaryotik hücrelerden istifade edilecekse, kullanilan ekspresyon vektöründe prokaryotik hücrelerde replikasyona izin veren bir orijin, bir promotor, bir ribozom baglanma yeri, bir çoklu klonlaina yeri, bir terminatör, bir ilaç direnç geni, bir oksotrofik tamamlayici gen ve benzeri unsurlar bulunabilir. E. coli ekspresyon vektörü örnekleri arasinda, pUC serisi, pBluescript II, pET ekspresyon sistemleri ve pGEX ekSpresyon sistemi bulunur. Yukarida bahsi geçen polipeptidleri kodlayan DNA'lar bu gibi ekspresyon vektörlerinin içerisine sokulabilir; bu vektörler kullanilarak prokaryotik konakçi hücreler transforme edilirler; elde edilen transformantlar kültürlenirler ve böylelikle, DNA'larm kodladiklari polipeptidlerin prokaryotik konakçi hücreler içerisinde eksprese olinalari saglanir. Bu bakimdan, polipeptidler, baska proteinlerle beraber füzyon proteinleri olarak daeksprese edilebilir.Konakçi hücreler olarak ökoryotik hücrelerden istifade edilecekse, ekspresyon vektörleri olarak, bir promotor, bir splicing bölgesi, bir poli(A) adisyon yeri ve benzeri unsurlar ihtiva eden ökaryotik hücreler içiii uygun ekspresyon vektörleri kullanilabilir. Bu gibi ekspresyon vektörlerine verilebilecek örnekler arasinda, pKAl, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 ve pYESZ vektörleri bulunur. Yukarida açiklanan prosedüre benzer sekilde, yukarida bahsi geçen polipeptidleri kodlayan DNA'lar bu gibi ekspresyon vektörlerine sokulurlar; bu vektörler kullanilarak ökaryotik konakçi hücreler transfomie edilirler; elde edilen transformantlar kültürlenirler ve böylelikle, DNA'larin kodladiklaripolipeptidlerin ökaryotik konakçi hücreler içerisinde eksprese olmalari13saglanir. Ekspresyon vektörü olarak plND/VS-His, pFLAG-CMV-Z, pEGFP-Nl veya pEGFP-Cl gibi bir vektör kullanilacaksa, polipeptidler, His tagi (örnegin (His)6-(His)10), FLAG tagi, myc tagi, HA tagi, GFP veya benzeri taglarla taglanmis çesitli füzyon proteinleriolarak eksprese edilebilirler.Elektroporasyon, kalsiyum fosfat yöntemi, lipozom yöntemi, DEAE dekstran yöntemi, mikroenjeksiyon, viral enfeksiyon, lipofeksiyon ve hücre membranindan nüfus edebilen peptidlere baglama gibi sektörde iyi bilinen teknikler kullanilarak, ekspresyon vektörleri, konakçihücrelere sokulabilir.Sektörde bilinen ayirma tekniklerinin bir kombinasyonu kullanilarak, ilgili polipeptid, konakçi hücrelerden izole edilebilir ve saflastirilabilir. Bu tekniklere verilebilecek örnekler arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, bir denatüran (örnegin üre) veya bir yüzey aktif maddeyle isleme, ultrasonikasyon, enzimatik sindirim, tuzla çökeltme, çözücü fraksiyonasyonu ve presipitasyonu, diyaliz, santritüjleme, ultrafiltrasyon, je] filtrasyonu, SDS-PAGE, izoelektrik odaklama elektroforezi, iyon degistirme kromatografisi, hidrofobik kroinatografi, afinite kromatografisi ve ters faz kromatografisisayilabilir.

Yukarida anlatildigi gibi hazirlanan antijenler, asagida tarif edilecegi üzere bu bulusa uygun antikoru hazirlamak için sensitizasyonanti jenleri olarak kullanilabilirler.< Antikorun yapisi >14Antikorlar (immünoglobulin), genelde, her biri en az iki adet agir zincir ile en az iki adet hafif zincir ihtiva eden heteromultimerik glikoproteinleri teskil ederler. lgM disindaki immünoglobulinler, her biri iki özdes hafif (L) zincir ve iki özdes agir (H) zincirden olusan yaklasik 150 kDa agirligindaki heterotetramerik glikoproteinlerdir.

Normalde hafif zincirlerin her biri bir tekli kovalent dis'ülfur bagi araciligiyla bir agir zincire baglanir, fakat farkli immünoglobulin izotiplerinde agir zincirler arasindaki disülfur bagi adedi farkli olabilir. Hafif zincir veya agir zincirlerin her birinde bir zincir-içi disülfûr bagi da bulunur. Her agir zincirin uçlarindan birinde bir degisken domain (VH bölgesi) bulunur ve bu bölgeyi birkaç adet sabit bölge takip eder. Her hafif zincirin bir ucunda bir degisken domain (VL bölgesi) bulunur ve diger uçta bir tekli sabit bölge yer alir. Hafif zincirin sabit bölgesi birinci agir zincir sabit bölgesiyle hizalanir ve hafif zincir degisken domaini agir zincirin degisken domainiyle hizalanir. Antikor degisken domainlerinde yer alan ve tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR'ler) olarak adlandirilan belirli bölgeler spesifik degiskenlik sergilerler ve antikora baglanma spesifisitesi kazandirirlar. Degisken bölgelerdeki nispeten korunan kisimlara çerçeve bölgeleri (FR'ler) denir. Tam boy agir ve hafif zincir degisken doinainlerinin her birinde, `uç CDR ile birbirlerine bagli halde dört adet FR bulunur. Bu üç CDR'ye, agir zincirin N-terminal ucundan itibaren sirasiyla CDRHl, CDRH2 ve CDRH3 denir. Hafif zincirde bulunan CDR'lere de benzer sekilde CDRLl, CDRL2 ve CDRL3 denir. CDRH3, antikorun antijene karsi sahip oldugu baglanma spesifisitesi açisindan en fazla önein arz eden bölgedir. Ote yaridan,her bir zincirde bulunan CDR°ler aralarindaki FR bölgelerinin15etkisiyle birbirlerine yakin konumlarda birlikte dururlar ve diger zincirde yer alan CDR”lerle birlikte antikorda bir antijen-baglanma yerinin olusmasina katkida bulunurlar. Sabit bölgeler antikor-antijen baglaniminda direkt bir etki göstermezler, fakat antikor-bagimli selüler sitotoksisite (ADCC), bir Fcy reseptörüne baglanina araciligiyla gerçeklesen fagositoz, bir iieonatal Fc reseptörünün (FcRn) aracililik ettigi yari-ömür/klirens hizi ve kompleman kaskadindaki bir Clq bileseninin aracilik ettigi kompleman-bagimlisitotoksisite (CDC) gibi çesitli efektör fonksiyonlar gösterirler.< Antikorun hazirlanmasi >Bu bulusa uygun anti-CAPRIN-l antikoru, bir tam boy CAPRIN-l proteinine ya da onun bir fragmanina karsi immünolojik reaktiviteyesahip olan bir antikora anlamina gelir.Bu baglamda, "immünolojik reaktivite" terimi, antikorun in vivo ortamda CAPRIN-l anti jenine (bir tam boy CAPRIN-l proteini veya onun bir kismi polipeptidi) baglanma kabiliyetine atif yapar. Bulusa konu olan antikor CAPRIN-l'e bu sekilde baglanmasi sayesiiide tümör hücrelerine hasar verme (örnegin öldürme, baskilaina veya geriletme) fonksiyonunu ortaya koymaya baslayabilir. Bulusa konu olan antikor, CAPRIN-l proteinine baglanmasi sayesinde, meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kolorektal kanser, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanseri, uterin serviks kanseri, yumurtalik kaiiseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma,fibrosarkom, mastositom veya melanom gibi tümörlere hasar verebilir.16Tercihen, bu bulusa konu olan antikorlar, monoklonal antikorlar olduklari sürece, bunlar konusunda herhangi bir 'Özel kisitlama yoktur ve bunlara 'Örnek olarak sentetik antikorlar, multispesifik aiitikorlar, insan antikorlari, hümanize antikorlar, kimerik antikorlar, tek zincirli antikorlar ve antikor fragmanlari (örnegin Fab, F(ab')2 ve F V) bulunur.

Ayrica, antikor herhangi bir immünoglobulin molekülü sinifina, 'Örnegin lgG, IgE, IgM, IgA, lgD veya lgY'ye ya da herhangi bir alt- sinifa, örnegin IgGl, IgG2, lgG3, IgG4, IgAl veya IgA2'ye mensupolabilir.Öte yandan, antikor asetilasyon, formilasyon, amidasyon, fosforilasyon, PEGilasyon veya benzeri bir yolla ya da glikozilasyoiiyoluyla modifiye edilebilir.Çesitli nionoklonal antikorlar hazirlama tekniklerine dair `Örneklerasagida gösterilmektedir.Örnegin, CAPRlN-l eksprese eden meme kanseri hücre hatlari SK- BR-3, immünizasyon için her bir fareye uygulanir. Bu farenin dalagi çikartilir. Dalak hücreleri ayrildiktan sonra bu, hücreler fare miyelom hücreleriyle füzyonlanirlar. Elde edilen füzyon hücreleri (hibridomlar) arasindan, kanser hücrelerinin büyüyüp çogalmalarini iiihibe edici bir etkiye sahip olan antikorlari üreten klonlar seçilir. Kanser hücrelerinin büyüyüp çogalmalarini iiihibe edici bir etkiye sahip monoklonal antikorlar üreten hibridoinlar izole edilir ve kültürlenir. Bu bulusa konu olan antikor, bir genel afiiiite saflastirma yöntemiyle kültürsüpernatanindan sailastirma yapilniasi yoluyla hazirlanabilir.17Monoklonal antikor üreten hibridomlar, örnegin asagida tarif edildigi gibi hazirlanabilirler. Oncelikle, hayvanlar sektörde biliiien bir yönteme göre sensitizasyoii aiitijenleriyle immünize edilirler. Bu immünizasyon yöntemi bünyesinde sensitizasyon antijenleri memelilere genelde intraperitoneal veya subkutan yolla enjekte edilirler. Daha soinut bir dille ifade etmek gerekirse, sensitizasyon anti jenleri PBS (fosfat tamponlu saliii), fizyolojik salin veya benzeri bir inadde içinde uygun bir miktarda seyreltilir ve ardindan, istenirse, bir geleneksel adjuvanin, örnegin bir tamamlanmis Freund adjuvaninin uygun bir miktariyla karistirilirlar. Emülsifikasyondan sonra, her bir meineliye her 4 ilâ 21 günde bir birkaç defa uygulama yapilir. Alternatif olarak, sentiziasyon anti jenleriyle immünizasyoniçin uygun bir tasiyici kullanilabilir.Bu yolla immünize edilen memeliiiin seruinuiida istenen antikorun seviyesinde bir artis söz konusu oldugu teyit edildikteii sonra, meineliden immünositleri t0planir ve bunlar hücre füzyonuna tâbi tutulurlar. Bilhassa tercih edilen immünositlerin örnekleri arasindadalak hücreleri vardir.Iminünositlerle füzyonlanacak diger ana hücre partnerleri olarak memeli iniyelom hücreleri kullanilir. Miyelom hücreleri olarak tercihen sektörde biliiien çesitli farkli hücre hatlari, örnegin P3Ul (P3- X63Ag8Ul), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Iminunol. (1979) 123, 1548- 1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology aiid Iinmunology (1978) 81, 1-7), NS-l (Kohler. G. and Milstein, C. Eur.

J. Immuiiol. (1976) 6, 511-519), MPC-ll (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8,405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276,18269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) , 1-21), 8194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) ve R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) kullanilir.Immünositler ile miyelom hücreleri arasindaki hücre füzyonu, temel olarak sektörde bilinen bir yönteme göre, örnegin Kohler ve Milstein'in tarif ettikleri yönteme (Kohler, G. and Milstein, C.

Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) göre gerçeklestirilebilir.Daha somut bir dille ifade etmek gerekirse, hücre füzyonu, örnegin bir geleneksel besin vasati içerisinde bir hücre füzyonu promotoru esliginde gerçeklestirilir. Füzyon proinotoru olarak ömegin polietilen glikol (PEG) ya da Japon hemaglütinasyon Virüsü (HVJ) kullanilir.

Istenirse, füzyonun verimini arttirmak amaciyla dimetil sülfoksit gibibir yardimci madde de katilabilir.Immünositler ile iniyelom hücreleri arasindaki oran keyfi olarak belirlenebilir. Örnegin, immünositlerin miktari tercihen miyelom hücrelerinin miktarinin 1 ilâ 10 kati olarak ayarlanir. Hücre füzyonu için kullanilabilecek vasat örnekleri arasinda, miyelom hücre hatlarinin büyüyüp çogaltilmalari için uygun RPM11640 ve MEM vasatlari ve bu tip hücreleri kültürlemek için kullanima uygun geleneksel vasatlar bulunur. Bu vasatlarla birlikte ayrica fetal buzagiserumu (FCS) gibi bir serum destekleyicisi de kullanilabilir.Hücre füzyonunda, immünositler ve miyelom hücreleri önceden belirlenmis miktarda vasat içerisinde iyice karistirilirlar. Geneldekarisima %30 ile %60 (a/h) arasi bir konsantrasyonda önceden19yaklasik 37°C sicakliga dek isitilmis olan bir PEG çözeltisi (ortalaina moleküler agirligi: örnegin yaklasik 1000 ilâ 6000) ilave edilir ve onunla karistirilarak ilgili hibridomlarin olusmasi saglanir.

