TR201808037T4 - Tek bir döngüde kombine koşullandırma ve kemo seçimine yönelik yöntem. - Google Patents

Abstract

Radyasyonsuz hematopoetik kök hücre (HSC) nakline yönelik bir yöntem, bir ön-koşullandırma adımı olarak 6TG gibi bir pürin bazı analogunun 2 ila 10 mg/kg vücut ağırlığındaki bir veya iki dozunun memeli bir özneye uygulanması içerir. Yöntem ayrıca hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz (HPRT)-eksikliği olan donör HSC'lerin ön-koşullandırma adımında 48 ila 72 saatte özneye melezlenmesini ve 1 ila 5 mg/kg'lık pürin bazı analogunun melezleme adımını takiben iki ila sekiz hafta boyunca her iki ila dört günde bir özneye uygulanmasını içerir. Yöntem, ön-koşullandırma yokluğunda radyasyon aracılığıyla gerçekleştirilir. Bu yüzden, özne nakil işlemine yönelik hazırlık yapılırken miyeloablatif radyasyon ile tedavi edilmez ve bu yüzden özne miyeloablatif radyasyon ile indüklenen toksisiteye sahip değildir.

Description

TARIFNAME TEK BIR DÖNGÜDE KOMBINE KOSULLANDIRMA VE KEMO SEÇIMINE YÖNELIK YÖNTEM FEDERAL OLARAK DESTEKLENEN ARASTIRMA ILE ILGILI AÇIKLAMA Bu bulus, Hibe No. Ulusal Saglik Enstitüsü tarafindan verilen Al067769'un destegiyle Devlet destegi ile yapilmistir. Hükümet bu bulusa yönelik belirli haklara sahiptir.

ALTYAPI Hematopoetik kök hücre nakli (HSCT), birçok kalitsal bozukluk ve Ienfohematopoetik malignitelere (1) yönelik tedavinin bir dayanak noktasidir. Ilaveten, hematopoetik kök hücreleri (HSC) genellikle ex vivo gen terapisine yönelik önemli bir hedefi temsil eder.

HSC'ye gen aktarimi, normal BM ila sitotoksik ilaçlarin monogenik kusurlarinin düzeltilmesine hem de ilaç duyarliliginin degistirilmesine yönelik potansiyel bir strateji saglar. Bu uygulamalar, önemli bir terapötik potansiyele sahiptir, ancak HSC'ye düsük gen aktarimi ile kisitlanir. Ex vivo manipülasyon, fibronektin-destekli gen aktarimi ve HSC önceki gen aktariminin kuvvetlendirilmesi sirasinda baglanmayi minimuma indirilmesine yönelik gelistirilmis sitokinler gibi yakin zamandaki çalismalar, Insan hücrelerine gen aktariminin etkinligini ve insan gen terapisi deneylerini (2) gelistirmistir.

Ancak, HSC'ye gen aktariminin etkinligi ve çok sayida transdüse edilen hücrelerin melezlenmesi kanser ve monogenetik hastaliklarin basarili bir sekilde tedavi edilmesine yönelik bu teknoloji uygulamasini kapsamli hale getirmek üzere büyük bir zorluk olarak kalmaya devam eder.

Gen-modifiyeli HSC'nin melezlenmesini gelistirmek ve HSCT'den sonra dihidrofolat redüktaz (DHFR) (3) veya çoklu ilaç-direnci geni 1 (MDR1) edilmistir ancak kabul edilemez toksisite (5) veya yetersiz seçim etkinligi (6) nedeniyle genel olarak basarisiz olmustur. Mevcut olarak, OG-metilguanin-DNA-metiltransferaza halinde BCNU veya temozolomide karsi bunlarin kemo koruma saglama kabiliyetine yönelik test edilmistir, ancak bu ajanlar önemli bir toksisite riskine neden olur ve yakin zamandaki gözlemler mutant MGMT'nin yüksek seviyelerde (8) ifade edildiginde seçici yasayan hücrelerin 6TG ile in vivo olarak seçilmesine yönelik bir seçim stratejisi açiklanmistir. Ancak, bu patent basvurusunda, isinlama islemi in vivo seçiminden önce önceden kosullandirmaya yönelik yine kullanilir veya iri vivo seçimi 6TG uygulamasi arasinda iyilesme dönemi ile döngüler halinde gerçeklestirilir. ilaveten, önerilen 6TG dozu yüksektir ve uzun bir süre boyunca uygulanir (55 gün boyunca 200 mg/kg toplam doz). ilaveten, BM içindeki HPRT ifadesini devre disi birakmak ve akabinde in vivo olarak 6TG ile donör hücreleri seçmek üzere bir yaklasim tarafindan rapor edilmistir. Bu rapor, shRNA hedefleyici Hprt'yi ifade eden Ientiviral vektör ile HSC'de HPRT inaktivasyonunun fizibilitesini ve bu degistirilen hematopoetik hücrelere yönelik farelerde in vivo olarak 6TG ile kuvvetlendirme islemini göstermistir.

Ancak, bu raporda, önceden-kosullandirma islemi yine toplam vücut isinlamasi ile gerçeklestirilmistir ve in vivo kemo seçimi aktarim-sonrasi en az 4 hafta kadar baslatilmamistir. Ek olarak, 6TG kisa bir atis olarak veya sadece orta derecede iligi baskilayici olarak seçilen dozajlarda uygulanmistir ve yeterli HSC transdüksiyon seviyelerinin çalismalarda kullanilan ikinci-nesil Ientiviral vektörler tarafindan elde edilip edilmedigi açik degildir. Sonuç olarak, rapor edilen melezleme seviyeleri degisken ve nispeten orta derecede olmustur.

Kemik iligi hücreleri yeniden yapilandirilirken toksisiteden kaçinan daha etkili HSCT yöntemlerine yönelik bir ihtiyaç devam eder.

Referanslar: 2067. (5)Zaboikin M, Srinivasakumar N, Schuening F. Cancer Gene Ther. (6) Southgate T. Fairbairn LJ. Expert Rev Mol Med. 2004;6:1-24.

Ilkel hematopoetik hücrelerin in vivo seçimi (Patent terapötik alkilleyici ajanlarin toksisitesinden korumak üzere gen terapisine yönelik mutant alkiltransferazlarinin kullanimi (Patent KISA A IKLAMA Bulus, radyasyonsuz bir hemapoetik kök hücre (HSC) nakli yönteminde kullanima yönelik bir pürin bazi analogu saglar, burada pürin bazi analogu 6-tiyoguanindir (öTG) ve burada yöntem asagidaki adimlari içerir: (a) bir ön-kosullandirma adimi olarak pürin bazi analogunun 2 ila 10 mg/kg vücut agirligindaki bir veya iki dozunun memeli bir özneye uygulanmasi; (b) hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz (HPRT)-eksikligi olan donör HSC'lerin ön-kosullandirma adiminda 48 ila 72 saatte özneye melezlenmesi ve (c) 1 ila 5 mg/kg'lik pürin bazi analogunun melezleme adimini takiben iki ila sekiz hafta boyunca her iki ila dört günde bir özneye uygulanmasi; burada yöntem ön-kosullandirmanin yoklugunda radyasyon araciligiyla gerçeklestirilir.

Bu yüzden özne nakil islemine yönelik hazirlik yapilirken miyeloablatif radyasyon ile tedavi edilmez ve bu yüzden özne miyeloablatif radyasyon ile indüklenen toksisiteye sahip degildir.

Bir pürin bazi analogunun temsil edici özellikleri, asagidaki unsurlari içerir: 6-tiyoguanin (6TG), 6-merkaptopürin (6-MP) ve azatiyopürin (AZA). Bazi düzenlemelerde, özneye uygulanan toplam 6TG dozaji 105 mg/kg'i asmaz; tipik olarak özneye uygulanan toplam 6TG dozaji 75 mg/kg'i asmaz. Bir düzenlemede. pürin bazi analogunun uygulanmasi her 3 günde bir gerçeklestirilir ve melezleme adimini takiben dört haftadan daha uzun süre sürmez.

Yöntem ile uyumlu olarak tedavi edilen özneler, %75'in üzerinde genetik olarak modifiye edilen hematopoetik hücreler gösterecektir. Bazi düzenlemelerde, özneler Nakledilecek olan HPRT-eksikligi olan HSC'Ier, teknikte uzman kisilerce bilinen klasik yöntemler kullanilarak HPRT-eksikligi ile elde edilebilir. Temsil edici yöntemler. bunlar ile sinirli olmamak üzere, çinko parmak nükleazlari (ZFN'Ier), transkripsiyonel aktivatör- benzeri efektör nükleazlar (TALEN'Ier), küçük parçali homolog rekombinasyon (SFHR) kalip zincirleri, inhibitör RNA'Iar (siRNA'Iar) veya mikroRNA'Iar (miRNA'Iar), antisens RNA'Iar, trans-zincirleme RNA'Iari, ribozimler, hücre içi antikorlar veya dominant negatif veya rekabetçi inhibitör proteinleri kodlayan dizilerin eklenmesini içerir. Nakledilen HSC'Ier otolog, sinjeneik veya allojenik olabilir.

Bazi düzenlemelerde, nakledilecek olan HPRT-eksikligi olan HSC'Ier genetik olarak modifiye edilmistir. Özne kalitsal veya genetik bir bozukluk, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonu veya edinilmis immün yetmezlik sendromu (AIDS) gibi maligniteye sahip olabilir. Donör HSC'Ierin genetik modifikasyonu, hücrelerin HPRT- eksiklige sahip olarak elde edilmesinin ötesine uzanabilir ve ayni zamanda bir durumu tedavi etme veya düzeltme islevi görür.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1A-1 B. 6TG kosullandirma rejiminin optimizasyonu. (SEKIL 1A) Bir doz- bulma çalismasi olarak, HPRT-wt fareleri, araç kontrolü ile ve Gün 1'de (grup basina n=3) veya sirasiyla Gün 1 ve Gün 3'te (n=3) 10 mg/kg olan iki doz ile belirtildigi üzere 2.5 ila 10 mg/kg araliginda olan 6TG dozlarinin degistirilmesi yoluyla i.p. olarak enjekte edilmistir. Birinci 6TG dozundan sonra Gün 4'te, paraformaldehit ile sabitlenen kemik kesitleri H&E ile boyanmistir ve BM histolojisi incelenmistir. Temsili fotomikrograflar (40 x büyütme) her bir 6TG kosullandirma rejimine yönelik gösterilir. (SEKIL 1B) Temsili fotomikrograflar, kontrol cihazi ve Gün 1 ve Gün 3'te 10 mg/kg 6TG olan iki dozdan olusan optimize kosullandirma rejimi ile tedavi edilen HPRT-wt farelerinden düsük (10x) ve yüksek (100X) büyütmede genel ve detayli BM histolojisini gösterir.

Histolojik analizler yukaridaki gibi Gün 4'te gerçeklestirilmistir.

