TR201807961T4 - Glukoz polimerleri ve glukoz polimerlerinin hidrolizatlarının üretilmesine yönelik döngüleri dekontamine etme yöntemleri. - Google Patents
Glukoz polimerleri ve glukoz polimerlerinin hidrolizatlarının üretilmesine yönelik döngüleri dekontamine etme yöntemleri. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201807961T4 TR201807961T4 TR2018/07961T TR201807961T TR201807961T4 TR 201807961 T4 TR201807961 T4 TR 201807961T4 TR 2018/07961 T TR2018/07961 T TR 2018/07961T TR 201807961 T TR201807961 T TR 201807961T TR 201807961 T4 TR201807961 T4 TR 201807961T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- inflammatory
- hydrolysates
- pro
- glucose polymers
- molecules
- Prior art date
Links
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 title claims abstract description 137
- 239000008103 glucose Substances 0.000 title claims abstract description 136
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 72
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 71
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 151
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 claims description 132
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 69
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 63
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 40
- 102000008228 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 claims description 38
- 108010060888 Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 claims description 38
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 29
- 101001125026 Homo sapiens Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 Proteins 0.000 claims description 26
- 102100029441 Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 Human genes 0.000 claims description 26
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 25
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 25
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 24
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 24
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 23
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 20
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 19
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 17
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 claims description 16
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 14
- 229920002177 Icodextrin Polymers 0.000 claims description 13
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 claims description 12
- 229940016836 icodextrin Drugs 0.000 claims description 11
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 claims description 10
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 6
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008233 Toll-Like Receptor 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;hydrate Chemical compound O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N 0.000 claims description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000673 dextrose monohydrate Drugs 0.000 claims description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 claims 4
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 claims 4
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 claims 2
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 claims 2
- 102100027006 Paraplegin Human genes 0.000 claims 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract description 65
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 93
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 93
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 63
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 47
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 30
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 30
- 230000004044 response Effects 0.000 description 28
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 27
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 27
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 13
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 11
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 10
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 9
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 7
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 7
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 7
- 235000019910 Lycadex® Nutrition 0.000 description 6
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 6
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 6
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 6
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 5
- 101000764535 Homo sapiens Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 5
- 101001089108 Lotus tetragonolobus Anti-H(O) lectin Proteins 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- FYGDTMLNYKFZSV-MRCIVHHJSA-N dextrin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-MRCIVHHJSA-N 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 5
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 5
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- WECIKJKLCDCIMY-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2-cyanoethyl)acetamide Chemical compound ClCC(=O)NCCC#N WECIKJKLCDCIMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010071648 Noninfectious peritonitis Diseases 0.000 description 4
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 4
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 4
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001057752 Human cytomegalovirus (strain AD169) Uncharacterized protein IRL4 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000023385 chemokine (C-C motif) ligand 5 production Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012569 microbial contaminant Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004287 null lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002357 osmotic agent Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 241001147780 Alicyclobacillus Species 0.000 description 1
- 241000640374 Alicyclobacillus acidocaldarius Species 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070419 Chemical peritonitis Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036951 DNA polymerase subunit gamma-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037114 Elongin-C Human genes 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001011859 Homo sapiens Elongin-A Proteins 0.000 description 1
- 101001011846 Homo sapiens Elongin-B Proteins 0.000 description 1
- 101000881731 Homo sapiens Elongin-C Proteins 0.000 description 1
- 101001018720 Homo sapiens Magnesium-dependent phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000836005 Homo sapiens S-phase kinase-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005482 Lipopolysaccharide Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010031801 Lipopolysaccharide Receptors Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101000574441 Mus musculus Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010008211 N-Formylmethionine Leucyl-Phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 239000002561 chemical irritant Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 229940049774 extraneal Drugs 0.000 description 1
- 239000002880 extraneal Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000954 inflammatory inducer Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940051921 muramidase Drugs 0.000 description 1
- 108010009719 mutanolysin Proteins 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 210000004206 promonocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011046 pyrogen test Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, bir üretim adımı veya saflaştırma adımının, hücre hatları kullanılarak inflamatuar yanıta ilişkin in vitro bir test kullanılarak glukoz polimerlerinde veya bunların hidrolizatlarında pro-inflamatuar kontamine edici moleküllerin varlığı veya yapısı üzerindeki etkisinin belirlenmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Ayrıca glukoz polimerlerinin veya bunun hidrolizatlarının üretilmesine veya saflaştırılmasına ilişkin olarak glukoz polimerlerinde veya bunların hidrolizatlarında pro-inflamatuar kontamine edici moleküllerin analizini ve pro-inflamatuar kontamine edici moleküllerin varlığına ve yapısına ilişkin olarak optimize edilen üretim veya saflaştırma adımlarının seçimini içeren optimize bir yöntem ile ilgilidir.
Description
TARIFNAME
GLUKOZ POLIMERLERI VE GLUKOZ POLIMERLERININ HIDROLIZATLARININ
ÜRETILMESINE YÖNELIK DÖNGÜLERI DEKONTAMINE ETME YÖNTEMLERI
Mevcut bulus, glukoz polimerlerinin, daha belirgin olarak gida sektörlerine (Iiflerden
zengin saglik bilesenleri) ve tbbi alanlara (periton diyalizi) yönelik olanlarmi veya glukoz
polimerlerinin hidrolizatlarmm, daha belirgin olarak titlbi alanlara (pirojenik olmayan
enjekte edilebilir glukoz) yönelik olanlarli üretilmesine veya saflastIImasIia yönelik
döngülerin dekontamine etme yöntemleri ile ilgilidir.
BULUSUN ALT YAPISI
Basvuru sahibi bulusunu, glukoz polimerlerinin üretilmesine yönelik döngülerde veya
hidrolizatlarrimi üretilmesine yönelik döngülerde gelisebilen mikrobiyal kökenli
kontaminantlarlrii tehlikeli oldugu bilinen bir alanda gelistirmeyi seçmistir, söz konusu
kontaminantlar:
- G da zehirlenmesinden,
- Insan saglgFlçin çok zararliinflamatuar reaksiyonlardan sorumludur.
Saglkî güvenligi yaklasîhîida oldugu gibi gmla güvenligi yaklasmnmiji bir parçasîolarak
asagmlakiler de dahil uygun teknik yöntemler ile canlîhücreler formunda ve hücre artEgD
formunda olan, mikrobiyal kökenli kontaminantlarîi bulunmadEgIidan emin olunmasü
önemlidir:
- uygun saflastlma cihazlarin ve tekniklerinin kurulmasüile güvenli üretim
döngülerinin tan mlanmas+
- kontaminantlarini ve etkili dozajinilni tanimlanmaslnia yönelik yöntemlerin
tan mlanmas..
Örnegin periton diyalizi durumunda birkaç bilesen, en kesin saflik kosullarinda
hazIIIanmalml.
Periton diyalizi aslnda, böbreklerin kan plazmaslidan saflastmamadgüüre, kreatinin,
potasyum fazlasi Iveya su fazlas gibi at klar elimine etmeyi amaçlayan bir diyaliz
türüdür. Bu tmibi uygulama, son dönem böbrek hastalLgLdurumlarIida endikedir.
En yaygin kullanilan diyalizatlar, elektrolitlerin (sodyum, kalsiyum, magnezyum, klor) ve
özellikle ozmotik bir ajanTn (glukoz veya BAXTER tarafmidan pazarlanan ayaktan
periton diyalizi solüsyonunda EXTRANEAL® bulunan “ikodekstrin” gibi glukoz polimeri)
eklendigi asidik (5.2 - 5.5) veya fizyolojik (7.4) pH*daki bir tampon solüsyonundan
(Iaktat veya bikarbonat) olusur.
Küçük boyutu nedeniyle glukozun, peritondan hîl: bir sekilde geçmesinden, bu
durumun da 2 ila 4 saatlik infüzyonda ozmotik gradyan kayblia neden olmasîidan
dolay:yukarîla bahsedilen ikodekstrin gibi glukoz polimeri ozmotik ajan olarak glukoza
tercih edilir.
Glukoz polimerlerinin sürekli ayaktan periton diyalizi için kullanimina iliskin daha
spesifik bir alanda bu nisasta hidrolizatlar nin (glukoz oligomerleri ve polimerlerinin
glukoz karis.mi)i bu sekilde kullanilamayacagi hizli bir sekilde anlasilir olacakt r.
molekül agllgmia (Mw) ve 8.000 daltondan az olan sayßal ortalamalü molekül
agllglia (Mn) sahip, su içinde %10'da berrak ve renksiz solüsyonlar olusturan glukoz
polimerlerinin tercih edildigini açIslar.
Bu tür glukoz polimerleri aynîzamanda, molekül agllgü 5.000 ile 50.000 dalton
arasmda olan glukoz polimerlerinin en az %80'i az veya sII glukoz veya 3'ten az veya
buna esit (molekül aginlgLi504) olan DP`ye sahip glukoz polimeri ve 100.000'den fazla
(yaklasik 600 olan DP) molekül aginlig olan az veya sifin glukoz polimeri içerir.
Diger bir deyisle tercih edilen glukoz polimerleri, düsük polimolekülarite indeksine
(Mw/Mn oraninin hesaplanmas ile elde edilen deger) sahip glukoz polimerleridir.
Bu Patent Basvurusu EP 207.676'da nisasta hidrolizatlarîidan düsük polimolekülarite
indeksine sahip glukoz polimerlerinin elde edilmesi için önerilen prosesler asagElakileri
- su ile karîsabilen bir solvent ile bir maltodekstrinin fraksiyonel çöktürme
isleminin gerçeklestirilmesi,
- uygun sLniI veya dLsIama esigine sahip çesitli membranlardan bu aynU
maltodekstrinin moleküler filtrasyonunun gerçeklestirilmesi.
Her iki durumda da bu prosesler, çok yüksek molekül agITIITdH polimerleri ve
monomerleri veya düsük molekül agmllRIFbligomerleri elimine etme amacFtasT.
Ancak bu prosesler, uygulanmalarü bakmnlidan ve elde edilmelerini sagladEBlarD
ürünlerin verimi ve kalitesi bakînmidan tatmin edici degildir.
Önceki teknigin dezavantajlarlidan yoksun olan bir proses olmak üzere suda tamamen
çözünen ve 2.5'ten az düsük polimolekülarite indeksine sahip olan, tercihen 8.000
degerine sahip bir glukoz polimerinin üretilmesine yönelik bir prosesin gelistirilmesine
iliskin olarak, Basvuru Sahibi sirket, bu patentinde EP 667.356 bir maltodekstrin yerine
hidrolize bir nisastadan baslayarak bu problemi çözmeye çaIISmlstIn.
Kromatografik amia ile elde edilen glukoz polimeri bu sekilde tercihen, %3'ten az
glukoz ve 3'ten az veya buna esit DP degeri olan glukoz polimeri ve 600'den büyük DP
degeri olan %0.5'ten az glukoz polimeri içerir.
Son olarak periton diyalizi alanIida uzmanlar tarafîidan, ozmotik güçleri için kullanilan
bu glukoz polimerlerinin tamamen tatmin edici oldugu kabul edilmistir.
Ancak periton diyalizine yönelik bu preparatlarIi mikrobiyal kontaminasyon riski
istenmeyen bir durumdur.
Glukoz polimerlerinin üretim döngülerinin, mikroorganizmalar veya söz konusu
mikroorganizmalarda bulunan pro-inflamatuar maddeler ile kontamine edilebilecegi
Örnegin nisasta üretiminde mßI veya bugday nisastalarliîi mayalar, küfler ve
bakteriler, özellikle Alicyclobacillus acidoca/darius (döngünün slak ve asidik
bölgelerinde gelisen ekstremofilik bakteriler) türü asidotermofilik bakteriler ile
kontaminasyonu açiklanr.
Bu kontamine ürünleri alan hasta için majör risk peritonittir.
Bu peritonit olaylarm intraperitoneal bakteriyel enfeksiyonlardan kaynaklanlTl ve teshis
genellikle pozitif diyalizat kültürleri ile kolaylkla konur.
Aseptik, kimyasal peritonit veya kültür-negatif peritonit olarak açklanan “steril peritonit"
tipik olarak kimyasal bir irritandan veya yabancEmaddeden kaynaklanl.
Periton diyalizi solüsyonlarîili hazllanmasmia için ikodekstrin eklenmesi nedeniyle
potansiyel olarak mevcut olan pro-inflamatuar maddelerin indüksiyonu da dahil çesitli
nedenler ile ilgili olabilen izole aseptik peritonit vakalarLbildiriImistir.
Aseptik inflamatuar olaylari diyaliz solüsyonlar nin enjeksiyonundan sonra gözlenen
majör komplikasyonlardin.
Bu inflamatuar olaylarh herhangi bir ksmhm, kimyasal bir problem (kimyasal
kontaminantlarli kazara enjeksiyonu veya bazübilesiklerin yanlß dozajlar[)] ile iliskili
olmas: halinde vakalarmi büyük bir kismi direkt olarak, diyaliz solüsyonlarIiIi
haleanmasItda kullanIan solüsyonlarda mikrobiyal kontaminantlarli varlgü ile
iliskilidir.
Lipopolisakkarit (LPS) ve peptidoglikan (PGN), eser miktarlarda bulundugunda dahi bir
inflamasyonu tetikleme riski yüksek olan, mikrobiyal kökenli temel kontaminanttl.
Ayrica Basvuru Sahibi Sirketin, minimal biyoaktif yapls nlni muramil dipeptit (MDP)
oldugu depolimerizasyon ürünleri PGN gibi bu kontaminantlar tarafindan indüklenen
inflamatuar yanitl l kötülestirebilen moleküllerin varllg ni [hesaba katmasl Idiger bir
avantajdln.
Tek bas Iia aIIian bu deriveler, in vitro olarak inflamatuar degildir ve 1 ug/ml'den büyük
degerlere kars :anlamIÜJIr yanm verir.
Depolimerizasyon ürünlerine PGN ek olarak prototipinin f-MLP (tripeptit formil-Met-Leu-
Phe) oldugu formillenmis mikrobiyal peptitler de önemli sinerjik aktiviteye sahiptir.
Orijinal olarak bu peptitler, lökositler üzerindeki kimyasal çekicilik aktiviteleri yönünden
tan mlaninken bunlar, kendiliginden sitokin yan tiriii indükleyemez.
