TR201808440T4 - Hendra ve nipah virüsü G glikoproteininin çözünebilen formları. - Google Patents

Hendra ve nipah virüsü G glikoproteininin çözünebilen formları. Download PDF

Info

Publication number
TR201808440T4
TR201808440T4 TR2018/08440T TR201808440T TR201808440T4 TR 201808440 T4 TR201808440 T4 TR 201808440T4 TR 2018/08440 T TR2018/08440 T TR 2018/08440T TR 201808440 T TR201808440 T TR 201808440T TR 201808440 T4 TR201808440 T4 TR 201808440T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
virus
hev
glycoprotein
fusion
niv
Prior art date
Application number
TR2018/08440T
Other languages
English (en)
Inventor
C Broder Christopher
N Bossart Katharine
Original Assignee
Henry M Jackson Found Advancement Military Medicine Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henry M Jackson Found Advancement Military Medicine Inc filed Critical Henry M Jackson Found Advancement Military Medicine Inc
Publication of TR201808440T4 publication Critical patent/TR201808440T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/065—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • C07K14/07—Vaccinia virus; Variola virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/11—Paramyxoviridae (F); Pneumoviridae (F), e.g. respiratory syncytial virus [RSV]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18211—Henipavirus, e.g. hendra virus
    • C12N2760/18222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18211—Henipavirus, e.g. hendra virus
    • C12N2760/18234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18211—Henipavirus, e.g. hendra virus
    • C12N2760/18271—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

Bu buluş, Hendra ve Nipah virüsünden G glikoproteinin çözünebilir formları ile ilgilidir. Özellikle bu buluş, Hendra ve Nipah virüsünden G glikoproteinin çözünebilir formlarını içeren bileşimler ve ayrıca Hendra ve Nipah virüsünden G glikoproteinin çözünebilir formlarının kullanıldığı diagnostik ve terapötik yöntemler ile ilgilidir. Ayrıca buluş, nötralize edici antikorlar ve Hendra ve Nipah virüsleri tarafından enfeksiyonun önlenmesi ve tedavisine yönelik aşıları içeren terapötik antikorlar ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME HENDRA VE NIPAH VIRÜSÜ G GLIKOPROTEINININ ÇÖZÜNEBILEN FORMLARI l. Bulus Sahasi Bu mevcut bulus, Hendra virüsünün bir G glikoproteininin çözünebilen formlari ve Hendra virüsünün G glikoproteinin çözünebilen formunu içeren bilesimler ile ilgilidir. Bulus ayrica bir öznenin Hendra virüsüne karsi asilanmasinin bir yönteminde kullanima yönelik Hendra virüsünün bir G glikoproteininin çözünebilen formlari ile ilgilidir. 2. Altyapinin Açiklamasi Nipah virüsü ve Hendra virüsü, hayvanlar ve insanlarda son zamanlarda taninmayan ölümcül hastaliklardan sorumlu, yeni ortaya çikan virüslerdiri Bu Virüsler, çesitli önemli insan ve hayvan patojenlerini içeren, genis, zarfli, negatif- sens RNA virüslerinin farkli bir grubu olan Paramyxoviridae ailesindeki yeni bir Hem'pavz'rus cinsine ait yakin baglantili üyelerdir. Bu iki virüsün yeni ortaya çikmasinin, belli çevresel ve davranissal degisiklerin zemin hazirladigi yeni konakçilara inaruziyetin sonucu oldugu görülür. Hendra virüsü ilk olarak, hem atlar hem de insanlari ölümcül sekilde etkileyen agir solunum hastaliklari durumlarindan tanimlanmistir. Bunun görülmesinin akabinde, Malezyasda insan ölümleri ile baglantili ciddi bir atesli ensefalit salgini meydana gelmistir. Sonraki çalismalar, simdilerde Nipah virüsü olarak bilinen Hendra benzeri bir virüsü, bu epizodun etiyolojik ajani olarak tanimlamistir. Bu çalismalar, bunlarin insanlari içeren birçok konakçi türünde yüksek ölüm oranlari ile enfekte etme ve hastaliga neden olma kapasiteleri bakimindan paramiksovirüsler arasinda olagan disidir ve zoonotik Biyolojik Güvenlik Seviyesi-4 ajanlaridir. Halihazirda kedilerin, enfekte insanlarda görülen patolojiyi yeniden üretebilen iden küçük hayvan modeli oldugu 01482-P-0002 Nipah ve Hendra virüsü, NIAID seçimi, kategori C virüsleridir ve bunlari biyolojik savas ajanlari olarak kullanilinaya yönelik yüksek oranda adapte edilebilir hale getiren çesitli özelliklere sahiptir. Örnegin hücre kültürü veya embriyonlasmis tavuk yuinurtalarinda kolaylikla büyür, lXlO8 TClDso/ml*ye yakin yüksek konsantre-olmayan titreler üretir, (14) yüksek oranda enfeksiyözdür ve solunum yolu (22, 27) araciligiyla tasinir ve insanlara tasinmaya yönelik bir kaynak olarak islev gören canli hayvanlarda çogaltilabilir ve yayilabilir. Son kanitlar ayrica, ensefalit hastalarindan saglik çalisanlarina kadar NiVlnin nozokomiyal iletilebilirliginin mümkün oldugunu (45, 60) gösterir. Zartli virüslerin membranlarinin alici bir konakçi hücrenin plazma membrani ile füzyonu, viral giris ve enfeksiyon için bir ön kosuldur ve tüm zarIli virüslerin yasam döngüsündeki temel bir adimdir. Bu prosesin mekanizmalarinin dikkatle incelenmesi ve anlasilmasina yönelik arastirma önemli bir çalisma alanidir. Bu sadece viral patojenler ve bunlarin konakçi hücreleri arasindaki kompleks etkilesimler ile ilgili anlayis saglamaz, fakat ayni zamanda protein aracili membran füzyonunun kompleks ve temel biyokimyasal prosesine isik tutabilir ve ayrica yeni müdahale ve asi stratejilerinin gelistirilmesine yol açabilir. Bu HIV arastirma alaninda gösterilmistir, burada giris ve enfeksiyonda yer alan uzun süredir aranan koreseptörlerin kesfi, giris seviyesinde enfeksiyon prosesini bloke etmek üzere terapötiklerin gelistirilmesinde yeni genis bir çag açmistir ((3,18)9de incelenmistir). Paramiksovirüsler, negatif-sens RNA zarfli virüslerdir ve kizamik virüsü (MeV), kabakulak virüsü, Sendai virüsü (SeV), Newcastle hastaligi virüsü (NDV), rinderpest virüsü, köpek gençlik hastaligi virüsü (CDV), insan parainfluenza virüsleri (hPlV) ((36),da incelenmistir) dahil önemli çesitli insan ve hayvan patojenlerini kapsar. Retrovirüslerin aksine paramiksovirüsler, elektron mikroskobu altinda görüldügünde viral partikülün zarf membranindan çikinti yapan spayklar olarak görülen iki temel membran ankrajli glikoproteini içerir. Bir glikoprotein, konakçi 01482-P-0002 hücreye yönelik viriyon baglantisi ile baglantilidir ve belli virüse bagli olarak hemaglutinin-nöraminidaz proteini (HN), hemaglutinin (H) veya hemaglütine edici veya nöraminidaz aktivitelere ((44),te incelenmistir) sahip olinayan G proteini olarak tasarlanmistir. Diger glikoprotein, viral ve konakçi hücre membranlarinin ((36),da incelenmistir) füzyonunun kolaylastirilmasinda direkt olarak yer alan füzyon proteinidir (F). Virüsün seçmeli bir konakçi hücreye baglanmasinin akabinde viriyon ve plazma membranlari arasinda nötral pHide füzyon (veya pHiden bagimsiz olarak) nükleokapsidin sitoplazmaya uygulanmasini ile sonuçlanarak ortaya çikar. Ilgili bir proseste, bunlarin yüzeyleri üzerinde bu viral glikoproteinleri ifade eden hücreler, fizyolojik veya hücre kültürü kosullari altinda çok çekirdeklenmis dev hücrelerin (sinsitya) olusumu ile sonuçlanarak reseptör tasiyan hücrelere kaynasabilir. Zarf glikoproteinleri. HN zarf glikoproteini, hPIVs, NDV, SV5 ve digerlerine yönelik durumda oldugu gibi hedef hücre üzerinde viriyonun bunun reseptörü, siyalik aside baglanmasindan sorumludur. Bunun aksine MeV ve CDV gibi morbillivirüsler, sadece hemaglütine edici aktiviteye sahip olan bir baglanti proteinine (H) sahiptir ve siyalik aside baglanmaz. MeV, bir reseptör (19, 47) olarak hücre-yüzey proteinini kullanabildigi gösterilen birinci morbilivirüstür ve ko-ip deneyleri ve çözünebilir CD46 (48) kullanilarak MeV H glikoproteini ve MeV reseptörü CD46 arasindaki tahmin edilen etkilesimin gösterimidir. Ek olarak MeV alaninin izole olmasinin yani sira asi suslarinin sinyalleme lenfositi aktivasyon molekülünü (SLAM; CDISO) (61) kullanabildigi gösterilmistir. SLAM ayrica CDV (62) dahil diger birkaç morbilivirüse yönelik bir reseptör olarak islev gösterebilir. RSV gibi Pneumovirinadnin sahip oldugu Parainiksovirüs baglanti glikoproteinlerinin üçüncü bir sinifi G ile gösterilir ve hemaglütine edici veya nöraminidaz aktivitelerine ((44),te incelenmistir) sahip degildir. Baglanti glikoproteinler, molekülün amino (N)-termina1inin sitoplazmaya yönelik olarak yönlendirildigi ve proteinin karboksi (C)-terminalinin hücre disinda oldugu tip II 01482-P-0002 membran proteinleridir. Diger büyük zarf glikoproteini füzyon (F) glikoproteindir ve bu virüslere ait F daha çok benzerdir, burada tüm durumlarda bu direkt olarak, nötral pHsde virüs ve konakçi hücre arasindaki füzyona aracilik edilmesinde yer Paramiksovirüslerin F glikoproteini, proteinin N-terminalinin hücre disinda olmasi ile birlikte bir tip I integral membran glikoproteinidir. HIV-Pe ait gplZO/gp4l ve influenza virüsüne ((26),da incelenmistir) hemaglutinin (HA) gibi zarf glikoproteinini (Env) içeren diger viral füzyon proteinleri ile çesitli korunmus özellikleri paylasir. Biyolojik olarak aktif F proteini, F0 ((34, 55)"te incelenmistir) olarak bilinen bir prekursör polipeptidin proteolitik klevaji ile üretilen disülfit bagli iki alt birimden, F1 ve F2, olusur. Ayni sekilde HIV-I Env ve influenza HA, F3 ile analog bir membran distal alt birimi ve F1 ile analog membran ankrajli bir alt birimin üretimine yol açarak, bir konakçi hücre proteazi tarafindan proteolitik olarak aktive edilir. Tüm durumlarda membran ankrajli alt birim, virüs aileleri boyunca hidrofobik ve yüksek oranda korunmus olan ve füzyon peptidi ((30),da incelenmistir) olarak refere edilen yeni bir N-terminalini içerir. Su ana kadar incelenen tüm paramiksovirüsler, HN'nin (50) eksikliginde bazi ûizyonlara aracilik edebilen SV5 istisnasi ile birlikte etkili füzyona yönelik olarak bir baglanti ve F proteini gerektirir. Bu glikoproteinler arasindaki bi fiziksel bagin kaniti, sadece sinirli basari ile ve sadece NDV (57), hPIV (73) ile ve son zamanlarda MeV (51) ile gözlenmistir, ancak bu gözlemler genellikle kimyasal çapraz baglama ajanlarinin yardimi ile olmustur. Reseptör baglantisinin akabinde, baglanti proteinin viriyon/hücre iîîzyonuna (35, 53) neden olan F°de bir konformasyonel degisimi bir sekilde sinyallemesi ve indüklemesi gerektigi hipotezi kurulur. Bunlarin tek basina veya kombinasyon halinde ifade edilmesine bagli olarak bir paramiksovirüse ait HN ve F ,de bulunan bu konformasyonel farkliliklar, uzun bir süredir (13) belirtilmistir. Retrovirüslere ait olanlar gibi Paramiksovirüs F zarf glikoproteinlerinin, sinif 1 membran füzyon tipi proteinler oldugu düsünülür. Bu virüslerin füzyon 01482-P-0002 glikoproteinlerinin önemli bir özelligi, füzyon (29, 56) sirasinda veya bunun hemen akabinde bir saç tokasi trimeri yapisinin olusumunda yer alan yedilik tekrarlar olarak refere edilen 2 (ni-sarmal bölgelerin varligidir. Bu bölgelere ayrica, amino (N)-terminal ve karboksil (C)-terminal yedilik tekrarlar (veya HR] veya HR2) olarak refere edilir ve bu bölgelerin birine karsilik gelen peptitler, HIV-1 zarf glikoproteinin (32, 67) gp4l alt biriminden elde edilen diziler ile ilk olarak belirtilmek üzere füzyon prosesi sirasinda bulundugunda viral füzyon glikoproteininin aktivitesini inhibe edebilir. Esasen HIV-l füzyon inhibe edici peptitler, kinik basarilari karsilasmistir ve bunlarin ilk onaylanan füzyon inhibitör terapötikleri olmasi mümkündür. SVS, MeV, RSV, hPIV, NDV ve SeVsye ait Flnin N veya C yediliklerinden peptit dizilerinin ayrica güçlü füzyon (33, 37, 52, 68, 74, 75) oldugu gösterilmistir. Önemli konformasyonel degisikligin, paramiksovirüs F füzojenik aktivitenin aktivasyonu sirasinda meydana geldigi genel olarak kabul edilir. Prekursörün ve SVS F3nin (20) proteolitik olarak islenmis formlarinin ve SV5 F°nin (2) post füzyon 6-sarmal demetinin yapisi ile baglantili ayrimsal antikor baglama reaktiviteleri, sadece pre-füzyondan post- füzyon yapisal degisiklikten degil, ancak ayni zamanda F0 prekursöründen Fz-Fl olgun proteinine kadar olmak üzere konfonnasyonel degisiklik modelini güçlü sekilde destekler. Bir paramiksovirüs F çekirdeginin post-füzyon yapisinin muhtemelen diger paramiksovirüsler boyunca korunmasi ayrica RSVlnin (79) ve MeVHiin (80) F çekirdek yapilari tarafindan desteklenmistir. Ancak NDV°nin F glikoproteini ile ilgili son yapisal çalismalar bazi farkli ve ilgi çekici bulgular saglamistir. NDV F°nin oligomerik trimer yapisi (pre-füzyon veya meta-stabil durumda) bunu klasik influenza HA yapisindan ayirt eden bazi alternatif bilgiler sunmustur, bu prensip olarak trimerin (9, 10) HR] (ayrica HRA olarak adlandirilir) segmentleri tarafindan olusturulan merkezi sarili sarmallarin tamamen zir oryantasyonunda yansitilir. Su ana kadar bu sadece, bir parainiksovirüs F "nin pre-füzyon (veya meta-stabil) formu hakkindaki yapisal bilgidir (essen sadece diger meta-stabil, sinif I, influenza HA disinda yapi) ve viral Iîizyon proteinlerinin muhtemel bir üçüncü sinifini temsil eder. 01482-P-0002 Füzyon ve baglanti glikoproteinlerinin füzyona aracilik edilmesi ile nasil uyum içinde islev gösterdiginin tam olarak anlasilmasi henüz açikliga kavusturulmamistir, ancak NDV,ye ait HN glikoproteini kapsaminda, Morrison ve is arkadaslari (41) tarafindan son zamanlarda detayli olarak açiklanan paramiksovirüs aracili membran füzyon prosesinde baglanti glikoproteininin rolüne yönelik olarak ileri sürülen iki merkezi model vardir. Birinci modelde füzyon ve baglanti glikoproteinleri membranda fiziksel olarak baglantili degildir ancak reseptör baglantisinin akabinde, bunun F ile baglanmasini kolaylastiran ve böylece membran füzyonuna yol açarak F konformasyonel degisimini uygulayan veya kolaylastiran baglanti glikoproteininde degisiklik vardir. Ikinci modelde F ve baglanti glikoproteini önceden baglanir ve reseptör baglantisi, baglanti glikoproteinindeki konformasyonel degisikligi indükler ve bu proses, F7nin bunun füzyon aktif haline - membranin birlesmesinden hemen önce veya buna eslik eden sekilde 6-sarrnal demetinin olusumuna dogru ilerlemesine olanak taniyan F ile etkilesimi degistirir veya serbest birakir. NDV ile ilgili bulgular, proses sirasinda HRl bölgesinin degisken erisilebilirligini gösterir, burada F°ye ait HRl, F HN baglaminda gösterildiginde spesifik füzyon inhibe edici antikor için erisilebilirdir, ancak tek basina F"nin ifadesia antikora (41) bu noktadan sonra erisilebilir olmayan bir HRl bölgesine sahip farkli sekilde degistirilmis konformasyona sahip F"nin Iîizoj enik olmayan bir versiyonu ile sonuçlanir. Ikinci model, baglanti glikoproteinin F"yi füzojenik olmayan konformasyonunda tutmasidir ve reseptörün baglanmasinin ve baglanti glikoproteini Fsdeki konformasyonel degisikligin üzerine F, 6-sarma1 demeti olusumuna ve inembran füzyonunun kolaylastirilmasina yol açan konformasyonel degisikliklere girecek sekilde serbest birakilir. Bu, tek basina ifade edilen parainiksovirüs F ,nin füzyona aracilik etmemesi (belli kosullar altinda SVS istisnasi ile) ve NDV F HRI bölgesi (41) gibi belli bölgelere degisken antikor erisilebilirligine sahip olmamasi gözlemleri ile desteklenir. Bunun nedeni muhtemelen F "nin tek basina, ayrica ölü spayklar (17) olarak refere edilen füzyon defektif veya tetiklenmis HIV-I gp4l ,in gözlemleri ile tutarli olinak üzere uygun bir anda tetiklenmis bir füzyona veya ara konformasyona geçmesidir. HeV ve NiEV ile ilgili ön bulgular bu ikinci modeli 01482-P-0002 destekler. Son olarak reseptöre baglandiginda bir paramiksovirüsün baglanti glikoproteininin spesifik konformasyon degisikligi geçirmesi son zamanlarda, NDV,nin (58, 59) HN glikoproteini ile ilgili çalismalardan moleküler seviyede ortaya çikarilmistir. Bu çalismalar, reseptöre bagli glikoprotein reseptöre bagli olmayan HN yapisi ile karsilastirildiginda HN,nin yapisindaki net farkliliklari ortaya çikarmistir. Ek olarak bilinen tüin viral zarf glikoproteinleri bunlarin olgun ve fonksiyonel forrnalarinda ((16),da incelenmistir) homo- veya heterooligomerlerdir. Bunlar gibi multimerik proteinler genellikle genis alanlar üzerinde etkilesim kurar, böylece monomerik alt birimler ve olgun oligomer arasinda muhtemelen yapisal farkliliklar olusur (31). Bu özellik ayrica antijenik yapida farkliliklara çevrilebilir ve birçok protein, en belirgin sekilde trimerik influenza HA glikoproteini (69) ve HIV-I gp 120/gp41"e (7) yönelik olarak gösterilmistir. Esasen trimer spesifik, güçlü nötralize edici bir determinant, HAtnin birlesen alt birimlerinin arasindaki arayüz ile eslestirilmistir ve oligomer spesifik anti-HIV-l Env antikorlari tanimlanmistir ve gp41"de (7) konformasyona bagli epitoplar ile eslestirilmistir. Böylece tüm paramiksovirüsler, retrovirüsler ve influenza virüsü füzyon glikoproteinlerinin homotrimerler (8, 9, 21, 54, 71) oldugu görülür ve birkaç HN baglanti proteininin, homodimerlerin bir dimerinden olusmak üzere tetramerik oldugu gösterilmistir. Örnegin NDV HN viral yüzey (40, 43) üzerinde dimerleri ve tetramerleri olusturabilir ve son zamanlarda NDV3den HN dimerinin globüler bas bölgesinin kristal yapisi çözülmüstür (15). Son olarak ve bu virüslere yönelik immün yaniti ve asilarin gelistirilmesinin belli açilarinin anlasilmasinda önemli olan, neredeyse tüm virüs nötralize edici antikorlarin yöneltildigi bu virüslerin büyük zarf gliproteinleridir. Ortaya çikan patoienik paramiksovirüsler. 