Müteakiben uygun bir vasatin eklendigi ve süpernatanin santrifüj yoluyla uzaklastirildigi birbirini takip eden prosedürler tercihen tekrarlanarak, hücre füzyonu ajanlari ya da hibridomlarin çogaltilmasibakimindan mevcut olmasi istenmeyen benzeri maddeler çikartilir.Bu sekilde elde edilen hibridomlar, bir geleneksel seleksiyon vasati, örnegin bir HAT vasati (hipoksantin, aininopterin ve timidin içeren vasat) içerisinde kültürlenerek seleksiyona tâbi tutulur. HAT vasatinda gerçeklestirilen kültürleme islemi, ilgili hibridomlarin disinda kalan hücrelerin (füzyonlanmamis hücreler) ölmesini saglayacak yeterli bir süre boyunca (genelde birkaç güii ilâ birkaç hafta) sürdürülür.

Akabinde, ilgili antikoru üreten hibridomlar taranirlar ve bir geleneksel sinirlandirici seyreltme yöntemiyle tekli klonlar halindeklonlanirlar.Hibridomlarin insan harici hayvanlarda anti jenlerle immünizasyon yapilarak elde edildigi bahsi geçen yaklasimin yani sira, insan lenfositlerinin, örnegin EB virüsüyle enfekte edilmis insan lenfositlerinin proteinlerle, proteinleri eksprese eden hücrelerle veya onlarin lizatlariyla in vitro ortamda sensitize edilmeleri ve sensitize edilen lenfositlerin kalici olarak bölünme kabiliyetine sahip olan insan menseli miyelom hücreleriyle, örnegin U266 (Erisim No. TIB 196) ile füzyonlanmalari yoluyla, istenen aktiviteye (örnegin hücre çogalmasini inhibe edici aktivite) sahip olan insan antikorlarini üretenhibridomlar da elde edilebilir.20Bu yolla hazirlanan monoklonal antikor üreten hibridomlar, bir geleneksel vasatta alt-kültürlenebilirler ve ayrica sivi nitrojeniçerisinde uzun bir süre boyunca saklanabilirler.Somutlastirmak gerekirse, istenen anti jenler ya da istenen antijenleri eksprese eden hücreler bir geleneksel immünizasyon yöntemi çerçevesinde immünizasyonda sensitizasyon anti jenleri olarak kullanilirlar. Elde edilen iinrnünositler, bir geleneksel hücre füzyonu yönteini çerçevesinde sektörde bilinen ana hücrelerle füzyonlanirlar.

Monoklonal antikor üreten hücreler (hibridomlar) arasinda bir geleneksel tarama yöntemiyle tarama yapilarak ilgili monoklonalantikorlari üreten hibridomlar hazirlanabilir.Bu baglamda insan antikoru üreten fareler olarak örnegin KM fareler (Kirin Pharma Co., Ltd/Medarex) ya da Xeno fareler (Amgen Inc.) kullanilabilir (örnegin bkz: W002/43478 ve W002/092812 sayili uluslararasi yayinlar). CAPRIN-l proteinleriyle veya onlarin fragmanlariyla imniünize edilen bu gibi farelerin kanindan tam insan poliklonal antikorlari elde edilebilir. Alternatif olarak, bu sekilde immünize edilen farelerden dalak hücreleri izole edilip bu hücreler niiyeloni hücreleriyle füzyonlanabilirler. Bu yolla insan monoklonalantikorlari elde edilebilir.Anti jenler, hayvaii hücrelerinin kullanildigi bir yönteme göre (2007- 530068 A (2007) sayili JP Patent Yayini (Kohy0)) ya da bakulovirüsün kullanildigi bir yönteme göre (WO98/46777 sayiliUluslararasi Yayin) hazirlanabilirler. Düsük bir immünojenisiteye21sahip olan anti jenler, immünizasyon için albümiii gibi immünojenik niakromoleküllere baglanabilirler. Antijenler, immünizasyon içinuygun ad juvanlarla birlikte uygulanabilirler.Alternatif olarak, bulusa konu olan antikor, asagida belirtilen islemlerin yürütüldügü bir genetik mühendislik teknigi kullanilarak üretilen bir rekombiiian antikor olarak da elde edilebilir: antikor genlerinin hibridomlardan klonlanmalari; antikor genlerinin uygun vektörlere yerlestirilmeleri ve vektörlerin konakçilara sokulmalari (örnegin bkz: Carl, AK. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Birlesik Kralikta MACMILLAN PUBLISHERS LTD, tarafindan 1990 yilinda yayinlaiimistir). Daha somut bir dille ifade etmek gerekirse, ters transkriptaz uygulanarak hibridonilarin mRNA'larindan antikor degisken bölge (V bölge) cDNA'lari sentezlenir. Ilgili antikor V bölgelerini kodlayan DNA'lar elde edildikten soiira bu DNA'lar istenen antikor sabit bölgelerini (C bölgeleri) kodlayan DNA'larla ligate edilirler. Elde edilen ligasyon ürünleri ekspresyon vektörlerine yerlestirilirler. Alternatif olarak, antikor V bölgesini kodlayan DNA'lar antikor C bölgesi DNA'larini içeren ekspresyon vektörlerine yerlestirilebilirler. Bu DNA'lar, ekspresyon vektörlerine, ekspresyon kontrol bölgelerinin, örnegin bir arttirici ve bir promotoruii kontrolü altinda eksprese olmalarini saglamak üzere yerlestirilirler. Akabinde konakçi hücreler bu ekspresyon vektörleriyle transforme edilip hedefantikorlari eksprese etmeye birakilabilirler.Bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikoru bir moiioklonal antikordur.Monoklonal antikorlar arasinda insan monoklonal antikorlari, insan22harici hayvan inonoklonal antikorlari (ömegin fare monoklonal antikorlari, siçan monoklonal antikorlari, tavsan monoklonal antikorlari ve tavuk monoklonal antikorlari), kimerik monoklonal antikorlar ve benzerleri sayilabilir. Monoklonal antikor, CAPRIN-l proteinleriyle veya onlarin fragmanlariyla iinmünize edilmis olan insan harici hayvanlardan (örnegin fareler veya insan antikoru üreten fareler, tavuklar ve tavsanlar) alinan dalak hücreleri miyelom hücrelerine füzyonlanarak elde edilen hibridomlarin kültürlenmeleri yoluyla hazirlanabilir. Kiinerik antikor, farkli hayvanlardan elde edilen sekanslarin bir kombinasyonundan hazirlanan bir antikordur ve örnegin, fare antikoru agir ve hafif zincir degisken bölgeleri ile insan antikoru agir ve hafif zincir sabit bölgelerinden olusan bir antikoru teskil edebilir. Kimerik antikor, örnegin asagida belirtilen islemlerin yürütüldügü sektörde bilinen bir yöntem tatbik edilerek hazirlanabilir: antikor V bölgelerini kodlayan DNA'larin insan antikoru C bölgelerini kodlayan DNA'larla ligate edilmeleri; elde edilen ligasyon ürünlerinin ekSpresyon vektörlerine yerlestirilmeleri ve bu vektörler konakçilarasokularak antikorlarin üretilmeleri.Bir anti-tümör etkisine sahip insan-fare kimerik monoklonal antikorlari asagida Örnekler bölümünde tarif edilen bir yöntemle hazirlanir. Monoklonal antikorlar, örnegin, SEKANS KOD NO.: 8”de gösterilen amino asit sekansina sahip bir agir zincir degisken (VH) bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 12°de gösterilen bir ainino asit sekansina sahip bir hafif zincir degisken (VL) bölgesi içerirler.

Monoklonal antikorlarda, VH bölgesi, SEKANS KOD NO.: 5 amino asit sekansiyla gösterilen CDRl, SEKANS KOD NO.: 6 ainino asit sekansiyla gösterilen CDRZ ve SEKANS KOD NO.: 7 amino asit23sekansiyla gösterilen CDR3 içerebilir ve VL bölgesi, SEKANS KOD NO.: 9 amino asit sekansiyla gösterilen CDRl, SEKANS KOD NO.: amino asit sekansiyla gösterileii CDRZ ve SEKANS KOD NO.: 11amino asit sekansiyla gösterilen CDR3 içerebilir.Yeniden sekillendirilmis insan antikoru da denen hümanize antikor bir genetigi degistirilmis antikordur. Hümanize antikor, bir immünize hayvandan elde edilen antikor CDR'leri bir insan antikorunun tamamlayicilik belirleine bölgelerine greftlenerek olusturulur. Bu amaçla kullanilabilecek bir genel gen rekombinasyon yaklasimi dabilinmektedir.Somutlastirmak gerekirse, örnegin, terminal kisimlari üst üste binen bir dizi oligonükleotid ile PCR gerçeklestirilerek, fare ve tavuk antikorlari CDR'lerini insan antikoru çerçeve bölgelerine (FR'ler) baglayacak sekilde tasarlanan DNA sekanslari sentezlenir. Elde edilen DNA'lar, insan antikoru sabit bölgelerini kodlayan DNA'larla ligate edilirler. Ardindan elde elden ligasyon ürünleri ekspresyon vektörlerine yerlestirilirler ve bu vektörler de antikor üretimi için konakçilara sokularak ilgili antikor elde edilir (bkz: EP239400 sayili Avrupa patent basvurusu yayini ve WO 96/02576 sayili uluslararasi yayin). CDR'ler araciligiyla birbirlerine bagli bulunan insan antikoru FR'leri, tamamlayicilik belirleme bölgelerinin olumlu ve verimli bir antijen baglanma yeri olusturup olusturmadiklarina bakilarak seçilirler. Gerekirse, antikor degisken bölgelerinin çerçeve bölgelerinde yer alan ainino asitlerde, elde edilen yeiiiden sekillendirilmis insan antikorunun tainamlayicilik belirlemebölgelerinin uygun bir anti jen baglanma yeri olusturmasini saglayacak24ikaineler yapilabilir (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851- 856). Ayrica, bu çerçeve bölgeleri, çesitli insan antikorlarindan elde edilen çerçeve bölgeleriyle degistirilebilirler (bkz: WO 99/51743sayili Uluslararasi Yayin).CDR'ler araciligiyla birbirlerine baglanan insan antikoru çerçeve bölgeleri, tamamlayicilik belirleme bölgelerinin olumlu ve verimli bir anti jen baglanina yeri olusturup olusturmadiklari göz önünde tutularak seçilirler. Gerekirse, antikor degisken bölgelerinin çerçeve bölgelerinde yer alan amino asitlerde, elde edilen yeniden sekillendirilmis insan antikorunun tamainlayicilik belirleme bölgelerinin uygun bir antijen baglanma yeri olusturmalarini saglayacak ikameler yapilabilir (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).Bu yolla hazirlanan kiinerik antikor veya hümanize antikorun degisken bölgeleri (örnegin FR'ler) veya sabit bölgelerinde yer alanamino asitler örnegin baska amino asitlerle ikame edilebilirler.Amino asit ikainesi, örnegin lS'ten az sayida, 10'dan az sayida, 8 veya daha az sayida, 7 veya daha az sayida, 6 veya daha az sayida, 5 veya daha az sayida, 4 veya daha az sayida, 3 veya daha az sayida ya da 2 veya daha az sayida amino asidi, tercihen l ilâ 5 adet amino asidi ve daha çok tercihen 1 veya 2 adet amino asidi ilgilendiren bir ikamedir.