PGN ve/veya LPS izlerinin etkilerini kötülestirerek aseptik inflamatuar olaylaerolaylH
yoldan gerçeklestirebilmeleri nedeniyle bu "küçük moleküllerin” gözden kaçmmnamasiî
önemlidir.
Farmakope, pirojenik maddelerin saptanmas I'ia yönelik bir dizi testi saglar:
- Gram-negatif bakterilerin majör bileseni olan bakteriyel endotoksin saptama
testi (LAL testi),
- Tavsan pirojen testi.
Genellikle güvenilir olmakla birlikte bu testlerin s nirilamalar vardiri. Pirojenik tavsan
testi, bu maddeleri içeren ürünün enjekte edildigi tavsanda ates yüksekliginin ölçülmesi
(atesli yaniti) ile pirojenlerin dolayi tayinine dayalidin.
Bu test, istenmeyen maddenin çok düsük biyolojik aktiviteye veya pirojenik sistemin bir
yanmüindüklemek için çok düsük bir konsantrasyona sahip olmas: halinde yalancü
negatiflige yol açabilir.
Ayrma bu madde, lokal inflamatuar bir reaksiyon olusturmaya yeterli biyolojik aktiviteye
veya konsantrasyona sahip olabilir.
LAL testi sadece bakteriyel endotoksinleri (LPS) ve fungal flora duvarlarDLni bilesenleri
olan ß-glukanlari i saptar. Diger biyolojik safsizliklar (ADN, peptidoglikanlar....)
saptanmaz.
Bu nedenle ikodekstrin içeren periton diyalizi solüsyonlari ile gözlenen aseptik peritonit
vakasEbazEdurumlarda, bazj'naddelerin Farmakopede açiklanan testlerden ne sekilde
kaçabildigini ve ne sekilde advers klinik etkilere neden olabildigini gösterir.
Bu durumu düzeltmek amacßila BAXTER sirketi, Gram pozitif mikrobiyal
kontaminantlaririi tayinine yönelik girisimlerde bulunulmasirii' önermistir.
Özellikle EP 1. patentinde BAXTER sirketi, özellikle periton
diyalizi solüsyonunun hazrlanmasinia yönelik glukoz polimerlerinde Gram-pozitif
bakterilerin membranlarTilTt majör bilesenleri olan peptidoglikanlarît tayinine dayal`bir
pirojenik kontaminantlam saptanmaslia yönelik bir testi açklar.
Diger bir deyisle bu aseptik peritonit olaylarIiIi görülmesini önlemek amacýla
BAXTER sirketi, periton diyalizi solüsyonlarmli üretimine ve kullanmnîta yönelik olarak
periton diyalizi solüsyonunda peptidoglikanlarîi saptanmasmia yönelik bir protokolü
önermistir.
Ayrica bu EP 1.720.999 patentinde glukoz polimerlerinin akis yukari islenmesinin
sadece peptidoglikanlarii oldugu gibi yakalayabilen afinite reçineleri yoluyla
yapilabildiginden bahsedilmektedir.
Bu nedenle glukoz polimerlerinin üretim prosesinin degistirilmesi öngörülmemistir,
böylece nihai üründe Alicyclobacillus acidocaldarius türü asidotermofilik bakteriler veya
bu özel bakterilerin membran parçalarjle kontaminasyon yoktur.
sirket, güvenli hazIIama ve saflastlma islemlerine yönelik bir proses ile bu maddelerin
etkili sekilde kontaminantlarüçermemesini saglamak amacýla periton diyalizine yönelik
olarak bu durumda glukoz polimerleri olan daha iyi kalitedeki maddeler saglamßtl.
Basvuru sahibi sirket, kontaminasyonu engellemeye yönelik bir düzenlemede aktif
karbon/siyah granüler ile isleme, filtrasyon (mikrofiltrasyon ve ultrafiltrasyon) ve isii
uygulamasina iliskin birkaç adimi Ikombine eden önemli bir saflastnma yöntemini
uygulamistin.
Ancak bu yöntem gelistirilmistir ve basvuru sahibi sirket, glukoz polimerleri de dahil
üretim hatlarmimi optimum güvenligini saglamak amacßrla uygulanacak önemli proses
admnlarîiüdaha iyi tanInIamak üzere önceki teknikte var olandan daha etkili tayin ve
dozlama yöntemleri gelistirmek için çal smist r.
pro-inflamatuar moleküllerin varlig nin ölçülmesine yönelik kullan mi lle ilgilidir.
Yukarma açklananlara göre güvenli hazmlama ve saflastîma islemlerine iliskin bir
proses ile bu maddelerin etkili bir sekilde kontaminant içermemesini saglamak
amacgila bu durumda glukoz polimerleri ve hidrolizatlarüolan daha yüksek kalitedeki
terapötik uygulamalara yönelik maddeleri saglamak üzere karsIanmamß bir
gereksinim vard I.
Basvuru sahibi sirket bu nedenle bu gereksinimin, etkinliginin, çok özel
kontaminantlartiji dozajlaru ve tayin yöntemleri kullanuarak ölçülebildigi uygun
saflastinma adimlarini n uygulanmasi ile karsilanabilecegini bulmustur.
Son yillarda inflamatuar yan t testlerinde hayvan modellerin yerini almak üzere primer
hücrelerin kullanildigi birçok test gelistirilmistir.
Ancak bu in vitro modeller, deneysel yanltlIRtan sorumlu olabilen bireyler arasDyÜksek
degiskenlige maruz kalm.
Buna karsîi monositik hücre hatlarîtutarliyanttlar saglar, bu da gelistirilmekte olan
testlerin bu tür hücreleri kültürde daha fazla kullanma nedenidir. Ancak bu testler, bir
solüsyonda karßîn olarak bulunan tüm kontaminantlara karsügenel inflamatuar bir
yarim verme dezavantajna sahiptir ve bu nedenle kontaminant yapßîili karakterize
edilmesine izin vermez.
Ayrica, kötülesen inflamatuar yan tini, inflamasyonun akut fazinini sitokinleri örnegin
TNF-d (Tümör Nekroz Faktörü alfa), IL-1|3 (interlökin 1ß) ve kemokinler örnegin CCLS
(Kemokin (CC motifi) Iigand 5) / RANTES (Aktivasyon sonucu Regüle olan, Normal T-
hücresinde Ifade Edilen ve Sal Iian) için görüldügünün ancak IL-6 (interlökin 6) için az
oranda görüldügünün veya hiç görülmediginin bilinmesi önemlidir.
Basvuru sahibi sirket, asagidaki sonuçlara ulasmistlnz
(i) biyolojik solüsyonlarda eser miktarlarda bulunan bakteriyel kontaminantlarîfi
saptanmasýzordur,
(ii) sinerjik etkiler nedeniyle PGN ve LPS tayini ile snlllallimamas :önemlidir,
(iii) duyarlîve tekrarlanabilir tayin yöntemlerinin gelistirilmesi gereklidir ve
(iv) kontaminantlarmi yapsliîkarakterize edebilen duyarlüve tekrarlanabilir tayin
yöntemlerinin kullan [linas :avantajlml I.
Bu nedenle basvuru sahibi sirketin amacü halihazmda kullanIan ve/veya literatürde
açklanan prosedürlerin duyarllik esiginin altLnida pro-inflamatuar etkiye sahip olan
mikrobiyal kontaminantlarrli tayinine iliskin duyarl ve etkili yöntemler gelistirmek ve
sonrasinda üretim döngülerinden elde edilen partilerde eser halde bulunan pro-
inflamatuar moleküllerin ailesini veya hatta yaplSlnl tanimlamaktln.
Bulusun K sa Aç klamas
Mevcut bulus, asagdaki adTTilarGiçeren glukoz polimerler veya hidrolizatlarda pro-
inflamatuar moleküllerin varlgîveya yapsîüzerinde bir üretim adTnnTi etkisi veya
saflastîma adînnmi etkinliginin test edilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir:
a) glukoz polimerleri veya hidrolizatlar ni n saglanmas ;
b) ad m a)'da saglanan glukoz polimerleri veya hidrolizatlar'nda pro-inflamatuar
moleküllerin saptanmas veya analiz edilmesi;
0) ad m a)'da saglanan glukoz polimerleri veya hidrolizatlarin n üretilmesi veya
saflast r lmas na yönelik ad m n veya ad mlar n gerçeklestirilmesi;
d) ad m C)”de saglanan glukoz polimerleri veya hidrolizatlar nda pro-inflamatuar
moleküllerin saptanmas ve analiz edilmesi;
e) ad mlar b) ve d)'de saptanan veya analiz edilen glukoz polimerleri veya
hidrolizatlar nda pro-inflamatuar moleküllerin bir kars Iast rmas ile adm c)'nin
pro-inflamatuar moleküllerin varl gi veya yapis üzerindeki etkinligi veya etkisinin
belirlenmesi, pro-inflamatuar moleküllerin ve bu moleküllerin baz larni n
miktar ndaki bir azalma, glukoz polimerleri veya hidrolizatlarn n
dekontaminasyonu için ad m 0)'nin etkinliginin göstergesidir;
burada glukoz polimerleri veya hidrolizatlar-nda bulunan pro-inflamatuar moleküllerin
saptanmas_ ve analizi adT'nlI reseptörünü TLR2 (Toll Benzeri Reseptör 2) ve
transkripsiyonu direkt olarak TLR2 reseptörü ile iliskili sinyallesme yolag na bagiml
olan bir raportör geni ifade eden bir hücre hatt n n kullanlldg Iinflamatuar yan tin in
vitro bir analizini içerir, pro-inflamatuar molekülleri raportör genin aktivitesi ve sinyalinin
ölçülmesi yoluyla saptan r veya analiz edilir.
Bu ayr ca asag daki ad mlar içeren, glukoz polimerleri veya hidrolizatlar n n üretilmesi
veya saflastir Imaslna yönelik optimize edilen bir yöntem ile ilgilidir:
a) glukoz polimerleri veya hidrolizatlar ni n saglanmas ;
b) ad m a)'da saglanan glukoz polimerleri veya hidrolizatlar nda pro-inflamatuar
moleküllerin saptanmasWeya analiz edilmesi;
o) en azTidan glukoz polimerleri veya hidrolizatlarmda bulunan pro-inflamatuar
moleküller için uygun glukoz polimerleri veya hidrolizatlarrin üretilmesi veya
saflast r imas na yönelik ad mlar n seçilmesi;
d) ad m arda saglanan glukoz polimerleri veya bunlar n hidrolizatlar na yönelik
seçilmis bir veya daha fazla üretim veya saflast rma ad min n gerçeklestirilmesi;
e) adm d)'de elde edilen glukoz polimerleri veya hidrolizatlar nda pro-
inflamatuar moleküllerin saptanmas veya analiz edilmesi;
burada glukoz polimerleri veya hidrolizatlar nda bulunan pro-inflamatuar moleküllerin
saptanmas ve analizi ad ml, reseptörünü TLR2 (Toll Benzeri Reseptör 2) ve
transkripsiyonu direkt olarak TLR2 reseptörü ile iliskili sinyallesme yolag na bag ml
olan bir raportör geni ifade eden bir hücre hatt n n kullanlldg iinflamatuar yan tin in
vitro bir analizini içerir, pro-inflamatuar molekülleri raportör genin aktivitesi ve sinyalinin
ölçülmesi yoluyla saptan rveya analiz edilir.
Bir birinci aç da in vitro inflamatuar yant analizi, MDP veya LPS-duyarl lmakrofaj
farkllasmal hücre hatt THP-1 ile glukoz polimeri veya hidrolizatlarnln temas
ettirilmesini içerir, pro-inflamatuar moleküller, hücre hattîaracilgyla RANTES veya
TNF-a miktarT'iTî ölçülmesi yoluyla saptanlT veya analiz edilir.
Ikinci bir aç da in vitro inflamatuar yan t analizi, transkripsiyonu direkt olarak inflamatuar
sinyallesme yolaklar na bag ml Ibir raportör gen ile transfekte edilen bir makrofaj hatt
ile glukoz polimerleri veya bunlarn hidrolizatlar ile temas ettirilmesini içerebilir, pro-
inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla
saptanir veya analiz edilir.
Üçüncü bir aç da in vitro inflamatuar yanit analizi, NOD2 reseptörünü ve
transkripsiyonu direkt olarak NOD2 sinyallesme yolaklar na bagml. olan raportör bir
geni ifade eden bir hücre hatt .ile glukoz polimerleri veya hidrolizatlarn n temas
ettirilmesini içerir, pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin
ölçülmesi yoluyla saptan-r veya analiz edilir.
Dördüncü bir açîja in vitro inflamatuar yanti analizi, TLR4 reseptörünü ve
transkripsiyonu direkt olarak TLR4 sinyallesme yolaklarna bagleýolan raportör bir
geni ifade eden bir hücre hatt 'ile glukoz polimerleri veya hidrolizatlarn n temas
ettirilmesini içerir, pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin
ölçülmesi yoluyla saptan r veya analiz edilir.
Besinci bir aç da in vitro inflamatuar yari t. testi, glukoz polimerleri veya hidrolizatlar n n
asag dakiler ile temas ettirilmesini içerebilir:
a. MDP veya LPS-duyarl makrofaj farkllasms hücre hatt THP-1, pro-
inflamatuar moleküller hücre hatt. araclllg yla üretilen RANTES veya TNF-(i
miktar n n ölçülmesi yoluyla saptanr veya analiz edilir; ve
b. transkripsiyonu direkt olarak inflamatuar sinyallesme yolaklar na bag ml olan
raportör bir gen ile transfekte edilen makrofaj hatt, pro-inflamatuar moleküller,
raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptan r veya
analiz edilir; ve
C.TLR2 reseptörünü ve transkripsiyonu direkt olarak TLR2 sinyallesme
yolaklar na bag ml olan bir raportör geni ifade eden bir hücre hatt, pro-
inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi
yoluyla saptanT veya analiz edilir; ve
d.NOD2 reseptörünü ve transkripsiyonu direkt olarak NODZ sinyallesme
yolaklar na bag nnl olan bir raportör geni ifade eden bir hücre hatt, pro-
inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi
yoluyla saptan rveya analiz edilir; ve
e. TLR4 reseptörünü ve transkripsiyonu direkt olarak TLR4 sinyallesme
yolaklar na bag ml olan bir raportör geni ifade eden bir hücre hatt, pro-
inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi
yoluyla saptan r veya analiz edilir.