1994,te, yeni bir paramiksovirüs, atlar ve insanlardaki solunum hastaliginin ölümcül vakalarindan izole edilmistir ve MeV ve morbilivirüs cinsinin diger üyeleri ile uzaktan baglantili oldugu gösterilmistir; geçici olarak at inorbilivirüs (EMV) olarak adlandirilmistir, ancak o zamandan bu yana Hendra virüsü (HeV) (46) olarak yeniden adlandirilmistir. Hendra Avustralya"nin Brisbane banliyösünde ciddi solunum hastaliginin ilk 01482-P-0002 salgini 13 at ve egitmeninin ölümü ve stabil bir el ve diger 7 atin ölümcül olmayan enfeksiyonu ile sonuçlanmistir. Yaklasik olarak ayni zamanda, Hendra`nin yaklasik 100 km kuzeyinde baglantisiz bir olayda 35 yasindaki bir erkek, sonrada HeV enfeksiyonu sonucunda öldügü gösterilen iki ata baktiktan ve nekropsilerinde yardiinci olduktan sonra kisa bir aseptik menenjitik hastaligi yasamistir. On üç ay sonra bu kisi, kontrollü olmayan fokal ve genel epileptik aktivite ile karakterize edilen ciddi ensefalitin nüksetmesinden sikayetçi olmustur. Seroloji, PCR, elektron mikroskopisi (EM) ve immünohistokimya dahil olmak üzere bu fatalitenin degerlendirilmesinde gerçeklestirilen çesitli çalismalar, HeV'nin esasen bu hastanin ensefalitinin nedeni oldugunu ve virüsün 13 hafta önce (49) HeV ile enfekte olmus atlardan edinildigini ileri sürmüstür. Toplamda on bes at ve iki insan iki epizotta ölmüstür. Ayni zamanda, ortaya çikan virüsün kaynagi belirlenmis degildir, ancak son zamanlarda, yaygin olarak uçan köpekler olarak bilinen bazi Avustralya meyve yarasasi türlerinin yaklasik olarak virüslerin yarasa uterin sivilarindan izole edilmistir. Bu hayvanlarin, virüs (22, 24, , 76) için dogal konakçi oldugu görülür. Son zamanlarda HeV genlerinin nükleik asit dizisi analiz edilmistir ve diger paramiksovirüslerinki (64, 77, 78) ile karsilastirilmistir. Bu çalismalar, HeV5nin, Paramyxovi'ridae, alt aile Paramyxovirinaesnin bir üyesi oldugunu dogrulamistir. Bu olaylarin sonrasinda, 19983de Malezya ve Singapur"da domuzlar ile yakin temas maruziyeti olan insanlarda ciddi ensefalit salgini meydana gelmistir (1). Salgin ilk olarak Eylül 1998,de ve Haziranin ortasina kadar 1999,da not edilmistir, 105 ölüm dahil 265 ensefalit vakasi Malezya"da rapor edilmistir ve bir Ölüm ile 11 hastalik vakasi Singapufda rapor edilmistir. Bu salgin, günümüze kadar devam eden büyük negatif bir ekonomik etkiye sahiptir. Basarili olmasina ragmen salginin ilk günlerinde alinan önlemler, yaklasik olarak 1.3 milyon domuzun katledilmesi ve Malezya yarimadasinda domuz çiftligi endüstrisinin neredeyse kapanmasi ile sonuçlanmistir. EM; serolojik ve genetik çalismalar, bu virüsün ayrica bir paramiksovirüs oldugunu ve HeV ile yakindan baglantili 01482-P-0002 oldugunu göstermistir. Bu virüs, ilk izolatin Ölümcül bir insan vakasinin (l 1, 12, 23, 38, 39) serebrospinal sivisindan elde edildigi Malezya,nin küçük bir sehrinden sonra Nipah virüsü (NiV) olarak adlandirilmistir. Birçok insan hasta, Malezyaida 1998-1999 salgininin sonunda yaklasik olarak enfeksiyon ayni zamanda serokonversiyon ile ensefalitik olmayan veya asemptomatik bir episod olarak bulunabilir. Ilginç sekilde NiV enfeksiyonu ayrica, ensefalitik olmayan veya asemptomatik bir enfeksiyonun akabinde geç (10 haftadan daha fazla) meydana gelen daha ciddi nörolojik hastalik ile daha kronik bir süreç alabilir. Diger taraftan nörolojik belirtilerin (tekrarlayan ensefalit) nüksetmesi ayrica, daha önceden akut ensefalitten iyilesen hastalarda gösterilmistir. Tekrarlayan ensefalit vakalari ilk enfeksiyondan (72) sonra birkaç aydan yaklasik olarak iki yila kadar bulunmustur. Birlikte alindiginda %18'lik bir mortalite orani ile geç ensefalitik belirtilerin %10,a yakin bir insidans orani vardir. Böylece hem NiV hem de HeV ile birlikte uzatilmis bir enfeksiyon periyodu, ciddi nörolojik hastaligin meydana gelmesinden önce mümkündür. Bu Virüsler, özellikle de NiV°nin bu türdeki uzatilmis periyoda yönelik immünolojik klirensten kaçmasina olanak taniyan altta yatan mekanizma tamamen bilinmez. NiV°nin durumda nörolojik hastalik ve lgG alt sinifi yanitlarinin sonradan gösterimi, MeV enfeksiyonunun (72) nadir bir geç belirtisi olan subakut Sklerozan panensefalit (SSPE) ile benzerlikler göstermistir. Bunlari yeni paramiksovirüslerden ayira, HeV ve NiVanin moleküler karakterizasyonudur. Paramyxoviridae, Filovi'ri'dae, Rhabdovi'ridae, ve Bornavi'ridae ailelerinin tümü, benzer genom organizasyonu, replikasyon stratejileri ve polimeraz bölge yapisi (63) tasiyan negatif-sens RNA zarfli virüslerdir. Bu aileler, aile seviyesinin üzerindeki Virüs taksonomisinin birinci taksonu olan Mononegavirales sinifinda gruplandirilir. Mononegaviraleslteki genom boyutu ~8.9-l9. lkb olmak üzere çok çesitlidir. Bir grup olarak paramiksovirüslerin genoinlarinin genellikle siki sekilde yaygin oldugu, Filoviridae,ye boyut olarak daha yakin olmak üzere genomlari 01482-P-0002 18.2 kb olan HeV ve NiVSnin disinda 15.1-15.9 kb araliginda boyutlara sahip oldugu düsünülür. Eklenen bu uzunlugun çogu, tekrardan Marburg ve Ebloa Filovirüsleri (63) ile çok benzer olmak üzere alt transkripsiyon biriminde 3›a ucundaki transle edilmemis bölgelerdir. Ayrica P proteini 100 kalinti ile daha büyüktür (bilinen en uzun) ve bilinmeyen fonksiyona sahip HeV7deki küçük bir bazik proteindir (SB).Birlikte alindiginda hem HeV hem de NiVinin moleküler özellikleri, bunlarin insanlari içeren birçok türde potansiyel olarak ölümcül hastaliga neden olma yeteneginin yaptigi gibi bunlari olagan disi paramiksovirüsler haline getirir. Patojenez. Yeni tanimlanan bu viral zoonozlari incelemek üzere hayvan modellerinin gelistirilmesi veya karakterizasyonu, bunlarin patojenik özelliklerinin anlasilmasina yönelik olarak ve terapötiklerin gelistirilmesinde önemlidir. Insanlardaki HeV enfeksiyonunun iki ölümcül vakasindan ilki, havalandirmali yasam desteginde birkaç günün sonrasinda ciddi solunum hastaliginin sonucudur. Hastanin akcigerleri, sinsitya ile histolojik kronik alveolit ile baglantili büyük konjesyon, hemoraji ve ödem lezyonlarina sahiptir. Ikinci ölümcül vaka, 1 yildan daha fazla öncesinde ilk enfeksiyondan sonra ((27),de incelenmistir) lenfositler ve beyin parenkimasinin çesitli kisimlarindaki plazma hücreleri be nekroz odak noktalari ile leptomenenjitli olandir. Çok çekirdekli endotelyal hücreler ayrica iç organlarin yani sira beyinde de görülmüstür. Bunun aksine NiV enfeksiyonu olan çok daha fazla insan vakasi vardir. Malezya ve Singapursda genis NiV salginindan kaynaklanan 30`dan fazla kisinin otopsisi yapilmistir ve immüno- ve histolojik özellikler, vaskülit, tromboz, iskemi ve nekrozun ((27),de incelenmistir) eslik ettigi sistemik endotelyal enfeksiyonu içerir. Bu degisiklikler özellikle merkezi sinir sisteminde (CNS) belirtilmistir. Immünohistokimyasal analiz ayrica endotelyal hücreler ve etkilenmis damarlarin (27) ortaminda olmasinin yani sira nöronlarda ve CNS"de görülen nekrotik odak noktalarindaki diger parenkimal hücrelerde NiV antijenlerinin yaygin varligini göstermistir. Enfekte insanlarda vaskülit ve endotelyal enfeksiyon kaniti ayrica, incelenen birçok organda görülmüstür. Yaygin endotelyal hücre enfeksiyonu, 01482-P-0002 vaskülit ve CNS parenkimal hücre enfeksiyonu, insanlarda ((27),de incelenmistir) NIV enfeksiyonunun ölümcül sonucunda temel bir rol oynar. Dogadaki prensip zoonotik episodlar, HeV vakalarindaki at ve NiV vakasinda domuzu içerir. Bu virüslerin her ikisi de in vitro çalisinalarda (4,5) belirgin bir genis konakçi hücre tropizinine sahiptir. Bu gözlemler, dogal ve deneysel enfeksiyonda gözlenmis olan ile baglantilidir. At ve doinuzun deneysel enfeksiyonlari, sirasiyla HeV ve NiV ile gerçeklestirilmistir ve dogal olarak NiV ile enfekte olan bir at incelenmistir. Atlarda virüsün neden oldugu patolojinin, domuzlarda NiVanin neden oldugundan çok daha ciddi oldugu görülür. Domuzlara ek olarak kedilerin HeV enfeksiyonu ayrica gerçeklestirilmistir ve bu durumda hastalik, akcigerde (28) görülen en ciddi etkilere sahip genel vasküler hastalik ile karakterize edilen atlarda görülene benzer. Gine domuzlari ayrica deneysel olarak HeV (28) ile enfekte edilmistir ve patolojinin, dogal ve deneysel olarak enfekte edilen atlarin yani sira insan vakalarina kiyasla birkaç konuda önemli farkli oldugu görülmüstür. Gine domuzlarinda HeV genel vasküler hastaliga neden olmustur, ancak atlar ve kedilerin aksine çok az pulmoner ödem vardir veya hiç yoktur. Histolojik olarak vasküler hastalik arterler ve damarlarda ve akciger, böbrek, dalak, lenf dügümleri, gastrointestinal kanal ve iskelet ve interkostal kaslarda yaygindir. Gine domuzunun NiV enfeksiyonu henüz iyi açiklanmamistir. Diger küçük laboratuvar hayvan modelleri ile ilgili olarak NiV ve HeV, subkütanöz uygulamadan sonra dahi farelerde hastaliga neden olmaz, ancak ve sasirtici olmamak üzere bunlar, intrakraniyal olarak uygulanmasi halinde fareleri Öldürecektir. Ayrica Malezyafda kemirgenlerde NiViye yönelik herhangi bir serolojik kanit yoktur ve birkaç yüz serum salgin sirasinda test edilmistir. Dogal NiV enfeksiyonlarinin kaniti ayrica köpekler ve kedilerde gösterilmistir. Kedinin deneysel NiV enfeksiyonunda ciddi klinik isaretlere sahip hayvanlarda büyük lezyonlar, HeV ile enfekte olan kedilerinkine güçlü sekilde benzerdir. 01482-P-0002 Bunlar, hidrotoraks, akcigerlerde ödem ve pulmoner lenf dügümleri, bronslarda köpük ve akcigerde yogun mor-kirmizi konsolidasyondan olusur. Histolojik görünüm, yaygin perivasküler, peribronsiyal ve alveoler hemoraji ve ödem, arterler ve arteriyolleri etkileyen vaskülitler, alveolitler, endotelyal hücreler ve alveoler epitelyum hücrelerinde ((27),de incelenmistir) sinsityum olusumu bakimindan benzer özellikler vardir. Birlikte alindiginda, bu zamana kadar olan kanit, kedinin bir hayvan modelini temsil ettigini gösterir, böylece en yakindan görülen patoloji, ölümcül insan hastaligi sürecine benzer. Ek olarak kedilerin NiV veya HeV ile enfeksiyonu esit sekilde ölümcüldür. NiV ve HeV,nin bazi belirgin varyasyonlar ile benzer hastaliklara neden oldugu görülür ve temel patolojik proseslerin iyi açiklanmis olmasina ragmen, enfekte olan türlere bagli olarak hastalik sürecini açik sekilde etkileyen faktörler hakkinda çok az sey bilinir. Bu, insan enfeksiyonlarindaki özel bir konudur, burada ciddi ve genellikle ölümcül hastaligin nüksetmesine neden olmasindan önce bu virüslerin konakçida kalici olma (2 yila kadar) kalmasina yönelik göze çarpan bir özellik vardir. Kediler, subkütanöz enfeksiyon ve 50,000 ile subkütanöz veya oral uygulamaya karsi direnemeyip 6-8 gün içinde ölür. Kedilerin NIV ile deneysel enfeksiyonu, bu türlerin ile oronazal enfeksiyona karsi duyarliligini dogrulamistir. Kisacasi kedilerde NiV tarafindan indüklenen klinik ve patolojik sendrom, NiV ile ölümcül enfeksiyonda viral antijenin varligi ile baglantili olarak solunum epitelyumunun kapsamli inflamasyonunun olmasinin disinda bu türlerdeki HeV enfeksiyonu ile baglantili olmasi ile karsilastirilabilirdir. Kisacasi önemli sayida insan fataliteleri ile sonuçlanan tekrarlayan NiV salginlari son zamanlarda dogrulanmistir (Fatal fruit bat virus sparks epidemics in southern fatalitelere neden oldugu bilinir ve NiV ile genetik olarak immünolojik olarak yakin baglantilidir. Halihazirda Nipah virüsü veya Hendra virüsünün neden oldugu enfeksiyon veya hastaligin önlenmesine yönelik herhangi bir asi veya terapötik yoktur. Nipah virüsü ve Hendra virüsü, Amerika Birlesik Devletleri, 01482-P-0002 Ulusal Alerji ve Enfeksiyöz hastalik Enstitüsü, C kategorisi, biyolojik savunma konusunda öncelikli ajanlardir. Ayrica bu virüslerin zoonotik Biyolojik Güvenlik Seviyesi 4 ajanlari (BSL-4) olmasi nedeniyle asilar ve/veya diagnostiklerin güven ile üretimi oldukça maliyetlidir ve zordur. Böylece asilar ve/veya diagnostiklerin yüksek verimlilik ile üretilmesine olanak taniyan Nipah virüsü veya Hendra virüsü asilari ve diagnostiklerine yönelik ihtiyaç vardir. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut tarifname, mevcut stratejiler ve tasarimlar ile baglantili problemler ve dezavantajlarin üstesinden gelir ve Hendra virüsünün G zarf glikoproteinin çözünebilen forinlarinin tasarimi, üretimi ve kullanimina yönelik yeni aletler ve yöntemler saglar. Bir açida, bulus Hendra virüsü G proteininin ekto bölgesinin çözünebilen peptit monomerlerinin bir oligomerini saglar, burada bir monoiner Hendra virüsü G proteininin amino asitleri 71-604"ünün amino asit dizisini içerir; burada bir monomer Hendra virüsü G proteininin tam amino asit dizisini içennez; ve burada bir monomer asagidaki unsurlardan olusan gruptan seçilen dogal bir Hendra virüsü G proteininin bir veya daha fazla karakteristigini korur: viral bir konakçi hücre reseptör hücresi ile etkilesim kurma yetenegi, bir antikor reaksiyonunu ortaya çikarma yetenegi, nötralize edici bir antikor reaksiyonu ortaya çikarma yetenegi, bir konakçi hücrenin Hendra virüsü tarafindan enfeksiyonunu bloke etme veya önleme yetenegi. Diger bir açida, bulus birinci açinin oligomeri ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içeren bir farmasötik bilesim saglar. Diger bir açida, bulus bir öznenin Hendra virüsü enfeksiyonuna karsi asilanmasinin bir yönteminde kullanima yönelik Hendra virüsü G proteininin ekto bölgesinin çözünebilen peptit monomerlerinin bir oligomerini saglar, burada monomerler i) Hendra virüsü G proteininin ekto bölgesinin monomerleridir ancak transmembran bölgenin tümünü veya bir kismini ve sitoplazmik kuyrugun tümünü 01482-P-0002 veya bir kismini içermez; ii) Hendra virüsü G proteininin amino asitleri 71-604,ün amino asit dizisini içerir; ve iii) asagidaki unsurlardan olusan gruptan seçilen dogal bir Hendra virüsü G proteininin bir veya daha fazla karakteristigini korur: Viral bir konakçi hücre reseptör hücresi ile etkilesim kurma yetenegi, bir antikor reaksiyonunu ortaya çikarma yetenegi, nötralize edici bir antikor reaksiyonu ortaya çikarma yetenegi, bir konakçi hücrenin Hendra Virüsü tarafindan enfeksiyonunu bloke etme veya önleme yetenegi. Ayrica burada açiklananlar Nipah virüsünden elde edilen çözünebilir bir G proteinini kodlayan polinükleotidler veya polipeptitler veya parçalaridir. Ayrica burada açiklananlar, Hendra virüsü ve/veya Nipah virüsünden elde edilen çözünebilir G proteinin üretilmesinin yöntemleridir. Ayrica burada açiklananlar, Hendra virüsü ve/Veya Nipah virüsünden elde edilen çözünebilir bir G proteini kodlayan polinükleotidleri içeren ifade vektörleridir. Ayrica burada açiklananlar, çözünebilir peptit monomeri kodlayan bir polipeptit ve çözünebilir polipeptit monomerlerinin stabilitesini arttiran, çözünebilir peptit monomerlerinin immünojenesitesini arttiran ve/Veya çözünebilir peptit monomerlerinin saflastirilmasinda yardimci olarak bir veya daha fazla diger polipeptidi içeren füzyon proteinleridir. Ayrica burada açiklananlar, Hendra ve/veya Nipah virüsünden elde edilen çözünebilir bir G proteinine spesifik olan nötralize edici antikorlar gibi antikorlar ve parçalari ve bu tür antikorlarin diagnostigi ve/Veya terapötik uygulamasidir. Ayrica burada açiklanan, bulusun oligomerlerini içeren bir alt birim asisidir. 01482-P-0002 Ayrica burada açiklananlar, bir öznede Hendra ve/veya Nipah virüsü ile enfeksiyonun önlenmesinin veya bir Öznede Hendra ve/veya Nipah Viiüsünün bir enfeksiyonunun azaltilmasinin yöntemleridir. Ayrica burada açiklananlar tarifnamenin polinükleotidleri, polipeptitleri ve/veya antikorlarini içeren diagnostik kitlerdir. Bulusun diger düzenlemeleri ve avantajlari, bu açiklamayi takip eden ve kismen buradan açik olabilen veya bulusun uygulamasindan ögrenilebilen açiklamada kismen açiklanir. Sekillerin ve Tablonun Açiklamasi Sekil 1, çözünebilir HeV G zarf glikoproteininin ifadesini gösterir. Bir myc etiketi veya S etiketi çözünebilir HeV G"yi kodlayan vaksinia virüsü, HeLa hücrelerinde metabolik etiketleme yoluyla üretilmistir. Kontrol, dogal sus HeV G'dir. Her bir SG yapisinin spesifik çökelmesi, myc MAb veya S boncuklari kullanilarak lizatlar veya üst fazlardan çökeltme yoluyla gösterilir. Sekil 2, HeVlnin inhibisyonu ve SG S etiketi tarafindan NiV aracili füzyonu gösterir. HeLa hücreleri, T7 RNA polimerazi (efektör hücreler) kodlayan bir vaksinianin yani sira HeV F ve HeV G veya NiV F ve NiV G glikoproteinlerini kodlayan vaksinia rekombinantlari ile enfekte edilmistir. Gösterilen her bir hedef hücre tipi, raportör vaksinia virüsü vCB21R,yi kodlayan Ecoli' LacZ ile enfekte edilmistir. Her bir hedef hücre tipi (1 X 105), 96 gözlü bir plakanin ikili gözlerinde kaplanmistir. SG S etiketi veya kontrol üst fazlari eklenmistir ve 30 dakika 37°C,de inkübe edilmistir. heV veya NiV glikoproteini ifade eden hücreler (1 X 105) akabinde her bir hedef hücre tipi ile karistirilmistir. 37°C°de 2.5 saat sonra Nonidet P-40 eklenmistir ve ß-Gal aktivitesi ölçülmüstür. Paneller A ve B: SG S etiketi ile enfekte edilmis üst faz veya WR ile enfekte edilmis üst faz tarafindan U HeV aracili 01482-P-0002 füzyonun inhibisyonu. Paneller C ve D: sG S etiketi tarafindan U373 hücrelerinde (Panel C) veya PCI 13 hücrelerinde (Panel D) HeV ve NiV aracili tüzyonun inhibisyonu. Paneller E ve F: Satlastirilmis SG myc etiketi tarafindan U373 hücrelerinde (Panel E) veya PCI 31 hücrelerinde (Panel F) HeV ve NiV aracili füzyonun inhibisyonu. Sekil 3, sHeV G zarf glikoproteini ile boyanan seçmeli ve seçmeli olmayan hücre hatlarinin dolayli immünoflorensansini gösterir. Hücreler, uygun ortamda 8 gözlü Lab-Tek II bölmesinin lamlarinda kaplanmistir ve 3 gün inkübe edilmistir. Hücreler aseton ile 2 dakika sabitlenmistir. HeLa hücreleri, bir füzyon seçmeli olmayan hücre hattini gösterirken U373, PCI 13 ve Vero füzyon seçmeli hücre hatlarini gösterir. Hücreler, bir anti-HeV G spesifik tavsan antiserumu ve bir esek anti-tavsan Alexa Fluor 488 konjugatinin akabinde sG S etiketi ile boyanmistir. Numuneler, yansitmali bir isik Iloresani baglantisi ve bir Olympus U-M41001 filtresi ile bir Olympus mikroskobu ile incelenmistir. Tüm görüntüler, 40x,lik bir orijinal büyütmede bir SPOT RT CCD dijital kamerasi ile elde edilmistir. Panel A: sG S etiketi ve esek anti-tavsan Alexa Fluor 488 konjugati. Panel B: SG S etiketia anti-HeV G antiserumu ve esek anti-tavsan Alexa Fluor 488 konjugati. Sekil 4, çözünebilir NiV G zarf glikoproteininin ifadesini gösterir. S etiketi çözünebilir HeV G"yi kodlayan vaksinia virüsü veya S etiketi çözünebilir HeV G veya NiV G"yi kodlayan plazmid ifadesi vektörleri, HeLa hücrelerinde metabolik etiketleme yoluyla üretilmistir. Her bir sG yapisinin spesifik çökeltilmesi, S boncuklari kullanilarak Iizatlar veya üst fazlardan çökeltme yoluyla gösterilir. Sekil 5, çözüncbilir HeV G zarf glikoproteininin oligomerik yapilarinin analizini gösterir. HeLa hücreleri, vaksinia Virüsünü kodlayan sHeV G (S etiketi) ile enfekte olmustur ve 37°C,de 16 saat inkübe edilmistir (6 gözlü bir plakanin 4 gözü). Enfeksiyondan 6 saat sonra baslanarak hücreler bir gece [358]-met/cys ile metabolik olarak etiketlenmistir. Üst fazlar çikarilmistir, santrifugasyon yoluyla berraklastirilmistir, konsantre edilmistir ve tampon PBS içinde degistirilmistir. 01482-P-0002 sHeV Ganin yarisi (400 ul) akabinde, 100 mM Tris pH 7.5 ile söndürülen DTSSP baglanmistir. Çapraz baglanan ve çapraz baglanmayan preparatlar akabinde iki esit parçaya bölünmüstür ve sürekli (%5-20) sükroz gradyanlari (4 gradyan) üzerinde katmanlanmistir ve parçalara ayrilmistir. Tüm fraksiyonlar akabinde S- protein agarozu ile çökeltilmistir ve metabolik olarak etiketlenen sGinin numuneleri, indirgeyici ve indirgeyici olmayan kosullar altinda %10 SDS-PAGE ile çözülmüstür ve otoradyografi ile saptanmistir. Sekil 6, çözünebilir HeV G glikoprotein yapilarinin bir semasini gösterir. IgK- zincir bagi (SEQ ID NO. 10); 15 aa bagi (SEQ ID NO. 11); S-peptit etiketi (SEQ Sekil 7, HeV sGlnin bir moleküler agirlik profilini gösterir. Yüksek moleküler agirlik standartlarinin bir paneli bir Superdex 200 boyut dislama kolonu üzerinde ayrilmistir ve bir kalibrasyon egrisi olusturulmustur. Satlastirilan SGS-etiketi ve SGmyc-etjketi numuneleri, kalibre edilen Superdex 200 kolonu üzerinde ayrilinistir ve parçalara bölünmüstür. Büyük SG piklerinin Kav degerleri hesaplanmistir ve bunlarin açik moleküler agirliklari, moleküler agirlik standartlarindan kalibrasyon egrisi kullanilarak belirlenmistir. Sekil, SGS-etiketi ile gözlenen üç temel piki gösterir. Üç pikin (pik l, 2 ve 3) her biri ile baglantili gösterilen moleküler tahminler, üç farkli SGS_etiketipreparatln1n yedi bagimsiz ayriminin ortalamalaridir. Sekil 8, SGS-etiketinin oligomerik formlaridir. HeLa hücreleri, vaksinia virüsünü kodlayan sGsmikcn ile enfekte edilmistir ve 16 saat 37°C"de inkübe edilmistir. Enfeksiyondan 6 saat sonra baslanarak hücreler bir gece {35S} -metiyonin/sistein ile metabolik olarak etiketlenmistir. Üst fazlar çikarilmistir, santrifugasyon ile berraklastirilmistir, konsantre edilmistir, tampon PBS içinde degistirilmistir. SGS_ Dithiobis(sülfosüksinimidilpropiyonat)] (4 mM/RT°/30 dakika) ile çapraz baglanmistir. Çapraz baglanan ve çapraz baglanmayan preparatlar, sürekli (%5- 01482-P-0002 ) sükroz gradyanlari (2 gradyan) üzerinde katmanlanmistir ve parçalara ayrilmistir. Tüm fraksiyonlar 2 tüpe bölünmüstür (indirgeyici ve indirgeyici olmayan kosullara yönelik olarak, fraksiyonlar akabinde S-protein agaroz ile çökeltilmistir ve metabolik olarak etiketlenen sG numuneleri, indirgeyici ve indirgeyici olmayan kosullar altinda %75 SDS-PAGE ile çözülinüstür ve otoradyografi ile saptanmistir. Gradyanlarin alti ve üstü gösterilir. A: çapraz baglanmamis ve indirgenmemis, B: çapraz baglanmamis ve indirgenmis, C: çapraz baglanmis ve indirgenmemis, D: çapraz baglanmis ve indirgenmis. Sekil 9, tam uzunluktaki HeV G,nin oligomerik formunu gösterir. HeLA hücreleri, vaksinia virüsünü kodlayan HeV G ile enfekte edilmistir ve 16 saat 37°C"de inkübe edilmistir. Enfeksiyondan 6 saat sonra baslanarak hücreler bir gece {35S}-metiy0nin/sistein ile metabolik olarak etiketlenmistir. Üst fazlar çikarilmistir ve hücreler 2 saat tam ortamda takip edilmistir, PBS içinde iki kez yikanmistir ve geri kazanilmistir. Çapraz baglanmamis HeV G ifade eden hücreler, Triton-X içeren tamponda parçalanmistir, santrifugasyon ile berraklastirilmistir ve sürekli bir sükroz gradyani (%5-20) üzerinde katmanlanmistir ve parçalara ayrilmistir. Tüm fraksiyonlar 2 tüpe bölünmüstür (indirgeyici ve indirgeyici olmayan kosullara yönelik olarak), fraksiyonlar akabinde, Protein G-Sefarozun akabinde anti-HeV antiserum ile çökeltilmistir ve metabolik olarak etiketlenmis HeV G numuneleri, indirgeyici ve indirgeyici olmayan kosullar altinda %75 SDS-PAGE ile çözülmüstür ve otoradyografi ile saptanmistir. Gradyanlarin alti ve üstü gösterilir. A: çapraz baglanmamis ve indirgenmemis, B: çapraz baglanmamis ve indirgenmis. Sekil 10, HeV ve NiV,nin immünofloresans bazli sinsitya analizini gösterir. Vero hücreleri, 96 gözlü plakalarda kaplanmistir ve %90 konflüansa kadar veya NiV (SGS-etiketi ile kombine edilmistir) ile enfeksiyondan önce 37°C3de 30 dakika sGs_e.,-keti ile önceden isleme tabi tutulmustur. Hücreler 24 saat inkübe edilmistir, metanol içinde sabitlenmistir ve dijital mikroskopiden önce P 01482-P-0002 proteinine yönelik olarak immünofloresan ile etiketlenmistir. Görüntüler, bir Olympus DP70 yüksek çözünürlüklü renkli kameraya baglanan bir Olympus lX7l ters mikroskobu kullanilarak elde edilmistir ve tüm görüntüler 85x,lik bir orijinal büyütmede elde edilmistir. Anti-P etiketli HeV ve NiV"nin F ITC iminünofloresansinin temsili görüntüleri. A: islenmemis kontrol enfeksiyonlari, B: 100 ug/ml SGS-etiketi varliginda enfeksiyonlar. Sekil 11, SGS-etiketi tarafindan HeV ve NiV enfeksiyonunun inhibisyonunu gösterir. Vero hücreleri 96 gözlü plakalarda kaplanmistir ve %90 konflüansa kadar büyütülmüstür. Hücreler, 1.5 x 103 TCID50/ml ve 7.5 x lOZTCIDso/ml canli HeV veya NiV (SGS-etiketi ile kombine edilmistir) ile enfeksiyondan önce 37°C,de 30 dakika sGs_et,-keu- ile önceden isleme tabi tutulmustur. Hücreler 24 saat inkübe edilmistir, metanol içinde sabitlenmistir ve dijital mikroskopiden ve her bir sinsityumun ilgili alanini belirlemek üzere görüntü analizinden önce P proteinine yönelik olarak immünofloresan ile etiketlenmistir. Sekil, ilgili sinsityal alana (pikselz) karsi HeV (daireler) ve NiVSye (üçgenler) yönelik SGS- etiketi konsantrasyonunu gösterir. Sekil 12, SG proteininin lineer yapisini gösterir. Sekil 13, sG proteininin üç boyutlu yapisini gösterir. Sekil 14, sG proteininin (SEQ 1D NO 15) amino asid dizisini gösterir. Tablo 1 HeV ve N iV enfeksiyonunun nötralizasyonunu gösterir. Anti-HeV G antiserumlari saflastirilmis sGsmkcti ile 3 asi yoluyla tavsanlarda üretilmistir. Üçüncü enjeksiyondan 2 gafta sonra toplanan serumlar, HeV ve NiViye karsi bir Virüs nötralizasyon analizinde analiz edilmistir. Serum nötralizasyon titreleri, CPE (+ ile gösterilmistir) varligi ile belirlenmistir ve ikili gözlerin en az birinin herhangi bir CPE göstermedigi serum dilüsyonu olarak kaydedilmistir. 01482-P-0002 Bulusun Açiklamasi Genel Teknikler Mevcut bulusun uygulamasi, aksi gösterilmedikçe, teknik uzmanligi dahilinde olan klasik moleküler biyoloji teknikleri (rekombinant teknikleri içerir), mikrobiyoloji, hücre biyolojisi, biyokimya ve immünolojiyi kullanir. Bu tür teknikler, örnegin Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J .M. Miller and MP. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (EM. Ausubel, et al, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al, eds., 1994); Current Protocols in Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., Shepherd and C Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995) gibi literatürde tam olarak açiklanir. Burada kullanildigi üzere "bir" ve "bu" tekil formu, aksi belirtilmedikçe çogul referanslari içerir. Örnegin "bir" G glikoproteini bir veya daha fazla G glikoproteinini içerir. 01482-P-0002 Genellikle bu tarifname, HeV G glikoproteini zarf proteininin çözünebilir formlarini, spesifik olarak Hendra Virüsü G proteinlerinin ekto bölgesinin çözünebilir peptit monomerlerinin oligomerlerini ve bir öznenin Hendra virüsü enfeksiyonuna karsi asilanmasinin bir yöntemindeki kullanimlarini saglar. Ayrica açiklananlar, bu proteinlerin teshis, saptama ve tedavide kullanilmasina yönelik yöntemlerdir. Spesifik olarak bu bulus, asilar, diagnostikler ve taramanin hizli yüksek verimli üretimine olanak taniyan dogal viral G glikoproteininin karakteristiklerini koruyan HeV G glikoproteini zarf proteinlerinin ekto bölgesinin çözünebilir peptit monomerlerinin oligomerlerini saglar. HeV G glikoproteinlerinin çözünebilir peptit monomerleri, bir HeV G glikoproteininin ekto bölgesinin (örnegin hücre disi) tümü veya bir kisinini içerir ve genellikle G glikoproteininin transmembran bölgesinin tümü veya bir kisminin ve G glikoproteininin sitoplazmik kuyrugunun tümü veya bir kisminin silinmesi yoluyla üretilir. Örnek yoluyla çözünebilir peptit monomeri, bir HeV G glikoproteinin tam ekto bölgesini içerebilir. Ayrica örnek yoluyla ve sinirlama olmadan, çözünebilir bir peptit monomeri, ekto bölgenin tümü veya bir kismi ve bir HeV G glikoproteinin transmembran bölgesinin bir kismini içerebilir. HeV G glikoproteinlerinin çözünebilir peptit monomerleri, oligomerik form veya formlarda üretilebilen Viral konakçi hücre reseptörü ile etkilesim kurma veya baglanma yetenegi veya dogal G glikoproteinini taniyabilen antikorlari (bunlarla sinirli olmamak üzere, viral nötralize edici antikorlari içerir) ortaya çikarma yetenegi gibi karsilik gelen dogal viral glikoproteinin bir veya daha fazla karakteristigini korur. Ek karakteristiklerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, bir konakçi hücrenin enfeksiyonunun bloke edilmesi veya önlenmesi yetenegini içerir. Klasik metodoloji, karakteristiklerden biri veya daha fazlasina yönelik olarak çözünebilir HeV G glikoproteinlerini degerlendirmek üzere kullanilabilir. Kullanilabilen metodolojinin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, burada Örneklerde açiklanan analizleri içerir. 