Sekil 2A-2B. HPRT-eksikligi olan farelerde 6TG'nin kosullandirici dozlari ile enjeksiyondan sonra ilerleyici miyelotoksisite eksikligi ve 6TG kosullandirmasi ile tek basina düsük melezleme orani. (SEKIL 2A) HPRT-wt VE HPRT-eksikligi olan fareler, Günler 1 ve 3'te 10 mg/kg 6TG ile i.p. olarak enjekte edilmistir.

Birinci 6TG dozundan sonra Gün 7'de, paraformaldehit ile sabitlenen kemik kesitleri H&E ile boyanmistir ve BM histolojisi incelenmistir. Temsili fotomikrograflar (40 x büyütme) gösterilir. (SEKIL 28) Tedavi plani: HPRT-wt disi alici fareler (n=4), Gün-2'de 6TG'nin (10 mg/kg, i.p.) birinci kosullandirma dozunu almistir, akabinde HPRT-eksikligi olan erkek BM ile nakledilmistir, akabinde Gün 0'da 6TG'nin (10 mg/kg, i.p.) ikinci bir kosullandirma dozunu almistir. BM, birinci 6TG dozundan sonra Gün 7'de analiz edilmistir. H&E ile boyanan paraformaldehit ile sabitlenen kemik kesitleri (40 x büyütme) gösterilir.

Sekil 3. HPRT-wt karsisinda HPRT-eksikligi olan farelerde kronik düsük-doz 6TG miyelotoksisitesinin doz yaniti ve zaman seyri. HPRT-dogal suslu fareler ve HPRT-eksikligi olan fareler, yukarida her bir panelde gösterildigi üzere fakli 6TG dozlari ve araç kontrolü (grup basina n=3) ile her 3 günde bir tedavi edilmistir. HPRT-dogal suslu fareler için, histoloji tedavinin baslamasindan sonra 60 güne kadar asagidaki süre noktalarinda incelenmistir: HPRT-eksikligi olan farelerde, histoloji tüm hayvanlara yönelik Gün 60'ta incelenmistir. H&E ile boyanan paraformaldehit ile sabitlenen kemik kesitlerinin temsili fotomikrograflari (40x orijinal büyütme) gösterilir.

Sekil 4A-4B. Kombine 6TG kosullandirma ve in vi'vo kemo seçimi stratejisinin optimizasyonu. Tedavi plani: HPRT-wt disi alici fareler Gün -2'de 6TG'nin (10 mg/kg, i.p.) birinci kosullandirma dozunu almistir. akabinde Gün O'da 6TG'nin (10 mg/kg, i.p.) ikinci bir kosullandirma dozu ile birlikte HPRT-eksikligi olan erkek BM ile nakledilmistir. In vivo kemo seçimi akabinde belirtildigi üzere 2 hafta boyunca (SEKIL 4A) veya 4 hafta boyunca (SEKIL 48) her 3 günde bir 2.5 mg/kg veya 5.0 mg/kg 6TG olan tekrar eden i.p. enjeksiyonlari ile gerçeklestirilmistir. H&E ile boyanan paraformaldehit ile sabitlenen kemik kesitlerinden kemik iliginin temsili fotomikrograflari (40x orijinal büyütme) gösterilir.

Sekil 5. HPRT-wt alicilarinin kombine 6TG kosullandirmasi ve kemo seçimi kullanilarak HPRT-eksikligi olan donör-deriveli BM ile nakil isleminden sonra uzun-vadeli hematopoetik yeniden yapilandirma. Bar grafikleri, belirtildigi üzere 4 haftada (yani, kemo seçimi periyodunun bitiminden hemen sonra) ve nakil isleminden sonra 4 ayda, 7 ayda ve 12 ayda XY kromozom FISH analizi ile belirlendigi üzere kemik iliginde (BM) ve periferik kan Iökositlerinde (PBL) donör-deriveli hücrelerin yüzdesini gösterir.

DETAYLI A IKLAMA Bulus, 6-tiyoguaninin (6TG) 6TG miyelotoksisitede tiyoguanin nükleotidine hipoksantin- guanin fosforiboziltransferaz (HPRT)-aracili dönüsümünün önemli rolünden yararlanan yeni bir iri vivo kemo seçimi stratejisi saglar. HPRT-eksikliginin hematopoetik hücre gelisimi ve fonksiyonunu tek basina bozmamasi nedeniyle, nakil islemine yönelik kullanilacak olan hematopoetik hücrelerden uzaklastirilabilir. In vivo kemo seçimi stratejisi, HPRT-dogal suslu alicilarin hem iligi yok edici kosullandirmasi hem de donör hücrelerin tek döngülü bir in vivo kemo seçimi prosesine yönelik 6TG kullanilarak HPRT-eksikligi olan donör HSC'Ier ile gerçeklestirilen HSCT'yi içerir. Bulus, HPRT aktivitesindeki melezlenen HSC eksikligi 6TG'nin sitotoksik etkilerine oldukça dirençliyken 6TG'nin ekstra-hematopoetik dokularin üzerinde herhangi bir olumsuz etki olmadan seçici miyeloablatifi indükledigi bir dozajlama programinin gelistirilmesi ve kesfedilmesine baglidir. Bu kombine 6TG kosullandirma ve kemo seçimi stratejisi ile, düsük genel toksisite ile HPRT-eksikligi olan donör HSC'nin etkili ve yüksek melezlemesi elde edilebilir. In vivo kemo seçimindeki 6TG, HPRT-eksikligi olan donör (veya melezlenen) BM'nin kendini yenileyen, pluripotent HSC popülasyonunun büyütülmesi yoluyla immünofenotik olarak normal kemik iliginin (BM) uzun-vadeli yeniden yapilandirilmasina izin verir.

Oldukça etkili ve genellikle toksik-olmayan kosullandirma ve tek döngülü in vivo kemo seçimine yönelik burada açiklanan yöntem, HSCT melezleme etkinligi ve nakil islemi sonucunu gelistirmek ve ex vivo gen terapisinden sonra genetik olarak modifiye edilen hücrelere seçici bir avantaj saglamak üzere bir strateji olarak genellikle uygulanabilir. In vivo kemo seçimi stratejisi, HPRT-eksikligi olan donör HSC'nin hem ön-kosullandirma hem de tek döngülü kemo seçimine yönelik sadece 6TG veya diger bir pürin bazi analogu kullanir ve alici >%95 oraninda BM'nin degistirilmesi ile oldukça etkili melezleme ve uzun-vadeli yeniden yapilandirma saglayabilir. Bu strateji, genel olarak gen terapisinin kapsamini genisletmek üzere fazla sayida ex vivo olarak manipüle edilen HSC'nin melezleme isleminin gelistirilmesine yönelik uygulanabilir.

Tanimlar Bu uygulamada kullanilan tüm bilimsel ve teknik terimler, aksi belirtilmedigi sürece teknikte yaygin olarak kullanilan anlamlara sahiptir. Bu basvuruda kullanildigi üzere, asagidaki kelimeler veya ifadeler belirtilen anlamlara sahiptir.

Burada kullanildigi üzere, "radyasyonsuz hematopoetik kök hücre (HSC) nakli" alicinin radyasyon araciligiyla miyeloablatif kosullandirmaya tabi tutulmadigi anlamina gelir.

Bunun yerine, kosullandirma donör HSC'Ier ile melezlemeden önce (ve bu gün dahil olmak üzere) 48 saat boyunca tipik olarak uygulanan 6TG uygulamasi yoluyla elde Burada kullanildigi üzere, "HPRT-eksikligi olan" hem dogal olarak HPRT-eksikligi olan hücreleri hem de gen modifikasyonu yoluyla HPRT-eksikligi olan olarak elde edilen hücreleri içerir.

Burada kullanildigi üzere, "donör HSC'Ier" veya "donör hücreler" HSC'Ierin nakil alicisi veya diger bir özneden derive edilip edilmedigine bakilmaksizin melezlenecek hücrelere refere eder. Bu yüzden, bir özneden hasat edilen hücreler modifiye edilebilir ve "donör hücreler" haline gelerek ayni özneye tekrar melezlenebilir. Bunlar burada edilebilir.

Burada kullanildigi üzere, "bir" veya "bu" açik bir sekilde aksi belirtilmedigi sürece en az bir anlamina gelir.

Hematogoetik Nakil Islemine Yöneli_k Kombine Kosgllangirma ve Kemo Seçimi Bulus, bir radyasyonsuz hematopoetik kök hücre (HSC) nakil islemi yönteminde kullanima yönelik bir pürin bazi analogu saglar, burada pürin bazi analogu 6- tiyoguanindir (GTG) ve burada yöntem asagidaki adimlari içerir: (a) bir ön-kosullandirma adimi olarak pürin bazi analogunun 2 ila 10 mg/kg vücut agirligindaki bir veya iki dozunun memeli bir özneye uygulanmasi; (b) hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz (HPRT)-eksikligi olan donör HSC'Ierin ön-kosullandirma adiminda 48 ila 72 saatte özneye melezlenmesi ve (o) 1 ila 5 mg/kg”lik pürin bazi analogunun melezleme adimini takiben iki ila sekiz hafta boyunca her iki ila dört günde bir özneye uygulanmasi; burada yöntem ön-kosullandirma yoklugunda radyasyon araciligiyla gerçeklestirilir.

Bu yüzden, özne nakil islemine yönelik hazirlik yapilirken miyeloablatif radyasyon ile tedavi edilmez ve bu yüzden özne miyeloablatif radyasyon ile indüklenen toksisiteye sahip degildir. Yöntem, herhangi bir türde radyasyon tedavisi almamis olan özneler, miyeloablatif radyasyon tedavisi almamis olan özneler ve burada açiklanan yönteme yönelik ön-kosullandirma olabilecek bir zaman araliginda ve/veya bir dozda olmayacak sekilde geçmiste miyeloablatif radyasyon tedavisi almis olan özneler dahil olmak üzere çesitli özneler ile kullanima yönelik düsünülür. Örnegin, özne tipik olarak burada açiklanan kombine kosullandirma ve kemo seçimi yöntemindeki 2 hafta içinde veya hatta 8 hafta içinde miyeloablatif radyasyon almamistir.

Bir pürin bazi analogunun temsili örnekleri, asagidaki unsurlari içerir: 6-tiyoguanin (BTG), 6-merkaptopürin (6-MP) ve azatiyopürin (AZA). Bazi düzenlemelerde, özneye uygulanan toplam 6TG dozaji 105 mg/kg'i asmaz; tipik olarak özneye uygulanan toplam BTG dozaji 75 mg/kg'i asmaz. Bir düzenlemede, pürin bazi analogunun uygulanmasi melezleme adimini takiben her 3 günde bir ve dört haftadan fazla olmayacak sekilde gerçeklestirilir.

Ayni zamanda burada açiklanan, alternatif bir 6TG'nin internetten bilinen (örnegin, rxlist.com) pürin bazi analogu olarak kullanildigi bir yöntemdir ve bulusun yönteminde kullanima yönelik uygun bir dozu tanimlarken teknikte uzman klinisyeni yönlendirmek üzere diger kaynaklar mevcuttur. Örnegin, pediatrik hastalarda ve yetiskinlerde 6TG tek-ajanli kemoterapiye yönelik normal oral doz günde 2 mg/kg vücut agirligidir; 4 hafta sonra tedaviye herhangi bir yanitin gözlenmemesi halinde, doz 3 mg/kg'a yükseltilebilir.