Alt-riiC._bir açîîla in vitro inflamatuar yanTtesti ayr_ca bir immünite reseptörü aracTigyla
transfekte edilmemis bir kontrol hattnî'i glukoz polimerleri veya hidrolizatlaFile temas
ettirilmesini içerebilir.
Tercihen pro-inflamatuar moleküller, bakteriyel kökenlidir, tercihen PGN, LPS,
mikrobiyal peptitler dahil ve ß-glukanlardan seçilir.
Tercihen saflast Hma veya üretim ad m veya ad mlar., s uygulama, asidifikasyon, aktif
karbon üzerinden geçirme, adsorpsiyon reçineleri üzerinden geçirme, ultrafiltrasyon,
filtrasyon, kimyasal veya enzimatik hidroliz ad mlar ndan seçilir
Tercihen glukoz polimerleri, ikodekstrin ve maltodekstrinler, özellikle dallanmß veya
dallanmamß maltodekstrinlerden seçilir ve glukoz polimeri hidrolizatlar: dekstroz
monohidrat gibi toplam hidroliz ürünüdür.
Tercihen glukoz polimer numuneleri veya hidrolizatlar, özellikle 30 kDa”daki bir 3 mm
esigi ile önceden filtrelenir ve filtrat, testte kullan lan hücre hattjle temas ettirilir.
Bulusun Detayl Aç klamas
Mevcut tarifname bu nedenle asag daki adimlar l glukoz polimerleri veya
hidrolizatlarnda pro-inflamatuar moleküllerin varlrg_ veya yap-s_ üzerinde üretim
adTnTliTî etkisi veya saflastîima adTnTîTii etkinliginin test edilmesine yönelik bir yöntem
ile ilgilidir:
a) glukoz polimerleri veya hidrolizatlar ni n saglanmas ;
b) istege bagl' olarak adm a)'da saglanan glukoz polimerleri veya
hidrolizatlar nda pro-inflamatuar moleküllerin saptanmas veya analiz edilmesi
0) ad m a)”da saglanan glukoz polimerleri veya hidrolizatlarin n üretilmesi veya
saflast r lmas adlmn n veya admlar n n gerçeklestirilmesi;
d) adlmdan c) sonra elde edilen glukoz polimerleri veya hidrolizatlarlnda pro-
inflamatuar moleküllerin tespit edilmesi veya analiz edilmesi;
e) adTn c)'nin pro-inflamatuar moleküllerin varlgîve yap-sîüzerindeki etkisinin
veya etkinliginin belirlenmesi;
burada glukoz polimerleri veya hidrolizatlar nda bulunan pro-inflamatuar moleküllerin
saptanmas 've analizi ad m , bir hücre hatt rl n kullan Id g inflamatuar yan t n in vitro bir
analizini içerir, hücre hatt , bir makrofaj veya bir makrofaj farkl Iasan hücre hatt veya bir
veya daha fazla reseptör TLR (Toll Benzeri Reseptör) veya NOD (NÜk/eotid baglama
O/igomerizasyon Domeni içeren proteinler) örnegin TLR2, TLR4 veya NOD2 ve
reseptör veya reseptörlerin yan tlar n n saptanmas na yönelik olarak veya bir
kombinasyonunu ifade eden bir hücredir.
Yöntem özellikle ad m e) baglaminda ad mlar b) ve d)'de saptanan veya analiz edilen
glukoz polimerleri veya hidrolizatlarnda pro-inflamatuar moleküllerin bir
karslastrmasin içerir. Dolaysyla pro-inflamatuar moleküllerin ve bu moleküllerin
baz'lar'nn miktar ndaki bir azalma, glukoz polimerleri veya hidrolizatlarnn
dekontaminasyonu için bir üretim veya saflast'rma adim nin etkinliginin göstergesidir.
Pro-inflamatuar moleküllerin miktari ve yaps,i asag da aç klanan yöntem ile
belirlenecektir.
Bu yöntemin amac özellikle glukoz polimerleri veya hidrolizatlar n n, özellikle periton
diyalizi solüsyonunun hazTIanmasTlia yönelik olarak glukoz polimerlerinin dekontamine
edilmesine yönelik optimize bir prosesin gelistirilmesidir, yöntem tercihen in vitro
inflamatuar yanmtestinde pro-inflamatuar moleküllerin saptanmasîveya analizini içerir.
Özellikle saflastlma veya üretim adEnlarIiIt pro-inflamatuar moleküller üzerindeki
etkisi veya etkinligi karakterize edildiginde, özellikle bunlarli varlEgDve yapmama göre,
teknikte uzman kisiler, glukoz polimerleri veya hidrolizatlarLrida bulunan pro-inflamatuar
molekülleri göz önünde bulundurarak en uygun adimlar seçebilir. Dolayisiyla optimize
edilmis proses asag daki adimlari içerir:
a) glukoz polimerleri veya hidrolizatlar ni n saglanmas ;
b) ad m a)'da saglanan glukoz polimerleri veya hidrolizatlar nda pro-inflamatuar
moleküllerin saptanmasWeya analiz edilmesi;
o) en azTidan glukoz polimerleri veya hidrolizatlarmda bulunan pro-inflamatuar
moleküller için uygun glukoz polimerleri veya hidrolizatlarTFn üretilmesi veya
saflast r imas na yönelik ad mlar n seçilmesi;
d) istege bagl olarak, ad m a)'da saglanan glukoz polimerleri veya bunlarn
hidrolizatlar na yönelik seçilmis bir veya daha fazla üretim veya saflastrma
ad m n n gerçeklestirilmesi; ve
e) istege bagl olarak, ad mda d)'de elde edilen glukoz polimerleri veya
hidrolizatlar nda pro-inflamatuar moleküllerin saptanmas veya analiz edilmesi;
burada glukoz polimerleri veya hidrolizatlar nda bulunan pro-inflamatuar moleküllerin
saptanmas ve analizi ad m , bir hücre hatt rt n kullan ld g inflamatuar yan t n in vitro bir
analizini içerir, hücre hatt , bir makrofaj veya bir makrofaj farki lasan hücre hatt veya bir
veya daha fazla reseptör TLR (Toll Benzeri Reseptör) veya NOD (NÜk/eotid baglama
Oligomerizasyon Domeni içeren protein/er) örnegin TLR2, TLR4 veya NOD2 ve
reseptör veya reseptörlerin yan tlar n n saptanmas na yönelik olarak veya bir
kombinasyonunu ifade eden bir hücredir.
Glukoz polimerleri veya hidrolizatlarl, periton diyalizi, enteral ve parenteral besleme ve
yeni doganlarh beslenmesine yönelik tasarlanabilir.
Tercih edilen bir açma mevcut tarifnamenin parças: olarak hazîlanacak glukoz
polimerleri ikodekstrin veya maltodekstrinlerdir (asagla açtRIandEgîüzere dallanmß
veya dallanmamß).
Burada söz konusu glukoz polimerleri hidrolizatlarLJ basvuru sahibi sirket tarafindan
LYCADEX® PF markas alt'nda pazarlanan, pirojenik olmayan dekstroz monohidrat
gibi toplam hidroliz ürününü içerir.
Bunlar, bunlarin hazirilanmas nin bir veya daha fazla asamaslnida ve özellikle ham
materyal seviyesinde, hazmlanma proseslerinin herhangi bir asamasîtda ve/veya
prosesin nihai ürününü seviyesinde dekontemine edilebilir.
Dolayßýla mevcut mevcut tarifnameye ait yöntemlerde saglanan glukoz polimerleri
veya hidrolizatlarm ham materyale, hazîlanma prosesinin herhangi bir seviyesindeki
ürüne veya nihai ürüne karsÜDi gelir.
Pro-inflamatuar kontaminantlar özellikle bakteri kökenlidir. Bunlar özellikle PGN, LPS,
mikrobiyal peptitler, ß-glukanlar, vb. olabilir
Insanlarda terapötik kullanima yönelik (örnegin peritoneal diyaliz solüsyonlar) glukoz
polimerinin hazinlanmas na yönelik yöntemlerin dekontaminasyon ad mlaririi n etkinligini
gözlemlemek amacýla mevcut tarifname baglammida kullanttan in vitro inflamatuar
yanttlarli ölçülmesine yönelik yöntemler, monosit/makrofaj tipi hatlarmi (THP-1, ve/veya
Raw-Bluem) ve dogal immüniteye spesifik bir reseptörü ifade eden (HEK-BIueTM)
transfekte edilmis hücre hatlarmii kullanttdEgZhücre testlerine ("biyo-ana/iz/er') dayan I.
THP-1 hatt (, bir insan pro-monosit hattdin. Pro-inflamatuar yant
testine yönelik olarak hücreler, forbol esterin (PMA) varlLgIida 3 gün
monosit/makrofajlarda farklllasln.
Mevcut tarifnameye göre gerçeklestirilen testlere yönelik olarak makrofajlar veya
makrofaj farkliiasmalîtücreler, özellikle makrofaj farleasmaIFiFHP-i hücreleri, özellikle
8. aureus MDP olmak üzere MDP varlEgIida duyarlIastI.. Aslîtda MDP zayî bir
inflamatuar indükleyicidir, ancak diger inflamatuar moleküller ile sinerjik olarak hareket
ettigi bilinir. Bu nitelik, çogunlukla TLR'Ier olmak üzere MDP'den baska reseptörlerin
müdahalesi ile bu molekülerin hareket etmesine dayanI. Bu nedenle MDP varlEgE
glukoz polimerleri veya hidrolizatlarIiIi solüsyonlarmda bulunan kontaminantlariile
indüklenen inflamatuar yanmîartlacaktî, böylelikle kontaminantlarIi düsük seviyeleri
tespit edilir. Tercihen MDP, 1 pg/mL'den fazla bir konsantrasyonda, tercihen 1 ile 100
pg/ml aras'ndaki bir konsantrasyonda numuneye eklenir. En çok tercih edilen bir açlda
MDP, 10 ug/mL olan bir konsantrasyonda numuneye eklenir.
Alternatif olarak makrofajlar veya makrofaj farklllasmall Ihücreler, özellikle makrofaj
farkliiasmalý THP-1 hücreleri, MDP'den baska moleküllerin varlgmda
duyarlIastIEtabilir. AsIIida LPS, özellikle E. coliden allian LPS de kullanIabiIir.
Numuneye en az 10 pg/ml`lik bir konsantrasyonda, örnegin 25 pg/mL”Iik bir
konsantrasyonda eklenebilir.
Tercih edilen bir açIa makrofajlar veya makrofaj farklIasmaID hücreler, özellikle
makrofaj farklIasmalDTHP-1 hücreleri, kültür ortamIiIi 0.5 ve 1 x 106hücre/ml'si
arasmda, tercihen 0.7 ile 0.8 X 106 hücre/ml arasinda ve hatta daha çok tercihen
yaklasüi olarak 0.75 X 106 hücre/ml olan bir yogunlukta kullanüLr.
In vitro Inflamatuar yanit testi, duyarl Iastlnilmls THP-1 hücreleri ile RANTES üretiminin
ölçümüne dayan r. Aslinda önceki çal smalar, bu kemokin analizinin glukoz
solüsyonlar nda düsük dozlardaki kontaminantlar, özellikle endotoksinin saptanmasil
için uygundur. Alternatif olarak in vitro inflamatuar yanü] testi ayrEta duyarlIastIm'nß
THP-1 hücreleri ile TNF-o üretiminin ölçülmesine dayandIIabilir. Sitokinlerin analiz
edilmesi, ELISA dahil olmak üzere teknikte iyi bilinen herhangi bir yolla
gerçeklestirilebilir. Tercih edilen bir açmla analiz, 8 saatlik uyarmadan sonra TNF-a
üretiminin ölçülmesini içerir. Tercih edilen bir diger açîda analiz, özellikle bir ELISA
analizi ile olmak üzere 20 saatlik uyarmadan sonra RANTES üretiminin ölçülmesini
Bu birinci test, PGN ve/veya LPS ile, tercihen orta boyutlu (özellikle yaklasik olarak PGN ve/veya LPS ile, hatta daha çok tercihen LPS ile glukoz polimerleri veya
hidrolizatlarhmi özellikle kontaminasyonunu saptamak üzere kullan Tiri.
Raw-BlueTM hatt: alkalin fosfatazît salgttanmß bir formunu (SEAP: salgîanmiîs
embriyonik alkalin fosfataz) üreten bir raportör gen ile transfekte edilen bir fare
makrofaj hattIE, bunun transkripsiyonu direkt olarak inflamatuar sinyallesme
yolaklarDa bagmnlmll. Bu hattîi avantaj: TLR2, TLR4 ve NOD2 reseptörleri dahil
olmak üzere dogal immüniteye sahip tüm reseptörleri esas itibariyle ifade etmesidir.
Dolayisyla bu hücreler, inflamatuar kontaminantlaani çoguna yani verecektir ve yanit,
üretilen SEAPinin enzimatik aktivitesinin ölçülmesi yoluyla gözlenecektir. Tercihen bu
hat, yaklasik 0.5 x 106hücre/göz olan bir hücre yogunlugunda testte kullanilir. Glukoz
polimerler veya hidrolizatlari ipreparatirii n temas ettirilmesi yaklasik olarak 16 ila 24
saat sürmüstür.
HEK-BlueTM (InvivoGen) dahil olmak üzere hücre hatlarü özellikle insan reseptörleri (h)
gibi dogal immüniteye sahip bir reseptörü kodlayan bir vektör ile stabil transfeksiyon
yoluyla tasarlanan hatlardî. Bunlar ayrma sentezi asIDifade edilen reseptör ile iliskili
sinyallesme kanalîin direkt kontrolü altIida oldugu SEAP üreten bir raportör gen
olmak üzere raportör gen ile birlikte transfekte edilir. Tercihen raportör gen, renkli veya
floresan bir proteini veya aktivitesi bir substrat ile veya bu olmaksîli ölçülebilen bir
proteini kodlar. Raportör genin sinyal aktivitesinin saptanmasü bir veya daha fazla
dogal immünite reseptörlerini aktive edebilen ve numunelerin inflamatuar bir yaniU
tetikleyebilen kontaminantlari iiçerdigini gösterir. Bu hatlarini kullan lmasi,i ifade edilen
reseptöre göre mikrobiyal kökenli moleküllerin belirli familyalarinii i hedefleyebilir.
