TR201802431T4 - Protein üretme usulü. - Google Patents

Protein üretme usulü. Download PDF

Info

Publication number
TR201802431T4
TR201802431T4 TR2018/02431T TR201802431T TR201802431T4 TR 201802431 T4 TR201802431 T4 TR 201802431T4 TR 2018/02431 T TR2018/02431 T TR 2018/02431T TR 201802431 T TR201802431 T TR 201802431T TR 201802431 T4 TR201802431 T4 TR 201802431T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
gene
transposon
sequence
cell
Prior art date
Application number
TR2018/02431T
Other languages
English (en)
Inventor
Kawakami Koichi
Kurokawa Megumi
Yamaguchi Keina
Ogawa Risa
Tsukahara Masayoshi
Hayashi Yoko
Original Assignee
Inter Univ Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inter Univ Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems, Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Inter Univ Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems
Publication of TR201802431T4 publication Critical patent/TR201802431T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/108—Orthomyxoviridae (F), e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

Bu buluş bir ilgili proteinin üretilmesi için bir usule ilişkin olup, bir ilgili geni kodlayan bir DNA'yı bulunduran bir gen fragmanını içeren ve ayrıca gen fragmanının her iki terminalinde transpozon dizilerini içeren en az bir ekspresyon vektörünün bir memeli hücresi süspansiyonuna eklenmesini; bir çift (iki) transpozon dizisi arasına eklenmiş gen fragmanının memeli hücresinin bir kromozomu içine entegre edilmesini, bu şekilde söz konusu ilgili proteini eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun elde edilmesini; ve memeli hücresine süspansiyon kültürünün yapılmasını içerir.

Description

TARIFNAME PROTEIN URETME USULU Teknik Alan Bu bulus, bir çift transpozon dizisi arasina eklenen bir gen fragmaninin bir memeli hücresinin bir kromozomu içine entegre edilmesi için bir ilgili geni kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren en az bir ekspresyon vektörünün bir memeli hücresi süspansiyonuna eklenmesini içeren bir usule; ve proteini üreten bir memeli hücresi süspansiyonuna süspansiyon kültürü yapilmasini içeren bir usule; proteini eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonuna; ve bir ilgili geni kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörüne iliskindir. Bulusa Iliskin Bilinen Hususlar Rekombinant DNA teknikleriyle ekzojen protein üretimi ilaç sanayii ve gida sanayii gibi çesitli sanayilerde kullanilir. Çogu durumda, rekombinant proteinlerin üretimi ilgili proteini kodlayan bir nükleotit dizisini içeren bir ekspresyon vektörünün Escherichia coli, maya, böcek hücresi, bitki hücresi ve hayvan hücresi gibi bir konakçi içine eklenmesi, ekspresyon vektörünün kromozom Içine entegre edilmis oldugu bir transformantin seçilmesi ve ayrica transforme olmus hücre hattinin uygun kültür kosullari altinda yetistirilmesi yoluyla gerçeklestirilir. Bununla birlikte, bir ekzojen proteini verimli sekilde üretebilecek bir konakçi gelistirmek için ilgili her protein için iyi üretkenlige sahip bir konakçi hücrenin seçilmesi gereklidir, dolayisiyla her konakçi için ekzojen protein üretme tekniklerine iliskin daha ileri bir teknik inovasyonun olmasi istenir. Escherichia coli gibi bakteri sistemlerinde ve maya sistemlerinde, hayvan hücrelerinden farkli olarak çogu durumda seker zinciri modifikasyonu gibi post-translasyonel modifikasyonlarin elde edilmesi zordur ve dolayisiyla kendi etkinligine sahip bir protein üretiminde sorun ortaya Böcek sisteminde üretilen protein fosforilasyon ve seker zincirlerinin eklenmesi gibi post- translasyonel bir modifikasyona tabi oldugu için bu sistem kendi özgün fizyolojik etkinligine sahip proteinin eksprese edilebilmesi degerine sahiptir. B ununla birlikte, salgilanan proteinin seker zinciri yapisinin memelilerden türetilen hücrelerde görülenden farkli olmasi nedeniyle proteinin farmasötik kullanimda uygulanmasi söz konusu oldugunda antijenik ve benzeri bir sorun olusturur. Ilaveten, ekzojen bir genin eklenmesi söz konusu oldugunda, böcek hücresi sisteminde rekombinant bir Virüs kullanildigi için güvenilirlik açisindan bunun virüs inaktivasyonunu ve kontrolünü gerektirmesi sorunu söz konusudur. Hayvan hücresi sisteminde, fosforilasyon, seker zinciri ilavesi ve katlanma gibi post- translasyonel modifikasyonlar canli vücutta üretilenlere daha benzer bir tarzda insan dahil gelismis hayvanlardan elde edilen proteinlere tasinabilir. B ir proteinin orijinal olarak sahip oldugu tizyolojik etkinligi rekombinant proteininde yeniden yaratmak için bu tür hassas post- translasyo nel modifikasyonlar gereklidir ve konakçi olarak bir memeli hücresinin kullanildigi bir protein üretme sistemi genellikle bu tür bir fizyolojik etkinligi gerektiren farmasötik ürünlere ve benzerine uygulanir. Bununla birlikte, konakçi olarak bir memeli hücresinin kullanildigi bir protein ekspresyonu sistemi genellikle üretkenlik açisindan zayiitir ve çogu durumda eklenilen genlerin stabilitesi açisindan da bir sorun çikarir. Konakçi olarak bir memeli kültür hücresi kullanarak bir proteinin üretkenliginin iyilestirilmesi sadece tedaviye yönelik ilaçlarin, tani maddelerinin ve benzerinin üretimi açisindan çok önemli olmakla kalmayip, bunlarin arastirilmasina ve gelistirilmesine de büyük katki saglar. Dolayisiyla, konakçi olarak bir memeli kültür hücresinin, özellikle belirtmek gerekirse Çin hamsteri over hücresinin (CHO hücresi) kullanildigi yüksek üretkenlikte bir hücre hattinin elde edilmesini kolaylikla mümkün kilan bir gen ekspresyonu sisteminin gelistirilmesi aciliyet arz etmektedir. Transpozon kromozomda bir lokustan diger lokusa hareket edebilen degistirilebilir bir genetik unsurdur. Transpozon moleküler biyoloji ve genetik üzerine yapilan çalismalar açisindan önemli bir araçtir ve böceklerde veya nematodda (örnegin, Drosophila melanogaster veya Caenorhabditis elegans) ve bitkilerde mutajenez, gen tuzaklama ve transgenik bireylerin hazirlanmasi gibi bir amaçla kullanilir. Bununla birlikte, memeli hücrelerini içeren omurgali hayvanlar için bu tür bir teknigin gelistirilmesi gecikmistir. Bununla birlikte, son yillarda omurgali hayvanlarda da etkinlikleri olan transpozonlar bildirilmis ve bunlarin bir kisminin memeli hücrelerinde, örnegin fare ve insandan elde edilen hücrede bir etkinlige sahip oldugu gösterilmistir. Tipik örnekleri bir medakadan (yillik baligi) klonlanan Toll (Patent Referansi 1) ve Tol2 (Patent Olmayan Referans 1) transpozonlarini, Pasifik somon baligi (Onchorhynchus) genomunda bulunan otonom olmayan bir transpozondan yeniden olusturulan Uyuyan Güzel'i (Patent Olmayan Referans 2), kurbagadan elde edilen Kurbaga Prens yapay transpozonunu (Patent Olmayan Referans 3) ve böcekten elde edilen piggyBac transpozonunu (Patent Olmayan Referans 4) içerir. Bu DNA transpozonlari mutajenez, gen tuzaklama, transgenik bireylerin hazirlanmasi, ilaç dirençli proteinlerin ekspresyonu ve benzeri için, bir memeli hücresi genomunda yeni bir fenotipin ortaya çikartilmasinda bir gen ekleme araci olarak kullanilmaktadirlar (Patent Olmayan Referans 5-12). Böcekler söz konusu oldugunda, pulkanatli bir böcekten elde edilen piggyB ac transpozonunu kullanarak bir ekzojen genin ipekböcegi kromozomu içine eklenildigi, bu sekilde söz konusu ekzojen gen tarafindan kodlanan proteinin eksprese edildigi bir usul incelenmis ve yukaridaki tekniklerin kullanildigi bir protein üretme usulü açiklanmistir (Patent Referansi 2). Bununla birlikte, ilgili proteinin yeterli seviyelerde eksprese edilmemesi ve ipekböceginin tüm vücudunda üretilmesi yüzünden eksprese edilen ekzojen proteinin büyük bir miktarda kontamine protein içeren vücut sivisindan oldukça saf bir formda geri kazanilmasini saglamak için ileri bir saflastirma tekniginin gerekli olmasi bakimindan ekonomik bir sorun olusturur. Ilaveten, 6418 direnci ile iliskili bir proteinin medaka türevi transpozon Tol2 (Patent Olmayan Referans 12 ve 13) kullanarak bir memeli hücresinde eksprese edildigi bir örnek bilinmektedir. Kültür edilmis memeli türevi bir hücre kullanarak tibbi kullanima yönelik bir protein ilacin üretilmesi söz konusu oldugunda, bilinmeyen bir virüsten veya patojenik polipeptitten kaynaklanan beklenmedik bir kontaminasyonu önlemek için üretim süreci sirasinda hayvan türevi bir bilesenin bulundurulmamasi önemlidir. Bir protein ilacin üretilmesinde hayvan hücresi olarak en yaygin kullanilan CHO hücresidir ve son yillarda yapilan çalismalar sayesinde bir serumun veya hayvan türevi bilesenin kullanilmadigi güvenilir bir besiyerinde kültür edilebilen bir CHO hücre hatti süspansiyonu gelistirilmistir. Bununla birlikte, serumsuz veya proteinsiz bir kosulda içine bir gen eklenilen bir hücre hattinin üretkenligi semm kullanilan bir kosulda içine bir gen eklenilen hücre hattinin üretkenliginin yarisi ile sinirlidir (Patent Olmayan Literatür 14). Serumsuz veya proteinsiz bir kosulda gen transdüksiyonunun teknik açidan zor oldugu bilinir. Genel olarak bir ilgili proteini eksprese eden bir hücrenin taranmasi için seçilebilir bir markör ayni gen ekspresyonu vektöründe düzenlenir. Bu, genomda mevcut bir genin kolaylikla eksprese edildigi bir bölgenin ve genomda mevcut bir genin zorlukla eksprese edildigi bir bölgenin olduguna (pozisyon etkileri denilir, Patent Olmayan Literatür 15) ve seçilebilir markör eksprese edildiginde ilgili proteinin de eksprese edildigi varsayimina dayanir. Ote yandan, ilgili protein iki veya daha fazla polipeptitten, örnegin bir antikordan ve benzerinden olustugunda, her polipeptidin farkli vektörleri kullanarak eksprese edildigi de bilinir. Bir antikor söz konusu oldugunda, antikorun agir zincirinin ekspresyonu hafif zincirinin ekspresyonundan daha yüksek oldugunda üretkenligin daha yüksek oldugu gösterilmistir (Patent Olmayan Literatür 16). Bundan sonra agir zincir ve hafif zincir ekspresyonlarinm ayni vektörde sabit hale geldigi Öngörüldü. Yüksek üretkenlik elde etmek amaciyla maksatli olarak farkli vektörleri kullanarak agir zincirin ve hafif zincirin eksprese edilmesiyle agir zinciri ve hafif zinciri optimum bir oranda eksprese eden bir hücre hattinin elde edilmesi mümkün hale geldi. Bununla birlikte, bir protein iki veya daha fazla farkli vektörün kullanilmasiyla eksprese edildiginde, iki veya daha fazla seçilebilir markör gen de gerekli olur. Bu sorunun üstesinden gelmenin bir yolu olarak, aslen bir polipeptit zincirinden olusan bir dhfr geninin iki polipeptit zincirine bölündügü ve bunlarin birinin bir agir zincir ekspresyon vektöründe düzenlendigi, digerinin ise bir hafif zincir ekspresyon vektöründe düzenlendigi bir örnek bildirildi (Patent Olmayan Literatür 17:. Bununla birlikte, Patent Olmayan Literatür 17*de açiklanan hücre bir CHO hücresi olup, burada hücre besiyerine eklenen ve yukarida açiklanan protein bilesene bagli olsa da, gen ekleme veriminin serumsuz veya proteinsiz kosulda gen ekleme durumundan oldukça farkli olmasi olasidir. B ir gen yüksek güvenilirlige sahip ve viral enfeksiyon tehlikesinden ve benzerinden muaf serumsuz veya proteinsiz bir kosulda eklenildiginde bile yüksek üretkenlikte bir hücre seçmenin yine de zor oldugu öngörüldü. Basvurusu Bulusun Açiklamasi Bulusla Çözüm Getirilen Sorunlar Bir ilgili proteini üretmek ve analiz etmek için memeli türevi bir kültür hücresi kullanarak söz konusu ilgili proteini stabil olarak ve yüksek ölçüde eksprese eden bir hücre hattinin seçilmesi gereklidir. Ancak ilgili proteini üreten hücrenin hazirlaninasi ve kültür edilmesi oldukça fazla çaba ve zaman gerektirir. Ilaveten, ilgili proteinin bir transpozon dizisi kullanarak bir memeli hücresinde eksprese edildigi bilinse de, bir ilgili proteini yüksek düzeyde eksprese edebilecek ve dolayisiyla bir transpozon dizisinin kullanildigi bir protein üretme sistemi olarak kullanilabilecek bir hücrenin hazirlanmasi; bir transpozon dizisi kullanarak bir ilgili proteini yüksek düzeyde üretebilecek bir memeli hücresini hazirlama usulü; ve hücreyi kullanarak bir protein üretim usulü bilinmemektedir. Yukarida açiklandigi gibi, bir ilgili proteinin, bir memeli kültür hücresi kullanarak söz konusu ilgili proteini yüksek düzeyde üretebilecek bir protein üretme sistemi olusturarak verimli sekilde ve kisa bir süre içinde büyük bir miktarda ekspresyonu gereklidir. ilaveten, gen eklemeden bir üretici hücrenin olusturulmasina dek bir hayvandan elde edilen herhangi bir bilesene gerek duymadan bir üretici genin olusturulmasi istenmektedir. Sonuç olarak, bulusun amaçlari verimli sekilde olusturulabilecek bir ilgili proteini oldukça yüksek düzeyde eksprese edebilecek bir hücrenin ve hücreyi kullanarak ilgili proteini üretmek Sorunlari Çözme Yollari Yukarida bahsedilen sorunlara çözüm getirmek için mevcut bulusun sahipleri kapsamli çalismalar gerçeklestirmis ve sonuç olarak ilgili proteini kodlayan bir DNA'yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren en az bir ekspresyon vektörünün bir memeli hücresi süspansiyonuna eklenmesi; ve bir çift (iki) transpozon dizisi arasina eklenen gen fragmaninm memeli hücresinin bir kromozomu içine entegre edilmesiyle söz konusu ilgili proteinin verimli sekilde üretilebilecegini bulmuslardir. Ilaveten, ilgili proteinin hücreyi kullanarak verimli sekilde üretilebilecegi bulunmus ve bu sekilde bulus tamamlanmistir. Ozel olarak belirtmek gerekirse, bulus asagidakilere iliskindir: 1. Bir antikor üretmek için bir usul, söz konusu usul bir CHO hücresi süspansiyonuna asagidakilerin eklenmesini içerir: (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA°yi bulunduran bir gen fragmanini ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA7y1 bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; veya (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA,yi ve bir seçilebilir markörü bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA°yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; veya (c) bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA°yi ve bir seçilebilir markörü bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragirianinin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü, burada her transpozon dizisi çifti Toll nükleotit dizileri veya T0l2 nükleotit dizileridir; bu usulde bir transpozazin transpozon dizilerinde etki göstermesi saglanir, bu sekilde gen fragmanlarinin bir CHO hücresi kromozomu içine entegre edilmesiyle antikoru eksprese eden bir CHO hücresi elde edilir; ve CHO hücresine süspansiyon kültürü uygulanir. 2. Bir antikor üretmek için bir usul, söz konusu usul asagidaki (A) ila (Ci asamalarini (A) B ir CHO hücresi süspansiyonuiia eszamanli olarak asagidakilerin eklenmesi: (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA°yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA'yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (c) bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA°yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA,yi bulunduran bir gen fragmanini ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü, burada her transpozon dizisi çifti Toll nükleotit dizileri veya T0I2 nükleotit dizileridir ve transpozon dizilerini taniyan ve bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmanini bir kromozomun içine aktarma etkinligine sahip bir transpozazi kodlayan DNA"yi içeren bir ekspresyon vektörü; (B) gen fragmanlarini bir CHO hücresi kromozomu içine entegre etmek için asama (A),da CHO hücresi süspansiyonuna eklenmis olan ekspresyon vektöründen geçici olarak transpozaz eksprese ederek antikoru eksprese eden bir CHO hücresi süspansiyonunun elde edilmesi, ve (C) antikoru üretmek için asama (B)ide elde edilen antikoru eksprese eden CHO hücresi süspansiyonuna süspansiyon kültürünün yapilmasi; 3. Bir antikor eksprese eden bir CHO hücresi süspansiyonunun elde edilmesi için bir usul, söz konusu usul bir CHO hücresi süspansiyonUna asagidakilerin eklenmesini (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA°yi bulunduran bir gen fragmanini ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; veya (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA,yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA*yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; veya (c) bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA,yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini Içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNAlyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü, burada her transpozon dizisi çifti Toll nükleotit dizileri veya TOI2 nükleotit dizileridir; bu usulde bir transpozazin transpozon dizilerinde etki göstermesi saglanir, bu sekilde gen fragmanlari bir CHO hücresi kromozomu içine entegre edilir; 4. Yukarida madde 1 ila 33ten herhangi birinde açiklanan usul olup, burada T0|2 nükleotit dizileri DIZI ID. NO:2"de gösterilen nükleotit dizisi ve DIZI ID. NO:3,te gösterilen nükleotit dizisidir; . Yukarida madde 1 ila 39ten herhangi birinde açiklanan usul olup, burada Toll nükleotit dizileri DIZI ID. NO: 14"& gösterilen nükleotit dizisi ve DIZI ID. NO:15,te gösterilen nükleotit dizisidir; 6. Yukarida madde 1 ila 5°ten herhangi birinde açiklanan usul olup, burada CHO hücresi süspansiyonu serumsuz bir besiyerinde sag kalabilen ve çogalabilen bir hücredir; 7. Yukarida madde 1 ila 6"dan herhangi birinde açiklanan usul olup, burada CHO hücresi süspansiyonu süspansiyon kültürüne adapte olmus bir CHO hücresidir; 8. Yukarida madde 1 ila 77den herhangi birinde açiklanan usul olup, burada CHO hücresi CHO-K1,CHO-K15V, DUKX Bll, CHO/DG44, Pro-3 ve CHO-S arasindan seçilen en az biridir; 9. Yukarida madde 1 ila 8"den herhangi birinde açiklanan usul olup, burada seçilebilir markör gen bir sikloheksimid direnç genidir; . Yukarida madde 9°da açiklanan usul olup, burada sikloheksimid direnç geni insan ribozomal protein L36 mutantini kodlayan bir gendir; 11. Yukarida madde 1 ila lO°dan herhangi birinde açiklanan usul olup, burada antikor tümörle baglantili bir antijeni, alerji veya enflamasyonla baglantili bir antijeni, kardiyovasküler hastalikla baglantili bir antijeni, otoimmün bir hastaliga iliskin bir antijeni veya bir bakteriyel enfeksiyonla baglantili bir antijeni taniyan bir antikordur; 12. Içine asagidakilerin entegre edildigi bir kromozoma sahip bir CHO hücresi süspansiyonu: (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA°yi bulunduran ve gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisine sahip bir gen fragmani; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNAiyi bulunduran ve gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisine sahip bir gen fragmani; ve bir seçilebilir markör gen içeren ve gen fragmaninin her iki terminalinde bir çiit transpozon dizisine sahip bir gen fragmani; veya (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNAiyi ve bir seçilebilir markör geni içeren ve gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisine sahip bir gen fragmani; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA"yi bulunduran ve gen fragmaninm her iki terminalinde bir çift transpozon dizisine sahip bir gen fragmani; veya (c) bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNAiyi ve bir seçilebilir markör geni içeren ve gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisine sahip bir gen fragmani; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA"yi içeren ve gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisine sahip bir gen fragmani, burada her transpozon dizisi çifti Toll nükleotit dizileri veya TOI2 nükleotit dizileridir; ve antikoru üretir ve serumsuz bir besiyerinde sag kalabilir ve çogalabilir; 13. Yukarida madde 12'de açiklanan CHO hücresi olup, burada