Ikame yapilmis olan bir antikor, ikame yapilmamis olan bir antikor ile fonksiyonel açidan esdeger nitelikte olmalidir. Ikamenin konservatif amino asit ikainesi olmasi, yani ikamenin yük, yan zincirler, polariteve aroinatisite gibi özellikleri bakimindan birbirlerine benzeyen amino25asitler arasinda yapilmasi arzu edilir. Amino asitler, tasidiklari benzer özellikler çerçevesinde örnegin asagida gösterildigi gibi siniflandirilabilirler: bazik amino asitler (arjinin, lizin ve histidin); asidik amino asitler (aspartik asit ve glutamik asit); yüksüz polar amino asitler (glisin, asparajin, glutamin, serin, treonin, sistein ve tirozin); polar olmayan amino asitler (lösin, izolösin, alanin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan ve metionin); dallanmis ainino asitler (lösin, valin ve izolösin) ve aromatik amino asitler (fenilalanin,tirozin, triptofan ve histidin).Modifiye antikorlara örnek olarak, polietilen glikol (PEG) gibi çesitli moleküllere bagli bulunaii antikorlar gösterilebilir. Bulusa konu olan modifiye antikorda, antikorun bagli olabilecegi madde için belirlenmis herhangi bir sinirlama yoktur. Bu gibi bir modifiye antikor elde etmek için, elde edilen antikor kimyasal olarak modifiye edilebilir. Bu amaçla kullanilabilecek olan bir yöntem sektörde halihazirda mevcutve bilinen bir yöntemdir.Burada geçen " fonksiyonel açidan esdeger" tabiri, atif yapilan antikorun bulusa konu olan antikor ile benzer bir biyolojik veya biyokimyasal aktiviteye sahip oldugu, daha somut ifade etmek gerekirse, atif yapilan antikorun örnegin insanlara uygulandiginda tümörlere hasar verebildigi ve esasen herhangi bir re jeksiyon sorununa yol açmadigi anlamina gelir. Burada bahsi geçen aktivite, örnegin hücre çogalmasini inhibe edici aktivite veya baglanma aktivitesiolabilir.26Belirli bir polipeptid ile fonksiyonel açidan esdeger olan bir polipeptid hazirlainaya yarayan ve söz konusu polipeptidde bir inutasyon yapilmasina dayanan bir yöntem, sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca iyi bilinmektedir. Örnegin, sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar bulusa konu olan antikora yer hedefli mutagenez (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) veya benzeri bir yolla usulüne uygun sekilde bir mutasyon yerlestirerek bulusa konu olan antikorafonksiyonel açidan esdeger olan bir antikor hazirlayabilirler.Yukarida açiklanan bir CAPRlN-l proteininin bir epitopunu taniyan bir antikor, sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca genel olarak bilinen bir yöntemle hazirlanabilir. Antikor, örnegin, kanser hücrelerinin büyüyüp çogalmalarini inhibe edici bir etkiye sahip olan anti-CAPRIN-l antikorunun tanidigi CAPRIN-l proteini epitopunun bir geleneksel yöntem (örnegin epitop haritalama) kullanilarak belirlenmesine ve epitoptaki amino asit sekansini barindiran bir polipeptid bir immünojen olarak kullanilarak bir antikorun hazirlanmasina dayanan bir yöntem kullanilarak ya da bir geleneksel yöntemle hazirlanan bir antikorun hedef aldigi bir epitopun belirlenmesine ve anti-CAPRIN-l antikoru ile ayni epitopu taniyabilen bir antikorun seçilmesine dayanan bir yöntem kullanilarak elde edilebilir. Burada geçen "epitop" terimi, memelilerde ve terciheninsanlarda anti jenisite veya immünojenisiteye sahip olan bir polipeptid27fragmanina atif yapar. En küçük biriiiii yaklasik 7 ilâ 12 adet aminoasitten ve tercihen 8 ilâ 11 adet amiiio asitten olusur.Bulusa konu olan antikor; CAPRIN-l'e karsi immünolojik reaktiviteye sahip olan bir antikor, CAPRIN-l'i spesifik olarak algilayip taniyabilen bir antikor ya da CAPRIN-l'e spesifik baglanabilen bir antikordur ve kanser hastaliklarinda sitotoksik aktivite veya tümör büyümesini inhibe edici etki sergiler. Söz konusu antikorun alici hayvaiilarda rejeksiyona yol açinayan ya da en fazla ufak bir rejeksiyona yol açan bir yapiya sahip olmasi tercih edilir. Bu gibi antikorlara verilebilecek örnekler arasinda, alici hayvanlarin insanlar olmasi kaydiyla insan antikorlari, hümanize antikorlar, kimerik aiitikorlar (örnegiii insan-fare kimerik antikorlari), tek zincirli antikorlar ve bispesifik antikorlar bulunur. Bu antikorlar, bir insan antikoruiidan elde edilen agir ve hafif zincir degisken bölgeleri ya da bir insan disi hayvan antikorundan elde edilen tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDRl, CDR2 ve CDR3) ile bir insan antikorundan elde edilen çerçeve bölgelerinden olusan agir ve hafif zincir degisken bölgeleri ihtiva ederler. Alternatif olarak, bu antikorlar, bir insan disi hayvan antikorundan elde edilen agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin ve bir insan antikorundan elde edilen agir ve hafif zincir sabit bölgelerinin yer aldiklari rekombiiian antikorlardir. Bulusa konu olan antikorun ilk iki antikor olmasi tercihedilir.Bu gibi rekombinaii antikorlar asagida tarif edildigi gibi hazirlanabilirler: antikor üreten hücrelerden, örnegin hibridomlardan,insan CAPRlN-l'ini hedef alan moiioklonal aiitikorlar (ömegiii insan,28fare, siçan, tavsan ve tavuk monoklonal antikorlari) kodlayan DNA'lar klonlanir ve bu DNA'lar sablon olarak kullanilarak, RT-PCR veya benzeri bir teknikle antikorlarin hafif ve agir zincir degisken bölgelerini kodlayan DNA'lar hazirlanir. Hafif ve agir zincir degisken bölgelerinin ilgili sekanslari ve her bölgedeki CDRl, CDR2 ve CDR3'ün ilgili sekanslari, Kabat AB numaralandirma sistemi (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)temelinde belirlenirler.Her bir degisken bölgeyi kodlayan bir DNA veya her bir CDR'yi kodlayan bir DNA, bir genetik mühendislik teknigi (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ya da bir DNA sentezleyici kullanilarak hazirlanir. Yukarida bahsi geçen insan monoklonal antikoru üreten hibridomlar, insan antikoru üreten hayvanlar (örnegin fareler) insan CAPRIN-l'i ile immünize edilip ardindan bu immünize edilmis hayvanlardan kesilip alinan dalak hücreleri miyelom hücreleri ile füzyonlanarak hazirlanabilirler. Ayrica, eger gerekirse bir genetik mühendislik teknigi ya da bir DNA sentezleyici kullanilarak, bir insan antikorundan elde edilen hafif veya agir zincir degisken ve sabitbölgelerini kodlayan DNA'lar da hazirlanir.Hümanize antikorlara istinaden, bir insan antikoru menseli hafif veya agir zincir degisken bölgelerini kodlayan DNA'lardaki CDR kodlama sekanslarinin bir insan harici hayvan (örnegin fare, siçan, tavsan veya tavuk) menseli antikorun mütekabil CDR kodlama sekanslari ileikame edilerek DNA'lar üretilip, bu DNA'larin sirasiyla insan antikoru29menseli hafif veya agir zincir sabit bölgelerini kodlayan DNA'lar ile ligate edilmesi yoluyla hümanize antikorlari kodlayan bir DNAhazirlanabilir.Kiinerik antikorlara istinaden, bir insan harici hayvan (örnegin fare, siçan, tavsan veya tavuk) menseli antikorun hafif veya agir zincir degisken bölgelerini kodlayan DNA'lar insan antikoru menseli hafif veya agir zincir sabit bölgelerini kodlayan DNA'lar ile ligate edilerekkiinerik antikoru kodlayan bir DNA hazirlanabilir.Tek zincirli antikor, agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin birbirlerine bir baglayici araciligiyla lineer olarak bagli olduklari bir antikor anlamina gelir. Tek Zincirli antikoru kodlayan bir DNA, agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir DNA, baglayiciyi kodlayan bir DNA ve hafif zincir degisken bölgesini kodlayan bir DNA birbirlerine ligate edilerek hazirlanabilir. Bu baglainda, agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin her ikisi de bir insan antikorundan ya da yalnizca CDR'lerin bir insan harici hayvan (örnegin fare, siçan, tavsan veya tavuk) menseli antikorun CDR'leri ile ikame edildigi bir insan antikorundan elde edilir. Baglayici, 12 ilâ 19 adet amino asitten olusur. Buna verilebilecek örnekler arasinda, 15 adet ainino asitten olusan (G4S)3 bulunur (GB. Kim et al., Protein Engineering Designand Selection 2007, 20 (9): 425-432).Bispesifik antikor (diabody), iki farkli epitopa spesifik baglanabilen bir antikor anlamina gelir. Bispesifik antikoru kodlayan bir DNA, örnegin, bir agir zincir degisken bölgesi A'yi kodlayan bir DNA, bir hafif zincir degisken bölgesi B'yi kodlayan bir DNA, bir agir zincir30degisken bölgesi B'yi kodlayan bir DNA ve bir hafif zincir degisken bölgesi A'yi kodlayan bir DNA'nin bu sirayla birbirlerine ligate edilmeleri ve hafif zincir degisken bölgesi B'yi kodlayan DNA ile agir zincir degisken bölgesi B'yi kodlayan DNA'nin yukarida belirtildigi gibi olan bir baglayiciyi kodlayan bir DNA araciligiyla ligate edilmeleri yoluyla hazirlanabilir. Bu baglamda, agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin hepsi bir insan antikorundan ya da yalnizca CDR'leriii bir insan harici hayvan (örnegin fare, siçan, tavsan veya tavuk) menseli antikorun CDR'leri ile ikame edilmis oldugu bir insanantikorundan elde edilir.Bu yolla hazirlanan rekombinaii DNA'lar bir veya daha fazla sayida uygun vektöre yerlestirilebilir ve bu vektörler daha sonra konakçi hücrelere (örnegin memeli hücreleri, maya hücreleri ve böcek hücreleri) sokulurlar ve DNA'lar (birlikte) eksprese olarak rekoinbinan antikorlari üretilirler (bkz: P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C.

Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).Yukarida tarif edilen yöntemlerin herhangi birisiyle hazirlanabilecek olan bulus konusu antikor örnekleri arasinda, daha sonradan sunulacakolan Orneklerde elde edilen asagidaki (a) antikoru bulunur:(a) SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen tamainlayicilik belirleme bölgelerini içeren bir agir zincir degisken bölgesininve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile gösterilen31tamamlayicilik belirleme bölgelerini içeren bir hafif zincir degisken bölgesinin bulundugu bir antikor (örnegin SEKANS KOD NO.: 8 ile gösterilen bir agir zincir degisken bölgesinin ve SEKANS KOD NO.: 12 ile gösterilen bir hafif zincir degiskenbölgesinin bulundugu bir antikor).Bu baglamda, SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen amino asit sekanslari, bir fare antikoru-kaynakli agir zincir degisken bölgesinin sirasiyla CDRl, CDR2 ve CDR3°üne tekabül eder. SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 1 1 ile gösterilen ainino asit sekanslari, bir fare antikoru- kaynakli hafif zincir degisken bölgesinin sirasiyla CDRl, CDR2 ve CDR3 ”üne tekabül eder.Bu bulusa konu olan hüinanize antikor, kiinerik antikor, tek zincirli antikor ve bispesifik antikor örnekleri arasinda asagida belirtilenantikorlar bulunur.(i) SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen amino asit sekanslarini ve insan antikoru-kaynakli çerçeve bölgelerinin amino asit sekanslarini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile gösterilen amino asit sekanslarini ve insan antikoru-kaynakli çerçeve bölgelerinin amino asit sekanslarini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi bulunan bir antikor.(ii) SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen amino asit sekanslarini ve insan antikoru-kaynakli çerçeve bölgelerinin amino asit sekanslarini içeren bir agir zincir degisken bölgesi,bir insan antikoru-kaynakli ainino asit sekansi içeren bir agir32zincir sabit bölgesi, SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile gösterilen ainino asit sekanslarini ve insan antikoru-kaynakli çerçeve bölgelerinin amino asit sekanslarini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi ve bir insan antikoru-kaynakli amino asit sekansi içeren bir hafif zincir sabit bölgesi bulunan bir antikor.(iii) SEKANS KOD NO.: 8 ile gösterilen amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölgesi, bir insan antikoru- kaynakli ainino asit sekansi içeren bir agir zincir sabit bölgesi, SEKANS KOD NO.: 12 ile gösterilen ainino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi ve bir insan antikoru- kaynakli amino asit sekansi içeren bir hafif zincir sabit bölgesibuluiian bir antikor.Insan antikoru agir ve hafif zincirlerinin sabit ve degisken bölgelerinin sekanslari, örnegin NCBI'da (ABD; GenBank, Unigene ve benzeri) bulunmaktadirlar. Ornegin asagida belirtilen sekanslar degerlendirilebilir: bir insan IgGl agir zincir sabit bölgesi olarak Erisim No. J00228; bir insan [gG2 agir zincir sabit bölgesi olarak Erisim No. J00230; bir insan IgG3 agir zincir sabit bölgesi olarak Erisim No. X03604; bir insan lgG4 agir zincir sabit bölgesi olarak Erisim No. K01316; bir insan hafif Zincir K sabit bölgesi olarak Erisim N0. V00557, X64l35 ve X64l33 ve bir insan hafif zincir ?t sabit bölgesi olarak Erisim No. X641 32 ve X641 34.Bu antikorlarin sitotoksik aktiviteye sahip olmalari ve buna bagliolarak bir anti-tümör etkisi ortaya koyabilmeleri tercih edilir.33Yukarida bahsi geçen antikorlardaki agir ve hafif zincir degisken bölgeleri ve CDR'lerine istinaden yukarida belirtilen sekanslar sadece örnek vermek amaciyla sunulmaktadir ve dolayisiyla bulusa konu olan antikorun bu sekanslar ile sinirli olmadigi açiktir. Yukarida özel olarak tanimlanmakta olan antikorlardan farkli anti-insan CAPRIN-l insan antikorlari veya insan menseli olmayan hayvan antikorlari (örnegin fare antikorlari) üretme kabiliyetine sahip olan hibridomlar hazirlanirlar ve bu hibridoinlarin ürettikleri monokloiial antikorlar geri kazanilir ve endikatörler olarak insan CAPRIN-l'ine karsi immünolojik baglanma aktivitelerine ve sitotoksik aktivitelerine bakilarak geri kazanilan antikorlariii ilgili antikorlar olup olmadiklari belirlenir. Böylelikle ilgili inonoklonal antikor üreten hibridomlar tanimlanir. Daha sonra yukarida açiklandigi gibi bu hibridomlardan ilgili antikorlarin agir ve hafif zincir degisken bölgelerini kodlayan DNA'lar hazirlanir ve bunlar sekanslanir. Bu DNA'lar, farkliantikorlar hazirlamak için kullanilir.Yukarida açiklanan antikor, CAPRIN-l'i spesifik olarak algilayip taniyabilecek spesifisiteye sahip oldugu sürece, özellikle bir çerçeve bölgesi sekansi ve/veya bir sabit bölge sekansinda bir veya birkaç adet amino asidi ilgilendiren bir ikame, silme veya eklemenin yapilmis oldugu (a) antikoru olabilir. Burada geçen "birkaç" kelimesi, tercihen2 ilâ 5, daha çok tercihen 2 veya 3'e karsilik gelir.Bulusa konu olan antikor, CAPRlN-l proteinine veya onun fragmanina yönelik olarak tercihen en az 107 M`l, en az 108 M", en az x 108M`1, en az 109 M1, en az 5 x 109 M1, en az 1010 Ml, en az 5 x1010 M4, en az 1011M`1, en az 5 X 1011 M", en az 1012 M4 veya en az341013 M'1 düzeyinde bir afinite sabiti Ka (kon/koff) degerine sahiptir.Bulusa konu olan antikor bir anti-tümör ajaniyla konjuge edilebilir.