Tercihen hTLR2 veya hTLR4 veya hNOD2”yi ifade eden hücre hatlari ikullan lir1. Ek
olarak dogal immünite reseptörünü ifade etmeyen bir kontrol hatt da kullanilin. Bu
kontrol hattIiIi kullanmnü glukoz polimerler veya hidrolizatlarIiIi solüsyonlarliîî bir
toksisite mekanizmasügibi parazitik bir mekanizma vasEtas :ila raportör genin üretimini
indüklemedigini dogrulamak üzere faydalîil.
Mevcut tarifnameye göre testi gerçeklestirmeye yönelik olarak tercihen dört hat
kullanilin:
. HEK-BlueTM hTLR2: hTLR2 reseptörünü ifade eden bu hat, TLR2 agonistlerine
(özellikle PGN ve Iipopeptitleri) spesifik olarak yaniti verir. Bunun kullan mI,i bu
kontaminantlarîri inflamatuar yanitlariîtetikleyen seviyelerinin bilinmesine olanak
. HEK-BlueTM hTLR4: hTLR4 reseptörünü ifade eden bu hat, LPS'ye spesifik
olarak yanI verir. Bunun kullanînü bu kontaminantlarli inflamatuar yanIIarD
tetikleyen seviyelerinin bilinmesine olanak tan I,
. HEK-BlueTM hNOD2: hNOD2 reseptörünü ifade eden bu hat, spesifik olarak
NOD2 agonistlerine yarim verir. Bunun kullanmnü inflamatuar yanttlarütetikleyen
ilgili moleküller ve MDP oranMIi bilinmesine olanak tani,
o HEK-BlueTM Null2: Bu, bir immünite reseptörü ile transfekte edilmeyen bir
kontrol hattidin. Bunun kullanim.' glukoz polimerleri veya hidrolizatlarlnirii
solüsyonlar nin bir toksisite mekanizmasi iile SEAP üretimini indüklemedigini
dogrulamak üzere önemlidir.
Ancak bununla birlikte teknikte uzman kisilerin ayrica diger ticari hatlarH(lmgenex)
kullanabildigi ve hatlarüiazllayabildikleri not edilmelidir.
Tercih edilen bir açîla hücre hatlarü kültür ortammiîi 0.5 ve 1 x 106hücre/mL'si
araslidaki bir hücre yogunlugunda kullanmî ve glukoz polimerleri veya hidrolizatlarlimi
preparatîm hücreler ile temas haline getirilmesi yaklasik olarak 16 ila 24 saat sürer.
Kontaminantlarîi miktarIiI'i belirlenmesi, bir doz yanI egrisi kullanilarak
gerçeklestirilebilir. Bu doz yani egrisi özellikle, artan kontaminant dozlarLiiIe aynU
kosullar altinda ayni ihücreler ile gerçeklestirilebilir. Doz yaniti egrileri özellikle LPS
standartlar., PGN, Iipopeptit, ß-glukanlari ive MDP ile gerçeklestirilir. Tercihen bu tür bir
doz yant egrisi, artan LPS dozlari IiIe TLR4 (örnegin THP-1, HEK-BIueT'V' hTLR4 ve
Raw-BIueTN') ifade eden hücreler, artan PGN dozlari iiIe TLR2 (örnegin THP-l, HEK-
BlueTM hTLR2 ve Raw-BIueTM) ifade eden hücreler ve artan MDP dozlarîile NOD2
(örnegin HEK-BlueTM hNOD2) vasîasýla reaktif olan hücreler için üretilebilir.
Belirli açIarda THP-1 hatlarm Raw-BlueT'V' ve HEK-BlueTM, standart konsantrasyonlar
arttlnlarak inkübe edilmistir ve hücresel yanItL THP-1 hattina yönelik ELISA ile
RANTES Üretiminin miktaania göre ve raportör gen özellikle Raw-BlueT'V' ve HEK-
BlueTM hatlar na yönelik SEAP”nin enzimatik aktivitesi ölçülerek ölçülmüstür.
Mevcut açklamanm testi, bir inflamatuar yanmmtetikleyen kontaminantmtanmnlar. Bu
nedenle, NOD2 ifade eden hat özellikle HEK-BlueTM hNOD2, özellikle PGN ve
MDP'nin, tercihen MDPlnin depolimerizasyon ürünleri ile kontaminasyonu saptamaya
olanak saglar. TLR2 ifade eden hat, özellikle HEK-BlueTM hTLR2 ve/veya Raw-BlueTM
özellikle PGN ile kontaminasyonu saptar. Ayrßa makrofajlar özellikle THP-1
makrofajlarüve TLR4 ifade eden hat, özellikle HEK-Blue TM hTLR4, özellikle LPS ile
kontaminasyonu saptar.
Tercih edilen bir açLdla inflamatuar yanLtJLni in vitro analizi, asagLdaki hücre hatlariile
testleri içerir:
- makrofajlar, özellikle THP-1 makrofajlarl,l bir TLR2 reseptörünün aktivitesini
saptamaya yönelik bir hücre hatt, özellikle HEK-BIueT'V' hTLR2 hatti,l HEK-Blue
TM hTLR4 hattýdahil olmak üzere bir reseptör TLR4'ün aktivitesini saptamaya
yönelik bir hücre hatt: bir NOD2 reseptörünün aktivitesini saptamaya yönelik bir
hücre hattü özellikle HEK-BlueTM hNOD2 ve istege baglüolarak ancak tercihen
bir kontrol hattüözellikle HEK-BlueTM Null2 susu; veya
- bir raportör gen ile transfekte edilen makrofaj hücre hattm özellikle Raw-BlueTM
hatt: bir TLR2 reseptörünün aktivitesini saptamaya yönelik bir hücre hatt:
özellikle HEK-BIueT'VI hTLR2 hattm bir TLR4 reseptörünün aktivitesini
saptayamaya yönelik bir hücre hatt: özellikle HEK-BlueT'V' hTLR4, bir NOD2
reseptörünün aktivitesini saptamaya yönelik bir hücre hatt, özellikle HEK-
BlueTM hNOD2 hatti ive Istege bagli lolarak ancak tercihen bir kontrol hatti,
özellikle HEK-BlueTM Null2.
Tercih edilen bir açlda farkli lnumunelerde kontaminantlarim varlig , genel inflamatuar
yanma ve belirli kontaminantlara karsüspesifik yanEtIara yönelik bakîs açßlia sahip
olmak üzere yukarmla açtklanan bes hücre türü kullanmarak test edilmistir:
- Hat THP-1 duyarl: MDP: LPS'ye yüksek reaktivitesi olan bütün
kontaminantlar,
- Raw-BIueTM: PGN'ye yönelik yüksek reaktivitesi olan bütün kontaminantlar,
- HEK-BlueTM hTLR2: PGN ve diger Iigandlar TLR2 (lipopeptitler ...),
- HEK-BIueTM hTLR4: LPS
- HEK-BIueTM hNODZ: MDP ve PGN depolimerizasyon ürünleri,
- HEK-BIueTM Null2: negatif kontrol.
Mevcut açlklamaya göre yöntemde üretme veya saflastrma ad mlarii siiislemi
admnlarj asidifikasyon, aktif karbon üzerinden geçirme, adsorpsiyon reçineleri
üzerinden geçirme, ultrafiltrasyon, filtrasyon, kimyasal veya enzimatik hidroliz veya
kombinasyonlarmdan seçilebilir.Farle parametreler, en etkili olanIi seçilmesine
yönelik her bir asamaya yönelik test edilebilir. Örnegin aktif bir karbon geçisi
durumunda, aktif karbonun ve kombinasyonlarîm farle sIiEflarü test edilebilir.
Ultrafiltrasyon durumunda farkl`smim esiklerinin test edilmesi ve/veya bunlar-n kombine
edilmesi mümkündür. Isiuygulamasüdurumunda uygulama sßakltglim ve süresinin
degistirilmesi mümkündür. Enzimatik uygulama durumunda kullanman enzim veya
enzimlerin, bunlarIi konsantrasyonlarlin ve proses kosullarIiIi degistirilmesi
mümkündür.
Belirli bir açilarda uygulamalar, pirojen içermeyen suyun (p.p.i.) içinde en az %32
(agirlik/hacim) olarak haz rlanan numunelerin üzerinde gerçeklestirilmistir ve akabinde
solüsyonlar, 0.22 um olacak sekilde filtrelenmistir. Hücresel analizlere yönelik
numuneler, hücre kültürü ortamlida 1/10 seyreltilmistir (nihai konsantrasyon: %32
Glukoz polimer numuneleri veya hidrolizatlarüayrma pro-inflamatuar moleküllerin testi
veya analizinden önce enzimatik veya kimyasal uygulamalara veya filtrasyon
admnlarîta tabi tutulabilir.Istege baglü olarak bu proses adEnlarmdan veya
filtrasyondan önce ve sonra elde edilen sonuçlar karsIastImabilir.
Bu nedenle bir glukoz polimer numunesi veya bunun hidrolizatlarl,ltest edilmeden önce
mutanolisin ile muamele edilebilir. Bu enzim, bunun muramidaz aktivitesi ile PGN'yi
depolimerize edebilir. Örnegin yaklask 2500 U/ml“lik bir konsantrasyonda enzim,
numune varl ginida olabilir, istege bagl olarak 6 ila 16 saat, tercihen yaklasik 16 saat
boyunca %75 ila 37.5 (aglltR/hacim) bir konsantrasyonda bir glukoz polimere
seyreltilebilir. Akabinde bu sekilde islem görmüs numune, mevcut aç klamanirii bir veya
daha fazla hücre hattUIe teste tabi tutulacaktm.
Alternatif olarak glukoz polimerlerin veya bunlarin hidrolizatlarlnln numune hazinlantsi,
test edilmeden önce filtrelenebilir. Bu filtrenin amacHönceIikIi olarak yüksek moleküler
aglîiliklH PGN, gibi yüksek moleküler agmlklý molekülleri uzaklastTmak ve küçük
boyutlardaki belirli kontaminantlarü analiz etmek üzere filtrat üzerinde test
gerçeklestirmektir. Filtrasyona yönelik SmiI esikleri örnegin 30 kD ile 150 kD aras Iida,
olabilir. Tercih edilen bir açIa hücre testleri, ultrafiltrasyon ile elde edilen fraksiyonlar
üzerinde, özellikle 30 ve 100 kDa'IER SIII esikleri ile gerçeklestirilmistir. Tercihen
filtrasyon, ultrafiltrasyon ile gerçeklestirilir. Aynüzamanda teknikte bilinen herhangi bir
araç ile gerçeklestirilebilir. Bu nedenle numune bu sekilde filtrelenir ve filtrat, mevcut
aç klamanini hücre testlerine tabi tutulur. Filtrasyonsuz veya bundan önce elde edilen
sonuçlarn karsllastinllmasi,l inflamatuar küçük moleküllerin spesifik katklsimi
saptayacakt r. Ayrica bu, üretim adimlar niiri veya saflastmmann kontaminantlarini
(hidroliz ve agregasyon) boyutlarini. degistirip degistirmedigini ve/veya kontaminantlarn
tan Tnlanm s belirli boyutlarmi *ortadan kald Tmad lg ?i Fkontrol edebilir.
AyrEta, numunelerin Iizozim ve/veya ß-glukanaz ile islenmesi, PGN ve/veya ß-glukanhü
uzaklastII ve böylece kontamine edilmis yglilarda (glikolipidler ve lipopeptitler)
mevcut olabilen TLR2'nin diger agonistlerinin önemi bilinir.
Mevcut açtlilamanli yöntemlerinin tercih edilen bir açîslida hücre testinin birinci bir
dizisi, moleküllerin boyutuna bakürnaksîm yanmarEblçmek ve bu moleküller araslidaki
olasLl sinerjistik etkileri tutmak amacwla filtrelenmemis numuneler üzerinde
gerçeklestirilir.Akabinde ikinci bir dizide hücre testleri, kontaminantlarn (hidroliz ve
agregasyon) boyutlarini. degistirip degistirmedigini ve/veya kontaminantlarn
tan mlanmjs belirli boyutlarinili ortadan kaldinmad glni dogrulamak amac yla
ultrafiltrasyon (sinir esikleri: 30 ve ile elde edilen fraksiyonlar üzerinde
gerçeklestirilmistir.
Bulusun yöntemini göstermek üzere farklüdekontaminasyon admnlar: ayrü glukoz
polimerlerin farklii dizileri ve glukoz polimer hidrolizatinn bir yiginii üzerinde
gerçeklestirilir.
ikodekstrine yönelik glukoz polimerler, ham materyaller (patent EP 667.356'n n
ögretisine göre kromatografik aleimadan önce)
- bir ikodekstrin yFgFriiiî
- NUTRIOSE® FBOG marka adüaltlida basvuru sahibi sirket tarafndan sattian
- LYCADEX® PF marka adüaltîida Basvuru Sahibi taraflidan piyasaya sürülen.
enjeksiyona yönelik solüsyonunun kosullandIIrnasîia yönelik haziîlanan birçok
dekstroz monohidrat,
- basvuru sahibinin mülk sahibi oldugu uluslararas: patent basvurusu WO
glukoz polimeri,
- Ticari bir maltodekstrin.
