TR201809053T4 - Macrophomina phaseolina'dan elde edilen pektin parçalama enzimleri ve bunların kullanımları. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, Macrophomina phaseolina ("M. phaseolina") fungusundan türetilen, pektini parçalamadan sorumlu olan enzimleri şifreleyen izole edilmiş polinükleotidi açıklar ve bu, SEQ. ID NO.'ları: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 ve 61'de izah edilen nükleotid dizilerini veya bu dizilerin komplemanını içerir ve/veya bunlardan oluşur. Mevcut buluş ayrıca, SEQ ID NO'.ları: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 ve 63'te izah edilen polinükleotid dizileri tarafından şifrelenen izole edilmiş polipeptit; polinükleotidi içeren bir rekombinant gen yapısı; pektin parçalama enziminin arttırılmış üretimi ile veya pektin parçalama enziminin arttırılmış üretimine sahip olan, rekombinant gen yapısını içeren bir transformant ve bir transgenik fungus ile de ilgilidir. Buluşun polipeptidi, diğer şeyler arasında, üretilmiş meyve suları, tekstil ürünleri, kâğıt hamuru ve kâğıt, kahve, çay ve sıvı yağ ekstraksiyonu ve pektik atık su muamelesi, için kullanılabilir.

Description

TARIFNAME MACROPHOMINA PHASEOLINA'DAN ELDE EDILEN PEKTIN PARÇALAMA ENZIMLERI VE BUNLARIN KULLANIMLARI BULUSUN ALANI Mevcut bulus, pektat liyazi aktivitesine sahip olan M. phaseolina'dan izole edilmis polipeptitler ve polipeptitleri sifreleyen izole edilmis polinükleotidler ve bu polinükleotidleri ve polipeptitleri yapmak ve kullanmak için yöntemler ile ilgilidir. Bulus ayrica, polinükleotidleri içeren nükleik asit yapilari, vektörler ve konak hücreler ayni zamanda polipeptitleri üretmek ve kullanmak için yöntemler ile de ilgilidir. Bulusun polipeptitleri, diger seyler arasinda, lifin ve kumaslarin havuzlanmasi ve zamklanmasi için tekstil endüstrisinde; meyve ve sebze suyunun ekstraksiyonu için gida endüstrisinde; iyi kalitede kâgidin üretilmesi için kâgit endüstrisinde ve ayrica kahvenin ve çayin fermentasyonu, sivi yag ekstraksiyonu ve pektik atik su muamelesi için, kullanilabilir.

BULUSUN ALT-YAPISI Pektin, primer bitki-hücresi duvarinin orta lamelinde bulunan kompleks heteropolimerlerin bir grubudur ve inter-selüler dolgu olarak etki eder. Bunlar ayrica, bunlarin kolloidal dogasindan dolayi bitkilerin su-regülasyonunda önemli bir fonksiyona da sahiptir. Hücre duvarlari arasinda konumlandirilan orta lameller agirlikli olarak, protopektinden (pektinin bir çözünemeyen formundan) insa edilir.

Pektin iki farkli belirli bölgeden olusur: "düz" ve "saçakli" bölgeler. "Düz" bölge, metanol ile esterlenmis karboksil gruplarinin bazilari ile bir poligalaktoüronik asit olusturan, 0t-l,4-bagli D-galaktüronik asidin bir omurgasindan olusur (Rouse A.

Pectin: distribution, signiücance. In: Nagy S, Shaw P, Veldhuis Meds. Citrus Science and Technology, Vol 1. Westport CT: AVI publishing Inc. 1977). 01 678-P-0004 tarafindan bölünür.