Antikorun anti-tümör ajaniyla konjugasyonu, bir amino grubu, bir karboksil grubu, bir hidroksi grubu, bir tiol grubu veya benzeri bir gruba (örnegin bir süksinimidil grubu, bir formil grubu, bir 2- piridilditio grubu, bir maleimidil grubu, bir alkoksikarbonil grubu veya bir hidroksi grubu) karsi reaktif olan bir grubun bulundugu biraralayici araciligiyla gerçeklestirilebilir.Anti-tümör ajanlarina verilebilecek 'Örnekler arasinda, literatürden bilinen asagidaki anti-tümör ajanlari ve benzeri maddeler bulunur: paklitaksel, doksorubisin, daunorubisin, siklofosfamid, metotreksat, 5- florourasil, tiotepa, busülfan, iinprosülfan, piposülfan, benzodopa, karbokuon, meturedopa, uredopa, altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforainid, trimetilolomelamin, bullatasin, bullatakinon, kamptotesin, briyostatin, kallistatin, kriptofisin 1, kriptofisin 8, dolastatin, duokarmisin, eleuterobin, pankratistatin, sarkodiktiin, spongistatin, klorambusil, klornafazin, kolofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretamin oksit hidroklorür, melfalan, novembikin, fenesterin, prednimustin, trofosfaniid, urasil mustard, karinustin, klorozotosin, foteinustin, lomustin, nimustin, ranimustin, kalikamisin, dineinisin, klodronat, esperamisin, aklasinomisin, aktinomisin, autramisin, azaserin, bleomisin, kaktinomisin, karabisin, karminomisin, karzinofilin, kromomisin, daktinomisin, detorbisin, 6-dia20-5-okso-L-norlösin, adriainisin, epirubisin, ezorubisin, idarubisin, marselloinisin,mitomisin C, mikofenolik asit, nogalamisin, olivomisin, peplomisin,35potfiromisin, puromisin, kelamisin, rodorubisin, streptonigrin, streptozosin, tubersidin, ubenimeks, zinostatin, zorubisin, denopterin, pteropterin, trimetreksat, fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin, ansitabin, azasitidin, 6-aza`uridin, karmofur, sitarabin, dideoksiüridin, doksifluridin, enositabin, floksüridin, androjenler (örnegin kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan ve testolakton), aminoglutetimid, mitotan, trilostan, frolinik asit, aseglaton, aldofosfamid glikozit, aminolevulinik asit, enilurasil, amsakrin, bestrabusil, bisantren, edatraksat, defofamin, demekolsin, diazikuon, elfomitin, elliptinyum asetat, epotilon, etoglusid, lentinan, lonidamin, maytansin, ansamitosin, mitoguazon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubisin, losoksantron, podofillinik asit, 2-etilhidrazit, prokarbazin, razoksan, rizoksin, sizofillan, spirogermanyum, tenuazonik asit, triazikuon, roridin A, anguidin, üretan, vindesin, dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gasitozin, dosetaksel, klorambusil, gemsitabin, 6-ti0guanin, merkaptOpurin, sisplatin, oksaliplatin, karboplatin, Vinblastin, etopozit, ifosfamid, mitoksantron, Vinkristin, Vinorelbin, novantron, tenipozit, edatreksat, daunomisin, aminopterin, kseloda, ibandronat, irinotekan, topoizomeraz inhibitörleri, diflorometiloritin (DMFO), retinoik asit, kapesitabin ve bunlarin farmakolojik açidan kabul edilebilir tuzlari vetürevleri.Alternatif olarak, bulusa konu olan antikor bir anti-tümör ajaniyla kombinasyon halinde uygulanarak daha kuvvetli bir terapötik etki olusmasi saglanabilir. Bu yaklasim, CAPRIN-l eksprese eden birkanser hastaliginin bulundugu bir hastada cerrahi müdahaleden önce36veya sonra kullanilabilir. Bu yaklasim, tek basina bir anti-tümör ajani kullanilmasina dayanan geleneksel inetotla tedavi edilmis olan CAPRIN-l eksprese eden bir kanser hastaliginda bilhassa cerrahiden sonra uygulanarak kanserin nüksetmesine karsi daha kuvvetli birkoruma olusturulabilir veyahut sag kalim süresi uzatilabilir.Bulusa konu olan antikorla kombine halde uygulanabilecek anti-tümör ajani 'Örnekleri arasinda, literatürden bilinen asagidaki anti-tümör ajanlari ve benzeri maddeler bulunur: paklitaksel, doksorubisin, daunorubisin, siklofosfamid, metotreksat, 5-florourasil, tiotepa, busi'ilfan, improsülfan, piposülfan, benzodopa, karbokuon, meturedopa, uredopa, altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid, trimetilolomelamin, bullatasin, bullatakinon, kamptotesin, briyostatin, kallistatin, kriptofisin 1, kriptofisin 8, dolastatin, duokarmisin, eleuterobin, pankratistatin, sarkodiktiin, spongistatin, klorambusil, klornafazin, kolofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretainin, mekloretamin oksit hidroklorür, melfalan, novembikin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, urasil mustard, karmustin, klorozotosin, fotemustin, lomustin, niinustin, ranimustin, kalikamisin, dinemisin, klodronat, esperamisin, aklasinomisin, aktinomisin, autramisin, azaserin, bleomisin, kaktinomisin, karabisin, karminomisin, karzinofilin, kromomisin, daktinomisin, detorbisin, 6-diazo-5-okso-L-norlösin, adriamisin, epiiubisin, ezorubisin, idarubisin, marsellomisin, mitomisin C, mikofenolik asit, nogalamisin, olivomisin, peplomisin, potfiromisin, puromisin, kelamisin, rodorubisin, streptonigrin, streptozosin, tubersidin, ubenimeks, zinostatin, zorubisin, denopterin,pteropterin, trimetreksat, fludarabin, 6-merkapt0purin, tiamiprin,37tioguanin, ansitabin, azasitidin, 6-azaüridin, karmofur, sitarabin, dideoksi'ûridin, doksifluridin, enositabin, floksüridin, kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton, aminoglutetimid, initotan, trilostan, frolinik asit, aseglaton, aldofosfainid glikozit, aininolevulinik asit, enilurasil, amsakrin, bestrabusil, bisantren, edatraksat, defofamin, demekolsin, diazikuon, elfornitin, elliptinyum asetat, epotilon, etoglusid, lentinan, lonidamin, maytansin, ansamitosin, mitoguazon, initoksantron, mopidanniol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubisin, losoksantron, podofillinik asit, 2-etilhidrazit, prokarbazin, razoksan, rizoksin, sizofillan, spirogermanyum, tenuazonik asit, triazikuon, roridin A, anguidin, üretan, Vindesin, dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobronian, gasitozin, dosetaksel, klorambusil, genisitabin, 6- tioguanin, nierkaptopurin, sisplatin, oksaliplatin, karboplatin, Vinblastin, etopozit, ifosfamid, mitoksantron, Vinkristin, Vinorelbin, novantron, tenipozit, edatreksat, daunomisin, aminopterin, kseloda, ibandronat, irinotekan, t0p0izoineraz inhibitörleri, difloroinetiloritin (DMFO), retinoik asit, kapesitabin ve buiilarin farmakolojik açidan kabul edilebilir (sektörde bilinen) tuzlari ve (sektörde bilinen) türevleri. Bu anti-tümör ajanlari arasindan siklofosfamid, paklitaksel,dosetaksel veya Vinorelbinin kullanilmasi özellikle tercih edilir.Bulusa konu olan antikor, literatürden bilinen 21'At, 131I, 1251, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 175Lu veya 176Lu gibi bir radyoizotopa baglanabilir. Tümör tedavisi veya tanisinda etkili bir radyoizotopun kullanilmasi tercih edilir. Bu bulusa göre, anti-tümör ajanlariiiinkapsamina bu gibi bir radyoizotop da girer.38< Antit'i'imör etkisi >Bu bulusta kullanilmasi hedeflenen anti-CAPRIN-l antikorunun CAPRIN-l eksprese eden kanser hücreleri üzerindeki anti-tümör etkisinin asagida belirtilen mekanizma sayesinde açiga çiktigi düsünülmektedir: CAPRIN-l eksprese eden kanser hücrelerine karsi antikor-bagimli efekt'or hücre aracili sitotoksisite (ADCC) ve CAPRIN-l ekSprese eden hücrelere karsi kompleman-bagimli sitotoksisite (CDC). Ancak bu bulusun kapsaininin bahsi geçenmekanizma ile sinirlanmasi hedeflenmemektedir.Bahsi geçen mekanizmaya dayanan anti-tümör etkisinin kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese olan antikor baglanimli hedef molekül sayisiyla bagintili oldugu bilinmektedir (Niwa R., Clinical Cancer Research (2005) Mar 15; 11 (6): 2327-2336). Kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese olan hedef molekül sayisi, hücre yüzeyi üzerindeki molekül adedini ölçme yetkinligine sahip olan halihazirda mevcut bir esey kiti kullanilarak incelenebilir.

Somutlastirmak gerekirse, antikor baglanimli hedef molekül adedi, kanser hücrelerinin örnegin primer antikorlar olarak hedef molekülleri hedef alan antikorlar ile reaksiyona sokulmalari, ardindan onlarla birlikte primer antikorlari hedef alan floresan etiketli antikorlar ile reaksiyona sokulmalari ve ayrica baslangiçtan itibaren bilinen sayida molekülle kapli kalibrasyon egrisi boncuklarinin kullanilmalari, numunelerin ortalama floresans yogunlugunun ölçülmesi ve elde edilen kalibrasyon egrisi temelinde hedef molekül adediiiinbelirlenmesi yoluyla hesaplanabilir.39Dolayisiyla, bu bulus kapsaminda kullanilacak olan anti-CAPRlN-l antikoru, asagidaki Örnekler ile spesifik olarak gösterilecegi üzere, ex vivo ortamda CAPRIN-l eksprese eden kanser hücrelerine yönelik ADCC aktivitesi veya CDC aktivitesi belirlenerek ya da bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikoruiiun bir primer antikor olarak kullanilmasi sartiyla kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese olan CAPRIN-l molekülü adedi belirlenerek sahip oldugu aktivitebakimindan analiz edilebilir.Bulus kapsaminda kullanilacak olan anti-CAPRIN-l antikoru, kanser hücreleri üzerindeki CAPRIN-l proteinlerine baglanir ve sahip oldugu aktivite araciligiyla bir anti-tümör etkisi ortaya koyar. Dolayisiyla bu bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikorunun kanser hastaliklarinin tedavisinde veya önlenmesinde faydali oldugu düsünülinektedir.

Somut bir dille ifade etmek gerekirse, bu bulus, kanser hastaliklarinin tedavisine ve/veya önlenmesine yönelik olan ve etkin bilesen olarak anti-CAPRIN-l antikoru ihtiva eden bir farniasötik bilesim ortaya koymaktadir. Insan vücutlarina (antikor tedavisi olarak) uygulama amaciyla kullanilacak olan anti-CAPRIN-l antikorunun immünojenisitenin düsürülmesi adina bir iiisan antikoru ya da birhüinaiiize antikor olmasi tercih edilir.Kanser hücrelerinin yüzeyi üzerindeki bir CAPRIN-l proteinine karsi daha yüksek baglanma afinitesi sergileyen bir anti-CAPRIN-l antikoru daha kuvvetli bir anti-tümör aktivitesi ortaya koyar.