Basarili Uygulamalar asagidaki gibidir:
- Bill örnegin:
0 70°C ve/veya
o 120°C,
asidifikasyon,
çesitli kalitede kömür üzerinde geçis, örnegin:
0 NORIT sirketine ait SX+
o NORIT sirketine ait SX2,
o NORIT sirketine ait C EXTRA USP,
o NORIT sirketine ait A SUPRA EUR,
0 CECA sirketine ait ENO-PC,
o CECA sirketine ait L4S,
o CECA sirketine ait LSS,
o CECA sirketine ait CSA,
o Rohm & Haas'tan Amberlite XAD-4,
o Rohm & Haas'tan Amberlite XAD-761,
o Rohm & Haas'tan XAD-1600 Amberlite,
o Dow'dan Amberlite XAD-16 HP (= FPX66),
o Dow'dan Dowex SD2,
o Purolite`ten Macronet MN-100,
o Purolite`ten Macronet MN-150,
- farklwmim esiklerine sahip olan ultrafiltrasyon, örnegin,
0 5kDa;
o 30 kDa;
- spesifik enzimleri kullanan enzimatik hidroliz, örnegin:
o [3 1-3 glukanaz
o proteazlar.
o manaz aktivitesine yönelik enzim haanlanLslar_ (örnegin, deterjan
ürünleri ve temizlemeye yönelik kullanIan NOVOZYMES sirketi
tarafîidan piyasaya sürülen Mannaway®).
o endo-beta-glukanaz aktivitesine yönelik enzimatik hazirlanlslar
(örnegin, Specialty Enzymes and Biotechnologies Co. sirketi tarafndan
üretilen ve Advances Enzyme Technologies Ltd. taraflidan piyasaya
sürülen SEBro® TL)
0 asit proteaz aktivitesine yönelik enzim hazmlanßlar_(örnegin Specialty
Enzymes and Biotechnologies Co. sirketi tarafindan üretilen ve
Advances Enzymes Technologies Ltd. tarafmidan piyasaya sürülen
SEBfI0® FL100).
Bulus, aç klama amaci olan asagidaki örnekler kullan Iarak daha iyi anlasllacakt n.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
Sekil 1: Raw-BlueT'V' hücrelerinin standart agonistlere yanltlari.l
Sekil 2: HEK-BlueTM TLR2 hücrelerinin standart agonistlere yanLtIarLJ
Sekil 3: HEK-BlueTM TLR4 hücrelerinin standart agonistlere yanitlari.l
Sekil 4: HEK-BlueTM NOD2 hücrelerinin standart agonistlere yanitlarl.l
Sekil 5: HEK-BlueTM Null hücrelerinin standart agonistlere yanmarm
Sekil 6: Filtrelenmemis matrislar ile indüklenen ve 100 kDa ve 30 kDa
filtrelerden geçisten sonra Raw-BlueTM hücrelerinin yanttlarü
Sekil 7: Filtrelenmemis matrislar ile indüklenen ve 100 kDa ve 30 kDa
filtrelerden geçisten sonra HEK-Blue`TM TLR2 hücrelerinin yanttlarü
Sekil 8: Filtrelenmemis matrislar ile indüklenen ve 100 kDa ve 30 kDa
filtrelerden geçisten sonra HEK-BlueT'V' TLR4 hücrelerinin yanîlarEJ
Sekil 9: Filtrelenmemis matrislar ile indüklenen ve 100 kDa ve 30 kDa
filtrelerden geçisten sonra HEK-BlueTM NOD2 hücrelerinin yanLtlarLJ
Sekil 10: Matrisler tarafindan indüklenen HEK-BlueTM Null yanitlari.!
Sekil 11: Farkli matrislerin toplam inflamatuar aktiviteleri
Sekil 12: Kömür SX+ üzerinden geçtikten sonra matrisler taraf ndan indüklenen
hücresel yantlar.
Sekil 13: Farkli kömürler üzerinden geçirildikten sonra E3063 matrisi
indüklenen hücresel yanIlar.
Sekil 14: Farkl: kömürler üzerinden geçirildikten sonra E1565 matrisi
indüklenen hücresel yan Ilar.
Sekil 15: Farkl: kömürler üzerinden geçirildikten sonra E1242 matrisi
indüklenen hücresel yanIIar.
Sekil 16: Farklükömürler üzerinden geçirildikten sonra Lab3943 matrisi
indüklenen hücresel yanIlar.
Sekil 17: 5 kDa üzerinde ultrafiltrasyon isleminde sonra E1565 matrisi
indüklenen hücresel yan tlar.
Sekil 18: 5 kDa üzerinde ultrafiltrasyon isleminde sonra Lab3943 matrisi
indüklenen hücresel yan tlar.
indüklenen hücresel yan Iiar.
Sekil 20: SEBro®TL ile islendikten sonra E5250 matrisi ile indüklenen hücresel
yanttlar.
Sekil 21: SEBPro® FL1OO ile islendikten sonra E30630 matrisi ile indüklenen
hücresel yantlar.
Sekil 22: Endüstriyel reçineler ile islendikten sonra E1565 matrisi ile indüklenen
hücresel yan tlar.
Örnekler
Örnek 1: Doz-yaniti egrilerinin olusturulmasl i
Doz yanm egrileri, standart agonist molekülleri ile gerçeklestirilir. LPS. PGN, LTA,
zimosan ve MDP. Raw-BlueTM hatlarîve HEK-BlueTM TLR2. TLR4, NOD2 ve Null,
agonistin artan konsantrasyonlarüile inkübe edilir ve hücresel yarim, SEAP aktivitesinin
(sekiller 1-5) miktar:belirlenerek ölçülür. TNF-oi, hücre aktivasyonunun pozitif kontrolü
olarak kullanim:
- Raw-BlueTM hatt: hücreler matrislerin ve glukoz polimerlerin (PGN, LPS,
zimosan, LTA) türevlerinin içinde mevcut olabilecek temel inflamatuar
moleküllere yant verir; bunlar, güçlü bir reaktivite vidas PGN'ye sahiptir ancak
depolimerizasyon ürünlerini (MDP) kars Tamaz.
- HEK-BlueTM hTLR2: PGN`ye karsügüçlü reaktivite; hücreler diger TLR2 (LTA,
zimosan) ligandlarIia daha zayü] bir sekilde yanI verir ve LPS ve MDP'ye karsD
herhangi bir reaktivite göstermez,
- HEK-BlueTM hTLR4: LPS'ye karsügüçlü reaktivite; hücreler diger zimosana
daha zaytt] bir sekilde yantt verir ve PGN, LTA ve MDP'ye karsiherhangi bir
reaktivite göstermez,
- HEK-BlueTM hNOD2: MDP'ye karsEgüçIü reaktivite,
- HEK-BlueTM Null2: hücresel toksisite kontrolü yoklugu.
Örnek 2 glukoz polimeri ve glukoz polimer hidrolizatim bir ylg nliiii Iayiiimak üzere
farklLmatrisIerin haz rlanLSLI
YukarIa görüldügü üzere, matrisler asagmlaki gibidir:
- 5 glukoz polimeri, Ikodekstrine yönelik ham materyaller (patent EP 867.356'nIi
E5248 ve E5250 olarak refere edilir.
gerçeklestirilir.
- kontamine edilmis ikodekstrinin bir ygliü(burada E209J'ye refere edilir) ve
birçok “standart” ikodekstrin, diger bir ifadeyle hücre bazlüolmayan analizlerde
kontaminasyonun kontrolü (burada P11-11'e refere edilir). Bu yglilar, patent
667.356'nî1 ögretisine göre hazIIlan.
- NUTRIOSE® FBOB marka adDaItIida basvuru sahibi sirket taraflidan satman
birçok dallanmLs maltodekstrin,
- LYCADEX® PF marka adi Ialt nda Basvuru Sahibi tarafindan piyasaya sürülen,
enjeksiyona yönelik solüsyonunun kosulland r Imas na yönelik hazirlanan birçok
dekstroz monohidrat,
- burada LA83943 olarak refere edilen, peritoneal diyalize yönelik yüksek
çözünebilir dallanmls glukoz polimerlerinin birçok aparatî
amiloglukosidaz ile çift enzimatik uygulama ile hazîlanmßtl.
burada Cargill'e refere edilir.
Örnek 3: islenmemis numuneler ile veya 100 kDa veya 30 kDa filtreden geçisten
sonra indükleneri hücresel yanIIarmi analizi
Bu testlerin amaci,l pro-inflamatuar reaktiviteyi ve glukoz polimer matrislerinde bulunan
kontaminantlarln ve glukoz polimer hidrolizatini ylg nini n yap Sin belirlemektir.
Örnek ?ye göre numuneler, pirojen içermeyen su (p.p.i.) içinde %32 (agIIER/hacim)
olacak sekilde hazîlan I.
LPS ve PGN dozaj oranlar: SLP-HS analizi ve LAL (asagIa verilen veriler)
kullanilarak hücre testlerine daha önceden yapilmistm.
11 3 9J
(EU/ modifi < 153,
Hücresel analizlere yönelik numuneler, hücre kültürü ortamlida 1/10 seyreltilmistir
(nihai konsantrasyon: %32 (w/v)).
Analizler asaglaki gibi gerçeklestirilmistir:
Raw-BlueTM hatt:i PGN'ye yönelik yüksek reaktivitesi olan bütün
kontaminantlar,
- HEK-BlueT'V' hTLR2: PGN'ye yönelik yüksek reaktivite,
- HEK-BlueTM hTLR4: LPS'ye yüksek yanî verirlik,
- HEK-BlueTM hNOD2: MDP ve PGN depolimerizasyon ürünleri,
- HEK-Blue“`li Null2: hücresel toksisite kontrolü yoklugu.
Hücre türüne göre sonuçlar, Sekiller 6 ve 10lda gösterilir.
Raws
Hücre Yan tlari (Sekil 6):
Kontamine olmayan P11-11 kontrolü varlEgIida elde edilen ile benzer bir yanI veren
Cargill matrisi haricinde diger bütün numuneler, makrofaj hatt nini temasna bir
inflamatuar yanLtJ tetikler. En reaktif matrisler E-3063 (hücre yantLmm doymuslugu) ve
E-1242 ve E-1565'tir.
Kontaminantlar esas olarak yüksek moleküler agmlglîolan moleküllerdir (örnegin PGN,
zimosan) veya agregalarTörnegin LPS, LTA) olusturabilir. Alerlida 100 kDa filtrasyonu
büyük oranda numuneler ile indüklenen yanttlarüazaltî, bu islemin büyük bir parçayü
boyuta sahip olan, muhtemelen daha büyük kontaminantlarn kIImasîidan
kaynaklanan kontaminantlarüçerdigini gösterecek sekilde P11-11'den önemli derecede
daha yüksek bir aktiviteye sahiptir. 30 kDa'ya filtrasyon, farklünumunelerin islemden
sonra pro-inflamatuar aktivitelerinin neredeyse tamammükaybetmeleri nedeniyle daha
etkilidir.
HEK-TLR2 Hücre Yanltlarl (Sekil 7):
HEK-TLR2 hücreleri ile elde edilen sonuçlar, önceki sonuçlar dogrular.
E-3063 matrisi, TLR2 indüserlerinde çok yüksek kontaminasyon seviyesi gösteren bir
zamanda Raws hücrelerinde gözlemlenenden daha yüksek yanîlar verir. Bu fark,
bunlarIi TLR2'nin (PGN veya lipopeptitler) güçlü indüserleri ile yüklenmesiyle açmlan I.
100 kDa ve 30 kDa filtrasyonlar, bu numuneler ile indüklenen inflamatuar yanmarü
nötrlestirir, kontaminantlarn baskIt bir sekilde yüksek moleküler aglltklü PGN
oldugunu gösterir. Ancak E-3063 ve E-1565 matrisleri filtrasyondan sonra önemli bir
aktivite göstermeye devam eder. Bu veriler, bu bilesiklerin PGN degradasyon ürünlerini
ve/veya Iipopeptitleri içerdigini gösterir. PGN”nin aksine TLR2'nin diger güçlü
indüserleri, <30 kDa kütleye sahiptir ve bu nedenle filtrasyondan sonra dahi bir
hücresel yan t verir.
E-5250 ve E-5248 matrisleri ve NUTRIOSE®, Raws hücreleri ile gözlemlenen ile
benzer bir yogunlukta zaymyanmar verir, bu iç numunenin TLR2lnin (örnegin, zimosan,
ß-glukanlar veya LTA) zayI indüserlerini içerdigini gösterir.
Önceden oldugu gibi matris ve Cargill LYCADEX®, TLR2'nin kontaminant
indüserlerinin yoklugunu gösteren bir yanmtetiklemez.
HEK-TLR4 Hücre Yanltlarl (Sekil 8):
dogrulayan bir sekilde HEK-TLR4 hücrelerinde ortalama yogunlukta bir yanii
tetikler.FiItrasy0nlar kßmi olarak hücre yanEtlarIiD azaltl, bu LPS'nin agregalarü
olusturabilecek olmasîve sadece agregalEolmayan moleküllerin uzaklastIJmasüile
açIslanI.
LPS oranlaanin bir inflamatuar yanLtmUtetikleyebilen esik degerinin aItLnida oldugunu
gösterir. Birinci iki matris, HEK-TLR2 hücrelerinde güçlü bir reaktivite ile iliskilendirilen
Raw hücrelerinde bir inflamatuar yanitii isaglar. Bu veriler, bu iki matrisin büyük oranda
PGN ile kontamine edildigini gösterir. E5248, E5250 ve LYCADEX® matrisleri aynil
zamanda Raw hücrelerinde bir inflamatuar yanltl Itetikler. Ancak bunlar, üç numunede
PGN ve LPS disinda diger kontaminantlarm varlgmýgösteren, TLR2`ye göre çok az
veya sm] aktiftir.
HEK-NOD2 Hücre YanEtlarElSekil 9):
HEK-NOD2 hücreleri bütün numunelere yarim verir ancak sadece E-1565, Lab3943 ve
Cargill matrisleri, NOD2'nin indüserleri ile güçlü bir sekilde yüklenir. Bu almm PGN
depolimerizasyonun ürününe (MDP) yarim verir ancak aynîzamanda düsük moleküler
agLiJlIklLl degradasyon ürünlerine yanLtJ verir. Bu nedenle gözlemlenen yan tlaani
yogunlugu, numunelerin gelismis veya daha az gelismis bir degradasyon prosesine tabi
tutulan PGN ile kontamine edilmesini ve/veya edildigini gösterir. Beklendigi gibi 100 ve
kDa filtrasyonlar , incelenen bilesiklerin (MDP ve degrade olmus PGN) küçük olmasi l
nedeniyle hücrelerin yan ti üzerinde önemli bir etkiye sahip degildir.
HEK-Null Hücre Yan IlarEKSekil 10):
Son olarak HEK-Null hücreleri, diger hücre hatlarlida gözlemlenen reaktivitenin bir
toksik etki ile degil ancak bir inflamatuar türü yanlti ile baglantili oldugunu gösteren bir
sekilde farkILnumunelerin varlLgIida önemli yan tlar üretir.
Numune Sonuçlari (Sekil 11):
- E1242: zayT bir sekilde degrade PGN ile güçlü bir kontaminasyon nedeniyle
ortalama yogunlukta inflamatuar aktivite.
