TR201802420T4 - ECM bileşimi, tümör mikro-ortam platformu ve bunun yöntemleri. - Google Patents

ECM bileşimi, tümör mikro-ortam platformu ve bunun yöntemleri. Download PDF

Info

Publication number
TR201802420T4
TR201802420T4 TR2018/02420T TR201802420T TR201802420T4 TR 201802420 T4 TR201802420 T4 TR 201802420T4 TR 2018/02420 T TR2018/02420 T TR 2018/02420T TR 201802420 T TR201802420 T TR 201802420T TR 201802420 T4 TR201802420 T4 TR 201802420T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
tumor
approximately
response
drugs
patient
Prior art date
Application number
TR2018/02420T
Other languages
English (en)
Inventor
Sundaram Mallikarjun
Majumder Biswanath
Jain Misti
Thiagarajan Saravanan
Pinto Dency
Radhakrishnan Padhma
Original Assignee
Mitra Rxdx India Private Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitra Rxdx India Private Ltd filed Critical Mitra Rxdx India Private Ltd
Publication of TR201802420T4 publication Critical patent/TR201802420T4/tr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Mevcut açıklama, kanser tipine ve tümör dokusunun uzun süreli kültürlenmesi için bir tümör mikro-ortam platformuna spesifik bir Ekstra Selüler Matriks bileşimi ile ilgilidir, burada söz konusu kültürleme, fizyolojik olarak ilgili sinyalleme sistemlerini taklit etmek için insan ligandları ve tümör dokusu mikro-ortamı sağlar. Mevcut açıklama ilaveten, bir Klinik Yanıt Kestrici'nin geliştirilmesi ve tanısal alanda (hasta için tedavi opsiyonunun seleksiyonunda) ve geçişsel biyoloji alanında (anti-kanser ilaçların geliştirilmesinde) bunun uygulanması ile ilgilidir. Açıklama ilaveten, bir tümör hastasının ilaca (ilaçlara) klinik yanıtını tahmin etmenin bir yöntemi ile ilgilidir. Açıklama ilaveten, tümör hücrelerini, tümör durumunun endikasyonu için söz konusu hücrelerin viabilitesini belirlemek amacıyla spesifik belirteçlerin varlığı için taramak için bir yöntem ile ilgilidir.

Description

TARFNAME ECM BILESIMI, TÜMÖR MIKRO-ORTAM PLATFORMU VE BUNUN YÖNTEMLERI TEKNIK SAHA Bu basvuru, kanser alani ve kanser için tanisallarin ve terapötiklerin gelistirilmesi ile ilgilidir. Daha spesifik olarak, bulus Ekstra Selüler Matriks [ECM] bilesimi, tümör dokusunu kültürlemek için tümör mikro-ortam platformu ve bunlarin yöntemlerini saglar. Mevcut açiklama, bir 'Klinik Yanit Kestirici' ve kemoterapi, hedeflenmis, biyolojik ilaçlar ve genis bir sekilde anti-tümör etkiye sahip olan ajanlar için çesitli kanserlerde bunun uygulanmasi ile ilgilidir. Mevcut açiklama ilaveten, tümör dokusunun uzun süreli kültürü için bir yöntem ile ilgilidir, burada söz konusu kültür, fizyolojik olarak ilgili sinyalleme sistemlerini taklit etmek için insan Iigandlari ve tümör dokusu mikro-ortami saglar. Açiklama ilaveten, tümör hücrelerini, tümör durumunun endikasyonu için söz konusu hücrelerin viabilitesini belirlemek amaciyla spesifik belirteçlerin varligi için taramak için bir yöntem ile ilgilidir. Açiklama ayrica, bir tümör süjesinin yanitini tahmin etmenin yöntemi ve anti-kanser ajanini taramanin veya gelistirmenin yöntemi ile de ilgilidir. AgiKLAMANiN ALT-YAPISI VE ÖNCEKI TEKNIGI Teknikte bilinen çesitli hasta ayirim araçlari asagida genis bir sekilde siniflandirilir: Biyo-belirteçler: Hastanin tümörünün, normal dokusunun, serumunun, idrarinin, tükürügünün ayni zamanda vücudun diger parçalarinin &Iveya salgilanmis/bosaltilmis maddenin analizine dayanan çesitli biyo-belirteçler vardir. Örnegin: Her2, bir proteindir ayni zamanda Her2 proteinini asiri eksprese eden hastalari bunlarin az eksprese edenlerden ayiran bir gen bazli belirteçtir. Detaylandirilmis klinik arastirma, nihayetinde daha yüksek düzeylerde Her2 proteinine sahip olanlarin monoklonal antikor Herseptin'e anlamli olarak daha iyi yanit verdigini göstermek için yürütülmüstür. Bu baglamda, Her2, tetkik edilmekte olan hasta için Herseptin tedavisinin sonucunu tahmin etmek için bir "Biyo-belirteç" olarak onaylanmistir. Varligi veya yoklugu veya ekspresyon profili tetkik edilmekte olan hedeflenmis ilaçlarin etkinligini tahmin etmek için kullanilan baska biyo-belirteçler, örnegin, EGFR, C-MET, vardir. Bir biyo-belirtecin kullanilmasi için, bir XY düzleminin her iki ekseninin tanimlanmasi gerekir, yani, bir kisinin bir eksen üzerinde biyo-belirtecin miktarini veya kalitesini ve diger eksen üzerinde klinik yaniti tanimlamasi gerekir. Biyo-belirtecin kullanilmasindan önce, bir kisinin biyo-belirtecin kalitesinin &/veya miktarinin sabitlenmis kombinasyonu ayni zamanda klinik sonuç için kapsamli bir miktarda veri gelistirmesi gerekir. Bu tarz bir veri tabani gelistirildiginde, ayni hastalik ve ayni ilaç için yeni bir hasta için, biyo- belirtecin kalitesinin veya miktarinin ölçülmesi, hastaya bu özel ilaç uygulandiginda, klinik sonucu tahmin etmek için kullanilabilir. Böylelikle, bir biyo-belirtece dayali yaklasim büyük oranda, çok sayida girdi faktörü, örnegin, kullanilan ilaç, içinde bunun kullanildigi hastalik ve kullanilan biyo-belirteç, ile sinirlandirilir. Kemo-belirteçler: Farkli kanserlerde kemoterapötiklerin, örnegin, Sisplatin'in, etkinligini tahmin etmek için kullanilan testler vardir. Bu testler, destekleyici belirteçlerin varligini veya yoklugunu veya varliginin derecesini ölçer. Kemo-belirteçler, biyo-belirteçler ile ayni eksikliklerden muzdariptir. Hastanin güncel veya önceki hastalik durumlari: Bas & Boyun skuamöz hücreli karsinoma da sahip olan HPV pozitif hastalar, HPV negatif Bas & Boyun skuamöz hücreli karsinom hastalarina kiyasla kemoterapiye daha iyi yanit verir. Bu olguda, hastalarin HPV durumu, bunlarin Bas & Boyun Skuamöz hücreli karsinom gelistirdikleri olayda bunlarin Bas & Boyun skuamöz hücreli karsinom için ilaçlara yanitini tahmin etmek amaciyla bir ölçü olarak kullanilir. Bu tanisal kategori altinda mevcut sinirli bir miktarda bilgi vardir. Bu bilgi büyük ölçüde, korelasyon temellidir ve zorunlu bir sekilde neden olma temelli degildir. Kemo-duyarlilik testi: Testlerin bu kategorisinde, hastanin tümör örnegi alinir, tümör hücrelerine homojenize edilir ve bu sisteme in vitro sistem içinde çesitli kemoterapötikler ile muamele edilir. Alternatif olarak, hastanin tümör örnegine homojenizasyon olmadan in vitro sistem içinde çesitli kemoterapötikler ile muamele edilir. Bu in vitro testler, çesitli adlar (örnegin, Oncotest GMBH firmasindan Tek-katmanli analiz veya klonojenik analiz, Chemofx firmasindan kemo-duyarlilik analizi, Oncotech firmasindan Extreme Drug Resistance (EDR) testi) altinda toplanir. Bu modelin temel eksikligi, hastanin tümör mikro-ortaminin bu kemo-duyarlilik testlerinde yakalanmamasidir. Örnegin, bir kaç literatürde, in vitro hücre veya doku temelli sistemlerin klinik sonucun temsilcisi olmadigi iddia edilmistir. Hücre hatti temelli in vitro ve in vivo ksenogreft sistem. Yakin zamanlarda, tümör büyümesi inhibisyonuna dayanan tümör büyümesi in vitro & in vivo pre-klinik testler hakkinda ayni zamanda klinik etkinligi tahmin etmek için yayimlanmis çok fazla sayida literatür vardir. Önceki teknigin yöntemlerinin tümü, bunlarin, tümör örneklerinin lokal mikro-ortamini taklit edemiyor olmasina yönelik içsel sinirlandirmalara ve sonuç olarak bunlarin klinik sonuçlari tahmin etmek için güvenilebilir analizler olarak kullanilmasini önleyen klinik sonuca kötü korelasyona sahiptir. Faz I klinik çalismalara giren tüm kanser ilaçlarinin yalnizca %10'u basarili bir sekilde pazara girer. Bu düsük basari orani, onkoloji ilaçlarinin maliyetinin asiri bir sekilde yüksek olmasinin ana nedenlerinden biridir; düsük basari orani, onkoloji alaninda güncel in vitro ve in vivo testlerin düsük kestirim gücüne atfedilebilir. Çok yakin zamana kadar, 2D hücre tek-katmanlarina dayanan geleneksel çalismalar, ekstraselüler matriks bilesenlerinin, hücre-iIa-hücre ve hücre-iIa-matriks etkilesimlerinin üç-boyutlu (3-D) aginda hücrelerin in vivo farklilasmasini, proliferasyonunu ve fonksiyonunu yöneten doku yapisinin, gerçekte, basitlestirilmis 2D mono-katmanli kosul altinda kaybedilmesi bakimindan bunlarin anlamli sinirlandirmalarini göstermistir. Spesifik yapinin yoklugunda ayni zamanda stromal bilesenlerin ve tümörler ile iliskili diger hücrelerin kaybinda, tümör-idamesi, baslatilmasi ve progresyonu ile iliskili tümör sinyallemesini ve yollarini çalismak için fonksiyonel analizler dogru bir sekilde çalisilamaz. Bununla birlikte, önceki teknigin modelleri, bunlarin aynen tümör mikro-ortaminda kullanilmamasi bakimindan kusurludur; bu fonksiyon kaybina ve ayrica sinyalleme sistemlerinde kullanilan hücre vasatlari içinde insan kaynakli ligandlarin yoklugundan kaynaklanan degisime de yol açabilir. Daha güncel olarak, çok sayida epitelyal insan kanserlerinde güncel küçük-molekül]ü-inhibitörlerin sinirlandirilmis basarisi, terapiye yaniti daha dogru bir sekilde tahmin etmek için, tercihen münferit kansere ve bunun essiz genetik ve epigenetik degisimlerine uygun hâle getirilmek için daha iyi teknikler gelistirme ihtiyacini vurgular. Tümör-stroma etkilesimleri uzun süredir malignitenin patojenezinde ve disseminasyonunda önemli yönler olarak fark edilmistir. Tümör idamesinde peri-tümöral dokularin rolünü destekleyen anlamli bulgular, bir kaç kanser tipinin stromasinda genetik mutasyonlarin ve terapiye direncin edinilmesinde stromal hücreler tarafindan oynanan rolün varligini içerir. Gerçek kanserin temsilcisi olmasi için bir kültürlenmis tümör için, tümörün, bu in vitro çogaldikça, bunun doku organizasyonunu ve yapisini, bunun onkojenik özelliklerini, bunun farklilasmis fonksiyonunu ve in vivo bulunabilen herhangi bir hücresel heterojenligini idame ettirmesi esastir. In vitro büyüyen insan tümörleri, yukaridaki kriterleri karsilayabildiginde ve buna ek olarak kültür içinde uzun zaman periyotlari boyunca yüksek siklikta büyütülebildiginde, bunlarin kanser biyolojisinde temel çalismalar için ayni zamanda klinik olarak ilgili testler için degerli oldugu kanitlanmalidir. Bu açiklamada saglanan çalismalar, insan tümörlerinin gerçekten de yukaridaki kriterleri in vitro karsilayabilip karsilayamadigina yönelik önemli soruya deginir. Standart primer hücre-kültür sistemlerini ve hücre-hatti temelli subkütan veya ortotopik ksenogreftleri kullanan önceki çalismalar tümör davranisini anlamada ilerlemistir; bununla birlikte, hücre hatti temelli modeller yaygin bir sekilde homojen modeller olarak tanindigindan, bu yöntemler karsinojenezi ve tümör progresyonunu modüle etmede tümör mikro-ortaminin rolünü degerlendirmede içsel sinirlandirmalara sahiptir ve bu, bunlarin bir heterojen hastaligi, örnegin, kanseri, neden yeterli bir sekilde temsil etmediginin temel nedenlerinden biridir. Aksine, mevcut açiklama, plaka üzerine insan tümörü mikro-ortamini taklit eden ve böylece kanser tedavisini farkli alanlarinda, hem tanisallarda hem de geçissel biyolojide, potansiyel uygulamalar ile sonuçlanan bir in vitro hasta ayirim araci olusturmak için bir sistemler biyolojisi yaklasimi gelistirme ile ilgilidir. Mevcut açiklama ayrica, hem tanisallar için hem de geçissel biyoloji uygulamalari için bir kaç örnek ile hipotezi dogrular. ilaveten, mevcut açiklamanin hasta ayirim aracinin kullanilmasi ayrica, otoimmün bozukluklar ve enflamatuvar hastaliklar için tanisal, eslik eden tanisal ve geçissel biyoloji uygulamalarinin gelistirilmesinde de uygulanabilir. Patent-disi literatür önceki teknik belgesi CHRIS S. HUGHES VE ARK., "Matrigelz A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture", PROTEOMICS, çogalmak amaciyla tutunma için bir yüzeye ihtiyaç duydugunu açiklar. Belirli hücreler, özellikle primer ve kök hücreler, hücreleri bir farklilasmamis hâlde idame ettirmek için spesifik kültür vasati sartlari ile birlikte özellestirilmis büyüme matriksleri kullanilmasini gerektirir. Fare tümör hücrelerinden türetilen ve Matrigel olarak ticarilestirilmis bir jelatinöz protein karisimi, bu kök hücreleri bir farklilasmamis hâlde muhafaza ettiginden, kök hücreler için bir bazal membran matriksi olarak yaygin bir sekilde kullanilir. Bununla birlikte, Matrigel, iyi-tanimlanmis bir matriks degildir ve bundan dolayi, deneysel sonuçlarda çesitliligin bir kaynagini üretebilir. Bu çalismada, bunlar amonyum sülfat çökeltmesi, boyut dislama kromatografisi ve bir-boyutlu SDS-PAGE içeren fraksiyonasyon protokolleri ile birlestirilmis bir dinamik iteratif dislama yöntemi kullanilarak Matrigel'in bir derinlemesine proteomik analizini sunar. Matrigel'in düsük kütle ve bolluk bilesenlerini tanimlama yetisi, bu yöntemin ekstraselüler matriksin analizi için yararini ayni zamanda matriksin kendisinin karmasikligini açiklar. Patent-disi literatür önceki teknik belgesi SANDRA Z HASLAM VE ARK., "Tumour- stroma interactions: Reciprocal regulation of extracellular matrix proteins and ovarian steroid activity in the mammary gland", BREAST CANCER RESEARCH, (20010802), vol. 3, no. 6, normal ve neoplastik mamari hücrelerinde hem in i/ivo hem de in vitro mamari stroma-kaynakli ekstraselüler matriks (ECM) proteinleri, integrinler ve ovaryan hormon-bagimli proliferasyon arasindaki etkilesimlere odaklanan bir incelemedir. In vitro çalismalar, fibronektinin normal mamari epitelyal hücrelerin progesteron-indüklü proliferasyonu için gerekli oldugunu ve spesifik ECM proteinlerinin ayrica büyüme faktörleri ve ovaryan hormonlar arasindaki etkilesimleri regüle ettigini de gösterir. Insan meme kanseri hücre hatlari ile çalismalar, Iamininin östrojen-indüklü proliferasyonu ve östrojen-yanit-elemani-aracili transkripsiyonu in vitro inhibe ettigini ve ayrica östrojen- indüklü proliferasyonu da in vivo inhibe ettigini göstermistir. Karsilikli olarak, ovaryan steroidler, in vivo mamari bez gelisimi sirasinda, ECM proteinlerinin ve bunlarin hücresel reseptörlerinin, integrinlerin, ekspresyonunu regüle eder. Fibronektin-spesifik integrin, 05ß1, ovaryan steroidler tarafindan regüle edilir ve bunun ekspresyonu pik proliferasyonunun gelisimsel evreleri ile pozitif bir sekilde koreledir. Bu çalismalar, ovaryan hormon yanit verilebilirliginin ve ECM/integrin ekspresyonunun koordine edilmis regülasyonunun, normal mamari bez gelisimi ve meme kanseri büyümesi ve progresyonu için kritik olabilecegini öne sürer. Patent-disi literatür önceki teknik belgesi N. E. CAMPBELL VE ARK., "Extracellular Matrix Proteins and Tumor Angiogenesis", JOURNAL OF ONCOLOGY, (20100101), ekstraselüler matriksin ve ECM proteinlerinin tümör anjiyogenezinde oynadigi role odaklanan bir incelemedir. Bir solid tümörün kütlesinin çogu, zengin bir sekilde ekstraselüler matriks ile donatilan stroma içerir. Bu matriks içinde, tümörijenik prosesleri regüle eden çok sayida proteinin ekspresyonunu ve fonksiyonunu regüle eden bir sürü matri-selüler protein vardir. Tümör büyümesi ve progresyonu için hayati olan proseslerin biri, anjiyogenezdir veya önceden var olan vaskülatürden yeni kan damarlarinin olusmasidir. Ekstraselüler matriks içinde, yapisal proteinler, bir sürü proteaz ve tümör anjiyogenezini siki bir biçimde regüle edilmis sekilde kontrol eden yerli pro ve anti-anjiyojenik faktör vardir. ESLIK EDEN SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Açiklamanin daha olay anlasilabilmesi ve pratik yürürlüge koyulabilmesi için, referans simdi, eslik eden sekillere atif ile açiklandigi üzere, emsal uygulamalara yapilacaktir. Asagidaki detayli bir açiklama ile birlikte sekiller, spesifikasyona katilir ve spesifikasyonun parçasini olusturur ve mevcut açiklamaya uygun sekilde, uygulamalari ilave açiklama görevi görür ve çesitli prensipleri ve avantalari açiklar, burada: Sekil 1, "Klinik Yanit Kestirici" teknolojisinin gelistirilmesini ve validasyonunu gösteren sematik diyagrami gösterir. Sekil 2, eksplant modelde parakrin faktörlerin önemini gösterir. Sekil 3A, eksplant modelde Ekstraselüler matriksin önemini gösterir ve 38, eksplant modelde mikro-ortamin önemini gösterir. Sekil 4A-G, mikro-ortami ve kültür içinde hasta tümörlerinin sinyalleme agini muhafaza eden otolog Iigandlari ve Ekstra Selüler Matriksi gösterir. Görüntü büyütme: 20X. Sekil 5A-C, ECM'nin bilesimini ve bunun viabilite ve proliferasyon üzerindeki etkisini gösterir. Sekil 6, farkli TPM'nin proliferasyon ve aktive eden kanser sinyalleme proteinleri üzerindeki etkilerinin karsilastirmasini gösterir. Sekil 7A-C, insan tümörü ksenogreftlerinin erken geçislerinin orijinal hasta tümörlerinin moleküler karakteristiklerini muhafaza ettigini gösterir. Sekil 8A-C, hasta tümörünün ve bundan türetilen ksenogreftin bir tümör eksplant kültür modelinde test edildiginde anti-kanser terapiye özdes yanit sonucu gösterdigini gösterir. Sekil 9A-H, TPF'nin ve Setuksimab'in hasta tümörü eksplant kültürü üzerindeki anti-tümör etkilerinin in vivo etkinlik deneyleri ile test edildigi üzere insan tümörü ksenogreftlerinin yanitina benzer oldugunu gösterir. Sekil 10, "Klinik Yanit Kestirici" modelli ilaç yanit platformunun in vivo etkinlik ile korelasyonunu gösterir. Sekil 11, "Klinik Yanit Kestirici" teknolojisinin gelistirilmesini ve validasyonunu gösteren bir sematik diyagrami gösterir. Sekil 12, Bas ve Boyun Kanserinde "Klinik Yanit Kestirici" analiz verilerinin klinik validasyonunu gösterir. M skoru, "Klinik Yanit Kestirici" kullanilarak hesaplanir ve tahmin edilen sonuç hastanin klinik sonucu ile koreledir. 60'tan daha büyük olan M-skoru, 30 hasta tümörü için elde edilir ve bu hastalarin tam yanita sahip oldugu tahmin edilir ve bu hastalarin %90'indan fazlasi gerçekten, 'ten daha küçük M-skoruna sahip olan yaklasik 29 hastanin yanit- vermeyenlerden oldugu tahmin edilir ve hastalarin %100'ü tedavi sonrasi yanit göstermemistir. Sekil 13A-S, ilaçlar veya ilaçlarin kombinasyonlari ile tedavi edilen kanser hastalari için "Klinik Yanit Kestirici" Analiz ile elde edilen etkinlik verileri gösterir. ERIFNAMENIN ETAYLI AÇIKLAMASI Mevcut açiklama, kollajen 1, kollajen 3, kollajen 4, kollajen 6, Fibronektin, Vitronektin, Kadherin, Filamin A, Vimentin, Laminin, Dekorin, Tenassin C ve Osteopontin bilesenleri içeren Bir Ekstra Selüler Matriks [ECM] bilesimi ile ilgilidir. Mevcut açiklama ayrica, ilaveten Bazal membran proteinlerinden, Sitoskeletal proteinlerden ve Matriks proteinlerinden olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla bilesen içeren bu tarz bilesim ile de ilgilidir. Mevcut açiklama ayrica, yukarida bahsedildigi üzere Ekstra Selüler Matriks [ECM] bilesimi elde etmek için bir yöntem ile de ilgilidir. söz konusu yöntem asagidakileri ECM'nin kollajen 1, kollajen 3, kollajen 4, kollajen 6, Fibronektin, Vitronektin, Kadherin, Filamin A, Vimentin, Laminin, Dekorin, Tenassin C ve Osteopontin bilesenlerini birlestirme. Mevcut açiklama ayrica, burada ECM bilesimi elde etmek için bilesenlerin ilaveten Bazal membran proteininden, Sitoskeletal proteinden ve Matriks proteininden olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla bilesen içerdigi tarzda yöntem ile de ilgilidir. Mevcut açiklama ayrica, tümör dokusunu kültürlemek için bir tümör mikro-ortam platformu ile de ilgilidir, söz konusu mikro-ortam, yukarida bahsedildigi üzere ECM bilesimi, opsiyonel olarak serum, plazma veya otolog PBMC'Ier ile birlikte kültür vasati ve ilaç içerir. Mevcut açiklama ayrica, tümör dokusunu kültürlemek amaciyla tümör mikro-ortam platformu elde etmek için bir yöntem ile de ilgilidir, söz konusu yöntem yukarida bahsedildigi üzere ECM bilesimi ile platformu kaplama ve tümör mikro-ortam platformu elde etmek için platforma opsiyonel olarak serum, plazma veya otolog PBMC'Ier ile birlikte kültür vasati ve ilaç ekleme eylemini içerir. Mevcut açiklama ayrica, tümör dokusunun organotipik kültürlenmesinin bir yöntemi ile de ilgilidir, söz konusu yöntem organotipik kültür elde etmek için tümör dokusunu yukarida bahsedildigi üzere tümör mikro-ortam platformu üzerinde kültürleme eylemini Mevcut açiklama ayrica, bir tümör süjesinin ilaca (ilaçlara) yanitini tahmin etmenin bir yöntemi ile de ilgilidir, söz konusu yöntem asagidaki eylemleri içerir: a. süjenin tümör dokusunu kültürlenmis tümör dokusu elde etmek için istem 3'te tanimlanan tümör mikro-orta platformu üzerinde kültürleme; b. kültürlenmis tümör dokusuna ilaç (ilaçlar) ile muamele etme ve analizi yürütme; c. analizin okumasini duyarlilik indeksi elde etmek için sayisal metrige dönüstürme ve böylece, süjenin ilaca (ilaçlara) yanitini tahmin etme ve d. opsiyonel olarak, duyarlilik indeksini süjenin ilaca (ilaçlara) klinik yanitina korele etme. Mevcut açiklama ayrica, bir tümör süjesinin ilaca (ilaçlara) yanitini tahmin etmenin bir yöntemi ile de ilgilidir, söz konusu yöntem asagidaki eylemleri içerir: 3. süjenin tümör dokusunu kültürlenmis tümör dokusu elde etmek için istem 3'te tanimlanan tümör mikro-orta platformu üzerinde kültürleme; b. kültürlenmis tümör dokusuna ilaç (ilaçlar) ile muamele etme; c. ilaca tümör yanitini birden fazla analizin her biri için degerlendirme skoru elde etmek amaciyla birden fazla analiz ile degerlendirme; d. birden fazla analizin her biri için bir agirlik skoru tayin etme; e. birden fazla analizin her biri için bagimsiz analiz skoru elde etmek amaciyla birden fazla analizin her birinin degerlendirme skorunu birden fazla analizin karsilik gelen analizinin agirlik skoru ile çarpma; f. duyarlilik indeksi elde etmek için birden fazla analizin her birinin bagimsiz analiz skorunu birlestirme ve böylece süjenin ilaca (ilaçlara) yanitini tahmin etme ve g. opsiyonel olarak, duyarlilik indeksini süjenin ilaca (ilaçlara) klinik yanitina korele Mevcut açiklama ayrica, anti-kanser ajan taramanin veya gelistirmenin bir yöntemi ile de ilgilidir, söz konusu yöntem asagidaki eylemleri içerir: a. süjenin tümör dokusunu kültürlenmis tümör dokusu elde etmek için istem 3'te tanimlanan tümör mikro-orta platformu üzerinde kültürleme; b. kültürlenmis tümör dokusuna ajan ile muamele etme, ajana tümör yanitini söz konusu ajanin tümör hücresi üzerindeki etkisini belirlemek için analiz ile degerlendirme. Mevcut açiklama ayrica, anti-kanser ajan taramanin veya gelistirmenin bir yöntemi ile de ilgilidir, söz konusu yöntem asagidaki eylemleri içerir: a. süjenin tümör dokusunu kültürlenmis tümör dokusu elde etmek için istem 3'te tanimlanan tümör mikro-orta platformu üzerinde kültürleme; b. kültürlenmis tümör dokusuna ajan ile muamele etme ve ilaca tümör yanitini analiz ile degerlendirme ve c. biyo-belirteçler için taramak amaciyla mikro-dizilim ve Nükleik Asit analizi yürütme. Yukaridaki ECM bilesiminin bir baska uygulamasinda, bilesim tümör spesifiktir ve burada kollajen 1, yaklasik 0,01 ug/ml ila yaklasik 100 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 5 ug/ml veya yaklasik 20 ug/ml veya yaklasik 50 ug/ml olan, konsantrasyondadir; kollajen 3, yaklasik 0,01 ug/ml ila yaklasik 100 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 0,1 tig/ml veya yaklasik 1 uglml veya yaklasik 100 ug/ml olan, konsantrasyondadir; kollajen 4, yaklasik 0,01 tig/ml ila yaklasik 500 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 5 tig/ml veya yaklasik 20 tig/ml veya yaklasik 250 tig/ml olan, konsantrasyondadir; kollajen 6, yaklasik 0,01 tig/ml ila yaklasik 500 tig/ml araliginda, tercihen yaklasik 0,1 ug/ml veya yaklasik 1 ug/ml veya yaklasik 10 ug/ml olan, konsantrasyondadir; Fibronektin, yaklasik 0,01 tig/ml ila yaklasik 750 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 5 tig/ml veya yaklasik 20 ug/ml veya yaklasik 500 ug/ml olan, konsantrasyondadir; Vitronektin, yaklasik 0,01 ug/ml ila yaklasik 95 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 5 ug/ml veya yaklasik 10 tig/ml olan, konsantrasyondadir; Kadherin, yaklasik 0,01 ug/ml ila yaklasik 500 tig/ml araliginda, tercihen yaklasik 1 pg/ml ve yaklasik 5 ug/ml olan, konsantrasyondadir; Filamin A, yaklasik 0,01 ug/ml ila yaklasik 500 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 5 ug/ml veya yaklasik 10 ug/ml olan, konsantrasyondadir; Vimentin, yaklasik 0,01 ug/ml ile yaklasik 100 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 1 tig/ml veya yaklasik 10 ug/ml olan, konsantrasyondadir; Laminin, yaklasik 0,01 ug/ml ila yaklasik 100 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 5 ug/ml veya yaklasik 10 ug/ml veya yaklasik 20 ug/ml olan, konsantrasyondadir; Dekorin, yaklasik 0,01 ug/ml ila yaklasik 100 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 10 tig/ml veya yaklasik ug/ml olan, konsantrasyondadir; Tenassin C, yaklasik 0,01 tig/ml ila yaklasik 500 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 10 tig/ml veya yaklasik 25 tig/ml olan, konsantrasyondadir ve Osteopontin, yaklasik 0,01 ug/ml ila yaklasik 150 ug/ml araliginda, tercihen yaklasik 1 ug/ml veya yaklasik 5 ug/ml olan, konsantrasyondadir. Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, söz konusu tümör dokusu, santral sinir sistemini, kemik iligini, kani, dalagi, timüsü, kalbi, mamari bezi, karacigeri, pankreasi, tiroidi, iskelet kasini, böbregi, akcigeri, ince bagirsagi, mideyi, özofagusu, overi, idrar kesesini, testisi, uterusu, stromal dokuyu ve bag dokuyu veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu içeren gruptan seçilen kaynaktan elde edilir ve tümör veya tümör dokusu, cerrahi olarak veya biyopsi ile veya ksenogreft olarak veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu ile elde edilir ve tümör veya tümör dokusu yaklasik 100 um ila yaklasik 3000 um kesitleri olan küçük parçalara bölünür. Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, yukarida-atfedilen tümör mikro-ortam platformunda, tümör dokusu, santral sinir sistemini, kemik iligini, kani, dalagi, timüsü, kalbi, mamari bezi, karacigeri, pankreasi, tiroidi, iskelet kasini, böbregi, akcigeri, ince bagirsagi, mideyi, özofagusu, overi, idrar kesesini, testisi, uterusu, stromal dokuyu ve bag dokuyu veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu içeren gruptan seçilen kaynaktan elde edilir ve tümör veya tümör dokusu, cerrahi olarak veya biyopsi ile veya ksenogreft olarak veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu ile elde edilir ve tümör veya tümör dokusu yaklasik 100 um ila yaklasik 3000 um kesitleri olan küçük parçalara bölünür; burada tümör dokusunu kültürleme yaklasik 30°C ila yaklasik 40°C araliginda, tercihen yaklasik 37°C olan, sicaklikta; yaklasik 2 ila 10 gün boyunca, tercihen yaklasik 3 ila 7 gün boyunca ve yaklasik %5'Iik COz'de yürütülür ve burada kaplama platform, plakayi, tabani, flaski, tabagi, petri-plakasini ve petri-tabagini içeren gruptan seçilir. Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, yukarida-atfedilen mikro-ortam platformu, tümör hücresinin sinyalleme aglarini idame ettirmek içindir ve bir aynen doku mikro- ortamini, hücresel yapiyi ve tümör stroma etkilesiminin bütünlügünü idame ettirmek Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, kültür vasati, yaklasik %60 ila yaklasik Medium [DMEM] veya 15 RPMI1640 [Roswell Park Memorial Institute Medium], yaklasik ag/ag %0,1 ila yaklasik %40 araliginda, tercihen yaklasik %2 olan, konsantrasyon isi ile inaktive edilmis Fötal Bovin Serumu, PBS; ag/ag yaklasik %1 ila yaklasik %2 araliginda, tercihen yaklasik %1 olan, konsantrasyonda Penisilin- Streptomisin; yaklasik 10 mM ila yaklasik 500 mM araliginda, tercihen yaklasik 100 mM olan, konsantrasyonda sodyum pirüvat; yaklasik 1 mM ila yaklasik 10 mM araliginda, tercihen yaklasik 5 mM olan, konsantrasyonda L-glutamin olan esansiyel- olmayan amino asit ve yaklasik 1 mM ila yaklasik 20 mM araliginda, tercihen yaklasik mM olan, konsantrasyon HEPES ((4-(2-hidr0ksietiI)-1-piperazinetansülfonik asit) içeren gruptan seçilir ve serum, yaklasik %0,1 ila yaklasik %10 araliginda, tercihen yaklasik %2 olan, konsantrasyondadir. Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, yukarida-atfedilen yöntemlerde, tümör mide, kolon, bas & boyun, beyin, oral kavite, meme, gastrik, gastrointestinal, özofajiyal, kolorektal, pankreatik, akciger, karaciger, böbrek, ovaryan, uterin, kemik, prostat, testiküler, gliyoblasyom, astrositom, melanom, tiroit, idrar kesesi, küçük hücreli olmayan akciger, küçük hücreli akciger, AML'yi, Akut Miyeloid Lösemiyi, CML'yi, Kronik Miyelojenöz Lösemiyi, ALL'yi, Akut Lenfositik Lösemiyi, TALL'yi, T-hücreli Akut Lenfoblastik Lösemiyi, NHL'yi, Hodgkin-disi Lenfomayi, DBCL'yi, Difüz B-hücreli Lenfomayi, CLL'yi, Kronik Lenfositik Lösemiyi ve multipl miyelomu içeren hematolojik kanserleri veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu içeren gruptan seçilir. Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, yukarida-atfedilen yöntemlerde, analiz, hücre viabilitesi, hücre ölümü, hücre proliferasyonu, tümör morfolojisi, tümör stroma içerigi, hücre metabolizmasi, senesans için analizi veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu içeren gruptan seçilir ve burada hücre viabilitesi ve hücre metabolizmasi için analiz WST analizini, ATP alim analizini ve glikoz alim analizini içeren gruptan seçilir; hücre ölümü için analiz, LDH analizini, Aktive Edilmis Kaspaz-3 analizini, Aktive Edilmis Kaspaz-8 analizini ve Nitrik Oksit Sentaz analizini, TUNEL'i içeren gruptan seçilir; hücre proliferasyonu için analiz, Ki67 analizini, ATP/ADP orani analizini ve glikoz alim analizini içeren gruptan seçilir ve tümör morfolojisi ve tümör stromasi için analiz, H&E, Hematoksilin & Eozin boyamadir veya bunlarin herhangi bir kombinasyonudur. Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, yöntem süje için tedaviye kemoterapiyi, hedeflenmis terapiyi, cerrahiyi, radyasyonu veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu içeren gruptan karar vermek için kullanilir ve burada duyarlilik indeksi, duyarlilik indeksi sirasiyla 60'tan daha büyük, 20 ila 60 arasinda veya 20'den daha küçük oldugunda, tam klinik yanita, parsiyel klinik yanita ve klinik yanit olmamasina koreledir. Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, yukarida-atfedilen yöntemlerde, birden fazla analizin her biri için bir agirlik skorunu tayin etme, kullanilan ilacin dogasina baglidir. Açiklamanin daha baska bir uygulamasinda, yukarida-atfedilen yöntemlerde, DNA'nin, RNA'nin veya mikro RNA'nin mikro-dizilimi ve Nükleik Asit analizi, ilaç muamelesinden önce ve sonra yol modülasyonunu saptamak için yürütülür ve burada mikro-dizilim ve Nükleik Asit analizi, Gerçek-zamanli PCR'i, RTPCR'I, Immüno-histokimyasal, IHC, analizi ve fosfo-proteomik profillemeyi Içeren gruptan seçilen analiz kullanilarak dogrulanir. Mevcut Yöntemin Klinik Öziti Mevcut açiklamada kullanilan protokolün genel özeti asagidaki sekilde saglanir: Birinci adim, hasta bilgilendirilmis oluru alindiktan sonra doku örnegi toplamadir ve kan örnegi toplamadir. Örnekler, IRB onayli prosedürler kullanilarak klinik isbirligi yoluyla alinir. Tümör ilgili hasta kaynagindan elde edilir edilmez, bu eksplantlar ve/veya ksenogreft tedavi yöntemine tabi tutulur. Eksplantlar tedavi yönteminde, "Klinik Yanit Kestirici", primer hasta tümöründe yanitin degerlendirilmesi için gerçeklestirilir. Alternatif olarak, tümör kaynagi bir ksenogreft oldugunda, farelerden elde edilen tümör kesip çikarilir ve ilaveten asagida tarif edildigi üzere eksplant analizine tabi tutulur. Bir baska uygulamada, tümör elde edilir ve farelere implante edilir, bunda sonra, bunun büyümesine izini verilir, akabinde bu kesilip çikarilir ve sonra mevcut "Klinik Yanit Kestirici" analize tabi tutulur. Doku örnegi elde edildikten sonra, bu a) eksplant analizinden, b) IHC (immünohistokimya)/H&E gibi histoloji temelli analizlerden çesitli girdiler ve c) primer tümör kaynakli ksenogreftlerden etkinlik analizi elde etmek için bölünür. A) Eksplant analizi için verilen doku örnegi, yaklasik 100-3000 um kalinlikli kesitler üretmek için Leica Vibratome kullanilarak dilimlenir. Bu kesitler, kanser tipi spesifik ECM bilesimi ile kapli plakalar içinde otolog serumlar ve ayrica opsiyonel olarak çesitli ilaçlar içeren vasatlar ile dört kopya hâlinde yaklasik 48- 96 saatlik bir periyot boyunca kültürlenir. Ilaç içeren ve serum/plazma/PBMC'Ier/serum kaynakli Iigandlar ile zenginlestirilmis vasatla, her 24 saatte bir degistirilir. U periyottan sonra, hücre viabilitesi yüzdesini degerlendirmek için MTTNVST analizi yapilir. Vasat kültüründen elde edilen süpernatant her 24 saatte bir uzaklastirilir ve kinetik yanit egilimlerini vermesi için (ATP'den ve glikozdan yararlanma deneyleri kullanilarak) proliferasyon ve (laktat dehidrojenaz analizlerinin ve Kaspaz-S ve Kaspaz-8 ölçümlerinin degerlendirilmesi ile) hücre ölümü için degerlendirilir. Sonuçlar bir ilaç ile muamele edilmemis kontrole karsi kantifiye edilir. Muamele edilmemis kontrole kiyasa hücre viabilitesinde/proliferasyonunda anlamli olan kayip, iIaca/kombinasyona yanitin ve ayrica arttirilmis hücre ölümünün göstergesidir. Hem muamele edilmis hem de muamele edilmemis doku kesitleri ayrica, kültür periyodunun sonunda histolojik degerlendirme için de verilir. B) Histolojik degerlendirme için verilen dokular, TUNEL ve aktive edilmis Kaspaz-3 analizi ile apoptoz için degerlendirilir. Hücre proliferasyonu ayrica, Ki67 gibi standart proliferasyon belirteçleri için de analiz edilir. H&E ayrica rutin olarak, dokunun mitotik sekillerini, nekrozunu ve genel bariz özelliklerini degerlendirmek için de gerçeklestirilir. C) Seçilen tümörler, immün-yetmez hâle getirilmis farelerde seri geçis yoluyla doku genislemesi ve idamesi amaciyla tümör bankasi üretmek için bir ksenogreft olarak immün-yetmez hâle getirilmis farelere implante edilir. Spesifik bir yaklasimda, ksenogreft çalisma, "Klinik Yanit Kestirici" yaniti valide etmek için yapilir. Ksenogreft çalisma için verilen örnek, bunu takiben ilaç etkinlik tahminine tabi tutulan primer tümör ksenogreftleri üretmek için yaklasik 3-5 immün-yetmez hâle getirilmis SCID faresine implante etmek için kullanilir. Yukarida yansitildigi üzere, ksenogreft metodoloji, rutin bir prosedür degildir, ancak mevcut "Klinik Yanit Kestirici" yanitin validasyonunun bir parçasidir. "Klinik Yanit Kestirici" yanit analizinin parçasi olarak, eksplant ve ksenogreft sisteminde test edilen kemoterapötiklerin ve hedeflenmis terapilerin, bundan tümör dokusunun elde edildigi hasta için hekim tarafindan reçete edilen rejime özdes oldugu gözlenir. Test edilen solid kanser tipine bakilmaksizin, yukarda bahsedilen ile ayni prosedür izlenir. Solid kanserlerin farkli tipleri arasinda prosedürel tek farklilik, test edilen ilaçlarin panelidir ve kapli plakanin ECM bilesimidir. ilaveten, serum kaynakli Iigandlar, eksplant modelinde test edilen her bir hasta için essizdir. Ksenogreft tümör dokusu hacmi yaklasik 500 mm3'e ulastiginda, eksplant sistemi ilaveten, dokuyu parental hasta dokusuna özdes olan eksplant sistem içinde test etme ve tüm bu preklinik okumalardan, yani, ksenogreft sistemin, eksplant sistemin ve parental hasta doku sisteminin okumalarindan, elde edilen etkinlik verilerini korele etme ile valide edilir. Primer tümör kaynakli ksenogreftler için klinik verileri ve etkinlik verileri üretmek için geçen süre, 3-8 ay arasindadir. Bununla birlikte, eksplant analizi ve histolojik degerlendirme için is dönüs süresi yaklasik 1 haftadir. D) Tüm preklinik sonuçlar, örnegin, hücre viabilitesi, apoptoz ile, sitotoksisite ile hücre ölümü ve ayrica proliferasyon durumu nihai olarak, M-skoru denilen bir tek skoru vermesi için birlestirilir. Bu M-skoru ilk olarak, bir egitim kohortu kullanilarak insa edilmistir. Düsük M-skoru klinik kosulda kötü yanitin göstergesi olurken, yüksek M-skorunun daha iyi yanita karsilik geldigi bulunur. Tümörler için M-skoru üretilirken ve klinik sonuç ile korele edilirken, bu ilaveten, ~ 100 bas ve boyun tümörünün bir validasyon kohortu kullanilarak valide edilir. sonuç terapiden yaklasik 6 ay sonra toplanir. Bundan sonra, preklinik ve klinik sonuçlardan elde edilen sonuçlar korele edilir. Ayni "Klinik Yanit Kestirici" preklinik prosedür, yanit-verenleri ve yanit-vermeyenleri tanimlamak için kullanilir ve bu çok sayida solid kanserde klinik sonuç ile karsilastirilir. Emsal bir yöntemde, "Klinik Yanit Kestirici" için analizler ile baglantili olarak, doku örnekleri ayrica, tümörün biyolojisi anlamak amaciyla tümör dokusunun genetik materyalini belirlemek için de degerlendirilebilir. Tümör dokusu RNA ve miRNA mikro- dizilim analizini, spesifik mutasyonlar için gen analizini, DNA'nin ekzon dizilemesini ve Genetik profillemeyi degerlendirmek için nükleik asit izolasyonuna tabi tutulur. Emsal bir yöntemde, ilaç gelistirme/tümör imzasi/ilaç direnci ve eslik eden tanisallar asagidaki sekilde yapilir. Muamele edilmemis tümör örneklerinin genetik profilini muamele edilmis örneklerinki ile karsilastirma ile, ilaç muamelesinden dolayi etkilenmis yollar için çikarim yapilir. Toplam mRNA profiline bakma ile, tedavinin bir sonucu olarak modüle edilmis yollar ve bunun ilaç yaniti üzerindeki etkisi korele edilir. Yanit-verenlerin ve yanit-vermeyenlerin DNA dizisi, yanit veya yanit-vermeme için bir imza almak için karsilastirilir. Bu sekilde, her bir sonuç için bir imza için çikarim yapilir. Ilaç direnci durumunda, genetik materyal, eksplantlarda dirençli hücrelerden izole edilir ve direnç arkasindaki biyolojiyi anlamak için muamele edilmemis örnekler ile karsilastirmada yol modülasyonuna bakilir. Eslik eden tanisallarin gelistirilmesi için, eksplant okumasi, yanit-verenleri ve yanit-vermeyenleri ayirt etmek için kullanilir ve altta yatan genetik bilgi bunu, bu özel ilaç tedavisi için bir eslik eden tanisal olarak kullanilmasi amaciyla genetik imzaya indirmek için kullanilir. Emsal bir yöntemde, "Klinik Yanit Kestirici" avantajlarinin biri, ayni zamanda tümör- stroma etkilesiminin bütünlügünü korurken, aynen doku mikro-ortamini ve hücresel yapiyi idame ettirme yetisidir. Bu, bu biyofiziksel ve biyokimyasal baglamda, hücrelerin hakiki doku ve organ özgüllügü göstermesidir. Burada, eksplant kültürün hücresel yapiyi ve mikro-ortami idame ettirmek için doku kesitleri kullanilan bir yöntemi tarif edilir. Kültür vasatlarina ayrica ilave olarak, natif ortama benzeyen fizyolojik olarak ilgili sinyalleme yollarini taklit etmek için hasta kaynakli ligandlar da takviye edilir. Ilave olarak, eksplant test etme platform sistemi, bu kanser tipine spesifik olan ECM bilesiminden yararlanir. Bu sekilde, eksplant sistemi, mümkün oldugu kadar yakin bir sekilde, natif konak ortamini taklit eden bir sistemdir. Bu essiz sistem bizim, tümör ortami içinde tümör sinyallemesi ve spesifik yollari hedef alan küçük moleküllü inhibitörlerin etkisi ile ilgili spesifik sorulara deginmemize olanak saglar. Emsal bir yöntemde, hastanin tümör mikro-ortamini taklit eden lokal tümör mikro- ortaminin in vitro olusturulmasinin yöntemi gerçeklestirilir. Hem tümör dokusunun hem de stromal dokunun uzun süreli organotipik kültürlenmesi için yöntem gerçeklestirilir, burada söz konusu kültür fizyolojik olarak ilgili sinyalleme sistemlerini taklit eden insan efektörleri ve anjiyojenik faktörler içeren bir organotipik kültür yapilir. Organotipik kültür içinde, tümör dokusu bas & boyun (HNSCC), beyin, oral kavite, meme, gastrik, özofajiyal, kolorektal (CRC), pankreatik, akciger, karaciger, böbrek, ovaryan, uterin, kemik, prostat, testiküler ve insan veya hayvan orijinli baska doku tümörlerini içeren solid tümörlerinden ayni zamanda Akut Miyeloid Lösemiyi (AML), kronik miyelojenöz lösemiyi (CML), Akut Ienfositik lösemiyi (ALL), T-hücreli akut lenfoblastik lösemiyi (TALL), Hodgkin-dusu lenfomayi (NHL), difüz B-hücreli lenfomayi (DBCL) ve kronik söz konusu dokuyu ekstra selüler proteinleri bir kokteyli veya bas & boyun, oral kavite, meme, over, uterus, gastro-intestinal, kolorektal, pankreatik, prostat, gliyoblastom, astrositom, melanom, tiroit, böbrek, idrar kesesi, küçük hücreli olmayan akciger, küçük hücreli akciger, karaciger, kemik ve insan veya hayvan orijinli baska doku kanserlerinden olusan gruptan seçilen bir doku tipinden elde edilen kanser evresine ve tipine spesifik olan tanimlanmis Ekstra Selüler Matriks ile önceden-kaplanmis plakalar içinde kültürleme ile tümör dokusu viabilitesini ve sinyalleme agini idame ettirmek Bir baska uygulamada, organotipik kültüre, insan serumundan izole edilmis Iigandlar takviye edilir, burada serum otolog insan serumudur, heterolog insan serumudur. ilaveten, organotipik kültüre, otolog insan serumu veya heterolog insan serumu veya otolog insan plazmasindan izole edilmis Iigandlar veya heterolog insan plazmasindan izole edilmis Iigandlar veya otolog insan kanindan izole edilmis Iigandlar veya heterolog insan kanindan izole edilmis Iigandlar veya insan-olmayan serumdan, plazmadan veya kandan izole edilmis Iigandlar veya otolog kandan izole edilmis PBMC'Ier takviye edilir. Daha baska bir uygulamada, organotipik kültüre ayrica, insan kanindan izole edilmis immün faktörler de takviye edilir, öyle ki bu otolog insan anindan veya heterolog insan kanindan elde edilir. Organotipik kültüre, otolog insan plazmasi veya heterolog insan plazmasi veya otolog insan kani veya heterolog insan kani veya insan-olmayan serumdan, plazmadan veya kandan izole edilmis immün faktörler takviye edilir. Organotipik kültüre ayrica, insan serumundan, örnegin, otolog insan serumundan, heterolog insan serumundan, izole edilmis anjiyojenik faktörler de takviye edilir. Organotipik kültüre, insan-olmayan serumdan, plazmadan veya kandan izole edilmis anjiyojenik faktörler veya piyasada satilan anjiyojenik faktörler takviye edilir. Daha baska bir yöntemde, söz konusu organotipik kültür içindeki doku, kültür içinde 7 günden daha uzun bir süre boyunca canlidir. Söz konusu kültür kosullari ve tümör dokusu ayrica, sinyalleme aglarini çalismak için de kullanilir. ilaveten, organotipik kültür içindeki tümör dokusu kesip çikarilir ve maksimal doku viabilitesini idama ettirmek için islenir. Söz konusu organotipik kültür ayrica, kanser hücrelerinin taranmasi, kültürü ve ex vivo genislemesi için de kullanilir. Bir baska uygulamada, elde edilen organotipik kültürün ilave islenmesi ve dondurarak-saklanmasi da yapilir. Bir baska yöntemde, mevcut tümör mikro-ortaminin uygulanmasi, tetkik edilmekte olan hasta için optimal tedavi opsiyonunun seleksiyonundadir. Tümör mikro-ortami ayrica, - tetkik edilmekte olan hasta için anti-kanser ilaçlarin seleksiyonunda, tetkik edilmekte olan hasta için seçilmis ilaçlar ile birlestirilmesi için anti-kanser ilaçlarin seleksiyonunda, hasta için kemoterapi, hedeflenmis terapi, cerrahi, radyasyon veya bunlarin bir kombinasyonu arasindan tedavi opsiyonuna karar vermede, hastanin kemoterapiye, hedeflenmis terapiye, cerrahiye, Radyasyona veya bunlarin bir kombinasyonuna yanit verip vermeyecegine karar vermede, tetkik edilmekte olan kanser hastasinin tedavisi için kanser-disi ilaçlarin seleksiyonunda - da kullanilir. Bir baska yöntemde, mevcut tümör mikro-ortaminin uygulanmasi anti-kanser ilaçlarin gelistirilmesindedir. Tümör mikro-ortami ayrica, tetkik edilmekte olan anti-kanser ilacinin bunun için optimal aktiviteye sahip oldugu kanser tiplerini tanimlamak için, optimal aktivite saglamak için tetkik edilmekte olan anti-kanser ilaç ile birlestirilebilen optimal bakim standardi ilaçlarini tanimlamak için, optimal aktivite saglamak için tetkik edilmekte olan anti-kanser ilaç için optimal dozlari tanimlamak için, optimal aktivite saglamak için tetkik edilmekte olan anti-kanser ilaç ile birlestirilebilen bakim standardi ilaçlar için optimal dozlari tanimlamak için, tek basina veya bakim standardi ilaçlar ile kombinasyon hâlinde optimal aktivite saglamak için tetkik edilmekte olan anti-kanser ilacin uygulanabilecegi optimal hastalari tanimlamak için anti-kanser ilaçlarin pre-klinik veya klinik gelisiminde - de kullanilir. Bir baska yöntemde, mevcut tümör mikro-ortaminin uygulanmasi, kemoterapileri, hedeflenmis ilaçlar için eslik eden tanisal testlerin gelistirilmesindedir. Tümör mikro- ortami ayrica, - kemoterapötikler veya biyolojikleri içeren hedeflenmis ilaçlar için "yanit- verenleri ve yanit-vermeyenleri" tanimlamak, kemoterapötige veya biyolojikleri içeren hedeflenmis ilaçlara yanit vermesi olasi olan hastalari önceden-seçmek için bir fonksiyonel eslik-eden tanisal test olarak, kemoterapötige veya biyolojikleri içeren hedeflenmis ilaçlara yanit vermesi olasi olan hastalari önceden-seçmek için eslik-ede tanisal test gelistirmek için kullanilan, kemoterapötikler veya biyolojikleri içeren hedeflenmis ilaçlar için bu sekilde seçilmis "yanit-verenleri ve yanit-vermeyenleri" moleküler profilleme için, kemoterapötikler veya biyolojikleri içeren hedeflenmis ilaçlar için eslik-eden tanisal testlerin gelistirilmesinde - de kullanilir. Daha baska bir yöntemde, mevcut hasta ayirim aracinin uygulanmasi ayrica, otoimmün hastaliklar ve enflamatuvar bozukluklar için ilaçlarin gelistirilmesindedir ve otoimmün hastaliklar ve enflamatuvar bozukluklar için kullanilan ilaçlar için eslik-eden tanisal testlerin gelistirilmesindedir. Bir baska örnekte, spesifik belirteçlerin varligi için tümör hücrelerini taramak, burada yöntem, IHC'yi ve diger teknikleri içerir ve söz konusu hücrelerin viabilitesini belirlemek, burada büyüme ve proliferasyon tümör durumunun göstergesidir, için bir yöntem Bir baska yöntemde, bunlarin tümör üzerindeki etkisi için ajanlari taramak için bir yöntem sunulur, burada yöntem aday ajanlari bir kültür ile temas ettirme ve söz konusu ajanin söz konusu kültür içinde tümör hücreleri üzerindeki etkisini belirleme eylemini Bir baska örnekte, yukarida-bahsedilen yöntemler/uygulamalar, insan orijinden veya hayvan orijinden elde edilen doku kesiti kullanir. Ilaveten, söz konusu doku, santral sinir sisteminden, kemikten, ilikten, kandan (örnegin, monositler), dalaktan, timüsten, kalpten, mamari bezlerden, karacigerden, pankreastan, tiroitten, iskelet kasindan, böbrekten, akcigerden, ince bagirsaktan, mideden, özofagustan, overden, idrar kesesinden, testisten, uterustan veya bag dokudan elde edilir. Devaminda, yukardaki yöntemlerde, söz konusu hücreler, kök hücrelerdir veya hücreler birden fazla organdan elde edilir veya hücreler bir saglikli organdan veya organlardan elde edilir veya hücreler bir hastalikli organdan veya organlardan elde edilir veya hücreler genetik olarak degistirilmistir veya hücreler bir transgenik hayvan organindan elde edilir. Bir baska örnekte, mevcut açiklama