Dolayisiyla bu bulusa uygun antikorun CAPRIN-l proteinine yönelik yüksek baglanma afinitesine bagli olarak daha kuvvetli bir anti-tümöretkisine sahip olniasi beklenebilir ve bu antikor kanser hastaliklarinin40tedavisinde ve/veya önlenmesinde kullanma amacina yönelik farmasötik bilesim olarak kullanilabilir. Bu bulusa uygun antikorun, yukarida tarif edildigi gibi, tercihen en az 107 M`1, en az 108 M'l, en az ›< lOgM", en az 109 M", en az 5 ><109 M", en az 1010 M", en az 5 x 1010 M`l, en az 1011M`1, en az 5 X 1011 M'l, en az 1012 M'1 ya da en az 1013 M'1 düzeyinde bir birlesme sabiti (afinite sabiti) Ka (kon/kw)degeriyle yüksek baglanma afinitesine sahip olmasi tercih edilir.Kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde anti-CAPRIN-l antikorlarina baglanabilecek ne kadar fazla CAPRlN-l molekülü varsa, anti-tümör aktivitesi de 0 kadar kuvvetli olur. Arzu edilen, beklenen anti-tümör etkisinin üretilebilmesi adina, antikorlarin baglandiklari CAPRlN-l molekülleri sayisinin bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikoru kullanilarak ölçülebilecegi üzere kaiiser hücresi basina 104 veya daha fazla, tercihen 105 veya daha fazla olmasidir. Hücre yüzeyi üzerinde çok sayida CAPRIN-l molekülü barindiran tümör (kanser hücreleri), bulusa konu olan antikorun uygulanacagi kanser olarak bilhassa tercihedilir.< Antijen eksprese eden hücrelere baglanma >Antikorun CAPRIN-l'e baglanma kabiliyeti, asagidaki Orneklerde açiklandigi gibi örnegin ELISA, Western blot, immünofloresans ve akis sitometrisi analizi gibi bir baglanma eseyi tatbik edilerekbelirlenebilir.< Immünohistokimyasal boyama >41CAPRlN-l'i algilayip taniyan antikor, bir hastadan cerrahi inüdahale esnasinda alinan ya da CAPRIN-l eksprese eden bir hücre hatti inoküle edilen bir ksenogreft dokusu tasiyan hayvandan spontan olarak veya transfeksiyonu müteakiben elde edilen bir dokunun paraforinaldehit veya asetonda fiske edilip dondurulmus bir kesiti veya paraformaldehitte fiske edilip parafine gömülmüs bir kesitinin kullanildigi sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca iyi bilinen bir immünohistokimyasal yöntem uygulanarak CAPRIN-l'e yönelikreaktivitesi bakimindan test edilebilir.Immünohistokimyasal boyamada, CAPRIN-l'e karsi reaktif olan antikor çesitli yöntemlerle boyanabilir. Örnegin antikor bir hayir turpu peroksidaz-konjuge keçi anti-fare antikoru, keçi anti-tavsan antikoru veya keçi anti-tavuk antikoruyla reaksiyona sokularakgörüntülenebilir.< Kanseri tedavi etmeye ve/veya 'önlemeye yönelik farmasötikbilesim ve yollar >Bu bulusa konu olan kanser hastaliklariiia yönelik terapötik ve/Veya önleyici farinasötik bilesimin bir hedefi, bir CAPRlN-l geni ekspreseettigi sürece herhangi bir kanser (hücreler) olabilir.

Burada kullanildigi anlamiyla "tümör" ve "kanser" terimleri malign neoplazma atif yapmakta ve birbirleriyle esanlamli terimler gibikullanilmaktadirlar.Bu bulus kapsaminda hedef alinan kanser hastaligi bir CAPRlN-l42proteini kodlayan geni eksprese eden bir kanser hastaligidir ve tercihen meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kolorektal kanseri, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofaguskanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, mastositoin ya da melanomdur.Bu kanserlerin spesifik örnekleri arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, meme adenokarsinomu, kompleks tip meme adenokarsinomu, malign mikst meme bezi tümörü, intraduktal papiller adenokarsinom, akciger adenokarsinomu, skuainöz hücreli kanser, küçük hücreli kanser, büyük hücreli kanser, nöroepitelyal doku tümörü olan gliom, ventriküler ependimom, nöronal tümör, embriyonal nöroektodermal tümör, nörilemmom, nörofibrom, menenjiyom, kronik lenfositik lösemi, lenfoma, gastrointestinal lenfoma, sindirim sistemi lenfomasi, küçük hücreli ilâ orta boy hücreli lenfoma, çekuin kanseri, çikan kolon kanseri, inen kolon kanseri, transvers kolon kanseri, sigmoid kolon kanseri, rektum kanseri, epitelyal yumurtalik kanseri, germ hücreli tümör, stromal hücreli tümör, pankreatik duktal karsinom, invazif pankreatik duktal karsinom, pankreatik adenokarsinom, asinar hücreli karsinom, adenoskuainöz karsinom, dev hücreli tümör, intraduktal papiller- müsinöz neoplazm, müsinöz kistik neoplazm, pankreatoblastom, seröz kistadenokarsinom, kati papiller tümör, gastrinom, glukagonom, insülinom, multipl endokrin neoplazileri tip-l (Wermer sendromu), fonksiyonel olmayan adacik hücreli tümör, somatostatinom ve VIPomsayilabilir.Aliciyi teskil eden denek (hasta) tercihen bir memeli, örnegin bir43primat, pet hayvani, besi hayvani veya spor hayvani da dahil memelive özellikle tercihen bir insan, köpek veya kedidir.Bulusa konu olan antikor bir farmasötik bilesiin bünyesinde kullanilacaksa, bu farinasötik bilesim sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca bilinen bir yöntem kullanilarak formüle edilebilir. Omegin farmasötik bilesim, su veya baska herhangi bir farmasötik açidan kabul edilebilir sivinin bulundugu bir parental enjeksiyonluk aseptik çözelti veya süspansiyon formunda kullanilabilir. Farinasötik bilesim, örnegin, farmakolojik açidan kabul edilebilir tasiyicilar veya vasatlar, somutlastirmak gerekirse duruma göre hangisi uygunsa sterilize su, fizyolojik salin, bitkisel yag, bir emülsifiye edici, bir süspanse edici ajan, bir yüzey aktif madde, bir stabilizatör, bir aroma maddesi, bir yardimci madde, bir vehikül, bir koruyucu, bir baglayici veya benzeri bir maddeyle kombinasyon halinde, sektör genelinde kabul gören farmasötik uygulama için gerekli bir birim dozaj formunda antikorla karistirilarak formüle edilebilir. Bu gibi bir preparatta kullanilacak olan etkin bilesen miktari, belirtilen aralikta dahilinde uygun bir dozaulasilabilecek sekilde belirlenir.Bir enjeksiyonluk aseptik bilesim, enjekte edilebilir distile su gibi bir vehikül kullanilarak geleneksel farmasötik uygulamaya göre formüleedilebilir.En jeksiyonluk aköz çözeltilere verilebilecek örnekler arasinda, glukoz ve ömegin D-sorbitol, D-mannoz, D-mannitol ve/veya sodyum klorür gibi baska ad juvanlar ihtiva eden izotonik çözeltiler ve fizyolojik salinbulunur. Bu çözeltiler, bir alkol (özellikle de etanol) veya bir polialkol44(örnegin propilen glikol ve polietilen glikol) veya bir iyonik olmayan yüzey aktif madde, örnegin Polysorbate 80TM veya HCO-60 gibiuygun bir çözünürlestirici ile kombinasyon halinde kullanilabilirler.Yagli çözeltilere verilebilecek örnekler arasinda, susam yagi veya soya fasulyesi yagi sayilabilir. Bu çözeltiler, benzil benzoat veya benzil alkol gibi bir çözünürlestirici ile kombinasyon halinde kullanilabilirler. Bu çözeltilere bir tampon (örnegin bir fosfat tamponu çözeltisi veya bir sodyum asetat tamponu çözeltisi), bir yatistirici ajan (örnegin prokain hidroklorür), bir stabilizatör (örnegin benzil alkol veya fenol) veya bir antioksidan da katilabilir. Bu sekilde hazirlanan enjeksiyonluk çözeltiler genelde uygun ampullere doldurularakkullanilirlar.Bu bulusa konu olan farmasötik bilesim oral veya parenteral yolla ve tercihen parenteral yolla uygulanir. Dozaj forinlarina verilebilecek Spesifik örnekler arasinda, en jeksiyonlar, intranazal uygulama a janlari, transpulmoner uygulama ajanlari ve perkutan uygulama ajanlari sayilabilir. Enjeksiyon örnekleri arasinda, farmasötik bilesimin ister sistemik ister lokal olarak uygulanabilecegi intravenöz enjeksiyon, intramüski'iler enjeksiyon, intraperitoneal enjeksiyon ve subkutanenjeksiyon bulunur.Ayrica, uygulama yöntemi, hastanin yasi, kilosu, cinsiyeti, semptomlari ve hastaya dair benzeri bilgi ve veriler temelinde uygun sekilde seçilebilir. Antikoru içeren veya antikoru kodlayan bir polini'ikleotidi içeren bir farmasötik bilesimin dozu, örnegin 0,0001 ila1000 mg/kg Vücut agirligi araligindaki degerler arasindan seçilebilir.45Alternatif olarak, doz, örnegin 0,001 ilâ 100.000 mg/hasta Vücudu araligi içerisinden de seçilebilir, ancak dozun sadece bu sayisal degerlerle sinirli olmasi sart degildir. Doz ve uygulama yöntemi hastanin kilosu, yasi, cinsiyeti, semptomlari ve hastaya dair benzeri bilgi ve verilere bagli olarak farklilik gösterebilecek olmasina ragmen, sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar uygun doz ve uygulamayöntemini rahatlikla tayin edebilirler.Bulusa konu olan antikoru veya onun fragmanlarini içeren farmasötik bilesim, bir denege bir kanser hastaligini, tercihen meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kolorektal kanser, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanseri, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, mastositoin veya melanomu tedavi etmekve/veya önlemek amaciyla uygulanabilir.Bir kanser hastaligini tedavi etmek ve/veya önlemek için kullanilabilecek olan ve bulus konusu farmasötik bilesimin yukarida 'Örneklendirilen bir anti-tümör ajani veya bu gibi bir anti-tümör ajani ihtiva eden bir farmas'otik bilesimle konibinasyon halinde bir denege uygulanmasina dayanan bir yöntem de bu bulusun konusudur. Bulus konusu antikor veya antikor fragmani ile bir anti-tümör ajani bir denege eszamanli olarak veya ayri ayri uygulanabilirler. Bu farmasötik bilesimler ayri ayri uygulanacaklarsa, söz konusu uygulamalarin hangi sirayla yapilacagi önem arz etmez. Dozlama araliklari, dozlar, uygulama yollari ve doz sayisi, sektörde bilgi ve beceri sahibi bir uzman tarafindan kolayca belirlenebilir. Eszamanliuygulanabilecek diger farmasötik dozaj formlarina verilebilecek46örnekler arasinda, bulus konusu antikor veya antikor fraginaninin ya da antit'ümör ajaniiiin bir farmakolojik açidan kabul edilebilir tasiyici (veya bir vasat) içerisine karistirilmasi suretiyle formüle edilen farmasötik bilesimler bulunur. Bulusa konu olan antikoru ihtiva eden farmas'Ötik bilesimler ve dozaj formlarinin bilesimi, formülasyonu, uygulama yollari, dozlari, uygulandigi kanser hastaligi ve benzeri niteliklerine dair yukari verilen bilgiler, yukarida atif yapilan anti- tümör ajaiii ihtiva eden farmas'otik bilesimler ve dozaj formlarininherhangi birisi için de geçerlidir.Dolayisiyla, bu bulus, bulusa konu olan farmasötik bilesimi ve yukarida 'Örnekleri verildigi gibi olan bir anti-tümör ajaninin buluiidugu bir farmas'otik bilesimi bünyesinde barindiran ve kaiiser hastaliklarinin tedavisi ve/veya önlenmesine yönelik olan bir farmasötik kombinasyon sunar. Bu bulus, ayni zamanda, bir farmakolojik açidan kabul edilebilir tasiyici ile birlikte bulusa konu olan antikoru veya onun fragmanini ve anti-tümör ajanini ihtiva eden ve kanser hastaliklarinin tedavisi ve/veya `Önlenmesine yönelik olanbir farmasötik bilesiinle de ilgilidir.Bu bulus, bulusa konu olan antikoru veya onun fragmanini (antikor baglanma fragmani) kodlayan bir DNA da ortaya koyar. Bu DNA, antikorun agir ve/veya hafif Zincirlerini kodlayan bir DNA olabilecegi gibi, antikorun agir ve/veya hafif zincir degisken bölgelerini kodlayan bir DNA da olabilir. Bu DNA, antikorun tamamlayicilik belirlemebölgelerinin her birini veya bunlarin bir kombinasyonunu kodlayan bir47DNA da olabilir. Bu DNA, örnegin yukarida bahsi geçen (a) antikoru kapsaminda, örnegin SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen amino asit sekanslarini kodlayan nükleotid sekanslarinin bulundugu bir agir Zincir degisken bölgesi kodlayici DNA”yi ya da SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 1 1 ile gösterilen amino asit sekanslarini kodlayan nükleotid sekanslarinin bulundugu bir hafif Zincir degisken bölgesikodlayici DNA'yi kapsar.Bu sekanslari barindiran DNA'nin kodladigi tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR'ler), antikorun spesifisitesini belirleyen bölgeler olarak islev görûrler. Dolayisiyla antikorun diger bölgelerini (yani sabit bölgeler ve çerçeve bölgeleri) kodlayan sekanslar baska antikorlardan elde edilmis olan sekanslar olabilirler. Bu baglamda, "baska antikorlar" tabiri ile atif yapilan antikorlar arasinda, insan disi organizmalardan elde edilen antikorlar da bulunur, fakat advers reaksiyonlarin düsük tutulmasi adina bunlarin insanlardan elde edilen antikorlar olmalari tercih edilir. Somutlastirmak gerekirse, bulusa konu olan DNA'da, agir ve hafif zincirlerdeki çerçeve bölgelerinin ve sabit bölgelerin her birini kodlayan bölgeler, tercihen, mütekabil insan antikoru menseli amino asit sekanslarini kodlayan nükleotidsekanslarindan olusurlar.Bulusa konu olan antikoru kodlayan DNA'lara verilebilecek diger örnekler arasinda, SEKANS KOD NO.: 8 amino asit sekansini kodlayan bir nükleotid sekansinin bulundugu bir agir zincir degisken bölgesini kodlayaii bir DNA ve SEKANS KOD NO.: 12 amino asit sekansini kodlayan bir nükleotid sekansinin bulundugu bir hafif zincirdegisken bölgesini kodlayan bir DNA bulunur. Bu baglamda,48SEKANS KOD NO.: 8 amino asit sekansini kodlayan nükleotid sekansi, örnegin, SEKANS KOD NO.: 13 ile temsil edilen nükleotid sekansidir. SEKANS KOD NO.: 12 ainino asit sekansini kodlayan nükleotid sekanslarinin bir örnegi, örnegin, SEKANS KOD NO.: 14 ile temsil edilen nükleotid sekansidir. DNA'da agir ve hafif zincirlerin sabit bölgelerini kodlayan bölgeler varsa, bu bölgelerin her biri tercihen bir mütekabil insan antikoru menseli ainino asit sekansini (agir ve hafif zincirlerdeki sabit bölgelerin her birinin amino asitsekansi) kodlayan bir nükleotid sekansi içerir.Bu antikor DNA'lari, örnegin yukarida tarif edilen yöntemlerle ya da asagida açiklanan yöntemle elde edilebilirler. Oncelikle, bulusa konu olan antikoru üreten hibridoinlardan ticari piyasadan edinilen bir RNA ekstraksiyon kiti kullanilarak toplam RNA'lar hazirlanir ve daha sonra ters transkriptaz ve randomize primerler veya benzeri unsurlar kullanilarak bu toplam RNA'lardan CDNA'lar sentezlenir. Akabinde, antikorlari kodlayan cDNA'lar, bilinen fare antikoru agir veya hafif zincir genlerindeki degisken bölgelerin korunan sekanslarina yönelik oligonükleotid primerleri kullanilarak PCR yöntemiyle amplifiye edilirler. Sabit bölgeleri kodlayan sekanslar, bilinen sekanslar PCR ile amplifiye edilerek elde edilebilirler. DNA'nin nükleotid sekaiisi, örnegin sekanslama için bir plazmid veya bir faja sokululabilir ve birgeleneksel yönteme göre belirlenebilir.Bu bulus, ayni zamanda, yukarida bahsi geçen (a) antikoruyla iliskili asagida belirtilen polipeptidler ve DNA'lari da sunar:49(i) SEKANS KOD NO.: 8 ve 12 ile temsil edilen ainino asit sekaiislarindan herhangi birisini içeren bir polipeptid ve bu polipeptidi kodlayan bir DNA (örnegin, SEKANS KOD NO.: 13 ve 14 ile temsil edilen nükleotid sekanslarinin herhangi birisini içeren bir DNA);(ii) SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen amino asit sekanslarindaii olusan gruptan seçilen agir zincir CDR polipeptidleri ve bu polipeptidleri kodlayan bir DNA ve(iii) SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile gösterilen amino asit sekanslarindan seçilen hafif zincir CDR polipeptidleri ve bupolipeptidleri kodlayan bir DNA.Bu polipeptidler ve DNA'lar, yukarida belirtilen genetik mühendislikteknikleri kullanilarak hazirlanabilirler.OrneklerBulus asagida verilen Örnekler çerçevesinde daha somut bir dille açiklanacaktir. Bunlarin sadece örnek olduklari ve dolayisiyla bulusunbu spesifik örnekler ile sinirli olmadigi unutulmamalidir.Örnek 1 Her bir dokuda CAPRIN-l ekspresyonunun analiziWO 2010/016526 sayili patent yayinindaki Ornek l(4) altinda tarif edilen prosedüre göre köpek ve insanlara ait normal dokularda ve çesitli hücre hatlarinda RT-PCR ile CAPRIN-l geninin ekspresyonu incelendi. Sonuç olarak, saglikli köpek dokulari arasindan testistekuvvetli bir ekspresyon gözlemlenirken, köpek meme kanseri ve50adenokarsinom dokularda da ekspresyon gözlemlendi. Insan dokularinda yapilan ekspresyon incelemesi sonucunda, köpek CAPRIN-l genine istinaden tespit edilmis oldugu gibi, normal dokular arasindan sadece testiste ekspresyon gözlemlendi. Bunun aksine, kanser hücreleri arasindan, 8 insan meme kanseri hücre hattini (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA- MB-231V ve MRK-nu-l) ve 4 pankreas kanseri hücre hattini da (Çapan-2, MIAPaCa-Z, Panc-l ve BXPc-3) kapsayan birçok farkli kanser hücre hatti çesidinde ekspresyon tespit edildi. Bu sonuçlar, CAPRlN-l ekspresyonunun testis hariç normal dokularda bulunmadigini, ancak meme kanseri hücre hatlarinda CAPRIN-lekspresyonunun söz konusu oldugunu kanitladi.Ornek 2 CAPRIN-l'e karsi fare monoklonal antikorununhazirlanisiWO 2010/016526 sayili patent yayinindaki Örnek 3 kapsaminda hazirlanan 100 pg insan CAPRIN-l proteinleri (SEKANS KOD NO.: 2 ile gösterilen ainino asit sekansini barindiran proteinler), esit miktarda MPL+TDM ad juvaniyla (Sigma-Aldrich Corp.) karistirildi.