Pektin/pektat liyazlari, düz bölgede pektini depolimerize eder, bu 4,5-d0ymamis indirgememe ucu olan oligomerler üretmek için ß-eliminasyonu vasitasiyla glikosidik baglari yarar (Lombard V, Bernard T, Rancurel C, Brumer H, Coutinho PM, Henrissat B. A hierarchical classifîcation of polysaccharide lyases for pektinin saçakli bölgeleri içinde yarar (Jensen MH, Otten H, Christensen U, Borchert TV, Christensen LL, Larsen S, Leggio LL. Structural and biochemical studies elucidate the mechanism of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus Pektin esteraz, pektini metanole ve poligalaktüronik aside hidrolize eder. Bu enzim, Aspergi'llus türünü, Botrytis cinerea, Fusari'um monilforme, Rhizopus stoloni'ßar, Trichoderma türünü, vb. içeren birkaç fungus tarafindan üretilebilir (Polizeli ML, Jorge JA, Terenzi HF. Pectinase production by Neurospora crassa: purification and biochemical Characterization of extracellular polygalacturonase esterazinin ticari üretimi için majör kaynaktir (Torres EF, Aguilar C, Esquivel JCC, Gonzales GV. Pectinase. In: Enzyme Technology, Pandey, A., Webb, C., Soccol, C.R., Larroche, C (Eds), Asiatech Publishiers Inc., New Delhi, India, Pektin-parçalama enzimleri, gida endüstrisinde, primer olarak meyve ve bitki isleme, örnegin, meyve suyu üretimi veya sarap yapimi, için, önemli araçlardir.

Uygulamalarin diger alanlari, kâgit hamuru ve kâgit endüstrisini (Reid l, Ricard M. Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps hayvan yemini (Barreto de Menezes TJ, Salva JG, Baldini VL, Papini RS, Sales AM. Protein enrichment of citrus wastes by solid substrate fermentation. Proc. 01 678-P-0004 (Hoondal GS, Tiwari RP, Tiwari R, Dahiya N, Beg QK. Microbial alkaline pectinases and their applications: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol.

Elsevier Sci. Ltd. ppzl33-154), sivi yag ekstraksiyonunu (Scott D. Enzymes, industrial. In: Encyclopedia of Chemical Technology. Grayson M, Ekarth D and temizlenmesini (Singh R, Saxena S, Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A (Kapoor M, Beg QK, Bhushan B, Singh K, Dadich KS, Hoondal GS. Application of alkaline and thermostable polygalacturonase from Bacillus sp. MGcp-2 in degumming of ramie (Boehmeria nivea) and sunn hemp (Crotolaria juncia) bast Chemical technology in the pretreatment processes of textiles. In: Textile science and technology serieslst ed., Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1999; p. 12) ve atik yönetimini (Kashyap DR, Vohra PK, Chopra S, Tewari R. Applications of içerir. WO 98/45393, çamurlu zeminlemeye karsi göze çarpan temizleme gücü olan protopektinaz içeren deterjan bilesimlerini açiklar.

Bu enzimler endüstride münferit olarak veya bir kokteyl (karisim) formunda kullanilir. Örnegin, gida endüstrisinde, bu, münferit enzim, örnegin, peltelesme için gerekli olan pektin esterazi, ayni zamanda farkli enzimlerin kombinasyonu, örnegin, bitki materyalinin sivilastirilmasi için gerekli olan poligalaktüronaz ile pektin esterazi, olarak kullanilir (Heldt-Hansen HP, Kofod LV, Budolfsen G, Nielsen PM, Hüttel S, Bladt T. Application of tailor made pectinases. ln: Visser J and Voragen AJG (eds), Pectin and Peactnases. Progress in Biotechnology. 01 678-P-0004 Aspergi'llus niger'den elde edilen bu enzimlerin bir kaçinin klonlanmasi ve ekspresyonu bildirilmistir. EP 0 278 355, pektin liyazi geninin klonlanmasini, bunun dizisini ve ekspresyonunu tarif eder. EP 0 353 188, bazi diger pektin liyazlarini ekler. EO 0 421 919, iki poligalaktüronazi açiklar ve bir baska endo- poligalaktüronaz EP 0 388 593'te açiklanmistir. Bu patent basvurularinin ikisi, genin kaynagi olarak Aspergi'llus niger'i kullanmistir. WO 94/ 14952, Aspergillus aculeatus'tan elde edilebilen endo-poligalaktüronaz aktivitesi olan üç enzimi tarif eder. Bununla birlikte, M. phaseoli'na'dan elde edilen pektin parçalama enzimlerini sifreleyen genlerin klonlanmasi konusunda bildirilmis yayin yoktur.