Geri dönüsümlü miyelosüpresyon gözlenerek tek bir oral dozda 35 mg/kg”a kadar verilmistir.

Akut Ienfatik lösemi bakimindan, pediatrik hastalar ve yetiskinlere yönelik normal baslangiç dozu, günde 2.5 mg/kg G-MP vücut agirligidir (siradan yetiskinlerde 100 ila 200 mg ve siradan 5 yasindaki bir çocukta 50 mg). Akut Iösemisi olan pediatrik hastalar birçok durumda zorlanmadan bu dozu tolere etmistir; bazi hastalarda birkaç hafta boyunca veya daha fazla günlük olarak devam ettirilebilir. Bu dozajda 4 haftadan sonra, herhangi bir klinik gelismenin ve Iökosit veya trombosit baskilamasina yönelik kesin bir kanitin görülmemesi halinde, dozaj günde 5 mg/kg'a kadar yükseltilebilir. 2.5 mg/kg/gün olan bir dozaj, akut Ienfatik lösemisi ve yüksek toplam Iökosit sayisi olan bazi yetiskinlerde 1 ila 2 hafta içinde Iökosit sayisinda hizli bir düsüs ile sonuçlanabilir.

Tam bir hematolojik remisyon elde edildiginde, idame tedavisi önemli olarak düsünülür.

Idame dozlari hastadan hastaya degisiklik gösterecektir. 6-MP'nin normal günlük idame dozu, tek bir doz olarak 1.5 ila 2.5 mg/kg/gündür. 6-TG ve 6-MP'ye yönelik dozaj, bir sekilde karsilastirilabilir, öte yandan AZA'ya yönelik dozajin ilk önce 6-MP'ye yönelik biyoaktif hale getirilmesinin gerekli olmasi nedeniyle karsilastirilmasi zordur ve genellikle Iöseminin tedavi edilmesine yönelik kullanilmaz.

Kati organ nakli alan hastalara yönelik, reddetmeyi önlemek ve toksisiteyi minimuma indirmek üzere gerekli AZA dozu, dikkatli bir yönetim gerektirerek ayri hastalara göre degisecektir. Baslangiç dozu, genellikle nakil isleminin baslangicinda günün günde 3 ila 5 mg/kg'dir. AZA genellikle nakil gününde veya nadiren nakilden 1 ila 3 gün önce tek bir günlük doz olarak verilir. Dozun günde 1 ila 3 mg/kg olan idame seviyelerine azaltilmasi, genellikle mümkündür. AZA dozu, reddetme tehdidi nedeniyle toksik seviyelere yükseltilmemelidir.

HPRT-eksikligi olan donör HSC'ler, dogal olarak HPRT-eksikligi yasayabilir veya genetik modifikasyon yoluyla HPRT-eksikligi olacak sekilde elde edilebilir. Bu baglamda, "donör HSCtler" HSC'lerin nakil isleminin alicisindan veya diger bir özneden derive edilip edilmedigine bakilmaksizin melezlenecek hücrelere refere eder.

Nakledilen HSCiler otolog, sinjeneik veya allojenik olabilir.

Genetik modifikasyon, teknikte uzman kisilerce bilinen bir dizi yoldan herhangi biri kullanilarak elde edilebilir. Genetik modifikasyonun uygun yollarina örnekler, bunlar ile sinirli olmamak üzere, çinko parmak nükleazlari (ZFN'Ier), transkripsiyonel aktivatör- benzeri efektör nükleazlar (TALEN'Ier), küçük parçali homolog rekombinasyon (SFHR) kalip zincirleri, inhibitör RNA'Iar (siRNA'Iar) veya mikroRNA'lar (miRNA'Iar), antisens RNA'Iar, trans-zincirleme RNA'Iari, ribozimler, hücre içi antikorlar veya dominant negatif veya rekabetçi inhibitör proteinleri kodlayan dizilerin eklenmesini içerir. Modifikasyon, donör HSC”Ier veya progenitörler ile direkt olarak kullanilabilir. Bu teknolojiler, bunlar ile sinirli olmamak üzere, hematopoetik progenitör hücreler veya direkt olarak hematopoetik kök hücreleri ve ayni zamanda hematopoetik progenitör veya hematopoetik kök hücreler olarak farklilastirilan veya trans-farklilastirilan yetiskin veya embriyonik kök hücreler veya indüklenmis pluripotent kök hücrelerin diger türlerini içeren bir dizi hücre tipinin genetik modifikasyonuna yönelik kullanilabilir.

Bazi düzenlemelerde, nakledilecek HPRT-eksikligi olan HSC'Ier belirli bir terapötik amaca uymak üzere genetik olarak modifiye edilmistir. Örnegin, donör HSC'Ier kalitsal bir genetik kusuru düzeltmek, normal kemik iliginin sitotoksik ilaçlara ilaç duyarliligini degistirmek, lenfohematopoetik hücreleri etkileyen bulasici mikroorganizmalara karsi direnç saglamak, endojen bagisiklik sistemini degistirmek veya yeniden-ayarlamak veya endojen kemik iliginin degistirilmesi ve nakledilen bir doku karsisinda etmek üzere modifiye edilebilir.

Daha spesifik olarak, kalitsal genetik kusurlar, bunlar ile sinirli olmamak üzere, orak hücreli anemi, talasemi, kalitsal sferositoz, GGPD eksikligi ve benzeri gibi hemoglobinopatileri içeren hemapotoez bozukluklarini, siddetli kombine immün yetmezlik (SCID) gibi immünolojik veya antimikrobiyal fonksiyon bozukluklarini, kronik granülomatöz hastaligini (CGD), Wiskott-Aldrich sendromu (WAS) gibi koagülasyon kusurlarina yol açan trombopoiez bozukluklarini ve ayni zamanda epidermoliz büllozanin (EB) çesitli formlari ve mukopolisakkaridoz gibi doku hasari bölgelerine giden hematopoetik hücrelerin genetik mühendisligi ile iyilestirilebilen diger genetik yapisal veya metabolik bozukluklari içerebilir.

Kemik iliginin kemotoksik ilaçlara yönelik ilaç duyarliliginin avantajli olmasinin mümkün oldugu modifikasyondaki hastaliklar, bunlar ile sinirli olmamak üzere, maksimum tolere edilen dozaji miyelotoksisite ile sinirlandirilan kemoterapi ajanlari ile tedavi edilen malign hastaliklari içerir. Bunlar akciger kanseri, kolorektal kanser, meme kanseri, prostat kanseri, pankreas kanseri, mide kanseri, karaciger kanseri, bas ve boyun kanseri, böbrek hücreli karsinom, mesane kanseri, serviks kanseri, yumurtalik kanseri, deri kanseri, sarkomlar ve gliomayi içerir.

Kemik iligi veya hematopoetik kök hücre nakli isleminin enjoden bagisiklik sistemini degistirmek veya yeniden ayarlamak üzere kullanildigi hastaliklar, bunlar ile sinirli olmamak üzere, inflamatuar bagirsak hastaligi, skleroderma ve Iupus eritematozusu Bulasici mikroorganizmalara karsi direnç saglamanin avantajli olabilecegi hastaliklar, bunlar ile sinirli olmamak üzere, HIV enfeksiyonu ve AIDS, HTLV enfeksiyonu ve parvovirüs B19 enfeksiyonunu içerir.

Kemik iligi veya hematopoetik kök hücre nakli islemi ile tedavi edilen malign veya önceden-malign Ienfohematopoez hastaliklari, bunlar ile sinirli olmamak üzere, akut miyelojenöz lösemi, akut lenfositik lösemi, Ienfoma ve miyelodisplastik sendromlari Bu teknolojinin terapötik uygulamasinin diger bir örnegi, radyasyon hasari ve kemotoksinlerin neden oldugu endojen Ienfohematopoezde olusan hasar sonrasi kemik iligi veya hematopoetik kök hücre nakli isleminin sonucunu gelistirmek olabilir.

Bu teknolojinin terapötik-olmayan ancak ticari olarak kullanisli bir uygulamasi, bunlarin endojen Ienfohematopoezinin bir insan donöründe hücreler ile neredeyse tamamen yerlestirildigi insanlasmis hayvan modelleri üretmek üzere kullanilmasi olabilir. Üretildikten sonra, bu tür hayvanlar örnegin insan hastaliklarina uygulamaya yönelik düsünülen yeni ilaçlarin miyelotoksisitesini test etmek üzere kullanilabilir. Bu, lenfohematopoezinin çesitli ilaçlara olan duyarliliginin hayvan türlerine bagli olarak farkli olmasinin mümkün olmasi nedeniyle avantajlidir, bu yüzden bu tür testlerin en çok insanlastirilmis bir hayvan modelinde test edilmesi istenir.

Tipik olarak, özne bir memelidir. Memeli özne fare, köpek, kedi, sigir, at, koyun, primat veya insan olabilir. Bir düzenlemede özne insandir.

Uygulama ve Dozai Bilesimler, siklikla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar ile birlikte herhangi bir uygun sekilde uygulanir. Mevcut bulusun baglaminda tedavinin bir özneye uygulanmasina yönelik uygun yöntemler mevcuttur ve birden fazla yolun belirli bir bilesimi uygulamak üzere kullanilamamasina ragmen, belirli bir yol diger yoldan siklikla daha hizli ve etkili bir reaksiyon saglayabilir. Mevcut bulusun baglaminda bir hastaya uygulanan doz, bir süre sonra hastada yararli bir terapötik yaniti etkilemek veya hastaligin ilerlemesini engellemek üzere yeterli olmalidir. Bu yüzden, bilesim etkili bir yanit elde etmek ve/veya hastalik kaynakli semptomlari ve/veya komplikasyonlari hafifletmek, azaltmak, tedavi etmek veya en azindan kismen durdurmak üzere yeterli bir miktarda bir özneye uygulanir. Bunu saglamak üzere yeterli bir miktar, “terapötik olarak etkili bir doz” olarak tanimlanir.

Burada açiklanan terapötik bilesimlerin uygulama yollari ve sikligi, ayrica dozaj, kisiden kisiye ve ayni zamanda seçilen ilaca göre degisecektir ve standart teknikler kullanilarak hazir bir sekilde olusturulabilir. Genel olarak, farmasötik bilesimler örnegin, enjeksiyon yoluyla (örnegin, intrakutanöz, intratümöral, intramüsküler, intravenöz veya subkutanöz), intranazal olarak (örnegin, soluma yoluyla) veya oral olarak uygulanabilir.

Alternatif protokoller ayri hastalara yönelik uygun olabilir.