tümör hücrelerini spesifik belirteçler için taramak için - süjenin tümör dokusunu istem 3'te tanimlanan mevcut tümör mikro-ortam platformu üzerinde kültürleme ve birden fazla analizin her biri için degerlendirme skoru elde etmek için birden fazla analiz ile ilaca tümör yanitini degerlendirmek için kültürlenmis tümör dokusuna ilaç (ilaçlar) ile muamele etme - eylemini içeren bir yöntem ile ilgilidir. Bundan sonra, mRNA'nin ve mikro RNA'nin mikro-dizilim analizi, varsayimsal biyo-belirteçleri tanimlamak için tedavi-öncesi profile kiyasla tedavi sonrasi yol modülasyonunu saptamak için yapilir; ayni hedeflerin konfirmasyonu, RT-PCR ve Asagidaki deneyler ilaveten, mevcut açiklamanin yönlerini detaylandirir ve açiklar. Bununla birlikte, bu örneklerin mevcut açiklamanin kapsamini sinirlandirdigi seklinde anlam çikarilmamalidir. ÖRNEKLER Mevcut açiklama, asagidaki açiklayici örnekler yoluyla bulusun çesitli yönlerini sunar, burada örnek 1, mevcut "Klinik Yanit Kestirici" analizde kullanilan hücre plakalari üzerinde uygun ECM bilesiminin preparasyonu ve kaplamasi ile ilgilidir. "Klinik Yanit Kestirici" analiz sisteminin düzenegi Örnek 2'de detaylandirilir. Örnekler 1 ve 2 ayrica, mevcut analiz için plakalari kanser spesifik ECM ile kaplamanin ve mevcut "Klinik Yanit Kestirici" proseste serum kaynakli ligandlari eklemenin önemini de açiklar. Örnek 3, Eksplant protokolü (yani, "Klinik Yanit Kestirici" protokol) saglar, burada tümör dokusunun kaynagi, hastadan veya bunun ksenogreftinden elde edilebilir ve ksenogreft tümör dokusu üretmenin metodoloji Örnek 4'te saglanir. Örnek 5, "Klinik Yanit Kestirici" Analiz ile elde edilen sonuçlari valide etmek için, SCID/çiplak farelerin tümör ksenogreftlerinde ilaçlarin terapötik etkinligini belirlemek için kullanilan protokolü sunar. Akabinde, "Klinik Yanit Kestirici" sistem, Örnek 6'da açiklandigi üzere preklinik validasyona ve Örnek 14'te klinik validasyona tabi tutulur. "Klinik Yanit Kestirici" Analiz'de kullanilan analizlerin protokolleri Örnek 7'de saglanmistir ve M skoru kavrami Örnek 8'de sunulur. "Klinik Yanit Kestirici" sistem ilaveten, Örnekler 9'da, 13'te ve 14'te çok sayida solid kanserin yanitini tahmin etmek için test edilir. Örek 10, mevcut analizi valide etmek için klinik sonuç ile elde edilen sonuçlari karsilastiran tüm "Klinik Yanit Kestirici" protokolü gösterir. Örnek 11 ve 12, mevcut "Klinik Yanit Kestirici" analizin sirasiyla biyo-belirteçlere, hücre hatlarina kiyasla daha iyi bir yanit kestirici oldugu durumu göstermek için deneysel veriler saglar. Örnek 1: Hücre Plakalari üzerinde Uygun ECM Bilesiminin Preparasvonu ve Kaplamasi: Tümörün kaynagi, hastadan standart protokoller ile türetilen primer tümör dokusudur. Alternatif olarak, primer insan tümör dokusu, çesitli solid kanserler için primer insan tümörü ksenogreftleri üretmek için immün-yetmez hâle getirilmis SCID farelerine subkütan olarak implante edilir. Yaklasik 1000 mm3'lük tümör hacmi ölçümünü takiben, tümör ksenogreftten kesip çikarilir. ECM, asagida saglanan protokole göre hasta tümöründen veya ksenogreft tümör dokusundan izole edilir. Insan ECM'sinin izolasyonu ve bunun karakterizasyonu: Cerrahi olarak uzaklastirilmis taze tümör dokulari diseke edilir, 1-2 mm'lik kesitlere kesilir ve dispaz çözeltisi (Stem cell Technologies Inc.) içinde süspanse edilir ve 4 mM EDTA, 2 mM N-etilmaleimid ve proteaz (Roche) ve fosfataz inhibitörleri (Sigma) içeren bir yüksek tuz tamponu çözeltisi içinde homojenize edilir. Homojenize edilmis karisim, 7000 g'de 15 dk boyunca sentrifüj edilir ve süpernatant dökülür. Pelet, 2 M üre gece boyu karistirilir. Karisim akabinde son olarak, 14.000 g'de 20 dk boyunca sentrifüj edilir ve 2 M üre tamponu içinde yeniden-süspanse edilir ve alikotlar hâlinde -80°C'de saklanir. Protein tahmini, kantifikasyon için izole edilmis ECM proteinlerinin miktarini tahmin etmek için DC protein analiz kiti (modifiye edilmis Lowry, Bio-Rad) kullanilarak yapilir. Doku kültürü tabaklarinin kaplanmasi, protein ekstraktlari ile 37°C'de 3 sa boyunca gerçeklestirilir. Farkli endikasyonlar için çesitli tümör dokusundan ECM izolasyonunu takiben, bu ECM'Ierin bilesimi kütle spektrometrisi ile analiz edilir, bunun sonuçlari Tablolar 1A ila 1G'de gösterilir. Farkli primer tümörlerden (HNSCC, mide, pankreatik ve kolon kanserlerinden) izole edilmis Ekstra Selüler Matriks'in farkli bilesimlerinin dagilimi ve bollugu Tablolar 1A ila 1G'de sunulur. Örnekler saflastirilir ve LCMS analizine tabi tutulur. Majör matriks proteinlerinin bollugu her bir tümör tipi için gösterilir. Yukarida- bahsedilen tablolarda açiklandigi üzere, ECM kaplama için gerekli olan bilesenler her bir kanser tipine spesifiktir. Dolayisiyla, yukaridaki tüm veriler, spesifik tümör/kanser tipine yönelik gözler üzerine kaplanacak olan ECM'nin bilesimini tanimlamaya yardimci olur. ECM karisimi içinde gerekli olan bilesenlerin konsantrasyonlari, 1A ila 1G arasindaki tablolarin bir özeti olan, asagidaki Tablo 1'de saglanir. Tablo 1: ECM bilesiminin bilesenlerinin konsantrasyonu S.No Hu-ECM Listesi Kaplama konsantrasyonu (uglml) 1 kollajen1 yaklasik 0,01 ila yaklasik 100, tercihen yaklasik 5, S.No Hu-ECM Listesi Kaplama konsantrasyonu (pg/ml) yaklasik 20 ve yaklasik 50 yaklasik 0,01 ila yaklasik 100, tercihen yaklasik 0,1, 2 kollajen3 yaklasik 1, yaklasik 10 ve yaklasik 100 yaklasik 0,01 ile yaklasik 500, tercihen yaklasik 5, 3 kollajen4 yaklasik 20 ve yaklasik 250 yaklasik 0,01 ila yaklasik 500, tercihen yaklasik 0.1, 4 kollajenö yaklasik 1 ve yaklasik 10 yaklasik 0,01 ila yaklasik 750, tercihen yaklasik 5, FM yaklasik 20 ve yaklasik 500 yaklasik 0,01 ila yaklasik 95, tercihen yaklasik 5 ve 6 VN yaklasik 10 yaklasik 0,01 ila yaklasik 500, tercihen yaklasik 1 ve 7 Kadherin yaklasik 5 yaklasik 0,01 ila yaklasik 500, tercihen yaklasik 5 ve 8 FilaminA yaklasik 10 yaklasik 0,01 ila yaklasik 100, tercihen yaklasik 1 ve 9 Vimentin yaklasik 10 yaklasik 0,01 ila yaklasik 100, tercihen yaklasik 5, Laminin yaklasik 10 ve yaklasik 20 yaklasik 0,01 ile yaklasik 100, tercihen yaklasik 10 11 Dekorin ve yaklasik 20 yaklasik 0,01 ila yaklasik 500, tercihen yaklasik 10 12 Tenassin C ve yaklasik 25 yaklasik 0,01 ila yaklasik 150, tercihen yaklasik 1 ve 13 Osteopontin yaklasik 5 Primer donör tümörü ile karsilastirildiginda farkli tiplerdeki primer ksenogreft tümörlerinin ECM'sinin degerlendirilmesi sonrasinda, kaplama deneyleri ayrica, ayni tipteki solid kanserden (örn., Kolondan) elde edilen, ancak farkli primer tümör ksenogreftlerinden (farkli primer donörlerden) izole edilmis ECM'Ieri test etmek için de gerçeklestirilir. Farkli bir sekilde kaplanmis ECM plakalari ayrica, bunlarin eksplantlarda test edilen dokular için destek/iskele saglama yetisi açisindan da analiz edilir. Yukaridaki tüm veriler, bir spesifik tümör/kanser tipine yönelik plaka üzerine kaplanacak olan nihai ECM'ye ulasmak için toplayip siralanir. Farkli bir sekilde kaplanmis ECM Matriksi'i üzerinde tümör dokularinin viabilitesi, %5'lik COz'de 37°C'de yaklasik 3 ila yaklasik 7 günlük bir periyot boyunca izlenir. Tablo 1A: MIDE Asagidaki tablo, ECM'nin gastrik tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Aralik %'Si 1 81 Kollajen-alfa-1 (I) zinciri O.7-49.5 2 82 Kollajen-alfa-Z (I) zinciri 0.4-39.8 7 836 Tüberin izoformu 5 O.3-35.8 8 837 Protokadherin alfa-8 izoformu 1 öncülü O.9-6.3 9 838 Protokadherin alfa-8 izoformu 2 öncülü 0-35 1 C1 Aktin, sitoplazmik 1 02-25 2 C2 Aktin, sitoplazmik 2 04-37 3 CB Aktin, bir kardiyak kas 2-33.? 4 C4 Aktin, bir iskelet kasi 0.2-21.3 Asagidaki tablo, ECM'nin gastrik tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Sitokeratin, tip 1 Sitokeratin, tip 2 Aktin, aortik düz kas 1 Aktin, gama-enterik düz kas izoformu 2 Aktin, aortik düz kas 2 Distonin Protein 8100-A8 Anneksin A1 Protein 8100-A9 Hiyalüronan sentaz 2 MICAL C-ucu-benzeri protein Klor kanali CLIO-benzeri protein 1 GDNF familyasi reseptörü alfa-1 Rab proteinleri geranilgeraniltransferaz bileseni A 1 Bazonüklin-1 Ökaryotik translasyon baslatma faktörü 2- alfa kinazi 4 Diaçilgliserol kinazi delta AMSH-benzeri proteaz Tau-tübülin kinazi 1 Rho-iliskili protein kinazi 2 Aralik O.2-11.3 1-20.3 345.1 2.8-12.8 0.2-8.6 O.1-6.6 146.6 02-23.? 09-25.? O.9-30.9 O.9-13.8 O.8-5.2 O.8-18.3 O.7-6.1 0.6-26 Asagidaki tablo, ECM'nin gastrik tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad NAD-bagimli deasetilaz sirtüin-1 Glikojen fosforilaz, beyinden OksisteroI-baglama proteini 1 Histon H4 POTE ankirin alan familya üyesi F POTE ankirin alan familya üyesi E POTE ankirin alan familya üyesi l izoformu 2 Karakterize edilmemis protein Serum albümin preproproteini AIfa-1-asit glikoprotein 1 öncülü Immünoglobülin süper-familya Limkain-b1 izoformu 1 Limkain-b1 izoformu 3 Limkain-b1 izoformu 2 Büyüme proteini 2 inhibitörü Hemoglobin alt-birimi gama-2 alt-birimi Hemoglobin epsilon sapiens] Hemoglobin alt-birimi delta Hemoglobin alt-birimi beta Hemoglobin alt-birimi gama-1 Aralik %'si O.5-3.6 0.2-8 0.7-6 0.7-7.6 0.1 -5.2 O.4-8.1 0.2-14 O.2-20.4 0.1-9 0.1-9 0.1-9.2 0.1-9.9 O.5~4.6 O.5-18.6 O.5-22.5 O.5-17.2 O.5-31.1 Asagidaki tablo, ECM'nin gastrik tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad 202224 Ubikuitin-benzeri modifiye edici-aktive eden NudC alani-içeren protein 2 Apoptojenik protein 1, mitokondriyal Ribozom-baglama proteini Protein C150rf2 Ribozomal L1 alani-içeren protein 1 Guanin nükleotidi-baglama proteini KrueppeI-benzeri faktör T hücresi reseptörü beta zinciri Tablo 1B: CRC Aralik %'si 0.2-36.6 O.2-8.6 0.8-30.4 0.1 -21 O.9-51.4 O.8-38.3 0.1-14.3 0.1-5 Asagidaki tablo, ECM'nin kolorektal tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Miyozin 1 Miyozin 9 Fibronektin Izoformu 9 Fibronektin Izoformu 10 Fibronektin izoformu 4 preproproteini Dezmoplakin Izoformu DPI Elastin mikrofibril ara yüzleyici 1 Aralik %'si O.3-25.5 O.2-12.4 O.4-20.7 0.3-23.1 0.2-11.2 0.1-15.6 02-33.? 0-1 1.6 Asagidaki tablo, ECM'nin kolorektal tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Obskürin izoformu b Obskürin izoformu a CAP-Gly alani-içeren baglayici protein izoformu 2 CAP-Gly alani-içeren baglayici protein izoformu 1 Obskürin-benzeri protein 1 izoformu 1 öncülü Obskürin-benzeri protein 1 izoformu 2 öncülü Obskürin- benzeri protein 1 izoformu 3 öncülü KOIlajen-alfa-1 (l) zinciri Kollajen-alfa-Z (I) zinciri Kollajen-alfa-3 (VI) zinciri izoformu 1 Kollajen-alfa-1 (III) zinciri Protokadherin alfa-8 izoformu 1 öncülü Protokadherin alfa-8 izoformu 2 öncülü Kollajen-alfa-6(lV) zinciri izoformu B öncülü Kollajen-alfa-6(IV) zinciri izoformu A öncülü Kollajen, tip XXll, alfa 1 StabiIIn-2 öncülü Semaforin-4G izoformu 1 SemaforIn-4G izoformu 2 Aralik %'si O.2-4.8 0.1-5 0.1-13.5 0.1-17.4 1 .1-28.3 0.9-42.8 O-22.5 O.9-36.7 0.6-9.2 4.6-5.7 O.8-5.2 O.3-2.3 0.4-1.9 0.1 -14.5 0.1-3.5 O.2-13.8 O.2-22.7 Asagidaki tablo, ECM'nin kolorektal tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Protokadherin Yagi 1 öncülü Tetraspanin-1 1 K0llajen-alfa-1 (XX) zinciri Aktin, sitoplazmik 1 Aktin, sitoplazmik 2 Aktin, bir iskelet kasi Tübülin-a Tübülin, b Sitokeratin, tip 2 69 KDa'luk protein Koronin 1 A Baglanti plakoglobini FilamIn-A Izoformu 1 Vimentin Plastin 2 Kalmodulin Varsayimsal çinko parmak protein 137 Deforme edilmis epidermal oto-regülatör faktör 1 homologu Aralik %'si O.2-30.9 0.1 -1 9.2 0.1 -23.8 O.3-29.9 O.3-14.8 1 .1-35.2 O.5-17.7 0.3-24.8 O.3-9.9 O.9-15.8 02-255 O.2-22.4 O.2-37.8 O.5-13.6 0.1-18.7 O.5-25.9 06-166 Asagidaki tablo, ECM'nin kolorektal tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad GIiseraldehit-S-fosfat spesifik R30 Transkripsiyon faktörü MAFK 6 R31 Triptofan 2,3-di0ksijenaz 7 R32 Eritroid membran-iliskili protein 8 R33 Alkildihidroksiasetonefosfat sentaz 9 R3? Kalsiyum-baglama mitokondriyal tasiyici protein R74 Rho-iliskili protein kinazi 2 11 R79 Tripsin-1 preproproteini 12 R83 Kromo-aIan-helikaz-DNA-baglama proteini 7 HMG kutu transkripsiyon faktörü BBX izoformu 13 RSS 1 14 R87 Pleckstrin homoloji alani-içeren familya R88 Ekzonükleaz GOR 16 R89 Nörobea kin izoformu 1 17 R90 Nörolize edilmis-benzeri protein 2 19 R92 E3 ubikuitin-protein ligazi NEDD benzeri R93 Çinko parmak proteini 84 izoformu 1 21 R94 Kalsiyum homeostaz ER proteini 22 R95 DNA primaz büyük alt-birimi 23 R96 Rho GTPaz-aktive eden protein 22 24 R97 Protein Niban izoformu 2 dehidrojenaz, Aralik %'si O.6-5.4 O.5-8.8 O.2-14.6 O.2-15.4 O.3-17.3 O.6-18.1 O.3-32.9 0.1-10.1 O.2-21.9 O.3-33.8 O.4-18.9 0.4-1 1.2 03-25.? O.3-27.8 0.1 -22.9 O.2-9.5 O.2-20.4 O.9-28.6 O.4-38.8 Asagidaki tablo, ECM'nin kolorektal tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad sarili-sarmal, ANK tekrari ve PH alani-içeren protein 3 ile ARF-GAP Serin proteazi HTRA1 Fas apoptotik inhibitör molekül Aspartat aminotransferaz, sitoplazmik Mitojen-aktive edilmis protein kinazi kinazi kinazi 4 izoformu b Protein kinazi C delta Hb alt-birimleri (alfa) lg a-1 zinciri C bölgesi Karakterize edilmemis protein Serum albümin preproproteini Hemoglobin alt-birimi delta Hemoglobin alt-birimi beta Hemoglobin alt-birimi gama-1 Paraneoplastik antijen-benzeri protein 68 Paraneoplastik antijen-benzeri protein 6A Ribozom biyojenez proteini BRX1 Krueppel-benzeri faktör Max-benzeri protein X Izoformu gama Ribonükleoprotein PTB-baglama 1 ATP-baglama kaseti alt-familyasi G üyesi 8 Aralik %'si O.2-11.7 0.3-162 0.1-16 O.2-22.2 0.1-9.9 O.2-15.2 0.1 -27.8 0.3-175 O.7-14.2 0.1-17.4 0.1-28.5 0.1-15.2 0.1-16.1 O.5-16.1 0-15.4 0.3-19.4 0.5-13 O.3-9.3 0.1-13.0 Asagidaki tablo, ECM'nin kolorektal tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Hücre bölünme siklusu 7 homologu Hipotetikal protein LOC254778 Fosfat tasiyici protein, mitokondriyal izoform b TANK-baglama kinazi 1-baglama protein 1 KRT8P11, keratin 8 psödo-geni 11 Radikal SAM alani-içeren mitokondriyal öncül Tablo 1C: CaBr protein Aralik %'si 0.9-3 0.1 -23.6 0.5-18.1 0.1-27.8 0.1-26.2 0.9-7 0.3-20 O.5-8.4 Asagidaki tablo, ECM'nin meme tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Troponin C, iskelet kasi Lümikan Dekorin izoformu c Dekorin izoformu a K0llajen-alfa-1 (l) zinciri Kollajen-alfa-2 (I) zinciri Kollajen-alfa-3 (VI) zinciri izoformu 1 Aralik %'si 0.1-11.9 05-26.? 0-14.2 0.4-6 0.8-43.6 0.1-40.9 0.3-259 Asagidaki tablo, ECM'nin meme tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Kollajen-alfa-3 (VI) zinciri Izoformu 4 Kollajen-alfa-2 (VI) zinciri Izoformu 2C2 Kollajen-alfa-Z (VI) zinciri Izoformu 202A' Kollajen-alfa-2 (VI) zinciri Izoformu 202A K0llajen-alfa-1 (III) zinciri Kollajen-alfa-3 (VI) zinciri Izoformu 5 Kollajen-alfa-1 (XII) zinciri uzun izoformu KOIlajen-alfa-1 (XII) zinciri kisa izoformu Kollajen-alfa-1 (XIV) zinciri Kollajen-alfa-1 (VI) zinciri Fermitin familyasi homologu 3 Ventriküler zon-eksprese edilmis PH alani-içeren protein homologu 1 izoformu 1 Protokadherin gama-BG izoformu 2 Protokadherin gama-86 izoformu 1 Ventriküler zon-eksprese edilmis PH alani-içeren protein izoformu 1 Ventriküler zon-eksprese edilmis PH alani-içeren protein homologu 1 izoformu 2 Transmembran protein 630 Von Willebrand faktörü, tip C Aktin, gama-enterik düz kas izoformu 1 öncülü Sitokeratin, tip 1 Aralik %'si O.1-15.8 0.5-35.2 0.4-14.9 0.5-39.8 0.4-12.6 0.8-6.6 0.2-4.5 0.6-14.4 0.1-14.3 0.6-23.8 0.5-11.5 0.1-8.4 0.1-17.4 1-8.? 0.9-6.9 0.7-8.3 2.1-8 0.9-48 0.9-26 Asagidaki tablo, ECM'nin meme tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Sitokeratin, tip 2 Vimentin Vinkülin izoformu meta-VCL Vinkülin izoformu VCL Fostensin Dis yogun lif proteini 2 Fru ktoz bifosfatealdolaz A Pirüvat Kinazi OIfaktomedin-4 Anneksin A1 KreatinKinazi M-tip Poliribonükleotid nü kleotidiltransferaz 1, mitokondriyal öncül Deforme edilmis epidermal oto-regülatör faktör 1 homologu Insülin-benzeri büyüme faktörü ll Fumarat hidrataz, mitokondriyal öncül Nükleer reseptör ko-aktivatörü 5 Protein BEX5 Protein THEMIS Aralik %'si 3.0-51 0.3-15 0.1-22.3 0.2-12.2 0.8-13.8 1-14.? 0.2-6.2 0.5-8 1.6-152 0.7-15.4 0.5-9.3 2.2-10 0.5-13.6 0.1-11.3 0.4-13 0.2-8.9 0.3-6.6 0.9-9.3 1-13.8 0.2-9.8 Asagidaki tablo, ECM'nin meme tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Oligodendrosit transkripsiyon faktörü Sodyum kanali protein tip 8 alt-birimi alfa Transkripsiyon faktörü HIVEP2 Serin/treonin-protein kinazi SMG1 Varsayimsal Ras GTPaz-aktive eden protein 4B Ras GTPaz-aktive eden protein 4 Hümanin-benzeri protein 3 Homeobox proteini NkX-6.1 Sepiapterin redüktaz Adenilat siklaz 3 Histon H1 Karakterize edilmemis protein Serum albümin preproproteini 398 ribozomal protein L20 Varsayimsal karakterize edilmemis SMG1- benzeri protein Kardiyotrofin-benzeri sitokin benzeri 1 izoformu 1 Ankirin tekrar alani 138 Lösin-açisindan zengin tekrar LGI familyasi üyesi 2 öncülü NudC alani-içeren protein 2 Apoptojenik protein 1, mitokondriyal Aralik %'si 05-17.? O.1-9.2 0.9-10 1-20.1 0.7-8.7 0.3-13.7 1.6-8 2-1 6.9 3.2-16.9 1-9.4 0.3-9.8 0-14.9 1.2-17.2 0.4-15.5 1 .5-35 2-9.4 0.9-12.1 1 .4-23 0.5-12.1 1-14.2 Asagidaki tablo, ECM'nin meme tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. Aralik %'si S.No Protein Ad 12 073 Anafaz-arttiran kompleks alt-birimi O-14.1 Translasyonel olarak-kontrol edilmis tümör 13 074 _ _ 0.9-6 proteini 14 075 Translasyon baslatma faktörü eIF-ZB alt-birimi 1-8.6 076 Varsayimsal Rab5-inter-Etki eden protein 0.5-8 16 077 Pankreatik sekretuvar tripsin inhibitörü 0.1-7.2 Tablo 1D: H ve N Asagidaki tablo, ECM'nin bas ve boyun skuamöz hücreli karsinom tümörlerinden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Aralik %'SI 1 M1 Miyozin 1 0.5-27 2 M2 Miyozin 2 0.1-6.4 3 M9 Miyozin 9 02-11 4 M17 Fibronektin Izoformu 1 0.1-7 M18 Fibronektin Izoformu 3 0-28 6 M19 Fibronektin Izoformu 4 O.1-12.5 7 M20 Fibronektin Izoformu 5 0.1-9.3 8 M21 Fibronektin Izoformu 6 0.1-10.5 9 M22 Fibronektin Izoformu 7 0.1-10.5 M23 Fibronektin Izoformu 8 O.1-3.3 Asagidaki tablo, ECM'nin bas ve boyun skuamöz hücreli karsinom tümörlerinden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad 121416 Fibronektin Izoformu 9 Fibronektin Izoformu 10 Fibronektin izoformu 4 preproprotein Fibronektin Izoformu 14 Fibronektin Izoformu 15 Fibronektin Izoformu 13 Fibronektin Izoformu 11 CEA-iliskili hücre adezyon molekülü 16 Kollajen-alfa-1 (I) zinciri Kollajen-alfa-2 (I) zinciri Kollajen-alfa-3 (VI) zinciri Izoformu 1 Kollajen-alfa-S (VI) zinciri Izoformu 2 Kollajen-alfa-3 (VI) zinciri Izoformu 4 Kollajen-alfa-2 (VI) zinciri Izoformu 202 Kollajen-alfa-2 (VI) zinciri Izoformu 2C2A' Kollajen-alfa-2 (VI) zinciri Izoformu 202A Kollajen-alfa-1 (III) zinciri COL1A1 ve PDGFB füzyon proteini Adiposit plazma membrani-Iliskili protein Aktin, sitoplazmik 1 Aralik %'si 0.1-9 0.1-8 0.1-21 0.1-4.6 O-6.8 0.1-12 0.6-5.4 2.3-21.7 1.4-24.1 1-11.6 1-8.4 1-18.2 0.3-6 0.3-4.7 0.3-9.5 0.2-13 0.2-9 O.5-13.9 1-5.4 Asagidaki tablo, ECM'nin bas ve boyun skuamöz hücreli karsinom tümörlerinden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad 032 1 1 033 12 C34 R43 Aktin, sitoplazmik 2 Sitokeratin, tip 1 Sitokeratin, tip 2 69 KDa'Iuk protein Vimentin Plastin 2 Aktin-benzeri protein 10 Septin-11 Gliyal fibriler asidik protein izoformu 1 Gliyal fibriler asidik protein izoformu 3 Gliyal fibriler asidik protein izoformu 2 OIfaktomedin-4 UPF0696 proteini Frajil X mental retardasyon 1 komsu protein Kalsiyum-baglama mitokondriyal tasiyici Nükleolar kompleks protein 2 homologu Çinko parmak HIT alan-içeren protein 1 28 kDa isi- ve asit-kararli fosfoprotein ADP-ribozilasyon faktörü-benzeri protein 16 Transkripsiyon faktörü LBX2 Sanli-sarmal alani-içeren protein 288 Aralik %'si 0.4-4.6 0.5-19 6.6-35.8 0.2-7.9 0.1-14.8 0.2-6 O.1-10.2 0.9-72 0.5-4.1 0.2-5 O.1-3.4 1-5.4 0.6-7.6 1.3-72 2-7.1 0.4-6.7 0.6-5.7 0.5-3.5 0.3-6.1 0.2-7 1-2.5 Asagidaki tablo, ECM'nin bas ve boyun skuamöz hücreli karsinom tümörlerinden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad 182022 Gastrik su peptidi 1 motor nöron sag kalimi-iIiskiIi-uç-birlestirme faktörü 30 DCN1-benzeri protein 1 R-spondin-1 OksisteroI-baglama proteini 1 NMDA reseptörü-regüle edilmis protein 2 izoformu a Tripsin-1 preproproteini Histon-Iizin N-metiltransferaz SUV39H1 E3 ubikuitin-protein Iigazi RING1 Klevaj stimülasyon faktörü alt-birimi 2 Kromo-alan-helikaz-DNA-baglama proteini 7 Translasyon faktörü GUF1, mitokondriyal CREB/ATF bZIP transkripsiyon faktörü Histon H1 Hb alt-birimleri (alfa) Beta globin Dermisidin Polipeptit iliskili kompleks alt-birimi a Kompleman 1 O baglama protein Karakterize edilmemis protein Aralik 0.2-6.1 0.1-3 0.8-6.9 0.6-4 1.8-6.6 0.5-6.9 O.1-6.4 O.9-5.2 O.6-4.6 0.7-4.9 O.9-3.9 0.1-8 0.6-9 0.2-12 0.3-52 1.2-7 0.6-4.4 1-8.7 0.1-72 1.3-12 Asagidaki tablo, ECM'nin bas ve boyun skuamöz hücreli karsinom tümörlerinden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad Serum albümin preproproteini Hemoglobin alt-birimi beta Düsük-yogunluklu Iipoprotein reseptör-iliskili protein 10 Protein FAM150A 398 ribozomal protein L20 TOMM20-benzeri protein 1 608 ribozomal proteini L10a UPF0711 proteini SWI5 homologu Nöroendokrin sekretuvar protein 55 WD tekrari-içeren protein 93 SWI/SNF kompleksi alt-birimi SMARCC2 Anlamli-olmayan transkriptlerin regülatörü MAP7 alani-içeren protein 1 Aktive edilmis T-hücreleri nükleer faktörü, sitoplazmik 1 izoformu A NHS-benzeri protein 1 izoformu 2 Ökaryotik translasyon baslatma faktörü 4H izoformu 2 Serum amiloid A protein preproproteini DNA onari protein RAD52 homologu Tablo 1E: Pankreas Aralik %'si 0-6.3 0.6-4 0.6-8 0.6-2 0.5-7 0.5-6.7 0.1-7 0.1-6 0.1-3 O.1-9.2 0.9-6.6 O.1-5.9 0-4.9 O.6-5.3 0.5-8 0.4-1.7 O.6-3.6 O.1-5.8 1-8.1 Asagidaki tablo, ECM'nin pankreatik tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad 851 1 1 852 Dezmoplakin Izoformu DPI Dezmoplakin Izoformu DPII Kollajen-alfa-1 (I) zinciri Kollajen-alfa-Z (I) zinciri Kollajen-alfa-S (VI) zinciri Izoformu 1 KOIIajen-alfa-3 (VI) zinciri Izoformu 2 Kollajen-alfa-3 (VI) zinciri Izoformu 4 Kollajen-alfa-1 (III) zinciri COL1A1 ve PDGFB füzyon proteini Protokadherin alfa-8 izoformu 1 öncülü Protokadherin alfa-8 izoformu 2 öncülü Nöreksin-2-beta izoformu alfa-2 öncülü Nöreksin-2-beta izoformu alfa-1 öncülü Sitokeratin, tip 1 Sitokeratin, tip 2 69 KDa'Iuk protein Baglanti plakoglobini Vimentin Gliyal fibriler asidik protein izoformu 1 Gliyal fibriler asidik protein izoformu 3 Gliyal fibriler asidik protein izoformu 2 Aralik %'si O.8-12.8 O.6-23.8 0.2-8 0.3-6 0.2-8 O.2-7.9 O.1-7.5 0.1-9.2 2.5-42.4 36-638 O.5-19.3 0.1-8 0.4-8.7 O.5-9.6 O.2-4.9 O.3-9.4 Asagidaki tablo, ECM'nin pankreatik tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad PeptidiI-prolil cis-trans izomerazi 78 Kda glikoz regüle edilmis protein Kalsiyum-baglama mitokondriyal tasiyici protein Protein THEMIS Testiste eksprese edilmis AMY-1-iliskili protein 1 Homeobox proteini MeisS izoformu 2 AçiI-koenzim A oksidaz-benzeri protein Çinko parmak RNA-baglama proteini Ras-GEF alani-içeren familya üyesi 10 Saksin Yag asidi amid hidrolazi DNA polimeraz zeta katalitik alt-birimi LON peptidazi N-ucu alani ve RING parmak proteini 1 Açiloksiaçil hidrolaz izoformu 2 preproprotein 60 KDA HSP Hb alt-birimleri (alfa) Protein Tro alfa1 H, miyelom Aralik %'si O.1-8.1 O.1-8.6 O.9-5.5 O.3-9.8 O.1-5.1 0.1-6.7 O.1-1.3 0.1-4 O.3-9.9 0-9.5 O-2.4 1.8-8 3-20.5 0.3-5 O.2-7.4 O.35-6.5 Asagidaki tablo, ECM'nin pankreatik tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad 111323 lg a-1 zinciri C bölgesi SNC73 protein mRNA Karakterize edilmemis protein Serum albümin preproproteini Hemoglobin alt-birimi delta Hemoglobin alt-birimi beta Hemoglobin alt-birimi gama-1 Ankirin tekrar alani 138 WD tekrari-içeren protein 93 DNA onarim proteini RAD52 homologu Hipotetik protein LOC254778 Fosfat tasiyici protein, mitokondriyal izoform b öncülü ELAV-benzeri protein 3 Sinyal peptidi, CUB ve EGF-alan-içeren protein 2 Vaküolar protein ayirma-iliskili protein 45 Mitotik-ig organize eden protein 2B Tasima proteini parçacik kompleksi alt- AF4/FMR2 familyasi üyesi 1 izoformu 2 PDZ ve LIM alani protein 3 izoformu a COBW alani-içeren protein 1 izoformu 2 Alfa fetoproteini Aralik %'si 1.7-20 3.8-19.3 7.8-10.6 0.2435 0-4.4 O-2.8 0.6-8.8 0-2.4 0.3-1.8 1.3-7 1 .7-232 1.1-10 O-1.9 2-10.9 0-2.7 O-15.1 O.2-11.4 0.5-6 0.3-14.1 Tablo 1 F: OVER Asagidaki tablo, ECM'nin ovaryan tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Ad 1 R1 15 Fibronektin Izoformu 4 CEA-ilgili hücre adezyon molekülü 16 Matriks ekstraselüler fosfoglikoproteini Kollajen-alfa-1 (III) zinciri Tüberin izoformu 5 Tetraspanin-11 FCH alani yalnizca protein 1 Baglantisal sarkoplazmik retikulum protein KIaudin-10 Tübülin, beta Sitokeratin, tip 1 Sitokeratin, tip 2 DNA'ya yönlendirilmis RNA polimeraz I Histon H1 UPF0711 proteini Lösin-açisindan zengin tekrar LGI Bagil Bolluk Yüzdesi O-22.9 O.3-13.8 O.5-9.2 O-37.7 1-13.3 O.3-23.4 0.2-5 0-11.5 142.1 0.1 -7.8 2-40.6 O.7-37.1 0.1-16.8 0.9-7 0.1-1.2 143.1 Asagidaki tablo, ECM'nin ovaryan tümörlerden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein 6 0116 7 0120 8 0121 9 0122 Bagil Bolluk Ad Yüzdesi familyasi üyesi 2 öncülü Translasyonel olarak-kontrol edilmis tümör proteini Hipotetik protein LOCZ54778 O-2.4 T-hücresi reseptörü alfa zinciri (Mb11a) O.2-8.8 Prorelaksin H2 O-6.9 Interlökin-22 0.1 -1 2.1 Kanser/testis antijen familyasi 45 O.3-11.5 Tablo 1 G: BEYIN Asagidaki tablo, ECM'nin gliyoblastom tümörlerinden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein Bagil Bolluk Ad Yüzdesi Troponin C, iskelet kasi 1-12.8 Kollajen-alfa-1 (I)zinciri 0.6-22.8 Kollajen-alfa-Z (I) zinciri 0.3-32.5 Protein Iin-7 homologu C 0.9-13.3 Sitokeratin, tip 2 3.5-25 drebrin-benzeri protein izoform b 1.6-21.6 Asagidaki tablo, ECM'nin gliyoblastom tümörlerinden izole edilmis ve LCMS ile analiz edilmis bilesenlerini listeler. S.No Protein 2 R114 3 R115 4 R116 0115 6 0116 7 0117 8 0118 9 0119 drebrin-benzeri protein izoform a drebrin-benzeri protein izoform c Frajil X mental reterdasyon 1 komsu proteini Sklerostin alani-içeren protein 1 DNA'ya yönlendirilmis RNA polimeraz R-spondin-3 Histon H2 lg a-1 zinciri C bölgesi Karakterize edilmemis protein immünoglobülin agir zincir degisken bölgesi T-hücresi reseptörü alfa Küçük asidik protein Protein FAM19A5 Varsayimsal protein FAMZZOBP Yüzdesi 0.4-1 1 .1 0.1-23.8 1-22.? 