- E1565: kßmi olarak degrade PGN ile güçlü bir kontaminasyon ve LPS varlEgD
nedeniyle ortalama yogunlukta inflamatuar aktivite.
- E3063: güçsüz bir sekilde degrade PGN ile güçlü bir kontaminasyon ve LPSinin
izleri ile baglantmîdayanmlünflamatuar aktivitesi.
- E5248: PGN'nin düsük bir kontaminasyonu ve PGN ve LPS dßîida inflamatuar
moleküllerin varlLgJle iliskili düsük yogunlukta inflamatuar aktivite.
- E5250: PGN'nin düsük bir kontaminasyonu ve PGN ve LPS dis nda inflamatuar
moleküllerin varligi ile iliskili düsük yogunlukta inflamatuar aktivite.
- Lab3943: k smi olarak degrade PGN ve LPS ile orta kontaminasyon ile
baglantlll brtalama yogunlukta inflamatuar aktivite.
- IcoE209J: düsük gradyanIFl PGN içinde güçlü bir kontaminasyon nedeniyle
ortalama yogunlukta inflamatuar aktivite.
- Cargill: saptanabilir inflamatuar aktivitenin yoklugu ancak PGN degradasyon
ürünlerinin varlEg:
- NUTRIOSE® kßmi olarak degrade PGNinin izleri ve LPS ile orta dereceli
kontaminasyon ile baglantülorta yogunlukta inflamatuar aktivite
- LYCADEX®: PGN degradasyon ürünlerinin düsük bir kontaminasyonu ve PGN
ve LPS dßmda inflamatuar moleküllerin varIEgZIIe iliskili düsük yogunlukta
inflamatuar aktivite.
Örnek 4 Aktif karbon üzerinde geçis isleminin etkisi.
Deneylerin birinci bir serisinde, tüm numuneler aynl Ikömür ile ard s k iki uygulamaya
tabi tutulmustur (%1 kömür NORIT SX+ 80°C'de 1 saat boyunca).
Sekil 12, hücre hattEile elde edilen sonuçlarîgösterir.
Birinci karbon uygulamas: Raws ve HEK-TLR2 hücrelerinde inflamatuar bir yan[t
siddetli bir sekilde azaltm. Tüm durumlarda, ikinci uygulama aercta inflamatuar yanLttan
sorumlu olan moleküllerin ortadan kald rllmas nl arttlnln. Uygulama etkisi E5248, E5250
ve Lab3943 NUTRIOSE® numunelerine yönelik daha az belirgindir. Bu veriler, SX+
kömür uygulamaslThITl az miktarda bozulan PGN'yi uzaklastîmak üzere etkili olacaglîiî
böylece bu kontaminantlarln çogunlukta oldugu matrislerin inflamatuar aktivitesini
azaltacagli :gösterin
HEK-TLR4 hücrelerine yönelik, yanI LPS taraflidan en fazla kontamine edilen E1565,
Lab3943 matrisleri ve NUTRIOSE®`ye yönelik azaltJE. Ancak, etki spesifik bir kinetik
LPS gösteren PGN'ye atfedilen yanttlara yönelik oldugu kadar belirgin degildir.
SX+ kömür uygulamalarLJHEK-NODZ hücrelerinin yanLtanida az etkiye sahiptir, PGN
bozulma ürünlerin uygun bir sekilde ortadan kaldlnllmadlglrlil gösterir. Son olarak, HEK-
Null hücreleri, kömür ile iliskili herhangi bir toksik etki haricinde uygulanm s numunelere
duyarl degildir.
Önceki testlerin numunelerin farkllî moleküler yapma kontaminantlar içerdigini
göstermesi nedeniyle, aktiflesmis karbonun geçirilmesi aracmgwla uygulama akabinde
gözlemlenen farklar beklenmistir. Bu deney aracEtEgÜIa belirtilen önemli bir bilgi,
kontaminantlarli boyutuna baglîolarak etkinlikteki farki gösterilmesidir. Dolayßjila,
kömür SX+ ile uygulama, yüksek moleküler ag IIEEIDPGN dahil, belirli bir kontaminant
sliIiIIi ortadan kaldllimnasda daha belirgin bir etkiye sahip olacaktI.
Bu hipotezi dogrulamak üzere, farklügözeneklilikteki birkaç kömür, E3063, E1565,
E1242 ve Lab3943 matrislerinin dekontamine edilmesinde etkinliklerine yönelik test
edilmistir.
Baslica büyük boyutta PGN (güçlü TLR2 yanitii)i ile kontamine edilen matrisler olan
(TLR2 yan Ilarîve NOD2) ve LPS (TLR4 yanIE)l içerir.
Optimize edilen isleme kosullarüasagElakilerdir: %0.5 kömür, 4.5'e ayarlüpH, 1 saat
boyunca 80°C`de inkübasyon. Uygulama akabinde, numuneler 0.22 pm filtre üzerinde
filtrelenmistir ve akabinde hücre testlerinde kullanim'stL
E3063 matrisine yönelik sonuçlar Sekil 13'te gösterilir.
HEK-Null hücrelerindeki yanî eksikligi, kömürlerin herhangi birinin hücre toksisitesi
sergilemedigini dogrular.
Test edilen tüm kömürler, bu matrisin baslza kontaminantlarüolan büyük PGlei
uzaklastlma etkinliklerini göstererek, Raws ve HEK-TLR2 hücrelerinin yanEtIarIiD
siddetli bir sekilde azaltmada etkilidir.
Yeni karbonlarLm SX+”e esit veya bundan etkili oldugu belirtilir.
Dolayis yla, uygulanan L4S, L3S, ENO-PC, C-extra USP ve SX2 numuneleri, bu
kömürlerin PGN'yi uzaklastinmada daha etkili oldugunu öne sürerek HEK-TLR2
hücrelerindeki arka plan gürültüsüne yakini selüler yanitlari indükler.
Daha az etkili kömüre iliskin, 30 kDa ve 100 kDa'da filtrasyon bunlarîi baslîia ortadan
kaldlmnayan PGN eserlerinden dolayü oldugunu göstererek, uygulama akabinde
kalntîyanmarEezaltm :stl
Aynisonuçlar, daha az etkili oldugu görülen L4S ve aksine HEK-TLR2 hücrelerinden
daha etkili olan A-Supra-Eur haricinde Raws hücrelerinde gözlemlenir. Bu kömür daha
genis bir islev spektrumuna sahip olabilir ve LPS gibi diger molekülleri ortadan
kaldLnabilir.
Kömür, E3063 matrisine göre HEK-NOD2 hücreleri ve HEK-TLR4'ün reaktivitesini
büyük oranda azaltinken, her iki hücre tipinde bu matris aracligiyla indüklenen
yanitlarini düsük genligi nedeniyle uygulamalar aras ndaki etkinlik farkliliklar ni iayrt
etmek zordur.
E1565 matrisine yönelik sonuçlar Sekil 14'te gösterilir.
E3063 matrisi gibi, aynükömürler HEK-TLR2 ve Raws indüklü hücre E1565'in
yanitlarini iazaltmada etkilidir. Ancak, boyuttaki ve dolayisyla PGN özelliklerindeki
farkiUJklar nedeniyle birkaç küçük fark anlasmr.
kDa'daki filtrasyonun az miktarda veya sifir kontaminant tutmas nedeniyle, HEK-
NOD2 hücrelerinin neredeyse tüm yanIIar_ PGN bozulma ürünlerinin varligmdan
kaynaklanm. Diger yandan, kömürler bu hücrelerin yanitini* azaltmada yetersizdir.
Asiîtda, MDP tipi kontaminantiarîi yükündeki azalma aracmgßila neden olunan
yanEt'taki azalma, hücrelerin maksimum yanEtiIiIi %50'sini geçmez.
Son olarak, kömürler TLR4 yanmîida ortalama bir etkiye sahiptir. LPS'nin tüm
formlarmiüortadan kaIdImada oldukça etkili olan SX+ haricinde, diger kömürler ile
uygulama taraflidan neden olunan azaltma uygulanmamîs aynünumune aracmgßrla
indüklenen yanLtiLni %50'sini geçmez. Ancak, L4S kömürleri, A-supra Eur ve daha az
derecede C-extra USP ve ENO-PC'nin <100 kDa boyutundaki moleküller taraf ndan
indüklenen yanitlari iazaltmada daha etkili oldugu belirtilir, bu karbonlarini tercihen
birikmemis LPS üzerinde islev gösterdigi öne sürülür.
E1242 matrisine yönelik sonuçlar Sekil 15'te gösterilir.
Test edilen tüm kömürler Raws ve HEK-TLR2 hücrelerinde E1242 boyasüaracmgýla
indüklenen yanmarüazaltmada etkilidir. Arka plan gürültüsüne yakli veya esit olan
yanitlar, PGN'ye karSJJJK gelen büyük moleküllerin ortadan kaIdIÜUEgügöstererek 30
kDa ve 100 kDaiitfiltrasyon öncesinde ve sonraslida aynîdm.
E1242 matrisi LPS tarafmidan oldukça az kontamine edilir. Ancak, ENO-PC ve A-
Supra-Eur'nin arka planda HEK-TLR4 hücrelerinin yanLtLni; azaltmada diger
kömürlerden daha etkili oldugu belirtilir. Bu gözlem, bu kömürlerin genis bir islev
spektrumuna sahip oldugunu ve LPS gibi, PGN disindaki molekülleri uzaklast rma etkili
oldugunu dogrular.
Son olarak, kömürlerin HEK-NOD2 hücrelerinin yanIIiDyaklasER %50 kadar azaltan
ENO-PC ve SX2 haricinde, PGN bozulma ürünlerini uzaklastîmada etkili degildir.
Lab3943 matrisine yönelik sonuçlar Sekil 16'da gösterilir.
Bu matris farkli Imoleküllerin genis bir spektrumu ile kontamine edilir. Beklendigi üzere,
tüm kömürler Raws hücrelerinde indüklenmis yanLtlarLi farki.' etkinlikler ile
uzaklastmin. SX+, CSA, L4S ve daha az derecede A-Supra-Eur'nin en etkili oldugu
belirtilebilir, bu kömürlerin genis bir aktivite spektrumuna sahip oldugu dogrulanir. HEK-
TLR2 hücrelerine yönelik, tüm kömürlerin PGN'yI uzaklastmmada etkili oldugu bulunur,
ancak kalmitFIyanIlarFrii, PGN bozulma ürünlerinin daha kolay bir sekilde ortadan
kald Itlidtgîiügöstererek filtrasyon öncesi ve sonras îida ayn EkaII.
LPS'nin ortadan kaldlmmasmda karbonlarîi davranßîayrîia degiskendir. Dolayßjila.
SX+ kömür, ENO-PC, L4S ve A-Supra-Eur, HEK-TLR4 hücrelerinin yanmîiüazaltmada
en çok etkilidir. Son olarak, yalnâca kömürler ENO-PC, C-Extra-USP ve SX2, HEK-
NOD2 hücrelerinin yanIIi: büyük oranda azaltmada nispeten aktif olmustur, bu
matristeki PGN bozulmasmini ürünlerini uzaklastUJma bunlaani etkili oldugunun kantdm.
- C-extra-USP ve SX2: PGN'yi ve bunun bozulma ürünlerini uzaklast rma etkilidir.
- A-Supra Eur: yüksek moleküler aginlikll I (örnegin birikmis LPS ve PGN)
moleküllere yönelik daha yüksek etkinlige sahip genis spektrum.
- ENO-PC: <1OO kDa moleküler agmlkl* moleküllere yönelik daha yüksek
etkinlige sahip genis spektrum (örnegin LPS ve PGNlnin bozulma ürünleri).
- diger kömürler: islev spektrumlarive en fazla kömür SX+'e esit etkinlik
Örnek 5: 5 kDa'lEk ultrafiltrasyon aracmEgS/la uygulama etkisi.
Ultrafiltrasyon uygulamasü dogrudan etki aracmgßtla veya diger kontamine etme
molekülleri ile bir fenomen sinerjisi araCJJgßlla bir inflamatuar yanmli baslattlrnasna
katimalarria karsLIkoymak amacLyla küçük moleküller aracilgyla kontaminasyonu
azaltmay veya ortadan kald rmayl amaçlar.
Deneyler, her ikisi kISmen bozulmus PGN (TLR2 ve NOD2 yan tlarj) ve LPS (TLR4
yanitii)l ile kontamine edilen E1565 ve Lab3943 matrisleri üzerinde yürütülmüstür.
kDa filtrasyonu 25 mL/dakikaltlî bir ortalama oranda gerçeklestirilmistir. FiltratlarIi
olmustur.
Ultrafiltrasyonun etkililigini kontrol etmek üzere baslang çta hücre yanitlari ifiltrattan
gelen numunelerden ölçülmüstür ve retentat fraksiyonlar baslangLçt solüsyonunun ( geçisi akabinde geri kazan Im stin.
Ultrafiltrasyon akabinde, baslangî,` numunesinde retentatm sürekli enjeksiyonu ile
kapali bir döngüde yürütülmüstür. Filtratmi uzaklastmilînasiî nedeniyle sviî kaybini?
dengelemek üzere, numune hacmi PPI eklenmesi aracmgwla sürekli olarak baslangî;
hacmine ayarlanmßtî. Bu durumda, hücre testleri 1 saat, 2 saat ve 3 saat
ultrafiltrasyon akabinde yapilan numunedeki numuneler üzerinde gerçeklestirilmistir.
E1565 matrisine yönelik sonuçlar Sekil 17'de gösterilir.
Retentat fraksiyonlaani indükledigi yanitlar dört hücre testindeki filtrelenmemis
numunelere yönelik gözlemlenenler ile aynid r. Ancak, Raws ve HEK-NOD2
hücrelerindeki Filtrat fraksiyonlar na yaniti olarak büyük oranda bir inflamatuar yant
gözlemlenmistir. Bu veriler, özellikle agregalar formunda olmalari halinde, PGN ve LPS
olmamak üzere PGN depolimerizasyon ürünlerini saglayan filtre sirlin esigi (5 kDa) ile
tutarlWT,. Diger yandan, retentatta inflamatuar yanitta azalma olmamasm filtrede
yalngca bir geçisin matrisin inflamatuar yanmîtü azaltmada yetersiz oldugunu
gösterir. Aslmida, Retentat/Filtrat fraksiyonlarE arasîida bölünmenin 25 ila 1'dir, bu
küçük inflamatuar molekülleri uzaklastîmada yetersizdir.