01482-P-0002 Polinükleotidler Polinükleotid terimi genis anlamda kullanilir ve herhangi bir uzunluktaki polimerik nükleotidlere (örnegin, oligonükleotidler, genler, küçük inhibe edici RNA; bir proteini kodlayan polinükleotidlerin parçalari, vb.) refere eder. Örnek yoluyla, polinükleotidler, ekto bölgenin tümü veya bir kismi veya ekto bölgenin tümü veya bir kismi ve transmembran bölgenin bir kisinini içerebilir. Polinükleotid örnegin lineer, dairesel, asiri sargili, tek iplikli, çift iplikli, dallanmis, kismen çift iplikli veya tek iplikli olabilir. Polinükleotidi içeren nükleotidler dogal olarak görülen nükleotidler veya modifiye edilmis nükleotidler olabilir. Genellikle polinükleotidler, bir HeV'nin G glikoproteininin ekto bölgesinin (örnegin hücre disi) tümü veya bir kismini kodlar. HeV G glikoproteininin çözünebilir bir peptit monomerini yapilandirmak üzere kullanilabilen dizilerin sinirlayici olmayan örnekleri, Wang, L.F. et al, J. Virol. 74 bulunabilir. Çözünebilir bir NiV G glikoproteinini yapilandir'rnak üzere kullanilabilen dizilerin sinirlayici olmayan örnekleri, Harcourt, BH et al, Virology bulunabilir. Genellikle herhangi bir Hendra Virüsü izolati veya susundan elde edilen G glikoproteini dizileri, polinükleotidler ve polipeptitleri elde etmek üzere kullanilabilir. Örnek yoluyla ve sinirlama olmadan, HeV G glikoproteininin çözünebilir bir peptit monoemerini kodlayan bir polinükleotid, Wang, L.F. et al., J. Virol. 74 amino asit 71-604°ünü kodlayan bi polinükleotid dizisini içerir. Burada ayrica, 01482-P-0002 içerebilen çözünebilir bir HeV G glikoproteini kodlayan bir polinükleotid açiklanir. yönelik amino asit dizisinin amino asitleri 7l-602iyi kodlayan bir polinükleotid dizisini içerebilen çözünebilir bir NiV G glikoproteinini kodlayan bir polinükleotid açiklanir. Burada ayrica, Harcourt, BH et al., Virology 271: 334- HeV G glikoproteinine yönelik polinükleotid dizisinin nükleotidleri 9026 ila 10696'yi içerebilen çözünebilir bir NiV G glikoproteinini kodlayan bir polinükleotid açiklanir. Bu polinükleotidlerin fonksiyonel esdegerleri ayrica burada açiklanir. Örnek yoluyla ve sinirlama olmadan, fonksiyonel olarak esdeger polinükleotidler, bir HeV veya NiVinin çözünebilir bir G glikoproteinini kodlar ve asagidaki karakteristiklerden biri veya daha fazlasina sahiptir: oligomerik form veya formlarda üretilebilen viral konakçi hücre reseptörü ile etkilesim kurma veya baglanma yetenegi, dogal G glikoproteinini taniyabilen antikorlari (bunlarla sinirli olmamak üzere, Viral nötralize edici antikorlari içerir) ortaya çikarma yetenegi ve/Veya bir konakçi hücrenin enfeksiyonunu bloke etme veya önleme yetenegi. Fonksiyonel olarak esdeger olan polinükleotid dizileri ayrica, teknikte bilinen yöntemler ile tanimlanabilir. Çesitli dizi hizalama yazilimi programlari, homoloji veya esdegerliginin belirlenmesini kolaylastirmak üzere teknikte mevcuttur. Bu programlarin sinirlayici olmayan örnekleri, BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLASTN ve TBLASTX (BLAST ncbi.nlm.nih.g0v/BLAST/ adresinde dünya çapinda agdan temin edilebilir) dahil BLAST ailesi programlari, FastA, Compare, DotPlot, BestFit, GAP, FrameAlign, ClustalW ve PileUp°tir. Bu programlar, GCG lnc.'s Wisconsin Package gibi dizi analizi yaziliminin kapsamli bir paketinde ticari olarak temin edilebilir. Diger benzer analiz ve hizalama programlari, DNA 01482-P-0002 Star's MegAlign gibi çesitli tedarikçilerden veya GeneJockey"de hizalama prograinlari satin alinabilir. Alternatif olarak dizi analizi ve hizalama programlarina, sdsc.edu/ResTools/cmshphtml adresinde CMS Molecular Biology Resource gibi sitelerde dünya çapinda ag aracililigiyla erisilebilir. Bir gene veya bir segmentine karsilik gelen DNA veya protein dizilerini içeren herhangi bir dizi veri tabani, dizi analizine yönelik olarak kullanilabilir. Yaygin olarak kullanilan veri tabanlari, bunlarla sinirli olmamak üzere, GenBank, EMBL, DDBJ, PDB, SWISS-PROT, EST, STS, GSS ve HTGSayi içerir. Yukarida bahsedilen hizalama programlarinin biri veya daha fazlasi ile açiklanan homoloji kapsaminin belirlenmesine yönelik parametreler teknikte iyi bilinir. Bunlar, bunlarla sinirli olmamak üzere p degeri, dizi ayniligi yüzdesi ve dizi benzerligi yüzdesini içerir. P degeri, hizalamanin sans eseri üretilmesi olasiligidir. Tek bir hizalamaya yönelik olarak p degeri, Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 2246'ya göre hesaplanabilir. Birçok hizalamaya yönelik olarak p degeri, BLAST°da programlanan gibi bir bulussal yaklasim kullanilarak hesaplanabilir. Dizi ayniligi yüzdesi, ikisi optimum sekilde hizalandiginda sorgu dizisi ve bilinen dizi arasindaki nükleotid veya amino asit eslesmelerinin sayisinin orani ile tanimlanir. Dizi benzerligi yüzdesi, dizi benzerligi hesaplandiginda farkli olan, ancak pozitif olarak benzer olan birinin amino asitleri skorlamasi disinda aynilik yüzdesi ile ayni sekilde hesaplanir. Böylece bir bazik amino asitten digerine degisim veya bir hidrofobik amino asitten digerine degisim gibi fonksiyon degistirilmeksizin siklikla meydana gelen konservatif degisiklikler, bunlar ayniymis gibi skorlanir. PoliQeQti'tler HeV G glikoproteinin ekto bölgesinin çözünebilir peptit monomerleri (burada ayrica polipeptitler olarak refere edilir) Wang, L.F. et al., J. Virol. 74 (21), 9972- (1998)) bir HeV G glikoproteinine yönelik amino asit dizisinin amino asitleri 71- 01482-P-0002 604,1'1 içerir. Polipeptit terimi burada, peptit veya protein veya parçalarini içerecek sekilde genis anlamda kullanilir. Burada ayrica, Harcourt, BH et al., Virology 1432-1) bir NiV G glikoproteinine yönelik amino asit dizisinin amino asitleri 71- 602'yi içerebilen çözünebilir bir NiV G glikoproteini açiklanir. Bu polipeptitlerin fonksiyonel esgdegerleri ayrica açiklanir. Örnek yoluyla ve sinirlama olmadan fonksiyonel olarak esdeger polipeptitler, asagidaki karakteristiklerden biri veya daha fazlasina sahiptir: viral konakçi hücre reseptörü ile etkilesim kurma veya baglanma yetenegi, dogal G glikoproteinini taniyabilen antikorlari (bunlarla sinirli olmamak üzere, Viral nötralize edici antikorlari içerir) ortaya çikarma yetenegi ve/veya bir konakçi hücrenin enfeksiyonunu bloke etme veya önleme yetenegi. Ayrica açiklananlar, kimyasal olarak modifiye edilmis peptitler, dogal olarak görülmeyen amino asitleri içeren peptit benzeri moleküller, peptitler ve benzerlerini içeren ve burada saglanan çözünebilir G glikoproteini polipeptitlerinin karakteristiklerini koruyan peptidomimetiklerdir. ("Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" 5th ed., vols. 1 to 3 (ed. M. E. Wolff; Wiley Interscience 1995). Ayrica burada açiklananlar, polipeptitler ile büyük oranda ayni fonksiyona sahip olan polipeptitler veya analoglaridir. Bu tür polipeptitler, bunlarla sinirli olmaksizin, polipeptidin bir sübstitüsyonu, eklemesi veya Silinmesini içerir. Ayrica burada açiklananlar, polipeptitler ile büyük oranda homolog olan proteinler veya peptitlerdir. Burada yukarida açiklanan çesitli dizi hizalama yazilimi programlari, herhangi bir proteinin burada açiklanan bir protein ile homolojisi veya esdegerliginin belirlenmesini kolaylastirmak üzere teknikte mevcuttur. 01482-P-0002 asit kalintisi dizisine sahip olan herhangi bir polipeptidi içerir, burada bir veya daha fazla kalinti fonksiyonel olarak benzer bir kalinti ile konservatif olarak sübstitüe edilinistir ve burada açiklanan sekilde polipeptitlerin fonksiyonel açilarini gösterir. Konservatif sübstitüsyonlarin örnekleri, izolösin, valin, lösin veya metiyonin gibi polar olmayan (hidrofobik) bir kalintinin bir digerine yönelik sübstitüsyonu, bir polar (hidrofilik) kalintinin arjinin ve lizin arasinda, glutamin ve asparajin arasinda, glisin ve serin arasindaki gibi bir digerine yönelik sübstitüsyonu, lizin, arjinin veya histidin gibi bir bazik kalintinin bir digerine yönelik sübstitüsyonu veya aspartik asit veya glutamik asit veya bir digeri gibi bir asidik kalintinin sübstitüsyonunu içerir. kimyasal olarak türevlendirilmis bir kalintinin kullanimini içerir. "Kimyasal türev", bir fonksiyonel yan grubun reaksiyonu ile kimyasal olarak türevlendirilen bir veya daha fazla kalintiya sahip olan söz konusu polipeptide refere eder. Türevlendirilmis bu tür moleküllerin örnekleri örnegin, serbest amino gruplarinin amin hidrokloridler, p-toluen, sülfonil gruplari, karbobenzoksi gruplari, t- bütiloksikarbonil gruplari, kloroasetil gruplari veya formil gruplarini olusturmak üzere türevlendirildigi bu molekülleri içerir. Serbest karboksil gruplari, tuzlar, metil ve etil esterler veya diger ester tipleri veya hidrazidleri olusturmak üzere türevlendirilebilir. Serbest hidroksil gruplari, O-asil veya O-alkil türevlerini olusturmak üzere türevlendirilebilir. Histidinin imidazol nitrojeni, N-im- benzilhistidini olusturmak üzere türevlendirilebilir. Ayrica kimyasal türevler olarak dahil olanlar, yirmi standart amino asidin dogal olarak görülen bir veya daha fazla amino asit türevini içeren proteinler veya peptitlerdir. Örnegin: 4- hidroksiprolin proline yönelik olarak sübstitüe edilebilir; 5-hidr0ksilizin lizine yönelik olarak sübstitüe edilebilir; 3-metilhistidin histidine yönelik olarak sübstitüe edilebilir; homoserin serine yönelik olarak sübstitüe edilebilir, ve omitin lizine yönelik olarak sübstitüe edilebilir. Polipeptitler ayrica, bir veya daha fazla 01482-P-0002 ekleme ve/veya silmeye sahip olan herhangi bir polipeptit veya dizileri burada açiklanan polipeptitlerin herhangi birinin dizisine göre kalintilari içerir. Iki polinükleotid veya polipeptit dizisinin, iki dizideki nükleotidler veya amino asitlerin dizisinin, asagida açiklanan sekilde maksimum karsiliga yönelik olarak hizalandiginda ayni olmasi halinde "ayni" oldugu ifade edilir. Iki dizi arasindaki karsilastirmalar tipik olarak, dizi benzerliginin lokal bölgelerini tanimlamak ve karsilastirmak üzere bir karsilastirma penceresinin üzerinden dizilerin karsilastirilmasi yoluyla gerçeklestirilir. Burada kullanildigi üzere bir yaklasik 75, 40 ila yaklasik 50,1ik bir segmente refere eder, burada bir dizi, iki dizinin optimum sekilde hizalanmasindan sonra ayni sayida bitisik pozisyonun bir referans dizisi ile karsilastirilabilir. Karsilastirmaya yönelik dizilerin optimum hizalanmasi, varsayilan parametrelerin kullanildigi biyoinformatik yaziliminin (DNASTAR, Inc., Madison, WI) Lasergene takimindaki Megalign programi kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bu program, asagidaki referanslarda açiklanan çesitli hizalama semalarini kapsar: Dayhoff, MD. (1978) A model of evolutionary Change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, RM., 1989, CABIOS 5:151- 425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, F reeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, 01482-P-0002 Tercihen "dizi ayniligi yüzdesi", en az 20 pozisyonluk bir karsilastirma penceresi üzerinden, optimum sekilde hizalanmis iki dizinin karsilastirilmasi yoluyla belirlenir, burada karsilastirma penceresindeki polipeptit dizisinin kismi, iki dizinin optimum hizalanmasina yönelik olarak referans dizilerine (eklemeler veya silmeleri içermez) kiyasla yüzde 20 veya daha az, genellikle yüzde 5 ila 15 veya yüzde 10 ila 12'lik ekleme veya silme (diger bir deyisle, bosluklar) içerebilir. Yüzde, ayni amino asit kalintisinin , eslestirilmis pozisyonlarin sayisini vermek üzere her iki dizide meydana geldigi pozisyonlarin sayisinin belirlenmesi, eslestirilmis pozisyonlarin sayisinin, referans dizisindeki (diger bir deyisle, pencere boyutu) pozisyonlarin toplam sayisi ile bölünmesi ve dizi ayniligi yüzdesini saglamak üzere sonuçlarin 100 ile çarpilmasi yoluyla hesaplanir. Burada açiklananlar ayrica, burada açiklanan çözünebilir bir G glikoproteini proteinini kodlayan en az bir polinükleotidi içeren ifade vektörleridir. Ifade vektörleri teknikte iyi bilinir ve bunlarla sinirli olmamak üzere, Viral vektörler veya plazmidleri içerir. Istenen bir polinükleotidin uygulamasi ve istenen bir hücrede ifadesine yönelik Viral bazli vektörler teknikte iyi bilinir. Örnek niteligindeki Viral bazli araçlar, bunlarla sinirli olmamak üzere, rekombinant retrovirüsler (bakiniz, örnegin, PCT Yayin No.. WO 90/07936; WO (örnegin, Sindbis virüs vektörleri, Seinliki orman virüsü), Ross River virüsü, adeno-baglantili virüs (AAV) vektörleri (bakiniz, örnegin, PCT Yayin No.. WO veya kus çiçek hastaligi), Bakulovirüs rekombinant sistemi ve herpes Virüsünü 01482-P-0002 Plazmidler gibi viral olinayan vektörler ayrica teknikte iyi bilinir ve bunlarla sinirli olmamak üzere, inaya ve bakteri bazli plazmidleri içerir. Vektörlerin bir konakçi hücreye yerlestirilmesi ve ifade edilen proteinin izole edilmesi ve saflastirilmasinin yöntemleri ayrica teknikte iyi bilinir (örnegin, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press). Konakçi hücrelerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, HeLa ve CHO hücreleri gibi memeli hücrelerini içerir. Örnek yoluyla, çözünebilir G proteinini kodlayan polinükleotidi içeren vektör ayrica, izolasyon ve/veya saIlastirmayi kolaylastirmak üzere bir etiket polinükleotid dizisini içerebilir. Etiketlerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, myc-epitopu, S-etiketi, his-etiketi, HSV epitopu, V5 epitopu, FLAG ve CBP"yi içerir. Bu tür etiketler ticari olarak temin edilebilir veya teknikte bilinen yöntemler ile kolaylikla yapilabilir. Vektör ayrica, bir bag dizisini kodlayan bir polinükleotid dizisini içerebilir. Genellikle baglama dizisi, çözünebilir G proteini polinükleotid dizisi ve polinükleotid etiketi dizisi arasinda vektörde konumlandirilir. Baglama dizileri, rastgele amino asitleri kodlayabilir veya fonksiyonel bölgeleri içerebilir. Fonksiyonel bölgeleri içeren baglama dizilerinin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, trombin klevaj bölgesi veya enterokinaz klevaj bölgesini içeren dizileri içerir. Örnek yoluyla ve sinirlama olmadan, çözünebilir bir G glikoproteini, bir memeli hücre kültürü sistemindeki vaksinia Virüsü rekombinantlari kullanilarak burada açiklanan sekilde üretilebilir. Bir Hendra Virüsü veya Nipah virüsü cDNA kalibindan istenen ekto bölge dizisini çogaltmak üzere kullanilabilen primerlerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, Örneklerdeki primerleri içerir. 