Teknikte uzman kisilerce anlasildigi üzere, dozlar mg/kg vücut agirligindan mg/vücut yüzey alanina dönüstürülebilir, sonuncusu insanlar dahil olmak üzere daha büyük memeli özneler ile kullanima yönelik uygundur. Allometrik ölçeklendirmeye yönelik hesaplayicilar teknikte bilinir ve kolaylikla internetten temin edilebilir. Genel olarak, allometrik ölçeklendirme 0.75-0.80'in bir üssünü kullanir. Daha fazla bilgi için, West & Devletleri Gida ve Ilaç Idaresi, 5600 Fishers Lane Rockville, MD 20857 adresinde bulunan Ilaç Bilgileri Egitim ve Iletisim Dairesi Baskanligi'ndaki Ilaç Degerlendirme ve Gida ile Ilaç Uygulamasi Arastirmasi'na yönelik HFD-24O Merkezi'nden temin edilebilen "Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers" makalesini yayinlar. gelir. Bu, 65 kg olan bir insana yönelik 0.4 mg/kg'a esittir. 6TG uygulamasindan sonra absorpsiyon %30 olarak tahmin edilir, bu yüzden farelerdeki bu i.p. dozu insanlarda yaklasik 1.3 mg/kg olan oral uygulamadan sonra absorbe edilmis bir doza karsilik gelir.

Pediatrik hastalarda ve yetiskinlerde 6TG tek-ajanli kemoterapiye yönelik klasik oral doz, günde 2 mg/kg vücut agirligidir; 4 hafta sonra tedaviye herhangi bir yanitin gözlenmemesi halinde, doz 3 mg/kg'a yükseltilebilir.

Bulus, özneye yönelik asiri isinlama veya asiri 6TG dozajini takiben toksisiteden kaçinilmasi bakimindan beklenmeyen bir avantaj saglar. Sasirtici bir sekilde, etkili kosullandirma ve kemik iliginin yeniden yapilandirilmasi, tedavi süresi boyunca ve iki ila sekiz hafta arasi bir süre boyunca 105 mg/kg”dan daha az toplam 6TG dozaji kullanilarak saglanabilir. Etkili melezleme, iki hafta kadar kisa bir süre boyunca 65 mg/kg'dan daha az toplam 6TG dozaji ile gözlenmistir. Ek olarak, yöntem bir ayri öznede toksisitenin izlenmesi ve her bir özneye yönelik minimal toksisite ile etkili melezlemeyi optimize etmek üzere dozun ayarlanmasi seçenegine olanak saglar. Bazi düzenlemelerde, özne melezleme-sonrasi tedaviler boyunca 1 veya 2.5 mg/kg vücut Yöntem ile uyumlu olarak tedavi edilen özneler, %75'in üzerinde genetik olarak modifiye edilen hematopoetik hücreleri gösterecektir. Bazi düzenlemelerde, özne hematopoetik hücreleri gösterir. Basarili melezleme, çesitli araliklar ile periferik kan veya kemik iliginin numune olarak alinmasi ile bir öznede dogrulanabilir. Periferik kan mononükleer hücreleri, bunlar ile sinirli olmamak üzere polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kantitatif gerçek zamanli PCR (Q-PCR), arastirmaci nükleaz analizi (ayrica analizi, immünohistokimya veya immünositokimya, hücre içi boyama ile akis sitometrisi analizi, HPRT enzimatik aktivite analizi, HPLC, kütle spektrometresi ve benzerini içeren genel olarak dahil olmak üzere teknikte uzman bir kisinin asina oldugu çesitli standart teknikler kullanilarak fonksiyonel aktivitede HPRT gen bozulmasi, nakavti veya azalmasinin izlenmesi yoluyla incelenebilir.

Asagidaki örnek, mevcut bulusu açiklamak ve bunun yapimi ve kullanimina yönelik teknikte uzman bir kisiye yardimci olmak üzere temsil edilir. Örnekler, herhangi bir sekilde bulusun kapsamini kisitlama amacini tasimaz. Örnek 1: 6-tiyokuanin ile tek basina kombine ön kosullandirma ve in vivo kemo seçimi HPRT-eksikligi olan kemik iligi ile normal hematopoezin oldukça etkin olarak yeniden yapilandirilmasini saglar 6-tiyoguanin (6TG) gibi pürin analoglari, hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz (HPRT) ile nükleotidlere dönüstürüldükten sonra miyelotoksisiteye neden olur. Bu örnek, HPRT-eksikligi olan HSC'nin hem kosullandirilmasi hem de in vivo kemo seçimine yönelik tek bir ajan olarak 6TG kullanan yeni ve oldukça etkili bir stratejinin gelisimini gösterir. BTG miyelotoksisitesinin doz-yaniti ve zaman seyri, ilk önce HPRT- dogal suslu fareler ve HPRT-eksikligi olan transgenik fareler ile karsilastirilmistir. Dozaj ve plan parametreleri, sinojenik HPRT-dogal suslu alicilara nakledilen HPRT-eksikligi olan transgenik donör kemik iliginin (BM) in vivo kemo seçiminden hemen sonra miyeIo-süpresif kosullandirmaya yönelik 6TG'yi kullanmak üzere optimize edilmistir.

Uygun dozajlarda 6TG, HPRT-dogal suslu farelerde ekstra-hematopoetik dokularin üzerinde herhangi bir olumsuz etki olmadan seçici miyelotoksisiteyi indüklemistir, öte yandan HPRT aktivitesinde eksik olan HSC, bunun sitotoksik etkilerine oldukça dirençli olmustur. Kombine 6TG kosullandirma ve nakil sonrasi kemo seçimi düsük toplam toksisite ile HPRT-eksikligi olan donör BM'ye yönelik tutarli olarak -%95 melezleme elde etmistir. Immünfenotipik olarak normal BM'nin uzun-vadeli bir sekilde yeniden yapilandirilmasi, hem primer hem de sekonder alicilarda elde edilmistir. Bu sonuçlar, tek-ajanli GTG'nin hem isinlama islemi gerektirmeden miyelo-süpresif kosullandirmada hem de HPRT-eksikligi olan donör hücrelerin in vivo kemo seçiminde kullanilabilmesi bakimindan kavrami kanitlar. Sonuçlar, nakil isleminden hem önce (kosullandirma olarak) hem de sonra (kemo seçimi olarak) 6TG'nin miyelosüpresif etkilerinin uygulanmasi yoluyla, HPRT-eksikligi olan hematopoetik kök hücrelerin oldukça etkili olarak melezlenmesi saglanabilir.

Hematopoetik kök hücreleri kullanilarak ex vivo gen terapisinin klinik etkinligi, seçici bir avantajin nakledilen hücrelere [1, 2] uygulanmasina bagli olmaya devam eder.

Melezlemeyi gelistirmek ve Ienfohematopoetik yeniden yapilandirmaya yönelik gerekli süreyi azaltmak üzere, dihidrofolat redüktaz (DHFR) [3] veya çoklu ilaç-dirençli gen 1 (MDR1) [4, 5] gibi ilaç dirençli genleri kullanan in vivo seçim stratejileri test edilmistir, ancak kabul edilemez toksisite [6] veya yetersiz seçim etkinligi [7] nedeniyle genel olarak basarisiz olmustur. Mevcut olarak, OB-metilguanin-DNA-metiltransferazin (MGM'I) mutant formlari, OB-benzilguanin [8, 9] ile kombinasyon halinde BCNU veya temozolomide karsi kemo koruma saglama kabiliyetleri açisindan test edilir, ancak bu ajanlar ayni zamanda önemli ölçüde bir toksisite riski tasir ve yakin zamandaki gözlemler mutant MGMT”nin yüksek seviyelerde [10] ifade edildiginde seçici bir dezavantaj saglayabilecegini belirtir. Özellikle, bu yaklasimlar genel olarak eksojen bir ilaç direnci genini miyeloablatif isinlama ile ön kosullanan alicilara fazlaca-ifade eden hematopoetik progenitörlerin nakline dayanir; ancak, kemo-direnç sitotoksik ilaçlarin aktivasyonuna yönelik normal olarak gerekli olan azalan endojen enzim seviyeleri ile saglanabilir. Bu baglamda, pürin nükleotid kurtarma yolu enzimi hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza (HPRT) ait yüksek seviyelerin pürin analogu ö-tiyoguanine (6TG) [11] yönelik artan duyarliliga neden oldugu önceden gözlemlenmistir. 6TG”nin metabolik dönüsümünün birinci adimi, tiyoguanozin monofosfati (TGMP) üretmek üzere riboz 5-fosfatin eklenmesine aracilik eden HPRT [12] ile katalize edilir. Bu yüzden, 6TG sitotoksisite bunun akabinde sonuçsuz uyumsuzluk onarimi ve sonraki apoptoz dahil olmak üzere DNA'ya dahil edilen tiyo-dGTPilere HPRT-aracili dönüsümünde temel olarak tahmin edilir.

Azalan aktivite yoluyla miyelo koruma saglamak üzere, endojen ilaç-aktive edici enzim normal olarak hematopoetik progenitörlerde oldukça fazla ifade edilmelidir, ancak normal hematopoeze yönelik gerekli degildir. Aslinda, hematopoetik progenitörler normal olarak bunlari 6TG'ye oldukça duyarli hale getiren yüksek HPRT [13-16] seviyelerini ifade eder. Gerçekten, 6-merkaptopürin (BMP), azatiyopürin (Aza) ve 6TG gibi pürin analoglari neredeyse yarim yüzyil boyunca [17] özellikle pediyatrik hastalarda lösemi tedavisine ve ayni zamanda organ nakli hastalarinda immünosüpresyona ve daha yakin zamanda otoimmün hastaliklara yönelik klinik olarak kullanilmistir. Daha yüksek dozlarda, miyelotoksisite klinik olarak kullanildiginda ve kisa bir süre boyunca uygun konsantrasyonlarda kullanildiginda 6TG'nin en sik ve sabit olumsuz etkisidir, 6TG normal HPRT-dogal suslu hayvanlarda [11] diger dokulara yönelik çok az toksisite ile kuvvetli bir sekilde miyelosüpresiftir.

Aksine, HPRT-eksikligi olan hayvanlardan kemik iligi (BM) 6TG'ye oldukça dirençlidir fenotipik ve fonksiyonel olarak normal oldugu biz [11] ve digerleri [18] tarafindan bulunmustur ve megaloblastik anemi durumlarinin insanlarda [19] kalitsal HPRT eksikligi (Lesch-Nyhan sendromu) ile iliskilendirilmesine ragmen, bunun adeninin [20] oral uygulamasina iyi yanit verdigi rapor edilmistir. ilaveten, HPRT eksikliginin insanlarda veya hayvanlarda [21] bagisiklik sisteminin herhangi bir sekilde bütün olarak zarar görmesi ile iliskili oldugu düsünülmez.