0.3-25.5 0.3-15.4 1-23.4 3.1-20 1-33.4 1.5-30.5 0.4-13.4 1 .3-30 0.6-10.3 3-9.? 0.2-18.5 Yukarida 1A ila 10 arasindaki tablolarda. 'B' ön-ekli proteinler, Bazal membran proteinleridir; 'C' ön-ekli proteinler, Sitoskleletal proteinlerdir; 'R' ön-ekli proteinler, regülatör proteinlerdir; 'M' ön-ekli proteinler, Matriks proteinleridir ve 'O' ön-ekli proteinler, 'digerleridir'. 1A ila 1G arasindaki tablolardan, H&N, Mide, Pankreas, Kolon, Özofagus ve Beyin gibi farkli kaynaklardan elde edilen tümör örneklerinin, spesifik tümörtipi için spesifik olarak formüle edilmis ECM karsimi ile kaplanmis plakalar üzerinde optimal viabiliteye sahip oldugu asikârdir. Böylelikle, ECM karisimi, eksplantlarda kullanilan solid kanser endikasyonunun her biri için elde edilir. Kaplama Prosesi: Böylelikle, bir tümör/kanser için spesifik ECM karisimi yukaridaki yönler ile belirlendiginde, spesifik kanser tipi için ECM karisimi, münferit ECM proteinlerini ve diger ilgili bilesenleri ekleme ve (kanser spesifik) kokteyl olusturmak için içerikleri karistirma ile hazirlanir. Yaklasik 96 gözlü plakalar üzerinde ECM kaplama, gözün yanlarini tek düze bir sekilde kaplamak için uygulayici çubuklar kullanilmasi ile basarilir. Diger durumlarda, yaklasik 200 ul ECM ekstrakti her bir göze eklenir ve yaklasik 37°C'de bir inkübatör içinde yaklasik 2 sa boyunca kurumasina izin verilir. Kaplanmis plakalar steril 1X PBS ile üç kere yikanir ve uzun süreli saklama için yaklasik -20°Ce saklanir. Örnek 2: Eksplant Düzenegi Otolog serum ligandlari ve otolog plazma ligandlari ve otolog PBMC'ler standart protokoller uyarinca hastadan elde edilir. Örnek 2.1: Otolog serum ligandlarinin ve ECM kaplamasinin eklenmesi natif tümör intraselüler sinyallemeyi ve viabiliteyi taklit etmesi için kültür içinde tümör mikro-ortamini yeniden-olusturur. Bir baska uygulamada, Sekiller 2, 3(A) ve 3(B), mümkün oldugu kadar yakin bir sekilde konak tümör mikro-ortamini taklit etmek için tasarlanan mevcut eksplantlar sisteminin dogasini açiklar. Primer amaç, tümör dokusu yapisini idame ettirmektir ve bu, hücre plakalarinin ECM bileseninin öneminin ilgili hâle gelmesidir. Hem yapisal bütünlük hem de fonksiyonel bütünlük, bu tümör aginin biyolojisini anlama ve ilaç yanitini veya direncini açiga çikarma ile ilgili oldugunda, elzemdir. ilaveten, mevcut sistem, bunun hem bir sinyalleme hem de yapisal bakis açisiyla doku mikro-ortamini aynen idame ettirmeyi amaçladigi sekilde tasarlanir. Bu, vasatlari eksplant kültür içinde otolog serum kaynakli Iigandlar ile takviye etme ile yapilir, bu natif sinyalleme aginin parçasi olan faktörler saglamak için önemlidir. Bu özellikle, bu küçük moleküllü inhibitörleri veya hedeflenmis terapötikleri veya hatta bunlarin etkisini spesifik yollar kanaliyla açiga çikaran kemoterapileri test etme ile ilgili oldugunda, ilgilidir. Hem yapisal bütünlügün hem de fonksiyon bütünlügün idame ettirildigi bir ortam saglama ile, mevcut eksplant model, kültür içinde eksplantlarin iyilestirilmis viabilitesini ve ayrica bu preklinik modelin klinik olarak ilgili oldugunu gösterir. Otolog serum kaynakli Iigandlar ile takviye edilmis eksplantlar kültürü, aynen natif sinyalleme aglarini idame ettirmek için gereklidir. Otolog serum kaynakli Iigandlarin eklenmesi, natif doku mikro-ortamini taklit etmek için elzem sinyalleme agini idame ettirir (Sekil 2). Sekil 3'ün Panelleri A ve B, otolog serum kaynakli Iigandlarin yoklugunda kültürlenmis eksplantlardir ve Paneller D ve E, otolog serum kaynakli ligandlar ile takviye edilmis vasat içinde kültürlenmis eksplantlardir. cMet [MET veya MNNG HOS Transforme Etme geni] için IHC gerçeklestirmede, otolog serum kaynakli Iigandlarin varliginda kültürlenmis eksplantlar göze çarpan bir sekilde arttirilmis cMet varligi gösterir, bu otolog serum kaynakli Iigandlar ile takviye edilmis vasatin natif sinyalleme agini taklit etmek için elzem parakrin faktörleri içerdigi gerçegini dogrular. Sekil 3A, kanser tipi spesifik ECM bilesenleri ile kaplanmis plakalarin, natif doku mikro-ortamini taklit etmek için elzem olan aynen doku yapisini idame ettirmeye yardimci olmak için uygun destek/iskele sagladigini gösterir. Kanser tipi spesifik ECM bilesenleri ile kaplanmis plakalar üzerinde kültürlenmis eksplantlar, hücre viabilitesini iyilestirir ve doku yapisini idame ettirmek için destek/iskele saglar. ECM kaplamasi olan (paneller C ve E) ve olmayan (paneller B ve D) plakalar üzerinde kültürlenmis tümör dokusunun H&E boyamasi. Sekil 3B, ECM ile kaplanmis plakalar içinde otolog serum kaynakli Iigandlar ile takviye edilmis vasatlar ile birlikte kültürlenmis eksplantlarin iyilestirilmis hücre viabilitesi gösterdigini gösterir. Örnek 2.2: Otolog Iigandlar ve Ekstra Selüler Matriks bilesimi, kültür içinde hasta tümörlerinin mikro-ortamini ve sinyalleme agini muhafaza eder. HNSCC hastalarindan elde edilen biyopsi tümörleri kesitlendilir (~200 mikron) ve RPMI vasati içinde yaklasik %10'luk FBS (kontrol) veya yaklasik %2'Iik otolog serum serum ve yaklasik %8'Iik FBS (Otolog serum) içeren 96 gözlü plakalar içinde yaklasik üç gün boyunca kültürlenir. Hücre viabilitesi WST analizi ile ölçülür. Hücre viabilitesi yüzdesi hesaplanir ve Kutu grafigi (Sekil 4(a)) olarak sunulur. Kutunun orta kismindaki yatay çizgi ortalamayi gösterir. Alt ve üst sinirlar, sirasiyla 25. ve 75. persantillerdir, alt ve üst kutu grafikleri sirasiyla 5. ve 95. persantillerdir. Kontrole kiyasla **P < 0. Otolog serumun tümörlerin proliferasyonu üzerindeki spesifik etkisini gösteren IHC verileri Sekil 4(b)'de oldugu sekilde grafik hâline getirilir. Tümör kesitleri, morfolojik degisimleri ve hücre proliferasyonunu degerlendirmek için H&E ile ve Ki67'ye karsi antikorlar ile boyanir. Görüntü büyütme 20X'tir. Sekil 4(c), Ekstra Selüler Matriks bilesiminin tümör viabilitesi üzerindeki etkilerini gösterir. Kültür plakasinin iç yüzeyi, jelatin, kollajen, Matrigel veya HNSCC'den izole edilmis Ekstra selüler Matriks (ECM) ile kaplanir ve tümör kesitleri 3 gün boyunca kültürlenir. Hücre viabilitesi, WST ile ölçülür ve canli hücre yüzdesi hesaplanir (ortalama ± s.e.m.). T72 kontrole kiyasla *P < 0,01 (varyans analizi). n = 8. Sekil 4(d), ECM bilesimi varliginda kültürden yaklasik 3 gün sonra eksplant tümörlerinin IHC profillerini gösterir. H&E (sol) ve Ki-67(sag). Sekil 4(e)'de gösterildigi üzere, Ki-67 skoru, diger tiplerdeki matriks destegine kiyasla ECM bilesiminin daha iyi etkisini gösterir. Otolog Serum ve ECM bilesimi kombinasyonu, tekli bilesene kiyasla proliferasyon üzerinde daha büyük etkiler gösterir, Sekil 4(f). Tümör kesitleri, kontrol, tek basina veya her Ikisi kombinasyon hâlinde otolog serum (yaklasik %2`lik), ECM bilesimi (yaklasik 100 ug/ml) ile yaklasik 72 saat boyunca kültürlenir. Ki-67 skoru, kültür içinde ECM bilesiminin ve otolog serumun birlestirilmis varliginin yararini gösterir. T72 kontrole kiyasla *P < , n = , kiyasla **P < 0,05. Sekil 4(g)'de karsilik gelen IHC verileri, ECM bilesimi ve otolog serum eklenmesi üzerine Ki-67 pozitif hücrede benzer artis gösterir. Tümör dokulari, parafin içine gömülür ve bunlar kesitlenir (5 mikron) ve anti Ki-67 antikorlari ile boyanir. Örnek 2.3: ECM bilesimi ve bunun viabilite ve proliferasyon üzerindeki etkileri. Ekstra Selüler Matriks Bilesimi (ECM), Sekil 5(a)'da gösterilen ECM bilesenlerinin bilesim yüzdesi uyarinca tümör dokusunun kültürlenmesinden önce plakalar üzerine kaplanir. Eksplantlar, heterolog insan tümörü kaynaklarindan izole edilmis farkli dozlardaki (1, 10 ve 100 g/ml) ECM ile kaplanmis plakalar içinde yaklasik 72 saat boyunca kültürlenir. Tümör hücresi viabilitesinin yüzdesi (ortalama ± s.e.m), WST ile ölçülür. Sirasiyla TO ve T72 kontrole kiyasla ANOVA ile *P < 0,05, **P < 0,01. Sekil (b)'de görüldügü üzere, ECM doza bagimli bir sekilde tümörlerin viabilitesini arttirir. Toplam intra-tümöral heterojenligiin ve bütünlügün idamesi, H&E (Sekil 5(c), üstte) ile belirlenir ve eksplant kosullarinda tümör hücresi proliferasyonu (Sekil 5(c), altta) Ki-67 antikorlari kullanilarak degerlendirilir. 5 bagimsiz deneyin temsilcisi olan veriler, üç kopya hâlinde gerçeklestirilmistir. Örnek 2.4: Farkli ECM Bilesiminin proliferasyon ve aktive eden kanser sinyalleme proteinleri üzerindeki etkilerinin karsilastirmasi. Kültür plakasinin iç yüzeyi, jelatin, kollajen, Matrigel veya kolon kanserinden izole edilmis Ekstra Selüler matriks (ECM) ile kaplanir ve tümör kesitleri 3 gün boyunca kültürlenir. Sekil 6(a)'da gösterilen eksplant tümörlerinin IHC (immünohistokimya) profilleri, hasta kaynakli ECM'Ierin standart tekli matriks proteinine kiyasla ERK1/2'nin proliferasyonu (Ki67) ve fosforilasyonu üzerinde daha büyük etki gösterdigini gösterir. Sekil 6(b), karsilik gelen Ki-67 skorunu gösterir. T72 kontrole kiyasla ANOVA (n = 5) ile *p < 0,01. Sekil 6(c)'de gösterilen Ki-67 skorunun saçilim grafigi, hasta kaynakli ECM'nin benzer kosullar altinda gerçeklestirilmis çok sayida bagimsiz deneyde eksplantlari pozitif bir sekilde etkiledigini gösterir. Her bir nokta bir deneyi (n=33) temsil eder. Yatay çizgi, tüm örneklerin ortalamasini temsil eder. Kontrole kiyasla ***P < 0,001. Yukaridaki sonuçlar, uygun ECM varliginda tümörü kültürlemenin konak tümör mikro-ortamini taklit etmek için tümör dokusunun viabilitesini ve sinyallemesini iyilestirdigini gösterir. Tümör dokusu hastadan veya ksenogreft kaynagindan elde edildiginde, bu asagida oldugu üzere Eksplant Protokolü'ne/"Klinik Yanit Kestirici" analize tabi tutulur: Eksplant Protokolü: 1. Yaklasik 3x3x3 mm'lik küçük (tümü tek düze boyutta ve nekrotik kütleden yoksun) tümör kesiti parçalari üretilir. 2. Tümör örnegi yaklasik 100-3000 pm'lik kesitler üretmek için Leica Vibratome kullanilarak çok sayida küçük parçaya bölünür ve önceden uygun ECM bilesimi ile kaplanmis 96 gözlü düz tabanli plakalar içinde üç kopya hâlinde kültürlenir. 3. Tümör dokulari, %1'Iik Penisilin-Streptomisin, sodyum pirüvat 100 mM, esansiyel- olmayan amino asit, L-glutamin 4 mM ve HEPES 10 mM ile birlikte yaklasik %2'Iik isi ile inaktive edilmis FBS ile degistirilmis yaklasik 2 ml'lik (DMEM) sartli vasatlari içinde idame ettirilir. Kültür vasatina, 12 saat sonra yaklasik %2'Iik serum kaynakli Iigandlar veya yaklasik %2'Iik plazma kaynakli Iigandlar takviye edilir veya her 96 göz için yaklasik 100.000 PMBC yaklasik %10'Iuk otolog plazma ile ekilir ve nemli kosullar altinda yaklasik %5'Iik COz'de yaklasik 37°C'de yaklasik 72 sa boyunca kültürlenir. 4. Serum/plazma/PBMC eklenmesi sirasinda vasatlar degistirilir. . Vasatlar, takviyeler ile birlikte her 24 saatte bir degistirilir. 6. 5 ul tüketilmis vasat, tümör dokusunun hücre viabilitesini, hücre metabolizmasini, hücre ölümünü ve hücre fizyolojisini belirlemek için kullanilir. 7. Yaklasik 48 saat ila yaklasik 120 saat araliginda olan kültür periyodunun sonunda, doku çesitli parametreler için degerlendirilir. Bu periyottan sonra, MTTNVST analizi hücre viabilitesi yüzdesini degerlendirmek için gerçeklestirilir. Vasat kültüründen elde edilen süpernatant, her 24 saatte bir uzaklastirilir ve kinetik yanit egilimleri vermesi için (ATP'den ve glikozdan yararlanma deneyleri kullanilarak) proliferasyon ve (Iaktat dehidrojenaz analizlerinin ve Kaspaz-3 ve Kaspaz-8 ölçümlerinin degerlendirilmesi ile) hücre ölümü için degerlendirilir. Sonuçlar bir ilaç ile muamele edilmemis kontrole karsi kantifiye edilir. Muamele edilmemis kontrole kiyasa hücre viabilitesinde/proliferasyonunda anlamli olan kayip, ilaca/kombinasyona yanitin ve ayrica arttirilmis hücre ölümünün göstergesidir. Hem muamele edilmis hem de muamele edilmemis doku kesitleri ayrica, kültür periyodunun sonunda IHC ve histolojik degerlendirme için de verilir. Histolojik degerlendirme için verilen dokular, TUNEL ve aktive edilmis Kaspaz-3 analizi ile apoptoz için degerlendirilir. Hücre proliferasyonu ayrica, Ki67 gibi standart proliferasyon belirteçleri için de analiz edilir. H&E ayrica rutin olarak, dokunun mitotik sekillerini, nekrozunu ve genel bariz özelliklerini degerlendirmek için de gerçeklestirilir. ECM bilesimi belirlendiginde ve bu gözlerin üzerine kaplandiginda, hastadan veya ksenogreft kaynagindan elde edilen tümör eksplant analizine tabi tutulur. Eksplant analizi için insan tümörü ksenogrefti üretmek için, tümör ilk olarak SClD farelerine implante edilir ve bundan sonra kesip çikarilmis tümör eksplantlar protokolüne ve Hayvan Implantasyonu ve Tümör Ksenogrefti Üretilmesi: Örnek Preparasyonu: 1. Yeni uzaklastirilmis insan tümörü örnegi DPBS (yaklasik 5 ML) içeren yaklasik 50 ml'lik tüp içine transfer edilir. 2. Örnek uzaklastirilir ve örnek çesitli deneyler için diseke edilir. 3. Kalan örnek yaklasik 2 ml DPBS içeren bir steril petri tabagina transfer edilir. 4. Tümör steril bistüri biçagi ile yaklasik bir kalem silgisi (yaklasik 5x5x5 mm) boyutundaki parçalara kesilir. Parçalari olabildigince tek düze yapmak için dikkat edilmelidir. Hayvan Preparasyonu: . Boynun etrafindan ve ön bacaklarin üzerinden yerlestirilmis isaret parmagi ve orta parmak ile geleneksel bir kavrama kullanilarak hayvanlar yakalanir. 6. Yaklasik 5-6 haftalik olan disi SCID farelerinin yüzeyi yaklasik %70'lik EtOH ile durulanir. Örnegin farelere implantasyonu: 7. subkütan boslukta solid implantasyon için her iki yan da kullanilir. 8. Bir farenin vücut yüzeyi durulandiktan sonra, bu (ventral taraf asagida olacak sekilde) uygun bir sekilde boyutlandirilmis burun konisi içine veya dorsal tarafi yukari bakacak sekilde fare kafesinin kapagi üzerine yerlestirilir. 9. Tümörün trokar ile içeri yerlestirilmesi için hazirlamak amaciyla orta-omurgadan kuyruk tabanina kadar olan alan (hacim/hacim) yaklasik %70'lik etanol ile doyurulmus kare sargi bezi kullanilarak silinir. . Implantasyondan hemen önce, tümör parçasi yaklasik1OOX P/S içine banyo yaptirilir/durulanir. 11. Solid tümör parçasi (yaklasik 5 mm3) trokarin ucuna alinir ve tümör örneginin kurumasina izin verilmeden steril pense veya bistüri kullanilarak içeri itilir. 12. Trokarin ucu kuyrugun tabaninin yatay olarak üst kismindan fare subkütan boslugu içine yerlestirilir, iki yan dogrudan kapatilir ve subkütan bosluk içine bir cep uygulanir ve piston parçasini ve igne parçasini sabitlenmis bir pozisyonda tutarken ve peritoneuma zarar vermeden (her seferinde birine olmak üzere) her iki yani üzerinde dorsal tarafinin ortasinin üst kismina yerlestirilir. 13. Münferit tümör parçasi (yaklasik 50 mg veya yaklasik 5 mm3) trokar kullanilarak olusturulan cep içine itilir. 14. Içeri yerlestirilen malzemeyi bozmadan trokar kibar bir sekilde uzaklastirilir. . Toksik-olmayan malzeme kullanilarak fare uygun bir sekilde (bas/vücut/kuyruk/isaret yok, vb.) isaretlenir. Hayvan takibi: 16. Fareler temiz bir kafese koyulur. 17. Palpabl tümör (yaklasik 50 mm3) ilk olarak fark edilir akabinde bu büyümeye 18. Fareler günlük olarak izlenir ve tümör büyümesi asagida tarif edildigi üzere çap ölçer ölçümü kullanilarak haftalik olarak ölçülür. Özet olarak, tümör büyümesi yaklasik -16 hafta boyunca biyolüminesan görüntüleme veya dis çap ölçer ölçümleri (tümör boyutu = [uzunluk x genislik x yükseklik] x 0,52) ile haftalik olarak izlenir. 19. Tümör yaklasik 700 mm3'lük bir maksimum boyuta ulastiginda, hayvanlara ötanazi uygulanir ve tümör çikarilir ve ayni prosedür izlenir. . Çikarilmis tümörler farkli çalismalar için çok sayida parçaya bölünür. Ilave olarak, potansiyel metastaz yerleri, örnegin, akcigerler ve lenf nodlari, abdomen ve seçilen olgularda beyin çikarilir ve formalin içine koyulur. 21.Hayvan yavas bir tümör büyümesine sahip oldugunda, büyümeyi kurtarmak bu evre bir evrede implante edilir. Tüm hayvanlara 16 haftanin sonunda ötanazi uygulanir. Ksenogreft analiz ile 'Klinik Yanit Kestirici' analizi valide etmek için protokol asagida saglanir: SCIDIÇipIak Farelerin Tümör Ksenogreftlerinde ilaçlarin Terapötik Etkinliginin Belirlenmesi: Hayvan Preparasyonu: 1. Etkinlik çalismalari için P1'den veya bunu takip eden geçisten (P1 veya PN`N1) fareler kullanilir. Hayvan Takibi & Doz/ama: 2. Fareler günlük olarak izlenir ve tümör büyümesi asagida tarif edildigi üzere çap ölçer ölçümü kullanilarak haftalik olarak ölçülür. Tümör hacmi, asagidaki formül kullanilarak hesaplanir: Tümör hacmi (mma) = L x W2/2; Burada, L = uzunluk (mm), W = genislik (mm). 3. Tümör yaklasik 150-200 mm3'lük bir boyuta ulastiginda, hayvanlar yaklasik 5 hafta boyunca uygun ilaç (yaklasik 1 doz/hafta) ile dozlanir. Fareler günlük olarak izlenir ve tümör büyümesi asagida tarif edildigi üzere çap ölçer ölçümü kullanilarak iki haftada bir ölçülür. 4. Hayvanlar tedaviden sonra yaklasik 4 hafta boyunca tümör regresyonu/büyümesi için izlenir. . Çalismanin sonunda, 002 bölmeleri kullanilan standart ötanazi prosedürü uyarinca farelere ötanazi uygulanir ve tümör örnekleri toplanir. Mevcut açiklamada test edilmesi için kullanilan ilaçlarin detayli listesi asagida Tablo 2'de verilir. Bu liste yalnizca açiklayici olma amaci tasir ve sinirlayici-degildir veya genis kapsamli ve ayrintili degildir. Tablo 2: "Klinik Yanit Kestirici" Analiz'de uygulanan ilaçlarin listesi Kanser Tipi Alt-Tip a) H&N kanseri Nazofarenks Tükürük bezi tümörü b) Kolorektal kanser Rezektabl Rezektabl-olmayan Lokal olarak ilerlemis Standardi) Kombinasyonu (Bakim Sisplatin Karboplatin & Paklitaksel Sisplatin & 5-FU Sisplatin Dosetaksel, Sisplatin & 5-FU Setuksimab Sisplatin & 5-FU Oksaliplatin, 5-FU, Lökovorin -FU & Lökoverin Oksaliplatin, 5-FU, Lökovorin -FU & Lökoverin Irinotekan. 