Bu karisim bir anti jen çözeltisi olarak farelere uygulandi. Söz konusu antijen çözeltisi 6 haftalik Balb/c farelerinin (Japan SLC, Inc.) her birine intraperitoneal yolla uygulandi. Daha sonra, immünizasyon sürecini tamamlamak için, haftada bir defa olmak üzere toplamda 7uygulama daha yapildi.Son immünizasyondan üç gün sonra farelerin dalaklari kesilip alindive iki sterilize lamin arasinda ezilerek ufalandi. Süpematani çikartmak51amaciyla PBS(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) ile yikama ve 1500 devir/dakika hizda 10 dakika süreyle santrifüjleme prosedürleri üç defa tekrarlanarak dalak hücreleri elde edildi. Elde edilen dalak hücreleri, fare miyelom hücreleri SP2/0 (ATCC) ile lO:1 oraninda karistirildilar. %10 FBS içeren ve 37°C sicakliga ulasana dek isitilmis olan 200 u] hacmindeki bir RPM11640 vasati ile 800 uL PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH) karistirilarak hazirlanan bir PEG çözeltisi hücre karisimina ilave edildi ve ardindan, hücrelerin füzyonlanmalari için 5 dakika süreyle beklemeye birakildi. 1700 devir/dakika hizda 5 dakika boyunca santrifüj gerçeklestirilerek süpematan uzaklastirildiktan sonra, hücreler, %2 esdegerinde bir HAT çözeltisiyle (Gibco) (HAT selektif vasati) desteklenmis olan %15 FBS'nin bulundugu 150 mL hacmindeki bir RPM11640 vasatinda süspanse edildiler. Elde edilen süspansiyon, 15 adet 96 kuyucuklu plakaya (Nunc) 100 uL/kuyucuk ölçüsünde ekildi. Dalak hücreleri ile miyelom hücreleri 37°C sicaklik ve %5 COZ ortaminda 7 gün boyuncakültürlenip füzyonlanarak hibridomlar elde edildi.Hazirlanan hibridomlar, ürettikleri antikorlarin CAPRlN-l proteinlerine yönelik baglanma afinitesinin gösterge olarak temel alindigi bir taramaya tâbi tutuldular. WO 2010/016526 sayili patent yayinindaki Örnek 3 kapsaminda hazirlanaii CAPRIN-l proteininin bulundugu 1 ug/mL düzeyinde bir çözelti 96 kuyucuklu bir plakaya 100 uL/kuyucuk yogunlugunda ilave edildi ve 18 saat boyunca 4°C sicaklik altinda beklemeye birakildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Daha sonra, bir %0,5 bovin serum albümini (BSA) çözeltisi (Sigma-Aldrich Corp.) 400 uL/kuyucuk yogunluguiida ilave edildi veelde edilen içerik 3 saat boyunca oda sicakligi altinda beklemeye52birakildi. Her kuyucuktaki çözelti çikartildi ve her kuyucuk 400 uL PBS-T ile üç defa yikandi. Ardindaii yukarida belirtildigi sekilde elde edilen her hibridomun kültür süpernatani 100 uL/kuyucuk yogunlugunda ilave edildi ve elde edilen içerik 2 saat boyunca oda sicakligi altinda beklemeye birakildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Daha sonra, PBS ile 5000 kat seyreltilmis olan HRP-etiketli anti-fare IgG (H+L) antikorlari (Invitrogen Corp.) 100 uL/kuyucuk yogunlugunda ilave edildiler ve elde edilen içerik 1 saat boyunca oda sicakligi altinda beklemeye birakildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Akabinde bir TMB sübstrati çözeltisi (Thermo Fisher Scientific Inc.) 100 uL/kuyucuk yogunlugunda eklendi ve elde edilen içerik renk reaksiyonuna neden olmak için 15 ilâ 30 dakika boyunca beklemeye birakildi. Renk olusumu gerçeklestikten sonra kuyucuk basina 100 uL 1 N sülfürik asit ilave edilerek reaksiyon durduruldu.

Bir absorbsiyon spektrometresi kullanilarak 450 nm ve 595 nm'de absorbans ölçüldü. Sonuç olarak, yüksek absorbans sahibi antikorlarüreten bir dizi hibridom seçildi.Seçilen hibridoiiilar 96 kuyucuklu bir plakaya plakanin her kuyucuguna 0,5 hücre düsecek yogunlukta ilave edildiler ve plakada kültürlendiler. Bir hafta sonra, kuyucuklarda tekil koloniler olusturan hibridomlar gözlemlendi. Bu kuyucuklardaki hücreler biraz daha kültürlendiler ve kloiilanan hibridomlar, ürettikleri antikorlarin CAPRIN-l proteinine yönelik baglanma afinitesinin bir gösterge olarak temel alindigi bir tarainaya tâbi tutuldular. WO 2010/016526 sayili patent yayinindaki Ornek 3 kapsaminda hazirlanan CAPRIN-l proteiniiiin bulundugu 1 ug/mL düzeyinde bir çözelti 96 kuyucuklu bir plakaya 100 uL/kuyucuk yogunlugunda ilave edildi ve 18 saat53boyunca 4°C sicaklik altinda beklemeye birakildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Daha sonra, bir %0,5 BSA çözeltisi 400 uL/kuyucuk yogunlugunda ilave edildi ve elde edilen içerik 3 saat boyunca oda sicakligi altinda bekletildi. Her kuyucuktaki çözelti çikartildi ve her kuyucuk 400 uL PBS-T ile üç defa yikandi. Ardindan yukarida belirtildigi sekilde elde edilen her hibridomun kültür süpernatani 100 uL/kuyucuk yoguiilugunda ilave edildi ve elde edilen içerik 2 saat boyunca oda sicakligi altinda bekleineye birakildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Daha sonra, PBS ile 5000 kat seyreltilmis olan HRP-etiketli anti-fare IgG (H+L) antikorlari (Invitrogen Corp.) 100 uL/kuyucuk yogunlugunda ilave edildiler ve elde edilen içerik 1 saat boyunca oda sicakligi altinda bekletildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Akabinde bir TMB sübstrati çözeltisi (Thermo Fisher Scientific Inc.) 100 uL/kuyucuk yogunlugunda eklendi ve elde edilen içerik renk reaksiyonu meydana gelmesi için 15 ilâ 30 dakika boyunca beklemeye birakildi. Renk olusuinu gerçeklestikten sonra kuyucuk basina 100 uL 1 N sülfürik asit ilave edilerek reaksiyon durduruldu. Bir absorbsiyon spektroinetresi kullanilarak 450 nm ve 595 nm'de absorbans ölçüldü.