01482-P-0002 Antikorlar Burada açiklanan antikorlarin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, HeV G glikoproteinine spesifik antikorlar, NiV G glikoproteinine spesifik antikorlar, HeV G glikoproteini ve NiV G glikoproteini ile çapraz reakte olan antikorlar ve nötralize edici antikorlari içeren antikorlarin örnekleridir. Örnek yoluyla, nötralize edici bir antikorun bir karakteristigi, bununla sinirli olmamak üzere, bir konakçi hücrenin enfeksiyonunu bloke etme veya önleme yetenegini içerir. Antikorlar, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak karakterize edilebilir. Antikorlar, monoklonal antikorlar, poliklonal antikorlar, antikor parçalari (örnegin, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, vb.), kimerik antikorlar, bispesifik antikorlar, heterokonjugat antikorlar, tek Zincirli (SCFV) mutantlari, bir antikor kismini içeren füzyon proteinleri, hümanize antikorlar ve antikorlarin glikosilasyon varyantlari, antikorlarin amino asit dizisi varyantlari ve kovalent olarak modifiye edilen antikorlari içeren gerekli spesifiklige sahip bir antijen tanima bölgesini içeren immünoglobulin molekülünün diger herhangi bir modifiye konfigürasyonunu kapsayabilir. Tercih edilen antikorlar, mürin, siçan, insan, primat veya diger herhangi bir kökenden (kimerik veya hümanize antikorlar dahil) elde edilir. Monoklonal ve poliklonal antikorlarin hazirlanmasina yönelik yöntemler teknikte iyi bilinir. Poliklonal antikorlar, bir memelide, örnegin bir immünize edici ajanin bir veya daha fazla enjeksiyonu ve istenmesi halinde bir adjuvan ile arttirilabilir. Adjuvanlarin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, anahtar deligi limpet, hemosiyanin, serum albumin, bovin tiroglobulin, soya fasulyesi tripsin inhibitörü, Freund tam adjuvani ve MPL-TDM adjuvanini içerir. Immünizasyon protokolü teknikte uzman bir kisi tarafindan belirlenebilir. Antikorlar alternatif olarak monoklonal antikorlar olabilir. Monoklonal antikorlar, hibridom yöntemler kullanilarak (bakiniz, örnegin, Kohler, B. and Milstein, C. 01482-P-0002 tarafindan modifiye edilmis sekilde üretilebilir. Isteninesi halinde ilgili antikor dizilenebilir ve polinükleotid dizisi akabinde ifade veya çogalmaya yönelik olarak bir vektörde klonlanabilir. Ilgili antikoru kodlayan dizi, bir konakçi hücrenin vektöründe saglanabilir ve konakçi hücre akabinde genisletilebilir ve ileride kullanilmak üzere dondurulabilir. Bir alternatifte polinükleotid dizisi, antikoru "hümanize etmek" veya antikonin (örnegin G glikoproteinine daha fazla atinite ve/veya Hendra veya Nipah virüsünün konakçi hücre reseptörüne füzyonunun inhibe edilmesinde daha fazla etkinlik elde etmek üzere antikor dizisini genetik olarak manipüle etmek) afinitesini veya diger karakteristiklerini gelistirmek üzere genetik manipülasyona yönelik olarak kullanilabilir. Antikorlar ayrica, teknikte bilinen yöntemler ile hümanize edilebilir. (Bakiniz, örnegin, U.S. Patent No spesifik insan immünoglobulin proteinlerini ifade etmek üzere gelistirilmis olan ticari olarak temin edilebilir fareler kullanilarak elde edilebilir. Diger bir altematifte antikorlar, rekombinant olarak yapilabilir ve teknikte bilinen herhangi bir yöntem kullanilabilir ifade edilebilir. Örnek yoluyla antikorlar, faj gösterim teknolojisi ile rekombinant olarak olusturulabilir. Bakiniz, örnegin, U.S. parçalarini in vitro olarak üretmek üzere kullanilabilir. Faj gösterimi, çesitli formatlarda gerçeklestirilebilir; inceleme için bakiniz, örnegin, Johnson, Kevin S. Örnek yoluyla, çözünebilir bir G glikoproteini burada açiklanan sekilde, bu 01482-P-0002 teknikler ile rekombinant antikorlarin izole edilmesi amaçlarina yönelik bir Antikorlar, ilk olarak antikorlarin ve antikor üreten hücrelerin konakçi hayvanlardan izole edilmesi, gen dizisinin elde edilmesi ve antikoru konakçi hücrelerde (örnegin CHO hücreleri) rekombinant olarak ifade etmek üzere gen dizisinin kullanilmasi yoluyla rekombinant olarak olusturulabilir. Kullanilabilen diger bir yöntem, antikor dizisinin bitkiler (örnegin, tütün) veya transgenik sütte ifade edilmesidir. Antikorlarin bitkiler veya sütte rekombinant olarak ifade edilmesine yönelik yöntemler açiklanmistir. Bakiniz, Örnegin, Peeters, et al. türevleri, örnegin hümanize, tek zincir, Vb,"nin olusturulmasina yönelik yöntemler teknikte bilinir. Antikorlar, örnegin Hendra veya Nipah G glikoproteinlerinin izole edilmesi veya saflastirilmasi veya bir biyolojik numune veya örnekte Hendra veya Nipah G glikoproteinlerinin saptanmasinda kullanilmaya yönelik klasik yöntemler ile bir tasiyiciya baglanabilir. Alternatif olarak örnek yoluyla, nötralize edici antikorlar, Hendra veya Nipah virüsü ile enfekte olan veya enfekte olmasindan süphelenilen bir özneye pasif immünoterapi olarak uygulanabilir. Bir "özne", bunlarla sinirli olmamak üzere, insanlar, simianlar, çiftlik hayvanlari, spor hayvanlari ve evcil hayvanlari içerir. Veterinerlik kullanimlar ayrica bulus tarafindan kapsanir. Diagnostikler Açiklanan çözünebilir G glikoproteinleri ve/veya anitkorlari Hendra ve Nipah virüsüne yönelik olarak çesitli immünoanalizlerde kullanilabilir. Rekombinant olarak ifade edilen çözünebilir G glikoproteinler, yüksek kalite kontrolü ile üretilebilir ve biyolojik numunelerde antikorun saptanmasi amaçlarina yönelik bir antijen olarak uygundur. Örnek yoluyla ve sinirlama olmadan, çözünebilir bir 01482-P-0002 HEV veya Niv G glikoproteini veya kombinasyonlari, bir Özneden alinan bir biyolojik numunedeki antikoru saptamak üzere bir ELlSA analizinde antijenler olarak kullanilabilir. Asilar Bu tarifname ayrica, Hendra virüsüne yönelik asilar ile ilgilidir. Ayrica burada, Nipah virüsüne yönelik bir asi açiklanir. Bir örnekte asilar DNA bazli asilardir. Teknikte uzman kisi, bir ekzojenöz proteinin in vi'vo ifadesini elde etmek üzere ifade vektörlerinin uygulamasina asinadir. Bakiniz, örnegin, U.S. Patent No. istenen bir hücrede ifadesine yönelik viral bazli vektörler teknikte iyi bilinir ve Sinirlayici olmayan örnekler burada açiklanir. Asilar protein bazlidir ve bulusun bir veya daha fazla oligomerini içerir. Tercih edilen parçalar ekto bölgesi ve fonksiyonel kisimlari ve ayrica nötralize edici antikorlar ile spesifik olarak reaktif olan kisimlardir. Çok reaktif olan kisimlar Sekil 14°te gösterilir. Burada açiklananlar ayrica, enfeksiyona karsi profilaksisin yani sira daha çabuk tedaviye yönelik olabilen antikor bazli asilardir. Ifade vektörlerinin uygulamasi, enjeksiyon, oral uygulama, partikül tabancasi veya kateter ile uygulama ve topikal uygulama dahil olmak üzere lokal veya sistemik uygulamayi içerir. Bir ifade vektörü veya alt genomik polinükleotidleri içeren terapötik bilesimlerin hedeflenen uygulamasi ayrica kullanilabilir. Reseptör aracili DNA uygulama teknikleri, örnegin Findeis et al, Trends Biotechnol. (1993) 112202; Chiou et al, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al, J. Biol. Chem. (1988) Bunlarla sinirli olmamak üzere, tek basina öldürülmüs adenovirüse bagli veya bagli olmayan polikatyonik yogunlastirilmis DNA (bakiniz, Örnegin, Curiel, Hum. 01482-P-0002 Gene Ther. (1992) 3:147); ligand-linked DNA (bakiniz, örnegin, Wu, J. Biol. hücre membranlari ile füzyonu içeren viral olmayan uygulama araçlari ve yöntemleri ayrica kullanilabilir. Örnek niteligindeki çiplak DNA uygulama açiklanir. Gen uygulama araçlari olarak hareket edebilen lipozomlar U.S. Patent Insana uygulamaya yönelik olarak, çözünebilir bir G glikoproteinini kodlayan polinükleotidi içeren kodonlar insan kullanimina yönelik olarak optimize edilebilir. Burada açiklanan ayrica, bir alt birim asi olarak kullanilmaya yönelik çözünebilir bir HeV veya NiV G glikoproteini veya bunun kombinasyonudur. Çözünebilir HeV veya NiV G glikoproteini veya bunun kombinasyonu kendi basina veya bir adjuvan ile kombinasyon halinde uygulanabilir, Adjuvanlarin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, alüminyum tuzlari, yag içinde su emülsiyonlari, su içinde yag emülsiyonlari, saponin, QuilA ve türevleri, iskomlar, lipozomlar, gama interferon veya interlökin 12 içeren sitokinler, DNA, kati veya yari-kati partikülde mikro kapsülleme, Freund tam ve eksik adjuvani veya muramil dipeptit ve analoglarini içeren aktif bilesenler, DEAE dekstran/mineral yagi, Alhydrogel, Auspharm adjuvani ve Algammulinî içerir. Çözünebilir HeV içeren alt birim asi, oral olarak, intravenöz olarak, subkütanöz olarak, intraarteriyel olarak, intramüsküler olarak, intrakardiyal olarak, intraspinal olarak, intratorasik olarak, intraperitoneal olarak, intraventriküler olarak, sublingual olarak ve/veya transdermal olarak uygulanabilir. 01482-P-0002 Uygulama dozaji ve plani, teknikte bilinen yöntemler ile belirlenebilir. Çözünebilir HeV veya NiV G glikoproteini veya kombinasyonlarinin Hendra, Nipah veya ilgili Henipavirüs virüslerine yönelik bir asi olarak etkinligi ayrica teknikte bilinen yöntemler ile degerlendirilebilir. Farmasötik Bilesimler Bulusun farmasötik bilesimi, bulusun oligomerini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içerir. Burada açiklanan ayrica, polinükleotidleri, polipeptitleri ve antikorlari içeren, ayrica liyofilize formülasyonlar veya aköz solüsyonlar formunda, teknikte bilinen farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilizörleri içerebilen bilesimlerdir (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover.). Kabul edilebilir tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilizörler, dozajlar ve konsantrasyonlarda alicilar için toksik degildir ve fosfat, sitrat ve diger organik asitler gibi tamponlar; askorbik asit ve metiyonini içeren antioksidanlar; koruyucular (oktadesilmetilbenzil, amonyum klorid; hekzametonyum klorid; benzalkonyuni klorid, benzetonyum klorid; fenol, bütil veya benzil alkol; metil veya propil paraben gibi alkil parabenler; katekol; rezorsinol; siklohekzanol; 3-pentanol; ve m-kresol gibi); düsük moleküler agirlikli (yaklasik 10 kalintidan daha az) polipeptitler, proteinler, Örnegin serum albumin, jelatin veya immünoglobulinler; polivinilpirolidon gibi hidrofilik polimerler; glisin, glutamin, asparajin, histidin, arjinin veya lizin gibi amino asitler; monosakkaritler, disakkaritler ve glukoz, mannoz veya dekstranlari içeren diger karbohidratlar; EDTA gibi selatlama ajanlari, sükroz, mannitol, trehaloz veya sorbitol gibi sekerler; sodyum gibi tuz olusturan karsi-iyonlar; metal kompleksler (örnegin Zn-protein koinpleksleri); ve/veya TWEENTM, PLURONICSTM veya polietilen glikol (PEG) gibi iyonik olmayan surfaktanlari içerebilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlar ayrica burada açiklanir. 01482-P-0002 Bulusun bilesimleri genellikle, enfeksiyonu azaltmak, enfeksiyonunun bir semptomunu hafifletmek ve/veya enfeksiyonu önlemek üzere bir immün yaniti indüklemek üzere yeterli bir miktarda bulusun oligomerini içerir. Mevcut bulusun farmasötik bilesimi ayrica, istenen etkiyi arttirmak ve/veya tamamlamak üzere islev gören ek ajanlari içerebilir. Örnek yoluyla, bir alt birim asi olarak uygulanan bulusun oligomerinin immünojenesitesini arttirmak üzere farmasötik bilesim ayrica bir adjuvani içerebilir. Adjuvanlarin örnekleri burada saglanir. Ayrica örnek yoluyla ve sinirlama olmadan, bulusun bir oligomerinin, Hendra ile enfekte olan veya enfekte olmasindan süphelenilen bir öznede immün yanitini arttirmak üzere uygulanmasi halinde ve/veya antikorlarin bir pasif immünoterapi formu olarak uygulanmasi halinde bilesim ayrica örnegin diger terapötik ajanlari (örnegin, anti-Viral ajanlar) içerebilir. Diagnostik Kitler Burada açiklananlar, açiklanan yöntemlerde kullanilmaya yönelik diagnostik kitlerdir. Kitler, örnek yoluyla ve sinirlama olmadan, çözünebilir bir G HeV veya NiV G glikoprotein veya bunun koinbinasyonlarini kodlayan polinükleotitler, çözünebilir bir G HeV veya NiV G glikoprotein veya bunun kombinasyonlarini ve/veya antikorlari ve burada açiklanan yöntemlere göre kullanima yönelik talimatlari içeren bir veya daha fazla kap içerir. Genellikle bu talimatlar, bir analizin uygulanmasina yönelik uygulamanin açiklamasi veya talimatlari içerir. Kaplar birim dozlar, yigin paketler (örnegin çok dozlu paketler) veya alt birim dozlari olabilir. Kitlerde saglanan talimatlar tipik olarak, bir etiket veya paket ekinin (örnegin kitte bulunan bir kagit yapragi) üzerine yazili talimatlardir, ancak makine tarafindan okunabilen talimatlar 01482-P-0002 (örnegin, bir manyetik veya optik depolama diski üzerinde tasinan talimatlar) ayrica kabul edilebilir. Kitler uygun paket içindedir. Uygun paket, bunlarla sinirli olmamak üzere, viyaller, siseler, kavanozlar, esnek paket (örnegin yalitilarak kapatilmis Mylar veya plastik torbalar) ve benzerlerini içerir. Ayrica tasarlananlar, bir solunum cihazi, nazal uygulama cihazi (örnegin bir atomizör) veya bir mini pompa gibi infüzyon cihazi gibi spesifik bir cihaz ile kombinasyon halinde kullanilmaya yönelik paketlerdir. Bir kit, steril bir erisim portuna sahip olabilir (örnegin kap, bir intravenöz solüsyon torbasi veya bir hipodermik enjeksiyon ignesi ile delinebilir bir durdurma elemanina sahip sise olabilir). Kap ayrica steril bir erisim portuna sahip olabilir (örnegin kap bir intravenöz solüsyon torbasi veya bir hipodermik enjeksiyon ignesi ile delinebilen bir durdurma elemanina sahip sise olabilir). Kitler istege bagli olarak, tamponlar ve açiklayici bilgiler gibi ek bilesenleri saglayabilir. Normalde kit, bir kap ve kap üzerinde veya bunun ile baglantili bir etiket veya paket ek(ler)ini içerir. Asagidaki örnekler, bulusun tüm düzenlemeleri olmamak üzere sadece belli düzenlemelerini içerir ve böylece bulusun kapsamini sinirlayici olarak görülmemelidir. Örnekler Örnek 1: Vektör Yapilari Vektörler, transmembran/sitoplazmik kuyrugu silinmis HeV G veya NiV GSyi ifade etmek üzere yapilandirilmistir. Tam uzunluktaki HeV veya NiV G proteininin klonlanan cDNA*lari, transmembran/sitoplazmik kuyrugu silinmis HeV G veya NiV Giyi kodlayan yaklasik 2600 bpslik parçalari üretmek üzere PCR ile çogaltilmistir. 01482-P-0002 Asagidaki oligonükleotid primerleri HeV G"nin çogaltilmasina yönelik olarak sentezlenmistir. SHGS: 5'- NO 1). GGCAGGTATC-3'. (SEQ ID NO 2). Asagidaki oligonükleotid primerleri, asagidakilerin çogaltilmasina yönelik olarak sentezlenmistir NiV G. sNGS: 5 '- (SEQ ID NO 3). sNGAS: 5'- CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATT Tüm PCR reaksiyonlari asagidaki ayarlar ile Accupol DNA polimeraz (PGS Soientifics Corp., Gaithersburg, MD) kullanilarak yapilmistir: baslangiçta 94°C 5 sHeV G ORF'ye yönelik bir PCR ürünü tarafindan üretilen bu primerler Sal J bölgelerinin yaninda bulunur ve sNiV G ORF X710 i' bölgelerinin yaninda bulunur. PCR ürünleri jel ile saflastirilmistir (Qiagen, Valencia, CA). Jel saflastirmasindan sonra sHeV G ve sNiV G, bir TOPO vektöründe (lnvitrogen Corp., Carlsbad, CA) alt klonlanmistir. PSectag2B (Invitrogen Corp.) satin alinmistir ve bir S-peptit etiketi veya bir myc- epitop etiketini içerecek sekilde modifiye edilmistir. Örtülen oligonükleotidler, S- peptidine yönelik diziyi kodlayacak ve Kpn 1 and EcoRl çikintilarini parçalayacak sekilde sentezleninistir. SPEPS: 5'- 01482-P-0002 (SEQ ID NO 5). SPEPAS: 5'AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTT AGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3'. (SEQ lD NO 6). Örtüsen oligonükleotidler, myc-epitopu etiketine yönelik diziyi kodlayacak ve Kpn 1 ve EcoRl çikintilarini parçalayacak sekilde sentezlenmistir. MTS: 5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3' (SEQ ID NO 7). MTAS 5'- 64 pmol SPEPS ve 64 pmol SPEPAS karistirilmistir ve 5 dakika 65°C°ye isitilmistir ve yavas bir sekilde 50°C'ye sogutulmustur. 