Bu gözlemler, 6TG-direnci olan ancak bunun disinda normal olan HPRT-eksikligi olan progenitör hücrelerin 6TG tedavisi gören HPRT-dogal suslu alicilara nakledildiginde seçici bir avantaja sahip olmasi gerektigini ve bu stratejinin ex vivo gen terapisinin sonucunu gelistirmek üzere kullanilabilecegini belirtir. Aslinda, Porter ve DeGregori [22] HSC'nin Hprt-hedefli shRNA'yi ifade eden Ientiviral bir vektör ile aktarilmasinin ve bu tasarlanmis hematopoetik hücrelerin farelerdeki 6TG kemo seçimi ile in vivo olarak iyilestirilmesinin fizibilitesini önceden göstermistir. Ancak, bu önceki raporda, 6TG sadece orta derecede miyelosüpresif olacak sekilde veya nakil isleminden sonra 4 hafta veya daha fazla olarak baslatilan kisa bir seçim süresinde seçilen dozajlarda uygulanmistir ve toplam vücut isinlamasi ile ön kosullandirma islemine ragmen, melezleme sonuçlari %5 - 50 araliginda olarak nispeten ilimli ve oldukça degisken olmustur [22].

Bu noktada, HPRT-eksikligi olan kemik iligi naklinden sonra melezleme ve hematopoetik yeniden yapilandirma üzerine 6TG uygulamasinin doz, süre ve uzunlugunun degistirilmesinin etkileri sistematik olarak incelenmistir. Bir degisken olarak vektör aktarim etkinligini disarida birakmak üzere, 'ideal' donör hücreleri olarak Hprt-nakavt hayvanlarindan BM kullanilmistir, böylelikle hem (i) HPRT-dogal suslu alicilarin miyelosüpresif kosullandirilmasina yönelik nakil-öncesinde hem de (ii) HPRT- eksikligi olan donör hücre popülasyonlarinin kemo seçici uygulamasina yönelik nakil- sonrasinda 6TG dozajini modifiye etme ve parametreleri planlama etkilerine odaklanmaya yardimci olur. Akabinde, burada 6TG'yi hem ön kosullandirma hem de in vivo kemo seçimine yönelik tek bir ajan olarak sirali bir sekilde uygulayan yeni bir rejimin gelistirilmesi açiklanir ve bu kombinasyon rejiminin hizli ve tutarli bir sekilde oldukça etkili melezleme ve uzun-vadeli yeniden yapilandirma sagladigini gösterir.

Materyaller ve yöntemler CSYBL/BJ ve Bö.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (CD45.1) fareleri, orijinal olarak Jackson Laboratory'den elde edilmistir (Bar Harbor, ME). 86.129P2-Hprt1b'm3/J fareleri, promotör ve Hprt-geninin birinci 2 eksonlari boyunca uzanan 55 kb'lik bir kayip tasir kurumsal özel patojen içermeyen hayvan tesisinde korunmustur. 6TG tedavisi farkli zaman noktalarinda 6TG'ye (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) ait 200 ul'lik degisen dozlarda intraperitoneal olarak (i.p.) enjekte edilmistir. Kontrol hayvanlari 200 ul'lik steril H20 ile i.p. olarak enjekte edilmistir.

Kemik iligi nakli ve 6TG in vivo kemo seçimi Disi alici CS7BL/6J (HPRT-wt) veya Bö.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (HPRT-wt, CD45.1) fareleri, HSCT'den 48 saat önce i.p. enjeksiyonu yoluyla 10 mg/kg 6TG ile tedavi edilen 0.8-1 x 107 çekirdekli BM hücreleri, HPRT-wt alicilarina intravenöz olarak enjekte edilmistir. 6TG (10 mg/kg) 2 saat sonra ve 3 günde bir bundan sonra 4 hafta boyunca 5 mg/kg'da i.p. enjeksiyonu ile tekrardan uygulanmistir. Sekonder alici farelere seri nakil, ayni hücre dozu ve 6 ay önce 6TG in vivo kemo seçimi ile nakil islemi gerçeklestiren primer alici farelerden BM'nin kullanilmasi haricinde yukaridaki gibi 6TG ön kosullandirma/kemo seçimi rejimi kullanilarak gerçeklestirilmistir.

Fare koromozomu X- ve Ytye özgü florans in situ hibridizasyon FISH, üreticinin protokolüne göre fareye özgü Tüm Kromozom-Y boya probu/RA89 (XqF1) DNA problari karisimi (Kreatech, Amsterdam, Hollanda) kullanilarak BM ve PBL hücrelerinin üzerinde gerçeklestirilmistir. Erkek donör HPRT-wt hücrelerinin disi alici C57BL/6J farelerindeki yüzdesini belirlemek üzere, her bir cam deney plakasi için 200 çekirdek, uygun çift ve üç-renkli filtreler ile donatilan bir floresan mikroskop (Zeiss) kullanilarak sayilmistir. Asagidaki kriterler FlSH'nin analiz edilmesine yönelik uygulanmistir: (1) çekirdegin kalitesi DAPI boyamasi araciligiyla degerlendirilmistir, (2) Y-kromozomuna yönelik yesil floresan sinyal puanlanmistir, (3) X-kromozomuna yönelik kirmizi floresan sinyal puanlanmistir, (4) Y-kromozomu çekirdegine yönelik yesil floresan sinyalin yoklugu, sadece bir X-kromozomu tespit edildiginde dahi disi olarak rapor edilmistir (Ek Sekil 81; ek sekiller için Deneysel Hematoloji 2012, 40:3- 13'e bakiniz).

Hematopoetik dokularin immünofenotipik analizi Fare BD Fc Blogu (BD Biosciences, Sari Jose, Kaliforniya) ile engellemeden sonra, 1, c-kit ve soy antikor kokteyline karsi FITC-, PE-, PerCP- veya APC-konjuge siçan anti-fare antikorlari ile boyanmistir. Antikorlar Biolegend (San Diego, Kaliforniya) veya BD Biosciences sirketinden alinmistir. Akis sitometrik verileri, bir BD LSRII running BD FACSDiva (BD Biosciences) ile elde edilmistir ve FlowJo yazilimi (TreeStar, Ashland, Oregon) kullanilarak analiz edilmistir (Ek Sekil 82).

Histogatoloiik analiz Bu çalismada kullanilan tüm farelerin nekropsisi ve tüm torasik ve abdominal organlar ve kemik iligini histolojik incelemesi, UCLA Laboratuvar Hayvani Tibbi Diagnostik Hizmet Laboratuvari Bölümü tarafindan gerçeklestirilmistir. Dokular rutin islenmistir veya gerekli olmasi halinde dekalsifiye edilmistir ve parafin kesitleri kesilmistir ve hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyanmistir.

Istatistiksel analiz Veriler, QuickCalcs istatistiksel yazilim programi (Graphpad Software Inc.) kullanilarak analiz edilmistir. Eslestirilmemis t-testleri, p degerlerini hesaplamak üzere kullanilmistir ve p<0.05 istatistiksel olarak önemli olarak dikkate alinmistir.

Sonuçlar HPRT-wt farelerde BTG'nin akut mivelotoksisitesi Hematopoetik progenitörlerde HPRT ifadesinin yüksek seviyeleri, 6TG'nin seçici bir miyelotoksik etkisine aracilik etmek ve bir kosullandirma rejimi olarak kullanilmasini saglamak üzere tahmin edilir. Buna göre, HPRT-wt farelerinde çesitli dozajlarda öTG'ye ait bolus enjeksiyonlarindan sonra BM üzerinde kisa-vadeli etkiler incelenmistir. 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg veya 10 mg/kgiik 6TG'ye ait tek bir dozun intraperitoneal enjeksiyonu, Gün 1lde veya 10 mg/kg'lik iki doz enjeksiyonu Günler 1 ve 3'te gerçeklestirilmistir ve BM histolojisi Gün 4'te incelenmistir. Artan miyelotoksisite, toplam 6TG dozaji arttikça gözlenmistir (Sekil 1A). Vasküler yapilar asamali olarak belirgin hale gelmistir ve hem eritroid hem de miyeloid soylarinin hücreleri tüketilmistir. Sadece vasküler endotelyum, mezenkimal hücreleri, birkaç olgun granülosit ve makrofaj ve az rastlanan hematopoetik progenitör hücreler test edilen en yüksek 6TG dozunda görülmüstür (Sekil 18).

Yukaridaki rejimlerin herhangi biri ile kolaylikla görülen herhangi bir klinik belirti Gün 4lte gözlenmemistir, ancak gözlem periyodu uzatildiginda, kilo kaybi ve ekstremitelerin soluklugu Gün 7'de görülmüstür. BM'nin histolojik olarak incelenmesi, ilave 6TG dozlari uygulanmasa bile Gün 4 ile Gün 7 arasinda artan bir siddet göstermistir (Sekil 1A, 2A).

Klinik ve histolojik bulgular ile uyumlu olarak, iki doz 10 mg/kg'lik 6TG ile tedavi edilen ve Gün 7'de analiz edilen HPRT-wt farelerine ait BM, araç kontrolü ile tedavi edilen önemli ölçüde nicel bir azalma göstermistir.

Geriye kalan BM hematopoetik hücrelerin akis sitometrisi ile immünofenotipik analizi (Tablo 1), uzun-vadeli çok soylu yeniden yapilandirma aktivitesi [24] ile HSC'yi içeren ilgili KLS (Iin'/c-kit*/sca-1+) progenitörleri oraninin, Gün 4”e kadar 3-kat (p<0.01) ve Gün Tye kadar 10-kat (p<0.001) olacak sekilde önemli ölçüde azaldigini ortaya çikarmistir (Tablo 1-iii, -iv). Olgun CD8+ ve CD4+ T hücrelerinin ilgili yüzdesi, BM histolojisinde de görülebilecegi üzere muhtemelen çok fazla genislemis kan damarlari ve periferik kan/kanama akisi nedeniyle Gün 7'deki kontrollere kiyasla 7-kata (p<0.001) ulasarak 6TG uygulamasindan bir süre sonra asamali olarak artmistir. 8220+ hücrelerinin ilgili yüzdesi, Gün 4lte herhangi bir kayda deger degisiklik göstermemistir, ancak 6TG uygulamasindan sonra Gün 7`deki kontrollere kiyasla iki katina çikmistir.

Tablo 1. 6TG kosullandirma rejiminden sonra BM hematopoetik hücrelerin immünofenotipik analizi.

BM hücreleri, asagidaki siçan anti-fare antikorlari ile boyanmistir: CD45-FITC, CD4-PE, CD8-APC, B220-PerCP, Mac1/Gr1 -PE, Sca-1-PE ve c-kit-FITC ve akis sitometrisi ile incelenmistir.

Tedavi ve analiz planlari küçük roma rakamlari ile belirtilir ve Sekil 1'deki gibidir. (i): Gün 1“de araç kontrolü, Gün 4'te analiz. (ii) Gün 1'de 10 mg/kg'lik 6TG'nin tek dozu, Gün 4'te analiz. (iii): Günler 1 ve 3'te 10 mg/kg'lik 6TG'nin iki dozu, Gün 4'te analiz. (iv) & (v): Günler 1 ve 3ite 10 mg/kg'lik 6TG'nin iki dozu, Gün 7'de analiz. En son iki kolon, sirasiyla HPRT-wt (iv) ve HPRT- eksikli olan (v) farelerde ayni 6TG dozaji ve planinin (10 mglkg 6TG x 2 doz) üç sonucunu gösterir. Belirtilen hematopoetik hücre alt popülasyonuna ait yüzdeler, toplam CD45+ hücrelerine ait ortalama % ± SD olarak ifade edilir (her bir grup için n=3).