Sonuç olarak, CAPRIN-l proteinine karsi reaktif monoklonalantikorlar üreten 1 12 adet hibridom hatti elde edildi.Daha sonra, bu monoklonal antikorlar arasinda tarama yapilarak, CAPRIN-l eksprese eden meme kanseri hücrelerinin yüzeyiyle reaksiyona girebilen antikorlar ayirt edildi. Somutlastirmak gerekirse, bir insan meme kanseri hücre hatti olan MDA-MB-231V'ye mensup 106 adet hücre 1,5 mL hacimli bir mikrosantrifüj tüpünde santrifûjetâbi tutuldu. Buna, yukarida tarif edildigi sekilde elde edilen54hibridoinun 100 ”L kültür süpematani eklendi ve elde edilen içerik bu üzerinde 1 saat boyunca bekleineye birakildi. PBS ile yikaina yapildiktan sonra, %0,1 FBS içeren PBS ile 500 kat seyreltilmis olan FITC-etiketli keçi anti-fare IgG antikorlari (Invitrogen Corp. ürünü) ilave edildi ve elde edilen içerik buz üzerinde 1 saat süreyle beklemeye birakildi. PBS ile yikaina yapildiktan sonra, FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) kullanilarak floresans yogunlugu ölçüld'û. Diger yandan, bir kontrol elde etmek amaciyla, antikorlar yerine bir hibridoin kültür vasati ile 500 kat seyreltilmis olan uygulama yapilmamis 6 haftalik Balb/c faresi serumu kullanilarak yukarida tarif edilen islemler tekrarlandi. Sonuç olarak, kontrolden daha kuvvetli bir floresans yogunluguna sahip olan, yani meme kanseri hücrelerinin yüzeyiyle reaksiyona girebilen bir inonoklonalantikor (#1) seçildi.Ornek 3 Seçilen monoklonal antikorun karakterizasyonuOrnek 2”de elde edilen monoclonal antikorlarin degisken bölgelerini kodlayan genlerin ainplifikasyon fragmanlari, W02010/016526 numarali dokümanda Ornek 5°te tarif edilen bir yönteme göre elde edildi ve gen sekanslari ve onlarin kodladiklari ainino asit sekanslari açisindan analiz edildi. Sonuçta, inonoklonal antikor #1, SEKANS KOD NO.: Side gösterilen agir zincir degisken bölgesinden ve SEKANS KOD NO.: 12°de gösterilen hafif zincir degisken bölgesinden olusan degisken bölgelere sahipti. Elde edilen monoklonal antikor #1”in agir zincir degisken bölgesini kodlayan gen sekansi, SEKANS KOD NO.: 13,& gösterilinektedir ve amino asit sekansi, SEKANS KOD NO.: 8°de gösterilmektedir. Elde edilen55monoklonal antikor #1 ”in hafif zincir degisken bölgesini kodlayan gen sekansi, SEKANS KOD NO.: l4°te gösterilmektedir ve amino asit sekansi, SEKANS KOD NO.: 12”de gösterilmektedirBaska bir deyisle, monoklonal antikor #liin SEKANS KOD NO.: 8°de gösterilen agir zincir degisken bölgesini ve SEKANS KOD NO.: 12”de gösterilen hafif zincir degisken bölgesini içerdigi tespit edildi; burada, agir zincir degisken bölgesi, sirasiyla SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile temsil edilen ainino asit sekanslarindan olusan CDRl, CDR2 ve CDR3 içermekteydi ve hafif zincir degisken bölgesi, sirasiyla SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile temsil edilen amino asit sekanslarindan olusan CDRl , CDR2 ve CDR3 içermekteydi.Ornek 4 Insan-fare kimerik monoklonal antikorununhazirlanmasiFare moiioklonal antikoru #1”in agir zincir degisken bölgesinin sekansini (SEKANS KOD NO.: 13) içeren ve Omek 3°te hazirlanan gen ainplifikasyonu fragmaninin her iki ucu bir restriksiyon enzimiyle isleme tâbi tutuldu; ardindan saflastirildi ve bir rutin yönteme göre, bir bir fare antikoru-kaynakli lider sekansin gen insertlerinin ve SEKANS KOD NO.: 37Sde gösterilen amino asit sekansini içeren bir insan IgGi H zincir sabit domaininin zaten bulundugu pcDNA4/myc-His vektör'u (Invitrogen Corp. ürünü) içine sokuldu. Ayrica, fare monokloiial antikoru #Fin hafif zincir degisken bölge sekansini (SEKANS KOD NO.: 14) içeren gen amplifikasyon fragmaninin her iki ucu, bir restriksiyon enzimiyle isleme tâbi tutuldu; ardindansaflastirildi ve bir rutin yönteme göre, bir fare antikoru-kaynakli lider56sekansin gen insertlerinin ve SEKANS KOD NO.: 38,de gösterilen amino asit sekansini içeren bir insan IgG1 L zincir sabit bölgesinin zaten bulundugu bir pcDNA3.1/myc-His vektörü (Invitrogen Corp.ürünü) içine sokuldu.Daha sonra, fare monoklonal antikoru #1”in agir zincir degisken bölgesinin (SEKANS KOD NO.: 13) insertini içeren rekoinbinan vektör ve fare monoklonal antikoru #1”in hafif zincir degisken bölgesinin (SEKANS KOD NO.: 14) insertini içeren rekombinan vektör, CHO-Kl hücreleri (Riken Hücre Bankasindan temin edilir) içine sokuldu. Daha soinut ifade etmek gerekirse, 2 X 105 CHO-Kl hücresi, 12 kuyucuklu kültür plakasinin beher kuyucugunda, 1 ml %10 FBS içeren bir Ham F12 vasati (Invitrogen Corp. ürünü) içinde kültürlendi ve PBS(-) ile yikandi. Daha sonra, her bir kuyucuga, 1 ml %10 FBS içeren bir taze Ham F12 vasati ilave edildi. 30 ul OptiMEM (Invitrogen Corp. ürünü) içinde vektörlerin her birinden 250 ng, 30 pl Polyfect transfeksiyon reaktifiyle (Qiagen N.V. ürünü) karistirildi ve bu karisim, her bir kuyucuga ilave edildi. Rekombinan vektörlerle ko- transfekte edilen CHO-Kl hücreleri, 200 ug/mL Zeocin (lnvitrogen Corp. ürünü) ve 200 ug/mL Geneticin (Roche Diagnostics KK. ürünü) takviye edilmis bir Ham F12 vasati içinde kültürlendi ve ardindan, 96 kuyucuklu bir plakaya 0,5 hücre/kuyucuk yogunlukla ekilerek fare monoklonal antikoru #1 ”in degisken bölgelerine sahip bir insan-fare kimerik monoklonal antikoru #1”i (#1) stabil biçimdeüreten bir hücre hatti hazirlandi.Hazirlanan her bir hücre hatti, 30 m1 serum-içermeyen OptiCHOvasati (lnvitrogen Corp. ürünü) bulunan 150-cm2 bir kap içinde 5 X57105 hücre/ml yogunlukla 5 gün süreyle kültürlendi ve böylece, insan- fare kimerik moiioklonal antikoru #1 içeren kültür süpematanlari eldeedildi.Ayrica, karsilastirma amaçli insan-fare kiinerik monoklonal antikorlari 1 ilâ 11”i stabil biçimde üreten hücre hatlari, karsilastirma antikorlari olarak W02010/016526 nuinarali dokümanda açiklanan sirasiyla asagidaki anti-CAPRIN-l fare-kaynakli monoklonal antikorlari baz alinarak yukarida açiklanan prosedürün aynisiyla hazirlandi: SEKANS KOD NO.: 15 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 16 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru 1; SEKANS KOD NO.: 17 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 18 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru 2; SEKANS KOD NO.: 19 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 20 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru 3; SEKANS KOD NO.: 21 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 22 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru 4; SEKANS KOD NO.: 23 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 24 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru 5; SEKANS KOD NO.: 25 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 26 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru 6; SEKANS KOD NO.: 27 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 28 ile temsiledilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru587; SEKANS KOD NO.: 29 ile teinsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 30 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru 8; SEKANS KOD NO.: 31 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 32 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru 9; SEKANS KOD NO.: 33 ile temsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 34 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru ve SEKANS KOD NO.: 35 ile teinsil edilen agir zincir degisken bölgesine ve SEKANS KOD NO.: 36 ile temsil edilen hafif zincir degisken bölgesine sahip bir karsilastirma antikoru. ll. Hazirlanan her bir hücre hatti, 30 ml serum-içermeyen OptiCHO vasati (lnvitrogen Corp. ürünü) bulunan 150-cm2 bir kap içinde 5 X 105 hücre/n11 yogunlukla 5 gün süreyle kültürlendi ve böylece, karsilastirma amaçli ilgili insan-fare kimerik antikoru l ilâ 11°i içeren kültür süpernatanlarielde edildi.Örnek 5 Anti-CAPRIN-l antikoru #1 kullanilarak çesitli farkli kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde CAPRIN-l ekspresyonuanaliziBir sonraki asamada, CAPRIN-l genini ekspresyonunun gözlemlenmis oldugu insan meme kanseri hücre hatlari (ZR75-l, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V ve MRK-nu-l), böbrek kanseri hücre hatlari (Caki-l, Caki-2, A498 ve ACHN), mesane kanseri hücre hatti (T24), yumurtalik kanseri hücre hatti (SKOV3), akciger kanseri hücre hatlari (QG56 ve A549), pankreas kanseri hücre hatlari (Çapan-2 ve MIAPaCa-Z), prostat59kanseri hücre hatti (PC3), uterin serviks kanseri hücre hatti (SW756), fibrosarkom hücre hatti (HT1080), beyin tümörü hücre hatlari (T98G, U87MG, U251, SNBl9 ve U373), gastrik kanser hücre hatlari (MNK28 ve MNK45), kolorektal kanser hücre hatlari (HT29, Lovo, CaC02, SW480 ve HCT116), lösemi hücre hatti (AMLS) ve lenfoma hücre hatti (Ramos), Ornek 2'de elde edilen #1 numarali monoklonal antikoru ihtiva eden kültür süpematanlari kullanilarak hücre yüzeyi üzerinde meydana gelen CAPRIN-l proteinleri ekSpresyonu bakimindan incelendiler. Her bir hücre hattindan 5 X 105 adet hücre 1,5 mL hacimli bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüje tâbi tutuldu.

Antikor #l içeren bir kültür süpematani (100 uL) bir tüpe konuldu ve 1 saat boyunca buz üzerinde beklemeye birakildi. PBS ile yikama yapildiktan sonra, buna, %0,1 FBS içeren PBS ile seyreltilmis FITC- etiketli keçi anti-fare IgG (H+L) antikorlari (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) ilave edildi ve elde edilen içerik takip eden 30 dakika boyunca 4°C sicaklik altinda bekleineye birakildi. PBS ile yikama yapildiktan sonra, FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) kullanilarak floresans yogunlugu ölçüldü.

Kullanilan negatif kontrol, sadece sekonder antikorlarla reaksiyona giren hücrelerdi. Sonuç olarak, antikor #1 uygulanan hücreler, negatif kontrolden en az %35 oraninda daha kuvvetli bir floresans yogunlugu saptandi. Bu sonuçlar, CAPRIN-l proteinlerinin insan kanser hücre hatlarinin hücre membrani yüzeyi üzerinde eksprese olduklarini kanitladi. Floresans yogunlugundaki artis oranlari, ilgili hücre hatlarinda asagida gösterilen denkleme göre hesaplanan ortalamafloresans yogunlugundaki (MFI) artis oranlari olarak ifade edildiler:Ortalama floresans yogunlundaki artis orani (Floresans60yogunlugundaki artis orani) (%) = ((Anti-CAPRIN-l aiitikorlari ile reaksiyona giren hücrelerin MFI degeri) - (Kontrol MFI degeri)) / (Kontrol MFI degeri) X 100Ornek 6 Anti-CAPRIN-l antikorunun kanser hücresi üzerindeantit'i'im'ör etkisi (ADCC aktivitesi)Ornek 4°te elde edilen anti-CAPRIN-l insan-fare kiinerik monoklonal antikoru #1, ADCC aktivitesi tayin edilerek CAPRIN-l-eksprese eden kanser hücrelerine hasar verme kabiliyetine sahip olup olmadigi açisindan incelendi. #1 numarali antikoru üreten bir hücre hattinin kültür süpematani, Hitrap Protein A Sepharose FF (GE Healthcare BioSciences Ltd.) kullanilarak saflastirildi. PBS(-) ikamesi yapildiktan sonra, çözelti bir 0,22 tim filtreden (Millipore Corp.) geçirilerek filtrelendi. Elde edilen antikor aktivite eseyinde kullanildi. CAPRIN-l ekspresyonu oldugu gözlemlenmis olan insan meme kanseri hücre hatti MCF7, insan kolorektal kanser hücre hatti HCT-116, insan pankreas kanseri hücre hatti MIAPaCa-2, insan böbrek kanseri hücre hatti Caki-2 ve insan akciger kanseri hücre hatti QG56'nin her birinden 106 adet hücre bir 50 mL hacimli santritüj tüpü içine toplandi ve daha sonra üzerlerine 100 uCi krom 51 ilave edilip, ardindan elde edilen içerik 37°C sicaklik altinda 2 saat süreyle inkübe edildi.

Akabinde, hedef hücrelere ulasmak için, hücreler %10 FBS içeren bir RPM11640 vasati ile üç defa yikandilar ve 96 kuyucuklu ve V dipli bir plakaya plakanin her bir kuyucuguna 2 X 103 adet hücre denk düsecek sekilde ilave edildiler. Saflastirilan antikor #1 ve Ornek 4'te elde edilen insan-fare kiinerik karsilastirma antikorlari 1 ilâ 11,in her biri 1ug/kuyucuk konsantrasyonda ilave edildi. Bir geleneksel yöntem61kullanilarak insan periferal kan lenfositlerinden ayrilan insan NK hücreleri içeren bir hücre popülasyonu, plakaya 2 X 105 hücre/kuyucuk yogunlukta ilave edildi ve 37°C sicaklik ve %5 (:02 kosullari altinda 4 saat süreyle kültürlendi. Kültürleme isleminden sonra, hasarli tümör hücrelerinden salinan krom 51 miktari, kültür süpernatani içinde ölçülerek kaiiser hücrelerine karsi her bir anti-CAPRIN-l aiitikorunun sitotoksik aktivitesi hesaplandi.