64 pmol MTS ve 64 pmol MTAS karistirilmistir ve 5 dakika 65°C"ye isitilmistir ve yavas bir sekilde 50°Csye sogutulmustur. Iki karisim seyreltilmistir ve S-peptidi ile modifiye edilen pSecTag2B veya myc-epitopu ile modifiye edilen pSecTag2B°yi üretmek üzere Kpnl-EcoR] ile parçalanan pSecTagZBsde klonlanmistir. Tüm yapilar baslangiçta, restriksiyon ile parçalama yoluyla taranmistir ve dizileme yoluyla dogrulanmistir. TOPO SG yapisi, saflastirilan Sal 1 jeli ile (Qiagen) parçalanmistir ve S-peptidi ile modifiye edilen pSecTagZB veya myc-epitopu ile modifiye edilen pSecTagZBhin Xho 1 bölgesindeki çerçevede alt klonlanmistir. Tüm yapilar baslangiçta restriksiyon ile parçalama yoluyla taranmistir ve ayrica dizileme yoluyla dogrulanmistir. lgic lider-S-peptit-s HeVG (sGsmikcn) ve ng lider-myc etiketi-sHeVG (sGmyc_ctikcn) yapilari akabinde vaksinia mekik vektörü pMCOZade [Carroll, 1995] alt klonlanmistir. Oligonükleotid SEQS: 5'- TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3' (SEQ ID NO 9) sentezlenmistir ve PCR ile SGS-etiketi ve sGmyC_enketim çogaltmak üzere oligonükleotid SHGAS ile kombinasyon halinde kullanilmistir. Tüm PCR 01482-P-0002 reaksiyonlari asagidaki ayarlar ile Accupol DNA polimeraz (PGS Scientifics Corp.) kullanilarak yapilmistir: baslangiçta 5 dakika 94°C ve akabinde 1 dakika ayninda bulunan PCR ürünlerini üretmistir. PCR ürünleri jel ile saflastirilmistir (Qiagen). Jel satlastirmasindan sonra SGS-etiketi ve SGmyc-elikeii bir TOPO vektöründe (lnvitrogen Corp.) alt klonlanmistir. sG S-etiketi ve sG myo-etiketi, Sal 1 ile parçalanmistir ve pMC02inin Sal 1 bölgesinde alt klonlanmistir. Tüin yapilar baslangiçta restriksiyon ile parçalama yoluyla taraninistir ve ayrica dizileme yoluyla dogrulanmistir. HeV SG S-etiketi ve HeV sG myo-etiketinin polipeptit yapilari Sekil 6°daki temsili bir sekilde gösterilir. Örnek 2: Çözünebilir G Proteininin Protein Üretimi Protein üretimine yönelik olarak genetik yapilar, rekombinant poksvirüs vektörlerini (vaksinia virüsü, sus WR) üretmek üzere kullanilmistir. Rekombinant poksvirüs akabinde tk-seçimi GUS boyamasinin (6) kullanildigi standart teknikler kullanilarak elde edilmistir. Kisaca CV-I hücreleri, bir kalsiyum fosfat transfeksiyon kiti (Promega, Corp., Madison, WI) kullanilarak pMC02 sHeV G füzyonu veya pMC02 sNiV G füsyonu ile transfekte edilmistir. Bu tek katmanlar akabinde, vaksinia virüsünün Western Reserve (WR) dogal susu ile enfekte edilmistir. 2 gün sonra hücre pelletleri ham rekombinant Virüs stoklari olarak toplanmistir. TK` hücreleri, 25 tig/ml 5-Br0mo-2'-de0ksiüridin (BrdU) (Calbiochem, La Jolla, CA) varliginda rekombinant ham stoklar ile enfekte edilmistir. 2 saat sonra virüs, %1 düsük erime noktali (LMP) agaroz (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ve 25ug/ml BrdU içeren bir EMEM-IO kaplamasi ile degistirilmistir. 2 gün inkübasyondan sonra glukuronik asit (X-GLUC) (Clontech, Palo Alto, CA) içeren bir ek EMEM-IO kaplamasi eklenmistir. 24-48 saat içinde mavi plaklar görünmüstür, bunlar toplanmistir ve çift seçim plak saflastirma isleminin iki tutuna dahi tabi tutulmustur. Rekombinant vaksinia virüsleri vKB16 (sHeV G füzyonu) ve vKB22 01482-P-0002 (sNiV G füzyonu) akabinde çogaltilmistir ve standart yöntemler ile saflastirilmistir. Kisacasi rekombinant vaksinia virüsleri plak saflastirma, hücre kültürü amplifikasyonu, bir ultrasantrifüjde sükroz yastigi pelletleme ve plak analizi ile titrasyon yoluyla saflastirilir. sHeV Ginin ifadesi hücre lizatlari ve kültür üst fazlarinda dogrulanmistir (Sekil 1). Sekil 1°de gösterildigi üzere bir myc-etiketi veya S-etiketi çözünebilir HeV G,yi kodlayan vaksinia Virüsü, HeLa hücrelerinde metabolik etiketleme yoluyla üretilmistir. Kontrol, dogal sus HeV G`dir. Her bir sG yapisinin spesifik çökeltilmesi, myc MAb veya S boncuklari kullanilarak lizatlar veya üst fazlardan çökeltme yoluyla gösterilir. Örnek 3: Çözünebilir G Proteininin Özellikleri Rekombinant olarak ifade edilen, çözünebilir, saflastirilmis G'nin (sHeV G) istenen özellikleri (örnegin, reseptör baglanma kapasitesi gibi dogal yapisal özellikler) korudugunu göstermek üzere, hedef hücrelerin aIinite ile saflastirilan sHeV g ile önceden inkübasyonunun, virüs aracili füzyon ve enfeksiyona karsi yatkin olan birkaç farkli hücre hattinda Virüs aracili füzyonun doza bagli inhibisyonu ile sonuçlandigi gösterilmistir (Sekil 2). Çözünebilir G glikoproteinlerinin saflastirilmasina yönelik olarak HeLa hücreleri, 2 saat VKBIS veya vKBlö (moi=3) ile enfekte edilmistir. Enfeksiyondan sonra Virüs uzaklastirilmistir ve serum içermeyen OptiMem ortami (Invitrogen, Corp.) eklenmistir. 36 saat sonra üst fazlar çikarilmistir ve santrifugasyon ile berraklastirilmistir. Bir S-proteini kolonu, bir XK26 kolonunda (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 15 ml S-protein agarozu (Novagen) ile dökülmüstür. S-protein kolonu, PBSsnin 10 yatak hacmi ile yikanmistir. VKBl6 ile enfekte edilen hücrelerden elde edilen üst faz S-proteini agaroz kolonunun üzerinden geçirilmistir, kolon PBS,nin 10 yatak hacmi ile yikanmistir ve SGS-etiketi ml IM Tris pH=8 içinde 0.2M sitrat pH=2"nin 1 yatak hacmi ile ayristirilmistir. 01482-P-0002 Lentil lektin Sefaroz B satin alininistir (Amersham Pharmacia Biotech) ve 25 ml,lik bir XK26 kolonu dökülmüstür. VKB15 ile enfekte edilen hücrelerden elde edilen üst fazlar lentil lektin kolonunun üzerinden geçirilmistir, kolon 10 yatak hacimli PBS ile yikaninistir ve SGmyc-etiketi 2 ml IM Tris pH:8 içinde 0.2M glisin pH=2.5"in 1 yatak hacmi ile ayristirilmistir. Her iki elüat akabinde 30 kDa Centricon santrifugal filtre birimleri (Millipore, Billerica, MA) kullanilarak konsantre edilmistir ve filtre ile sterilize edilmistir. Protein konsantrasyonlari SDS/PAGE, Commassie parlak mavi R-250 boyama ve NIH görüntüsü 1.62 yazilimi ile yogunluk ölçümü analizi kullanilarak hesaplanmistir. Sekil 2'de gösterildigi üzere çözünebilir HeV G zarf glikoproteini (S etiketi veya myo-etiketi versiyonlari) hem HeV hem de NiV aracili hücre-hücre füzyonunu bloke eder. HeV ve NiV hücre-hücre füzyonunun doz yanit inhibisyonu, oda sicakliginda 30 dakikada saflastirilmis sG'nin gösterilen miktari ile hedef hücrelerin önceden inkübe edilmesi yoluyla gerçeklestirilmistir. HeV veya NiV F ve G"yi ifade eden efektör hücreler eklenmistir ve füzyonun 2.5 saat 37°C'de ilerlemesine olanak taninmistir. Reaksiyon karisimlari, ß-gal raportör gen analizi kullanilarak ß-gal üretimine yönelik olarak islenmistir. Analizler iki kopya halinde gerçeklestirilmistir. Paneller A ve B, ham sHeV G (S-etiketi) içeren üst fazin iki degisken hücre tipinde HeV aracili füzyonu güçlü bir sekilde bloke edebilirken WR ile enfekte olan hücrelerden (rekombinant olmayan vaksinia Virüsü ile enfekte olmus) elde edilen bir kontrol üst fazinin herhangi bir etkiye sahip olmadigini gösterir. Paneller C ve D: U373 hücreleri (Panel C) veya PCI 13 hücrelerinde (Panel P) sG-S-etiketi tarafindan HeV ve NiV aracili füzyonun inhibisyonu. Paneller E ve F: U373 hücreleri (Panel E) veya PCl 31 hücrelerinde (Panel F) saflastirilmis myc-etiketi tarafindan HeV- ve NiV-aracili füzyonun inhibisyonu. Ek kanit olarak dolayli immünofloresans, gösterilen sHeV G9nin, virüs aracili füzyon ve enfeksiyona karsi yatkin olan hücre hatlarina spesifik olarak baglanabilecek sekilde gerçeklestirilmistir (Sekil 3). sHeV G, HeV ve NiV aracili 01482-P-0002 füzyon ve virüs enfeksiyonuna yönelik seçmeli olmayan bir hücre hatti olan HeLa hücrelerine baglanamaz. Bu veriler, sHeV G"nin, HeV G ve F ifade eden efektör hücrelerin akabinde baglanmasi ve füzyonunu bu sekilde bloke eden hedef hücreler üzerinde putatif reseptöre baglanma yoluyla HeV aracili füzyonu inhibe eder. sHeV G"nin putatif HeV reseptörü ile etkilesimi, reseptör saflastirmasi ve tanimlanmasina yönelik yararli bir alet olabilir. Çözünebilir G glikoproteininin ifade edilebilmesi ve saflastirilabilmesi ve ayrica dogal G glikoproteininden beklenen ile benzer biyokimyasal özellikler sergilemesi nedeniyle bunu, virüs nötralize edici antikorlarin ortaya çikarilmasina yönelik ideal bir alt birim immünojeni haline getirir. Benzer bir SG yapisi, Nipah virüsünün G zarf glikoproteinin kodlama dizisi kullanilarak ayni S-etiketi yaklasimi (yukaridaki yöntemlere bakiniz) kullanilarak olusturulmustur. Bu NiV G (S-etiketi) klonlanmistir ve ifade edilmistir ve Sekil 4"te gösterilir. sHeV G (S-etiketi) zarf glikoproteininin son bir analizi, proteinin tahmin edilen oligomerik yapisini degerlendirmek üzere yapilmistir. Çözünebilir bazi oligomerik özelliklerin ve salgilanan G glikoproteinin tutulmasi, yukaridaki giris kisminda tartisildigi üzere önemli immünolojik veya biyokimyasal özelliklerin tutulmasinda önemli olabilir. Sekil 5, G glikoproteininin monomerik, dimerik ve tetramerik formlarini tanimlayan sükroz gradyaninin bölümlere ayrilmasi yoluyla salgilanmis sHeV G (S-etiketi) glikoproteininin bir analizini gösterir. Hem çapraz baglanmis hem de çapraz baglanmamis materyaller analiz edilmistir. Sonuçlar, monomerik, dimerik ve bazi tetramerik sG"nin sG preparatini içerdigini ve bunun diger paramiksovirüs H ve HN baglanti glikoproteinlerinin (yukarida tartisilmistir) çözünebilir ve tam uzunluktaki versiyonlari ile ilgili bulgular ile uyum içinde oldugunu gösterir. Bu üç tür, istenmesi halinde preparatif boyut dislamali kromatografi teknikleri ile ayrilabilir. 01482-P-0002 Örnek 4: Cözünebilir ve salgilanmis HeV G9nin karakterizasvonu Daha sonra, salgilanmis sG*nin yapi olarak oligomerik olup olmadiginin belirlenmesi amaçlanmistir. Saflastirilmis SG materyalinin açik moleküler agirligi ilk olarak, kalibre edilmis bir Superdex 200 analitik dereceli kolon 10/300 ile boyut dislamali kromatografi kullanilarak incelenmistir. sGs_enken veya sGmyC_ etiketinin 500 ugîik bir alikuotu, Superdex 200 üzerinde geçilmistir ve fraksiyonlar, yüksek inoleküler agirlik standartlarina yönelik olarak kullanilan ayni yöntemler kullanilarak toplanmistir. Temel olarak ayni sonuçlar, sGsmketi ve SGmyc-etiketi glikoproteinleri ile gözlenmistir ve Sekil 7"de gösterilen sonuçlar SGS-etiketine yönelik olarak gösterilenlerdir. Protein standartlarinin ve üç temel sG türünün konumlari sekilde gösterilir. Iç ek, ayrilan sGlnin profilini gösterir. Satlastirilmis SGS-ctiketinin yedi bagimsiz ayirma deneyinde analizi, ~372 KDa +/- 19 KDa (materyalin ~%60,1) ve ~26l KDa +/- 47 KDa°lik (materyalin ~%35,i) açik moleküler agirliklari ve ~ bir küçük piki ile iki temel piki göstermistir. Bu sonuçlar, materyalin en az bir kisminin yapi olarak oligomerik oldugunu, glikoproteinin beklenen yapisi ile tutarli oldugunu göstermistir. Ancak çözünebilir virüsten elde edilen membran glikoproteinlerinin hazirlanmasi ve analizindeki önceki deneyimden, HIV-Fde gp120 gibi olmak üzere, boyut dislamali kromatografi analizinden elde edilen bu tür moleküler agirlik hesaplamalari fazla tahmin edilebilir. SG,IIII1 açik oligomerik türlerini karakterize etmek üzere sGsmketi sükroz gradyani yogunluk ölçümü kullanilarak analiz edilmistir. Bu analize yönelik olarak SGS- etiketiglikoproteini, bunun spesifik MAb'ye yönelik ihtiyaci önleyen S-proteini agaroz ile afinite ile çökeltilebilmesi nedeniyle seçilmistir. Sekil 8, ifade eden hücrelerin üst fazindan izole edilen metabolik olarak etiketlenmis SGS_ etiketinin oligomerik profillerini gösterir. Herhangi bir hücresel enkazi uzaklastirmak üzere kisa santrifugasyonun akabinde üst faz konsantre edilmistir ve tampon, burada açiklanan sekilde PBS ile degistirilinistir. Sükroz gradyaninda ayrilmadan önce üst fazin yarisi indirgenebilir bir çapraz baglayici olan DTSSP ile çapraz 01482-P-0002 baglanmistir ve çapraz baglanmayan ve çapraz baglanan materyal iki ayri sükroz gradyaninin üzerine yüklenmistir. Her bir gradyanin bölümlere ayrilmasindan sonra fraksiyonlar 2 tüpe bölünmüstür, S-proteini agarozu ile çökeltilmistir, yikanmistir ve SDS numune tamponunda yeniden süspanse edilmistir ve B- merkaptoetanole sahip bir grup ve ß-merkaptoetanole sahip olmayan bir grup ve tüm dört fraksiyon grubu akabinde SDS-PAGE ile analiz edilmistir. Sekiller 8A ve 8B, sükroz gradyani üzerinde ayrilan, bölümlere ayrilan ve immüno çökeltilen çapraz baglanmamis SGS-etiketidir› Sekil 8A,da fraksiyonlar, ß-merkaptoetanolün eksikliginde SDS-PAGE üzerinde çözülürken Sekil 8B,de fraksiyonlar ß- merkaptoetanolün varliginda SDS-PAGE üzerinde çözülmüstür. Sekiller 8C ve 8D, sükroz gradyani üzerinde ayrilan, bölümlere ayrilan ve immüno çökeltilen çapraz baglanmis SGS-etiketidir. Sekil 8C"de fraksiyonlar, ß-merkaptoetanolün eksikliginde SDS-PAGE üzerinde çözülürken Sekil 8D°de fraksiyonlar ß- merkaptoetanolün varliginda SDS-PAGE üzerinde çözülmüstür. Her bir gradyana yönelik baslangiç materyali ayrica, ß-merkaptoetanolün varliginda veya eksikliginde her bir jel üzerinde islenmistir ve kontrol olarak gösterilir. Sekiller 8A ve 8C9de gösterilen verilerden, hem çapraz baglanmamis hem de çapraz baglanmis SGS-etiketine yönelik olarak, üç farkli SG türünün bulundugu belirlenmistir. Gradyanlarin her biri üzerinde fraksiyonlarin her birinde SG,nin açik moleküler agirliklarma bagli olarak, bu üç tür muhtemelen monomer, dimer ve tetrameri temsil eder. Ek olarak gradyan santrifugasyonundan önce sG'nin DTSSP ile hizli çapraz baglanmasi tetramerik veya dimerik türlerin miktarini önemli oranda arttirmamistir. Çapraz baglanmamis, indirgenmemis ve indirgenmis sG"nin analizi açik bir sekilde, dimerik oligonierin disülfit bagli oldugunu gösterir, bu da diger paramiksovirüs baglanti glikoproteinlerinden (36, 44) elde edilen verilere bagli olarak tahmin edilmistir. Diger paramiksovirüs baglanti glikoproteinlerinin dimerlerinin, enfekte olan hücrelerin yüzeyi üzerinde bir tetramer olusturdugu gösterilmistir ve dogal oligomerik yapinin dimerlerin bir dimeri olduguna inanilir. Burada bu olasiligi analiz etmek üzere tam uzunluktaki HeV G ifade edilmistir ve HeLa hücrelerinde (bir reseptör-negatif hücre hatti) metabolik olarak etiketlenmistir ve benzer bir deney ve sükroz gradyani analizi 01482-P-0002 gerçeklestirilmistir. Bozulmamis hücreler üzerinde yüzeyde ifade edilen HeV G,nin bir çapraz baglama prosedürünün akabinde veya tedavi olmadan hücreler, iyonik olmayan deterjan ile parçalanmistir, lizatlar santrifugasyon ile berraklastirilmistir ve yüzeyde ifade edilen HeV G preparatlari sükroz gradyani santrifugasyonu ile analiz edilmistir. Fraksiyonlar, Protein G-Sefarozun akabinde poliklonal anti-HeV tavsan serumlari ile immünopresipitasyon yoluyla analiz edilmistir ve daha önceden oldugu gibi indirgeyici ve indirgeyici olmayan kosullar altinda SDS-PAGE üzerinde çözülmüstür. Sekil 9°da gösterilen, yüzeyde ifade edilen çapraz baglanmamis tam uzunluktaki radyoaktif olarak etiketlenmis HeV Ginin sükroz gradyani analizidir. Burada indirgenmemis fraksiyonlarda, tam uzunluktaki HeV Ginin %95°inin, açik tetramerik türler olarak bulundugu (Sekil 9A, seritler 2-5) ve bu oligomerik türün açik sekilde, monomerik olan karsilik gelen indirgenmis fraksiyonlar ile gösterilen sekilde disülfit baglarina bagimli oldugu (Sekil 9B, seritler 2-5) gözlenir. Ek olarak ayni sükroz gradyani profilleri, çapraz baglama reaktifinin kullanilmadigini veya dogal hücre-yüzeyde ifade edilen G formlarinin çok stabil tetramerik bir oligomer olmadigina bakilmaksizin görülmüstür. Hastanin dogal membran ankraj bölgesi ve veya bunun sitoplazmik kuyrugu bu stabiliteye katkida bulunabilir. Bununla birlikte, burada üretilen SGS_ etiketi