CHO hücresi süspansiyonu süspansiyon kültürüne adapte olmus bir CHO hücresidir; 14. Yukarida madde 12 ve l3"ten herhangi birinde açiklanan CHO hücresi olup, burada CHO hücresi CHO-Kl, CHO-KlSV, DUKXBll, CHO/DG44, Pro-3 ve CHO- S arasindan seçilen herhangi biridir; . Yukarida madde 12 ila l4aten herhangi birinde açiklanan CHO hücresi olup, burada seçilebilir markör gen bir sikloheksimid direnç genidir; 16. Yukarida madde 15°te açiklanan CHO hücresi olup, burada Sik loheksimid direnç geni insan ribozomal protein L36a mutantini kodlayan bir gendir; 17. Yukarida madde 12 ila 169dan herhangi birinde açiklanan CHO hücresi olup, burada antikor tümörle baglantili bir antijeni, alerji veya enflamasyonla baglantili bir antijeni, kardiyovasküler hastalikla baglantili bir antijeni, otoimmün bir hastaliga iliskin bir antijeni veya bir bakteriyel enfeksiyonla baglantili bir antijeni taniyan bir antikordur; 18. Yukarida madde 12 ila l7"den herhangi birinde açiklanan CHO hücresi olup, burada T0l2 nükleotit dizileri DIZI ID. NO:2'de gösterilen nükleotit dizisi ve DIZI ID. NO:3'te gösterilen nükleotit dizisidir; 19. Yukarida madde 12 ila 17 "den herhangi birinde açiklanan CHO hücresi olup, burada Toll nükleotit dizileri DIZI ID. NO:14°te gösterilen nükleotit dizisi ve DIZI ID. NO:15'te gösterilen nükleotit dizisidir; . Bir antikor üretmek Için bir usulde asagidakilerin kullanimi: (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA°yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; veya (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA7y1 ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; veya (cl bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA*yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA,yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü, burada her transpozon dizisi çifti Toll nükleotit dizileri veya T0I2 nükleotit dizileridir; 21. Yukarida madde 20°de açiklanan kullanim olup, burada T0|2 nükleotit dizileri DIZI ID. NO:2"de gösterilen nükleotit dizisi ve DIZI ID. NO:3,te gösterilen nükleotit dizisidir; ve 22. Yukarida madde 20"de açiklanan kullanim olup, burada Toll nükleotit dizileri DIZI ID. NO: l4lte gösterilen nükleotit dizisi ve DIZI ID. NO:15"te gösterilen nükleotit dizisidir. Bulusun Etkisi Bulusa ait protein üretme usulüne göre, bir ilgili protein bir memeli hücresi süspansiyonunun kullanilmasiyla verimli sekilde üretilebilir. Ilaveten, mevcut bulusa ait hücre bir rekombinant proteinin veya bir rekombinant polipeptidin yüksek bir verimlilikte üretilmesi için bir üretim Sekillere Yönelik Kisa Açiklama transpozon vektörünün sematik sunumu gösterilmektedir. T0l2-L Tol2 transpozonunun bir sol ucunu temsil eder (DIZI ID. No:2), TOI2-R TOI2 transpozonunun (DIZI ID. No:3) bir sag ucunu temsil eder, CMV bir CMV promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder, HC bir insan antikoru H zinciri cDNA'sini temsil eder, Lc bir insan antikoru L zinciri cDNA°sini temsil eder ve CHX-r bir sikloheksimid direnç genini temsil eder. sematik bir sunumu gösterilmektedir. CMV bir CMV promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder, Hc bir insan antikoru H zinciri cDNA,sin1 temsil eder, Lc bir insan antikoru L zinciri cDNAisini temsil eder ve CHX-r bir sikloheksimid direnç genini temsil eder. gösterilmektedir. CAGGS bir CAGGS promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder ve TPase cDNA bir Tol2 transpozaz cDNA°sin110 temsil eder. Tol2 transpozon vektörü kullanildiginda bir CHO-Kl hücresi süspansiyonu nda ve bir adhezif CHO-Kl hücresinde anti-insan influenza M2 antikorunun ekspresyon seviyesinin incelenmesine iliskin bir sonuç gösterilmektedir. Sekil 4A'da CHO-Kl hücresi süspansiyonuna iliskin bir sonuç sunulmakta ve Sekil 48 'de adhezif CHO-Kl hücresine iliskin bir sonuç sunulmaktadir. Her iki sekilde de, dikey eksen antikor üretimi miktarini (tig/mil gösterir ve yatay eksen her hücrenin transgenik klon sayisini gösterir. transpozon vektörünün sematik bir sunumu gösterilmektedir. T0|I transpozonunun bir sol ucunu temsil eder (DIZI ID. NO:14), Toll-R T0l1 transpozonunun bir sag ucunu temsil eder (DIZI ID. NO: 15), CMV bir CMV promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder, HC bir insan antikoru H zinciri cDNA"sin1 temsil eder, Lc bir insan antikoru L zinciri cDNAisini temsil eder ve CHX-r bir sikloheksimid direnç genini temsil eder. gösterilmektedir. CAGGS bir CAGGS promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder ve TPase CD NA bir TolI transpozaz CDNAssini temsil eder. transpozon vektörü kullanildiginda bir CHO-Kl hücresi süspansiyonu nda anti-insan influenza M2 antikorunun ekspresyon seviyesinin incelenmesine iliskin bir sonuç gösterilmektedir. Dikey eksen antikor üretimi miktarini (tig/ml) gösterir ve yatay eksen her hücrenin transgenik klon sayisini gösterir. transpozon vektön'inün sematik bir sunumu gösterilmektedir. T0|2-L TOIZ transpozonunun bir sol ucunu temsil eder (DIZI ID. No:2), T0I2-R T0I2 transpozonunun bir sag ucunu temsil eder (DIZI ID. No:3), Pmo bir Moloney Mürin Lösemi Virüsü promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder ve Hc bir anti-insan CD98 antikoru agir zinciri cDNA'sini temsil eder (DIZI ID. bir transpozon vektörünün sematik bir sunumu gösterilmektedir. TOI2-L TOI2 transpozonunun bir sol ucunu temsil eder (DIZI ID. No:2), T0I2-R T0I2 transpozonunun bir sag ucunu temsil eder (DIZI ID. NO:31, CMV bir CMV promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder ve LC bir anti- insan CD98 antikoru hafif zincir cDNA"sini temsil eder (DIZI ID. NO:21). transpozon vektörünün sematik bir sunumu gösterilmektedir. Tol2-L TOI2 transpozonunun bir sol ucunu temsil eder (DIZI iD. No:2), Tol2-R T0I2 transpozonunun bir sag ucunu temsil eder (DIZI ID. No:3), CMV bir CMV promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder ve CHX-r bir sikloheksimid direnç genini temsil eder (DIZI ID. No:7). TNFOLL vektörü bir CHO-Kl hücresine genetik yolla eklendiginde anti-insan TNFOt antikorunun üretim miktari gösterilmektedir. Dikey eksen besiyerinde üretilen antikor (ug/mli konsantrasyonunu göstermekte, kontrol plotu Kontrol olarak gösterilmekte ve test plotu Orn. ile gösterilmektedir. CDZOL vektörü bil' CHO-Kl hücresine genetik yolla eklendiginde anti-insan CDZO antikorunun üretim miktari gösterilmektedir. Dikey eksen besiyerinde üretilen antikor (ug/mll konsantrasyonunu göstermekte, kontrol plotu Kontrol olarak gösterilmekte ve test plotu Orn. ile gösterilmektedir. 13'te, TOI2-L TOI2-L dizisini (DIZI ID. NO:2) içeren bir DNA fragmanini temsil eder ve T0|2-R T0|2-R dizisini (DIZI ID. NO:31 içeren bir DNA fragmanini temsil eder, CMV bir CMV promotörünü temsil eder, poli A bir poliadenilasyon alanini temsil eder, HC CD98 antikorunun bir agir zincir genini temsil eder, LC bil' anti-insan CD98 antikoru hafif zincir genini temsil eder, SO bir SV40 promotörü temsil ederi SV bir SV40 poliadenilasyon alanini temsil eder ve Neo-r bir neomisin direnç genini temsil Bulusim Gerçeklestirilmesine Iliskin Düzenlemeler Bu bulus bir ilgili proteinin üretilmesi için bir usule iliskin olup, bir ilgili geni kodlayan bir10 DNAayi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde transpozon dizilerini içeren en az bir ekspresyon vektörünün bir memeli hücresi süspansiyonuna eklenmesini; bir çift (iki) transpozon dizisi arasina eklenmis gen fragmaninin memeli hücresinin bir kromozomu içine entegre edilmesini, bu sekilde söz konusu ilgili proteini eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun elde edilmesini; ve memeli hücresine süspansiyon kültürünün yapilmasini içerir. Mevcut bulusta bir ilgili proteinin üretilmesine iliskin usulün (buradan itibaren mevcut bulusa ait usul olarak geçer) Örnekleri bir ilgili proteinin üretilmesi için asagida verilen (A) ila (C) asamalarini içeren bir usulü içerir: (A) asagidaki ekspresyon vektörü (a) ve (bl'nin bir memeli hücresi süspansiyonuna eszamanli eklenmesi asamasi: (a) bir ilgili geni kodlayan bir DNAayi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fiagmaninin her iki terininalinde transpozon dizilerini içeren en az bir ekspresyon vektörü, (b) transpozon dizilerini taniyan ve bir çift transpozon diZiSi arasina eklenmis bir gen fragmanini bir kromozom içine aktarma etkinligine sahip bir transpozazi kodlayan bir DNA9yi içeren bir vektör, (B) bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis gen fragmanini memeli hücresinin bir kromozomu içine entegre etmek için asama (A)"da memeli hücresi süspansiyonuna eklenmis olan ekspresyon vektöründen (b) geçici olarak transpozaz eksprese edilmesi, bu sekilde ilgili proteini eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun elde edilmesi asamasi ve (C) asama (B)"de elde edilen ilgili proteini eksprese eden memeli hücresi süspansiyonuna süspansiyon kültürü yaparak ilgili proteinin üretilmesi asamasi. Ilaveten, mevcut bulus, transpozon dizisi çifti arasina eklenen gen fragmaninin kromozom içine entegre edilmesi için içine bir ilgili geni kodlayan bir DNA°yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fraginaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren ekspresyon vektöründen ve bir ekspresyon vektöründen en az birinin eklenmis oldugu ve ilgili proteini üreten bir memeli hücresi süspansiyonuna iliskindir. Mevcut bulusta, ilgili protein bir veya daha fazla poiipeptitten olusan bir proteindir ve bulusa ait usule göre ilgili proteinin ekspresyonunu gerçeklestirebilir. Bir ilgili geni kodlayan bir DNAsyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çi& transpozon dizisi içeren en az bir ekspresyon vektörü bir veya iki veya daha fazla cins ekspresyon vektörü anlamina gelir. Ozellikle belirtmek gerekirse, iki veya daha fazla polipeptitten olusan bir ilgili proteini eksprese etmek için ilgili polipeptitleri kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çi& transpozon dizisi içeren iki veya daha fazla ekspresyon vektörünün kullanilmasi gereklidir. Daha özellikle belirtmek gerekirse, yukarida bahsedilen iki veya daha fazla polipeptitten olusan ilgili protein bir antikordur. Antikorun H zinciri ve L zinciri bir ekspresyon vektörü kullanarak eksprese edilebilir veya sirasiyla H zincirini eksprese eden bir vektörden ve L zincirini eksprese eden bir vektörden olusan iki ekspresyon vektörünü kullanarak eksprese edilebilir. Mevcut bulusa ait usule göre, ilgili proteini üreten bir memeli hücresi süspansiyonunu kullanarak bir ilgili protein üretilebilmekte olup, burada ilgili proteini kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çi& transpozon dizisi içeren ekspresyon vektörünün eklenmesiyle bir çin transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmani kromozom içine entegre edilir. Gen ilavesinin bir isareti olarak kullanilacak seçilebilir markör gen ilgili proteini kodlayan DNAiyi içeren ekspresyon vektörüyle ayni vektöre entegre edilebilir veya farkli bir vektöre entegre edilebilir. Yani, ilgili proteini kodlayan DNA°yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çi& transpozon dizisi Içeren ekspresyon vektörlerinden en az biri bir ilgili geni kodlayan DNA"yi ve bir seçilebilir markör geni bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çi& transpozon dizisi içeren ekspresyon vektörü olarak kullanilabilir. Ayrica, ilgili proteini kodlayan DNA"y1 bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çi& transpozon dizisi içeren ekspresyon vektörüne ilaveten, bir memeli hücresine bir seçilebiiir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninm her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörü de eklenebilir. Ozellikle belirtmek gerekirse, mevcut bulusa ait bir ilgili proteini üretmek için usul örnekleri asagidaki (A) ila (C) asamalarini içeren bir usulü içerir:10 (Al asagidaki ekspresyon vektörü (al ve (bl'nin bir memeli hücresi süspansiyonuna eszamanli eklenmesi asamasi: (a) bir ilgili geni kodlayan bir DNAlyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde transpozon dizilerini içeren en az bir ekspresyon vektörü; (b) transpozon dizilerini taniyan ve bir çi& transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmanini bir kromozom içine aktarma etkinligine sahip bir transpozazi kodlayan bir DNA,yi içeren bir vektör, (B) bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis gen fragmanini memeli hücresinin bir kromozomu içine entegre etmek için asama (A)7da memeli hücresi süspansiyonuna eklenmis olan ekspresyon vektöründen (b) geçici olarak transpozaz eksprese edilmesi ve bu sekilde ilgili proteini eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun elde edilmesi asamasi ve (C) asama (B),de elde edilen ilgili proteini eksprese eden memeli hücresi süspansiyonuna süspansiyon kültürü yaparak ilgili proteinin üretilmesi asamasi. Ilaveten, mevcut bulusa ait bir ilgili proteini üretmek için usul örnekleri asagidaki (A) ila (C) asamalarini içeren bir usulü içerir: (A) asagidaki ekspresyon vektörü (a) ve (anin bir memeli hücresi süspansiyonuna eszamanli eklenmesi asamasi: (a) bir ilgili geni kodlayan bir DNA,yi bulunduran bir gen ûagmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çifi transpozon dizisi içeren en az bir ekspresyon vektörü, (b) bir seçilebilir markör içeren ve seçilebilir markörün her iki ucunda bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörü, (C) transpozon dizilerini taniyan ve bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmanini bir kromozom içine aktarma etkinligine sahip bir transpozazi kodlayan bir DNA"yi içeren bir vektör, (B) bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis gen fragmanini memeli hücresinin bir kromozomu içine entegre etmek için asama (Arda memeli hücresi süspansiyonuna eklenmis olan ekspresyon vektöründen (b) geçici olarak transpozaz eksprese edilmesi ve bu sekilde ilgili proteini eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun elde10 edilmesi asamasi ve (C) asama (B),de elde edilen ilgili proteini eksprese eden memeli hücresi süspansiyonuna süspansiyon kültürü yaparak ilgili proteinin üretilmesi asamasi. Mevcut bulus, bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis gen fragmaninin ve seçilebilir markörün bir kromozoma entegre edilmesi için içine bir ilgili geni kodlayan bir DNA*yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çi& transpozon dizisi Içeren en az bir ekspresyon vektörünün ve bir seçilebilir markör içeren ve seçilebilir markörün her iki ucunda bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörünün eklenmis oldugu ve bir ilgili proteini üreten bir memeli hücresi süspansiyonuna iliskindir. Ilaveten, mevcut bulus bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis gen fragmaninin bir kromozoma entegre edilmesi Için içine bir ilgili geni kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini ve bir seçilebilir markörü içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki ucunda bir çift transpozon dizisi içeren bir protein ekspresyon vektörünün eklenmis oldugu ve bir ilgili proteini üreten bir memeli hücresi süspansiyonuna iliskindir. Ayrica, mevcut bulusa ait bir ilgili proteini üreten memeli hücresi süspansiyonu örnekleri içine eszamanli olarak (a) bir ilgili geni kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini ve bir seçilebilir markör geni içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde transpozon dizileri içeren bir ekspresyon vektörünün ve (b) bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis gen fragmanini kromozom içine entegre edilmesi için transpozon dizilerini taniyan ve bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis gen fragmaninin bir kromozom içine aktarilmasi etkinligine sahip bir transpozazi (transferaz) kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir vektörün eklenmis oldugu ve ilgili proteini üreten bir memeli hücresi süspansiyonunu içerir. Mevcut bulusa göre, bir memeli hücresi süspansiyonuna eklenecek, ilgili proteini kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir Çift transpozon dizisi içeren ekspresyon vektörlerinin sayisina memeli hücresi tarafindan ilgili proteinin ekspresyonu ve üretimi gerçeklestirilebildigi sürece özel bir sinirlama getirilmemistir ve örnekleri tercihen 1 ila 20 ekspresyon vektörü cinsini içerir, daha tercihen 2 ila 10 ekspresyon vektörü cinsinden bahsedilebilir ve örnegin 3 ila 8 ekspresyon vektörü cinsi, 4 ila 7 ekspresyon vektörü cinsi, 1 ila 6 ekspresyon vektörü cinsi, 1 ila 5 ekspresyon vektörü cinsi, 1 ila 4 ekspresyon vektörü cinsi ve 1 ila 3 ekspresyon vektörü cinsi tercih edilir. Ilaveten, mevcut bulus düzenlemesi örnekleri bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmaninin memeli hücresi kromozomu içine entegrasyonunu artirmak için bir usulü, ki10 burada memeli hücresi süspansiyonu içine eszamanli olarak (a) bir ilgili geni kodlayan bir DNASyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren ekspresyon vektöründen ve (b) transpozon dizilerini taniyabilen ve transpozon dizisi çifti arasina eklenmis gen fragmanini kromozoma ekleme etkinligine sahip transpozazi kodlayan bir DNA"yi içeren bir vektörden en az biri eklenir; bir ilgili geni kodlayan bir DNA`nin memeli hücresi kromozomu içine yüksek bir frekansta entegre edilmesi için bir usulü ve usullerle elde edilen ve bir ilgili proteini üretebilecek bir memeli hücresi süspansiyonunu içerir. Mevcut tarifnamede "transpozon" terimi yeri degistirilebilir bir genetik unsurdur ve belli bir yapiyi koruyarak bir kromozomda veya bir kromozomdan bir baska kromozoma (transpozisyonl hareket eden bir gen birimi anlamina gelir. Tr anspozon, bir gen biriminin her iki terminalinde ayni yönde veya ters yönde konumlanan tekrarlayan bir transpozon dizisi (ters çevrilmis tekrar dizisi (IR dizisi) veya terminali ters çevrilmis tekrar dizisi (TIR dizisi) de denilir) ve transpozon dizileri arasinda mevcut olan bir genin eklenmesi için transpozon dizisini taniyan bir transpozazi kodlayan bir nükleotit dizisini Transpozondan translasyon yapilan transpozaz, transpozonun her iki terminalindeki transpozon dizilerini taniyarak, bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis DNA fragmanini parçalayarak ve fragmani eklenilecegi alana ekleyerek bir DNA"yi ekleyebilir. Mevcut tarifnamede "transpozon dizisi" terimi bir transpozaz tarafindan taninan ve IR dizisi veya TIR dizisi ile ayni anlama sahip bir transpozonun nükleotit dizisi anlamina gelir. Nükleotit dizisini içeren bir DNA bir transpozaz etkinligi ile eklenebildigi (genomda baska bir konuma eklendigi) ve bir transpozaza özgün bir transpozon dizisi oldugu sürece eksik bir tekrar parçasi içerebilir. Bulusta kullanilacak transpozon dizisi olarak, bir transpozaz tarafindan taninabilecek ve memeli hücrelerine tasinabilecek bir çin dogal veya yapay DNA türü transpozondan türetilen bir nükleotit dizisi kullanilir. DNA türü bir transpozondan türetilen nükleotit dizileri medaka baligindan elde edilen TOII nükleotit dizileri veya T0l2 nükleotit dizileridir. Ozellikle belirtmek gerekirse, bunlar arasinda DIZI ID. NO:6,da gösterilen nükleotit dizisini içeren medaka baligindan elde edilen T012 transpozonu ve DIZI ID. NO:13°te gösterilen nükleotit dizisini içeren medaka baligindan elde edilen T012 transpozonu içeren nükleotit dizileri tercih edilir. B ir çift T0l2 transpozondan elde edilen nükleotit dizisi örnekleri Dizi Listesi içinde DIZI ID. dizisini ve 4148 ila 4682 konumlarindaki nükleotit dizisini içerir. B ir çift T0l2 transpozondan elde edilen nükleotit dizisi olarak, Dizi Listesi içinde DIZI ID. NO: 1 "de gösterilen T012 transpozon nükleotit dizisinde 1 ila 200 konuinlarindaki nükleotit konumlarindaki nükleotit dizisi (DIZI ID. No:3) (buradan itibaren "T0l2-R dizisi" olarak geçer) daha fazla tercih edilir. B ir çift T0l1 transpozondan elde edilen transpozon dizisi örnekleri Dizi Listesi içinde DIZI ID. NO:l3°te gösterilen Toll transpozon nükleotit dizisinde 1 ila 157 konumlarindaki bir nükleotit dizisini ve 1748 ila 1855 konumlarindaki nükleotit dizisini bulunduran nükleotit dizisini içerir. B ir çift Toll transpozondan elde edilen transpozon dizisi olarak, Dizi Listesi içinde DIZI ID. NO: l3ate gösterilen Toll transpozon nükleotit dizisinde 1 ila 200 konumlarindaki nükleotit konumlarindaki nükleotit dizisi (DIZI ID. NO:15) (buradan itibaren "Toll-R dizisi'i olarak geçer] daha fazla tercih edilir. Bulusta kullanilacak transpozon dizisi örnekleri transpozisyon reaksiyonlarinin yukarida bahsedilen transpozondan elde edilen bir transpozon dizisine ait bir kismi diziyi kullanarak, nükleotit dizisinin uzunlugunu ayarlayarak ve nükleotit dizisini ekleme, silme veya sübstitüsyonla modifiye ederek denetlendigi transpozon dizilerini içerir. Mevcut bulusa ait ilgili proteinin üretilmesine iliskin usul örnekleri, ilgili proteinin en az birinin en az iki transpozon dizisi ve en az iki transpozaz kullanarak üretildigi bir usulü de Ozellikle belirtmek gerekirse, örnekler iki T0l1 transpozon dizisine eklenmis bir ilk ilgili proteini kodlayan DNA,y1 bulunduran bir vektörüni iki T0l2 transpozon dizisine eklenmis bir ikinci ilgili proteini kodlayan DNAayi bulunduran bir vektörün, bir Toll transpozaz ekspresyon vektörünün ve bir T0l2 transpozon ekspresyon vektörünün, eszamanli olarak veya sirayla memeli hücresi kromozomu içine eklenmesi ve bu sekilde ilgili iki proteini üreten bir memeli hücresinin elde edilmesi asamalarini içeren bir protein üretme usulünü içerir. Ilaveten, birinci ilgili protein ve ikinci ilgili protein ayni olabilir ve hücre içine eklenecek gen kopyalarinin sayisini artirarak ilgili proteinin üretkenligi de iyilestirilebilir. Bir transpozonun transpozisyon reaksiyonunun denetlenmesi hususunda, transpozisyon reaksiyonu transpozon dizisinin bil' transpozaz tarafindan taninmasini sirasiyla hizlandirarak veya bastirarak hizlandirilabilir veya bastirilabilir. Ilaveten, transpozonun transpozisyon reaksiyonu hususunda, transpozisyon reaksiyonu bir çift (iki) transpozon dizisi arasina eklenen nükleotit dizisinin boyunu kisaltarak artirilabilir ve transpozisyon reaksiyonu boyu uzatarak azaltilabilir. Dolayisiyla, çok sayida protein içeren bir ilgili proteinin eksprese edilmesi ve hazirlanmasi durumunda ilgili proteinler, her proteini kodlayan DNA'yi farkli bir ekspresyon vektörüne ekleyerek, DNA"yi bir kOnakçi hücre kromozomu içine entegre ederek ve hücreyi kullanarak ilgili proteini üretmek üzere ilgili proteini hazirlayabilecek bir memeli hücresi süspansiyonunu olusturarak hazirlanabilir. Mevcut tarifnamede "transpozaz" terimi transpozon dizilerine sahip nükleotit dizilerini taniyan ve nükleotit dizileri arasinda mevcut olan bir gen fragmanini bir kromozoma veya kromozomdan bir baska kromozoma aktaran bir enzim anlamina gelir. Transpozaz örnekleri medaka baligindan elde edilen Toll ve T012'den, Onchorhynchus baligi genomunda bulunan otonom olmayan bir transpozondan yeniden olusturulan Uyuyan GüzeVden (SB), Uyuyan Güzel 11'den (SBll), kurbagadan elde edilen yapay transpozon Kurbaga Prens"ten (FP) ve böcekten elde edilen transpozon PiggyBac'den (PB) elde edilen enzimleri içerir. Transpozaz olarak, bir natif enzim kullanilabilir ve transpozazla ayni transpozisyon etkinligi korundugu sürece amino asitlerinin bir parçasi sübstitüe edilmis, silinmis, araya sokulmus ve/veya eklenmis herhangi bir transpozaz kullanilabilir. Transpozazin enzim etkinliginin kontrol edilmesiyle, transpozon dizileri arasinda bulunan DNA°n1n transpozisyon reaksiyonu kontrol edilebilir. TranspozaZa benzer bir transpozisyon etkinligine sahip olup olmadigini analiz etmek 2 bilesenli analiz sistemiyle ölçüm yapilabilir. Ozellikle, otonom olmayan bir T0l2 parçasinin bir transpozaz etkinligi ile bir memeli hücresi kromozomu içine aktarilip aktarilamayacagi ve eklenip eklenemeyecegi ayri ayri T0l2 transpozazi silinmis bir Tol2 transpozon (ToI2 türevi otonom olmayan transpozon] içeren bir plazmit ve Tol2 transpozaz içeren bir plazmit kullanarak analiz edilebilir. Mevcut tarifnamede "otonom olmayan transpozon" terimi transpozon içinde bulunan bir transpozazi kaybetmis ve bu nedenle otonom transpozisyonunu gerçeklestiremeyen bir transpozon anlamina gelir. Otonom olmayan transpozon, bir transpozaz proteinin, transpozaz proteini kodlayan bir mRNA°nin veya transpozaz proteini kodlayan bir DNAinin hücre içinde eszamanli bulunmasini saglayarak otonom olmayan transpozonun transpozon dizileri içine eklenmis DNAtyi konakçi hücre kromozomu içine aktarabilir. Transpozaz geni bir transpozazi kodlayan gen anlamina gelir. Bir memeli hücresinde ekspresyon veriminin iyilestirilmesi için Kozak konsensüs dizisi (Kozak M.I Nucleic ACIdS baslangiç kodonu arasindaki bir araligi uygun bir mesafeye (örnegin, 6 ila 18 bazdan itibaren) ayarlayan bir dizi genin translasyonu baslatma kodonu ATGinin bir yukari bölgesine baglanabilir. Bulusa ait usule göre, en az bir ekspresyon vektörü içinde ilgili proteini kodlayan bir DNA,y1 içeren bir gen fragmaninm bir konakçi hücre kromozomu içine entegre edilmesini saglamak için ilgili proteini kodlayan bir DNA"yi bulunduran gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörü konakçi hücreye eklenir ve bir transpozazin hücreye eklenen ekspresyon vektöründe bulunan transpozon dizileri üzerinde etki göstermesi saglanir. B ir transpozazin hücreye eklenen ekspresyon vektöründe bulunan transpozon dizileri üzerinde etki göstermesini saglamak için hücreye transpozaz enjekte edilebilir veya ilgili proteini kodlayan bir DNA"y1 ve 'bir seçilebilir markör geni içeren bir ekspresyon vektörü ile birlikte en az bir ilgili proteini kodlayan bir DNA'yi içeren bir ekspresyon vektörü veya bir ilgili geni kodlayan bir DNA konakçi hücre içine eklenebilir. Ilaveten, transpozaz genini kodlayan bir RNAtnin konakçi hücre içine eklenmesiyle hücrede transpozaz eksprese edilebilir. Ekspresyon vektörüne özel bir sinirlama getirilmemektedir. Içine transpozaz geni içeren bir ekspresyon vektörünün eklenecegi konakçi hücreye; kullanima; ve benzerine bagli olarak teknikte uzman olanlarca bilinen ekspresyon vektörleri arasindan istege göre seçerek herhangi bir ekspresyon vektörü kullanilabilir. Bulusa ait usulle iki veya daha fazla polipeptitten veya iki veya daha fazla ilgili proteinden olusan bir ilgili proteinin üretilmesi söz konusu oldugunda, her proteini kodlayan bir10 DNAsnin bir konakçi hücre kromozomuna entegre edildigi bir protein üretici hücre her proteini kodlayan DNA,nin ayni ekspresyon vektörüne eklenmesiyle veya DNA"n1n ilgili farkli ekspresyon vektörüne eklenmesiyle ve ekspresyon vektörünün bir konakçi hücreye eklenmesiyle hazirlanabilir. Transpozaz ilgili proteinle birlikte eksprese olmak için bir ekspresyon vektörüne eklenebilir veya ekspresyon vektöründen farkli bir vektöre eklenebilir. Transpozazin geçici olarak etki göstermesi saglanabilir veya sürekli etki göstermesi saglanabilir ancak stabil üretim için bir hücre hazirlamak için tercihen transpozazin geçici etki göstermesi saglanir. Transpozazin geçici etki göstermesini saglama usulünün örnekleri transpozazi kodlayan bir DNA°yi bulunduran bir ekspresyon vektörünün ve bir ilgili geni kodlayan bir DNA'yi bulunduran bir ekspresyon vektörünün hazirlanmasini ve ardindan ekspresyon plazmitlerinin her ikisinin eszamanli olarak bir konakçi hücreye eklenmesini içeren bir usulü içerir. Mevcut tarifnamede "ekspresyon vektörü" terimi bir memeli hücresine eklemekte ve bir ilgili proteini eksprese etmekte kullanilan bir ekspresyon vektörü anlamina gelir. Bulusta kullanilan ekspresyon vektörü bir ekspresyon kasetinin her iki tarafinda en az bir çi& transpozon dizisinin mevcut oldugu bir yapiya sahiptir. Mevcut tarifnamede "ekspresyon kaseti" terimi bir ilgili proteini ve ilgili proteini kodlayan bir diziyi eksprese etmek için gerekli bir gen ekspresyonunu kontrol etme bölgesine sahip bir nükleotit dizisi anlamina gelir. Gen ekspresyonunu kontrol etme bölgesinin örnekleri bir hizlandiriciyi, promotörü ve sonlandiriciyi içerir. Ekspresyon kaseti seçilebilir bir markör gen içerebilir. Bir hayvan hücresinde islev görebildigi sürece herhangi bir promotör kullanilabilir. Ornekleri sitomegalovirüs (CMV) IE (hizli erken) genine ait bir promotörü, SV40 erken promotörü, retrovirüs promotörü, metallotionein promotörü, isi sok promotörü, SRoi promotörü, Moloney mürin lösemi virüsü, bir hizlandirici ve benzerini içerir. Ayni sekilde, insan CMV IE geni hizlandiricisi da promotörle birlikte kullanilabilir. bin hücreden ayirt etmekte kullanilabilecek istege bagli bir baska markör gen anlamina gelir. Seçilebilir markör gen örnekleri bir ilaç direnç genini (neomisin direnç geni, dihidrofolat redüktaz (DHFR) geni, puromisin direnç geni, blastisidin direnç geni, zeosin direnç geni, Incelemesiz Patent Basvurusu) ), floresans ve biyoluminesans markör genleri (yesil floresan protein GFP gibi) ve benzerini içerir. Bulusta tercih edilen seçilebilir markör bir ilaç direnç genidir ve özellikle tercih edilen seçilebilir markör bir sikloheksimid direnç genidir. Ayrica, seçilebilir markör proteinin ilaç direnci özelligi ve Iuminesans (isildama) özelligi seçilebilir markör geni genetik olarak modifiye ederek veya seçilebilir markör genin transkripsiyonunu veya translasyonunu kontrol ederek (örnegin, bir promotör modifikasyonu, bir amino asit kodon modifikasyonu ve benzeri) amino asidi modifiye edilmis bir varyantin hazirlanmasiyla da degistirilebilir. ilaveten, farkli ilaç direnci kuvvetlerine sahip bir seçilebilir markör gen eklenmis hücreler ilaç konsantrasyonunun ayarlanmasiyla da seçilebilir. Seçiiebilir markör proteinin ilaç direnci özelliginin ve luminesans özelliginin kontrol altina alinmasi için zayitlatilmis bir seçilebilir markör genin kullanilmasi tercih edilir. Zayiflatilmis seçilebilir markör gen hücre içinde seçilebilir markör gen tarafindan kodlanan proteinin etkinliginin azalmasini saglayacak bir tarzda modifiye edilmis bir seçilebilir markör gendir. Hücre içindeki etkinligin azalmasini saglayacak bir tarzda modifiye edilmis seçilebilir markör gen örnekleri (A) bir seçilebilir markör gen tarafindan kodlanan bir proteinin amino asit dizisinin söz konusu proteinin hücre içindeki etkinligini azaltacak sekilde modifiye edilmis oldugu bir seçilebilir markör geni ve (B) seçilebilir markör genin ekspresyonunu azaltmak için seçilebilir markör genin ekspresyonunu kontrol eden bir nükleotit dizisinin modifiye edilmis oldugu veya ORF (açik okuma çerçevesi) içindeki bir nükleotit dizisinin modifiye edilmis oldugu bir seçilebilir markör geni içerir. Bir seçilebilir markör gen tarafindan kodlanan bir proteinin amino asit dizisinin sözkonusu proteinin hücre içindeki etkinligini azaltacak sekilde modifiye edilmis oldugu seçilebilir Bir proteinin hücre içindeki ekspresyon seviyesinin seçilebilir markör genin ekspresyonunu kontrol eden bir nükleotit dizisinin modifiye edilmesiyle azaltilmasina iliskin usulün örnekleri seçilebilir markör gen ekspresyonunu kontrol eden promotör dizi, sonlandirici dizi, hizlandirici dizi, Kozak konsensüs dizisi veya Shine-Dalgarno dizisine ait dizinin modifiye edilmesi için bir usulü içerir. Daha hususiyetle, örnekler seçilebilir markör genin ekspresyonunu kontrol eden bir promotör dizinin daha zayif bir promotör dizi ile degistirildigi bir usulü içerir. Seçilebilir markör genin ORF'sindeki bir nükleotit dizisinin modifiye edilmesiyle proteinin hücre içindeki ekspresyon seviyesinin azaltilmasi usulünün örnekleri ORF'deki bir kodonun hücre içinde daha da az kodon kullanimi sikligina sahip bir es kodonla degistirildigi bir usulü Bulusa ait zayiflatilmis seçilebilir markör gen örnekleri genin ORFisinde yukarida bahsedilen kodonun hücrede daha da az kodon kullanimi sikligina sahip bir es kodonla degistirildigi bir seçilebilir markörü içerir. Çesitli biyolojik türlere ait hücrelerde, her es kodon arasinda daha da düsük kullanim sikligma sahip es kodon bilinen literatüre, veri tabanlarina ve benzerine dayanarak seçilebilir. Düsük kullanim sikligina sahip bir es kodonla ikame olarak, özellikle CHO hücresi SÖZ konusu oldugunda örnekler lösin kodonunun TTA ile ikamesini, arginin kodonunun CGA veya CGT ile ikamesini, alanin kodonunun GCG ile ikamesini, valin kodonunun GTA ile ikamesini, serin kodonunun TCG ile ikamesini, izolösin kodonunun ATA ile ikamesini, treonin kodonunun ACG ile ikamesini, prolin kodonunun CCG ile ikamesini, glutamik asit kodonunun GAA ile ikamesini, tirozin kodonunun TAT ile ikamesini, lizin kodonunun AAA ile ikamesini, fenilalanin kodonunun TTT ile ikamesini, histidin kodonunun CAT ile ikamesini, glutamin kodonunun CAA ile ikamesini, asparajin kodonunun AAT ile ikamesini, aspartik asit kodonunun GAT ile ikamesini, sistein kodonunun TGT ile ikamesini ve glisin kodonunun GGT ile ikamesini içerir. Zayiflatilmis bir seçilebilir markör gende, protein üretici bir hücre verimli sekilde elde edilebildigi sürece modifikasyon öncesinde seçilebilir markör genle karsilastirildiginda degistirilecek kodonlarin sayisina özel bir sinirlama getirilmemektedir ancak 20 veya daha fazla amino asit kalintisina karsilik gelen kodonlarin ikame edilmesi tercih edilmektedir. Zayiflatilmis bir seçilebilir markör gende, modifikasyon öncesinde seçilebilir markör genle karsilastirildiginda modifiye edilecek bazlarin sayisina özel bir sinirlama getirilmemektedir ancak seçilebilir markör geni kodlayan nükleotit dizisinin %lO"unun veya daha fazlasinin modifiye edilmesi tercih edilmektedir. ilaveten, zayiflatilmis bir seçilebilir markör gende ikame edilecek kodonlar tarafindan kodlanan amino asit kalintilarina özel bir sinirlama getirilmemektedir ancak tercih edilen örnekler lösin, alanin, serin ve valini içerir. ZayiIlatilmis bir seçilebilir markör gen söz konusu oldugunda, Iösine karsilik gelen kodonlarin ikame edilmesi durumunda özel bir sinirlama getirilmemektedir ancak seçilebilir markör gende bulunan lösin kalintilarinin toplamina karsilik gelen kodonlar arasindan lösin kalintilarinin %703ine veya daha fazlasina karsilik gelen kodonlarin ikame edilmesi tercih Y ine zayiflatilmis bir seçilebilir markör gen söz konusu oldugunda, alanine karsilik gelen kodonlar ikame edildiginde özel bir sinirlama getirilinemektedir ancak seçilebilir markör gcnde bulunan alanin kalintilarinin toplamina karsilik gelen kodonlar arasindan alanin kalintilarinin %70°ine veya daha fazlasina karsilik gelen kodonlarin ikame edilmesi tercih Kodonlarin daha az kullanim sikligina sahip es kodonlarla ikame edildigi bu tür bir modifikasyonla elde edilen zayiflatilmis seçilebilir markör genin belli basli örnekleri DIZI ID. NO:37, 38 veya 39'Ia temsil edilen nükleotit dizisini içeren bir neomisin direnç genini, DIZI ID. NO:41, 43 veya 44"Ie temsil edilen nükleotit dizisini içeren bir puromisin direnç genini, DIZI ID. NO:45 veya 46,1a temsil edilen nükleotit dizisinden olusan bir Zeosin direnç genini ve DIZI ID. NO:47 veya 48'le temsil edilen nükleotit dizisini içeren bir higromisin direnç genini içerir. Ilaveten, bir seçilebilir markör genin zayiflatilmasi, antikor üretici bir hücrenin hazirlanmasinda ilaç dirençli bir hücre seçildiginde bir ilacin konsantrasyonunun geleneksel olarak kullanilan konsantrasyonla karsilastirildiginda anlamli ölçüde artirilmasiyla veya Ilaç direnç geni metabolize olmadan ve Ilaci bozundurmadan önce ilave uygulama yaparak da mümkündür. Sikloheksimid (buradan itibaren bazen CHX olarak geçer) bir protein sentezi inhibitörüdür ve seçilebilir markör gen olarak bir CHX direnç geni kullaniminin örnekleri bilinen maya 262879 sayili belge) durumlarini içerir. Hayvan hücreleri söz konusu oldugunda, DIZI LISTESI içinde DIZI ID. NO:7 ile temsil edilen nükleotit dizisi tarafindan kodlanan bir proteini eksprese eden bir transformantin sikloheksimide direnç sagladigi ortaya konulmus olup, burada DIZI LISTESI içinde DIZI ID. No:5 ile temsil edilen nükleotit dizisi tarafindan kodlanan bir insan ribozomal protein alt birimi L36alya ait 54 konumlu prolin glutaminle ikame edilir. Ilaveten, sikloheksimid direnç markörü örnekleri bir mutant insan ribozomal protein alt birimi L44'ü içermekte olup, burada bir insan ribozomal protein alt birimi L44'ün konum 54'ündeki prolin glutaminle ikame edilir. B ir transpozon dizisi içeren yukarida bahsedilen protein ekspresyon vektörünün, bir transpozazi veya RNA°yi eksprese etmek için bir plazmit vektörün eklenmesi usulüne özel bir sinirlama getirilmemektedir. Ornekleri kalsiyum fosfat transfeksiyonu, elektroporasyon, Transpozazin bir protein formunda dogrudan eklenmesi usulünün örnekleri bir mikroenjeksiyon teknigini veya endositozla hücre içine beslemeyi içerir. Gen ekleme Masami Muramatsu ve Tadashi Yamamoto editörlügünde, YOdO-Sha tarafindan yayinlanan Shin içinde tarif edilen usulle gerçeklestirilebilir. Konakçi hücre bir memeli hücresi süspansiyonudur. Memeli hücresi bir Çin hamsteri over hattini içerir. ilaveten, yukarida bahsedilen konakçi hücre hücrenin protein üretimi için uygun olmasini saglamak üzere kromozomal DNA modifikasyonuna, bir ekzojen genin eklenmesine ve benzerine bagli modifikasyonlar yaparak bulusa ait protein üretme usulünde de kullanilabilir. Ayrica, üretilecek bir ilgili proteine baglanan seker zincirini kontrol etmek Için Iektin direnci belgeler), GDP-mannoz eksik bir hücre ve Fx proteini eksik bir hücre de konakçi hücre olarak kullanilabilir. Mevcut bulusta, ilgili protein iki veya daha fazla protein poiipeptidinden olusan kompleks bir proteindir. Ilaveten, bulusta protein ve poiipeptit esaniamlidir ancak görece düsük bir molekül agirligina sahip bir molekülü veya bir kompleks proteini olusturan bir protein bazen bir poiipeptit olarak tanimlanabilir. Bulusta ilgili protein bir antikordur. Ozellikle belirtmek gerekirse, ilgili protein örnekleri bir monoklonal antikoru ve bir poliklonal antikoru içerir. Antikor bir antikor agir zincir (H zincir) polipeptidi ve iki antikor hafif zincir (L zinciri polipeptidi içeren bir moleküldür ve alti sinifolarak IgA, IgD, IgE, lgG ve IgM alt siniflari bilinir. Ayrica, lgG IgGl, IgGZ, IgG3 ve IgG4°e siniflandirilir. lgG antikoru iki H zincir polipeptidinden ve iki L zincir polipeptidinden olusan bir heterotetramerik moleküldür. H zincir ve L zincirin her biri antijen baglama ile baglantili bir degisken bölgeden (V) ve bir sabit bölgeden (C) olusur ve bunlarin her biri sirasiyla VH, CH, VL veya CL olarak isimlendirilir. CH bölgesi ayrica CH1,CH2 ve CH3 bölgelerine siniflandirilir ve CH2 ve CH3 bölgeleri birlikte Fc bölgesi olarak veya basitçe Fc olarak isimlendirilir. Antikor tek bir epitopla reaksiyona giren bir monoklonal antikoru, iki veya daha fazla epitopla reaksiyona giren bir poliklonal antikoru ve bir rekombinant antikoru içerir. Monoklonal antikor tek bir klonal antikor üretici hücre tarafindan salgilanan ve sadece bir ep itopu (antijenik determinant olarak da isimlendirilir) taniyan bir antikordur ve bir monoklonal antikoru olusturan amino asit dizisi (birincil yapi) tekbiçimlidir. Poliklonal antikor monoklonal antikorlarin bir karisimidir ve iki veya daha fazla epitopla reaksiyona girebilir. Rekombinant antikor örnekleri bir kimerik antikor, insan özellikleri katilmis bir antikor, bir insan antikoru, bir Fc füzyon proteini, Fc amino asidi modifiye antikor ve çok degerlikli bir antikor ve bunun bir kismi fragmanini içerir. Amino asit modifikasyonlu