Sürekli ultrafiltrasyon, öngörülebilir olan HEK-NOD2 hücrelerinde ve ayrma Raws ve
HEK-TLR2 hücrelerinde indüklenen yan IZazaltmada yeterlidir. PGN ve LPS ile E1565
kontaminasyonu göz önüne aldegI'ida, son iki hücre tipinde azalan yarim, küçük
inflamatuar moleküllerin sinerjik aktivitesinin bir azaltlele kesinlikle iliskilidir.
Lab3943 matrisine yönelik sonuçlar Sekil 18'de gösterilir.
Beklendigi üzere, MDP ile iliskili bir inflamatuar aktivitesi filtratta bulunur (HEK-
NOD2). Kayda deger bir yanI ayrßa HEK-TLR4 hücrelerinde gözlemlenmistir. Bu
sonuç, bunun filtreden geçmesini saglayarak LPS'nin E1565 sablonunda mevcut
olandan daha az birikmis bir yapßal konfigürasyonda oldugunu gösterir,.
bir azalmasi Ne Raws hücreleri ve HEK-TLR2'nin (sinerjik islev) reaktivitesinde daha az
ancak kayda deger bir azalma araciligLyla görülebilen, PGN depolimerizasyon
ürünlerinin yükünü azaltmada etkilidir.
Örnek 6: Enzim uygulamalarini n etkisi.
Bu testlerin amacm endüstriyel enzimlerin glikoz polimer matrislerinde mevcut olan
kontaminantlarmi pro-inflamatuar reaktivitesini azaltma yetenegini test etmektir.
Numuneler %32,de (agElEK/hacim) hazîlanmßtl ve asagîiaki açklanan kosullar
altîida enzimlerin varlEgIida uygulanmßt. Uygulama akabinde, enzimler Isttma
aracmgiýla etkisiz hale getirilmistir, solüsyonlar 0.22 pm steril filtre üzerinde
filtrelenmistir ve akabinde hücre testlerinde kullanlmss'tr'.
Endüstriyel üç enzim haz rlan s kontaminant yükünü azaltma yeteneklerine yönelik test
edilmistir:
- Mannaway®: 4 saat ve 24 saat boyunca %O.4'te (hacim/hacim), pH 10'da,
50°C'de inkübasyon
inkübasyon.
inkübasyon.
Iki matris asaglaki unsurlarn test edilmesine yönelik seçilir: E3063 (az miktarda
bozulan PGN ve LPS eserleri ile yüksek kontaminasyon) ve E5250 (düsük PGN
kontaminasyonu ve PGN ve LPS haricinde inflamatuar moleküllerin varllg ).
Mannaway®“e ait iki boyanin uygulama etkileri Sekil 19'da gösterilir.
Enzim solüsyonunun P-11.11 matrisine (kontaminasyon olmamasîjli kontrolü)
eklenmesi Raws hücreleri, HEK-TLR2 veya HEK-TLR4'te inflamatuar yanI
indüklemez. Eser miktarlarda PGN bozulma ürünlerinin varlEgîöne sürülerek, HEK-
NOD2 hücrelerinde küçük bir artma gözlemlenmistir. Ancak, bu sonuçlar deney
kosullarIida kullanman enzimin herhangi bir büyük miktarda pro-inflamatuar
kontaminantlar meydana getirmedigini gösterir.
E3063 matrisi üzerindeki testler Raws ve HEK-TLR2 hücrelerindeki yanltlarda bir
azalma olmasi Inedeniyle enzimin büyük bir olasilikla PGN'nin zaylfi bir Iitik islevine
sahip oldugunu gösterir. Uygulama, kismi bir PGN bozulmas_ile tutarlFiolan, HEK-
NOD2 hücrelerindeki yantta bir artmaya neden olur. Diger yandan, HEK-TLR4
hücrelerindeki yanIta bir artma ayrEa gözlemlenir. Enzim hazllanSIimi
kontaminasyon meydana getirmemesi nedeniyle, LPS'nin meydana gelmesi büyük
olasmIsla matrisin kendisinden bir kontaminant salmnüaynakllî.
E5250 matrisinin enzimatik uygulamasüdört hücre tipindeki inflamatuar yanIta bir
artma indükler. Orijinal olarak, bu matris zaym inflamatuar yanmarü
tetiklemistir. DolaysLyla, TLR2 ve TRL4 yantlarIidaki artma enzimin matristen PGN ve
LPS tipi kontaminantlari Serbest binaktig'ni öne sürer.
Mannaway® yayg n bir sekilde gida ürünlerinde aritma ajan olarak kullanillr. Elde
edilen sonuçlar büyük olasilikla enzimin, genellikle 0.22 um filtre üzerinde bir filtrasyon
adiTinHaracligyla uzaklastmtian makro-kompleksleri (bakteriyel debrisi) ayrstmdigmm
öne sürer. Bu inflamatuar moleküllerin çözülmesi araclgjila enzim, bunlarîi hücre
testlerinde yan [tlarEindüklemek üzere erisilebilir hale getirmistir.
E5250 SEBro®TL araCJJggila matrisin uygulama etkileri Sekil 20'de gösterilir.
Enzim solüsyonunun P-11.11 matrisine eklenmesi, deney kosullarnda kullanman
enzimin herhangi bir kontaminant saglamadEgmiD göstererek, dört hücre tipinin
tamam nda inflamatuar yantLlndüklemez.
E5250 matrisinin uygulamasi Raws ve HEK-TLR2 hücrelerindeki inflamatuar yan tlarda
az miktarda bir azalma indükler. Enzim baslica beta-glukanaz özelliklerine yönelik
aç klanin. Ancak, gözlemlenen selüler yanitlarn azaltilmasi IHEK-NOD2 hücrelerinin
arttmImS bir yanmüile birlikte gelir. Bu veriler, enzim haleanSîtmi ayrîia bir PGN
çözebilen aktivite içerdigini gösterir.
PGN bozulma ürünlerinin meydana gelmesine paralel olarak, TLR4 yanmîida küçük bir
artma enzim varI glrtda gözlemlenirken, ikinci kontamine edilmez. Önceden
bahsedildigi üzere, büyük olasUlkla enzim Mannaway® ile gözlemlenenden daha az
oranda inflamatuar kontaminantlar serbest b rakmist r.
P-11.11 matrisi içine enzim hazllanîslîm eklenmesi, HEK-TLR4 hücrelerinde güçlü bir
inflamatuar yanEtl ve Raws ve HEK-TLR2 hücrelerinde zayI ancak kayda deger yanmar
indükler. Bu veriler, enzimin LPS ve PGN eserleri ile kontamine edildigini gösterir.
Enzimin E3063 matrisin eklenmesi, HEK-NOD2 hücrelerindeki yanma bir artma ile
birlikte gelen, TLR2'deki yanma az miktarda bir azalma indükler. Bu veriler,
SEBPro®FL100'ün PGN üzerinde düsük Iitik isleve sahip oldugunu gösterir. Ancak,
bunun kullanimi izorunlu olarak LPS'yi ortadan kald'rmak üzere dekontaminasyon
öncesinde bir adim gerektirecektir.
Örnek 7: Reçinelerin geçirilmesi aracillglyla uygulama etkisi
Bu testlerin amac: endüstriyel reçinelerin glikoz polimer matrisinde mevcut olan
kontaminantlarü tutma ve dolaysgla bu matrislerin pro-inflamatuar reaktivitesini
azaltma yetenegini test etmektir.
Testler, üretim döngüsünde (TLR2, TLR4 ve NOD2 yanttlarj bulunabilen pro-
inflamatuar moleküllerin çesitli tipleri ile kontamine edilmesi nedeniyle E1565 matrisi
(steril su içinde %32 agIlIs/hacimde çözünmüstür) ile gerçeklestirilmistir.
Deneylere yönelik olarak, dekontamine edilecek solüsyon her bir reçinenin (yatak
hacmi) 20 mLisini içeren bir kolon üzerinde sürekli olarak ayr stlnlm st r. inflamatuar
reaktiviteye yönelik hücre testleri kolon üzerinden geçmesinden önce (kontaminasyon
kontrolü) ve akabinde solüsyonun 4 hacimli (geçis 5) ve 10 hacimli (geçis 11) geçisi
akabinde geri kazan Ian numuneler üzerindeki solüsyon kullan Iarak
gerçeklestirilmistir. Bu prosedür, glikoz polimer varlgmiî'i reçinelerin bir satürasyon
fenomenine neden olup olmadgßiîkontrol etmek üzere kullanEIInßtI.
Sonuçlar Sekil 22'de gösterilir.
FarklLireçineIer üzerindeki solüsyonun bölümü E1565 Raws hücreleri ile temas
halindeki matrisin inflamatuar yan tinda bir azalmaya neden olur. FPX66 haricinde,
diger reçinelere yönelik azalma yaniti. en az %50'dir. Bu reçinenin E1565 matrisinde
bulundurulan pro-inflamatuar aktivitesine sahip kontamine edici molekülleri
uzaklastiî'imak üzere en etkili oldugunu göstererek, azalma SD2 reçinesini geçmesi
akabinde %70'e ulasmîstl. Tüm durumlarda, geçitler 5 ile 11 araslida kayda deger
herhangi bir fark gözlemlenmemistir, bu herhangi bir destek satürasyon fenomenini
hariç bmakî.
E5250 matrisine göre HEK-TLR2 hücrelerinin reaktivitesi, bu uygulamalarli PGN yükü
kontaminantIiDazaltmada etkisiz oldugunu göstererek, farklüreçinelerden geçmesi
akabinde büyük oranda degistirilmez.
azaltmada oldukça etkili olduklarini gösterir. Bu veriler, bu iki reçinenin LPS-benzeri
moleküllere yönelik yüksek bir tutma kapasitesine sahip oldugunu gösterir. Aksine,
diger reçineler kontaminantFtutmada az veya tamamen etkisizdir.
Son olarak, FPX66'nm tamamen etkisiz olmasüharicinde, farklüreçineler matrise göre
HEK-NOD2 hücrelerinin yanEtIarD orta derecede azaItI. Ancak, gözlemlenen etki,
reçinelerin PGN bozulma ürünlerini tutmaya dair düsük bir kapasiteye sahip oldugunu
göstererek düsük kaII.
LPS eserlerinin varlEgZharicinde, E1565 matrisi PGN ve bunun bozulma ürünleri ile
oldukça kontamine edilir. Bunlar tek basna az inflamatuar reaktiviteye sahiptir, diger
yandan, PGN ve LPS gibi TLR'ler ile etkilesen diger inflamatuar moleküller ile sinerjik
olarak hareket edebilir ve toplam inflamatuar yaniti siddetlendirebilir.
Bu örnekteki testler, çesitli reçineleri geçmesi akabinde Raws hücrelerinin
reaktivitesinde kayda deger bir azalma gösterir. Toplam inflamatuar yanEttaki bu
azalma, reçinelerin geçisinin TLR2 yanmarliîmodifiye etmemesi nedeniyle bir PGN
tutulmasmin arkas Itdan gelmez.
Yedi taneden yalnütca iki reçine (MN- TLR4 yanmîiüazaltmada büyük
ölçüde etkilidir. Dolaylsiyla, Raws hücrelerinde gözlemlenen inflamatuar yan ttaki
azalmantm, her iki reçinedeki matrisin geçisi akabinde LPS tutulmasuile en az ksmen
ardlsik oldugu sonucu çikartilabilir.
FPX66 haricinde, tüm reçineler orta derecede PGN*nin bozulma ürünlerini
tutar. inflamatuar yanltlardaki siddetlenme üzerinde bu küçük moleküllerin etkisi göz
önüne alndglida, bu sonuçlar reçinelerin basima etkisinin, bu küçük moleküller ile
iliskili sinerjik etkileri ortadan kald mak oldugunu gösterir.
FPX66 matrisine yönelik oldugu üzere, bunun etkisi büyük olasmEla LPS, PGN ve
bunun bozulma ürünleri dßîida inflamatuar moleküllerin ortadan kaldMmasJile
ilgilidir. Bu hipotez, bu reçinenin azaltl'mîs toplam inflamatuar yanmlida daha az etkili
oldugu durumu ile tutarldLn.
Birlikte ele al ndlg nda, bu veriler dikkatli bir sekilde seçilen birkaç endüstriyel reçine ile
matrislerin uygulanmasini n, PGN dis nda inflamatuar kontaminatlarl uzaklast rmada ve
ayrca bu moleküller aras nda gözlemlenen sinerjiyi azaltmada etkili olabilecegini
gösterir. Mevcut çalßmanm Örnek 47ü belirli endüstriyel kömürlerin PGN'nin
uzaklastlmnasîida özellikle etkili oldugunu göstermistir. Dolaysgla, uygulamalari iki
tipini içeren bir prosesin kontaminantlarli farklüailelerini hedeflemesi ve inflamatuar
yarim içermeyen matrisler saglamas :beklenir.