Mevcut bulus, diger seyler arasinda, endüstriyel proseslerde veya amaçlarda kullanilabilen, M. phaseolina'dan türetilen pektin parçalama enzimlerinin genlerini ve bunlann sifrelenniis proteinlerini açiklamak amaciyla bir genomik yaklasimi alir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Diger seyler arasinda, mevcut bulus, M phaseoli'na'dan türetilebilen pektin parçalama enzimleri ile ilgilidir. Mevcut açiklama ayrica, pektinin parçalanmasinda M phaseoli'na fungusunun kullanimi ile de ilgilidir.

Mevcut bulusun primer amaci, pektat liyazini sifreleyen nükleotid dizilerinin kümelerini (M. phaseolina fungusunun SEQ ID NO.'1ar1: 1'i ve 2'yi) açiklamaktir.

Bulusun her bir geni için, bir açik okuma çerçevesi (ORF) dizisi, tahmin edilen intron dizilerini silme ve ekzon dizilerinin birbirine uçlarini-birlestirme ile ilgili genomik diziden manüel olarak türetilmistir. Enzim genlerini içeren vektörler, ekspresyon vektörleri ve konak hücreler de dâhil edilir.

Ilaveten, bulus genlerin ORF dizilerinden çikarim yapilan polipeptit dizilerini saglar. Bulusun polipeptit dizileri, pektat liyazininkilere (SEQ ID NO: 3) karsilik gelir. Mevcut bulus ayrica, yukarida tarif edilen nükleotid dizilerinin komplemanini içeren bir izole edilmis polinükleotid ile de ilgilidir. 01 678-P-0004 Mevcut bulusun bir baska amaci, degerli endüstriyel ürünlerin üretimi amaciyla pektin parçalanmasinin regülasyonu, dönüsümü için faydalamlacak/yararlanilacak olan primer amaçta izah edilen genlerin ve enzimlerin moleküler biyolojisini ve Dahasi, mevcut bulusun amaci, pektin parçalama polipeptidinin in vitro üretimini kolaylastirmaktir ve mevcut bulus ayrica, SEQ ID NO: 3'te izah edildigi üzere en az %80 sirali amino asit içeren polipeptidi eksprese edebilen bir ekspresyon yapisi da içerir. Tercihen, ekspresyon yapisi, SEQ ID NO: 2'de izah edildigi üzere sirali nükleotid içeren DNA'yi veya cDNA'yi içeri yerlestirmistir.

Mevcut bulusun bir baska amaci, SEQ ID NO: 2'de izah edilen nükleotid dizisine sahip olan bir polinükleotid sablonu içeren bir rekombinant gen yapisini açiklar, burada polinükleotid sablonu, pektini parçalayan bir enzimi üretmek için bir konak hücre içinde eksprese edilebilir. Tercihen, rekombinant gen yapisi ilaveten, polinükleotid sablonunun ekspresyonunu arttirmak için operatif olarak bagli bir promotör bölgesi içerir.

Mevcut bulusun tercih edilen uygulamalarinin biri, bir enfekte olmus Hint keneviri bitkisinden izole edilen M. phaseoli'na'nin msö susudur. Izole edilmis polipeptit ayrica tercihen bu sustan da türetilir.