5-FU, Lökoverin -FU, Irinotekan, Lökoverin, Bevacizumab Irinotekan & Setuksimab Pa nitu mumab Epirubisin, Sisplatin & Ka pesitabin Dosetaksel, Sisplatin, Infüzyonel Epirubisin, Sisplatin & Ka pesitabin Kanser Tipi Özofagus kanseri d) Pankreas, Safra Kesesi, Safra kanseri e) Karaciger f) Ovaryan kanser Alt-Tip Metastatik Metastatik Gastrik, Gastro- özofajiyal (Her2+) GI Stromal Imatinibe dirençli GI stromal Safra Kesesi Kolanjiyokarsinom Adenokarsinom Rezeke Pan kreatik Karsinom Ca-Pankreas Hepatoselüler Karsinom Germ hücresi kanseri Platinyum d uyarli relapse olmus Ca Platinum resistant Ca Yumusak doku Ilaç Kombinasyonu (Bakim Standardi) Dosetaksel, Sisplatin, Infüzyonel Epirubisin, Sisplatin & Kapesitabin Herseptin Imatinib Sunitinib Sisplatin & Gemistabin Sisplatin & Gemistabin Sisplatin & Gemistabin -FU & Lökovorin Erlotinib Sorafenib Trabektidin, PLD Doksorubisin Dosetaksel Trabektidin, PLD Doksorubisin Kanser Tipi 9) Meme Kanseri Alt-Tip karsinomu Ilerlemis Ca (ilerleme/ rekürans) peritoneal karsinom Fallop Tüpü Karsinomu Relapse olmus epitelyal Karsinom Papiller Ca Peritoneal Ca Fallop Tüpü Karsinomu Invasif epitelyal Ca Her2+ primer Ilaç Kombinasyonu (Bakim Standardi) Karboplatin & Gemsitabin Dosetaksel Doseta ksel Doksirubisin (PLD) ve Ka rboplatin. Karboplatin & Paklitaksel Karboplatin & Paklitaksel Karboplatin & Paklitaksel Karboplatin & Paklitaksel Sisplatin ve Gemsitabin Siklofosfamid & Paklitaksel Doseta ksel Dosetaksel ve Siklofosfamid Dosetaksel, Siklofosfamid, Epirubisin ve Florourasil Filgrastim, Siklofosfamid, Doksorubisin ve Florourasil Filgrastim, Siklofosfamid, Epirubisin ve Florourasil Gemsitabin ve Dosetaksel Trastuzumab, Siklofosfamid, Kanser Tipi Kanser Tipi Meme Kanseri Alt-Tip Hormonal Early Ca-Br Yüksek riskli Ca-Br Lokal olarak Ilerlemis Lokal olarak Ilerlemis Ilaç Kombinasyonu (Bakim Standardi) Doksorubisin ve Paklitaksel Siklofosfamid, Paklitaksel ve Trastuzumab Doseta ksel, Karboplatin ve Trastuzumab Doseta ksel, Trastuzumab, Florourasil, Epirubisin ve Siklofosfamid LHRH agonisti ve tamoksifen Tamoksifen Doksorubisin ve Siklofosfamid Ilaç kombinasyonlari (SOC) Siklofosfamid (oral), Metotreksat ve Florourasil Doksorubisin ve Siklofosfamid akabinde Dosetaksel (TAXOTE RE). Florourasil Siklofosfamid, Epirubisin ve Florourasil Siklofosfamid, Epirubisin, Florourasil ve Filgrastim (G-CSF) Doksorubisin ve Siklofosfamid akabinde Dosetaksel (TAXOTERE) ve Trastuzumab Kanser Tipi Alt-Tip Metastatik Metastatik (Her2+) Metastatik Kemik metastazlari ilerlemis Ca-Br Ilaç Kombinasyonu (Bakim Standardi) An astrozol Ka pesitabin Florourasil Dosetaksel Dosetaksel ve Kapesitabin Doksorubisin Doksorubisin ve Siklofosfamid Gemsitabin Gemsitabin ve Paklitaksel Paklitaksel Vinorelbin Trastuzumab Trastuzumab ve Dosetaksel Trastuzumab ve Paklitaksel Trastuzumab ve Vinorelbin Klodronat Pa midronat Siklofosfamid, Metotreksat ve Florourasil Eksemestan Ilaç Kombinasyonu (Bakim Kanser Tipi Alt-Tip Standardi) Letrozol Megestrol ilerlemis Ca-Br Trastuzumab, Paklitaksel ve (Her2+) Karboplatin Siklofosfamid, Epirubisin ve Enflamatuvar Ca-Br Florourasil Florourasil Filgrastim, Siklofosfamid, Epirubisin ve Florourasil Örnek 6: Eksplant Sisteminin Preklinik Validasvonu: Tümörlerden üretilen tümör ksenogreftlerinin hasta tümörüne benzer oldugu bilinir ve bundan dolayi bu tarz bir sistemden elde edilen etkinlik okumasi hastanin bu tedaviye yanitinin göstergesidir. Mevcut Eksplant sisteminde, ilaç kombinasyonlari ile muamele edildiginde HTX'in duyarliligi ayni tümör için eksplanttan elde edilen yanit sonucuna çok benzerdir, bu "Klinik Yanit Kestirici" eksplant sisteminin hastalarin ilaçlara veya ilaçlarin kombinasyonuna yanitinin yüksek dereceli tahmin edilebilirligine sahip oldugunu gösterir. Bu, asagidaki alt-örnekler ile gösterilmektedir: Örnek 6.1: Insan tümör ksenogreftlerinin erken geçisleri orijinal tümörlerin moleküler karakteristiklerini muhafaza eder. Insan tümör ksenogreftlerinin erken geçisleri orijinal tümörlerin moleküler karakteristiklerini muhafaza eder. Sekil 7(A), ayni orijinli ve seri geçis örneklerinin siki kümelenmesini göstermek için Genespring GX yazilimi ile üretilen 3D PCA egrisini gösterir. Egri, yaklasik 4 çift kolon karsinomu ve yaklasik 2 çift HNSCC örnegi içeren yaklasik 6 ayri kümeyi gösterir. Kolon kanserinin ve HNSCC'nin denetlenmeyen iki boyutlu hiyerarsik kümelenmesi Sekil 7'nin panel B'sinde gösterilir. Örnek 6.2: Insan tümör ksenogreftinin erken geçislerinden türetilen tümör eksplant kültürü ve hasta tümörleri özdes anti-tümör etki gösterir. Insan tümör ksenogreftinin erken geçislerinden türetilen tümör eksplant kültürü ve hasta tümörleri Özdes anti-tümör etki gösterir. Primer donör tümörlerinden (PO) ve bundan üretilen greftlerden sonra (P1 ve P2) türetilen eksplantlara kontrol olarak TPF (Siplatin, Dosetaksel, 5FU) veya DMSO [Dimetil Sülfoksit] ile muamele edilir. Muameleden yaklasik yetmis iki saat sonra, viabilite WST ile ölçülür ve viabilitenin inhibisyon yüzdesi %100 olarak karsilik gelen DMSO kontrolü kullanilarak hesaplanir (ortalama ± s.e.m.) (Sekil 8a). TPF muamelesini takiben PO ve P1, P2 tümörlerinden elde edilen eksplantlarin Ki-67 immünoreaktivite paterni. Görüntü büyütme, 200 X'tir (Sekil 8b). Ekplantlar içinde çogalan hücrelerin düsüsü gösteren ve her alan için Ki-67 pozitif hücrelerin hesaplanmasina (üç kopyanin ortalama ± s.e.m. degerine) göre ölçülen temsili Ki-67 skoru. Karsilik gelen kontrole kiyasla ANOVA ile *P < 0,05, **P < 0,01. n :4 (Sekil 80). Veriler, parental tümörlerin ve bunu takip eden ksenogreftlerin TPF'ye özdes yanit durumunu idame ettirdigini gösterir ve orijinal olarak refrakter olan primer tümörlerin müteakip ksenogreftlerde ayni paterni idame ettirdigi bulunur. TPF'nin ve Setuksimab'in tümör eksplant kültürü üzerindeki anti-tümör etkileri insan tümörü ksenogreft modellerine benzer. HNSCC hastalarindan elde edilen biyopsi örnekleri kesitlenir (~200 mikron) ve ECM kapli 96 gözlü plakalar içinde RPMI vasatlari içinde yaklasik %2'Iik otolog serum ve yaklasik %8'Iik FBS ile yaklasik üç gün boyunca DMSO (Kontrol) ve Dosetaksel, Sisplatin ve 5-FU (TPF) ile kültürlenir. Hücre viabilitesi WST ile ölçülür ve hücre viabilitesi yüzdesi hesaplanir. Sekil 9(a)'daki kutu grafigi, TPF ile muamele edilmis tümörlerinde viabilitenin anlamli inhibisyonunu gösterir. Çok sayida donörde (n=20) kontrole kiyasa ikili T testi ile ** p<0,001. Sekil 9(b), karsilik gelen IHC profilini gösterir. DMSO (kontrol) ve TPF ile muamele edilmis tümör kesitleri H&E ve Ki- 67 ile boyanir. Saçilim grafigi, TPF'ye (T72 kontrole normalize edilmis kat inhibisyonu) diferansiyel bir sekilde yanit gösteren eksplant örneklerini temsil eder. Her bir nokta, bir deneyi (n=50) temsil eder. Yatay çizgi, tüm örneklerin ortalamasini temsil eder. Yanit- vermeyenler yanit-verenlere kiyasla çok düsük düzeylerde inhibisyona sahiptir. Sekil 9(c), in VIVO tümör büyümesi inhibisyonunu gösterir. Ayni hasta tümörleri immün- yetmez hâle getirilmis farelerde büyütülür. Tümör tasiyan farelere günlük olarak normal salin (Kontrol) ve (TPF) ile 21 gün boyunca muamele edilir. Tümör hacimleri gösterilen zaman noktalarinda ölçülür. Veriler her grup için 6 farenin ortalama tümör hacmi ± s.e.m. degeridir. Karsilik gelen vehikül kontrole kiyasla "p<0,001. Tümörler diseke edilir, tartilir ve rezidüel tümörlerin yüzdesi hesaplanir. Muamele sonunda tümörlerin temsili IHC özellikleri Sekil 9(d)'de gösterilir. Hem kontrol hem de TPF gruplarindan elde edilen ötanazi uygulanmis farelerden diseke edilmis tümörler gömülür, kesitler ve gösterildigi üzere H&E, Ki-67 ve TUNEL ile boyanir. Ölçek çubuklari, 50 pm ve ekli küçük resimler, 100 um. HNSCC hastalarindan elde edilen biyopsi örnekleri kesitlenir (~200 mikron) ve ECM kapli 96 gözlü plakalar içinde RPMI vasatlari içinde yaklasik %2`Iik otolog serum ve yaklasik %8'Iik FBS ile yaklasik üç gün boyunca DMSO (Kontrol) ve Setuksimab ile kültürlenir. Hücre viabilitesi WST ile ölçülür. Sekil 9(e)'deki kutu grafigi, çok sayida deneyde karsilik gelen kontrollere (n=20) kiyasa Setuksimab ile muamele edilmis tümörlerinde hücre viabilitesinin inhibisyonu yüzdesini temsil eder. Çok sayida kontrole kiyasla ikili T testi ile hesaplandigi üzere **' p<, proliferasyondaki ve morfolojideki degisimleri gösterir. DMSO (kontrol) ve Setuksimab ile muamele edilmis tümör kesitleri H&E ve Ki-67 ile boyanir. Saçilim grafigi, Setuksimab'a (T72 kontrole normalize edilmis kat inhibisyonu) diferansiyel bir sekilde yanit gösteren eksplant örneklerini temsil eder. Her bir nokta, bir deneyi (n=40) temsil eder. Yatay çizgi, tüm örneklerin ortalamasini temsil eder. Kontrole kiyasla **P < 0,001. Sekil 9(g), Setuksimab ile muamele edilmis farelerde tümör büyümesi inhibisyonunu temsil eder. Setuksimab eksplant kültürü (e) için kullanilan HNSCC tümörleri immün- yetmez hâle getirilmis farelerde büyütülür ve bunlara bir haftada üç kere normal salin (Kontrol) ve Setuksimab (Muamele edilmis) ile yaklasik 23 gün boyunca muamele edilir. Tümör hacimleri gösterilen zaman noktalarinda ölçülür. Veriler her grup için 10 farenin ortalama tümör hacmi ± s.e.m. degeridir. Karsilik gelen vehikül kontrole kiyasla vurgulayan lHC verilerini temsil eder. Tümörler Setuksimab'in son dozundan yaklasik 6 saat sonra ötanazi uygulanmis farelerden hasat edilir. Tümör kesitleri H&E, Ki-67 ve TUNEL ile boyanir. Ölçek çubuklari, 50-m ve ekli küçük resimler, 100-m. Örnek 6.3: "Klinik Yanit Kestirici" modelli ilaç yanit platformunun in vivo etkinlik ile korelasyonu. TPF/setuksimab ile muamele edilmis eksplantlardan elde edilen veriler, viabilitesinin inhibisyonunu, proliferasyonu ve apoptozun indüksiyonunu degerlendirmek için bagimsiz bir sekilde skorlanir. Her bir analizin bagil katkisi Örnek 8'de ayrintili olarak anlatildigi sekilde belirlenir. Nihai bir bilesik "Klinik Yanit Kestirici" yanit skoru (inhibisyon), tümör inhibisyonunun tüm bilesenlerini birlestirme ve bunu HTX içinde ayni münferit hasta tümörleri ve ilaçlar kullanilan in vivo etkinlik çalismalarindan elde edilen tümör büyümesi inhibisyonu verileri ile korele etme ile hesaplanir. Spearman korelasyon katsayisi yöntemi lineer iliskiyi hesaplamak için kullanilir. R2 degeri, in vivo yanit ve "Klinik Yanit Kestirici" modelli yanit arasindaki pozitif korelasyonu belirtmistir (n=15) (Sekil 10). "Klinik Yanit Kestirici" analizde görülen tümör inhibisyonu düzeyi, HTX modelinde görülene karsilik gelir. Örnek 7: Eksglant Protokolü'ngle Kißnilan Analizler Hastadan veya ksenogreft kaynagindan elde edilen tümör örnekleri bundan sonra, M Skoru elde etmek için asagidaki analizler yoluyla "Klinik Yanit Kestirici" analize tabi tutulur. M-skoru kavrami örnek 7'de detayli olarak açiklanir. Örnek 7.1: Hücre Viabilitesini Belirlemek için Analizler: a) SOLID TÜMÖR EKSPLANTLARININ DOKU VIABILITESINI ÖLÇMEK IÇIN MTT Normal MTT analizinin modifiye edilmis versiyonu (Veira V ve ark., Max Loda Lab PNAS 2010) kullanilir. Özet olarak, dokular vibratom (400 mikronluk kesitler) ile tam olarak esit kesitlere kesilir ve yaklasik %60 ila yaklasik %100 araliginda, tercihen yaklasik %80 olan, konsantrasyonda en fazla 72 saat boyunca RPMI 1640 [RPMI - Roswell Park Memorial Institute] içinde kültürlenir. Doku viabilitesi, TO ve ayrica T72 zaman noktasinda bir MTT 1-(4,5-dimetiltiyazoI-2-iI)-3, 5-difenilformazan analizi (Sigma Aldrich) kullanilarak degerlendirilir. Doku kesitleri 37°C'de 4 saat boyunca 5 mg/mL MTT ile inkübe edilir, hasat edilir ve oda sicakliginda 25 dk boyunca 0,1 M HCI- izopropil alkol ile inkübasyon ile çökeltilir/tuz ile ekstrakte edilir. Bir viabilite degeri, 570 nm'de formazanin optik yogunlugunu eksplantlarin kuru agirligina bölme ile belirlenir. taban hatti örnekleri (TO), absorbans okumalarinda örnek arasi varyasyonu normalize etmek kalibratörler (1x) olarak kullanilir ve doku viabilitesi TO örneklerine kiyasla bir viabilite yüzdesi olarak ifade edilir. Farkli kanser tipleri için, eksplantlar içindeki doku kesitleri pik plazma konsantrasyonunda farkli ilaçlar içeren vasatlar ile en fazla 72 sa boyunca inkübe edilir. Ilaçlar içeren vasatlar her 24 saatte bir degistirilir ve MTT olagan oldugu üzere T72 ve TO zaman noktalarinda gerçeklestirilir. Ilaç etkinligini degerlendirmek için, çalisma periyodunun sonunda doku viabilitesi, burada dokunun herhangi bir ilaca maruz birakilmadigi TO zaman noktasindaki doku viabilitesine kiyasla kademelendirilir. b) WST ANALIZI: Özet olarak, dokular vibratom (400 mikronluk kesitler) ile tam olarak esit kesitlere kesilir ve yaklasik %60 ila yaklasik %100 araliginda, tercihen yaklasik %80 olan, konsantrasyonda en fazla 72 saat boyunca RPMI 1640 [RPMl - Roswell Park Memorial 72 saatlik inkübasyonun sonunda, 40 ul CCK-8 (hücre sayma kiti-8, Dojindo Laboratories, Japan) her bir göze eklenir ve inkübasyon 37°C/%5'Iik COz'de bir baska 3 sa boyunca sürdürülmüstür. inkübasyon sirasinda, plaka mikro plaka sallayici üzerinde yaklasik 90 rpm'de inkübatör içinde hafif bir sekilde ajite edilir. Yaklasik 3 saatlik inkübasyonun sonunda, doku kesitleri ilgili %10'Iuk formalin tüplerine dikkatli bir sekilde koyulur ve bunlar Immünohistokimyasal çalismalar için teslim edilir. Paralel olarak, absorbans mikro plaka okuyucu (Bio-Red, USA) kullanilarak 450 nm'de ölçülür. Adenozin-S'-trifosfat (ATP), tüm canlilarin kimyasindaki merkezi bir moleküldür ve çok sayida biyolojik prosesi izlemek için kullanilir. ATP*den yararlanma, StayBriteTM ATP Assay Kit (BioVision) kullanilarak çalisilir. Dakikadaki ATP düzeylerini saptamak için bir kesin, güvenilir yöntem Lüsiferaz/Lüsiferin'dir. Analiz yüksek girdi-çikti (1 s/örnek) için tam olarak otomatiktir ve ATP üretimini saptamak için oldukça duyarlidir ve idealdir. Lüsiferin + ATP + O: w, Oksilüsiferin + AMP + Pirofosfat + CO: + Isik Standart Egri: Örneklerde mutlak ATP içerigini hesaplamak için, bir ATP standart egrisi üretilir. 81 olarak etiketlenmis bir tüp içine yaklasik 10'4 M'Iik ATP çözeltisi yapmak için yaklasik 990 ul Lizis Tamponuna yaklasik 10 ul ATP stok çözeltisi eklenir, akabinde yaklasik 3 - 5 daha fazla 10 katlik seyreltme (yani, yaklasik 10'5 M, yaklasik yaklasik 90 ul Lizis Tamponu) yapilir. Ölçüm: 96-gözlü plaka içine yaklasik 10 ul örnek veya standart eklenir. Hazirlanmis Reaction Mix'in yaklasik 90 ul'si gözlere eklenir, akabinde karistirilir ve Iüminesans (L) 7 M ATP, her göz için yaklasik 1 pmol verir, vb.). Arka-plan lüminesansi için düzeltmek için, ilk olarak yalnizca yaklasik 90 pl Reaction mix eklenir, arka-plan Iüminesans (BL) okunur ve akabinde yaklasik 10 pl örnek veya standart gözlere eklenir, karistirilir ve toplam Iüminesans (L) okunur. Hesaplamalar: BL'yi örnekler ve standartlar için her bir L okumasindan çikartma ile arka-plani düzeltme. Standart egri çizilir. Örnek gözleri içindeki ATP miktari lineer regresyon kullanilarak standart egriden hesaplanir. Örneklerdeki ATP konsantrasyonu, asagidaki formül kullanilarak hesaplanabilir: C = Sa/Sv (pmol/pl veya nmol/ml veya uM) Burada: Sa, standart egriden elde edilen (pmol cinsinden) örnek miktaridir. Sv, örnek gözleri içine eklenen (pl cinsinden) örnek hacmidir. ATP'nin moleküler agirligi: 507,18 g/mol. d) GLIKOZ ANALIZI (GOD-POD YÖNTEMI) Yaklasik 2 ul süpernatant test plakasinin her bir gözünden alinir ve bir 96 gözlü plakaya eklenir. Bir standart olarak, benzer bir sekilde yaklasik 2 ul Glikoz standart reaktifi (Kons. 100 mg/dl) de üç kopya hâlinde 96 gözlü plakaya eklenir. Bu gözlere yaklasik 200 pl Glikoz reaktifi (Medsource Ozone) eklenir ve oda sicakliginda yaklasik dk boyunca inkübe edilir. Absorbanslar BioRad plaka okuyucu kullanilarak yaklasik 490 nm'de ölçülür. Graph Pad Prism yazilimi kullanilarak grafikler çizilir ve analiz edilir. Örnek 7.2: Hücre Ölümünü Belirlemek için Analizler Laktat Dehidrojenaz degerlendirmesi, LDH Cytotoxicity Assay Kit (Cayman) kullanilarak yapilir. Birinci adimda, LDH Iaktatin pirüvata oksidasyonu ile NAD*'nin NADH'ye ve H"ya indirgenmesini katalizler. Reaksiyonun ikinci adiminda, diaforaz, bir tetrazolyum tuzunun (INT) 490-520 nm'de güçlü bir sekilde absorbe eden hayli-renkli formazana indirgenmesini katalizlemek için yeni-olusturulmus NADH'yi ve H"yi kullanir. Üretilen formazan miktari, sitotoksisitenin bir sonucu olarak kültür vasati içine salinan LDH miktari ile orantilidir. Plaka Düzenegi: Her bir plaka, bir standart egri, hücreler içermeyen gözler ve deneysel muamele veya vehikül ile hücreler içeren gözler içermelidir. 96-gözlü doku plakalari, yaklasik 400xg'de bes dakika boyunca sentrifüj edilir. Yeni bir 96-gözlü plaka kullanilarak, yukarida hazirlanan standartlarin yaklasik 100 ul'si uygun gözlere transfer edilir. Kültürlenmis hücrelerin her bir gözünden her bir süpernatantin yaklasik 100 ul'si yeni plaka üzerinde karsilik gelen gözlere transfer edilir. Yaklasik 100 ul Reaction Solution bir tekrarli pipet kullanilarak her bir göze eklenir. Plaka oda sicakliginda yaklasik 30 dakika boyunca bir orbital sallayici üzerinde hafif sallama ile inkübe edilir. Bir plaka okuyucu ile yaklasik 490 nm'de absorbans okunur. Hesaplamalar: Yalnizca analiz tampon vasati (kör çözeltiler) içeren gözlerin ortalama absorbans degerleri, tüm diger gözlerin absorbans degerlerinden çikartilir. Bir standart Egri, LDH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak 490 nm'de absorbans için grafik hâline getirilir ve dogrunun denklemi belirlenir. Örnek içinde bulunana LDH aktivitesinin belirlenmesi, asagidaki formül kullanilarak hesaplanir: (A492 nm - y-kesen) LDH Aktivitesi (pU) = _ LDH aktivitesi analizinden deger (uU) Örnek içindeki toplam LDH Aktivitesi (pU/ml) = analiz edilen X örnek hacmi (genel olarak 0.1 mi› f) KASPAZ-3 ANALIZI CPP32/Caspase-3 Fluorometric Protease Assay Kit (BioVision)i DEVD-bagimli Kaspaz aktivitesini analiz etmek için kullanilir. Analiz, DEVD-AFC (AFC: 7-amino-4-triflorometil koumarin) substratinin klevajinin saptanmasina dayanir. DEVD-AFC, mavi isik yayar (Amaks = 400 nm); CPP32 veya ilgili Kaspazlar ile sübstratin klevaji üzerine, serbest AFC, bir florometre veya bir flüoresans mikro-fitre plaka okuyucu kullanilarak kantifiye edilen, bir sari-yesil flüoresans yayar (Amaks = 505 nm). Bir apoptotik örnekten AFC'nin flüoresansinin bir indüklenmemis kontrol ile karsilastirilmasi, Kaspaz-ß/CPPSZ aktivitesindeki kat artisinin belirlenmesine olanak saglar. Analiz Prosedürü 1. Arzu edilen yöntem ile hücrelerde apoptoz indüklenir. Es-zamanli olarak, indüksiyon olmayan bir kontrol kültürü inkübe edilir. 2. Hücreler sayilir ve (apoptoz düzeyine bagli olarak) yaklasik 1-5 x 106 hücre pelet hâline getirilir veya yaklasik 20-200 ug hücre lizati kullanilir. Doku örnekleri için, doku, doku lizati üretmek için Lizis Tamponu (1X doku hacmi Için, yaklasik 3X hacim lizis tamponu eklenir) içinde homojenize edilir, akabinde kit prosedürü takip edilir. 3. Hücreler yaklasik 50 pl sogutulmus Hücre Lizis Tamponu içinde yeniden- süspanse edilir. 4. Hücreler buz üzerinde yaklasik 10 dakika inkübe edilir. . Her bir örnege yaklasik 50 pl 2X Reaksiyon Tamponu (yaklasik 10 mM DTT içerir) eklenir. 6. Yaklasik 1 mM'Iik DEVD-AFC substratinin yaklasik 5 ul'si (yaklasik 50 HM nihai konsantrasyon) eklenir ve yaklasik 37°C'de yaklasik 1-2 saat inkübe edilir. 7. Örnekler bir 400-nm'lik eksitasyon filtresi ve 505-nm'lik emisyon filtresi ile donatilmis bir florometre içinde okunur. Bir plaka-okuma düzenegi için, örnekler bir 96-gözlü plakaya transfer edilir. Tüm analiz, dogrudan bir 96-gözlü plaka içinde de gerçeklestirilebilir. CPP32 aktivitesindeki kat-artisi, bu sonuçlari indüklenmemis kontrolün düzeyi ile karsilastirma ile belirlenir. 9) KASPAZ-8 ANALIZI FLICE/Caspase-8 Fluorometric Assay Kit (BioVision), IETD dizisini taniyan Kaspazlarin aktivitesini analiz etmek için kullanilir. Analiz, IETD-AFC (AFC: 7-amin0-4-triflorometil koumarin) substratinin klevajinin saptanmasina dayanir. IETD-AFC, mavi isik yayar (Amaks = 400 nm); FLICE veya ilgili Kaspazlar ile sübstratin klevaji üzerine, serbest AFC, bir florometre veya bir flüoresans mikro-titre plaka okuyucu kullanilarak kantifiye edilen, bir sari-yesil flüoresans yayar (Amaks = 505 nm). Bir apoptotik örnekten AFC'nin flüoresansinin bir indüklenmemis kontrol ile karsilastirilmasi, FLICE aktivitesindeki kat artisinin belirlenmesine olanak saglar. Analiz Prosedürü 1. Arzu edilen yöntem ile hücrelerde apoptoz indüklenir. Es-zamanli olarak, indüksiyon olmayan bir kontrol kültürü inkübe edilir. 2. Hücreler sayilir ve yaklasik 1-5 x 106 hücre pelet hâline getirilir veya protein konsantrasyonu ölçüleceginde yaklasik 500-200 ug hücre Iizati kullanilir. 3. Hücreler yaklasik 50 ul sogutulmus Hücre Lizis Tamponu içinde yeniden-süspanse edilir. Hücreler buz üzerinde yaklasik 10 dakika inkübe edilir. 4. Her bir örnege yaklasik 50 pl 2x Reaksiyon Tamponu (yaklasik 10 mM DTT içerir) eklenir. Yaklasik 1 mM'Iik IETD-AFC substratinin yaklasik 5 ul'si (yaklasik 50 pM nihai konsantrasyon) eklenir ve yaklasik 37°C'de yaklasik 1-2 saat inkübe edilir. . Örnekler bir 400-nm'lik eksitasyon filtresi ve 505-nm'lik emisyon filtresi ile donatilmis bir florometre içinde okunur. Bir plaka-okuma düzenegi için, örnekler bir 96-gözlü plakaya transfer edilir. Tüm analiz, dogrudan bir 96-gözlü plaka içinde de gerçeklestirilebilir. FLICE aktivitesindeki kat-artisi, bu sonuçlari indüklenmemis kontrolün düzeyi ile karsilastirma ile belirlenebilir. Örnek 7.3: Hücre Senesansini Belirlemek için Analizler: h) SENESANS ILISKILI BETA-GAL BOYAMA Doku kesitleri durumunda, sivi nitrojen (LN2) içine daldirarak dondurulmus Optimal kesme sicakligindaki (OCT) bilesik içine gömülmüs doku süperfrost Iamlar üzerine yerlestirilir. Akabinde, hücreler yaklasik 37°C'de boyama çözeltisi (yaklasik 40 mM sitrik asit sodyum fosfat, pH 6,0, yaklasik 1 mg/ml 5-bromo-4-kl0ro-3-izolil-b-D- galaktosid [X-gal, Fisher], yaklasik 5 mM potasyum ferrisiyanür, yaklasik 5 mM potasyum ferrosiyanür, yaklasik ile yaklasik 20 sa inkübe edilir. Inkübasyondan sonra, hücreler PBS ile iki kere yikanir ve maya boyama için basit isik mikroskobu altinda incelenir. Örnek 7.4: Histolojik Degerlendirme için Analizler! IHC Analizleri: i) IMMÜNO-HISTOKIMYASAL (IHC) ANALIZLER: Tümör yaklasik %10'Iuk tamponlanmis formalin içinde fikse edilir ve parafine gömülür. Tümör kesitleri kesilir (yaklasik 5 um) ve ksilen içinde parafininden arindirilir, bunu azalan derecelerde etanol içinde rehidrasyon izler. Kesitler Hematoksilin ve Eozin (H&E) ile boyanir. Antijen geri-alimi Vect0r® Antigen Unmasking Solution (Citrate based, Vector Laboratories) içinde yaklasik 30 dk boyunca mikro dalga isitmaya maruz birakma ile yapilir. Lamlarin sogumasina izin verilir ve bunu takiben Iamlar Tris tamponlu salin içinde yikanir. Endojen peroksidazin söndürülmesi, kesitleri yaklasik yaklasik %10'Iuk keçi serumu ile yaklasik 1 sa boyunca oda sicakliginda yapilir. Müteakip inkübasyon adimlarini, Tris Tamponlu Salin (TBS) içinde yikamalar izler. Kesitler, yukarida bahsedilen kosullarda primer antikor ile inkübe edilir, bunu RT'de 1 sa boyunca yabanturpu peroksidaza (HRP)-k0njuge edilmis sekonder antikor (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent; Cell Signaling Technology) ile inkübasyon izler. Kromojenik sinyalin gelismesi, 3,3'-diaminobenzidin (DAB Peroxidase Substrate Kit; Vector Laboratories) kullanilarak yapilir. Dokular, Hematoksilin (Papanicolaous solution 1a; Merck) ile karsi-boyanir. Tavsan monoklonal fosfo-AKT (Ser (Clone 4OH9, Cell Signaling Technology) yaklasik 4°C'de gece boyu inkübasyon için sirasiyla yaklasik 1:50'Iik ve yaklasik 1:100'Iük seyreltmede kullanilir. Tavsan monoklonal fosfo- 86 Ribozomal Protein (pSöRP) (Ser ve fosfo-PRAS40 (Thr246, 077D7), Cell Signaling Technology firmasindan elde edilir ve yaklasik 4°C'de gece boyu inkübasyon için yaklasik 1:200'Iük seyreltmede kullanilir; yaklasik 1:200'Iük seyreltmede tavsan poliklonal GLUT1 (Abcam) yaklasik 25°C ila yaklasik 35°C araliginda oda sicakliginda (RT) yaklasik 1 saatlik inkübasyon için kullanilir; tavsan poliklonal Ki67 (Vector Laboratories), RT'de yaklasik 1 sa boyunca yaklasik 1:600'Iük seyreltmede kullanilir. Apoptoz indüksiyonu, RT'de yaklasik 1 sa boyunca yaklasik 1:600'lük seyreltmede poliklonal anti-yarilmis Kaspaz-3 (Asp175) antikoru (rabbit polyclonal, Cell Signaling Technology) kullanilarak yarilmis Kaspaz-3 için boyama ile saptanir. Eslesmis lgG izotip kontrolü, her bir primer antikor için kullanilir. Her bir lam bagimsiz bir sekilde, iki uzman tarafindan incelenir ve skorlama/kademelendirme, H skoru formülü uyarinca gerçeklestirilir. j) FIKSE EDILMIS DOKULARIN IMMÜNOHISTOKIMYA BOYAMASI - FOSFO ERK/FOSFOR EGFR Bu teknige dayanarak olusturan temel prensip, çogaltilan ve görsellestirilen antijen- antikor reaksiyonudur. Hedef antijen, fiksasyon sirasinda neden olunan protein katlanmasindan dolayi antikor için fiziksel olarak erisilemez olabilir. Antijen geri-alimi denilen bir prosedür ile bunun üstesinden gelinir, burada isi protein katlanmasini degistirmek için kullanilir ve antijen daha çok erisilebilir hâle gelir. Endojen peroksidazi söndürme, protein bloku ve endojen biyotinin blokaji, arka-plan boyamayi ve spesifik- olmayan baglamayi önlemek için önemli adimlardir. Bu standardize edilmis protokol, hedef antijeni baglayan primer antikor (genel olarak tavsan/fare mAb); primer antikoru baglayan biyotinlenmis sekonder antikor (genel olarak keçi anti-tavsan lgG) ve sekonder antikora bagli biyotini hedef alan avidin biyotin kompleksi (ABC: bir kompleks olusturmak için avidini baglayan biyotinlenmis yabanturpu peroksidazi) içeren bir üç katmanli saptama sistemini kullanir. Antikorlar, antijenin