glikoproteinin çogunlugu (~%60-70), önemli ve yararli dogal yapisal özellikleri koruyabildigini göstermek üzere bir oligomerik dimerdir. Örnek 5: Cözünebilir HeV G tarafindan HeV ve NiV enfeksiyonunun inhibisyonu sGs_etiketinin kültürdeki Vero hücrelerinin canli virüs enfeksiyonunu etkileyip etkilemedigi daha sonra degerlendirilmistir. Burada, Vero hücrelerinin sGsatikmm çesitli konsantrasyonlari ile önceden inkübasyonunun akabinde hücreler, virüs asisinin çikarilmasinin ve sGs-e[iketi ile inkübasyonun akabinde, 30 dakika SGS_ veya NiV ile enfekte edilmistir. Kültürde 24 saat sonra HeV ve NiV enfeksiyonu odak noktalarinin sayisi, yöntemlerde detayli olarak açiklandigi üzere bir anti- 01482-P-0002 fosfoprotein (P) ile hücre tek katmanlarinin spesifik immüno boyanmasi yoluyla ölçülmüstür. sGMnkmnin varliginda veya eksikliginde enfekte Vero hücrelerinin temsili örnekleri Sekil lO,da gösterilir. Tipik olarak Vero hücrelerinin canli HeV veya NiV ile enfeksiyonu, her bir virüse yönelik karakteristik sinsityum morfolojileri üretir. HeV sinsityada HeV P proteinine yönelik immünofloresans, HeV9nin yeniden üretilebilir sekilde enfekte oldugunu ve enfekte olan hücrelerin çogu boyunca esit olarak saptanabilen hücre çekirdegi ve viral protein ile her bir sinsityumda çevredeki hücreleri dahil ettigini göstermistir (Sekil lOA). NiV ile enfekte olan hücreler baslangiçta HeV sinsitya ile benzer bir görüntü gösterir, ancak son olarak her bir dev hücreye dahil edilen çekirdekler, dis çevreye dogru birlikte ayri sekilde tutulurken kalan hücresel enkaz ayrica merkezi bölge büyük oranda bos birakilarak dis tarafta düzenlenir. Böylece NiV sinsityada HeV P proteinine yönelik immünofloresan genellikle, viral antijende (Sekil lOB) kaplanmis içi bos küreler olarak görülür ve karsilastirma yoluyla isleme tabi tutulmamis kontrol HeV enfeksiyonlari, islenmemis NiV kontrolüne (Sekiller 10A ve lOB) göre daha küçük sinsityum üretir. Sekiller 10C ve 10D, 100 ug/ml SGS_ etiketinin varliginda HeV ve NiV ile enfekte olan Vero hücrelerinin temsili örnekleridir. Immünofloresans ile saptanan sekilde yine bazi enfekte hücrelerin bulunmasina ragmen sinsitya olusumu HeV ve NiV ile enfekte olan hücrelerde tamamen bloke edilmistir (sirasiyla Sekiller lOC ve lOD). Ayrica saflastirilmis sGsmikcti glikoproteini tarafindan HeV ve NiV enfeksiyonunun inhibisyonunun niceliksel analizi, Sekil 11"de gösterildigi üzere, bunun spesifikligini gösterecek sekilde doza bagli bir yaniti ortaya çikarmistir. Bununla birlikte, bu veriler, HeV ve NiV,nin konakçi hücrenin yüzeyi üzerinde ortak bir reseptör kullandigina dair güçlü kanit saglar. Ek olarak her iki virüsün sGsmkcn tarafindan spesifik inhibisyonu ayrica, sGsmkcii yapisinin, önemli dogal yapisal elementleri korudugunu göstermistir. Ilgi çekici sekilde HeV enfeksiyonu, sGSenkem yönelik olarak belirlenen lC50 NiVlye yönelik olarak (13.20 ug/ml) HeV"ye (3.3 ug/ml) yönelik olandan dört kat daha fazla olacak sekilde NiV9den önemli oranda daha iyi inhibe edilmistir (Sekil 11). Her iki virüsün ortak bir reseptör kullandigini ileri süren mevcut kanit ele alindiginda, virüs enfeksiyonuna karsi hücre-füzyonun 01482-P-0002 sGs-enketi inhibisyonunda gözlenen farkliliga yönelik nedenler bilinmezligini korur. Sekil 3,te gösterildigi üzere, sGsmkmmn HeV ve NiV aracili hücre-tüzyonunu inhibe etme yetenegindeki benzer bir farklilik gözlenmemistir. Substrat döngüsünün daha yüksek seviyeleri ile gösterilmek üzere HeV aracili füzyonun, NiV aracili füzyondan daha güçlü olmasina ragmen her iki hücre-füzyonu analizinde SGS-etiketi IC50°si sabit kalmistir. Önceki raporlarda heterotipik fonksiyon araciligiyla, HeV ve NiV arasindaki hücre-füzyon oranlarindaki farkliligin füzyon proteinine bagli oldugu gösterilmistir. Burada dogal NiV enfeksiyonunun, HeV enfeksiyonundan daha güçlü oldugunun görüldügü gösterilmistir. Muhtemelen, enfeksiyon sirasinda mevcut olan diger viral proteinler, böylece enfeksiyonun yatkinligini degistirerek enfeksiyon kinetiklerini etkiler veya bunlar, hücre yüzeyinde ifade edilen reseptöre yönelik olarak HeV SG7ye karsi NiV G"nin afinitesindeki farkliliklar olabilir. Örnek 6: Çözünebilir HeV G, güçlü bir virüs nötralize edici poliklonal antikor yanitini ortaya çikarir. Birkaç istisna ile, neredeyse tüm nötralize edici antikorun yönlendirildigi, virüslerin zarf glikoproteinleridir ve tüm basarili insan Viral asilari, bir virüsün immünolojik olarak baglantili suslari ile çapraz reakte olabilen nötralize edici antikorlari indükler. Daha spesifik olarak virüs nötralize edici antikorlar, paramiksovirüs kabakulak ve kizamik durumunda kilit asi ile indüklenen koruyucu mekanizmadir ve NiV'den vaksinia virüsü tarafindan ifade edilen tam uzunluktaki zarf glikoproteinler, Virüs nötralize edici antikorlari ortaya çikarabilir. Veriler, sGsmkmi glikoproteinin, bunun spesifik olarak reseptör pozitif hücrelere baglanma ve hem HeV ve NiV aracili füzyon ve enfeksiyonu bloke etme yetenegine bagli olarak önemli yapisal özellikleri korudugunu gösterir. Böylece hayvanlarin SG ile immünizasyonu potansiyel olarak, güçlü virüs nötralize edici antikorlar üretmelidir. Bu olasiligi test etmek üzere saflastirilmis SGS-etiketi, tavsanlari immünize etmek üzere kullanilmistir ve ortaya çikan anti-G antiserumu, hem HeV hem de NiV ile yapilan virüs nötralizasyon analizlerinde 01482-P-0002 degerlendirilmistir. Tablo 1, poliklonal tavsan anti-G semmlari tarafindan HeV ve NiV enfeksiyonunun nötralizasyonunu kisaca açiklar. Her iki tavsandan alinan serumlar, 12128011ik bir dilüsyonda HeVinin tam nötralizasyonunu yapabilir. NiV ayrica, 12640,lik bir dilüsyonda tam nötralizasyon ile birlikte SGS-etiketi antiserumu tarafindan nötralize edilmistir. Titredeki iki katlik bir fark, HeV ve NiV G glikoproteinlerinin kismi antikor çapraz reaktivitesi ile tutarlidir. Her iki tavsandaki ön kanamalar ayrica, bunlarin HeV be NiV,yi nötralize etme yetenegine yönelik olarak test edilmistir. En yüksek konsantrasyonda hafif oranda nötralizasyon olmasina ragmen bu aktivite serumlarin dilüsyonu üzerine tamamen ortadan kaldirilmistir. Önceki çalismalar, HeV ve NiV antiserumlarinin, her bir serumun heterotipik virüse (14) karsi hafif oranda etkili olmasi ile birlikte çapraz nötralize oldugunu göstermistir. Ayrica HeV ve NiV°ye (4,81) yönelik hücre- füzyon analizi kullanilarak çapraz nötralizasyonda benzer bir egilim gösterilmistir. sGSetikdinin yüksek seviyelerde nötralize edici antikorlar ile bu tür güçlü bir immün yanitini ortaya çikarabilmesi nedeniyle bu, asi gelistirme stratejilerine yönelik bir yol saglayabilir. Gösterilen Referanslar 1. Anonymous. 1999. From the Centers for Disease Control and Prevention. Outbreak of Hendra-like virusMalaysia and Singapore, 1998-1999. Jama 28121787-8. 2. Baker, K. A., R. E. Dutch, R. A. Lamb, and T. S. Jardetzky. 1999. Structural basis for paramyxovirus-mediated membrane fusion. M0] Cell 3:309-19. 3. Berger, E. A., P. M. Murphy, and J. M. Farber. 1999. Chemokine receptors as HIV-l coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease. Annu Rev linmunol 172657-700. 4. Bossart, K. N., L.F. Wang, B. T. Eaton, and C. C. Broder. 2001. Functional expression and membrane fusion tropism of the envelope glycoproteins of Hendra virus. Virology 290: 121-35. 01482-P-0002 . Bossart, K. N., L. P. Wang, M. N. Flora, K. B. Chua, S. K. Lam, B. T. Eaton, and C. C. Broder. 2002. Membrane fusion tropism and heterotypic functional activities of the nipah virus and hendra virus envelope glycoproteins. J Virol 76:11186-98. 6. Broder, C. C, and P. L. Earl. 1999. Recombinant vaccinia viruses. Design, generation, and isolation. Mol Biotechnol 132223-45. 7. Broder, C. C, P. L. Earl, D. Long, S. T. Abedon, B. Moss, and R. W. Doms. 1994. Antigenic implications of human immunodeficiency Virus type 1 envelope quaternary structure: oligomer-specific and -sensitive monoclonal 8. Chan, D. C, D. Fass, J. M. Berger, and P. S. Kim. 1997. Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein. Cell 89:263-73. 9. Chen, L., P. M. Colman, L. J. Cosgrove, M. C. Lawrence, L. J. Lawrence, P. A. Tulloch, and J. J. German. 2001. Cloning, expression, and crystallization of the fusion protein of Newcastle disease virus. Virology 290:290-9. . Chen, L., J. J. Gorman, J. McKimm-Breschkin, L. J. Lawrence, P. A. Tulloch, B. J. Smith, P. M. Colman, and M. C. Lawrence. 2001. The structure of the ûision glycoprotein of Newcastle disease Virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion. Structure (Camb) 92255- 66. ll. Chua, K. B., W. J. Bellini, P. A. Rota, B. H. Harcourt, A. Tamin, S. K. Lam, T. G. Ksiazek, P. E. Rollin, S. R. Zaki, W. Shieh, C. S. Goldsmith, D. J. Gubler, J. T. Roehrig, B. Eaton, A. R. Gould, J. Olson, H. Field, P. Daniels, A. E. Ling, C. J. Peters, L. J. Anderson, and B. W. Mahy. 2000. Nipah virus: a recently emergent deadly paramyxovirus. Science 288: 1432-5. 12. Chua, K. B., K. J. Goh, K. T. Wong, A. Kamarulzaman, P. S. Tan, T. G. Ksiazek, S. R. Zaki, G. Paul, S. K. Lam, and C. T. Tan. 1999. Fatal encephalitis due to Nipah Virus among pig-farmers in Malaysia [see 13. Citovsky, V., P. Yanai, and A. Loyter. 1986. The use of circular dichroism to study conformational changes induced in Sendai virus envelope 01482-P-0002 glycoproteins. A correlation with the viral fusogenic activity. J Biol Chem 26122235-9. 14. Crameri, G., L. F. Wang, C. Morrissy, J. White, and B. T. Eaton. 2002. A rapid immune plaque assay for the detection of Hendra and Nipah viruses and anti-virus antibodies. J Virol Methods 99:41-51. . Crennell, S., T. Takimoto, A. Portner, and G. Taylor. 2000. Crystal structure of the multifunctional paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase Nat Struct Biol 7:1068-74. 16. Doms, R. W., R. Lamb, J. K. Rose, and A. Helenius. 1993. Folding and 17. Doms, R. W., and J. P. Moore. 2000. HIV-I membrane fusion. Targets Of opportunity. J Cell Biol 1512F9-Fl4. 18. Doms, R. W., and D. Trono. 2000. The plasma membrane as a combat zone in the HIV battlefield [In Process Citation]. Genes Dev 14:2677-88. 19. Dorig, R. E., A. Marcil, A. Chopra, and C. D. Richardson. 1993. The human CD46 molecule is a receptor for measles virus (Edmonston strain). . Dutch, R. E., R. N. Hagglund, M. A. Nagel, R. G. Paterson, and R. A. Lamb. 2001. Paramyxovirus fusion (F) protein: a conformational change on cleavage activation. Virology 281 : 138-50. 21. Fass, D., S. C. Harrison, and P. S. Kim. 1996. Retrovirus envelope domain at 1.7 angstrom resolution. Nat Struct Bio] 3:465-9. 22. Field, H., P. Young, J. M. Yob, J. Mills, L. Hall, and J. Mackenzie. 2001. The natural history of Hendra and Nipah viruses. Microbes lnfect 3:307-14. 23. Goh, K. J., C. T. Tan, N. K. Chew, P. S. Tan, A. Kamarulzaman, S. A. Sarji, K. T. Wong, B. .1. Abdullah, K. B. Chua, and S. K. Lam. 2000. Clinical features of Nipah virus encephalitis among pig fariners in Malaysia [see comments]. N Engl J Med 342: 1229-35. 24. Halpin, K., P. L. Young, H. Field, and J. S. Mackenzie. 1999. Newly discovered viruses of flying foxes. Vet Microbiol 68:83-7. 01482-P-0002 . Halpin, K., P. L. Young, H. E. Field, and J. S. Mackenzie. 2000. Isolation of Hendra Virus from pteropid bats: a natural reservoir of Hendra virus. J Gen 26. Hernandez, L. D., L. R. Hoffman, T. G. Wolfsberg, and J. M. White. 1996. Virus-cell and cell-cell fusion. Annu Rev Cell Dev Biol 12:627-61. 27. Hooper, P., S. Zaki, P. Daniels, and D. Middleton. 2001. Comparative pathology of the diseases caused by Hendra and Nipah viruses. Microbes 28. Hooper, P. T., H. A. Westbury, and G. M. Russell. 1997. The lesions of experimental equine morbillivirus disease in cats and guinea pigs. Vet Pathol 34:323-9. 29. Hughson, F. M. 1997. Enveloped viruses: a common mode of inembrane fusion? Curr Biol 7:R565-9. H. Hughes, and H. E. Varmus (ed.), Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 31. Hurtley, S. M., and A. Helenius. 1989. Protein oligomerization in the endoplasmic reticulum. Ann. Rev. Cell Biol. 5:277-307. 32. Jiang, S., K. Lin, N. Stride, and A. R. Neurath. 1993. HIV-l inhibition by a peptide. Nature 36511 13. 33. Joshi, S. B., R. E. Dutch, and R. A. Lamb. 1998. A core trimer of the paramyxovirus fusion protein: parallels to influenza virus hemagglutinin and HIV-l gp41. Virology 248z20-34. 34. Klenk, H. D., and W. Garten. 1994. Host cell proteases controlling virus pathogenicity. Trends Microbiol 2:39-43. . Lamb, R. A. 1993. Paramyxovirus fusion: A hypothesis for changes. Virology 197:1-11. 36. Lamb, R. A., and D. Kolakofsky. 2001. Paramyxoviridae: The viruses and their replication., p. 1305-1340. In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed), Fields Virology, 4 ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. 01482-P-0002 37. Lainbert, D. M., S. Barney, A. L. Lambert, K. Gufhrie, R. Medinas, D. E. Davis, T. Bucy, J. Erickson, G. Merutka, and S. R. Petteway, Jr. 1996. Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion. Proc Natl Acad Sci U S A 93:2186-91. 38. Lee, K. E., T. Umapathi, C. B. Tan, H. T. Tjia, T. S. Chua, H. M. Oh, K. M. Fock, A. Kurup, A. Das, A. K. Tan, and W. L. Lee. 1999. The neurological manifestations of Nipah virus encephalitis, a novel paramyxovirus. Ann Neurol 46:428-32. 39. Lim, C. C, Y. Y. Sitoh, F. Hui, K. E. Lee, B. S. Ang, E. Lim, W. E. Lim, H. M. Oh, P. A. Tambyah, J. S. Wong, C. B. Tan, and T. S. Chee. 2000. Nipah Viral encephalitis or Japanese encephalitis? MR findings in a new zoonotic disease. AJNR Am J Neuroradiol 21:455-61. 40. Markwell, M. A., and C. F. Fox. 1980. Protein-protein interactions Within paramyxoviruses identified by native disulfide bonding or reversible Chemical cross-linking. J Virol 33:152-66. 41. McGinnes, L. W., K. Gravel, and T. G. Morrison. 2002. Newcastle disease Virus HN protein alters the conformation of the F protein at cell surfaces. J 42. Middleton, D. J., H. A. Westbury, C. J. Morrissy, B. M. van der Heide, G. M. Russell, M. A. Braun, and A. D. Hyatt. 2002. Experimental nipah virus infection in pigs and cats. J Comp Pathol 126:]24-36. 43. Morrison, T. G. 1988. Structure, function, and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins. Virus Res 10:] 13-35. 44. Morrison, T. G. 2001. The three faces of paramyxovirus attachment proteins. Trends Microbiol 9:103-5. 45. Mounts, A. W., H. Kaur, U. D. Parashar, T. G. Ksiazek, D. Cannon, J. T. Arokiasamy, L. J. Anderson, and M. S. Lye. 2001. A cohort study of health care workers to assess nosocomial transmissibility of Nipah virus, Malaysia, 01482-P-0002 46. Murray, K., P. Selleck, P. Hooper, A. Hyatt, A. Gould, L. Gleeson, H. Westbury, L. Hiley, L. Selvey, B. Rodwell, and et al. 1995. A morbilliviius that caused fatal disease in horses and humans. Science 268:94-7. 47. Naniche, D., G. Varior-Krishnan, F. Cervoni, T. F. Wild, B. Rossi, C. Rabourdin-Combe, and D. Gerlier. 1993. Human membrane cofactor protein 48. Nussbaum, 0., C. C. Broder, B. Moss, L. B. Stem, S. Rozenblatt, and B. A. Berger. 1995. Functional and structural interactions between measles virus hemagglutinin and CD46. J Virol 69:3341-9. 