Hücre HPRT-dogal susu eksikligi popülasyonu Önemli ölçüde, karaciger enzimleri HPRT-wt farelerinde bu kosullandirma rejimini takiben yükselmemistir, 6TG sitotoksisitesinin bu dozajda hematopoetik progenitörlere yönelik seçiciligini belirtir ve miyelosüpresif bir kosullandirma rejimi olarak bunun HPRT-eksikligi olan farelerge 6TG kosgllandirma (Maiinda mivelotoksisite eksikligi Yukaridaki bulgulara zit olarak, HPRT-eksikligi olan fareler maksimum dozajlama ile muamele edildiginde (Günler 1 ve 3'te iki doz 10 mg/kg'lik 6TG), kemik iligi histolojisi Gün 7'de hiçbir sekilde etkilenmeden kalmistir (Sekil 2A) ve araç kontrol grubununki ile karsilastirilabilir olmustur (Sekil 1A). Önemli bir sekilde, 6TG ile tedavi edilen HPRT- eksikligi olan farelere ait bir uyluk ve kaval kemiginden elde edilen çekirdekli BM olmustur ve ayni 6TG rejimi ile tedavi edilen HPRT-wt farelerin içerdigi sayidan ilaveten, 6TG ile tedavi edilen HPRT-eksikligi olan farelere ait BM'de hematopoetik hücre alt popülasyonlarinin orani (Tablo 1-v), araç kontrollü-tedavi edilen HPRT-wt farelerinin (Tablo 1-i) ve tedavi edilmemis HPRT-wt farelerinin (Tablo 2, %BM kolonu) ve ayni zamanda tedavi edilmemis HPRT-eksikligi olan farelerin (Tablo 3, %BM kolon) orani ile karsilastirilabilir olmustur.

Tablo 2. Tedavi görmemis HPRT-wt farelerinde hematopoetik hücrelerin immünofenotipik analizi.

BM, PBL, dalak (S) ve timüs (T) asagidaki siçan anti-fare antikorlar ile boyanmistir: CD45-FITC (BM, PBL, T, 8), CD4-PE (BM, PBL, T, 8), CD8-APC (BM, PBL, T, 8), Macl/Grl-PE (BM, PBL, S), BZZO-PerCP (BM, PBL, S), Sca- 1-PE (BM) ve c-kit-FITC (BM) ve akis sitometrisi ile incelenmistir. Belirtilen hematopoetik hücre alt popülasyonlarinin yüzdeleri toplam CD45+ hücrelerine ait ortalama % ± SD olarak ifade edilir (her bir grup için n=3).

Hücre popülasyonu CD45+ CD4*/CD8+ 8220* 92.6±3.2 3.9±1.6 1.6±O.8 .4±8.2 87.3±8.1 3.6±2.4 98.6±0.5 12.2±2.6 11.4±1.7 47.8±13.2 36.1±5.0 98.7±0.6 6.5±2.1 3.6±1.2 85.6±4.3 97.1±1.0 19.7±1.7 16.5±0.3 54.4±4.9 18.7±3.9 Tablo 3. Tedavi görmemis HPRT-eksikligi olan farelerde hematopoetik hücrelerin immünofenotipik analizi.

BM, PBL, dalak (S) ve timüs (T) asagidaki siçan anti-fare antikorlari ile boyanmistir: CD45-FITC (BM, PBL, T, 8), CD4-PE (BM, PBL, T, 8), CD8-APC (BM, PBL, T, 8), Maci/Gri-PE (BM, PBL, S), BZZO-PerCP (BM, PBL, S), Sca- 1-PE (BM) ve c-kit-FITC (BM) ve akis sitometrisi ile incelenmistir. Belirtilen hematopoetik hücre alt popülasyonlarinin yüzdeleri toplam CD45+ hücrelerine ait ortalama % ± SD olarak ifade edilir (her bir grup için n=3).

Hücre popülasyonu CD45+ CD4*/CD8+ 8220+ 92.3±1.3 4.9±1.4 2.4±O.2 28.2±2.7 79.7±2.2 3.3±0.5 96.1 ±2.7 .9±O.8 11.7±O.7 55.7±2.9 .1 ±4.0 98.7±0.4 6.5±1.0 2.9±O.1 86.9±O.9 94.9±1.8 18.4±2.7 11.8±1.9 51 .3±5.5 9.9±1.8 Birlikte ele alindiginda, bu sonuçlar iki doz kadar 10 mg/kg 6TG'nin 7 günde olusan asamali olarak artan miyelotoksisite ile HSCT'den önce 3 gün kadar iyi bir sekilde tolere edilebilen etkili bir kosullandirma rejimi olarak kullanilabilecegini belirtmistir.

HPRT-wt alicilarinda 6TG kosullandirmasindan sonra HPRT-eksikligi olan BM'nin Yukarida olusturulan plana bagli olarak, 6TG (10 mg/kg i.p.) yukarida açiklandigi üzere her bir plan için bir dozun 48 saat önce (bu noktada Gün 1 yerine Gün -2 olarak belirtilir) uygulanmasi ve bir dozun nakil islemi gününde (Gün 3 yerine Gün 0 olarak belirtilir) uygulanmasi yoluyla HPRT-wt alicilarinda (CD45.1) bir kosullandirma rejimi olarak kullanilmistir. Kosullandirmadan sonra, HPRT-wt alicilari akabinde HPRT- eksikligi olan konjenik donörlerden (CD45.2) BM ile nakledilmistir.

Gün 4'te, kemik iligi daha az erken progenitör hücreleri ve artan vaskülarite ile azalan hücresellik göstermistir (Sekil 28) ve HPRT-eksikligi olan BM ile nakledilen bu BTG- kosullu HPRT-wt farelerinden kurtarilan çekirdekli BM hücrelerinin toplam sayisi akis sitometrik analizi, gün 4'te toplam hücre popülasyonunun sadece %17.8 ± edildigini göstermistir.

Kronik düsük-dozlu 6TG tedavisinden sonra mivelotoksisiteve yönelik esik 6TG ön kosullandirmasinin yüksek melezleme seviyelerini elde etmek üzere tek basina yeterli olmayabilecegini yukaridaki sonuçlarin belirttigi üzere, daha düsük 6TG dozlari ile kronik tedavi göz önüne alindiginda gerçeklestirilmistir. HPRT-wt ve HPRT-eksikligi olan farelere (grup basina n=3), araç ile tek basina 60 gün kadar her 3 günde bir 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.5 mg/kg veya 5.0 mg/kg'lik 6TG i.p. olarak enjekte edilmistir. HPRT-wt farelerinde, araç kontrol grubu ayni zamanda 0.25 mg/kg ve 0.5 mg/kg`lik 6TG gruplari 60 günlük bir süre boyunca %100 hayatta kalma göstermistir ve 0.25 mg/kg ve 0.5 mg/kg'lik 6TG gruplarinda BM'nin histolojik incelemesi, Gün 60yta normal hücresellik göstermistir (Sekil 3).

Aksine, HPRT-wt 1.0 mg/kg'lik 6TG grubunda, gün 38'de (13 mg/kg toplam dozaj), Gün 42'de (14 mg/kg toplam dozaj) ve Gün 51 'de (17 mg/kg toplam dozaj) ölümler meydana gelmistir (Tablo 81). Daha yüksek dozajlarda, 2.5 mg/kg veya 5 mg/kg'lik tekrar eden 6TG enjeksiyonlari alan HPRT-wt fareleri, sürekli olarak ilerleyen klinik sikinti belirtileri (hareketsizlik, kambur durus, kendi kendini temizleme eksikligi, anokreksi), anemi (ekstremitelerin soluklugu) ve %>10 kilo kaybi göstermistir, kurumsal kurallara göre (5.0 mg/kg 6TG grubu; 35 mg/kg toplam dozaj) ölmeleri gerekli olmustur. BM”nin 1.0 mg/kg`lik 6TG grubundan histolojik olarak incelenmesi, birçok apoptotik biçim göstermistir ve hasara yönelik bir baslangiç aktivasyon yaniti yansitarak daha düsük dozaj gruplarina göre daha fazla blast hücre gözlenmistir (Sekil 3; Gün 38). daha yüksek dozaj gruplari ayni zamanda her bir grupta 6TG'nin kümülatif dozaji ile orantili olan Iezyonlarin siddeti ile önemli ölçüde azalmis hücresellik ve vasküler yapilarin genislemesini göstermistir. 2.5 mg/kg'lik 6TGtnin tekrar eden dozlari ile tedavi edilen fareler, azalan hücresellik ve yaygin apoptoz göstermistir (Gün 28). 5 mg/kg”lik en yüksek kronik dozajda, hayatta kalan hücrelerin birçogunun miyeloid soydan gelmesi ile BM önemli derecede tükenmistir (Gün 22).

HPRT-wt farelerinin aksine, HPRT-eksikligi olan farelerin tümü, enjekte edilen 6TG dozajindan (yukaridaki ile ayni dozlama planlarina göre uygulanan 105 mg/kg'a kadar maksimum toplam doz) (Tablo 81) bagimsiz olarak deney boyunca hayatta kalmistir (60 gün). HPRT-eksikligi olan farelerin herhangi birinde, Gün 60`ta deneyin bitis zaman noktasinda 6TG dozajina bakilmaksizin kayda deger bir BM patolojisi gözlenmemistir (Sekil 3). Kalp, akciger, karaciger, pankreas, böbrek ve dalak dahil olmak üzere incelenen dokularin herhangi birinde kayda deger tedavi ile alakali bir anormallik gözlenmemistir. Bu yüzden, HPRT-eksikligi olan fareler, HPRT-wt farelerinde ölümcül miyelotoksisiteye neden olan 1.0 mg/kg, 2.5 mg/kg ve 5.0 mg/kg'lik dozlarda kronik 6TG tedavisinin herhangi bir toksik etkisini göstermemistir.