Kullanilan negatif kontrol, izotip kontrol antikorlariyla tedavi edilen hücrelerdi. Bu degerlendirmede kullanilan NK hücrelerini içeren hücre popülasyonu asagida tarif edildigi gibi hazirlandi: insan periferal kan mononükleer hücre separasyonuna yönelik bir Özgül agirlik separasyon çözeltisi Histopaque (Sigma-Aldrich Corp.) kullanilarak bir geleneksel yönteme göre periferal kandan ayrilan insan periferal kan mononükleer hücreleri, çesitli farkli FITC floresan boyasiyla etiketli antikorlar (anti-insan CD3 antikoru, anti-insan CD20 antikoru, anti-insan CDl9 antikoru, anti-insan CDllc antikoru veya anti-HLA-DR antikoru (Becton, Dickinson and C0mpany)) ile reaksiyoiia sokuldular ve antikorlarin boyamadigi bir hücre popülasyonu bir hücre ayiklayici (FACS Vantage SE (Becton, Dickinson and C0mpany)) kullanilarak ayrildi ya da insan NK hücresi separasyon kiti (Miltenyi Biotec K.K.) ile bir hücre popülasyonu ayrildi. Kanser hücrelerine karsi sitotoksik aktivite degerlendirmesiiiin bir sonucu olarak, kullaiiilaii izotip koiitrol antikorlari ve kullanilan karsilastirma antikorlari 1 ilâ ll, insan meme kanseri hücre hatti MCF7, insaii kolorektal kanser hücre hatti HCT-116, insan pankreas kanseri hücre hatti MIAPaCa-Z, insan böbrek kanseri hücre hatti Caki- 2 ve insaii akciger kanseri hücre hatti QG56snin hepsine karsi %5stenaz sitotoksik aktiviteye sahipti. Bunun aksine, antikor #1, insan meme62kanseri hücre hatti MCF7, insan kolorektal kanser hücre hatti HCT- 116, insan pankreas kanseri hücre hatti MIAPaCa-Z, insan böbrek kanseri hücre hatti Caki-2 ve insan akciger kanseri hücre hatti QG56”ya karsi sirasiyla %26, %17, %29, %23 ve %11 oraninda sitotoksik aktivite gösterdi. Benzer sekilde, kullanilan izotip koiitrol antikorlari ve kullanilaii karsilastirma antikorlari l ilâ ll'in asagida siralanan diger kanser hücrelerine karsi sergiledikleri sitotoksik aktivite de %4'ten düsüktü: meme kanseri hücre hatlari ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V ve MRK-nu-l, gliom hücre hatlari T98G ve U373, akciger kanseri hücre hatti A549, böbrek kanseri hücre hatlari Caki-l ve ACHN, uterin serviks kaiiseri hücre hatti SW756, mesane kanseri hücre hatti T24, gastrik kanser hücre hatlari MKN28 ve MKN45, kolorektal kanser hücre hatti SW480, lösemi hücre hatti AML5 ve lenfoina hücre hatti Ramos.

Diger yandan, antikor #l°in bu hücre hatlarina karsi %10 oraninda veya daha yüksek bir oranda sitotoksik aktiviteye sahip olduklari gözleinlendi. Bu sonuçlar, CAPRIN-l ”e karsi elde edilen monoklonal antikor #1'in CAPRlN-l eksprese eden kanser hücrelerine, sahip olduklari ADCC aktivitesi araciligiyla hasar verdigini ortaya koydu ve antikor #1'in insan kanser hücrelerine karsi karsilastirma ainaçli antikorlar l ilâ ll'den daha kuvvetli bir sitotoksik aktivitesergilediklerini kanitladi.Bu sonuçlar, yukarida tarif edildigi gibi bu bulusta kullanilan anti- CAPRIN-l antikoru, lenfositler (NK hücreleri içeren hücre popülasyonu) ve her kanser hücre hattindan 2 x 103 adet hücrenin dahil edilen krom 51 ile karistirilmalari, hücrelerin 4 saat boyuncakültürlenmeleri, kültür tamamlandiktan sonra vasata salinan krom 5163miktarinin ölçülmesi ve asagidaki denklem uyarinca her kanser hücre hattina karsi ortaya konan sitotoksik aktivitenin hesaplanmasi yoluylasitotoksik aktivite belirlenerek elde edildi:*Ekspresyont Sitotoksik aktivite (%) : [CAPRIN-l'i hedef alan antikorun ve lenfositlerin (NK hücreler içeren hücre popülasyonu) uygulandigi hedef hücrelerden salinan krom 51 miktari] / [1 Nhidroklorik asidin uygulandigi hedef hücrelerden salinan krom 51miktari] X 100Daha sonra, Ornek 49te elde edilen insan-fare kimerik inonoklonal antikoru #1, kanser-tasiyan farelerde in-vivo ortamda antitüm'or etkisi açisindan degerlendirildi. Kullanilan antikor #1, antikor #1”i üreten her hücre hattinin kültür süpernatanindan kolonla saflastirildi. Benzer sekilde, Ornek 49te hazirlanan anti-CAPRIN-l insan-fare kimerik karsilastirma monoklonal antikorlari l ilâ 11 de, kanser-tasiyan farelerde in-vivo ortamda antitüm'or etkileri açisindandegerlendirildiler.Daha somut ifade etmek gerekirse, antikor #1, bir CAPRIN-l- eksprese eden insan-kaynakli kanser hücre hattinin transplante edildigi kanser-tasiyan fareler kullanilarak antitümör etkisi açisindan incelendi. Insan pankreas kanseri hücre hatti Çapan-2 hücreleri (ATCC°den satin alindi), 65 Balb/c adet tüysüz farenin (Japan SLC, Inc.) sirtina 2 X 106 hücre/fare yogunlukta subkutan yoldan transplante edildi ve bu hücreler, tümör yaklasik 5 mm çapta olana kadar çogaltildi. Antikor #1 ve insan-fare kimerik karsilastirma antikorlari lilâ ll°in her biri, kanser-tasiyan fare grubundan 5 hayvana (beher64antikor için) 200 ug (200 ul)/fare dozda intraperitoneal yoldan uygulandi. Daha sonra, her bir antikor, kanser-tasiyan farelere, 2 gün süreyle toplam üç defa yukarida açiklananla ayni doz seviyesinde intraperitoneal yoldan uygulandi. Tümör büyüklügü her gün ölçülerek antitümör etkisi tayin edildi. Öte yandan, bir kontrol grubu olarak, kanser-tasiyan fare grubunun geriye kalan 5 hayvanina antikorlar yerine PBS(-) uygulandi. Tümör büyüklügü (hacim) asagidaki formüle göre hesaplandi: 0,5 >< (Büyük eksen >< Küçük eksen >< Küçük eksen).Antitümör etkisi eseyinin bir sonucu olarak, CAPRlN-l”e karsi antikor #l alan test grubunda antikor uygulamasindan sonra 29. günde tümör büyümesi, ayni tarihte kontrol grubunda tümör büyüklügüne (%100 olarak tanimlanir) kiyasla %68°e kadar baskilandi. Bunun aksine, insan-fare kimerik karsilastirma antikorlari l ilâ ll alan farelerde tümör büyümesi yaklasik %85°e kadar baskilandi. Bu sonuçlar, elde edilen anti-CAPRIN-l antikoru #Pin in-vivo ortamda CAPRIN-l-ekSprese eden kanser hücreleri üzerinde bir antitümör etki ortaya koydugunu gösterdi. Sonuçlar, ayrica, antikor #1”in in- vivo ortamda karsilastirma antikorlari 1 ilâ l l°e kiyasla daha kuvvetlibir antitümör etki sergiledigini de gösterdi.Ornek 7 Anti-CAPRIN-l antikoru #1”in tanidigi çesitli farkli kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde CAPRIN-l moleküllerininsayisiInsan meme kanseri hücre hatlari (ZR75-l, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V ve MRK-nu-l), böbrek kanseri hücre hatlari (Caki-l, Caki-2, A498 ve ACHN), bir mesane65kanseri hücre hatti (T24), bir yumurtalik kanseri hücre hatti (SKOV3), akciger kanseri hücre hatlari (QG56 ve A549), pankreas kanseri hücre hatlari (MIAPaCa-2 ve Çapan-2), bir prostat kanseri hücre hatti (PC3), bir uterin serviks kanseri hücre hatti (SW756), fibrosarkom hücre hatti (HTlOSO), beyin tümörü hücre hatlari (T98G, U87MG, U251, SNB19 ve U373), gastrik kanser hücre hatlari (MNK28 ve MNK45), kolorektal kanser hücre hatlari (HT29, Lovo, CaCoZ, SW480 ve HCT116), bir lösemi hücre hatti (AMLS) ve lenfoma hücre hatti (Ramos), anti-CAPRIN-l antikoru #l'in bu hücrelerin yüzeyleri üzerinde algilayip tanidiklari CAPRlN-l moleküllerinin sayisini saptamak inaksadiyla molekül sayisinin Ölçümüne yönelik bir esey kiti olan "QIFIKIT" (Dako Japan Inc. ürünü) kullanilarak incelendiler. Bu muhtelif kanser hücrelerinin yüzeyleri üzerindeki CAPRIN-l moleküllerinin sayisi benzer sekilde karsilastirma ainaçli antikorlar l ilâ ll kullanilarak da incelendi. Benzer sekilde, bu çesitli farkli kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde CAPRIN-l moleküllerinin sayisi da, Ornek 4”te hazirlanan anti-CAPRIN-l monoklonal antikorlari olankarsilastirma antikorlari l ilâ ll kullanilarak incelendi.Kit ile birlikte sunulan protokole göre, antikor #1 ve karsilastirma amaçli antikorlar l ilâ 11, PES ile 5 ug/mL nihai konsantrasyona ulasana dek seyreltildi ve bu seyrelti her bir hücre hattina ilave edilip onunla 30 dakika boyunca reaksiyona sokuldu. PBS ile yikaina yapildiktan sonra, kit ile birlikte sunulan floresan etiketli anti-fare IgG antikorlari, yine kit ile birlikte sunulan kalibrasyon boncuklari ile beraber sekonder antikorlar olarak her bir hücre hattina ilave edildiler ve elde edilen içerik takip eden 45 dakika boyunca buz üzerindebeklemeye birakildi. Her bir hücre hatti ve kalibrasyon boncuklari 66PES ile yikandi. Daha sonra FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) ile floresans yogunlugu Ölçülerek bir ortalama floresans yogunlugu degeri (ortalama) elde edildi. Ek olarak, yukarida açiklanana benzer sekilde karsilastirma antikorlari kullanilarak floresans yogunlugu da ölçüldü ve bir ortalama elde edildi. Negatif kontrol olarak, izotip kontrol antikorlari ile reaksiyona sokulan hücreler kullanildi ve bunlar için de bir ortalama deger hesaplandi. Kit ile birlikte suiiulan protokole göre ortalama floresans yogunlugu degeri (ortalama) kullanilarak moleküllerin sayisi hesaplandi. Sonuç olarak, antikor #l'in muhtelif kanser hücrelerinin yüzeyleri üzerinde algilayip tanidigi CAPRIN-l moleküllerinin sayisinin incelenen tüm insan kanser hücre hatlarina istinaden hücre basina 105 veya daha fazla oldugu tespit edildi. Diger yandan, karsilastirma amaçli antikorlar l ilâ ll'in algilayip tanidiklari moleküllerin sayisi hücrebasina 105'ten azdi.Endüstriyel UygulanabilirlikBu bulusa konu olan antikor, kanser hastaliklarini tedavi etme ve/Veya`Önleme amaçli uygulamalarda faydalidir ve kullanima uygundur.

Claims (1)

1. ISTEMLER Bir antikor ya da onun bir fraginani; burada, antikor ya da onun fragmani, bir CAPRIN-l proteiniyle immünolojik reaktiviteye sahiptir ve SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile gösterilen tainainlayicilik belirleme bölgelerini kapsayan bir agir Zincir degisken bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile gösterilen tamamlayicilik belirleine bölgelerini kapsayan bir hafif zincir degisken bölgesi içerir. Istem 1”e uygun olan ve antikorun bir insan antikoru, bir hümanize antikor, bir kimerik antikor, bir tek Zincirli antikor ya da bir multispesifik antikor oldugu antikor ya da onun fragmani. Istem 1 ya da 2”ye uygun olan ve bir antitümör ajaniyla kon juge edilen antikor ya da onun fragmani. Onceki istemlerin herhangi birisine uygun olan ve kanser hastaliklarinin tedavisi ve/Veya önlenmesi için bir yöntemde kullanma amacina yönelik olan antikor ya da onun fragmani. Istem 4°e göre kullanma amacina yönelik olan ve kanser hastaliginin meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kolorektal kanser, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, inastositom veya melanom oldugu antikor ya da onun fragmani. Istem 1 ilâ istem 3°ün herhangi birisine uygun antikoru ya da onun fragmanini bir etkin inadde olarak içeren bir farmasötik bilesim. Istein 6”ye uygun olan ve kanser hastaliklarinin tedavisi ve/Veya önlenmesi için bir yöntemde kullanma amacina yönelik olan farmasötik bilesim. Istem 79ye göre kullanma amacina yönelik olan ve kanserin meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kolorektal kanser, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, mastositom veya inelanom oldugu farmasötik bilesim. Istem 1 ya da istem 2sye uygun olan antikoru ya da onun fragmanini kodlayan bir DNA.