bir antikor gerek bir degisken bölgede, gerek bir sabit bölgede bir amino asit modifikasyonuna sahip olabilir ve antikor etkinligi kontrol altindadir. Çok degerlikli antikor bir antijende iki veya daha fazla farkli epitopla reaksiyona giren bir çok degerlikli antikoru, iki veya daha fazla farkli antijenle reaksiyona giren bir çok degerlikli antikoru ve benzerini içerir ancak herhangi bir çok degerlikli antikoru da içerebilir. Ilaveten, çok degerlikli antikor antije ne baglanma etkinligini korudugu sürece herhangi bir yapiya sahip Mevcut bulusa ait üretim usulüne göre yukarida bahsedilen herhangi bir ilgili protein ve/Veya ilgili peptit eksprese edilebilir ve üretilebilir. Içine mevcut bulusa ait en az bir ilgili proteini kodlayan bir DNAinin sokuldugu hücre örnekleri asagida belirtilen (A) ve (B) asamalari ile hazirlanan bir antikor üretici hücreyi Asama (A): Asagidaki (a) ila (ci'den seçilen bir ekspresyon vektöründen veya ekspresyon vektörü (d) ve ekspresyon vektörü (ei'den bir kombinasyonun her ikisinin eszamanli olarak bir memeli hücresi süspansiyonu na eklenmesine iliskin bir asama: (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA"yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninm her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA"yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNASyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (c) bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA,y1 ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörü; ve (d) bir antikorun H zincirini ve L zincirini kodlayan DNA7y1 ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörü; (e) transpozon dizilerini taniyan ve bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmaninin bir kromozom içine aktarilmasi etkinligine sahip bir transpozaz kodlayan DNA,yi bulunduran bir vektör; Asama (B): B ir antikoru eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun seçilmesine iliskin bir asama olup, burada asama (A)ida memeli hücresi süspansiyonuna eklenmis ekspresyon vektörü (e)°den transpozazin geçici sekilde eksprese edilmesiyle, bir çift transpozon dizisi arasinda eklenmis yukarida geçen H zinciri, L zinciri ve seçilebilir markör genleri yukarida geçen memeli hücresine ait bir kromozoma entegre edilir. Mevcut bulusa ait bir antikoru üretme usulünün örnekleri bir ilgili proteinin üretilmesi için asagidaki (Al ila (C) asamalarini içeren bir usulü içerir. Asama (A): Asagidaki (a) ila (0)"den seçilen bir ekspresyon vektön'inden veya ekspresyon vektörü (d) ve ekspresyon vektöiü (e)"den bir kombinasyonun eszamanli olarak bir memeli hücresi süspansiyonuna eklenmesine iliskin bir asama: (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA7y1 bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terininalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA"yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNAiyi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (c) bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNAiyi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA°yi bulunduran bir gen fragmanini ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve (d) bir antikorun H zincirini ve L zincirini kodlayan DNA°yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörü; (e) transpozon dizilerini taniyan ve bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmaninin bir kromozom içine aktarilmasi etkinligine sahip bir transpozaz kodlayan DNA°yi bulunduran bir vektör; Asama (B): B ir antikoru eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun elde edilmesine iliskin bir asama olup, burada asama (A)"da memeli hücresi süspansiyonuna eklenmis ekspresyon vektörü (e)"den transpozazin geçici sekilde eksprese edilmesiyle, bir çift transpozon dizisi arasinda eklenmis yukarida geçen H zinciri, L zinciri ve seçilebilir markör genleri yukarida geçen memeli hücresine ait bir kromozoma entegre edilir; ve Asama (C): B ir antikor eksprese eden asama (B)"de elde edilen bir memeli hücresi süspansiyonuna süspansiyon kültürü uygulayarak antikorun üretimine iliskin bir asama. ilaveten, mevcut bulus yüksek bir antikor üretkenligine sahip bir hücre hattinin üretimine iliskin bir usulü ve hücre hattinin taranmasi için asagidaki (A) ve (B) asamalarini içeren bir usulü içerir. Asama (Al: Asagidaki (a) ila (c)°den seçilen bir ekspresyon vektöründen veya ekspresyon vektörü ((1) ve ekspresyon vektörü (efden bir kombinasyonun eszamanli olarak bir memeli hücresi süspansiyonuna eklenmesine iliskin bir asama: (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA'yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA,yi bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA'yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA7y1 bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (Cl bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNAiyi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA,yi bulunduran bir gen fragmanini ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve (d) bir antikorun H zincirini ve L zincirini kodlayan DNA7y1 ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörü; (e) transpozon dizilerini taniyan ve bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmaninin bir kromozom içine aktarilmasi etkinligine sahip bir transpozaz kodlayan DNA"y1 bulunduran bir vektör; ve Asama (B): Bir antikoru yüksek seviyede eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun seçilmesine iliskin bir asama olup, burada asama (A)`da memeli hücresi süspansiyonuna eklenmis ekspresyon vektÖrÜ (el'den transpozazin geçici sekilde eksprese edilmesiyle, bir çift transpozon dizisi arasinda eklenmis yukarida geçen H zinciri, L zinciri ve seçilebilir markör genleri yukarida geçen memeli hücresine ait bir kromozoma entegre edilir. Ilaveten, mevcut bulus bir antikor üretimi için asagidaki (A), (B) ve (C) asamalarini içeren bir usulü içerir. Asama (A): Asagidaki (a) ila (c)'den seçilen bir ekspresyon vektöründen veya ekspresyon vektörü (d) ve ekspresyon vektörü (e),den bir kombinasyonun eszamanli olarak bir memeli hücresi süspansiyonuna eklenmesine iliskin bir asama: (a) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA9y1 bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA5y1 bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fraginaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; (b) bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA7yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA°y1 bulunduran bir gen fragmanini ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve (C) bir antikorun L zincirini kodlayan bir DNA,yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve bir antikorun H zincirini kodlayan bir DNA7y1 bulunduran bir gen fragmanini ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisini içeren bir ekspresyon vektörü; ve (di bir antikorun H zincirini ve L zincirini kodlayan DNA,yi ve bir seçilebilir markör gen bulunduran bir gen fragmanini içeren ve ayrica gen fragmaninin her iki terminalinde bir çift transpozon dizisi içeren bir ekspresyon vektörü; (e) transpozon dizilerini taniyan ve bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis bir gen fragmaninin bir kromozom içine aktarilmasi etkinligine sahip bir transpozaz kodlayan DNAiyi bulunduran bir vektör; Asama (B): B ir antikoru eksprese eden bir memeli hücresi süspansiyonunun elde edilmesine iliskin bir asama olup, burada asama (A),da memeli hücresi süspansiyonuna eklenmis ekspresyon vektörü (e)`den transpozazin geçici sekilde eksprese edilmesiyle, bir çift transpozon dizisi arasinda eklenmis yukarida geçen H zinciri, L zinciri ve seçilebilir markör genleri yukarida geçen memeli hücresine ait bir kroinozoina entegre edilir; ve Asama (C): Bir antikor eksprese eden asama (B),de elde edilen bir memeli hücresi süspansiyonuna süspansiyon kültürü uygulayarak antikorun üretimine iliskin bir asama. Içine mevcut bulusa ait en az bir ilgili proteini kodlayan bir DNA'nin eklenildigi memeli hücresi örnekleri içine birkaç farkli antikor geni eklenmis bir poliklonal antikor üretici hücreyi, bir kompleks molekül üretici hücreyi ve benzerini içerir. Poliklonal antikor üretici hücre örnekleri içine en az iki veya daha fazla farkli monoklonal antikor geni eklenmis bir hücreyi, içine çesitli antijenlere yönelik çesitli monoklonal antikor genleri eklenmis bir hücreyi, bir antijenle immünize edilmis ve içine insan disi bir antikora ait bir gen kütüphanesi eklenmis bir hücreyi, içine bir hastadan elde edilen bir antikor gen kütüphanesi eklenmis bir hücreyi ve benzerini içerir. Kompleks molekül üretici hücre kompleks molekül olusturmak üzere bir hücrede birlikte eksprese olan ilgili proteinleri kodlayan DNA'lar eklenildigi sürece herhangi bir hücre olabilir. Belli basli örnekleri içinde FcyRIII (CD16) ve ortak y zincirinin birlikte transfekte edilmis oldugu bir hücreyi, içinde neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve [32 makrogloblinin birlikte transfekte edilmis oldugu bir hücreyi, içinde CD98 ve LATI, in birlikte transfekte edilmis Mevcut bulusa ait antikor üretim usulü ile üretilen antikor herhangi bir antikor olabilir ve örnekleri tümörle baglantili bir antijeni taniyan bir antikoru, alerji veya enflamasyonla baglantili bir antijeni taniyan bir antikoru, kardiyovasküler hastalikla baglantili bir antijeni taniyan bir antikoru, otoiininün hastaliklarla baglantili bir antijeni taniyan bir antikoru, virüs veya bakteriyel enfeksiyonla baglantili bir antijeni taniyan bir antikoru ve benzerini içer ir. Tümörle baglantili antijen örnekleri CDla, CDZ, CD3, CD4, CDS, CDG, CD7, CD9, CDlO, anjiyopoietinle baglantili protein 4 (AR P4l, aurora, B7-Hl, B7-DC, integlin, kemik iligi stromal antijen 2 (BSTZ), CA125, CA19.9, karbonik anhidraz 9 (CA9), kadherin, cc-kemokin reseptörü (CCR) 4, CCR7, karsinoembriyonik antijen (CEA), sistein açisindan zengin fibroblast büyüme faktörü reseptör-1 (CFR-ll, c-Meti c-Myc, kollajen, CTA, bag dokusu büyüme faktörü (CTGF), CTLA-4, sitokeratin-18, DF3, E-katerin, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), EGFRvIII, EGFRZ (HERZ), EGFR3 (HER3), EGFR4 (HER4], endoglin, epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAMl, endotelyal protein C reseptörü (EPCR), efrin, efrin reseptörü (Ephl, EphA2, endotelyaz-Z (ET2), FAM3D, fibroblast etkinlestirici protein (FAP), Fc reseptörü homologu 1 (FcRHll, ferritin, fibroblast büyüme faktörü-8 (FGF-8), FGF8 reseptörü, bazik FGF (bFGF), bFGF reseptörü, FGF reseptörü (FGFR) 3, FGFR4, G-CSF reseptörü, gangliozit (örnegin GDZ, GD3, GM2 ve GM3J, globo H, gp75, gp88, GPR- HLA-DR), HM, idyotip epitop, insülin benzeri büyüme faktörü (IGF), IGF reseptörü (IGFRl, interlökin (örnegin IL-6 ve IL-lSl, interlökin reseptörü (örnegin IL-6R ve IL-lSR), integrin, immün reseptör translokasyonu baglantili-4 (IRTA-4l, kallikrein 1, KDR, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KSl/4, Iamp-l, Iamp-2, laminin-S, Lewis y, sialil Lewis x, Ienfotoksin-beta reseptörü (LTBR), LUNX, melanoma baglantili kondroitin sülfat proteoglikan (MCSP), mezotelin, MICA, Müllerian inhibe edici madde tip II reseptörü (MISIIR), musin, nöral hücre adezyonu molekülü (NCAM), NeCI-S, NotChl, OSteOpontIn, trombosit kaynakli büyüme faktörü (PDGF), PDGF reseptörü, trombosit faktör-4 (PF-4), fosfatidilserin, Prostat Spesifik Antijen (PSA), prostat kök hücre antijeni (PSCAl, prostat spesifik membran antijeni (PSMA), Paratiroid hormonla baglantili protein/peptit (PTHrP), NF-kappaB ligandi reseptör etkinlestiricisi (RANKL), hiyalüronik asit aracili motilite reseptörü (RHAMM)i ROBOl, SART3, semaforin 4B (SEMA4Bl, salgilayici lökosit proteaz inhibitörü (SLPI), SMS-l, sfingozin-l-fosfat, tümör baglantili glikoprotein-72 (TAG-72), transferrin reseptörü (TfR), TGF-beta, Thy-1,Tie-1,Tie2 reseptörü,T hücresi immünoglobulin domeni ve musin domen 1 (TIM-1), insan doku faktörü (hTF), Tn antijeni, tümör nekroz faktörü (TNF), Thomsen- Friedenreich antijeni (TF antijeni), TNF reseptörü, tümör nekroz faktörü baglantili apoptoz indükleyici ligand(TRAIL1,TRAIL reseptörü (örnegin DR4 ve DRS), sistem ASC amino asit transportör 2 (ASCT21,trkC, TROP-2, TWEAK reseptörü Fn14, tip IV kollajenaz, ürokinaz reseptörü, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), VEGF reseptörü (örnegin VEGFRI, VEGFRZ ve VEGFR3), vimentin, VLA-4 ve benzerini ve yukarida bahsedilen antijeniere yönelik antikorlari içerir. Ayrica, tümörle baglantili bir antijeni taniyan antikor örnekleri [AntiCancer Res., 13, 331 ,736,137 sayili belge, Rituxan (R), Okrelizumab, OfatumumabI, anti-EGFR antikoru (Erbitux (R1, Vectivix (R1), anti-HERZ antikoru (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 EpCAM antikoru, anti-A33 antikoru, anti-folat reseptör antikoru (MRAb-003) ve benzerini Alerji veya enflamasyonla baglantili bir antijeni taniyan antikor örnekleri anti-inter lök In 6 antikoru [Hybridomai 13, 183 (1994)]i anti-tümör nekroz faktörü reseptör antikoru [Molecular Pharmacol., 58, ], anti-kemokin baglantili bir antijeni taniyan antikor örnekleri anti-CpIIb/Illa antikoru [J. Immunol., 152, anti-trombosit kaynakli büyüme faktörü reseptör antikoru [J, Biol. Chem., 272, 17400 antikoru, anti-nVßS antikoru, anti-a4ß7 antikoru ve benzerini içerir. Virüs veya bakteriyel enfeksiyonla baglantili antijeni taniyan antikor örnekleri anti-gp120 Mevcut bulusa ait usulle üretilen bir monoklonal antikorun efektör etkinligi çesitli usullerle kontrol edilebilir. Bilinen usullerin örnekleri bir antikorun Fc bölgesinde konum 297'de asparajine (Asn) baglanmis kompleks türde N baglantili bir seker zincirinin indirgeyici bir ucunda (lt-1,6 bagiyla N-asetilglukozamine (GlcNAc) bagli bir fukoz (buradan itibaren, bölgesinde amino asit kalintisinin(kalintilarinin) modifiye edilmesiyle bir efektör etkinliginin kontrol edilmesi için bir usulü ve benzerini içerir. Mevcut bulusa ait usulle üretilen monoklonal antikorun efektör etkinligi usullerden herhangi birini kullanarak kontrol edilebilir. anlamina gelir. Efektör etkinligi olarak, antikora bagli hücresel sitotoksisite (ADCC etkinligi), tamamlayiciya bagli sitotoksisite (CDC etkinligi), makrofajlar veya dendritik hücreler gibi fagositik hücrelerle antikora bagli fagositoz (ADP etkinligi) ve benzeri bilinmektedir. Ilaveten, mevcut bulusa ait usulle üretilmis bir monoklonal antikorun bir FC bölgesinin kompleks türde N baglantili bir seker zincirinde çekirdek fukoz miktarinin kontrol edilmesiyle antikora ait bir efektör etkinligi artirilabilir veya azaltilabilir. Antikorun Fc bölgesine bagli kompleks türde N baglantili seker zincirine baglanmis fukoz miktarinin azaltilmasina iliskin bir usul olarak, a1,6-fukoziltransferazi kodlayan bir genden muaf bir CHO hücresi kullanarak bir antikorun ekspresyonuyla fukozun baglanmadigi bir antikor elde edilebilir. Fukozun baglanmadigi antikor yüksek bir ADCC etkinligine sahiptir. Ote yandan, bir antikorun F c bölgesine bagli kompleks türde N baglantili bir seker zincirine baglanmis fukoz miktarinin artirilinasina iliskin bir usul olarak, içine al,6-fuk02iltran5ferazi kodlayan bir genin eklenildigi bir konakçi hücre kullanarak bir antikorun ekspresyonuyla fukozun baglandigi bir antikor elde edilebilir. FukOZun baglantigi antikor fukozun baglanmadigi antikora göre daha düsük bir ADCC etkinligine sahiptir. Ayrica, bir antikora ait bir Fe bölgesindeki amino asit kalintisinin(kalintilarinin) modifiye edilmesiyle, ADCC etkinligi veya CDC etkinligi artirilabilir veya azaltilabilir. Örnegin, bir amino asit dizisini kullanarak artirilabilir. 7,317,091 sayili ABD Patent belgelerinde açiklanan amino asit modifikasyonunu gerçeklestirerek artirilabilir veya azaltilabilir. Mevcut bulusta "memeli hücresi süspansiyonu" terimi kültür hücrelerinin adezyonunu kolaylastirmak için kaplanmis mikro boncuklar gibi bir hücre kültürü ankrajina, doku kültürü için bir kültür kabina (doku kültürü veya adezyon kültürü kabi ve benzeri olarak da geçer) ve benzerine yapismayan ve kültür çözeltisinde süspanse olarak sag kalabilen ve büyüyebilen bir hücre anlamina gelir. Hücre, hücre kültürü ankrajina yapismadigi sürece kültür çözeltisinde tek bir hücre halinde sag kalabilir ve büyüyebilir veya iki veya daha fazla hücrenin yapismasi ile olusan bir hücre kütlesi halinde sag kalabilir ve büyüyebilir. Ilaveten, mevcut bulusta kullanilacak bir memeli hücresi süspansiyonu olarak, hücre kültürü ankrajina yapismadan kültür Çözeltisi içinde süspanse olurken fetal buzagi serumu (buradan itibaren FCS olarak geçer) ve benzerini içermeyen bir serumsuz besiyerinde sag kalabilen ve büyüyebilen bir hücre tercih edilir ve protein içermeyen proteinsiz bir besiyerinde süspanse olarak sag kalabilen ve büyüyebilen bir memeli hücresi daha fazla tercih edilir. Doku kültürü kültür kabi, uygulanan adezyon kültürü için kapli oldugu sürece herhangi bir kap, örnegin bir sise, bir Petri tabagi ve benzeri olabilir. Ozellikle, örnegin bir memeli hücresi süspansiyonu olup olmadigi ticari olarak piyasada mevcut doku kültürü sisesini (Greiner tarafindan imal edilir), adezyon kültürü sisesini (Sumitomo Bakelite tarafindan imal edilir] ve benzerini kullanarak dogrulanabilir. Mevcut bulusta kullanilacak bir memeli hücresi süspansiyonu, ya esasen bir süspansiyon özelligine sahip bir CHO hücresini ayrica süspansiyon kültürüne adapte ederek hazirlanmis bir CHO hücresii ya da adhezif bir CHO hücresini süspansiyon kültürü kosullarina adapte ederek hazirlanmis bir CHO hücresi süspansiyonu olabilir. Esasen bir süspansiyon özelligine sahip hücre örnekleri CHO-S hücresini (Invitrogen tarafindan imal edilir) içer ir. Yukarida geçen "adhezif bir memeli hücresinin süspansiyon kültürü kosullarina adapte referansinda açiklanan usulle veya asagida gösterilen usulle hazirlanabilir ve süspansiyon kültürüne adaptasyon öncesindekilere benzer veya süspansiyon kültürüne adaptasyon öncesindekilerden üstün proliferasyon Özelligi ve sag kalim özelligi gösteren bir hücrenin adapte edilmis hücrenin sag kalim oraninin, proliferasyon hizinin (iki katina çikma süresi) ve benzerinin süspansiyon kültürüne adaptasyon öncesinde hücrenin gösterdikleri ile önemli ölçüde ayni olmasi anlainina gelir. Mevcut bulusta, adhezif bir memeli hücresinin süspansiyon kültürü kosullarina adaptasyonu usulünün örnekleri asagidaki usulü içerir. Serum içeren bir besiyerinin serum içerigi l/lO'a azaltilir ve görece yüksek hücre konsantrasyonunda alt kültür tekrarlanir. Memeli hücresi sag kalabilir ve proliferasyon gösterebilir hale geldiginde, serum içerigi daha da azaltilir ve alt kültür tekrarlanir. Bu usulle serumsuz kosullarda sag kalabilen ve proliferasyon gösterebilen bir memeli hücresi süspansiyonu hazirlanabilir. ilaveten, bir memeli hücresi süspansiyonu Pluronic-F68 veya benzeri gibi noniyonik yüzey aktif madde ilavesi ile uygun bir kültür çözeltisi içinde kültür yapilmasini içeren bir usulle de hazirlanabilir. Mevcut bulusta, memeli hücresi süspansiyonunun sahip oldugu bir özellik olarak, süspansiyon kültürü 2X105 hücre/ml kosulu altinda gerçeklestirilir ve ardindan 3 veya 4 gün kültür sonrasinda hücre konsantrasyonu tercihen 5<105 hücre/ml veya daha fazla, daha tercihen 8x105 hücre/ml veya daha fazla, özellikle tercihen 1<106 hücre/ml veya daha fazla, en fazla tercihen 1.5x106 hücre/ml veya daha fazla olur. Ilaveten, mevcut bulusa ait memeli hücresi süspansiyonunun iki katina çikma süresi tercihen 48 saat veya daha az, daha tercihen 24 saat veya daha az, özellikle tercihen 18 saat veya daha az, en fazla tercihen 11 saat veya daha azdir. Süspansiyon kültürü için besiyeri örnekleri ticari olarak piyasada mevcut besiyerlerini, örnegin CD-CHO