Kombine 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seci_mi HPRT-eksikligi ola_n BM'nin sürekli ve oldukça etkin bir sekilde melezlenmesini saglar Yukaridaki doz-bulucu çalismaya bagli olarak, akabinde HPRT-wt alicilarinda HPRT- eksikligi olan BMinin naklinden hemen sonra baslayan düsük 6TG dozlarinin sürekli olarak uygulanmasi ile kombine edilen 6TG önceden kosullandirma isleminin melezlenen donör hücrelere yönelik daha fazla kemo seçici büyütmeyi elde edip edemeyecegi sorulmustur. Buna göre, disi HPRT-wt fareleri önceden olusturulan her bir kosullandirma planina yönelik bir dozun 48 saat önce (Gün -2) uygulanmasi ve bir dozun nakil islemi gününde (Gün 0) uygulanmasi yoluyla 6TG (10 mg/kg i.p.) ile önceden kosullandirilmistir. HPRT-wt disi alicilari akabinde HPRT-eksikligi olan erkek BM ile nakledilmistir ve yukaridaki kronik miyelotoksisite sonuçlarina bagli olarak, alicilar ayrica 2 hafta boyunca (30 mg/kg toplam dozaj) ve 4 hafta boyunca (42.5 mg/kg) her 3 günde bir 2.5 mg/kg'lik 6TG'nin tekrar eden dozlari veya 2 hafta boyunca (40 mg/kg toplam dozaj) veya 4 hafta boyunca (65 mg/kg toplam dozaj) her 3 günde bir .0 mg/kg'lik 6TG`nin tekrar eden dozlari ile tedavi edilmistir. Analiz, sirasiyla 2 hafta veya 4 haftada in vivo kemo seçimi periyodundan hemen sonra gerçeklestirilmistir Beklendigi üzere, kombine 6TG kosullandirmasi, HSCT, ve 6TG in vivo kemo seçimi prosedürleri iyi tolere edilmistir ve herhangi bir sikinti belirtisi gözlenmemistir. 6TG ile tedavi edilen gruplarin tümünde, nakil islemi geçiren hayvanlarin %100'ü hayatta kalmistir (2 hafta tedavi: n=3 ve 4 hafta tedavi: n=8). Vücut agirliklari, 6TG ile tedavi edilen hayvanlarda nakil isleminden sonra birinci haftada baslangiçta düsmüstür, ancak stabilize edilmistir ve tüm hayvanlar bundan sonra normal kilolarina dönmüstür.

Histopatolojik analiz, nakil islemi geçiren hayvanlardaki genel hücresellik ve hematopoezin BTG kemo seçimi dozaji ve süresine bakilmaksizin tedavi edilmemis HPRT-wt kontrolünden ayirt edilebilir oldugunu göstermistir (Sekil 4).

Kromozom XY-FISH [25, 261, 2 hafta 6TG kemo seçimi alan gruplarda, bu zaman seviyelerinde donör-deriveli ilik ile çoktan fazla miktarda tekrardan yapilandirilmis oldugunu göstermistir. 2 haftada donör-deriveli periferik kan lökositlerinin (PBL) olmustur (Tablo 4). In vivo kemo seçimi HSCTiden sonra 4 haftaya kadar devam ettiginde, donör-deriveli BM hücrelerinin yüzdesi tekrardan hem 2.5 mg/kg grubunda Kayda deger bir sekilde, donör-deriveli PBL'nin yüzdesi, 4 haftada 2.5 mg/kg grubuna (p<0.005) ve ayni zamanda her iki dozdan biri ile 2 hafta kemo seçimi alan gruplara göre önemli ölçüde daha yüksek (p<0.0002) olmustur (Tablo 4). Bu yüzden, 4 hafta boyunca her 3 günde bir 5 mg/kgilik 6TG ile devam eden in vivo kemo seçimi ile kombine edilerek Gün -2 ve Gün Oda 10 mg/kg`lik 6TG ile ön kosullandirma. HPRT- eksikligi olan donör hücreler ile BM melezlemesinin maksimum seviyelerini ve ayni zamanda donör-deriveli PBL'nin en yüksek seviyelerini vermistir; bu rejim diger çalismalarda kullanilmistir.

Tablo 4. Kombine 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçiminden sonra hayatta kalma ve melezleme.

In vivo kemo seçimine yönelik tedavi planlari asagidaki gibidir: 2 hafta boyunca 2.5 mg/kg”lik 6TG, 2 hafta boyunca 5.0 mg/kgllik 6TG, 4 hafta boyunca 2.5 mg/kg'lik 6TG veya 4 hafta boyunca 5.0 mg/kg'lik 6TG ile iri vivo kemo seçimi. Tüm tedavi gruplari, %100 olan bir hayatta kalma orani göstermistir. HPRT-wt disi alici BM ve PBL'de HPRT-eksikligi olan erkek hematopoetik hücrelerin melezlenmesi, kromozom XY-FlSH ile belirlenmistir (ortalama% ± SD).

Tedavi Hayatta kalma (%) BM (%) PBL(%) 6TG 2.5 mg/kg 2 6TG 5.0 mg/kg 2 6TG 2.5 mg/kg 4 6TG 5.0 mg/kg 4 HPRT-eksikligi olan BM'nin uzun-vadeli yeniden vapilandirilmasinda kombine 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçimi sonuçlari Yukarida olusturulan kombine 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçim rejimi kullanilarak HPRT-eksikligi olan donör BM ile melezlemesinin devamliligi, nakil isleminden sonra 4 ay, 7 ay veya 12 ay (yani, sirasiyla 4-haftalik in vivo kemo seçimi periyodu bitiminden sonra 3 ay, 6 ay ve 11 ay) incelenmistir. Nakil islemi geçiren tüm hayvanlar (4 ay: n=8; 7 ay: n=6; 12 ay: n=5) incelenen tüm zaman noktalarinda sag ve iyi kalmistir, hiçbir sekilde morbidite veya rahatsizlik belirtileri göstermemistir. Bu hayvanlarin kabaca patolojik ve histolojik olarak incelenmesi, kayda deger bir sekilde herhangi bir anormallik göstermemistir.

Donör-deriveli progenitör hücreleri ile Iemfohematopoetige yönelik çok-soylu yeniden yapilandirma, kombine 6TG ön kosullandirmasi ve in vivo kemo seçimi ile HSCT'den 4 ay sonra, yani 4-haftalik kemo seçimi periyodu bittikten 3 ay sonra degerlendirilmistir.

BM, PBL, timüs ve dalaga yönelik immünofenotip, donörler olarak HPRT-eksikligi olan CD45.2 fareleri ve alicilar olarak HPRT-wt CD45.1 fareleri kullanilarak konjeneik bir CD45.1/CD45.2 nakil düzenlemesinde gerçeklestirilmistir (n=5). Hematopoetik dokularin tümü, CD45.2+ donör hücrelerinin toplam kemik iliginin %75'ini asan seviyelerde yüksek miktarda melezlenmesini göstermistir (Tablo 5). Donör-deriveli CD45.2+ popülasyonuna ait immünofenotip, T hücreleri (CD4/CD8), 8220+ hücreleri ve makrofajlar/ granülositlere (Mac-ilGr1) ait ilgili yüzdelerin, tedavi görmemis kontrollerin yüzdeleri ile karsilastirilabilir oldugunu göstermistir (Tablolar 2 ve 3).

Tablo 5. Konjeneik bir CD45.1/CD45.2 nakil modelinde 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçimi rejimi kullanilarak nakil isleminden 4 ay sonra hematopoetik dokularin immünofenotipik analizi. 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçimi metinde açiklandigi üzere gerçeklestirilmistir. Alici BM ve PBL asagidaki siçan anti-fare antikorlari ile boyanmistir: CD, CD8-APC (BM, PBL, T, 8), Mac1/Gr1-PE (BM, PBL), BZZO-PerCP (BM, PBL, S) ve akis sitometrisi ile incelenmistir. Belirtilen hematopoetik hücre alt popülasyonlarinin yüzdeleri, toplam CD45.2+ hücrelerine ait ortalama % ± SD olarak ifade edilir (her bir grup için n=5).

Hücre popülasyonu BM (%) PBL(%) Timüs(%) Dalak (%) CD4"/CD8+ 79.3±4.2 Melezleme seviyeleri ayni zamanda nakil-sonrasi 4-ay, 7-ay ve 12-ay seklindeki zaman noktalarinda kromozom XY-FISH ile degerlendirilmistir. Yüksek seviyelerde donör- deriveli BM ile sabit uzun-vadeli yeniden yapilandirma, nakil isleminden sonra sirasiyla melezleme seviyeleri ile tüm zaman noktalarinda gözlenmistir (Sekil 5). ilaveten, donör- deriveli PBL'nin yüzdesi, 4-haftalik GTG seçim periyodundan hemen sonraki seviye CD4+ ve CD8+ hücreleri, B220+ hücreleri ve Mac-1+/Gr1+ hücreleri ve ayrica KLS (Iin" /sca-1+/c-kit*) HSC'ye ait ilgili yüzdeler 4 ayda, 7 ayda ve 12 ayda immünofenotip islemi ile BM'de belirlenmistir (Tablo 6) ve tedavi görmemis disi HPRT-wt (Tablo 2) ve tedavi görmemis erkek HPRT-eksikligi olan (Tablo 3) kontrol fareleri ile karsilastirilmistir. Üç zaman noktasinin tümünde, KLS hücrelerinin 4 ay ve 7 ayda ve HSCT'den sonra 12 ayda normal aralikta yükselmesine ragmen her bir hücre popülasyonunun ilgili yüzdesi kontrollerin yüzdesi karsilastirilabilir olmustur. Bu yüzden, HPRT-eksikligi olan donör- deriveli ilik, nakil-sonrasi en az 12 ay boyunca normal hematopoeze yönelik uzun- vadeli yeniden yapilandirma saglayabilmistir.

Tablo 6. GTG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçimi rejimi kullanilarak HPRT- eksikligi olan BM ile nakil-sonrasi 4 ay, 7 ay ve 12 ayda BM'nin immünofenotipik analizi. 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçimi ile HSCT'den sonra belirtilen zaman noktalari, alici BM hücreleri asagidaki siçan anti-fare antikoriari ile boyanmistir: ve akis sitometrisi ile incelenmistir. Belirtilen hematopoetik hücre alt popülasyonlarinin yüzdeleri toplam CD45+ hücrelerine ait ortalama % ± SD olarak ifade edilir.

Hücre popülasyonu 4 ay BM (%) 7 ay BM (%) 12 ay BM (%) Hücre popülasyonu 4 ay BM (%) 7 ay BM (%) 12 ay BM (%) HPRT-eksikligi olan donör BM'nin kombine 6TG kosullandirmasi ve kemo seçimi ile birbirini izleyen nakil isleminden sonra sekonder alicilarin hematopoetik yeniden yapilandirilmasi 6TG kosullandirmasini kemo seçimi ile kombine eden optimize rejimin, uzun-vadeli yeniden yerlesen HSC'Iere yönelik seçim yapip yapmadigini daha ayrintili olarak degerlendirmek üzere, akabinde BM nakil-sonrasi 7 ayda primer alicilardan ayni rejimi kullanan sekonder alicilara [27] nakledilmistir. Sekonder nakil alicilari akabinde 4- haftalik 6TG in vivo kemo seçiminin bitiminden sonra 3 ay korunmustur (Ek Sekil 83). 6TG kosullandirmasi ve kemo seçiminden sonra, primer alicilari melezlemis olan HPRT-eksikligi olan erkek donör hücreler, sekonder disi alicilari yüksek seviyelerde seri olarak yeniden yerlestirebilmistir (XY-FISH ile belirlendigi üzere %95.5 ± %1.1).

Immünofenotipik analiz, sekonder alicilara ait BM ve PBL'de incelenen tüm hücre popülasyonlarinin yüzdelerinin (Tablo 7), tedavi görmemis kontrollerin yüzdeleri (Tablolar 2 ve 3) ile tekrardan karsilastirilabilir oldugunu ortaya çikarmistir.