Claims (2)
- ISTEMLER Asagidaki adimlari iiçeren, glukoz polimerlerinde veya hidrolizatlarinida pro- inflamatuar moleküllerin varlig veya yap si iüzerindeki bir üretim adim nirii veya üretim adimlaririin etkisini veya bir saflastiiima ad miriin veya saflastinma adFmIarIiITi etkisini test etmeye yönelik bir yöntem olup: a) glukoz polimerleri veya hidrolizatlarmiîi saglanmasü b) admn a)'da saglanan glukoz polimerlerinde veya hidrolizatlarlida pro- inflamatuar moleküllerin saptanmasEveya analiz edilmesi; c) admn a),da saglanan glukoz polimerleri veya hidrolizatlarüüzerinde üretim veya saflastlma adEnmiIi veya admnlarîim gerçeklestirilmesi; d) admn c)'den sonra elde edilen glukoz polimerleri veya hidrolizatlarlida pro- inflamatuar moleküllerin saptanmavaeya analiz edilmesi; e) adim 0)'nin, ad mlar b) ve d)'de saptanan veya analiz edilen glukoz polimerlerine veya hidrolizatlarina yönelik pro-inflamatuar moleküllerin varlgi iveya yap si iüzerindeki etkinliginin veya etkisinin belirlenmesi, pro- inflamatuar moleküllerin miktarinda bir azalma veya bu pro-inflamatuar moleküllerinden bazllarCi adTn c),nin, glukoz polimerlerini veya hidrolizatlarîtEidekontamine etmeye yönelik etkinliginin göstergesidir; özelligi, glukoz polimerleri veya hidrolizatlarîida pro-inflamatuar moleküllerin saptanmasmia veya analiz edilmesine yönelik adînmi, TLR2 reseptörünü (Toll Benzeri Reseptör 2) ve transkripsiyonunun, TLR2 sinyallesme yolagîim direkt kontrolü altIida oldugu raportör bir geni ifade eden bir hücre hattlimi kullanIdEgD in vitro inflamatuar yanÜ: testini içermesidir, pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptanm veya analiz edilir. Asagidaki adimlar içeren, glukoz polimerlerinin veya hidrolizatlaririini üretilmesine veya saflastinilmasinia yönelik optimize yöntem olup: a) glukoz polimerleri veya hidrolizatlarmîi saglanmasü b) admn a)'da saglanan glukoz polimerlerinde veya hidrolizatlarnda pro- inflamatuar moleküllerin saptanmas :veya analiz edilmesi; c) glukoz polimerleri veya hidrolizatlarnda bulunan pro-inflamatuar moleküller için uygun olan, glukoz polimerlerinin veya hidrolizatlarlrtin üretilmesine veya saflastmumasmla yönelik adIn veya ad mlarLm seçilmesi; d) adim a)'da saglanan glukoz polimerleri veya hidrolizatlarl !üzerinde seçilen üretim veya saflastlnma ad mlni n veya adimlarlniln gerçeklestirilmesi ve e) adFm d)”den sonra elde edilen glukoz polimerlerinde veya hidrolizatlarlTiida pro-inflamatuar moleküllerin saptanmasH/eya analiz edilmesi; özelligi, glukoz polimerleri veya hidrolizatlarîida pro-inflamatuar moleküllerin saptanmaslia veya analiz edilmesine yönelik adInIi, TLR2 reseptörünü (ToII Benzeri Reseptör
- 2) ve transkripsiyonunun, TLR2 sinyallesme yolagîimi direkt kontrolü aItIida oldugu raportör bir geni ifade eden bir hücre hattlimi kullanIdEgD in vitro inflamatuar yantt testini içermesidir, pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptanm veya analiz edilir. Önceki istemlerden herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi in vitro inflamatuar yan t. testinin ayrca, glukoz polimerlerinin veya hidrolizatlarlnin, MDP- veya LPS-duyarll,l makrofaj-farkllasmali lTHP-1 hücre hatt ile temas ettirilmesini içermesidir, pro-inflamatuar moleküller, bu hücre hattmtaraflndan üretilen RANTES veya TNF-a miktarlîtin ölçülmesi yoluyla saptanm veya analiz Önceki istemlerden herhangi birinde tanmnlanan yöntem olup, özelligi in vitro inflamatuar yanî testinin ayrîia, glukoz polimerlerinin veya hidrolizatlarlili, transkripsiyonunun inflamatuar sinyallesme yolaklarnm direkt kontrolü altIida oldugu raportör bir gen ile transfekte edilmis bir makrofaj hattüile temas ettirilmesini Içermesidir, pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptanln veya analiz edilir. Önceki istemlerden herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi in vitro inflamatuar yant testinin ayr ca, glukoz polimerlerinin veya hidrolizatlarirlini, TLR4 reseptörünü ve transkripsiyonunun, TLR4 sinyallesme yolaklarßiî'i direkt kontrolü aItIida oldugu raportör bir geni ifade eden bir hücre hattüile temas ettirilmesini içermesidir, pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptanl veya analiz edilir. Önceki istemlerden herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi in vitro inflamatuar yani testinin ayrca, glukoz polimerlerinin veya hidrolizatlarmmt, NOD2 reseptörünü ve transkripsiyonunun, NOD2 sinyallesme yolaklarln n direkt kontrolü alt nda oldugu raportör bir geni ifade eden bir hücre hatti lile temas ettirilmesini içermesidir, pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptanm veya analiz edilir. Önceki istemlerden herhangi birinde tanmnlanan yöntem olup, özelligi in vitro inflamatuar yanm testinin, glukoz polimerlerinin veya hidrolizatlarliîti asagElakiler ile temas ettirilmesini içermesidir: a. MDP- veya LPS-duyarlm makrofaj-farklüasmalü THP-1 hücre hattm pro- inflamatuar moleküller, bu hücre hattutarafndan üretilen RANTES veya TNF-d miktarlrtirii ölçülmesi yoluyla saptanin veya analiz edilir ve b. transkripsiyonunun inflamatuar sinyallesme yolaklarmlni direkt kontrolü alt nda oldugu raportör bir gen ile transfekte edilmis makrofaj hatt, pro- inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptan T veya analiz edilir ve c. TLR2 reseptörünü ve transkripsiyonunun TLR2 sinyallesme yolaklarliîi direkt kontrolü altîida oldugu raportör bir geni ifade eden bir hücre hattE pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptanl veya analiz edilir ve d. NOD2 reseptörünü ve transkripsiyonunun NOD2 sinyallesme yolaklarîimi direkt kontrolü altIida oldugu raportör bir geni ifade eden bir hücre hattÇ pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptanLn veya analiz edilir ve e. TLR4 reseptörünü ve transkripsiyonunun TLR2 sinyallesme yolaklarln n direkt kontrolü alt nda oldugu raportör bir geni ifade eden bir hücre hatti, pro-inflamatuar moleküller, raportör genin aktivitesinin veya sinyalinin ölçülmesi yoluyla saptanin veya analiz edilir. Önceki istemlerden herhangi birinde tanmnlanan yöntem olup, özelligi in vitro inflamatuar yarim testinin ayrma, glukoz polimerleri veya hidroilzatlarîtli, bir immünite reseptörü ile transfekte edilmemis kontrol hattjile temas ettirilmesini içermesidir. Önceki istemlerden herhangi birinde tanlmlanan yöntem olup, özelligi pro- inflamatuar moleküllerin, tercihen PGN'Ier, LPS'Ier, Iipopeptitler, PGN depolimerizasyon ürünleri, özellikle MDP, f-MLP gibi formillenmis mikrobiyal peptitler ve B-glukanlardan seçilen bakteriyel kökenli moleküller olmaswr. Önceki istemlerden herhangi birinde tanmnlanan yöntem olup, özelligi üretim veya saflastlma adînnîi veya ad Inlarliîi, ßîuygulamasü asidifikasyon, aktif karbon üzerinden geçirme, adsorpsiyon reçineleri üzerinden geçirme, ultrafiltrasyon, filtrasyon veya kimyasal veya enzimatik hidroliz admnlarlidan veya kombinasyonlarîidan seçilmesidir. .Önceki Istemlerden herhangi birinde tanlmlanan yöntem olup, özelligi glukoz polimerlerinin, ikodekstrin ve maltodekstrinler, özellikle dallanm s veya dallanmamis maltodekstrinlerden seçilmesidir ve glukoz polimeri hidrolizatlari,i dekstroz monohidrat gibi toplam hidroliz ürünüdür. Önceki istemlerden herhangi birinde tanmnlanan yöntem olup, özelligi glukoz polimerleri veya hidrolizatlarIiIi numunelerinin, özellikle 30 kDa'daki bir 811. esigi ile önceden filtrelenmesidir ve filtrat, testte kullanman hücre hattüile temas
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1254935 | 2012-05-29 | ||
| FR1256848 | 2012-07-16 | ||
| FR1259923 | 2012-10-18 | ||
| FR1350353 | 2013-01-16 | ||
| FR1352748 | 2013-03-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201807961T4 true TR201807961T4 (tr) | 2018-06-21 |
Family
ID=48699841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/07961T TR201807961T4 (tr) | 2012-05-29 | 2013-05-28 | Glukoz polimerleri ve glukoz polimerlerinin hidrolizatlarının üretilmesine yönelik döngüleri dekontamine etme yöntemleri. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20150125871A1 (tr) |
| EP (1) | EP2856154B1 (tr) |
| JP (1) | JP6244356B2 (tr) |
| CN (1) | CN104364648B (tr) |
| BR (1) | BR112014029808B1 (tr) |
| CA (1) | CA2873376C (tr) |
| ES (1) | ES2672980T3 (tr) |
| IN (1) | IN2014DN09655A (tr) |
| MX (1) | MX356270B (tr) |
| TR (1) | TR201807961T4 (tr) |
| WO (1) | WO2013178931A1 (tr) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6454682B2 (ja) | 2013-03-26 | 2019-01-16 | ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ | グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカンの量を決定する方法およびキット |
| MX377035B (es) * | 2014-02-07 | 2025-03-07 | Roquette Freres | Ensayo biológico de peptidoglicanos. |
| EP3119813B1 (fr) * | 2014-03-21 | 2023-01-04 | Roquette Frères | Procede optimise de decontamination de production de polymeres de glucose et d'hydrolysats de polymeres de glucose |
| FR3037063B1 (fr) * | 2015-06-04 | 2017-05-19 | Roquette Freres | Procede optimise de decontamination de l'amidon utilise comme matiere premiere pour l'obtention de polymeres de glucose destines a la dialyse peritoneale |
| CN106755199A (zh) * | 2017-02-14 | 2017-05-31 | 青岛力腾化工医药研究有限公司 | 一种艾考糊精的制备方法 |
| CN109400722A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-03-01 | 华仁药业股份有限公司 | 一种用于去除淀粉水解物中肽聚糖的方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3689863T2 (de) | 1985-06-22 | 1995-01-05 | Ml Lab Plc | In kontinuierlicher Peritonealdialyse verwendete Polymere. |
| FR2716199B1 (fr) | 1994-02-15 | 1996-04-26 | Roquette Freres | Procédé de fabrication d'un hydrolysat d'amidon à faible indice de polymolécularité, nouvel hydrolysat d'amidon ainsi obtenu et son utilisation en dialyse péritonéale. |
| US7118857B2 (en) * | 2004-02-27 | 2006-10-10 | Baxter International Inc. | Methods and compositions for detection of microbial contaminants in peritoneal dialysis solutions |
| KR101352222B1 (ko) * | 2005-12-22 | 2014-02-04 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 의료용 제품에서 비-내독소 발열성 오염물을 보다 잘검출할 수 있는 개선된 단핵구 활성화 시험 |
| FR2897869B1 (fr) | 2006-02-28 | 2011-05-06 | Roquette Freres | Polymeres solubles de glucose hautement branches pour la nutrition enterale, parenterale et pour la dialyse peritoneale |
| US20090239819A1 (en) * | 2008-03-20 | 2009-09-24 | Run Wang | Peritoneal dialysis solution test method |
| FR2945043B1 (fr) | 2009-04-30 | 2019-07-26 | Roquette Freres | Procede de purification de polymeres de glucose destines aux solutions de dialyse peritoneale |
| FR2966843B1 (fr) | 2010-11-03 | 2013-04-26 | Roquette Freres | Procede de decontamination d'hydrolysats d'amidon pour la preparation de polymeres de glucose destines a la dialyse peritoneale |
| MX350641B (es) * | 2011-04-08 | 2017-09-11 | Roquette Freres | Metodos para detectar contaminantes de polimeros de glucosa. |
| FR2978774B1 (fr) * | 2011-08-02 | 2015-02-20 | Roquette Freres | Methodes de detection des contaminants des circuits de production de polymeres de glucose |
| CN103492778A (zh) * | 2011-04-21 | 2014-01-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于将传热介质管固定至容器的装置 |
-
2013
- 2013-05-28 IN IN9655DEN2014 patent/IN2014DN09655A/en unknown
- 2013-05-28 CN CN201380029037.0A patent/CN104364648B/zh active Active
- 2013-05-28 US US14/403,600 patent/US20150125871A1/en not_active Abandoned
- 2013-05-28 ES ES13731837.4T patent/ES2672980T3/es active Active
- 2013-05-28 WO PCT/FR2013/051181 patent/WO2013178931A1/fr not_active Ceased
- 2013-05-28 EP EP13731837.4A patent/EP2856154B1/fr active Active
- 2013-05-28 MX MX2014014551A patent/MX356270B/es active IP Right Grant
- 2013-05-28 BR BR112014029808-4A patent/BR112014029808B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-05-28 CA CA2873376A patent/CA2873376C/fr active Active
- 2013-05-28 TR TR2018/07961T patent/TR201807961T4/tr unknown
- 2013-05-28 JP JP2015514558A patent/JP6244356B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2020
- 2020-06-29 US US16/915,087 patent/US20200400650A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6244356B2 (ja) | 2017-12-06 |
| ES2672980T3 (es) | 2018-06-19 |
| CA2873376C (fr) | 2022-04-19 |
| EP2856154B1 (fr) | 2018-03-14 |
| US20150125871A1 (en) | 2015-05-07 |
| CN104364648A (zh) | 2015-02-18 |
| MX356270B (es) | 2018-05-18 |
| JP2015520616A (ja) | 2015-07-23 |
| US20200400650A1 (en) | 2020-12-24 |
| EP2856154A1 (fr) | 2015-04-08 |
| IN2014DN09655A (tr) | 2015-07-31 |
| MX2014014551A (es) | 2015-07-06 |
| CA2873376A1 (fr) | 2013-12-05 |
| BR112014029808B1 (pt) | 2021-12-07 |
| BR112014029808A2 (pt) | 2017-06-27 |
| CN104364648B (zh) | 2017-04-26 |
| WO2013178931A1 (fr) | 2013-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TR201807961T4 (tr) | Glukoz polimerleri ve glukoz polimerlerinin hidrolizatlarının üretilmesine yönelik döngüleri dekontamine etme yöntemleri. | |
| JP6310973B2 (ja) | グルコースポリマーに含まれる汚染物質の検出方法 | |
| US20230279455A1 (en) | Optimized method for decontaminating production of glucose polymers and glucose polymer hydrolyzates | |
| TR201910239T4 (tr) | Periton diyalizine yönelik amaçlanan glukoz polimerlerinin elde edilmesine yönelik hammadde olarak kullanılan nişastanın dekontaminasyonuna yönelik optimize edilen proses. |