besiyerini (Invitrogen), EX-CELL , SFM4CHO besiyerini (HyCIonel ve benzerini içerir. ilaveten, memeli hücrelerinin kültür edilmesi için gerekli sakaritlerin, amino asitlerin ve benzerinin karistirilmasiyla da elde edilebilir. Memeli hücresi süspansiyonu süspansiyon kültürü yapilabilecek bir kültür kosulu altinda süspansiyon kültürü için kullanilabilecek bir kültür kabinin kullanilmasiyla kültür edilebilir. Kültür kabi örnekleri hücre kültürü süspansiyonu için 96 kuyucuklu bir plakayi (Coming tarafindan imal edilir), bir T siseyi (Becton Dickinson tarafindan imal edilir), konik bir siseyi (Coming tarafindan imal edilir] ve benzerini içerir. Kültür kosullari bakimindan, örnegin 37°C bir kültür sicakliginda %5 COz bir atmosferde statik olarak kültür yapilabilir. Çalkalamali bir kültür teçhizati, örnegin Wave B iyoreaktör (GE Healthcare B iOSCience tarafindan imal edilir) gibi özel olarak süspansiyon kültüründe kullanilan bir kültür teçhizati da kullanilabilir. Bir memeli hücresi süspansiyonu için Wave Biyoreaktör teçhizatinin kullanildigi süspansiyon kültürü kosullari durumunda, hücreye GE Healthcare B loscience anasayfasi http:/lwww.gelifesciences.c0Jp/tech_support/manual/pdf/celIcuIt/wave_03_16.pdf'de açiklanan usulle kültür yapilir. Çalkalamali kültüre ilaveten, bir biyoreaktör gibi döndürmeli çalkalamali bir teçhizatla da kültür yapilabilir. Bir biyoreaktör kullanarak yapilan kültür Cytotechnology, (2006] 52: 199 - 207 referansinda ve benzerinde açiklanan usulle gerçeklestirilebilir. Mevcut bulusta memeli hücresi süspansiyonlarindan baska bir hücre hattinin kullanilmasi söz konusu oldugunda, yukarida bahsedilen usulle süspansiyon kültürüne adapte edilmis bir memeli hücresi hatti ve mevcut bulusa ait protein üretme usulünde kullanilabilecek bir hücre hatti oldugu sürece herhangi bir hücre hatti kullanilabilir. Memeli hücresi süspansiyonu ile üretilen ilgili proteinin saflastirilinasi ilgili proteini içeren bir kültür çözeltisinde veya hücre homojenatinda ilgili proteinden baska katiskilardan ilgili proteinin ayrilmasiyla gerçeklestirilir. Ayirma usulü örnekleri santrifüjleme, diyaliz, amonyum sülfat çökeltmesi, kolon kromatografisi, filtreleme ve benzerini içerir. Ayirma ilgili proteinin ve katiskilarin fiziksel ve kimyasal özelliklerindeki farkliliklara veya kolon tasiyicisinin kendisi için baglanma güçlerindeki farkliliklara dayanarak gerçeklestirilebilir. Ilgili proteinin satlastirilmasi usulü olarak satlastirma Protein Experimentation Note (birinci ciltl - Extraction, Separation and Expression of Recombinant Protein (Protein Deneyi Notu (birinci cilt) - Rekombinant Protein Özütleme, Ayirma ve Ekspresyonu) (Japonca yazilan bir ders kitabinin çevirisi) (Masato Okada ve Kaori M iyazaki"nin editörlügünde Yodo-sha gerçeklestirilir. Mevcut bulus yukarida kolay anlasilmayi saglamak amaciyla tercih edilen düzenlemeleri göstererek tarif edilmistir. Buradan itibaren mevcut bulus özel olarak örneklere dayanarak daha ayrintili açiklanmaktadir ancak yukarida bahsedilen açiklamalar ve asagida verilen örnekler sadece örnek olusturmak amaciyla sunulmakta olup, bulusun sinirlandirilmasi amaci güdülmemektedir. Dolayisiyla, bulusun kapsami mevcut tarifnamede özel olarak açiklanan düzenlemeler ve örneklerle sinirli olmayip, sadece istemlerle sinirlidir. Rekombinasyona iliskin asagida açiklanan klonlama ve benzeri gibi çesitli deneysel teknikler J. Sambrook, E. F. Frisch ve T. Maniatisiin editörlügünü yaptigi Molecular Cloning, 2. Baski, Frederick M. Ausubel ve digerlerinin editörlügü nde Current Protocols tarafindan yayinlanan Current Protocols in Molecular Biology referanslarinda ve benzerinde açiklanan genetik mühendislik tekniklerine göre gerçeklestirildi. Anti-Insan Influenza M2 Antikorunun Ekspresyonu Için Transpozon Vektörün Hazirlanmasi Memeli hücreleri için bir çift TOIZ transpozon dizisi arasina eklenmis bir rastgele insan antikoru geninin ve bir ilaç direnci inarkör geninin bulundugu bir gen ekspresyonu kasetini içeren bir plazmit protein ekspresyonu için bir plazmit vektör olarak kullanildi. Kullanilan genlere ait her DNA bilinen bir nükleotit dizisine dayanarak kimyasal veya yapay olarak sentezlendi veya her iki terminal dizisine iliskin primerleri hazirlayarak ve ardindan sablon olarak uygun bir DNA kaynagi kullanip PCR gerçeklestirerek elde edildi. Daha sonra gen manipülasyonu gerçeklestirmek için primer terminaline bir restriksiyon enzimi için restriksiyon alani eklendi. Otonom olmayan T012 transpozona ait nükleotit dizisinde (DIZI ID. NO: 1), konum 1 ila ve konum 2285 ila 2788'deki nükleotit dizisi (TOIZ-R dizi) (DIZI iD. No:3) transpozon dizileri olarak kullanildi. B ir çift transpozon dizisi içeren her sentetik DNA fragmani (TAKARA BIO lNC. tarafindan imal edilir) asagidaki usule göre hazirlandi. Restriksiyon enzimi Nrul7ya iliskin bir tanima dizisinin Tol2-R dizisinin hem 5' terminaline, hem 3' terminaline baglandigi bir nükleotit dizisini içeren DNA fragmani hazirlandi. Ardindan, restriksiyon enzimi Fsel "e iliskin bir tanima dizisinin ToIZ-L dizisinin 5' terminaline baglandigi ve bir restriksiyon enzimi Ascl "nin bunun 3' terminaline baglandigi bir nükleotit dizisini içeren DNA fragmani hazirlandi. Daha sonra, bu sekilde hazirlanmis TOI2-R dizisini ve Tol2-L dizisini içeren DNA fragmanlari anti-insan influenza M2 antikoru Z3Gl'in amino asit dizisini kodlayan bir eklendi. CMV hizlandirici/promotör kontrolü altinda içine anti-insan influenza M2 antikoru Z3G1'In Koleksiyonu, Manassas, VA, ABDl H zincirini (DIZI ID. NO:10) kodlayan bir nükleotit dizisinin (DIZI ID. NO:9) ve L zincirini (DIZI ID. NO: 12) kodlayan bir nükleotit dizisinin belgesi) bir antikor gen ekspresyon kaseti olarak kullanildi. ToI2-R dizisini içeren DNA fragmani N5LG1_M2_Z3 vektöründe antikor gen ekspresyonu kasetini ve bir seçilebilir markörü içeren bir gen fragmaninin 5' terminal alaninda konumlanan restriksiyon enzimi Nrul alanina eklendi. Daha sonra, T0l2-L dizisini içeren DNA fragmani 3' terminal alaninda konumlanan restriksiyon enzimi Fsel ve ASCI alanlarina eklendi. ilaveten, bir sikloheksimid direnç geni ekspresyon kasetinin eklenmesiyle anti-insan influenza M2 antikorunun ekspresyonu için bir transpozon vektörü olusturulmus olup (Sekil 1), burada sikloheksimid için bir direnç genini (insan ribozomal proteini L36a"nin konum 54'ündeki prolinin glutamin ile sübstitüe edildigi bir gen] kodlayan bir nükleotit dizisi (DIZI ID. NO:5)10 CMV hizlandirici) promotör kontrolü altinda T0l2 transpozon dizisi ile birlesmis N5LG1_M2_Z3 vektörü FseI tanima alani ile birlesir. Ote yandan, transpozon dizilerini içermeyen bir vektör anti-insan influenza M2 antikoru ekspresyon vektörü olarak isimlendirildi ve kontrol vektörü olarak kullanildi (Sekil 2). Transpozaz Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Transpozaz, ilgili antikonin ekspresyon vektön'inden bagimsiz bir ekspresyon vektörü kullanarak eksprese edildi. Yani, medaka baligi türevi TOI2 transpozazi (DIZI ID. No:4) kodlayan bir gen bir pCAGGS vektörünün CAGGS promotörünün asagi kismina eklenir itibaren T0l2 vektörü olarak geçer) hazirlanir (Sekil 3). Memeli Hayvan Hücresi Kullanarak Transformant Hazirlama (1) CHO Hücresi Süspansiyonunun Hazirlanmasi CHO hücresi bir tripsin islemi ile siyrildi ve sonra geri kazanildi, ardindan %10 FCS içeren taze u-M E M besiyeri kullanarak %5 COz bir inkübatörde 37°C"de çalkalamali kültür yapildi. Bundan birkaç gün sonra bu hücrelerin büyüdügü dogrulandi ve sonra bunlari 2<105 hücre/ml bir konsantrasyonda %5 FCS Içeren bir (X-MEM besiyerine asilayarak, ardindan kültürü çalkalayarak çalkalamali kültür gerçeklestirildi. Bundan yine birkaç gün sonra %5 FCS içeren a-MEM besiyerini kullanarak ayni sekilde asilama gerçeklestirildi. Son olarak, alt kültürü tekrarlayarak ve serumsuz a-MEM besiyeri kullanip kültürü çalkalayarak ve hücrelerin serum mevcudiyetinde kültür edildiklerinde sahip olduklari ile ayni büyüme kapasitesine sahip olduklarini dogrulayarak süspansiyon kültürüne adapte edilmis bir hücre hazirlandi. (2) Antikor Üreten CHO Hücresinin Hazirlanmasi Ekspresyon vektörü olarak, Ornek 1 ve Ornek 2"de hazirlanan anti-insan influenza M2 antikoru ekspresyonu için transpozon vektörü (buradan itibaren bir transpozon vektörü olarak geçer) ve T0l2 vektörü pCAGGS-TZTP (Sekil 3, Kawakami K. & Noda T., Genetics, 166, antikoru ekspresyon vektörü kontrol olarak kullanildi. Yukarida bahsedilen ekspresyon vektörlerini süspansiyon kültürüne adapte edilmis CHO-Kl hücresine (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu Kat. No. CCL-61) veya HEK293 hücresine (Invitrogen, FreeStyle 293F Cell) ekleyerek sikloheksimid dirençli klonlari elde etme sikliklari karsilastirildi. Her hücre (4›<106 hücre) 400 ul PBS içinde süspanse edildi ve anti-insan influenza M2 antikorunu eksprese etmek için transpozon vektörü (10 ugl ve T0l2 vektörü (25 ug) elektroporasyonla dogrudan dairesel DNA formunda birlikte transfekte edildi. Bu baglamda, TOI2 transpozazi geçici olarak eksprese etmek için konakçi kromozom içine bütünlesmeyi engellemek amaciyla T012 vektörü dogrudan dairesel DNA formunda eklendi. Ilaveten, kontrol olarak anti-insan influenza M2 antikor ekspresyon vektörü (10 MG] bir restriksiyon enzimi ile dogrusal hale getirildi ve sonra elektroporasyonla standart gen ekleme usulüne göre hücrelerin her birine eklendi. Elektroporasyon 300 V voltaj, 500 uF elektrostatik kapasite ve oda sicakligi kosullari altinda bir elektroporatör (Gene Pulser Xcell System (Bio-Rad tarafindan imal edilmis)) kullanarak 4 mm bosluk genisliginde bir küvetle (Bio-Rad tarafindan imal edilmis) gerçeklestirildi. Elektroporasyonla gen eklemesi sonrasinda her hücre 96 kuyucuklu üç plakaya asilandi ve CHO hücresi için SAFC Biosciences tarafindan imal edilen EX-CELL 325-PF besiyerini ve HEK293 hücresi için FreeStyle-293 besiyerini (Invitrogen tarafindan imal edilmis) kullanarak 3 gün bir COz inkübatöründe kültür edildi. Bunun ardindan, gen eklemenin 4. gününde besiyeri degistirme gününden sonra hücrelerin sikloheksimid mevcudiyetinde kültür edilmesini saglamak için 3 tig/ml sikloheksimid besiyerine eklendi, ardindan her hafta besiyeri degisimi yaparak 3 hafta kültür yapildi. 3 hafta kültür sonrasinda sikloheksimid dirençli kolonilerin bulundugu kuyucuklarin sayisi hesaplandi. Sonuçlar Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmektedir. Tablo 1 Sikloheksimid Dirençli Hücre Sayilarinin Karsilastirilmasi (CHO Hücresi) Transpozon Vektörü Geleneksel Vektör Tablo 1 Sikloheksimid Dirençli Hücre Sayilarinin Karsilastirilmasi (CHO Hücresi) Transpozon Vektörü Geleneksel Vektör Tablo 2 Sikloheksimid Dirençli Hücre Sayilarinin Karsilastirilmasi (HEK293 Hücresi) Transpozon Vektörü Geleneksel Vektör Tablo 1,de gösterildigi gibi, anti-insan influenza M2 antikor ekspresyonu transpozon vektörü veya anti-insan influenza M2 antikor ekspresyon vektörü CHO-Kl hücresi süspansiyonuna eklendi. Sonuç olarak, diger hücre hatlarinda oldugu gibi içine anti-insan influenza M2 antikoru ekspresyon vektörü eklenmis hücrelerden sikloheksimid dirençli transformantlar elde edilmedi ancak anti-insan influenza M2 antikorunu eksprese etmek için içine transpozon vektörü eklenmis hücreden yüksek bir siklikla sikloheksimid dirençli transformantlar elde Ote yandan, Tablo ?de gösterildigi gibi, HEK293 hücrelerine gerek anti-insan influenza M2 antikorunu eksprese eden transpozon vektörü, gerek anti-insan influenza M2 antikoru ekspresyon vektörü eklenildiginde sikloheksimid dirençli transformantlar elde edilmedi. Bu sonuçlara dayanarak, bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis bir ilgili proteini kodlayan genin ve sikloheksimid direnç geninin memeli hücresi süspansiyonUnda konakçi hücre kromozomu içine etkili sekilde eklenildigi bulundu. (3) CHO Hücresi Süspansiyonunda ve Adhezif CHO Hücresinde Antikor Uretiminin Incelenmesi Bir CHO hücresi Süspansiyonunda veya bir adhezif CHO hücresinde antikor üretimi verimliligini incelemek amaciyla her hücre hatti tarafindan üretilen antikor miktari incelendi. CHO hücresi süspansiyonu olarak süspansiyon kültürüne adapte edilmis bir CHO-Kl hücresi süspansiyonu kullanildi. Ilaveten, adhezif CHO hücresi olarak süspansiyon kültürüne adaptasyon öncesindeki bir adhezif CHO-Kl hücresi kullanildi. Anti-insan influenza M2 antikor ekspresyonu transpozon vektörü (10 ugi ve Tol2 vektörü (25 ugi elektroporasyonla sirasiyla CHO-Kl hücresi süspansiyonuna ve adhezif CHO-Kl hücresine eklendi. Bunun ardindan, CHO-Kl hücresi süspansiyonu ve adhezif CHO-Kl hücresi her hücre için 96 kuyucuklu üç plakaya asilandi. CHO-Kl hücresi süspansiyonu için süspansiyon hücrelerine iliskin bir bir besiyeri (EX-CELL kullanildi, adhezif CHO-Kl hücresi Için ise edildi. Elektroporasyonun 4. gününde besiyeri degisimi gününden sonra hücrelerin sikloheksimid mevcudiyetinde kültür edilmesi için 3 ug/ml sikloheksimid besiyerine eklendi ve hücreler tekrar 3 hafta kültür edildi. Bu durumda, her hafta besiyeri degisimi gerçeklestirildi. CHO-Kl hücresi süspansiyonu için 1›<106 hücre 6 kuyucuklu bir plakaya asilandi, ardindan 3 gün bir COz inkübatöründe çalkalamali kültür yapildi ve kültür üst fazini kullanarak HPLC ile antikor proteini miktari ölçüldü. Adhezif CHO-Kl hücresi için 6 kuyucuklu bir plakada (2<106 hücre) hücre birlesik hale geldiginde ve 3 gün Statik kültür sonrasinda besiyeri degisimi gerçeklestirildi ve kültür üst fazmi kullanarak HPLC ile antikor proteini miktari ölçüldü. açiklanan usule göre ölçüldü. Sonuçlar Sekil 4'te gösterilmektedir. Sekil 4A"da gösterildigi gibi süspansiyon kültürüne adapte edilmis CHO-Kl hücresi kullanildiginda bariz ölçüde daha yüksek antikor ekspresyonu seviyesi gösteren çok sayida hücre elde edildi. Ote yandan, Sekil 4B"de gösterildigi gibi adhezif CHO-Kl hücresi kullanildiginda sadece HPLC tespit sinirinda (5 ug/ml) veya daha az bir ekspresyon seviyesi Bu sonuçlara dayanarak, transpozon vektörü kullanarak bir ilgili proteinin eksprese edilmesi söz konusu oldugunda, ilgili proteinin bir memeli hücresi süspansiyonu kullanildiginda yüksek bir seviyede eksprese edilebilecegi bulundu. ilaveten, Ornek 1 ila 3'teki sonuçlardan yola çikarak bulusa ait usulün, süspansiyon kültürüne adapte edilmis bir memeli hücresi süspansiyonu kullanarak bir ekzojen geni yüksek ölçüde eksprese edebilecek bir üretici hücrenin verimli sekilde hazirlanmasi yoluyla bir ilgili proteinin üretimi için yeni bir usul olarak kullanilabilecegi bulundu. TOII Transpozon Kullanarak Antikor Ekspresyonu Hücresi Hazirlama ve Antikor Hazirlama (1) Anti-Insan Influenza M2 Antikorunun Ekspresyonu Için Toll Transpozon Vektörü Hazirlama Ornek l'deki ile ayni tarzda, protein ekspresyonu plazmit vektörü olarak memeli hücreleri için bir çift Toll transpozon dizisi arasina eklenmis bir yapay insan antikoru geni ve bir ilaç direnci markör geni içeren bir gen ekspresyonu kasetinden olusan bir plazmit kullanildi. Kullanilan genlere iliskin her DNA bilinen dizi bilgisine dayanarak yapay yoldan kimyasal olarak sentezlendi veya her iki terminal dizisine iliskin primerleri hazirlayarak ve sablon olarak uygun bir DNA kaynagi kullanip PCR gerçeklestirerek elde edildi. Daha sonra gerçeklestirilecek gen manipülasyonu için primerin ucuna bir restriksiyon enzimi parçalama alani eklendi. olmayan Toll transpozonun nükleotit dizisinde, konum 1 ila 200'deki nükleotit dizisi (Toll-L ID. NO:15) transpozon dizileri olarak kullanildi. Her biri bir çift transpozon dizisi içeren sentetik DNA fragmanlarinin hepsi asagidaki usulle hazirlandi. Restriksiyon enzimi Nrulinin bir tanima dizisinin Toll-R dizisinin hem 5' terminaline, hem 3 terminaline baglanmis oldugu bir nükleotit dizisini içeren bir DNA fragmani hazirlandi. Bunun ardindan, restriksiyon enzimi Fsel'nin bir tanima dizisinin TOI1-L dizisinin 5' terminaline baglanmis oldugu ve bir restriksiyon enzimi Ascl"nin bunun 3' terminaline baglanmis oldugu bir nükleotit dizisini içeren bir DNA fragmani hazirlandi . Daha sonra, bu sekilde hazirlanan Toll-R dizisini ve TOI1-L dizisini içeren DNA fragmanlari ekspresyon vektörü N5LG1_M2_Z3 vektörüne eklendi. Toll-R dizisini içeren DNA fragmani N5LGl_M2_23 vektöründe antikor gen ekspresyonu kaseti ve bir seçilebilir markör gen içeren bir gen fragmaninin 5' terminal tarafinda bulunan restriksiyon enzimi Nrul alanina eklendi ve TOll-L dizisini içeren DNA fragmani 3' terminal tarafinda bulunan restriksiyon enzimi Fsel ve ASCl alanlarina eklendi. Ilaveten, bir sikloheksimid direnç geni ekspresyon kasetinin eklenmesiyle bir anti-insan10 influenza M2 antikorunun ekspresyonu için TOI1 transpozon vektörü olusturulmus olup (Sekil ), burada sikloheksimid için bir direnç geni (insan ribozomal protein L3Ga"nin konum 54'ündeki prolinin glutamine mutasyon yaptigi bir gen) CMV hizlandirici/promotör kontrolü altinda Tol2 transpozon dizisi ile birlesmis N5LG1_M2_Z3 vektörü Fsel tanima alani ile birlesir. (2) To" Transpozaz Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Transpozaz ilgili antikorun ekspresyon vektöründen bagimsiz bir ekspresyon vektörü kullanarak eksprese edildi. Yani, DIZI ID. NO:16 ile temsil edilen nükleotit dizisinden olusan medaka baligi türevi Toll transpozazi (DIZI ID. NO:17) kodlayan bir DNA fragmaninin CMV hizlandirici/ promotör kontrolü altinda baglanmis oldugu bir Toll transpozaz gen ekspresyonu kaseti pBIuescriptII SK (+] (Stratagene tarafindan imal edilir) içine eklendi ve Toll transpozaz ekspresyon vektörü pTolIase olarak kullanildi (Sekil 6). (3) Antikor Üreten CHO Hücresinin Hazirlanmasi Yukarida (1) ila (3)'te hazirlanan ekspresyon vektörlerini kullanarak TOI1 transpozonla ekspresyon vektörünün eklenme etkililigi Ornek 3ateki ile ayni sekilde incelendi. Sonuçlar Tablo 3'te gösterilmektedir. To" Transpozon Vektör Tablo 3"te gösterildigi gibi, tipki anti-insan influenza M2 antikorunu eksprese etmek için T0l2 transpozon vektörünün eklenildigi Örnek 3'te oldugu gibi CHO-Kl hücresi süspansiyonuna anti-insan influenza M2 antikorunu eksprese etmek Için Toll transpozon vektörü eklenildiginde, sikloheksimid dirençli transformantlar yüksek bir siklikta elde edilmistir. Bu sonuçlara dayanarak Toll transpozon kullanilmasi durumunda da bir çift transpozon dizisi arasina eklenilen antikor geninin ve sikloheksimid direnç geninin konakçi hücre kromozomu, yani memeli hücresi süspansiyonu içine etkili sekilde transdüksiyon yaptigi bulundu. (4) CHO Hücresi Süspansiyonu Ile Antikor Üretiminin Incelenmesi CHO hücresi süspansiyonunun antikor üretme verimi Örnek 3(3)iteki ile ayni sekilde Toll transpozon kullanarak incelendi. referansinda açiklanan usule göre ölçüldü. Sonuçlar Sekil 7'de gösterilmektedir. Sekil 7°de gösterildigi gibi, T0l1 transpozon kullanilan durumda da bariz ölçüde yüksek antikor ekspresyonu seviyesi gösteren büyük sayida hücre elde edildi. Bu sonuçtan yola çikarak, T0l2 transpozondan elde edilen nükleotit dizisinin kullanildigi duruma benzer sekilde, transpozon dizisi olarak Toll transpozondan elde edilen bir nükleotit dizisi kullanildiginda da ilgili proteini yüksek ölçüde eksprese edebilecek bir memeli hücresi süspansiyonunun elde edilebilecegi bulundu. (1) Anti-Insan CD98 Antikoru Agir Zincir Ekspresyonu Transpozon Vektörünün ve Anti-Insan CD98 Antikoru Hafif Zincir Ekspresyonu Transpozon Vektörünün Hazirlanmasi Sirasiyla DIZI ID. NO:20 ve 23 amino asit dizileri ile temsil edilen degisken bölge H zincirine ve L zincirine sahip bir anti-insan CD98 antikorunun hazirlanmasi için H zinciri ve L zinciri amino asit dizileri her antikor degisken bölgesine insan IgGl antikoru sabit bölgesinin amino asit dizisinin baglanmasiyla hazirlandi. B