Tablo 7. HPRT-eksikligi olan BM'nin 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçimi ile birbirini izleyen nakil isleminden sonra sekonder alicilarda hematopoetik hücrelerin immünopenotipik analizi. 6TG kosullandirmasi ve in vivo kemo seçimi rejimi ile birbirini Izleyen nakil islemi, Sekil 83'te açiklandigi üzere gerçeklestirilmistir.

Sekonder alici BM ve PBL, asagidaki siçan anti-fare antikorlari ile boyanmistir: CD45- FITC (BM, PBL), CD4-PE (BM, PBL), CD8-APC (BM, PBL), Mac1/Gr1-PE (BM, PBL) ve BZZO-PerCP (BM, PBL) ve akis sitometrisi ile incelenmistir. Belirtilen hematopoetik hücre alt popülasyonlarinin yüzdeleri, toplam CD45+ hücrelerine ait ortalama % ± SD olarak ifade edilir (her bir grup için n=6).

Hücre popülasyonu BM (%) PBL (%) Hücre popülasyonu BM (%) PBL (%) CD4+ 4.1±1.0 7.0±3.3 CD8+ 2.4±O.8 7.0±3.2 6TG'yi HPRT-eksikligi olan donör HSC'Ierin ön-nakil kosullanmasina ve ayrica devam eden nakil sonrasi in vivo kemo seçimine yönelik tek bir ajan olarak kullanan optimize bir rejim gelistirilmistir. Bu kombine 6TG kosullandirmasi ve kemo seçimi stratejisi, ilerleyici ve es zamanli bir replasman süreci boyunca düsük genel toksisite ile etkili HSC melezlemesi saglamistir, burada alici konaklar mevcut olsa bile çok az sikinti ve FISH ile -%95 ve CD45.2 immünofenotip islemi ile >%75 melezleme saglayan HPRT- eksikligi olan donör hücreler ile hizli bir sekilde ve neredeyse tamamen degistirilmistir.

Donör-deriveli PBL'nin yüzdesi, bunu takip eden 4-haftalik 6TG seçim periyodunun yüzdesi ile kiyaslandiginda bir süre sonra önemli ölçüde artmistir (nakil-sonrasi 4 ve 7 ay). PBL içindeki kalinti alici hücreler, muhtemelen PBL içindeki bölücü-olmayan olgun hücrelere yönelik daha düsük bir dönüsümü yansitir. BM'nin sabit uzun-vadeli yeniden yapilandirilmasi, hem primer hem de sekonder alicilarda elde edilmistir. BM, PBL, dalak ve timüsün immünofenotip analizi, uzun-vadeli yeniden yapilandirmadan sonra hematopoetik farklilasmanin 6TG in vivo kemo seçiminden etkilenmedigini göstermistir.

Bu sonuçlar ayni zamanda, uygun konsantrasyonlarda, 6TG'nin ekstra-hematopoetik dokularda herhangi bir olumsuz etki olmadan seçici miyelotoksisiteyi indükledigine dair önceki gözlemi dogrular. HPRT tüm somatik hücrelerde [30] düsük seviyelerde ifade edilir ve HPRT kalitsal kaybi, yüksek seviyelerde HPRT ifadesi ve aktivitesinin merkezi sinir sisteminde, özellikle nöral gelisme [32] sirasinda bulunmasindan dolayi siddetli zihin geriligi ve davranissal anormallikler olarak görülen Lesch-Nyhan sendromuna [31] neden olur. Ancak, tamamen farklilastirilan nöronlarin çogalmamasindan dolayi, bu daha yüksek seviyeler olgun yetiskinlerde daha yüksek GTG nörotoksisitesine dönüsmez.

Porter ve DeGregori [22] tarafindan yapilan önceki çalismada, 4.5 Gy olan toplam vücut isinlamasi miyeloablasyon elde etmek üzere kullanilmistir ve 6TG daha sonraki zamanlarda sadece kemo seçimine yönelik kullanilmistir. Aksine, bizim rejimimizde, tek bir ajan olarak 6TG hem kosullandirma (konak BM'nin sitoazalimi) hem de kemo seçici ilaç olma (donör BM'nin büyütülmesi) görevini yerine getirir. 6TG toksisitesinin apoptoz gecikmis bir etkiyi gösterdigi bilinir. Sonuçlar ayni zamanda 6TG'nin doz ve zamana bagli miyelotoksik bir etkisini belirtmistir. Bu yüzden, nakil isleminden önce 10 mg/kg'lik 6TG ile kosullandirma, 6TG miyelotoksisitedeki gecikmeyi telafi ederek ve nakil islemi sirasinda HSC'ye yönelik yeterli bir nis saglayarak 6TG i'n vivo kemo seçiminin sonucunu gelistirebilir. Ek olarak, Porter et al. %5 - 50 araliginda olan degisken melezleme seviyeleri ile sonuçlanarak nakil islemi sonrasi 1 aydan daha uzun bir süre sonra baslayarak kisa bir süre boyunca 0.25 - 2 mg/kg araliginda olan daha düsük dozlarda 6TG kullanmistir. Mevcut çalismada, Hprt-eksikligi olan BM nakledilen farenin nakil-sonrasi hemen baslayan kemo seçici ilacin uygulanmasi ve büyük ölçüde daha uzun seçim periyodlari boyunca devam etmesi yoluyla 6TG dozlarini 5- ila 40-kat daha fazla tolere edebildigi dogrulanmistir. 6TGi'n vivo kemo seçimi stratejisinin kullanimini klinik olarak uygun bir yaklasima dönüstürmek üzere, normal HSC'yi HPRT-eksikligi olan ve bu yüzden 6TG-dirençli olan olarak elde etmek amaci ile genetik olarak degistirmek üzere yöntemler gelistirmek gereklidir. Ilaveten, mevcut çalismanin otolog nakil düzenlemesinde durumu modelleyen bu stratejinin sinojenik farelerde kemik iligi nakline yönelik kullanilmasi ile sinirli oldugu vurgulanmalidir. Bu stratejinin, azaltilmis-yogunluk kosullandirma rejimlerinin klasik miyeloablatif rejimlerin toksisitesinin üstesinden gelmek üzere rutin olarak kullanilmasi nedeniyle allojenik düzenleme ile esit olarak kullanisli olup olmayacagi görülerek belirlenmelidir. Belirtilmesi gerekebilen potansiyel sorunlar, hematopoetik malignitelere yönelik allojenik nakil isleminden sonra Iösemik hücrelerden kaynaklanan spontan 6TG direnci olasiligini ve allojenik donör hücreler seçici bir sekilde in vivo olarak büyütüldügünde graft-versus-host hastaliginin olasi bir sekilde siddetlenmesini içerir.

Referanslar 1093. 1108.

Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th ed. New York: McGraw Hill; 1983. p. 1115-1143. Örnek 2: HPRT-eksikligi olan hücrelerin olusturulmasi Bu örnek, hem farkli HPRT-hedefli shRNA aday dizilerini ifade eden üçüncü- jenerasyon Ientiviral vektörleri hem de HPRTiyi hedef alan çinko parmak nükleazlarinin (ZFN) nükleo transferini kullanan otolog düzenleme ile ex vivo gen terapisi için dönüsümsel uygulamaya yöneliktir. Sonuncu yaklasim, ZFN yapisinin hedef genin kalici olarak nakavt edilmesini saglamak ve böylece genetik mühendisligi prosedürünün bir sonucu olarak eklemeli mutagenez potansiyelini hafifletmek üzere sadece geçici ifadesinin gerekli olmasi nedeniyle avantajlidir. Bu baglamda, bu strateji seçici bir avantajinin kemo direnç elde etmek üzere yeni bir transgenin eklenmesi yerine bir enzim eksikligi yoluyla nakledilen hücrelere aktarilmasi bakimindan essizdir.

HPRT-hedefli shRNA, HPRT'nin tespit edilemeyen seviyelere azaltarak düzenlenmesine yönelik basarili olmustur. Ek olarak HPRT, ZFN kullanilarak basarili Bulus, eklenen istemler haricinde sinirlandirilmaz.

Claims (1)

ISTEMLER . Radyasyonsuz hematopoetik kök hücre (HSC) nakline yönelik bir yöntemde kullanima yönelik bir pürin bazi analogu olup. özelligi pürin bazi analogunun 6- tiyoguanin (GTG) olmasi ve yöntemin asagidaki adimlari içermesidir: (a) bir ön-kosullandirma adimi olarak pürin bazi analogunun 2 ila 10 mg/kg vücut agirligindaki bir veya iki dozunun memeli bir özneye uygulanmasi; (b) hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz (HPRT)-eksikligi olan donör HSC'Ierin ön-kosullandirma adiminda 48 ila 72 saatte özneye melezlenmesi ve (c) 1 ila 5 mg/kg'lik pürin bazi analogunun melezleme adimini takiben iki ila sekiz hafta boyunca her iki ila dört günde bir özneye uygulanmasi; burada yöntem ön-kosullandirma yoklugunda radyasyon araciligiyla gerçeklestirilir. . istem 1'in kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi adim (a) ve adimin (c) kombinasyonu ile özneye uygulanan toplam 6TG dozajinin 105 mg/kg'i geçmemesidir. . Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi adim (a) ve adimin (c) kombinasyonu ile özneye uygulanan toplam 6TG dozajinin 75 mg/kg'i geçmemesidir. . Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi adimin (c) uygulanmasinin 3 günde bir gerçeklestirilmesi ve melezleme adimini takiben dört haftadan daha uzun bir süre gerçeklestirilmemesidir. . Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi öznenin %75'in üzerinde genetik olarak modifiye edilmis hematopoetik hücreler göstermesid ir. Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi öznenin %95'in üzerinde genetik olarak modifiye edilmis hematopoetik hücreler göstermesid ir. Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi nakledilecek HPRT-eksikligi olan HSC'Ierin, çinko parmak nükleazlari (ZFN'Ier), transkripsiyonel aktivatör-benzeri efektör nükleazlar (TALEN'Ier), küçük parçali homolog rekombinasyon (SFHR) kalip zincirleri, inhibitör RNA'Iar (siRNA'Iar) veya mikroRNA'Iar (miRNA'Iar), antisens RNA'Iar, trans-zincirleme RNA'Iari, ribozimler, hücre içi antikorlar veya dominant negatif veya rekabetçi inhibitör proteinleri kodlayan dizilerin eklenmesi araciligiyla HPRT-eksikligi olan olarak elde edilmesidir. Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi nakledilecek HPRT-eksikligi olan HSC'Ierin genetik olarak modifiye edilmis olmasidir. Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi nakledilecek HSCilerin otolog veya sinojenik olmasidir. Istemler

1-8'den herhangi birinin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi nakledilen HSC'Ierin allojenik olmasidir. .Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi öznenin miyeloablatif radyasyon ile tedavi edilmemesidir. .Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi öznenin kalitsal veya genetik bir bozukluk, Ienfohematopoetik hücreleri etkileyen edinilmis bir hastalik veya Ienfohematopoetik bir maligniteye sahip olmasidir. Önceki herhangi bir istemin kullanimina yönelik pürin bazi analogu olup, özelligi öznenin insan olmasidir.