saptanmasina ve sinyal amplifikasyonuna yardimci olur. ABC içinde bulunan peroksidaz enzimi bir reaksiyonu katalizler, burada DAB (3,3'-diamin0benzidin), bir mikroskop altinda görsellestirilebilen, nihayetinde hedef antijeni saptayan, bir kahverengi çökelti üretir. Prosedür: 1. Parafinden Arindirma ve Rehidrasyon asagida oldugu sekilde gerçeklestirilir: a. Ksilen - 2 yikama - her biri 6 dk ] Parafinden Arindirma b. %100 Etanol -1 yikama - her biri 3 dk" c. %90 Etanol -1 yikama - her biri 3 dk KsilenizasyondanArindirma d. %70 Etanol - 1 yikama - her biri 3 dk , . Musluk suyu (akan) - 10 dk ] Rehidrasyon Distile su -1 yikama - 5 dk Bunu antijen geri-alimi izler a. Preparasyon: bir 1 L'Iik beherglas içinde yaklasik 600 mL distile su + yaklasik b. Lamlar çözelti içinde yaklasik 10 dakika boyunca bekletilir. c. Beherglasin içerikleri ve Iamlar asagida oldugu sekilde mikrodalgaya koyulur: M-Düsük : yaklasik 5 dk Orta : yaklasik 5 dk M-Yüksek : yaklasik 5 dk Yüksek : yaklasik 5 dk d. Beherglasi bir musluk suyu ile doldurulmus banyo içine yerlestirerek Iamlar oda sicakligina sogutulur. e. Lamlar her bir yikama yaklasik 5 dk olmak üzere yaklasik 4 kere distile su ile yikanir (Coplin Kavanozu). f. Lamlar1X PBS ile 5 dk boyunca yikanir (Coplin Kavanozu). Endojen peroksidazin söndürülmesi yapilir a. Taze Preparasyon: yaklasik 9 mL H202 (%30) + yaklasik 75 mL Distile su b. Lamlar H202 çözeltisi içinde yaklasik 15 dk boyunca inkübe edilir (Coplin Kavanozu). c. Lamlar akan musluk suyu altinda yaklasik 2 dk boyunca yikanir. d. Lamlar 1X PBS ile yaklasik 7 dk boyunca yikanir (Coplin Kavanozu). e. Hidrofobik Pap kalemi kullanilarak doku yuvarlak içine alinir (bu, antikorlarin hacmini mümkün oldugu kadar küçük tutarak yapilir). Protein blokaji yapilir. Bu ve müteakip adimlar bir nemlendirilmis bölme (islak Whatman filtre kâgidi içeren bir tepsi) gerektirir. a. Yaklasik %10'luk Keçi serumu ( hazirlanir b. Her bir doku kesitine yaklasik 75 uL keçi serumu eklenir ve yaklasik 1 saat boyunca inkübe edilir. c. Serum dökülür. Yikama yapilmasi gerekmez. Avidin/Biyotin Bloku (Vector Labs #SP2001) yapilir a. Iki Eppendorf tüp içine gerekli olan Avidin ve Biyotin miktarlari dagitilir. b. Her bir doku kesitine yaklasik 75 uL Avidin eklenir ve yaklasik 15 dk boyunca inkübe edilir. C. Avidin dökülür ve Iamlar 1X PBS ile kisa bir süreligine durulanir (Coplin Kavanozu ). Primer Antikor eklenir a. 1X PBS ile yaklasik 1:200'Iük Fosfo-Erk/Fosfo-EGFR (Cell Signalling Technology #4370/#2237) hazirlanir. b. Her bir doku kesitine yaklasik 75 uL eklenir ve yaklasik 1 saat inkübe edilir. C. Lamlar her bir yikama yaklasik 3 dk olmak üzere 1X PBS ile üç kere yikanir (Coplin Kavanozu). Bunu, Sekonder Antikor eklenmesi izler b. Her bir doku kesitine yaklasik 75 uL eklenir ve yaklasik 30 dk inkübe edilir. c. Lamlar her bir yikama yaklasik 5 dk olmak üzere 1X PBS ile kapsamli bir sekilde üç kere yikanir (Coplin Kavanozu). ABC Reagent (Vector Labs; Vectastain ABC Kit Peroxidase Goat IgG #PK-4005) eklenir a. Asagidaki reaktif hazirlanir: yaklasik 1 damla çözelti A + yaklasik 1 damla çözelti B + yaklasik 2,5 mL 1X PBS. Reaktif oda sicakliginda kullanilmadan önce yaklasik 30 dk boyunca inkübe edilir. Herhangi bir ekstra miktar. en fazla bir ay boyunca yaklasik 4°C'de saklanabilir. b. Her bir doku kesitine yaklasik 75 pL eklenir ve yaklasik 30 dk inkübe edilir. c. Lamlar her bir yikama yaklasik 5 dk olmak üzere 1X PBS içinde üç kere yikanir (Coplin Kavanozu). DAB Substrate (Vector Labs #SK4100) Asagidaki adimlar karanlik bir odada yapilacaktir. a. Taze preparasyon DAB substrati: yaklasik 2,5 mL distile su içinde yaklasik 1 damla Tampon + yaklasik 2 damla DAB + yaklasik 1 damla H202. b. Her bir doku kesitine yaklasik 75 uL reaktif eklenir ve uygun maruziyet süresine karar vermek için mikroskop altinda gözlemlenir. c. Potasyum permanganat çözeltisi içindeki reaktif dökülür ve Iamlar musluk suyu içinde yikanir. Lamlar Hematoksilin kullanilarak karsi-boyamaya tabi tutulur a. Lamlar 2-3 kere hematoksiline daldirilir. b. Lamlar akan musluk suyu altinda yaklasik 5 dk boyunca yikanir. c. Lamlar yaklasik %1'Iik Lityum karbonat çözeltisi içinde yaklasik 30 saniye boyunca yikanir. d. %70 Etanol -1 yikama - yaklasik 3 dk e. %95 Etanol -1 yikama - yaklasik 3 dk f. %100 Etanol - 2 yikama - yaklasik 3 dk 9. Ksilen - 2 yikama - yaklasik 3 dk a. Lamlar DPX kullanilarak temiz Iameller ile kapatilir ve kurumaya birakilir. b. Uygun bir sekilde etiketlenir. k) FIKSE EDILMIS DOKULARIN TUNEL BOYAMASI Uç deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme (TUNEL), nükleik asitlerin uç ucunu etiketleme ile DNA fragmentasyonunu saptamak için bir yöntemdir. TUNEL, apoptotik sinyalleme kaskadlarindan kaynaklanan DNA fragmentasyonunu saptamak için kullanilir. Analiz, DNA içinde uç deoksinükleotidil transferaz veya TdT, bir belirteç ile sekonder bir sekilde etiketlenen dUTP'lerin eklenmesini katalizleyecek olan bir enzim, ile tanimlanabilen çentiklerin varligina dayanir. Bu ayrica, siddetli DNA hasarindan muzdarip olan hücreleri de etiketleyebilir. Prosedür: 1. Birinci adim, parafinden arindirmayi ve rehidrasyonu içerir: a. Ksilen - 2 yikama - her biri 6 dk :J ParafindenArindirma b. %100 Etanol -1 yikama - her biri 3 dk` c. %90 Etanol - 1 yikama - her biri 3 dk Ksilenizasyondan Arlndlrma d. %70 Etanol - 1 yikama - her biri 3 dk J . Musluk suyu (akan) - 10 dk 1 Rehidrasyon Distile su -1 yikama - 5 dk 4 2. Bunu antijen geri-alimi izler 2. b. Her bir doku kesitine yaklasik 50 uL eklenir ve yaklasik 5 dk boyunca inkübe edilir. 3. c. Lamlar her bir yikama yaklasik 2 dk olmak üzere dH20 içinde iki kere yikanir (Coplin Kavanozu). 3. Endojen peroksidazin söndürülmesi yapilir a. Taze Preparasyon: yaklasik + yaklasik 67,5 mL Distile su b. Lamlar H202 çözeltisi içinde yaklasik 5 dk boyunca inkübe edilir (Coplin Kavanozu). c. Lamlar akan musluk suyu altinda yaklasik 2 dk boyunca yikanir. d. Lamlar1X PBS içinde yaklasik 5 dk boyunca iki kere yikanir (Coplin Kavanozu). e. Hidrofobik Pap kalemi kullanilarak doku yuvarlak içine alinir (bu, antikorlarin/reaktiflerin hacmini mümkün oldugu kadar küçük tutarak yapilir). 4. Bunu, denge tamponu ile muamele izler. Bu ve müteakip adimlar bir nemlendirilmis bölme (islak Whatman filtre kâgidi Içeren bir tepsi) gerektirir. a. Her bir doku kesitine yaklasik 13 uL denge tamponu eklenir ve en az yaklasik 10 saniye boyunca inkübe edilir (en fazla yaklasik 60 dk, iyidir). b. Reaktif dökülür. Yikama yapilmasi gerekmez. . TdT enzimi eklenir a. TdT enzimi yaklasik 3:7'lik oranda Reaksiyon Tamponu içinde seyreltilir (Örnegin: yaklasik 70 uL Reaksiyon Tamponu içinde yaklasik 30 uL TdT). b. Her bir doku kesitine yaklasik 15 uL eklenir ve bir nemlendirilmis bölme içinde yaklasik 37°C'de yaklasik 1 saat boyunca inkübe edilir. c. Reaktif dökülür. a. Yaklasik 34 mL dH20'ye yaklasik 1 mL stok tamponu ekleme ile Durdur/Yika Tamponu hazirlanir. b. Lamlar tampon içine yerlestirilir ve yaklasik 15 s boyunca ajite edilir. c. Yaklasik 10 dk boyunca oda sicakliginda inkübe edilir. d. Lamlar her bir yikama yaklasik 1 dk olmak üzere 1X PBS ile üç kere yikanir (Coplin Kavanozu). e. Anti-digoksijenin Konjugatinin bir alikotu uzaklastirilir ve oda sicakligina yerlestirilir. 7. Anti-Digoksijenin Konjugati eklenir a. Her bir doku kesitidine 15 uL Anti-digoksijenin konjugati eklenir ve oda sicakliginda yaklasik 30 dk boyunca bir nemlendirilmis bölme içinde inube b. Lamlar her bir yikama yaklasik 2 dk olmak üzere 1X PBS içinde yaklasik dört kere yikanir (Coplin Kavanozu). 8. Lamlara peroksidaz substrati: DAB ile muamele edilir a. DAB substrati hazirlanir - DAB seyreltme tamponu ile yaklasik 1:50'Iik seyreltme. b. Her bir doku kesitine yaklasik 15 uL reaktif eklenir ve yaklasik 3-6 dk boyunca inkübe edilir. Uygun maruziyet süresini belirlemek için mikroskop altinda gözlenir. c. Lamlar her bir yikama yaklasik 1 dk olmak dH20 içinde üç kere yikanir (Coplin Kavanozu). d. Lamlar oda sicakliginda dH2O içinde yaklasik 5 dk boyunca inkübe 9. Metil yesili kullanilarak karsi-boyama yapilir a. Oda sicakliginda yaklasik 10 dk boyunca yaklasik %0,5'Iik metil yesili içinde karsi-boyanin b. Lamlar bir Coplin kavanozu içinde yaklasik 3 dHzO degisimi ile yikanir, birinci ve ikinci yikamalarin her birinde lam yaklasik 10 kere daldirilir, bunu üçüncü yikamada ajitasyon olmadan yaklasik 30 s izler. c. Lamlar bir Coplin kavanozu içinde yaklasik 3 %100'Iük N-Bütanol degisimi ile yikanir, birinci ve ikinci yikamalarin her birinde lam yaklasik kere daldirilir, bunu üçüncü yikamada ajitasyon olmadan yaklasik 30 s . Lamlarin üzerinin kapatilmasi a. Doku yaklasik 2 Ksilen degisimi içine yerlestirme ile dehidrate edilir, her bir kavanoz içinde yaklasik 2 dk boyunca inkübe edilir. kapatilir. l) HEMATOKSILIN VE EOZIN BOYAMA (H&E), histolojide popüler bir boyama yöntemidir. H&E dokunun mitotik sekillerini, nekrozunu ve genel bariz özelliklerini degerlendirmek için rutin olarak gerçeklestirilir. Hematoksilin & Eozin boyama (H&E) analizi ayrica, tümör stroma içerigini belirlemek için de kullanilir. Örnek 7.4: Hücre Proliferasyonu için Analizler. proliferasyon belirteçleri için analizler için de kullanilir. Örnek 7.6: Nükleik asit için Analizler. Nükleik asit izolasyonu ilaveten, RNA ve miRNA mikro-dizilim analizinde ve yalnizca seçilen örnekler için spesifik mutasyonlar için gen analizinde degerlendirilir. Yalnizca seçilmis örnekler için DNA için ekzon dizileme de gerçeklestirilebilir. Genetik profilleme, tümörün biyolojisi anlamak için ve "Klinik Yanit Kestirici" analizin bir parçasi olmadan m) DOKULARDAN TOPLAM RNA'NIN SAFLASTIRILMASI: Dokulardan toplam RNA'nin saflastirilmasi, Qiagen RNA extraction kit uyarinca yapilir. 1. RNA geç stabilize edilmis dokular reaktiften penseler kullanilarak uzaklastirilir. 2. Yaklasik 30-50 mg tümör kullanilir. 3. Tartilmis doku yaklasik 1,2 ml'lik tüp içine yerlestirilir, dokuya yaklasik 350 pl RLT tamponu eklenir, yaklasik 3000 rpm'de yaklasik 60 saniye boyunca bir doku mikro- parçalayici içinde hemen homojenize edilir. 4. Lizat ayri bir tüp içine toplanir, son hizda yaklasik 3 dk boyunca sentrifüj edilir. Süpernatant pipetleme ile dikkatli bir sekilde uzaklastirilir ve bu yeni bir mikro sentrifüj tüpüne transfer edilir. . Berrak hâle getirilmis lizata yaklasik 1 hacim (yaklasik 350 pl) yaklasik %70'lik etanol eklenir ve pipetleme ile hemen karistirilir. 6. Örnek yaklasik 2 ml'lik toplama tüpü içine yerlestirilmis bir RNeasy spin kolonuna transfer edilir. Kapagi hafif bir sekilde kapatilir ve yaklasik 10000 rpm'de yaklasik 15 s boyunca sentrifüj edilir. Kolondan akanlar dökülür. 7. Yaklasik 350 pl RW1 tamponu RNeasy spin kolonuna eklenir. Kapagi hafif bir sekilde kapatilir ve yaklasik 10000 rpm'de yaklasik 15 s boyunca sentrifüj edilir. Kolondan akanlar dökülür. 8. Yaklasik 10 pl DNase 1 stok çözeltileri yaklasik 70 pl RDD tamponuna eklenir. Tüpü hafif bir sekilde ters çevirme ile karistirilir. 9. Yaklasik 80 ul DNase 1 inkübasyon karisimi RNeasy spin kolonu membranina eklenir, oda sicakliginda yaklasik 15 dk inkübe edilir. . Yaklasik 350 ul RW1 tamponu RNeasy spin kolonuna eklenir. Kapagi hafif bir sekilde kapatilir ve yaklasik 10000 rpm'de yaklasik 15 s boyunca sentrifüj edilir. Kolondan akanlar dökülür. 11. Yaklasik 500 pl RPE tamponu RNeasy spin kolonuna eklenir. Kapagi hafif bir sekilde kapatilir ve yaklasik 10000 rpm'de yaklasik 15 s boyunca sentrifüj edilir. Kolondan akanlar dökülür. 12. Yaklasik 500 ul RPE tamponu RNeasy spin kolonuna eklenir. Kapagi hafif bir sekilde kapatilir ve yaklasik 10000 rpm'de yaklasik 2 dk boyunca sentrifüj edilir. Kolondan akanlar dökülür. 13. RNeasy spin kolonu bir yeni 2 ml'lik toplama tüpü içine yerlestirilir ve kolondan akanlar ile birlikte eksi toplama tüpü atilir. Kapagi hafif bir sekilde kapatilir ve son hizda yaklasik 1 dk boyunca sentrifüj edilir. 14. RNeasy spin kolonu bir yeni 1,5 ml'lik toplama tüpü içine yerlestirilir. Yaklasik 35 pl RNase serbest su dogrudan spin kolonu membranina eklenir. Kapagi hafif bir sekilde kapatilir ve son hizda yaklasik 10000 rpm'de yaklasik 1 dk boyunca sentrifüj edilir. . RNA ayristirilir ve yaklasik -80°C'de saklanir. n) TOPLAM RNA'NIN IZOLASYONU VE MIKRO-DIZILIM: RNA geç stabilize edilmis çekirdek biyopsisi ve karsilik gelen insan tümör ksenogreft örnekleri standart operasyon prosedürüne göre mikro-parçalayici (Sartorius) kullanilarak lize edilir. Pulverize edilmis dokulardan izole edilmis toplam RNA bunu takiben, biyo-analizör ve nanodrop ile bütünlük için degerlendirilir. Tümör RNA (cRNA) mikro-dizilimi Agilent Sure Print G3 Human GE 8x60K Microarrays sistem platformu (Agilent Technologies) kullanilarak yürütülür. RNA mikro-dizilimi için, yaklasik 7'nin üstündeki bir RIN degeri, bir kesim-degeri olarak kullanilir. Tümör örneklerinden veya eslesmis kontrolden ekstrakte edilmis asagi yukari yaklasik olarak 200 ng RNA nihai olarak cy3/cy5 etiketlenmis çogaltilmis cRNA üretmek için ters transkribe edilir ve Agilent Kits ve platform (Agilent Technologies) kullanilarak profillenir. Dizilim verileri, Feature ekstraksiyon yazilimi ve Agilent's Gene-Spring yazilimi kullanilarak normalize edilir. Ilave istatistiksel analiz, bu çalisma için uygun olan yazilim kullanilarak yürütülür. Veriler, karsilik gelen kontrole kiyasla (hem yukari yönde regüle edilmis hem de asagi yönde regüle edilmis genler için) kat farkliliklari olarak ifade edilir. Yaklasik 1,5 katin altindaki herhangi bir farklilik, ilave validasyon için anlamsiz olarak düsünülür. Bir isi haritasi üretilir ve iliski (genlerin benzerligi) bunlarin yanit duruma göre farkli primer tümör ve ksenogreft tümör örnekleri arasinda açiga kavusturulur. Denetlenmeyen dizilim, CR'den, PR'den veya PD'den türetilen primer tümörün ilaç yaniti baglaminda fonksiyonel profillemeye göre karsilik gelen ksenogreftler ile ilgililigini gösteren bir agaç üretmek için kullanilir. Normalize edilmis verilerin ANOVA analizi, farkli tümörler ve karsilik gelen ksenogreft gruplari arasinda ve içinde diferansiyel bir sekilde eksprese edilmis genleri (P < 0,05'te) ayirt etmek için gerçeklesti rilir. 0) GERÇEK ZAMANLI RT-PCR. Mikro-dizilimden anlamli bir sekilde eksprese edilmis genler, spesifik problar ve primer setleri kullanilarak Stratagene gerçek zamanli PCR platformu kullanilarak dogrulanir. p) MUTASYON ANALIZI IÇIN EKZON DIZILEME. Genomik DNA'Iar, DNAeasy Tissue Kit (Qiagen) kullanilarak primer HNSCC tümörlerinden izole edilir. Kalite kontrolü takiben, DNA'Iarin ekzon dizilemesi önceden tarif edilen prosedürler uyarinca mutasyon analizi için yürütülür. Özet olarak, spesifik dizileme primerleri ve etiketlenmis nükleotidler reaksiyon üretmek içindir ve spesifik gen dizileri Illumina Exome Sequencing platformu ile analiz edilir. Klinik yanit-veren ve yanit-vermeyen gruplarda mutasyonlar spektrumundaki farkliliklar belirlenir. Örnek 8: Klinik sonucu tahmin etmek için algoritmalarin üretilmesi: Tümör hastadan kesip çikarildiginda, bu (tek basina veya kombinasyon hâlinde) çok sayida ilaç ile örnekler 1-3'te tarif edildigi sekilde eksplant analizine tabi tutulur. Ilaca tümör yaniti, Örnek 6'de tarif edildigi sekilde çok sayida analiz ile degerlendirilir. Paralel olarak, klinik sonuçlar yerlesik protokoller uyarinca ölçülür. Farkli agirliklar, eksplantin münferit analiz sonuçlarina verilir, böylece elde edilen birlestirilmis skor gözlenen klinik sonuca bir lineer korelasyona sahiptir; yani, yüksek birlestirilmis skor (örnegin, 60) tam klinik yanita (CR) koreledir, düsük birlestirilmis skor (örnegin, <20) klinik yanit- olmamasina (NR) koreledir. Bu tarz bir skorlama sistemi tasarlandiginda, bu eksplant analizinden gelecekteki bir hastanin klinik yanitini tahmin etmek için kullanilabilir. Agirliklar, münferit parametrelere verilir, böylece kümülatif agirlik-ortalamali veriler gözlenen klinik sonuç ile iyi korelasyona sahiptir. Farkli algoritmalar korelasyona dâhil edilen parametreler için farkli münferit agirliklar (%0-100) kullanir. (Gösterilen 5 örnek algoritmada gösterildigi üzere) agirliklari manüel olarak tayin etmeye ek olarak, bir bilgisayar kullanilarak "Çok-varyantli Analiz" de mümkündür, burada farkli agirliklar, tahmin edilen klinik yanit ve gözlenen klinik yanit arasinda en az sapma miktarina sahip olan en uygun formüle ulasmak için tayin edilir. Çesitli eksplant analizleri ile elde edilen ham skorlar Tablo 4'te saglanir. Bu ayrica klinik okuma da verir (Geleneksel PERCIST kriterleri uyarinca elde edilen Tam Yanit, Parsiyel Yanit veya Yanit-Olmamasi). Tablo 4: Eksplant analizlerinden elde edilen Deneysel Veriler ve klinik degerlendirme. Eksplant analizi Klinik Okuma Örnek Kimlik Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz RECIST Sayisal No Temsil 1 5 20 0 120 NR 1 Örnek Kimlik Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz RECIST Sayisal No Temsil 22 0 O 150 NR 1 9 9 O 0 100 NR 1 19 19 O 0 100 NR 1 5 O 0 25 NR 1 26 27 O 0 42 NR 1 Örnek Kimlik Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz RECIST Sayisal No Temsil 27 8 0 0 50 NR 'l 29 18 O 36 18 NR 1 37 21 9 46 0 PR 2 42 7 O 0 30 NR 1 Tablo 5, gözlenen klinik okuma için sayisal deger verir. 3, 2 ve 1 degerleri sirasiyla, tam yanit, parsiyel yanit ve yanit-olmamasi için verilir. Tablo 6, 5 temsili algoritmanin her birinde eksplant analizi için verilen agirliklari gösterir. Bu agirliklar, eksplant analizinde kullanilan ilaçlarin dogasina göre verilir. Örnegin, aktivitelerini hücre proliferasyonunu bozma ile gösterdigi bilinen ilaçlar hücre proliferasyonu için daha yüksek agirliklar verir. Tablo 5: Klinik Yanitin, parsiyel yanitin ve yanit-olmamasinin sayisal temsili. Tam Yanit 3 Parsiyel Yanit 2 Yanit Yok 1 Tablo 6: Farkli eksplant analizine verilen agirlik, 5 temsili algoritma ile sonuçlanir. Duyarlilik Indeksi Agirligi (%) Viabilite Histoloji Prolife rasyon Apoptoz Yöntem 1 %25 %25 %25 %25 Yöntem 2 %30 %30 %25 %25 Yöntem 3 %30 %15 %25 %30 Yöntem 4 %30 %30 %30 %10 Yöntem 5 %10 %20 %30 %40 Her bir hasta için duyarlilik indeksi (yani, M-skoru), Tablo 7'de açiklandigi üzere, ham skoru karsilik gelen agirlik faktörü ile çarpma ve elde edilen sayilari toplama ile hesaplanir. Örnegin, hasta 1, Viabilite, histoloji, proliferasyon ve apoptoz için sirasiyla , 20, 0 ve 120 olan ham eksplant analiz skoruna sahiptir. Algoritma 1 (veya yöntem 1) altinda, bu faktörlerin her biri %25'Iik bir agirliga verilir. Böylelikle. algoritma 1 kullanilarak hasta 1 için duyarlilik indeksi asagidaki sekilde hesaplanacaktir: Bu sekilde hesaplanan Duyarlilik Indeksi, asagida oldugu sekilde tahmin edilen klinik sonuca (Tablo 8-12) dönüstürülür: Duyarlilik Indeksi 60 oldugunda, tahmin edilen klinik sonu = 3 (= Tam yanit). < Duyarlilik Indeksi < 60 oldugunda, tahmin edilen klinik sonu = 2 (= Parsiyel Duyarlilik Indeksi < 20 oldugunda, tahmin edilen klinik sonu = 1 (= Yanit- Olmamasi). Tablo 7: 5 temsili algoritma ile ölçüldügü üzere eksplant analizleri için agirliklarin uygulamasi ile ölçülen duyarlilik indeksi. Duyarlilik Indeksi Yöntem 3 Yöntem 4 Duyarhhkindeksi YüMm1 YÜMmZ YüMmS YüMm4 YÜMm5 8 7 9 4 11 14 17 7 21 9 9 11 5 13 Duyarlilik Indeksi Yöntem 1 Yöntem 2 Yöntem 3 Yöntem 438 Yöntem 5 Tahmin edilen klinik sonuç, algoritmalarin kestirici gücünü ölçmek için gözlenen klinik sonuç ile karsilastirilir (Tablolar 8-12). Gölgelendirilmis kisimlar, tahmin edilen sonuç ve gözlenen sonuç arasinda eslesmenin oldugu olgulari gösterir. Tablo 8: Algoritma 1'in Kestirici Etkililigi: "Tahmin Edilen Klinik Sonuç" ve "Gözlenen Klinik Sonuç" arasinda karsilastirma Duyarlilik indeksi : 60 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca. 3'IUK bir skor verilir (yani, Tam yanit) Duyarlilik indeksi <20 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca. 1'lik bir skor verilir (yani. Yanit-Olmamasi) 20 <' Duyarlilik Indeksi < 60 oldugunda, Tahmin edilen klinik sonuca. 2*Iii< bir sonuç verilir (yani. Parsiyel Yanit). Algoritma 1 Duyarlilik Tahmin _ Gözlenen Klinik Indeksi Edilen Klinik Sonuç 47 2 i 2 48 2 i 2 49 2 2 i 51 2 j 2 71 _ ...3 _ _I_ ....3 _ _ _ 2 n 1.. 2 Tablo 9: Algoritma-Z'nin Kestirici Etkililigi: "Tahmin Edilen Klinik Sonuç" ve "Gözlenen Klinik Sonuç" arasinda karsilastirma. Duyarlilik indeksi :› 60 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca. 3'l'uk bir skor verilir (yani. Tam yanit] Duyarlilik Indeksi <20 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca 1`Iik bir skor verilir (yani` Yanit-Olmamasi). 20 < Duyarlilik Indeksi < 60 oldugunda, Tahmin edilen klinik sonuca. 2'Iik bir sonuç verilir (yani. Parsiyel Yanit). Algoritma 2 Duyarlilik Tahmin Klinik Indeksi Edilen Klinik Sonuç NINNNHWNN'HwNwi-s Tablo 10: Algoritma 3'ün Kestirici Etkililigi: "Tahmin Edilen Klinik Sonuç" ve "Gözlenen Klinik Sonuç'i arasinda karsilastirma. Duyarlilik indeksi 60 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca. 3'luk bir skor verilir ijvyani Tam yanit). Duyarlilik indeksi `:'20 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca. 1'lik bir skor verilir (yani. `r'::init-Olmamasiji 20 < Duyarlilik indeksi < 80 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca. 2`lik bir sonuç verilir (yani Parsiyel Yanit; Algoritma 3 Duyarlilik _Tahmin _ Klinik Indeksi Edilen Klinik Sonuç 4 l564438 rqi-Nw-NNNNNNNNN-o`wwn-ww 21 -___ -__i.__-___ ___i_ _ 42' 2 2 32 2 '2 _ __ __z-____ _2-_ 27' 2 2 3& ----2---- -------- Tablo 11: Algoritma 4'Ün Kestirici Etkililigi: "Tahmin Edilen Klinik Sonuç" ve "Gözlenen Klinik Sonuç" arasinda karsilastirma Duyarlilik indeksi 60 oldugunda Tahmin edilen klinik sonuca. 3'Iuk bir skor venlir (yani Tam yanit) Duyarlilik indeksi <20 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca 1'lik bir skor verilir [yani `Yanit-Olmamasiji. 