ir Sinyal dizisinin baglanmis oldugu anti-insan CD98 antikoru agir zincir degisken bölgesi sayili Japon Patent belgesinde açiklanan bir vektöre (NSKGl-Val C2IgGlNS/I117Ll entegre edilmis dizileri kullanarak ve Ornek 1'de kullanilana benzer transpozon dizisi ve promotör kullanarak sirasiyla bir anti-insan CD98 antikoru agir zincir ekspresyonu transpozon vektörü (buradan itibaren CD98H vektörü olarak geçmektedir) ve bir anti-insan CD98 antikoru hafif zincir ekspresyonu transpozon vektörü (buradan itibaren, CD98L vektörü olarak geçmektedir) olusturuldu (Sekil 8 ve 9). Kullanilacak DNA fragmani geleneksel olarak bilinen diziye dayanarak yapay yoldan kimyasal olarak sentezlendi veya her iki terminal dizisine iliskin primerleri hazirlayarak ve sablon olarak uygun bir DNA kaynagi kullanip PCR gerçeklestirerek elde edildi. Daha sonra gerçeklestirilecek gen rekombinasyonu islemleri için her primerin bir terminaiine bir restriksiyon enzimi parçalama alani eklendi. (2) Sikloheksimid Direnç Geni Ekspresyonu Transpozon Vektörünün Hazirlanmasi Bir sikloheksimid direnç geni ekspresyonu transpozon vektörü (buradan itibaren CHX vektörü olarak geçmektediri sikloheksimid direnç geni ekspresyon kasetinin her iki terminaline Örnek 1`de açiklanan CMV hizlandirici/promotör kontrolü altinda bir sikloheksimid direnç genini kodlayan dizinin (DIZI ID. No:7) birlestirilmesi ve bir çift transpozon dizisinin (T0l-2L, T0l2-R) eklenmesiyle olustunildu (Sekil 10). Kullanilacak DNA fragmani geleneksel olarak bilinen diziye dayanarak yapay yoldan kimyasal olarak sentezlendi veya her iki terminal dizisine iliskin primerleri hazirlayarak ve ardindan sablon olarak uygun bir DNA kaynagi kullanip PCR gerçeklestirerek elde edildi. Daha sonra gerçeklestirilecek gen rekombinasyonu islemleri için her primerin bir terminaline bir restriksiyon enzimi parçalama alani eklendi. (3) Anti-Insan CD98 Antikoru Üreten CHO Hücresinin Hazirlanmasi Yukarida (1) ve (2) ,de hazirlanan CD98H vektörü (Sekil 8), CD98L vektörü (Sekil 9) ve CHX vektörü (Sekil 10) ve Ornek ?de hazirlanan T'olZ vektörü (Sekil 3) süspansiyon kültürüne adapte edilmis CHO-Kl hücresine eklendi ve yüksek düzeyde antikor eksprese edebildigi görülen hücrelerin sayisi karsilastirildi. Test plotunda, 4›<106 hücre miktarinda CHO-Kl hücresi 400 pl PBS içinde süspanse edildi ve Ligi elektro porasyonla dairesel bir DNA formunda dogrudan birlikte transfekte edildi. T0|2 transpozazi geçici ekspre etmek ve konakçi kromozomu içine entegrasyonu önleinek amaciyla Tol2 vektörü dogrudan dairesel DNA formunda eklendi. Elektroporasyon 300 V voltaj, 500 uF elektrostatik kapasite ve oda sicakligi kosullari altinda bir elektroporatör (Bio-Rad tarafindan imal edilen Gene Pulser Xcell System) kullanarak ve 4 mm bosluk genisliginde bir küvetle (B IO-Rad tarafindan imal edilmis) gerçeklestirildi. Ayni sekilde kontrol plotunda, CD98H vektörü (10 ilgi, CD98L vektörü (10 ilgi ve CHX vektörünün (10 ilgi her biri bir restriksiyon enzimi Pcil (Takara Bio Inc.) kullanarak dogrusal hale getirildi ve sonra yukarida açiklananla ayni tarzda elektroporasyon gerçeklestirildi. Elektroporasyonla genin eklenmesi sonrasinda her küvetteki hücreler %05 soya fasulyesi hidrolizati ile takviye edilmis bir CD OptiCHO besiyerinde (buradan itibaren 0.5CD besiyeri olarak geçmektedir) süspanse edildi, 96 kuyucuklu bir plakaya asilandi ve bir (:02 inkübatörde 4 gün kültür yapildi. Daha sonra gen eklemesinden 5 gün sonra yapilan besiyeri degisimini takiben 3 ug/ml sikloheksimid takviyeli 0.5CD besiyerini kullanarak (C4859, S igma-Aldrichl sikloheksimid mevcudiyetinde kültür gerçeklestirildi, bunu bir haftalik araliklarla besiyeri degisimi gerçeklestirerek 4 haftalik kültür izledi. 4 hafta kültür sonrasinda antikor ekspresyonu FRET (floresans rezonansiyla enerji aktarimi) kullanilan bir sandviç usulüyle (LENCETM, Perkin-Elmer Corp) belirlendi. Antikoru yüksek ölçüde eksprese eden hücreler bakimindan, antikoru kültür üst fazinda 5.0 ug/ml veya daha fazla bir konsantrasyonda eksprese eden klonlar Tablo 4'te gösterilen sonuçlarla antikor eksprese eden hücreler olarak sayildi. Kontrol Plotu Test Plotu Antikor ekspresyonu olan kuyucuklarin sayisi Tablo 4ite gösterildigi gibi, T0l2 vektörünün CHO-Kl hücresi süspansiyonuna anti-insan CD98 agir zincir ekspresyonu transpozon vektörü, anti-insan CD98 hafif zincir ekspresyonu transpozon vektörü ve sikloheksimid direnç geni vektörü ile birlikte transfekte edildigi test plotunda büyük sayida anti-insan CD98 antikor ekspresyonu hücresi bulundu ancak vektörlerin dogrusal zincirler haline getirilmesine ragmen T012 vektörünün birlikte transfekte edilmedigi kontrol plotunda anti-insan CD98 antikor ekspresyonu hücreleri bulunmadi. (1) Anti-Insan CD98 Antikoru Agir Zincir Gen Fragmanini, Anti-Insan CD98 Antikoru Hafif Zincir Gen Fragmanini ve Sikloheksimid Direnç Genini Içeren Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Anti-insan CD98 antikoru agir zinciri gen fragmanini, anti-insan CD98 antikoru hafif zinciri gen fragmanini ve sikloheksimid direnç genini içeren bir transpozon ekspresyon vektörü (buradan itibaren CD98-CHX ardisik vektör olarak geçer) yukarida açiklananla ayni tarzda bir sentetik DNA ve bir PCR usulü kullanip Ornek 5(1l,de hazirlanan anti-insan CD98 antikoru agir zinciri transpozon ekspresyon vektörünün Ornek 5(1l7de hazirlanan anti-insan CD98 antikoru hafif zincir ekspresyonu gen kaseti ve Ornek 5(2)°de hazirlanan sikloheksimid direnç geni kaseti ile birlestirilmesiyle olusturuldu. (2) Anti-Insan CD98 Antikoru Agir Zincir Gen Fragmanini ve Sikloheksimid Direnç Genini Içeren Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Anti-insan CD98 antikoru agir zincir gen fragmanini ve sikloheksimid direnç genini içeren bir transpozon ekspresyon vektörü (buradan itibaren CD98H-CHX transpozon ekspresyon vektörü olarak geçer) yukarida açiklananla ayni tarzda bir sentetik DNA ve bir PCR usulü kullanip Örnek 5( 1)'de hazirlanan anti-insan CD98 antikoru agir zinciri transpozon ekspresyon vektörünün Örnek 5(2),de hazirlanan sikloheksimid direnç geni kaseti ile birlestirilmesiyle olusturuldu. (3) Anti-Insan CD98 Antikoru Üreten CHO Hücresinin Hazirlanmasi Yukarida Ornek 5(1) ve (2)'de ve yine yukarida Ornek 6(1) ve (2)"de hazirlanan transpozon ekspresyon vektörülerini kullanarak, anti-CD98 antikorunu yüksek ölçüde eksprese edebilen hücrelerin sikligi anti-insan CD98 antikorunun gen aktarimi yapan H zinciri ve L zinciri söz konusu oldugunda ayni ekspresyon vektörünü kullanarak (kontrol plotu), sirasiyla anti-insan CD98 antikorunun gen aktarimi yapan H zinciri ve L zinciri veya sikloheksimid direnç geni söz konusu oldugunda farkli ekspresyon vektörlerini kullanarak (test plotu 1) ve gen aktarimi yapan H zinciri veya L zinciri söz konusu oldugunda farkli ekspresyon vektörlerini kullanarak (test plotu 2) karsilastirildi. Test plotu l*de, 4<106 hücre CHO-Kl hücresi 400 ul PBS içinde süspanse edildi ve CD98H elektroporasyonla dogrudan dairesel DNA olarak birlikte transfekte edildi. CHX vektörü (10 ilgi, CD98L vektörü (10 ug) ve TOI2 vektörü (10 ug) elektroporasyonla dogrudan dairesel DNA olarak birlikte transfekte edildi. Kontrol plotunda, 4<106 hücre CHO-Kl hücresi 400 |Ji PBS içinde süspanse edildi ve CD98- CHX ardisik vektörü (10 Lig] ve TOI2 vektörü (20 ilgi elektroporasyonla dogrudan dairesel DNA olarak birlikte transfekte edildi. Ayni sekilde, TOI2 transpozazi geçici olarak eksprese etmek ve konakçi kromozomu içine entegrasyonu önlemek için testlerin tamaminda T0|2 vektörü dogrudan dairesel DNA formunda eklendi. Asagidaki usulde, antikor Üretici hücrelerin sikligi Ornek 5(3] ile ayni tarzda dogrulandi. Antikor üretici hücrelere iliskin olarak, kültür üst fazindaki antikor konsantrasyonunun 3.0 üg/ml veya daha fazla oldugu klonlar antikor eksprese edici hücreler olarak sayildi. Sonuçlar Tablo S'te gösterilmektedir. Kontrol Plotu Test Plotu 1 Test Plotu 2 Antikor ekspresyonu olan kuyucuklarin sayisi CD98H vektörünün, CD98L vektörünün ve CHX vektörünün eklenildigi test plotu 1'de ve CD98H vektörünün ve CD98L vektörünün eklenildigi test plotu 2'de anti-insan CD98 antikorunu yüksek düzeyde eksprese edebilen hücrelerin sikligi belirgin ölçüde artti. Yukaridaki sonuçlar, antikor agir Zincir geninin ve antikor hafif zincir geninin ayni ekspresyon vektörüne entegre edilmesiyle hazirlanan bir ekspresyon vektörünün CHO hücresi süspansiyonu na eklenildigi bir durumla karsilastirildiginda, transpozon dizileri arasina sirasiyla antikor agir zincir geni ve antikor hafif zincir geni eklenmis farkli ekspresyon vektörleri CHO hücresi süspansiyonuna birlikte transfekte edildiginde yüksek bir antikor üretkenligine sahip hücrelerin kolaylikla elde edilebilecegini ve üretilebilecegini göstermektedir. Ilaveten, test plotu 1 ve test plotu 2'ye ait sonuçlardan eklenecek vektör iki veya daha fazla oldugunda bile, en az bir ilaç direnç geninin (seçilebilir markör gen) yeterli oldugu ortaya çikartildi. Ayrica, ilaç direnç geninin içine antikor agir zincir geni entegre edilmis bir ekspresyon vektöründe veya bagimsiz farkli bir vektörde mevcut olabilecegi ortaya çikartildi. Yukaridaki sonuçlarla bir transpozon vektörününi geleneksel yolla elde edilmesi zor bir durum olan iki veya daha fazla vektörde düzenlenmis genlerin bir memeli hücreleri süspansiyonuna etkili sekilde eklenmesinin araci olarak etkili oldugu gösterilmektedir. Ayrica, birden fazla polipeptit içeren bir proteinde veya birden fazla proteinde yüksek üretkenlik elde etmek amaciyla polipeptitlerin ve proteinlerin farkli transpozon vektörlerini kullanarak eklenmesinin etkili oldugu gösterilmektedir. (4) Anti-Insan CD98 Antikoru Üreten CHO Hücresi Kültürü Içine yukarida açiklanan Ornek 6(3] 'te elde edilen CD98-CHX ardisik vektörünün eklenildigi hücrelerin ve içine CD98H-CHX vektörünün ve CD98L vektörünün eklenildigi hücrelerin her birinden yüksek antikor üretkenligine sahip en üst üç hücre hatti seçildi ve antikor ekspresyonu seviyeleri karsilastirildi. Testlerin ayrintilari asagida gösterilmektedir. Sikloheksimid direncine dayanarak seçilmis ve ayrica anti-CD98 antikorunu eksprese eden Ornek 6(3l'te elde edilen CHO-Kl hücresine bu sirayla 96 kuyucuklu bir plaka, 24 kuyucuklu bir plaka ve 6 kuyucuklu bir plaka (Corning Glassworks) kullanarak çogaltma kültürü yapildi. Çogaltma kültürü sonrasinda her kültür üst fazindaki antikor konsantrasyonu ölçüldü ve yüksek seviyede anti-CD98 antikor ekspresyonuna sahip en üst üç hücre hatti CHO hücresi seçildi. Daha sonra, bu sekilde seçilen üç hücre hattinin her biri 3 ml % 0.5 CD besiyerinde (Invitrogenl, yani 0.5 CD besiyerinde 2<105 hücre/ml bir yogunluga süspanse edildi Ve 6 kuyucuklu bir plaka kullanarak 37°C'de %5 COZ bir atmosferde 5 gün boyunca bir karistiricida kültür edildi. 5 gün kültür sonrasinda besiyerindeki antikor miktari HPLC (Waters Associates, Inc.) ile belirlendi. Sonuçlar Tablo 6'da gösterilmektedir. Kontrol Plotundan Elde Edilen Test Plotu Z'den Elde Edilen Hücreler Hücreler Tablo 6°da gösterildigi gibi, içine CD98H vektörünün ve CD98L vektörünün birlikte transfekte edildigi CHO-Kl hücresi, içine CD98-CHX ardisik vektörü eklenmis CHO-Kl hücresi ile karsilastirildiginda yüksek bir antikor üretme seviyesine sahiptir. Yukaridaki sonuçlar CHO hücresi süspansiyonuna içlerine bir çift transpozon dizisi arasina sirasiyla antikor agir zincir geni ve antikor hafif zincir geni eklenmis farkli ekspresyon vektörleri birlikte transfekte edildiginde sadece yüksek düzeyde antikor üretici bir hücre hattinin kolaylikla elde edilebilecegi ve üretilebilecegi gösterilmekle kalmayip, bu sekilde elde edilen hücrenin yüksek bir antikor üretkenligine sahip oldugu da gösterilmektedir. (1) TNFa Antikoru Agir Zincir Gen Fragmanini, TNFa Antikoru Hafif Zincir Gen Fragmanini ve Sikloheksimid Direnç Genini Içeren Bir Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi DIZI ID. NO:26 ve DIZI ID. NO:29 amino asit dizisine sahip anti-insan TNFoi antikorunu hazirlamak için bir anti-insan TNFOt antikoru agir zincir gen fragmani, bir anti-insan TNFoi antikoru hafif zincir gen fragmani ve bir sikloheksimid direnç geni transpozon ekspresyon vektörü (buradan itibaren TNFa-CHX ardisik vektör olarak geçer), anti-insan CD98 agir zincir gen fragmanini ve hafif zincir gen fragmanini ve sikloheksimid direnç genini içeren VH ve VL gen fragmanlarini anti-insan TNFoi antikoru türevine ait sirasiyla VH ve VL ile degistirerek yapildi. Anti-insan TNFoi antikoru agir zincir geni ve hafif zincir geni dizileri, inceleme raporuna (Pharmaceutical and Medical Devices Agency, 14 Subat subkutane enjeksiyonuna ait sirasiyla Sekil 1 ve Sekil 2°de açiklanan Adalimumabin (rekombinant) agir zincir degisken bölge alt birimi veya hafif zincir degisken bölge alt birimi amino asit dizilerine (DIZI ID. NO:25 ve 28) bir sinyal dizisinin baglandigi amino asit dizilerinin (DIZI ID. NO:26 ve 29) hazirlanmasiyla ve amino asit dizilerinin (DIZI ID. NO:24 ve 27) degismeyecegi sekilde nükleotit dizilerini belirleyerek bir sentetik DNA kullanarak hazirlandi. Daha sonraki gen manipülasyonlari için yapay dizilerin terminaline bir restriksiyon enzimi parçalama alani eklendi. (2) Anti-Insan TNFu Antikoru Agir Zincir Fragmanini ve Sikloheksimid Direnç Genini Içeren Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Anti-insan TNFa antikoru agir zincir fragmanini ve sikloheksimid direnç genini içeren bir transpozon ekspresyon vektörü (buradan itibaren TNFoiH-CHX vektörü olarak geçer) anti- insan CD98 antikoru agir zincir fragmanini ve sikloheksimid direnç genini Içeren Ornek fragmani bölgesinin bir anti-insan TNFoi antikoru VH gen fragmanina modifiye edilmesiyle olusturuldu. Anti-insan TNFoi antikoru agir zincir geni olarak, bu madde (1)'de gösterilen diziyle ayni dizi kullanildi. (3) Anti-Insan TNFu Antikoru Hafif Zincir Geni Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Bir anti-insan TNFoi antikoru hafif zincir geni transpozon ekspresyon vektörü (buradan itibaren CD98L olarak geçer) Ornek 6(1)'de hazirlanan anti-insan CD98 antikoru hafif zincir geni transpozon ekspresyon vektörünün hafif zincir gen bölgesini anti-insan TNFa antikoru hafif zincirine modifiye ederek olusturuldu. Anti-insan TNFoi antikoru VL geni olarak, bu madde (1)"de gösterilen diziyle ayni dizi kullanildi. (4) Anti-Insan TNFa Antikoru Üreten CHO Hücresinin Hazirlanmasi10 Anti-insan TNFoi antikorunu üreten CHO-Kl hücresini hazirlamak amaciyla yukarida bahsedilen (1)"de hazirlanmis TNFoi-CHX ardisik vektörü (20 lig) ve Ornek ?de hazirlanmis Tol2 transpozaz ekspresyon vektörü (T0I2 vektörü) (10 ugl Ornek 3°te hazirlanmis süspansiyon kültürüne adapte edilmis CHO-Kl hücresine eklendi (kontrol plotu). Ayni sekilde, yukarida bahsedilen (2) ve (, TNFoi L vektörü (10 Lig) ve TOIZ vektörü (10 lig) dairesel DNA formunda dogrudan birlikte transfekte edildi (test plotul. Antikoru yüksek düzeyde eksprese edebilen hücrelerin sikligi, gen eklenmis hücrelere uygulanan kültürün 96 kuyucuklu bes plakada gerçeklestirilmesi hariç Örnek 6 ile ayni tarzda gen eklemesi, hücre kültürü ve benzerini gerçeklestirerek karsilastirildi. Yüksek bir antikor üretkenligine sahip hücreye iliskin olarak, kültür üst fazinda antikor konsantrasyonunun 3.0 tig/ml veya daha fazla oldugu klonlar antikor eksprese eden hücreler olarak sayildi. Sonuçlar Tablo 7'de gösterilmektedir. Kontrol Plotu Test Plotu Antikor Ekspresyonu Olan Kuyucuklarin Sayisi Tablo 7"de gösterildigi gibi, tipki Ornek 6"da hazirlanan anti-Insan CD98 antikoru üretici hücre durumunda oldugu gibi, içine TNFaH-CHX vektörünün ve TNFoiL vektörünün birlikte transfekte edildigi CHO-Kl hücresi, içine TNFoi-CHX ardisik vektörü eklenmis CHO-Kl hücresi ile karsilastirildiginda anti-insan TNFOt antikorunun oldukça yüksek eksprese edildigi hücreleri yaklasik 4 kat daha fazla siklikla gösterdi. Bu sonuç, herhangi bir antikora iliskin olarak, sirasiyla farkli ekspresyon vektörlerine eklenmis bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis antikor agir zincir geninin ve antikor hafif zincir geninin CHO hücresi süspansiyonuna birlikte transfekte edilmesiyle yüksek bir antikor üretkenligine sahip bir hücre hattinin kolaylikla elde edilebilecegini ve üretilebilecegini göstermektedir. (S) Anti-Insan TNFa Antikoru Ureten CHO Hücresinin Kültür Edilmesi Siklo heksimid direncine dayanarak TNFa-CHX ardisik vektörü eklenmis yukarida bahsedilen (4)'te elde edilen hücrelerden seçilen hücreler ve içine TNFoiH-CHX vektörünün ve TNFoiL vektörünün birlikte transfekte edildigi ve ayrica anti-insan TNFoi antikorunu eksprese eden hücreler seçildi ve bu sirayla 96 kuyucuklu plaka, 24 kuyucuklu plaka ve 6 kuyucuklu plaka kullanarak çogaltma kültürü yapildi. Çogaltma kültüründe basarili olmus TNFd-CHX ardisik vektörü eklenmis hücrelere ait 4 hücre hatti ve içine TNFdH-CHX vektörünün ve TNFaL vektörünün birlikte transfekte edildigi 52 hücre hattina iliskin olarak, bu hücreler kültür süresinin 7 gün olmasi hariç Örnek 6(4)`teki ile ayni tarzda kültür edildi ve antikorlarin ekspresyon seviyeleri ölçüldü. Sonuçlar Sekil 11'de gösterilmektedir. Sonuç olarak, içine TNFoiH-CHX vektörünün ve TNFoiL vektörünün birlikte transfekte edildigi CHO-Kl hücresi, içine TNch-CHX ardisik vektörünün eklenildigi CHO-Kl hücresine göre yaklasik 2.4 kat daha fazla antikor üretkenligi gösterdi. Bu sonuç, içinde sirasiyla antikor agir zincir geninin ve antikor hafifzincir geninin her birinin bir çift transpozon dizisi arasina eklenmis oldugu farkli ekspresyon vektörleri CHO hücresi Süspansiyonuna birlikte transfekte edildiginde tipki Ornek 6(4) "te oldugu gibi sadece yüksek bir antikor üretkenligine sahip bir hücrenin elde edilebilmesinin ve üretilebilmesinin mümkün olmasiyla kalinmadigini, bu sekilde elde edilen hücrenin yüksek bir antikor üretkenligine sahip oldugunu da göstermektedir. (1) Anti-Insan CD20 Antikoru Agir Zincir Gen Fragmanini, Anti-Insan CD20 Antikoru Hafif Zincir Gen Fragmanini ve Sikloheksimid Direnç Genini Içeren Transpozon E k Sp reSyon Vektörünün Hazirlanmasi Sirasiyla DIZI ID. NO:32 ve 35,e ait amino asit dizileriyle temsil edilen VH ve VL"yi içeren bir anti-insan CD20 antikorunun hazirlanmasi amaciyla Ornek 6(1),de hazirlanan CD98-CHX ardisik vektörünün antikor VH ve VL gen bölgelerini anti-insan CD20 antikorundan elde edilen sirasiyla VH ve VL ile degistirerek bir anti-insan CD20 antikoru agir zincir gen fragmanini, bir anti-insan CD20 antikoru hafif zincir gen fragmanini ve bir Sikloheksimid direnç genini içeren bir transpozon ekspresyon vektörü (buradan itibaren CD98-CHX ardisik vektörü olarak geçer) olusturuldu. Anti-insan CD20 antikoruna ait VH bölgesi ve VL bölgesinin gen dizileri, GenBank Erisim No. AR000013°te açiklanan nükleotit dizisinin ve 10 mg/ml enjeksiyonu inceleme raporu ilisikteki Rituxan(R) sayfasinda açiklanan sekilde rituksimabin VH ve VL amino asit dizilerine (sirasiyla DIZI ID. NO:32 ve 35) bir sinyal dizisinin baglandigi amino asit dizilerinin (sirasiyla DIZI lD. NO:31 ve 34) hazirlanmasiyla ve nükleotit dizilerinin amino asit dizisinin degismeyecegi sekilde (DIZI ID. NO:30 ve 33) belirlenmesiyle bir sentetik DNA kullanarak hazirlandi. Daha sonraki gen manipülasyonlari için yapay dizilerin terminaline bir restriksiyon enzimi parçalama alani eklendi. (2) Anti-Insan CD20 Antikoru Agir Zincir Gen Fragmanini ve Sikloheksimid Direnç Genini Içeren Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Anti-insan CD20 antikoru agir zincir gen fragmanini ve Sikloheksimid direnç genini içeren bir transpozon ekspresyon vektörü (buradan itibaren CDZOH-CHX vektörü olarak geçer) Ornek 6(2)"de hazirlanan