49. O'Sullivan, J. D., A. M. Allworth, D. L. Paterson, T. M. Snow, R. Boots, L. J. Gleeson, A. R. Gould, A. D. Hyatt, and J. Bradfield. 1997. Fatal encephalitis due to novel paramyxovirus transmitted from horses. Lancet 349293-5. 50. Paterson, R. G., M. L. Johnson, and R. A. Lamb. 1997. Paramyxovirus fusion (F) protein and hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein interactions: intracellular retention of F and HN does not affect transport of the homotypic HN or F protein. Virology 237: 1 -9. 51. Plemper, R. K., A. L. Hammond, and R. Cattaneo. 2001. Measles virus envelope glycoproteins hetero-oligomerize in the endoplasmic reticulum. J 52. Rapaport, D., M. Ovadia, and Y. Shai. 1995. A synthetic peptide corresponding to a conserved heptad repeat domain is a potent inhibitor of Sendai virus-cell fusion: an emerging similarity with functional domains of other viruses. Embo J 14:5524-31. 53. Russell, C. J., T. S. Jardetzky, and R. A. Lamb. 2001. Membrane fusion machines of paramyxoviruses: capture of intermediates of fusion. Embo J :4024-34. 54. Russell, R., R. G. Paterson, and R. A. Lainb. 1994. Studies With cross- linking reagents on the oligomeric form of the paramyxovirus fusion protein. Virology 1992160-8. 01482-P-0002 55. Scheid, A., and P. W. Choppin. 1974. Identification of biological activities of paramyxovirus glycoproteins. Activation of cell fusion, hemolysis, and infectivity of proteolytic cleavage of an inactive precursor protein of Sendai virus. Virology 57:475-90. 56. Singh, M., B. Berger, and P. S. Kim. 1999. LearnCoil-VMF: computational evidence for coiled-coil-like motifs in many viral membrane- 57. Stone-Hulslander, J., and T. G. Morrison. 1997. Detection of an interaction between the HN and F proteins in Newcastle disease virus-infected cells. J Virol 71:6287-95. 58. Takimoto, T., G. L. Taylor, H. C. Connaris, S. J. Crennell, and A. Portner. 2002. Role of the hemagglutinin-neuraminidase protein in the mechanism of paramyxovirus-cell membrane fusion. J Virol 76: 13028-33. 59. Takimoto, T., G. L. Taylor, S. J. Crennell, R. A. Scroggs, and A. Portner. 2000. Crystallization of Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein. Virology 270:208-14. 60. Tan, C. T., and K. S. Tan. 2001. Nosocomial transmissibility of Nipah Virus. J Infect Dis 18421367. 61. Tatsuo, H., N. Ono, K. Tanaka, and Y. Yanagi. is a cellular receptor for measles virus. Nature 406z893-7. 62. Tatsuo, H., N. Ono, and Y. Yanagi. 2001. Morbilliviruses use signaling lymphocyte activation molecules (CD150) as cellular receptors. J Virol 75:5842-50. 63. Wang, L., B. H. Harcourt, M. Yu, A. Tamin, P. A. Rota, W. J. Bellini, and B. T. Eaton. 2001. Molecular biology of Hendra and Nipah viruses. Microbes lnfect 3:279-87. 64. Wang, L. F., W. P. Michalski, M. Yu, L. 1. Pritchard, G. Crameri, B. Shiell, and B. T. Eaton. 1998. A novel P/V/C gene in a new member of the Paramyxoviridae family, which causes lethal infection in humans, horses, and other animals. J Virol 72: 1482-90. 01482-P-0002 65. Westbury, H. A., P. T. Hooper, S. L. Brouwer, and P. W. Selleck. 1996. Susceptibility of cats to equine morbillivirus. Aust Vet J 74:132-4. 66. Westbury, H. A., P. T. Hooper, P. W. Selleck, and P. K. Murray. 1995. Equine morbillivirus pneumonia: susceptibility of laboratory animals to the virus. Aust Vet J 72:278-9. 67. Wild, C. T., D. C. Shugars, T. K. Greenwell, C. B. MeDanal, and T. J. Matthews. 1994. Peptides corresponding to a predictive alpha-helical domain of human immunodeficiency Virus type l gp41 are potent inhibitors of virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A 91:9770-4. 68. Wild, T. F., and R. Buckland. 1997. Inhibition of measles virus infection and fusion with peptides corresponding to the leucine zipper region of the fusion protein. J Gen Virol 7 8:107-1 1. 69. Wiley, D. C, and J. J. Skehel. 1987. The structure and ûinction of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Ann. Rev. Biochem. 56:365-394. 70. Williamson, M. M., P. T. Hooper, P. W. Selleck, L. J. Gleeson, P. W. Daniels, H. A. Westbury, and P. K. Murray. 1998. Transmission studies of Hendra Virus (equine morbillivirus) in fruit bats, horses and cats. Aust Vet J 76:813-8. 71.Wilson, 1. A., J. J. Skehel, and D. C. Wiley. 1981. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza Virus at 3 A resolution. Nature 289z366-73. 72. Wong, S. C, M. H. Ooi, M. N. Wong, P. H. Tio, T. Solomon, and M. J. Cardosa. 2001. Late presentation of Nipah virus encephalitis and kinetics of the humoral immune response. J Neurol Neurosurg Psychiatry 71:552-4. 73. Yao, Q., X. Hu, and R. W. Compans. 1997. Association of the paraintluenza Virus fusion and hemagglutinin-neuraminidase glycoproteins on cell surfaces. J Virol 71 :650-6. 74. Young, J. K., R. P. Hicks, G. E. Wright, and T. G. Morrison. 1997. Analysis of a peptide inhibitor of paramyxovirus (NDV) fusion using 01482-P-0002 75. Young, J. K., D. Li, M. C. Abramowitz, and T. G. Morrison. 1999. protein heptad repeat regions. J Virol 73:5945-5 6. 76. Young, P. L., K. Halpin, P. W. Selleck, H. Field, J. L. Gravel, M. A. Kelly, and J. S. Mackenzie. 1996. Serologic evidence for the presence in Pteropus bats of a paramyxovirus related to equine morbillivirus. Emerg Infect 77. Yu, M., E. Hansson, J. P. Langedijk, B. T. Eaton, and L. F. Wang. 1998. The attachment protein of Hendra virus has high structural similarity but limited primary sequence homology compared with viruses in the genus Paramyxovirus. Virology 2512227-33. 78. Yu, M., B. Hansson, B. Shiell, W. Michalski, B. T. Eaton, and L. P. Wang. 1998. Sequence analysis of the Hendra virus nucleoprotein gene: comparISOn With other members of the subfamily Paramyxovirinae. J Gen Virol 7921775- 79. Zhao, X., M. Singh, V. N. Malashkevich, and P. S. Kim. 2000. Structural characterization of the human respiratory syncytial virus fusion protein core. Proc Natl Acad Sci U S A 97:14172-7. 80. Zhu, J., C. W. Zhang, Y. Qi, P. Tien, and G. F. Gao. 2002. The fusion protein core of measles virus forms stable coiled-coil trimer. Biochem Biophys Res Cornmun 299z897-902. 81. Bossart, K. N., and C. C. Broder. 2004. Viral glycoprotein-mediated cell 1:10 - - - - - - - - 1:20 -- -- -- -- 01482-P-0002 Dilüsyon 12160 12320 12640 121,280 122,560 125,120 1:10,240 120,480 01482-P-0002 DIZI LISTESI <110 THE HENRY M. JACKSON FOUNDATION FOR THE ADVANCEMENT OF MILITARY MEDICINE, INC. <120 HENDRA VE NIPAH VIRÜSÜ G GLIKOPROTEININ ÇÖZÜNEBILEN FORMLARI <140 PCT/USOS/24022 2005-07-07 <160 15 <170 PatentIn Ver. 3.3 <210 1 <21 l 40 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanniasi: Sentetik oligonükleotid <400 1 <210 2 <21 1 45 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik oligonükleotid <400 2 <210 3 <211 39 01482-P-0002 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik oligonükleotid <400 3 <210 4 <21 l 45 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik oligonükleotid <400 4 <210 5 <21 1 46 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik oligonükleotid <400 5 <210 6 <211 54 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik oligonükleotid <400 6 01482-P-0002 <210 7 <211 31 <212 DNA <21 3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik oligonükleotid <400 7 <2 10 8 <21 1 39 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik oligonükleotid <400 8 <210 9 <21 1 34 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik oligonükleotid <400 9 <210 10 <21 1 21 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik peptit 01482-P-0002 <400 10 r-Iet Mu Tl'ir Asu Thr LeJ Le; Le" Ti'p '-'aî -eii Leu Lêll Ti'p &'51 Hz› 1 3 iiî:- ;E Gls' SN' Ihr GI:: .Mp <210 11 <21 1 15 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik peptit <400 1 1 Ah Ah Giri ?ru Â`il Ar'ç AW; Ah ari.] Arg Ili" Lisa Luu Glv 'hr l 5 Li.' lâ› <210 12 <21 l 15 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik peptit <400 12 Lv› Ciu i'ir' Ahi ala Alu Lv.` Phc Giu Ari:: Gir HI: Vet "0.513 Str' 1 ` 1'i 1: <2 10 13 <21 1 10 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik peptit <400 13 Gîu '31" Lv; Lcu 11-.' Sur G1u Giu Abu LCL 1 2: II: <210 14 <211 15 01482-P-0002 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Dizinin Açiklanmasi: Sentetik peptit <400 14 .:.~'.r' HE'I' .31.5 :mp I`r (i`m Hîn eer (ily LJy Ari; xi-r Thr <210 15 <211 421 <212 PRT <213 Hendra virüsü 01482-P-0002 <400 15 TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.
TR2018/08440T 2004-07-09 2005-07-07 Hendra ve nipah virüsü G glikoproteininin çözünebilen formları. TR201808440T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58684304P 2004-07-09 2004-07-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201808440T4 true TR201808440T4 (tr) 2018-07-23

Family

ID=36793510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/08440T TR201808440T4 (tr) 2004-07-09 2005-07-07 Hendra ve nipah virüsü G glikoproteininin çözünebilen formları.

Country Status (7)

Country Link
US (7) US8865171B2 (tr)
EP (3) EP1789593B1 (tr)
AU (2) AU2005327194B2 (tr)
ES (2) ES2622394T3 (tr)
PT (2) PT1789593T (tr)
TR (1) TR201808440T4 (tr)
WO (1) WO2006085979A2 (tr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005327194B2 (en) * 2004-07-09 2010-09-09 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Soluble forms of Hendra and Nipah virus G glycoprotein
EP2707025B8 (en) * 2011-05-13 2017-08-23 Zoetis Services LLC Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
CA2837582C (en) 2011-05-27 2021-03-02 Merial Limited Genetic vaccines against hendra virus and nipah virus
HK1224177A1 (zh) * 2013-09-05 2017-08-18 硕腾服务有限责任公司 Hendra和nipah病毒g糖蛋白免疫原性組合物
MX2016007870A (es) * 2013-12-16 2016-10-07 Zoetis Services Llc Composiciones inmunogenas de glucoproteina g de los virus hendra y nipah.
CN108624602B (zh) * 2017-03-24 2020-10-16 华中农业大学 一株具有阻断活性的抗尼帕病毒g蛋白的单克隆抗体及其应用
KR20230039766A (ko) 2017-12-20 2023-03-21 조에티스 서비시즈 엘엘씨 Hendra 및 Nipah 바이러스 감염을 대비한 백신
US11890339B2 (en) 2018-08-03 2024-02-06 The United States of Americam as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Nipah virus immunogens and their use
CN116515865B (zh) * 2023-06-19 2025-11-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的尼帕病毒病疫苗
CN118812706B (zh) * 2024-08-21 2025-09-12 武汉大学 靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体及其用途

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5422120A (en) 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1990007936A1 (en) 1989-01-23 1990-07-26 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
CA2489769A1 (en) 1989-03-21 1990-10-04 Philip L. Felgner Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
AU648261B2 (en) 1989-08-18 1994-04-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
ZA911974B (en) 1990-03-21 1994-08-22 Res Dev Foundation Heterovesicular liposomes
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0650370A4 (en) 1992-06-08 1995-11-22 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS TARGETED ON SPECIFIC TISSUES.
CA2137361A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 W. French Anderson Vector particles resistant to inactivation by human serum
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
EP1024198A3 (en) 1992-12-03 2002-05-29 Genzyme Corporation Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae
PT695169E (pt) 1993-04-22 2003-04-30 Skyepharma Inc Lipossomas multivesiculares de ciclodextrina encapsulando compostos farmacologicos e metodos para a sua utilizacao
EP0705344B8 (en) 1993-06-24 2006-05-10 Advec Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
DK0814154T3 (da) 1993-09-15 2009-08-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Rekombinante alfavirusvektorer
AU687117B2 (en) 1993-10-25 1998-02-19 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
AU686277B2 (en) 1993-11-16 1998-02-05 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Vesicles with controlled release of actives
US6436908B1 (en) 1995-05-30 2002-08-20 Duke University Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function
DE69535669T2 (de) 1994-05-09 2008-12-04 Oxford Biomedica (Uk) Ltd. Retrovirale vektoren mit verminderter rekombinationsrate
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
WO1997042338A1 (en) 1996-05-06 1997-11-13 Chiron Corporation Crossless retroviral vectors
US6376471B1 (en) 1997-10-10 2002-04-23 Johns Hopkins University Gene delivery compositions and methods
WO2005028673A1 (en) * 2003-09-22 2005-03-31 Institut Pasteur A method for detecting nipah virus and method for providing immunoprotection against henipaviruses
AU2005327194B2 (en) 2004-07-09 2010-09-09 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Soluble forms of Hendra and Nipah virus G glycoprotein
AU2005333155B2 (en) * 2005-03-14 2011-11-17 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies against Hendra and Nipah viruses
WO2007005244A1 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 The Regents Of The University Of California Henipavirus receptor and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PT2495252T (pt) 2018-06-22
US20090041772A1 (en) 2009-02-12
EP1789593A4 (en) 2009-12-23
AU2005327194A1 (en) 2006-08-17
AU2010241382A1 (en) 2010-12-02
US20170174728A1 (en) 2017-06-22
US9056902B2 (en) 2015-06-16
US10053495B2 (en) 2018-08-21
WO2006085979A2 (en) 2006-08-17
WO2006085979A9 (en) 2009-08-13
US20210230230A1 (en) 2021-07-29
WO2006085979A3 (en) 2009-04-09
PT1789593T (pt) 2017-04-24
ES2673972T3 (es) 2018-06-26
EP2495252A2 (en) 2012-09-05
EP1789593A2 (en) 2007-05-30
AU2010241382B2 (en) 2012-10-11
US20150306208A1 (en) 2015-10-29
EP2495252B1 (en) 2018-04-18
US20130171132A1 (en) 2013-07-04
AU2005327194B2 (en) 2010-09-09
EP3381930B1 (en) 2025-04-16
US9533038B2 (en) 2017-01-03
EP2495252A3 (en) 2013-05-01
US20130171131A1 (en) 2013-07-04
US20190031719A1 (en) 2019-01-31
EP1789593B1 (en) 2017-03-15
ES2622394T3 (es) 2017-07-06
US8865171B2 (en) 2014-10-21
US9045532B2 (en) 2015-06-02
EP3381930A1 (en) 2018-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210230230A1 (en) Soluble Forms of Hendra and Nipah Virus G Glycoprotein
Tamin et al. Functional properties of the fusion and attachment glycoproteins of Nipah virus
Bossart et al. Functional expression and membrane fusion tropism of the envelope glycoproteins of Hendra virus
KR101334047B1 (ko) 백신 효율을 모니터하고 개선시키기 위해 변형된 인플루엔자 바이러스
US20040071709A1 (en) Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes
CN107029227A (zh) 热稳定的呼吸道合胞病毒融合前 f 蛋白寡聚物及其在免疫组合物中的用途
EP2227483B1 (en) Soluble forms of hendra and nipah virus f glycoprotein and uses thereof
US8114410B2 (en) Composition and methods for the inhibition of membrane fusion by paramyxoviruses
Broder Therapeutics and vaccines against Hendra and Nipah viruses
AU2013200151B2 (en) Soluble forms of hendra and nipah virus g glycoprotein
HK1261887A1 (en) Soluble forms of hendra and nipah virus g glycoprotein
HK1172355B (en) Soluble forms of hendra and nipah virus g glycoprotein
HK1172355A (en) Soluble forms of hendra and nipah virus g glycoprotein
AU2013276968A1 (en) Soluble Forms of Hendra and Nipah Virus F Glycoprotein and Uses Thereof