20 4: Duyarlilik Indeksi <' 60 oldugunda Tahmin edilen klinik sonuca 21"( bir sonuç verilir (yani. Parsiyel Yanit] AQOMma4 Tahmin Klinik 67 -___- -3-._-_ _ 1__-_J 45 2 2 i 45 2 2 l 61 3 3 j 3-145 Tablo 12: Algoritma 5'in Kestirici Etkililigi: "Tahmin Edilen Klinik Sonuç" ve "Gözlenen Klinik Sonuç" arasinda karsilastirma. Duyarlilik indeksi 60 oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca 3'iuk bir skor verilir (yani Tam yanit) Duyarlilrk Indeksi <2O oldugunda. Tahmin edilen klinik sonuca` 1'Iik bir skor verilir lyani Yanit-Olmamasi) 20 < Duyarlilik indeksi < 60 oldugunda Tahmin edilen klinik sonuca( 2'lik bir sonuç verilir (yani. Parsiyel Yanit] Algoritma 5 D."Ya""!k Ediilgrriinlêtl'iinik &Tik Tablolar 6-13'te manüel agirliklar vermek yerine, bir bilgisayar münferit eksplant analizlerine bu tarz agirliklar vermek amaciyla opsiyonel olarak bir çoklu-regresyon analizi kullanmak için kullanilabilir. Bu tarz durumlarda, bilgisayar gözlenen eksplant verileri kullanilarak bir polinominal uyum (lineer, ikinci dereceden veya daha yüksek mertebeden denklem) ile birlikte anilacaktir ve gözlenen klinik sonuç için en az sapmaya sahip olan bir tahmin edilen klinik sonuç öne sürecektir. Örnek 9: Yanit Tahmini Üret_mek için Çok Saga Solig Kanserde Eksplant Sistemi'nin Kullanilmasi çabuk taranmasina olanak saglar. Yerlesik ve arastirma ile ilgili olan (hem sitotoksik hem de hedeflenmis) anti-kanser ajanlarinin bir paneli primer olarak, bunlarin bilinen tümör büyümesi inhibisyonu özelliklerine göre seçilir. Bu ilaçlarin ex vivo etkinligi, 72 saatlik proliferasyon (Ki-67) ve viabilite analizinde (WST) hasta kaynakli eksplantlarin bir paneli için test edilir. Inhibisyon yüzdesi, muamele edilmemis kontrole atfen belirlenir. Sonuçlar Sekil 11'de açiklanir. %50'nin üstünde inhibisyonun, tam yanit oldugu düsünülür. %50'nin altinda ancak %20'nin üstünde olan inhibisyonun parsiyel yanit oldugu düsünülür. Yanit olmayan gruplarda, hiç bir sey göstermeyen (%0 ila %20 inhibisyon) ilaçlar yanit-olmadigi seklinde düsünülür ve bu kararli hastaliklara benzer. Özel bir endikasyon için hücre proliferasyonunda artis gösteren ilaçlarin progresif hastaliklar oldugu düsünülür. Elde edilen sonuçlar, "Klinik Yanit Kestirici" analizin tümör ksenogreft örnegini taklit ettigini gösterir. Böylelikle, bu ilaveten klinik sonuçlar kullanilarak valide edilir. Tümör örnekleri standart protokoller uyarinca bunlarin serumu ile birlikte hastalardan toplanir. Hastalar, "Klinik Yanit Kestirici" eksplant analizin baslangicindan önce PETBT veya BT degerlendirmesine sahiptir. Toplanan örnekler, Klinik Yanit Kestrici eksplant analizi için islenir. Yaklasik 3x3x3 mm'lik küçük tümör kesiti parçalari üretilir. Tümör örnekleri yaklasik 100-300 pm'lik kesitler üretmek için Leica Vibratome kullanilarak çok sayida küçük parçaya bölünür ve Örnek 1'de gösterildigi üzere önceden kanser spesifik ECM ile kaplanmis 96 gözlü düz tabanli plakalar içinde üç kopya hâlinde kültürlenir. Tümör dokulari, %1'Iik Penisilin-Streptomisin, sodyum pirüvat 100 mM, esansiyeI-olmayan amino asit, L-glutamin 4 mM ve HEPES 10 mM ile birlikte yaklasik %2'Iik isi ile inaktive edilmis FBS ile degistirilmis yaklasik 2 ml'lik (DMEM) sartli vasatlari içinde idame ettirilir. Kültür vasatina, 12 saat sonra yaklasik %2'Iik serum kaynakli Iigandlar takviye edilir. Ilaçlar opsiyonel olarak, vasat ile birlikte veya ayri olarak kültürün baslangicinda eklenir. Vasatlar, takviyeler ile birlikte her 24 saatte bir degistirilir. Yaklasik 5 pl tüketilmis vasat, tümör dokusunun hücre viabilitesini, hücre proliferasyonunu, histolojisini ve hücre ölümünü belirlemek için kullanilir. Yaklasik 72 saatlik kültür periyodunun sonunda, doku çesitli parametreler için degerlendirilir. Bu periyottan sonra, MTTNVST analizi hücre viabilitesi yüzdesini degerlendirmek için gerçeklestirilir. Vasat kültüründen elde edilen süpernatant, her 24 saatte bir uzaklastirilir ve kinetik yanit egilimleri vermesi için (ATP'den ve glikozdan yararlanma deneyleri kullanilarak) proliferasyon ve (laktat dehidrojenaz analizlerinin ve Kaspaz-3 ve Kaspaz-8 ölçümlerinin degerlendirilmesi ile) hücre ölümü için degerlendirilir. Sonuçlar bir ilaç ile muamele edilmemis kontrole karsi kantifiye edilir. Hem ilaç (ilaçlar) ile muamele edilmis hem de muamele edilmemis doku kesitleri ayrica kültür periyodunun sonunda IHC ve histolojik degerlendirme için de verilir. Histolojik degerlendirme için verilen dokular, TUNEL ve aktive edilmis Kaspaz-3 analizi ile apoptoz için degerlendirilir. Hücre proliferasyonu ayrica, Ki67 ve PCNA gibi standart proliferasyon belirteçleri için de analiz edilir. Tüm preklinik sonuçlar, örnegin, hücre viabilitesi, apoptoz ile hücre ölümü, histolojik degerlendirme ve ayrica proliferasyon durumu nihai olarak, asagida saglanan Tablo 3'te gösterilen, Duyarlilik Indeksi (veya M-skoru) denilen bir tek skoru vermesi için birlestirilir. Mevcut eksplant analizi için kaydedilen hastalar ayrica, klinik tedaviye de sahiptir ve PETBT veya BT ile 6-8 ayin sonunda yanit için degerlendirilmistir. Akabinde, "Klinik Yanit Kestirici" sonuç (M-skoru) klinik sonuç ile karsilastirilir. Elde edilen sonuçlar, asagida Tablo 3'te açiklanir. Tablo 3, (asagidaki kanser tiplerinin - HNSCC, Gliyoblastom, Ca-Over, Ca-Meme, Ca- Özofagus, CRC, Ca-Pankreas, Ca-Mide - birine sahip olan) ilgili hastalardan elde edilen tümör örneginin tipini ve hastanin "Klinik Yanit Kestirici" ve klinik tedavi yoluyla her iki analiz için bununla tedavi edildigi ilaci veya ilaç kombinasyonlarini gösterir. Asagida tablodan elde edilen sonuçlardan asikâr oldugu üzere, "Klinik Yanit Kestirici" analiz yanit-vermeyenler için yaklasik %100'Iük ve yanit-verenler için yaklasik %88'lik bir etkinlik ile klinik sonucu basarili bir sekilde tahmin etmistir. Bas ve Boyun kanserine sahip olan Hasta 1'in tümör örneklerine, "Klinik Yanit Kestirici" ile bir Sisplatin+5FU+Dosetaksel kombinasyonu ile muamele edilir. Hücre viabilitesi, histolojik degerlendirme, hücre proliferasyonu ve apoptoz ile hücre ölümü yoluyla doku analizi ile elde edilen preklinik sonuçlar, 8'Iik bir Duyarlilik Indeksi (veya M-skoru) vermesi için birlestirilir. Hasta 1'de preklinik tedavinin Duyarlilik Indeksi <20 oldugundan; ilaçlarin ayni kombinasyonu hastaya uygulandiginda, tedavinin kötü klinik sonuca sahip oldugu tahmin edilir. Bu, hastanin, klinik yanit-olmama durumu göstererek, 1'Iik bir skor verdigi klinik sonuç için elde edilen RECIST verilerinin sonuçlarindan valide edilir. Bas ve Boyun kanserine sahip olan Hasta 3'ün tümör örneklerine, "Klinik Yanit Kestirici" ile bir Karboplatin ve Paklitaksel kombinasyonu ile muamele edilir. Hücre viabilitesi, histolojik degerlendirme, hücre proliferasyonu ve apoptoz ile hücre ölümü yoluyla doku analizi ile elde edilen preklinik sonuçlar, 47'lik bir Duyarlilik Indeksi (veya M-skoru) vermesi için birlestirilir. Hasta 3'te preklinik tedavinin Duyarlilik Indeksi 20 ancak <60 oldugundan; ilaçlarin ayni kombinasyonu hastaya uygulandiginda, tedavinin parsiyel klinik sonuca sahip oldugu tahmin edilir. Bu, hastanin parsiyel yanit göstererek, 2'Iik bir skor verdigi klinik sonuç için elde edilen RECIST verilerinin sonuçlarindan valide edilir. Bas ve Boyun kanserine sahip olan Hasta 38'in tümör örneklerine, "Klinik Yanit Kestirici" ile bir Sisplatin, 5FU ve Dosetaksel kombinasyonu ile muamele edilir. Hücre viabilitesi, histolojik degerlendirme, hücre proliferasyonu ve apoptoz ile hücre ölümü yoluyla doku analizi ile elde edilen preklinik sonuçlar, 90'Iiik bir Duyarlilik Indeksi (veya M-skoru) vermesi için birlestirilir. Hasta 38'de preklinik tedavinin Duyarlilik Indeksi 60 oldugundan; ilaçlarin ayni kombinasyonu hastaya uygulandiginda, tedavinin tam klinik sonuca sahip oldugu tahmin edilir. Bu, hastanin tam yanit göstererek, 3'Iük bir skor verdigi klinik sonuç için elde edilen REClST verilerinin sonuçlarindan valide edilir. Kanser Tipi Tedavi Gliyoblastom Temozolomid HNSCC Karboplatin+PakIitaksel Ca-Over Ca-Meme Kapesitabin+Lapatinib .. 5FU+L0kovorin Ozofagus HNSCC Setuksimab Özofagus CRC Irinotekan+5FU Klinik Yanit Kestirici Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz -10010 Duyarlilik Indeksi RECIST Kanser Tipi Pankreas Pankreas Özofagus Özofagus Pankreas Tedavi Gemsitabin+SispIatin Gemsitabin+Erlotinib 5FU+Lök0vorin Karboplatin+PakIitaksel Epirubisin+SispIatin +Kapesitabin Gemsitabin+Sisplatin Setuksimab Vinorelbin Klinik Yanit Kestirici Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz Duyarlilik Indeksi RECIST Kanser Tipi Pankreas Pankreas Pankreas Özofagus Ca-Over Tedavi Gemsitabin+SispIatin 5FU+Lök0v0rin Gemsitabin+ErIotinib Epirubisin+SispIatin +Kapesitabin Herseptin BIeomisin+CispIati n+Et0posid Sisplatin+5FU+Dosetaksel Setuksimab Karboplatin+PaklitakseI Klinik Yanit Kestirici Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz 1005542 Duyarlilik Indeksi RECIST Kanser Tipi Ca-Over Ca-Mide Ca-Mide Özofagus Ca-Mide Tedavi Irinotekan+5FU Karboplatin+PaklitakseI Epirubisin+Sisplatin +Kapesitabin Sisplatin+5FU+Dosetaksel Karboplatin+PakIitakseI 5FU+Lök0v0rin Si klofosfamid +Doksorubisin+Paklilaksel 5FU+Lök0v0rin Sisplatin+5FU+Dosetaksel Klinik Yanit Kestirici Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz Duyarlilik Indeksi RECIST Kanser Tipi Ca-Over Ca-Mide Özofagus Özofagus Tedavi Karboplatin+PakIitakseI Sisplatin+5FU+Dosetaksel Karboplatin+PacIita xel Epirubisin+SispIatin +Kapesitabin Setuksimab Sisplatin+5FU+Dosetaksel Sisplatin+5FU+Dosetaksel Si klofosfamid +Doksorubisin+PakIitaksel Epirubisin+SispIatin Klinik Yanit Kestirici Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz Duyarlilik Indeksi RECIST Kanser Tipi Tedavi Özofagus +Kapesitabin CRC Irinotekan+5FU Duyarlilik Indeksi Klinik Yanit Kestirici Viabilite Histoloji Proliferasyon Apoptoz RECIST Örnek 11: "Klinik Yanit Kestirici", Bivo-Belirteclere kiyasla Daha Iyi Bir Yanit Kestiricidir Yukarida bahsedildigi üzere, biyo-belirteçlerin tahmin araçlari olarak önceki teknikte kullanilmasina ragmen, bunlar ile ilgili çok sayida kisitlama vardir. Bu kisitlamalarin, mevcut açiklamanin araçlari ve yöntemleri ile üstesinden gelinir. "Klinik Yanit Kestirici", ilk validasyon için kullanilmis olan ilaçlar veya hastalik ile sinirlandirilmaz. "Klinik Yanit Kestirici", bir platform teknolojisidir. Örnegin, "Klinik Yanit Kestirici" özel bir ilaç, 5-FU diyelim, için bir Kolorektal kanser modeli için gelistirildiginde ve bu modelin 5-FU'nun etkinligini tahmin etmede kullanisli oldugu gösterildiginde, model diger ilaçlar için portatiftir. Bunun nedeni, "Klinik Yanit Kestirici" için girdi kisitlamalarinin ilaca degil tetkik edilmekte olan hastaya (veya hasta kaynakli tümöre) bagli olmasidir. Bir baska büyük farklilik, "yönlendirici" ve "yolcu" biyo-belirteçler arasindaki farkliliktir. Çok sayida hedeflenmis ilaç için, hastalar, bunlarin özel bir biyo-belirtece sahip olup olmamasina göre ayrilir. Bununla birlikte, belirli bir biyo-belirtecin varligi, hastalarin ilaca yanit verip vermeyecegini garanti etmez. Bunun nedeni, kanserin, çok sayida faktörün ilaçlarin etkinligini etkilemeden sorumlu oldugu heterojen dogasidir. Aksine, vermeyecegine karar vermede tümör dokusunu bir bütün olarak aldigindan; bu, gerçek klinik sonucu belirleme ile daha çok ilgilidir. Biyo-belirteçlerin (özel bir ilaca yanit-vermeyenlere kiyasla yanit-verenlerde diferansiyel bir sekilde eksprese edilen genin/proteinin) bir avuç ilaç, örnegin, Herseptin (Her 2 biyo-belirteci) için mevcut olmasina ragmen, bunlar çok çesitli diger ilaçlar için mevcut degildir. Mevcut oldugunda, bunlar klinik sonuca düsük korelasyona sahiptir. Örnegin, KRAS, Kolorektal kanserde Erbitux için onaylanmis biyo-belirteç, %10-30 araliginda bir kestirici güce sahiptir. Biyo-belirteçlerin bu yönü, Tablo 13'te gösterilir. Tablo 13: Tüm yanit-vermeyenler, NR olarak ve yanit verenler, R olarak isaretlenir. Hasta Klinik "Klinik Yanit M- KRAS BRAF PIK3CA AREG EREG Kesüücü Skoru KRAS BRAF HK3CA AREG Kestirici" Skoru KRAS BRAF PIK3CA AREG EREG Yüksek Düsük Düsük Yüksek Düsük Yüksek Yüksek Düsük Yüksek Düsük Hasta Klinik "Klinik Yanit M- KRAS BRAF PIK3CA AREG EREG 51 NR NR 14 WT WT WT Düsük Yüksek Yukaridaki tabloda Setuksimab'a yanit için test edilen örnekler, evre III/IV kolon kanseri örnekleridir. NR olan test edilen örneklerin çogu, Setuksimab'a yaniti etkileyen kilit genlerde, örnegin, KRAS, BRAF ve PIKSCA, mutasyonlara sahiptir. Bu yolda ayrica, EGFR ligandlari Amphiregulin ve Epiregulin de gösterilir. Bu Iigandlarin düsük ekspresyonunun, NR'nin nedeni oldugu gösterilmistir ve Setuksimab'a yaniti etkiledigine inanilir. Bununla birlikte, beklenen sonuçlarin aksine, burada örneklerin, bu biyo-belirteçlerin yoklugunda NR olan bir alt-kümesi vardir. Dahasi, hem Amphiregulin hem de Epiregulin ligandlarinin ekspresyonunun yüksek oldugunun bulunmasina hastalarin NR oldugu bulunmustur. Bununla birlikte, "Klinik Yanit Kestirici" eksplant analizi sonuçlar, biyo-belirteçlerin ve EGFR ligandlarinin ekspresyonundan etkilenmeden klinik sonuç ile eslesir. Böylelikle, bir biyo-belirtecin varligi, siklikla bir ilacin özel bir hastada yanit verip vermeyecegine karar vermede kara verici bir faktör olmadigindan, bir kilini bir siklikla, özel bir ilaç ve Özel bir kanser tipi ile iliskilidir. Aksine, mevcut "Klinik Yanit Kestirici" model, özel hastaya spesifik fonksiyonel okuma saglar. Örnek 12: "Klinik Yanit Kestirici" Hücre Hatlarina kiyasla Daha Iyi Bir Yanit Kestiricidir Hücre hatti ile in vitro testlerde ve hücre hatti temelli ksenogreft modellerde temel eksiklik, hücre hatlarinin tanisi geregi homojen olurken, kanserin heterojen bir hastalik olmasidir. Bu modellerin, problemi fazla basitlestirdigi düsünülür. Klinik Yanit Kestiriciler'in serum/plazma/PBMC'Ier/serum kaynakli Iigandlar kullanmasi, tümör tipine özellestirilmis ekstraselüler matriks ve otolog tümör dokusundan elde edilen bozulmamis ekstraselüler matriks kullanmasi, uygun parakrin baglama faktörlerinin, canli kalmak için tümör hücrelerinin yerini almasini garantiye alir; böylece nihayetinde tümörün baslatilmasina, idamesine, progresyonuna ve baskilanmasina dâhil edilen sinyalleme yollarinin çalisilmasina olanak saglar ve önceki teknikte mevcut olan hücre hatti temelli hasta ayirim sistemleri ile iliskili kusurlarin üstesinden gelir. Bu yön, asagida Tablo 14'te ilaveten detayli olarak açiklanmistir. Tablo 14: Hücre hatlari üzerinde Setuksimab'a yanit, burada Y, Setuksimab'a yaniti gösterir, N, Setuksimab'a yanit olmadigini gösterir ve ND, Setuksimab'a yanitin endike olmadigini gösterir. Setuksimab'a S.No Hücre hatti K-Ras B-Raf PIK3Ca 1 CaC02 WT WT Y 2 HT29 WT MUT N 3 COLO-205 WT MUT N 4 SW48O MUT"C'12" WT N SW620 MUT "C12" WT WT N 6 HCT116 MUT"C13" WT N 7 LoVo MUT"C13" WT WT N 8 LS1034 WT N 9 LIM1215 WT WT WT Y GEO MUT"C12" WT WT Y 11 SW403 MUT"012" WT WT Y 12 SW837 MUT"C12" WT WT Y S.No Hücre hatti SW 1 463 SW948 320HSR SW1417 B-Raf PIK3Ca Setuksimab'a Setuksimab'a S.No Hücre hatti K-Ras B-Raf PIK3Ca COLO-201 WT MUT N Yukarida Tablo 14'te gösterildigi üzere, hücre hatlari çok homojen bir modeli temsil eder ve böyle olunca da ilaç gelistirilmesi için sinirli yarara sahiptir. Hücre hatlarinin, K- RAS ve B-RAF ve PlK3Ca için Dogal Tip (WT) olan %80'inden fazlasi setuksimab'a yanit gösterir. Bununla birlikte, klinik olarak, hastalarin yalnizca %10-30'u setuksimab'a yanit verir. Bu yanlis-eslesme, hücre temelli modelin klinik ilgililiginin olmamasindan kaynaklanir. "Klinik Yanit Kestirici" modelin, Örnek 11'de (Tablo 13) bir klinik olarak ilgili preklinik araç oldugu gösterilir. Bir sistemler biyolojisi yaklasimi kullanilarak, bu platform akla uygun ilaç gelistirilmesine olanak saglamak amaciyla klinik sonucun daha iyi bir kestiricisi görevini görmesi için hastaligin içsel heterojenligini yansitir. Teknikte bilinen diger teknolojiler açisindan "Klinik Yanit Kestirici" modelin avantajlari: modellerdir, ancak yalnizca ilaçlar tarafindan aracilik edilen yollar bilindiginde yararli olacaktir. Çesitli kanserlerde ve çesitli ilaçlar için, çok sayida yol dâhil edilir. Bu, genetik olarak mühendislik uygulanmis fare modellerinin majör eksikligidir. Mevcut bulus, hastadan türetilen taze solid dokulari kullanir. Ilaveten, doku analizler için isledikçe, hücre-hücre iletisimi mevcut bulus tarafindan bozulmaz. Lokal mikro-ortam da eksplant analizlerin olgularinda idame ettirilir. i› Mammaprint (Agendia) ve Oncotype-Dx (Genomic Health), hastalari gen profillemesine göre yüksek risk veya düsük risk için derecelendirmek için kullanilan testlerdir. Mammaprint, seçilen genlerin mikro-dizilim ekspresyon profillemesini kullanirken, Oncotype-Dx, seçilen genlerin RT-PCR analizini kullanir. Bu testlerin hiç biri, hasta için kisisellestirilmemistir ve bunlar hangi spesifik ilaç kombinasyonunun söz konusu hasta için en uygun oldugunu Söylemez. Aksine, "Klinik Yanit Kestirici", bu spesifik hasta için optimal ilaç kombinasyonunun ne olduguna karar vermek için hastanin kendi tümörünü ve hastanin kendi tümör mikro-ortamini kullanan fonksiyonel bir testtir. i› Kemo-duyarlilik testi açisindan, mevcut açiklama, asagidaki yol vasitasiyla söz konusu test ile iliskili eksikliklerin üstesinden gelebilir: Ilk olarak, mevcut bulus, belirli parakrin faktörlerin fonksiyonel sinyallemenin tümör dokulari içinde idame ettirilmesini garanti etmek için elzem oldugunu tanimlamistir. Ikinci olarak, mevcut bulus ilaveten, heterolog serumdan türetilene kiyasla otolog serumdan türetilen bu tarz parakrin faktörlerin klinik korelasyonunda bir farklilik oldugunu kesfetmistir. Üçüncü olarak, buna ek olarak, kanserin ayni alt-tipinden türetilmis olan ekstraselüler matriks ile hücre plakalarini kaplamak önemlidir. Döndürücü olarak, dogru miktarda doku difüzyonunun gerçeklesmesini garanti etmek için dokuyu özel bir boyutta (yaklasik 100 pm- 300 um) tutmak önemlidir. Hepsi birlikte ele alindiginda, bu faktörlerin kombinasyonu, "Klinik Yanit Kestirici" modelin klinik sonucun güvenilir bir yansiticisi olmasi ile sonuçlanir. Örnek 13: Klinik Yaniti Tahmin E_tmek icin "Klinik Yanit Kestirici" Klinik çalisma, spesifik Kanser ilaçlarina veya bunlarin kombinasyonlarina yaniti çalismak için farkli tümör tiplerine sahip olan hastalarda yapilir. Ayni ilaçlar ve bunlarin kombinasyonlari, mevcut bulusun "Klinik Yanit Kestirici" analizinde de kullanilir. Elde edilen sonuçlar (toplam inhibisyona dayanan M-Skoru), spesifik hasta için kisisellestirilmis bir tümör mikro-ortaminda yapilan çalismalara göre, hastanin bir ilaca veya ilaçlarin kombinasyonuna klinik yanitina korele edilir. Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri Sag piriform sinüs olan, Bas ve Boyun Kanseri olan 67 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile cerrahi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T3NOMO olarak belirlenmistir ve örnek tipi primer olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Sisplatin 66 Rx3 Sisplatin + 5-Florourasil 37 Rx4 Sisplatin + Dosetaksel+5-Florourasil 61 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Karboplatin + Paklitaksel 23 Rx5 Setu ksimab 19 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(A)'da gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Sisplatin 2) Sisplatin + Dosetaksel + 5-Florourasil 3) Sisplatin + 5-Florourasil. Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri Sag piriform sinüs olan, Bas ve Boyun Kanseri olan 55 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile cerrahi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T3/4N20M0 olarak belirlenmistir ve örnek tipi metastatik lenf nodu olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Sisplatin 39 Rx2 Karboplatin + Paklitaksel 74 Rx4 Sisplatin + Dosetaksel + 5-Florourasil 63 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx3 Sisplatin + 5-Florourasil 21 Rx5 Setuksimab 14 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(B)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne sürer: 1) Karboplatin + Paklitaksel 2) Sisplatin + Dosetaksel + 5-Florourasil 3) Sisplatin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri rektosigmoid kolon olan, Kolon Kanseri olan 40 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile cerrahi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi Evre Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Oksaliplatin + 5-Florourasil+ Lökovorin 64 Rx3 Irinotekan + 5-Florourasil+ Lökovorin 32 R] Epirubisin, + Sisplatin + Kapesitabin 51 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 5-Flor0urasil + Lökovorin 28 RA Irinotekan + 5-Florourasil + Lökovorin + Bevacizumab 21 Rx6 Panitumumab 19 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(C)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Oksaliplatin + 5-Flor0urasil + Lökovorin 2) Epirubisin + Sisplatin + Kapesitabin 3) Irinotekan + 5-Florourasil + Lökovorin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri perineal kütle (Ca-Rektum) olan. Kolon Kanseri olan 56 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T3NOM0 olarak belirlenmistir ve örnek tipi Recc olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Oksaliplatin + 5-Fl0r0urasil + Lökovorin 46 Rx3 Irinotekan + 5-Florourasil + Lökovorin 61 Rx4 Irinotekan + 5-Florourasil + Bevacizumab 39 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru RX2 5-Flor0urasil + Lökovorin 14 Rxö Panitumumab 27 RX? Epirubisin + Sisplatin + Kapesitabin 18 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(D)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Irinotekan + 5-Florourasil + Lökovorin 2) Oksaliplatin + 5-Flor0urasil + Lökovorin 3) Irinotekan + 5-Florourasil + Lökovorin + Bevacizumab Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri midenin pilorusu olan, Kolon Kanseri olan 49 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi bilinmemektedir ve örnek tipi metastatik lenf nodu recc olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, Öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Epirubisin + Sisplatin + Kapesitabin 47 Rx3 Imatinib 66 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Herseptin 14 Rx4 Sunitinib 25 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(E)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz. hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Imatinib 2) Epirubisin + Sisplatin + Kapesitabin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri mide olan, Mide Kanseri olan 68 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi bilinmemektedir ve örnek tipi recc olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rxt Epirubisin + Sisplatin + Kapesitabin 56 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Herseptin 15 Rx3 Imatinib 24 Rx4 Sunitinib 09 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(F)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Epirubisin + Sisplatin + Kapesitabin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri karaciger olan, Pankreatik Kanseri olan 45 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi bilinmemektedir ve örnek tipi metastatik olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rxi Sisplatin + Gemsitabin 37 Rx3 5-Florourasil + Lökovorin 54 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Erlotinib 21 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(G)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri pankreas olan, Pankreatik Kanseri olan 50 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile cerrahi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T2NOMO olarak belirlenmistir ve örnek tipi primer olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Sisplatin + Gemsitabin 72 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Erlotinib 14 Rx3 5-FU + Lökovorin 23 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(H)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri over olan, Over Kanseri olan 40 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi bilinmemektedir ve örnek tipi metastaz olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B. buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rxl Bleomisin + Etoposid + Sisplatin 76 Rx2 Trabektidin + PLD Doksorubisin 36 Rx4 Karboplatin + Gemsitabin 73 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx3 Dosetaksel 26 Rx5 Doksorubisin (PLD) + Karboplatin 19 Rxö Karboplatin + Paklitaksel 25 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(I)'da gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Bleomisin + Etoposid + Sisplatin 2) Karboplatin + Gemsitabin 3) Trabektidin + PLD Doksorubisin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri over olan, Over Kanseri olan 56 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile cerrahi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi bilinmemektedir ve örnek tipi primer olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra. spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar Rxl Bleomisin + Etoposid + Sisplatin Rx2 Trabektidin + PLD Doksorubisin Rx6 Karboplatin + Paklitaksel Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar Rx3 Dosetaksel Rx4 Karboplatin + Gemsitabin Rx5 Doksorubisin (PLD) + Karboplatin M-Skoru64 M-Skoru12 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(J)'da gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Trabektidin + PLD Doksorubisin 2) Bleomisin + Etoposid + Sisplatin 3) Karboplatin + Gemsitabin Örnek 13.11: Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri Bölgesel Lenf nodu (R) Meme olan, Meme Kanseri olan 49 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T3N1M0 olarak belirlenmistir ve örnek tipi metastaz ve recc olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B. buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Siklofosfamid + Doksorubisin + 5-Flor0urasil 52 Rx5 Dosetaksel + Kapesitabin 39 R10 Gemsitabin + Paklitaksel 48 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Anastrozol 20 Rx3 Kapesitabin 26 RX4 Dosetaksel 26 Rxö Doksorubisin 17 Rx7 Doksorubisin + Siklofosfamid 15 Rx8 Enantat 08 Rx9 Gemsitabin 21 Rx1 1 Paklitaksel 11 Rx12 Vinorelbin 19 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(K)'da gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Siklofosfamid + Doksorubisin + 5-Flor0urasil 2) Gemsitabin + Paklitaksel 3) Dosetaksel + Kapesitabin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri meme olan, Meme Kanseri olan 51 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi belirlenmemistir ve örnek tipi primer olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi Ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx3 Siklofosfamid + Doksorubisin + Dosetaksel 43 Rxö Filgrastim + Siklofosfamid + Doksorubisin + 5-Fl0r0urasil 77 R? Filgrastim + Siklofosfamid + Epirubisin, + 5-Flor0urasil 42 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Sisplatin + Gemsitabin 17 Rx2 Siklofosfamid + Paklitaksel 23 RA Dosetaksel + Siklofosfamid 22 Rx5 Dosetaksel + Siklofosfamid + Epirubisin + 5-Florourasil 19 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(L)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Filgrastim + Siklofosfamid + Doksorubisin + 5-Flor0urasil 2) Gemsitabin + Dosetaksel 3) Siklofosfamid + Doksorubisin + Dosetaksel 4) Filgrastim + Siklofosfamid + Epirubisin + 5-Florourasil Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri karaciger olan, Karaciger Kanseri olan 50 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile cerrahi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T3NxM1 olarak belirlenmistir ve örnek tipi metastaz olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit-Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Sorafenib 16 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(M)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, Sorafenib'in mevcut hasta için bir optimal terapötik opsiyon olmadigini öne sürer. Diger SOC'Ierin herhangi birinin bu hasta üzerinde kullanilabilip kullanilamayacagini görmek için, diger anti-kanser ajanlar kullanilarak ilave testlerin yapilmasi gerekir. Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri karaciger olan, Karaciger Kanseri olan 56 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile cerrahi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T4NOM0 olarak belirlenmistir ve örnek tipi primer olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru RX1 Sorafenib 46 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(M)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, Sorafenib'in hastanin tedavisi için bir optimal terapötik opsiyon oldugunu öne sürer. Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri perineal kütle olan, Kolorektum Kanseri olan 56 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T3N0M0 olarak belirlenmistir ve örnek tipi reküran olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Oksaliplatin + 5-FU + Lökovorin 75 Rx2 Irinotekan + 5-FU + Lökovorin 72 Rx3 Oksisiliplatin + 5-FU 35 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx4 Kapesitabin + Erbitux 24 Rx5 Avastin 20 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(O)'da gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Rx1 - Oksaliplatin + 5-FU + Lökovorin 2) Rx2 - Irinotekan + 5-FU + Lökovorin 3) RXS - Oksaliplatin + 5-FU ) Rx5 - Avastin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri rektosigmoid olan, akciger metastatigi (met'leri) içeren Kolorektum Kanseri olan 59 yasindaki bir erkek hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T4N2Mx olarak belirlenmistir ve örnek tipi metastatik olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rxt Oksaliplatin + Irinotekan 73 Rx3 5-FU + Lökovorin 29 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Erbitux + Kapesitabin 22 Rx4 Irinotekan + Erbitux 24 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(P)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Rx1 - Oksaliplatin + Irinotekan 3) Rx3 - 5-FU + Lökovorin 4) Rx4 - Irinotekan + Erbitux Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri pankreas olan, karaciger met'leri içeren Pankreatik Kanseri olan 45 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T3N2M1 olarak belirlenmistir ve örnek tipi metastatik olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx3 Abraksan 50 Rx4 Erlotinib + Gemsitabin 68 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Sisplatin + Gemsitabin 23 Rx2 Oksaliplatin, + 5-FU 23 Rx5 5-FU + Lökovorin 20 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(Q)'da gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Rx1 - Sisplatin + Gemsitabin 2) Rx2 - Oksaliplatin + 5-FU 3) Rx3 - Abraksan 4) Rx4 - Erlotinib + Gemsitabin ) Rx5 - 5-FU + Lökovorin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri Bölgesel lenf nodu (Rt Br) olan, met'leri içeren Meme Kanseri olan 49 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi T3N1M1 olarak belirlenmistir ve örnek tipi reküran olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi Ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx1 Siklofosfamid + Metotreksat + 5-FU 77 Rx3 Doksorubisin + Siklofosfamid + 5-FU 68 Rx4 Doksorubisin + Siklofosfamid + Paklitaksel 70 RX? Doksorubisin + Siklofosfamid 29 Rx8 Doksorubisin + Kapesitabin 32 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Abraksan 20 Rx5 Avastin 18 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(R)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Rx1 - Siklofosfamid+Metotreksat+5-FU 2) Rx2 - Abraksan 3) Rx3 - Doksorubisin+ Siklofosfamid+5-FU 4) Rx4 - Doksorubisin+ Siklofosfamid+Paklitaksel ) Rx5 - Avastin 6) Rx6 - Kapesitabin + Lapatinib 7) R] - D0ksorubisin+ Siklofosfamid 8) Rx8 - Dosetaksel + Kapesitabin Mevcut "Klinik Yanit Kestirici" Analiz, tümör yeri supraklavikülüs lenf nodu olan, Sub Klavyan Lenf Nodu Metastazi (SCLN met'Ieri) içeren Meme Kanseri olan 40 yasindaki bir kadin hasta üzerinde test edilmistir. Tümör Örnegi, hastanin oluru ile biyopsi yoluyla elde edilmistir. Elde edilen tümör analiz edilmistir, tümör evresi TxNxMZ olarak belirlenmistir ve örnek tipi metastatik olarak kategorize edilmistir. Tümör örnegi elde edilmistir ve yukarida 'Mevcut Yöntemin Genel Özeti' olarak yansitilan mevcut açiklamanin yöntemine tabi tutulmustur. Bundan sonra, spesifik ilaçlar açisindan tümör yanitina dayanarak elde edilen veriler elde edilir ve asagidaki tablolarda sunulur. Asagida tablolar, hastanin test edilen ilaçlara yönelik yanitini temsil eder, öyle ki tablo A, buna yönelik yanitin gözlendigi ilaçlari gösterir ve tablo B, buna yönelik yanitin gözlenmedigi ilaçlari gösterir. Tablo A: Yanit Verenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx2 Gemsitabin + Erlotinib 48 Tablo B: Yanit Vermeyenler Test Edilen Ilaçlar M-Skoru Rx3 Herseptin 15 Rx4 Metotreksat + Siklofosfamid 19 Rx5 Avastin 14 RXG 5-FU + Karboplatin 17 Yukarida tablolardan elde edilen M-Skoruna ve Sekil 13(S)'de gösterilen etkinlik verilerine göre, "Klinik Yanit Kestirici" analiz, hasta için en optimal terapötik opsiyonun, asagidaki sirada ilaçlarin/bunlarin kombinasyonlarinin uygulanmasi oldugunu öne 1) Rx1 - Kapesitabin + Lapatinib 3) Rx3 - Herseptin 4) Rx4 - Metotreksat + Siklofosfamid ) RXS - Avastin 6) Rx6 - 5-FU+ Karboplatin Örnek 14: Ilaclarin Test E_tkinligi icin "Klinik Yanit Kestjrici" Sisplatin, Paklitaksel ve 5-FU almasi kararlastirilan klinik çalismalara kaydedilen hastalardan elde edilen primer H&N tümör örnegi, "Klinik Yanit Kestirici" analize tabi tutulur. Tümör örnegi, ponksiyon biyopsisi ile toplanir. Toplanan örnegin tümör evresi, klinik Evre II/IIl'tür. "Klinik Yanit Kestirici" eksplant degerlendirmesi, Örnek 5'te açiklandigi üzere klinik sonucu tahmin etmek için yapilir. M-skoruna ulasmak için yapilan Analizler WST'dir, Kl'dir ve TUNEL'dir. Bagimsiz olarak, PET-BT görüntülemesi, PERCIST kriterleri uyarinca klinik sonucu degerlendirmek için tedavi öncesinde ve sonrasinda yapilir ve hasta klinik çalismalara tabi tutulur. "Klinik Yanit Kestirici" tahmini, "Klinik Yanit Kestirici" analizin kestirici gücünü degerlendirmek için klinik sonuç ile karsilastirilir (Sekil 12). Asagida yansitilan Tablo 15'te gösterildigi üzere yaklasik 112 H&N tümör hastasi bu çalismaya kaydedilir, burada "Klinik Yanit Kestirici", duyarlilik indeksini belirlemek ve bunu klinik sonuç ile korele etmek için kullanilir. Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL Indeksi Inhibisyonu Inhibisyonu Duyarlilik Indeksi Tahmini Progresif Progresif Parsiyel Progresif Sisplatin+Dosetaksel+5FU 31 10 5 7 13 Hastalik Sl Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik N°' Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL '"dekSI Duyarlilik Inhibisyonu Inhibisyonu Indeksi Tahmini Progresif Parsiyel Parsiyel Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel Sl Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik N°' Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL '"dekSI Duyarlilik Inhibisyonu Inhibisyonu Indeksi Tahmini Parsiyel Progresif 22 Sisplatin+DosetakseI+5FU 7 0 15 0 6 Hastalik Parsiyel Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel Parsiyel Parsiyel Parsiyel Sl Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik N°' Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL '"dekSI Duyarlilik Inhibisyonu Inhibisyonu Indeksi Tahmini Parsiyel Progresif Parsiyel Progresif 40 Sisplatin+DosetakseI+5FU 18 O 7 12 9 Hastalik Parsiyel Parsiyel Parsiyel Parsiyel Progresif 47 Sisplatin+DosetakseI+5FU 10 15 5 O 8 Hastalik Parsiyel Sl Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik N°' Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL '"dekSI Duyarlilik Inhibisyonu Inhibisyonu Indeksi Tahmini Parsiyel Parsiyel Parsiyel Progresif 54 Sisplatin+Dosetaksel+5FU 3 O 2 0 1 Hastalik Parsiyel Parsiyel Progresif 58 Sisplatin+Dosetaksel+5FU 5 15 4 O 6 Hastalik Parsiyel Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel Sl Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik N°' Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL '"dekSI Duyarlilik Inhibisyonu Inhibisyonu Indeksi Tahmini Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel Progresif Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel Progresif Parsiyel Progresif Sl Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik N°' Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL '"dekSI Duyarlilik Inhibisyonu Inhibisyonu Indeksi Tahmini Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel Progresif 90 Sisplatin+Dosetaksel+5FU 2 3 6 7 5 Hastalik Progresif Sl Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik N°' Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL '"dekSI Duyarlilik Inhibisyonu Inhibisyonu Indeksi Tahmini Parsiyel Parsiyel Progresif Progresif 98 Sisplatin+DosetakseI+5FU 17 0 8 5 8 Hastalik Parsiyel Parsiyel Progresif Parsiyel Parsiyel 107 Sisplatin+DosetakseI+5FU 0 20 5 O 6 Progresif Tedavi Klinik Yanit Kestirici Duyarlilik Viabilite Proliferasyon Histoloji TUNEL '"dekSI Duyarlilik Inhibisyonu Inhibisyonu Indeksi Tahmini Hastalik Parsiyel Parsiyel Progresif Progresif Sisplatin+Dosetaksel+5FU 21 0 12 0 8 Hastalik Yukaridaki tablodan ayni zamanda Sekil 12'den, asagidakiler türetilebilir: Sekil 12'nin sol paneli (doz-öncesi ve doz-sonrasi) kemoterapi öncesinde ve sonrasinda tümörlerin kisinin terapiye yanit verdigini gösterir. Bu kisiden alinan, oncoprint kullanilarak degerlendirilmekte olan tümör, gerçek klinik yanit ile uyumlu olarak klinik tam yanitin göstergesi olan 62'lik bir M-Skoru almistir. Sag üst panel, M-skoru /= 60'a sahip olan tümör örneginin klinik yanitini, hastalarin %90'indan fazlasinin tam yanita sahip olurken, %10'unun parsiyel yanita sahip oldugunu, gösterir. Bununla birlikte, bunlardan yanit-vermeyen yoktur. Benzer bir sekilde, sol orta panel, M-Skoru'nun 45 oldugu belirlenmis bir parsiyel yanit- veren kisinin bir temsilidir. 25 ila <60 arasindaki M-Skoru için tahmin edildigi üzere, hasta parsiyel yanitin göstergesidir. Bu kategoride M-Skoru'na sahip olan 53 hasta tümörünün, %79'undan fazlasi, %8'inin tam yanita sahip olmasi ve %13'ünün yanita sahip olmamasi ile, parsiyel yanit-veren kisilerdir. Alttaki panel, yanit-vermeyen kisilerin temsilidir, burada sol doz-sonrasi BT'si, hastanin tedaviden sonra progresif hastaliga sahip oldugunu ve tümörün yanit-olmamasinin göstergesi olan 18'lik bir M-Skoru verdigini gösterir. "Klinik Yanit Kestirici" ile yanita sahip olmadigi tahmin edilen 29 hastanin, %100'ü gerçekten yanit göstermemistir; bu, bu teknolojinin klinik sonucu güvenilir bir sekilde tahmin etme gücünü göstermektedir. UYGULAMALAR: Ilaç gelistirme uygulamasi: Hasta/ari ilaçlara eslesti'rme: Ilaç gelistirme baglaminda, ilaç hastalara uygulanmadan önce bile hangi hastanin gelistirilmekte olan ilaca yanit büyük olasilikla yanit verecegini bilmek önemlidir. ilaveten, bu, kanser baglaminda, bir kisinin kanser tedavisinde kullanilan "Kombinasyon" stratejisi altinda var olan hangi ilaçlarin gelistirilmekte olan ilaç ile birlestirilmesi gerektigine karar vermesi gerektiginden, özellikle önemlidir. Bu ayrica, hangi kanser tipinin (örnegin, pankreatik kansere kiyasla kolon kanseri) tedavi edilecegine karar vermede de yararlidir. Sonuç olarak; bu, daha kisa sürede gelistirme, daha düsük maliyet ve artmis basari sansi ile sonuçlanan daha iyi bir klinik çalisma stratejisi gelistirmede yararlidir. Tanisal uygulama: Tedavi seleksiyonu: Bu, güncel olarak onaylanmis opsiyonlar arasinda, tetkik edilmekte olan hasta için en uygun olan tedavi opsiyonuna karar vermede doktorlara yardimci olan bir tanisal model olarak yararlidir. Bu özellikle, güncel tedavi basari oraninin, TR TR

Claims (1)

1.
TR2018/02420T 2011-10-04 2012-10-04 ECM bileşimi, tümör mikro-ortam platformu ve bunun yöntemleri. TR201802420T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN3310CH2011 2011-10-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201802420T4 true TR201802420T4 (tr) 2018-03-21

Family

ID=54261176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/02420T TR201802420T4 (tr) 2011-10-04 2012-10-04 ECM bileşimi, tümör mikro-ortam platformu ve bunun yöntemleri.

Country Status (14)

Country Link
US (7) US20140228246A1 (tr)
EP (1) EP2764099B1 (tr)
JP (2) JP6147259B2 (tr)
AU (1) AU2012320088C1 (tr)
CA (1) CA2850274A1 (tr)
CY (1) CY1120087T1 (tr)
DK (1) DK2764099T3 (tr)
ES (1) ES2660975T3 (tr)
HU (1) HUE036537T2 (tr)
NO (1) NO2764099T3 (tr)
PT (1) PT2764099T (tr)
SG (1) SG11201401183UA (tr)
TR (1) TR201802420T4 (tr)
WO (1) WO2013050962A1 (tr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105593438B (zh) 2013-05-31 2019-07-05 伊顿智能动力有限公司 用于通过平衡保护来降低动臂跳动的液压系统及方法
EP3074028B1 (en) * 2013-11-27 2022-04-06 Research Foundation Of The City University Of New York Activity enhancing curcumin compositions and methods of use
CN103966168B (zh) * 2014-05-19 2017-05-03 广州恒迪生物科技有限公司 肿瘤活组织体外培养系统及培养方法
US10745667B2 (en) 2015-03-23 2020-08-18 Yao Tang Methods of primary tissue culture and drug screening using autologous serum and fluids
GB2555252A (en) * 2015-04-22 2018-04-25 Ono Pharmaceutical Co Method for extracting lead compound, method for selecting drug discovery target, device for generating scatter diagram, and data visualization method
GB201507894D0 (en) * 2015-05-08 2015-06-24 Imagen Biotech Ltd Personalised media
DK3365436T3 (da) * 2015-10-20 2021-10-11 Celcuity Inc Fremgangsmåder til fremstilling af en primær celleprøve
CN106047788A (zh) * 2016-08-22 2016-10-26 上海逍鹏生物科技有限公司 一种适用于高密度细胞培养体系的培养基
GB2555787A (en) 2016-11-07 2018-05-16 Landberg Goran Diagnostic methods
US20190361006A1 (en) * 2017-02-08 2019-11-28 Mitra Rxdx, Inc. Method of predicting clinical outcome of anticancer agents
SI3607050T1 (sl) 2017-04-05 2024-02-29 Yeda Research And Development Co. Ltd. Ex-vivo kulturni sistem in postopki uporabe le-tega
IL257225A (en) 2018-01-29 2018-04-09 Yeda Res & Dev Treatment of sarcoma
WO2019164951A1 (en) * 2018-02-22 2019-08-29 Mitra Rxdx, Inc. Methods of predicting response to temporally sequenced combination therapy
GB201818885D0 (en) * 2018-11-20 2019-01-02 Precomb Therapeutics Ag 3d human cancer model-based combinatiorial drug development method
WO2020172591A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 Mitra Rxdx, Inc. A method to predict a patient's response to an anti-cancer drug from an expression level of a set of genes
CA3130930A1 (en) * 2019-03-19 2020-09-24 Kyuson Yun Methods and systems for evaluation of cell samples
CN112961830A (zh) * 2021-02-25 2021-06-15 重庆医科大学附属口腔医院 口腔鳞癌组织脱细胞基质及其制备方法和应用
WO2022259242A1 (en) 2021-06-06 2022-12-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. Combined treatment for cancer
CN113774025B (zh) * 2021-08-26 2023-07-14 湖南丰晖生物科技有限公司 一种结直肠癌顺铂耐药株的构建方法
WO2023067582A1 (en) * 2021-10-23 2023-04-27 Mazumdar Shaw Medical Foundation Tumor microenvironment platform comprising oral carcinoma for predicting drug sensitivity, drug resistance and disease progression
US12312631B1 (en) 2022-06-15 2025-05-27 SageMedic Corporation High-throughput multiplexed sensitivity and resistance assay
PL444462A1 (pl) * 2023-04-18 2024-10-21 Uniwersytet Medyczny W Białymstoku Sposób oceny chemiowrażliwości komórek nowotworowych in vitro na leki przeciwnowotworowe i sposób diagnostyki ex vivo nowotworu piersi

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5508188A (en) * 1994-01-21 1996-04-16 The Regents Of The University Of California Method of growing cells in a mammal
FR2842822B1 (fr) * 2002-07-26 2004-10-01 Roussy Inst Gustave Procede de preparation d'une matrice extracellulaire et son utilisation pour la culture de cellules tumorales
US8071135B2 (en) * 2006-10-04 2011-12-06 Anthrogenesis Corporation Placental tissue compositions
US20120213706A1 (en) * 2009-04-15 2012-08-23 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Reconstituted tumor microenvironment for anticancer drug development
US20130071864A1 (en) * 2010-05-25 2013-03-21 Makoto Watanabe Colorectal cancer marker vitronectin and method for analyzing vitronectin concentration in blood sample

Also Published As

Publication number Publication date
CA2850274A1 (en) 2013-04-11
EP2764099A1 (en) 2014-08-13
US20140228246A1 (en) 2014-08-14
AU2012320088C1 (en) 2016-03-17
JP6378273B2 (ja) 2018-08-22
AU2012320088A1 (en) 2014-05-01
AU2012320088B9 (en) 2015-07-16
EP2764099A4 (en) 2015-05-06
JP2014534809A (ja) 2014-12-25
US20190170730A1 (en) 2019-06-06
PT2764099T (pt) 2018-02-28
US20200064333A1 (en) 2020-02-27
SG11201401183UA (en) 2014-09-26
EP2764099B1 (en) 2017-11-22
US20190383796A1 (en) 2019-12-19
AU2012320088B2 (en) 2015-07-02
WO2013050962A1 (en) 2013-04-11
CY1120087T1 (el) 2018-12-12
NO2764099T3 (tr) 2018-04-21
US20190383795A1 (en) 2019-12-19
US20190353640A1 (en) 2019-11-21
JP6147259B2 (ja) 2017-06-14
US20190346428A1 (en) 2019-11-14
DK2764099T3 (en) 2018-02-26
HUE036537T2 (hu) 2018-07-30
JP2017061448A (ja) 2017-03-30
ES2660975T3 (es) 2018-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201802420T4 (tr) ECM bileşimi, tümör mikro-ortam platformu ve bunun yöntemleri.
JP7330235B2 (ja) 血中循環腫瘍細胞に関する方法およびアッセイ
Grzegrzolka et al. Expression of EMT markers SLUG and TWIST in breast cancer
JP6782698B2 (ja) がん患者を診断および処置するためのｅｒｂｂシグナル伝達経路活性の測定方法
JP6158078B2 (ja) 薬物感受性、薬物抵抗性および疾患進行の予測のための組成物および方法
Pierobon et al. Pilot phase I/II personalized therapy trial for metastatic colorectal cancer: evaluating the feasibility of protein pathway activation mapping for stratifying patients to therapy with imatinib and panitumumab
Mehra et al. Quantification of excision repair cross-complementing group 1 and survival in p16-negative squamous cell head and neck cancers
Raviraj et al. Dormant but migratory tumour cells in desmoplastic stroma of invasive ductal carcinomas
Brlek et al. TWIST1 upregulation affects E-cadherin expression in brain metastases
ES2713240T3 (es) Proteína asociada a vesícula que interacciona con G-alfa (GIV) como marcador predictivo en cáncer colorrectal de estadio II
Armada et al. Regulation of ABCB1 activity by microRNA-200c and microRNA-203a in breast cancer cells: the quest for microRNAs’ involvement in cancer drug resistance
Sayhan et al. Expression of caveolin-1 in peritumoral stroma is associated with histological grade in ovarian serous tumors
Ye et al. CD98, a potential diagnostic cancer-related biomarker, and its prognostic impact in colorectal cancer patients
Chiappori et al. Features of potentially predictive biomarkers of chemotherapeutic efficacy in small cell lung cancer
WO2019057919A1 (en) METHODS AND KITS FOR THE PROGNOSIS OF LUNG ADENOCARCINOMA
WO2019057913A1 (en) METHOD AND KITS FOR THE PROGNOSIS OF SQUAMOUS CARCINOMA PULMONARY (SCC)
Tsiambas et al. Evaluation of epidermal growth factor receptor gene and chromosome 7 alterations in squamous cell carcinoma of the larynx, using chromogenic in situ hybridization on tissue microarrays
Zheng et al. Comprehensive analysis of the prognosis and biological significance of RORβ in head and neck squamous cell carcinoma
Teng et al. Leupaxin: A Prospective Therapeutic Target for Esophageal Squamous Carcinoma Treatment
Teng et al. Elucidating the Correlation between Leupaxin as a Prognostic Biomarker and Immunotherapeutic Efficacy in Esophageal Squamous Cell Carcinoma
Singh Targeting DNA damage repair pathways in breast and ovarian cancers
Scerri Herceptin® resistance in breast cancer: a pathwaybased approach
Daver et al. The Polycomb BMI1 Protein Is Co-expressed With CD26+ in Leukemic Stem Cells of Chronic Myeloid Leukemia
Payne The clinical and prognostic use of circulating tumour cells in breast cancer
Hendrix EACR Travel Fellowship Awards