CD98H-CHX vektörünün antikor VH gen bölgesini anti-insan CD20 antikorundan elde edilen bir VHSye modifiye ederek olusturuldu. Anti-insan CD20 antikoru agir zincir geni olarak, yukarida (l),de gösterilen bir dizi ile ayni dizi kullanildi.. (3) Anti-Insan CDZO Antikoru Hafif Zincir Geni Ekspresyonu Transpozon Vektörünün Hazirlanmasi Bir anti-insan CD20 antikoru hafif zincir geni ekspresyonu transpozon vektörü (buradan itibaren CD20L vektörü olarak geçer) Ornek 6(1]°de hazirlanmis anti-insan CD98 antikorunun VL gen bölgelerini anti-insan CD20 antikorundan elde edilen VL'ye modifiye ederek olusturuldu. Anti-Insan CD20 antikoru agir ve hafif genleri olarak yukarida (l),de gösterilen bir dizi ile ayni diziler kullanildi.. (4) Anti-Insan CD20 Antikorunu Üreten CHO Hücresinin Hazirlanmasi Anti-insan CD20 antikoru üreten CHO-Kl hücresinin hazirlanmasi amaciyla yukarida bahsedilen (1 lide hazirlanmis CD ZO-CHX ardisik vektörü ve Örnek 2`de hazirlanmis Tol2 transpozaz ekspresyon vektörü (TOI2 vektörü] Ornek 3(1}°de hazirlanmis süspansiyon kültürüne adapte edilmis CHO-Kl hücresine eklendi (kontrol plotul. Ayni sekilde, yukarida bahsedilen (2) ve (3),te hazirlanmis CDZOH-CHX vektörü (10 Ligi ve CD20L vektörü (10 ugl TOI2 vektörü (10 ugl ile birlikte (test plotul CHO-Kl hücresine birlikte transfekte edildi. Antikoru yüksek düzeyde eksprese edebilen hücrelerin sikligi, gen ekleninis hücrelere uygulanan kültürün 96 kuyucuklu bes plakada gerçeklestirilmesi hariç Örnek 6 ile ayni tarzda gen ekle mesi, hücre kültürü ve benzerini gerçeklestirerek karsilastirildi. Ayrica 3.0 ug/ml veya daha fazla antikor konsantrasyonlari antikor eksprese eden kuyucuklar olarak sayildi. Sonuçlar Tablo 87de gösterilmektedir. Kontrol Plotu Test Plotu Antikor Ekspresyonu Olan Kuyucuklarin Sayisi Sonuç olarak, içine CDZOH-CHX vektörünün ve CD20L vektörünün birlikte transfekte edilmis oldugu CHO-Kl hücresi, Içine CDZO-CHX ardisik vektörünün eklenmis oldugu CHO-Kl hücresi ile karsilastirildiginda anti-insan CD20 antikorunu yüksek ölçüde eksprese eden hücreleri yaklasik 3 kat daha fazla siklikla gösterdi. Bu sonuç Ornek 6(3l'te veya Ornek 7(3l,te gerçeklestirilen anti-Insan CD98 antikoru ve anti- insan TNFoi antikoru sonucuyla aynidir ve sirasiyla antikor agir zincir geninin ve antikor hafif Zincir genin In transpozon dizileri arasina entegre edilmis oldugu farkli ekspresyon vektörleri CHO hücresi süspansiyonUna birlikte transfekte edildiginde, her antikor durumunda antikoru yüksek seviyede üreten bir hücre hattinin kolaylikla elde edilebilecegini ve üretilebilecegini göstermektedir. (S) Anti-Insan CD20 Antikorunu Ureten CHO Hücresinin Kültür Edilmesi Sikloheksimid direncine dayanarak yukarida bahsedilen (3)"te elde edilen CD20-CHX ardisik vektörü eklenmis hücrelerden ve içine CDZOH-CHX vektörünün ve CDZOL vektörünün birlikte transfekte edildigi ve ayrica anti-insan CDZO antikorunu eksprese eden hücrelerden seçilen hücreler seçildi ve bu sirayla 96 kuyucuklu plaka, 24 kuyucuklu plaka ve 6 kuyucuklu plaka kullanarak çogaltma kültürü yapildi. Çogaltma kültüründe basarili olinus kontrol p lotu hücrelerine ait 4 hücre hattina ve test plotu hücrelerine ait 50 hücre hattina iliskin olarak, bu10 hücreler kültür süresinin 7 gün olmasi hariç Örnek 6(4),teki ile ayni tarzda kültür edildi Ve antikorlarin ekspresyon seviyeleri ölçüldü. Sonuçlar Sekil 12'de gösterilmektedir. Sekil 12"de gösterildigi gibi, içine CDZOH-CHX vektörünün ve CD20L vektörünün birlikte transfekte edildigi CHO-Kl hücresinin, içine CDZO-CHX ardisik vektörünün eklenildigi CHO-Kl hücresine göre yaklasik 1.6 kat daha yüksek antikor üretkenligi gösterdigi ortaya çikartildi. Bu sonuç, Örnek 6(4),te veya Örnek 7(5),te gerçeklestirilen anti-insan CD98 antikoru ve anti- insan TNFOL antikoru sonucuyla aynidir ve içinde sirasiyla antikor agir zincir geninin ve antikor hafif zincir geninin transpozon dizileri arasina eklenmis oldugu farkli ekspresyon vektörleri CHO hücresi süspansiyonuna birlikte transfekte edildiginde, sadece yüksek bir antikor üretkenligine sahip bir hücrenin kolaylikla elde edilebilmesinin ve üretilebilmesinin mümkün olmasiyla kalinmadigini, bu sekilde elde edilen hücrenin yüksek bir antikor üretkenligine sahip oldugunu da göstermektedir. T ranspozon Vektörünün Hazirlanmasi (1) Yaban Tip Neomisin Direnç Genini ve Anti-Insan CD98 Antikorunu Eksprese Eden Bir Transpozon Vektörünün Hazirlanmasi Bir çift T0l2 türevi nükleotit dizisi arasina eklenmis rastgele bir insan antikoru geni ve bir ilaç direnci markör geni bulunduran memeli hücresinde kullanima iliskin bir gen ekspresyonu kasetini içeren bir plazmit protein ekspresyonu için plazmit vektör olarak kullanildi. Kullanilacak genin DNA,Sl geleneksel olarak bilinen bir nükleotit dizisine dayanarak yapay yoldan kimyasal sentez gerçeklestirerek veya her iki terminal dizisine iliskin primerleri hazirlayarak ve sablon olarak uygun bir DNA kaynagi kullanip PCR gerçeklestirerek elde edildi. Daha sonra gerçeklestirilecek gen manipülasyonlari için her primer terminaline bir restriksiyon enzimi parçalama alani eklendi. nükleotit dizisinde (DIZI ID. No:1) konuin 1 ila 200'deki bir nükleotit dizisi (T0l2-L dizisi] (DIZI iD. No:2) ve konum (DIZI iD. NOZ3l transpozon dizileri olarak kullanildi. Gerek T0l2-R dizisini, gerek T0l2-L dizisini içeren bir DNA fragmani sentezlendi. CMV promotörün kontrolü altinda antikorun H zincirini kodlayan bir nükleotit dizisini (DIZI10 (4324637 sayili Japon Patent belgesi) dayanarak amplifikasyon yapilmis bir DNA fragmani antikor agir zinciri gen kaseti olarak ve SV40 promotörün kontrolü altinda antikorun hafif zincirini kodlayan bir nükleotit dizisini (DIZI ID. NO:21) içeren ve anti-insan CD98 antikoru NSKGl-Val C2IgG1NS/I117L vektörüne dayanarak ampliiikasyon yapilmis bir DNA fragmani antikor hafif zinciri gen kaseti olarak hazirlandi. Neomisin direnç geni kaseti olarak, SV40 promotör kontrolü altinda bir neomisin direnç genini kodlayan bir nükleotit dizisini bulunduran bir DNA,yi (DIZI ID. NO:36 ve GenBank Erisim No. U47120.2 ile temsil edilen nükleotit dizisinden Olusan neomisin fosfotransferazi kodlayan DNA) içeren bir DNA fragmani hazirlandi. Anti-CD98 antikoru ekspresyon vektorü A, yukarida bahsedilen antikor agir zinciri gen ekspresyonu kasetini, antikor hafif zinciri gen ekspresyonu kasetini ve neomisin direnç geni ekspresyon kasetini birlestirerek ve ayrica her iki terminalini bir dizi içeren bir DNA fragmaniyla ve bir Tol2-L dizisi içeren bir DNA fragmaniyla birlestirerek hazirlandi (Sekil (2) Modifiye Tipte Bir Neomisin Direnç Geni 1 Içeren Anti-Insan CD98 Antikoru Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi (1)'de elde edilen ve yaban tipte bir neomisin direnç geni içeren bir anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü Asnin neomisin direnç geninin, DIZI ID. NO:37 ile temsil edilen nükleotit dizisini içeren modifiye tipte bir neomisin direnç geni 1 ile degistirilmesiyle bir anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü B hazirlandi. Modifiye tipte neomisin direnç geni 1 yaban tip neomisin direnç genininki ile özdes bir amino asit dizisini kodlar ve toplamin %22"sine karsilik gelen 167 bazin modifiye edilmis oldugu bir nükleotit dizisine sahip olacak sekilde modifiye edilmistir. Ozellikle belirtmek gerekirse, toplam 32 IÖsin kalintisi arasinda 25 lösin kalintisina karsilik gelen kodonlar TTA olacak sekilde modifiye edilmistir. (3) Modifiye Tipte Bir Neomisin Direnç Geni 2 Içeren Anti-Insan CD98 Antikoru T ranspozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi (1)'de elde edilen ve yaban tipte bir neomisin direnç geni içeren bir anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü Asnin neomisin direnç geninin, DIZI lD. NO:38 ile temsil edilen nükleotit dizisini içeren modiiiye tipte bir neomisin direnç geni 2 ile degistirilmesiyle bir anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü C hazirlandi. Modifiye tipte neomisin direnç geni 2 yaban tip neomisin direnç genininki ile özdes amino asit dizisini kodlar ve toplamin %23"üne karsilik gelen 180 bazin modifiye edilmis oldugu bir nükleotit dizisine sahip olacak sekilde modifiye edilmistir. Özellikle belirtmek gerekirse, toplam 32 lösin kalintisi arasinda 28 lösin kalintisina karsilik gelen kodonlar TTA olacak sekilde modifiye edilmistir. (4) Modifiye Tipte Bir Neomisin Direnç Geni 3'e Sahip Anti-Insan CD98 Antikoru Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi (ll'de elde edilen ve yaban tipte bir neomisin direnç geni içeren bir anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü A°nin neomisin direnç geninin, DIZI ID. NO:39 ile temsil edilen nükleotit dizisini içeren modifiye tipte bir neomisin direnç geni 3 ile degistirilmesiyle bir anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü D hazirlandi. Modifiye tipte neomisin direnç geni 3 yaban tip neomisin direnç genininki ile özdes amino asit dizisini kodlar ve toplamin %26,sina karsilik gelen 203 bazin modifiye edilmis oldugu bir nükleotit dizisine sahip olacak sekilde modifiye edilmistir. Özellikle belirtmek gerekirse, toplam 32 lösin kalintisi arasinda 30 lösin kalintisina karsilik gelen kodonlar TTA olacak sekilde modifiye edilmistir. Hücreleri Ile Antikor Üretimi Antikor üretici hücre A - D, Ornek 9(1) ila (4)"te hazirlanan anti-insan CD98 transpozon ekspresyon vektörleri A ila D'den her birinin DiZi iD. NO:40 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren bir T012 transpozazi eksprese eden pCAGGS-TZTP vektörü ile birlikte CHO- K1 hücresi süspansiyonuna eklenmesiyle hazirlandi [Kwakami K. & Noda T., Genetics, 166, Vektörlerin CHO hücresi süspansiyonuna eklenmesi CHO hücresini (4›<106 hücre) 400 pl PBS tamponda süspanse ederek ve anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörünü (10 ilgi ve T0l2 transpozaz ekspresyon vektörü pCAGGS-TZTP'yI (20 ugl dogrudan dairesel DNA formunda elektroporasyonla birlikte transfekte ederek gerçeklestirildi. Bu durumda, T012 transpozazi geçici olarak eksprese etmek için TOI2 transpozaz ekspresyon vektörü de dogrudan dairesel DNA seklinde eklendi. ilaveten, T0|2 transpozazin kullanilmadigi bir kontrol olarak, Ornek l9(4l'teki anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü D (10 iJg) bir restriksiyon enzimi Pcil (TARABIO INC.) kullanarak dogrusal hale getirildi ve sonra elektroporasyonla CHO-Kl hücresi süspansiyonuna eklendi. Elektroporasyon 300 V voltaj, 500 üF elektrostatik kapasite ve oda sicakligi kosullari altinda bir elektroporatör [Gene Pulser Xcell System (B io-Rad tarafindan imal edilmis)] kullanarak ve 4 mm bosluk genisliginde bir küvet (Bio-Rad tarafindan imal edilmis) kullanarak gerçeklestirildi. Elektroporasyonla gen eklemesi sonrasinda her küvetteki hücreler 96 kuyucuklu bir plakaya asilandi ve %5 soya fasulyesi hidrolizati ile takviye edilmis bir CD OptiCHO besiyeri (Invitrogenl kullanarak 3 gün bir CO; inkübatöründe kültür edildi. Bunun ardindan, gen eklemesinden 4 gün sonra yapilan besiyeri degisimini takiben 500 lig/ml bir nihai konsantrasyon elde etmek için (3418 ekleyerek G mevcudiyetinde kültür gerçeklestirildi ve bir haftalik araliklarla besiyeri degisimi gerçelestirerek 3 hafta kültür yapildi. Kültür sonrasinda antikor ekspresyonu FRET (floresans rezonansiyla enerji aktarimi) uygulanmis bir sandviç usulüyle LANCE(R) analizini (Perkin-E Imer Corp) kullanarak belirlendi. Antikor Uretici Hücreler (yâmn B(M0difiye C(M0difiye D(M0difiye Kontrol Tip) Tip 1) TIP 2] Tip 3) Hücresi Maksimum ekspresyon gösteren hücrelerin antikor 0.5 2.0 1.6 5.1 - ekspresyonu seviyesi (mg/Li En iyi 10 hücrenin ortalama antikor ekspresyonu seviyesi 0.5 0.7 0.7 1.7 - Tablo 9"da gösterildigi gibi, modifiye tipte neomisin direnç genlerini eksprese eden B ila D hücrelerine ait anti-insan CD98 antikoru ekspresyon seviyeleri yaban tip neomisin direnç genini eksprese eden hücre A"ya göre daha yüksek olmustur. Ozellikle, modifiye tipte neomisin direnç geni 3'ü eksprese eden anti-insan CD98 antikorunu üretici hücre D durumunda, yaban tip neomisin direnç genini eksprese eden anti-insan CD98 antikorunu üretici hücre A'ya göre 10 kat daha yüksek ekspresyon seviyesi gösteren hücre hatti elde edilmistir. Ilaveten, modifiye tipte neomisin direnç geni 3 kullanildiginda bile, vektörün dogrusal formda yapilmasina ragmen içine T012 transpozaz ekspresyon vektörünün birlikte transfekte edilmedigi kontrol hücresiyle anti-insan CD98 antikorunu eksprese eden bir hücrenin elde edilmesi mümkün olmadi. Transpozon Vektörünün Hazirlanmasi (1) Modifiye Tipte Puromisin Direnç Geni 1'i Içeren Anti-Insan CD98 Antikoru Transpozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Ornek 9(l}*de elde edilen ve yaban tipte neomisin direnç geni içeren anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü A*nin neomisin direnç geninin, DIZI iD. NO:41 ile temsil edilen nükleotit dizisinden olusan modifiye tipte bir puromisin direnç geni I ile degistirilmesiyle bir anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü E hazirlandi. Modifiye tipte purOmisin direnç geni 1, DIZI ID. NO:42 ile temsil edilen nükleotit dizisinden olusan yaban tip puromisin direnç genininki (bir puromisin-N-asetil transferaz geni, GenBank Erisim No. UO7548.1,de açiklanan nükleotit dizisinden olusur) ile özdes bir amino asit dizisini kodlar ve bazlarin tamaminin % 3°üne karsilik gelen 17 bazin modifiye edilmis oldugu bir nükleotit dizisine sahip olacak sekilde modifiye edilmistir. Ozellikle belirtmek gerekirse, puromisin direnç geninde bulunan toplam 28 alanin kalintisi arasinda, 17 alanin kalintisina karsilik gelen kodon modifikasyonla GCG olarak degistirilmis ve yaban tipte zaten GCG olan kodonlarla birlikte alanin kalintilarinin tamamina karsilik gelen kodonlar GCG olarak degistirilmistir. (2) Modifiye Tipte Puromisin Direnç Geni 2,yi Içeren Anti-Insan CD98 Antikoru T ranspozon Ekspresyon Vektörünün Hazirlanmasi Ornek 9(1}'de elde edilen ve yaban tipte neomisin direnç geni içeren anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü Ainin neomisin direnç geninin, DIZI iD. NO:43 ile temsil edilen nükleotit dizisini içeren modifiye tipte bir puromisin direnç geni 2 ile degistirilmesiyle bir anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü F hazirlandi. Modifiye tipte puromisin direnç geni 2 yaban tip puromisin direnç genininki ile özdes bir amino asit dizisini kodlar ve bazlarin tamaminin %l4süne karsilik gelen 79 bazin modifiye edilmis oldugu bir nükleotit dizisine sahiptir. Ozellikle, modifiye tipte puromisin direnç geni liin alanin kalintilarina karsilik gelen kodoniarin modifikasyonuna ilaveten, lösin kalintilarina karsilik gelen kodoniar TTA olacak sekilde degistirilmis, valin kalintilarina karsilik gelen kodonlar GTA olacak sekilde degistirilmis ve serin kodonu TCG olacak sekilde degistirilmistir. CHO Hücresi Ile Antikor Üretimi Antikor üretici E ve F hücreleri modifiye tipte puromisin direnç geni 1 içeren Ornek 11(1)'deki anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü Elnin, modifiye tipte puromisin direnç geni 2 içeren Ornek 11(2)"deki anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörü F'nin ve Tol2 transpozaz ekspresyon vektörü pCAGGS-TZTP'nin CHO- K1 hücresi süspansiyonuna eklenmesiyle hazirlandi. Vektörlerin hücre süspansiyonuna eklenmesi CHO hücresi süspansiyonunun(4<106 hücre) 400 pl PBS tamponu içinde süspanse edilmesi ve dairesel DNA formunda modifiye tipte puromisin direnç geni içeren anti-insan CD98 antikoru transpozon ekspresyon vektörünün (10 ilgi ve pCAGGS-TZTP'nin (20 ug) dogrudan elektroporasyonla birlikte transfekte edilmesiyle gerçeklestirildi. Bu durUmda, T012 transpozazi geçici olarak eksprese etmek için T012 transpozaz ekspresyon vektörü pCAGGS-TZTP de dogrudan dairesel DNA seklinde eklendi. Elektroporasyon 300 V voltaj, 500 pF elektrostatik kapasite ve oda sicakligi kosullari altinda bir elektroporatör [Gene Pulser Xcell System (B io-Rad tarafindan imal edilmis)] kullanarak ve 4 mm bosluk genisliginde bir küvet (Bio-Rad tarafindan imal edilmis) kullanarak gerçeklestirildi. Elektroporasyonla gen eklemesi sonrasinda her küvetteki hücreler 96 kuyucuklu bir plakaya asilandi ve %5 soya fasulyesi hidrolizati ile takviye edilmis bir CD OptiCHO besiyeri (Invitrogeni kullanarak 3 gün bir COz inkübatöründe kültür edildi. Bunun ardindan, gen eklemesinden 2 gün sonra yapilan besiyeri degisimini takiben 5 tig/ml bir nihai konsantrasyon elde etmek için puromisin (P9620, Sigma-Aldrich) ekleyerek ve bir haftalik araliklarla puromisin içeren besiyeriyle besiyeri degisimi gerçeklestirerek 4 hafta kültür yapildi. Kültür sonrasinda antikor ekspresyon seviyesi FRET (floresans rezonansiyla enerji aktarimi] uygulanan bir sandviç usulüyle LANCE(R} analizini (Perkin-Elmer Corpl kullanarak belirlendi . Sonuçlar Tablo 10'da gösterilmektedir. Antikor Üretici Hücreler E (Modifikasyon 1) F (Modifikasyon 2] Maksimum ekspresyon gösteren hücrelerin antikor ekspresyonu seviyesi (mg/Li En iyi 10 hücrenin ortalama antikor 0 7 16 ekspresyonu seviyesi (mg/L) ' - Tablo 10°da gösterildigi gibi, modifiye tipte puromisin direnç geni 2 eksprese eden antikor üretici hücre F, modifiye tipte puromisin direnç geni 1 eksprese eden antikor üretici hücre E'ye göre iki kat veya daha fazla antikor üretkenligi sergilemistir. CHO Hücresi ile Antikor Uretimi Modifiye tipte puromisin direnç geni 2"yi eksprese eden Örnek 12ide elde edilmis antikor üretici hücre F anti-insan CD98 antikorunu üretmek üzere bir erlen kullanarak kültür edildi. Ozellikle belirtmek gerekirse, antikor üretici hücre Pye bu sirayla 96 kuyucuklu plaka, 24 kuyucuklu plaka ve 6 kuyucuklu plaka kullanarak çogaltma kültürü yapildi. Antikor üretici hücre F,ye ait hücre sayisinin yeterli düzeyde arttigi (hücre hatti 1 ve hücre hatti 2) iki hücre hatti seçildi ve sirasiyla %5 soya fasulyesi hidrolizati ile takviye edilmis 35 m1 CD OptiCHO besiyeri (Invitrogen) içinde süspanse edilerek 2X105 hücre/ml bir hücre yogunlugu elde edildi ve 37°C'de ve % 5 COz bir atmosferde 125 ml kapasiteli bir erlen (egik kapakli, Coming Glassworks] kullanarak bir karistiricida 1 haüa kültür yapildi, bu sekilde anti-insan CD98 antikoru üretildi. Kültür sonrasinda besiyerinde bulunan antikor miktari HPLC (Waters Associates, Inc.) ile belirlendi. Sonuçlar Tablo 11'de gösterilmektedir. Hücre Hatti 1 Hücre Hatti 2 Hücre Hatti 1 Hücre Hatti 2 Antikor Ekspresyonu Seviyesi (mg/I] 15.6 14.8 Yukaridaki sonuçlarda CHO hücresi süspansiyonundai bir çift transpozon dizisi arasinda eklenmis antikor geninin ve modifiye tipte ilaç direnci geninin konakçi kromozomu içine etkili sekilde eklenildigi ve ayrica yüksek ekspresyon sergileyen bir hücrenin seçilmesinde etkili olduklari gösterilmektedir. ilaveten, bu sekilde elde edilen hücreye çogaltma kültürü yapilabilecegi ve bir süspansiyon kültürü kosulu altinda ilgili proteini üretinenin mümkün oldugu bulundu. Mevcut bulusa ait proteini üretme usulü ile bir memeli hücresi süspansiyonu kullanarak bir ilgili protein verimli sekilde üretilebilir. Mevcut bulusa ait hücre bir rekombinant protein üretimi için protein üretici bir hücre olarak kullanilabilir. DIZI LISTESI DIZI ID. No:1 - Yapay Dizi Açiklamasi; Otonom olmayan TOI2 Transpozon Nükleotit Dizisi DIZI ID. No:2 - Yapay Dizi Açiklamasi; Tol2-L DIZISI DIZI ID. No:3 - Yapay Dizi Açiklamasi; DIZI DIZI ID. No:7 - Yapay Dizi Açiklainasi; Sikloheksimid Direnç Geni Nükleotit Dizisi DIZI ID. No:8 - Yapay Dizi Açiklamasi; Protein Kodlayici Sikloheksimid Direnç Geni Amino Asit Dizisi DIZI ID. No:9 - Yapay Dizi Açiklamasi; MZZ3 Antikoru H Zincirini Kodlayan Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:10 - Yapay Dizi Açiklamasi; MZZ3 Antikoru H Zincirini Kodlayan Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:11 - Yapay Dizi Açiklamasi; M223 Antikoru L Zincirini Kodlayan Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:12 - Yapay Dizi Açiklamasi; MZZ3 Antikoru L Zincirini Kodlayan Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO: 13- Yapay Dizi Açiklamasi; Otonom Olmayan Toll Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:14 - Yapay Dizi Açiklamasi; Toll-L DIZISI DIZI ID. NO:15 - Yapay Dizi Açiklamasi; Toll-R Dizisi DIZI ID. NO:18 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-CD98 Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesini Kodlayan Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:19 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-CD98 Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:20 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-CD98 Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:21 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-CD98 Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesini Kodlayan Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:22 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-CD98 Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:23 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-CD98 Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:24 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-Insan TNFoi Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesini Kodlayan Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:25 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-Insan TNFOL Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:26 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-Insan TNFoi Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:27 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-insan TNFa Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesini Kodlayan Nükleotit DIZISI DIZI ID. NO:28 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-Insan TNFa Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:29 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-Insan TNFoi Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:30 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-insan CDZO Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesini Kodlayan Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:31 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-insan CDZO Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:32 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-Insan CDZO Antikoru Agir Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:33 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-Insan CD2O Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesini Kodlayan Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:34 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-Insan CDZO Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:35 - Yapay Dizi Açiklamasi; Anti-insan CDZO Antikoru Hafif Zincir Degisken Bölgesi Amino Asit Dizisi DIZI ID. NO:36 - Yapay Dizi Açiklamasi; Yaban Tipte Neomisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:37 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Neomisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:38 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Neomisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:39 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Neomisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:41 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Puromisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:42 - Yapay Dizi Açiklamasi; Yaban Tipte Puromisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:43 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Puromisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:44 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Puromisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:45 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Zeosin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:46 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Zeosin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:47 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Higromisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI ID. NO:48 - Yapay Dizi Açiklamasi; Modifiye Tipte Higromisin Direnç Geninin Nükleotit Dizisi DIZI LISTESI <110 Inter-University Research Institute Corporation Research Organization of Enstitüsü B ilgi ve Sistemler Üzerine Kurumsal Arastirma Organizasyonu Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) <120 Protein Üretme Usulü <130 W503694 <160 48 <170 Patentln sürüm 3.3 <210 1 <211 2788 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi; otolog olmayan transpozon <400 1 <210 2 <211 200 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi; T0l2-L transpozon dizisi <400 2 <210 3 <211 504 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi; ToI2-R transpozon dizisi <400 3 <210 4 <211 2156 <212 DNA <213 Oryzias latipes <220 <221 CDS <222 (85}. <400 4 .(2034) Ser Ser Thr Val Gin Asn Gln Pro Gln Asp Gln Giu His Pro Met Giu Giu Val Cys Asp Ser Ser Ala <210 5 <211 649 <212 PRT <213 Oryzias latipes <400 5 <210 6 <211 4682 <212 DNA <213 Oryzias latipes <400 6 <210 7 <211 321 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi; Sikloheksimid direnç geni <220 <221 CDS <222 (1)..(321) <4007 <210 8 <211 106 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <400 8 <2109 <211 1404 <212 DNA <213 Yapay <220 Arg Leu Glu Cys Val Glu Pro Asn Cys Arg Ser Lys <223 M 223 Agir zincir <220 <221 CDS <222 (1}..(1404] <400 9 <210 10 <211 467 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <400 10 <210 11 <211 708 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 MZZ3 Hafif zincir <220 <221 CDS <222 (li..(708) <400 11 t1911 <210 12 <211235 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <40012 LeuPro <210 13 <211 1855 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 otolog olmayan Toll transpozon <400 13 <210 14 <211 200 <212 DNA <213 Yapay <220 <400 14 <21015 <211 505 <212 DNA <213 Yapay <220 <400 15 <210 16 <211 2745 <212 DNA <213 Oryzias latipes <220 <221› CDS <222 (30}. <400 16 .(2585) 991'- <210 17 <211 851 <212 PRT <213 Oryzias latipes <400 17 <210 18 <211 417 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: Anti-CD98 antikoru VH bölgesi <220 <221 CDS <222(1}..(417) <40018 999 Ct9 939 "-99 att <210 19 <211 139 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <40019 9t9 9C9 998 ctg Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile <210 20 <211 120 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: <400 20 <210 21 Anti-CD98 antikoru VH bölgesi <211 387 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: anti-CD98 antikoru VL bölgesi <220 <221 CDS <222 (1}..(387) <400 21 991'- <210 22 <211 129 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <400 22 A179` <210 23 <211 109 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: <400 23 anti-CD98 antikoru VL bölgesi Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arq Leu Leu <210 24 <211 420 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: Anti-TNF alfa antikoru VH bölgesi <220 <221 CDS <222 (1)..(420) <400 24 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser <210 25 <211 140 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <400 25 <210 26 <211 121 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: Anti-TNF alfa antikoru VH bölgesi <400 26 <210 27 <211 387 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: anti-TNF alfa antikoru VL bölgesi <220 <221 CDS <222 (l}..(387] <400 27 <210 28 <211 129 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <400 28 <210 29 <211 107 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: anti-TNF alfa antikoru VL bölgesi <400 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Giu Ile Lys 100 105 <210 30 <211 420 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: anti-CDZO antikoru VH bölgesi <220 <221 CDS <222(1L1420) <400 30 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Vai Ala Vai Ala Thr Arg 1 5 10 15 <210 31 <211 140 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <400 31 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asu 115 120 125 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 <210 32 <211 121 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: anti-CDZO antikoru VH bölgesi <400 32 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 40 45 Gly Ala Ile Ty:: Pro Gly Asn Giy Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Giy Thr Thr Vai Thr Val Ser Ala 115 120 <210 33 <211 384 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: anti-CDZO antikoru VL bölgesi <220 <221 CDS <222 (l}..(384) <400 33 Vai Ile Met Ser Argctg tct gca tct cca Leu Ser Ala Ser Protca agt gta agt tac <210 34 <211 128 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Sentetik Yapi <400 34 999 939 99a 999 999 ace aa9 <210 35 <211 106 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Yapay dizi açiklamasi: <400 35 <210 36 <211 795 <212 DNA <213 bilinmiyor anti-CDZO antikoru VL bölgesi <220 <223 yaban tip neomisin direnç geni <220 <221› CDS <222 (1)..(795) <400 36 991'- <210 37 <211795 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye neomisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (1)..(795) <400 37 9519' 99'i'- <210 38 <211 795 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye neomisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (1}..(795) <400 38 <210 39 <211 795 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye neomisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (1)..(795) <400 39 <21040 <211649 <212 PRT <213 Oryzias latipes <400 40 <210 41 <211 600 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye puromisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (l}..(600] <400 41 Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val 1 5 10 15 Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala 25 30 Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu 40 45 Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val 50 55 60 Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala 85 90 95 Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val 130 135 140 Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asu Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys 180 185 190 <210 42 <211 600 <212 DNA <213 bHinnHyor <220 <223 yaban tip puromisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (1)..(600) <400 42 Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val l 5 10 15 Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala 25 30 Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu 40 45 Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val 50 55 60 Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala 85 90 95 Glu Leu Ser Gly Ser Arq Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Giu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val 130 135 140 Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys 180 185 190 <210 43 <211 600 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye puromisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (1)..(600) <400 43 <210 44 <211 600 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye puromisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (l}..(600) <400 44 Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val 1 5 10 15 Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala 25 30 Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Giu Arg Val Thr Glu 40 45 Leu Gin Glu Leu Phe Leu Thr Arg Vai Giy Leu Asp Ile Giy Lys Val 50 55 60 Trp Val Ala Asp Asp Giy Ala Ala Vai Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gin Gin Met Giu Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Pro Asp His Gin Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val 130 135 140 Leu Pro Gly Val Giu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Vai Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys 180 185 190 <210 45 <211 375 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye zeosin direnç geni <220 <221 CDS <222 (1)..(375) <400 45 9c9 99a 9C9 t99 gta tgg <210 46 <211 375 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye zeosin direnç geni <220 <221 CDS <222 (l}..(375] <400 46 <210 47 <211 1026 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye higromisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (l}..(1026] <400 47 909 gga tcg Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg <210 48 <211 1026 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 modifiye higromisin direnç geni <220 <221 CDS <222 (li..(1026) <400 48 Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Glu Lys Phe Asp Ser vai Ser Asp Leu Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu 100 105 Gln Pro Vai Ala Giu Ala Met Asp Aia 115 120 Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Giy 130 135 Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala 145 150 His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr EP 2 653 540 B1 CMV poly A poly A CNN EP 2 653 540 B1 CMV poly A EP 2 653 540 B1 poly A Transposase Anlikur Urelimi Miklari a 3 EF.? 5 5:: 3 si.? EP 2 653 540 B1 E 23 3 'i 5 G ?B 9 BIHISISHISWITIBISW Clones of Suspension Cell iESQEETEÜIE Clones of Adherent Cell EP 2 653 540 B1 CMV pmyA pmyA CMV EP 2 653 540 B1 polyA Transposase EP 2 653 540 B1 Seca& _mgsmm coâmamxm Cell Number EP 2 653 540 B1 polat A HC EP 2 653 540 B1 0053" `ß- Lc EP 2 653 540 B1 pan; A CHX-I' EP 2 653 540 B1 Antikor Uretimi Miktari i (gg/mL) Control EP 2 653 540 B1 Antikor Uretimi Miktari (uglmL) Control EP 2 653 540 B1 polat A TR
TR2018/02431T 2010-12-15 2011-12-14 Protein üretme usulü. TR201802431T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010279849 2010-12-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201802431T4 true TR201802431T4 (tr) 2018-03-21

Family

ID=46244724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/02431T TR201802431T4 (tr) 2010-12-15 2011-12-14 Protein üretme usulü.

Country Status (16)

Country Link
US (1) US9102971B2 (tr)
EP (1) EP2653540B9 (tr)
JP (1) JP6087148B2 (tr)
KR (1) KR102058658B1 (tr)
CN (2) CN103261414A (tr)
AU (1) AU2011342161C1 (tr)
BR (1) BR112013014949B1 (tr)
CA (1) CA2820151C (tr)
DK (1) DK2653540T3 (tr)
ES (1) ES2661981T3 (tr)
PT (1) PT2653540T (tr)
RU (1) RU2598255C2 (tr)
SG (2) SG191124A1 (tr)
TR (1) TR201802431T4 (tr)
TW (1) TWI617664B (tr)
WO (1) WO2012081628A1 (tr)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2653541B1 (en) * 2010-12-15 2017-11-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for producing proteins
CN104114701A (zh) 2011-12-22 2014-10-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 表达载体组织、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
PT2692865E (pt) 2012-07-30 2015-02-06 Nbe Therapeutics Llc Identificação mediada por transposição de proteínas funcionais ou de ligação específicas
JP6871679B2 (ja) * 2016-03-23 2021-05-12 国立大学法人 岡山大学 遺伝子発現用カセット及びその産生物
US10960721B2 (en) * 2018-06-26 2021-03-30 Ford Global Technologies, Llc System for detection and response to retreating trailer
WO2021049606A1 (ja) 2019-09-13 2021-03-18 協和キリン株式会社 ＤｃＲ３改変体
KR102586165B1 (ko) * 2019-10-02 2023-10-10 아주대학교산학협력단 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물 및 이의 제조방법
CN112480236B (zh) * 2020-12-16 2022-03-29 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽lecvepncrskr及其制备方法和应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5667786A (en) 1995-06-07 1997-09-16 Novavax, Inc. Method for treating tumors with a toxin
JPH10299A (ja) 1996-06-18 1998-01-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 誘導加熱式アイロン装置
ATE516354T1 (de) 1997-05-15 2011-07-15 Genentech Inc Apo-2-rezeptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6291243B1 (en) * 1999-04-28 2001-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University P element derived vector and methods for its use
BR0014926A (pt) 1999-10-19 2002-06-18 Minos Biosystems Ltd Sistema de produção de proteìna
GB9924721D0 (en) 1999-10-19 1999-12-22 Craig Roger Protein production system
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
JP4817514B2 (ja) * 2001-03-09 2011-11-16 協和発酵キリン株式会社 新規動物細胞用ベクターおよびその使用
JP4364474B2 (ja) * 2002-02-15 2009-11-18 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 哺乳動物において機能的なトランスポゾン
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
GB0212666D0 (en) * 2002-05-31 2002-07-10 Secr Defence Immunogenic sequences
DE60335637D1 (de) * 2002-07-24 2011-02-17 Manoa Biosciences Inc Vektoren auf transposonbasis und verfahren zur integration von nukleinsäuren
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
SI1680140T1 (sl) 2003-10-16 2011-08-31 Imclone Llc Inhibitorji receptorja-1 za fibroblastni rastni faktor in metode za zdravljenje z le-temi
WO2006055931A2 (en) * 2004-11-18 2006-05-26 Stratatech Corporation Vectors for stable gene expression
US8124091B2 (en) 2004-12-06 2012-02-28 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to influenza M2 protein and methods of making and using same
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US20090298065A1 (en) 2006-01-05 2009-12-03 The John Hopkins University Methods for Identifying Functional Noncoding Sequences
TWI390034B (zh) 2006-04-06 2013-03-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Novel anti-CD98 antibody
JP5320546B2 (ja) 2006-12-13 2013-10-23 国立大学法人名古屋大学 Ｔｏｌ１因子のトランスポザーゼ及びそれを用いたＤＮＡ導入システム
EP2281845B1 (en) 2008-04-25 2020-09-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Stable polyvalent antibody
US8268592B2 (en) 2008-07-17 2012-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Anti-system ASC amino acid transporter 2 (ASCT2) antibody
WO2010036976A2 (en) * 2008-09-25 2010-04-01 Transgenrx, Inc. Novel vectors for production of antibodies
US20100311116A1 (en) * 2009-06-04 2010-12-09 Excellgene Sa Fast generation of high expression stable cell lines expressing recombinant proteins under minimal and short-term selective pressure
CN102803484A (zh) * 2009-06-11 2012-11-28 大学共同利用机关法人情报·系统研究机构 生产蛋白质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013014949B1 (pt) 2021-12-28
PT2653540T (pt) 2018-02-27
SG191124A1 (en) 2013-07-31
US20120196327A1 (en) 2012-08-02
BR112013014949A2 (pt) 2017-05-30
RU2598255C2 (ru) 2016-09-20
TWI617664B (zh) 2018-03-11
AU2011342161C1 (en) 2016-03-17
CN107312796A (zh) 2017-11-03
SG10201602874VA (en) 2016-05-30
KR102058658B1 (ko) 2019-12-24
EP2653540A4 (en) 2014-05-21
EP2653540B1 (en) 2018-01-24
CA2820151C (en) 2019-03-26
ES2661981T3 (es) 2018-04-04
TW201231650A (en) 2012-08-01
AU2011342161B2 (en) 2015-09-10
US9102971B2 (en) 2015-08-11
JPWO2012081628A1 (ja) 2014-05-22
CA2820151A1 (en) 2012-06-21
EP2653540A1 (en) 2013-10-23
RU2013132448A (ru) 2015-01-20
EP2653540B9 (en) 2018-05-16
AU2011342161A1 (en) 2013-05-02
DK2653540T3 (en) 2018-02-05
WO2012081628A1 (ja) 2012-06-21
JP6087148B2 (ja) 2017-03-01
CN103261414A (zh) 2013-08-21
KR20140012035A (ko) 2014-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2441831B1 (en) Process for production of protein
TR201802431T4 (tr) Protein üretme usulü.
CN116218782A (zh) 细胞选择和修饰细胞代谢的方法
JP2022538430A (ja) Ｓｉｒｔ－１遺伝子ノックアウトを有する哺乳類細胞株
JP2022537334A (ja) 所定の構成の複数の発現カセットの標的化組込みによって三価の抗体を発現する細胞を生成するための方法
JP2022537202A (ja) 所定の構成の複数の発現カセットの標的指向性組込みによって多価二重特異性抗体発現細胞を作製するための方法
CN120322561A (zh) 新型转座酶系统
EP2653541B1 (en) Method for producing proteins
HK1188252A (en) Protein production method
HK1167163A (en) Process for production of protein