Ilaveten, mevcut açiklamanin amaci, diger seyler arasinda, meyve suyunun üretilmesi, tekstil ürünleri, kâgit hamuru ve kâgit, kahve, çay ve sivi yag ekstraksiyonu, için artan küresel talep ile basa çikmak amaciyla M. phaseolina'dan pektin parçalama enzimini izole etmek için bir potansiyel ticari olarak Açiklamanin ilave amaci, hayvan yemlerinin islenmesinde, ineyve suyunda, tekstil ürünlerinde, kâgit hamurunda ve kâgitta, kahvede, çayda ve sivi yag 01 678-P-0004 ekstraksiyonunda, sak liflerinin havuzlanmasinda/zamklanmasinda pektin parçalama maddelerinden yararlanmaya yöneliktir.

Bu yararliliklarin herhangi biri veya tümü, endüstriyel ve diger kullanimlar için arastirma ürünleri olarak veya malzemeler olarak ticarilestirme için bir kit hâlinde gelistirilebilmektedir. Kitler, bulusun bir veya birden fazla M. phaseolina genine karsilik gelen polinükleotidleri ve/veya polipeptitleri, antikorlari ve/veya baska reaktitleri içerebilir.

Bir birinci yönünde, bulus, SEQ ID NO: 1'de veya 2'de izah edilen nükleotid dizisine veya bunlarin herhangi bir kombinasyonuna veya bunlarin komplemanina en az %80 özdes olan bir izole edilmis polinükleotid dizisi saglar, burada söz konusu polinükleotid bir pektat liyazini sifreler.

Bir ikinci yönünde, bulus orta-sertlikteki kosullar altinda SEQ ID NO: 1'de veya 2'de izah edilen bir nükleotid dizisini veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu veya bunlarin komplemanini içeren bir izole edilmis polinükleotid dizisine hibridize olan bir izole edilmis nükleik asit probu saglar, burada söz konusu polinükleotid bir pektat liyazini sifreler ve burada söz konusu orta-sertlikteki kosullar, filtreye-bagli DNA'ya 6x sodyum klorür/sodyum sitrat (SSC) içinde yaklasik 45°C'de hibridizasyonu, akabinde yaklasik 50 ila yaklasik 65°C'de 0,2xSSC/%O,1 SDS içinde bir veya birden fazla yikamayi içerir.

Bir üçüncü yönünde, bulus birinci yönün, bir heterolog proteini veya peptidi sifreleyen bir kodlama dizisi içindeki durdurma kodonu ile kesintiye-ugratilmamis izole edilmis polinükleotid dizisini içeren bir nükleik molekül saglar.

Bir dördüncü yönünde, bu bulus birinci yönün izole edilmis polinükleotid dizisini içeren bir rekombinant vektör saglar. 01 678-P-0004 Bir besinci yönünde, bulus birinci yönün izole edilmis polinükleotid dizisini içeren bir ekspresyon yapisi saglar, burada polinükleotid dizisi bir konak hücre içinde nükleotid dizisinin ekspresyonunu kontrol eden transkripsiyonel veya translasyonel regülatör sinyallerini veya her ikisini içeren bir regülatör nükleotid dizisi ile operatif olarak iliskilendirilir.

Bulusun bir altinci yönü, birinci yönün izole edilmis polinükleotid dizisini içeren bir genetik olarak mühendislik uygulanmis konak hücre saglar.

Bulusun bir yedinci yönü, polipeptit yapmanin asagidaki adimlari içeren bir yöntemini saglar: i. besinci yönün bir ekspresyon yapisi ile transforme edilmis bir hücreyi polipeptidi üretmek için etkili olan kosullar altinda kültürleme ve ii. polipeptidi izole etme.

Bulusun bir sekizinci yönü, SEQ ID NO: 3'te izah edilen bir amino asit dizisine veya bunun herhangi bir kombinasyonuna en aZ %80 özdes olan ve pektat liyazinin katalitik aktivitesini gösteren bir amino asit dizisini içeren bir izole edilmis polipeptit saglar.

Bulusun bir dokuzuncu yönü, bir ikinci polipeptidin bir amino asit dizisine bir kovalent bag vasitasiyla kaynastirilmis sekizinci yönün bir polipeptidini içeren bir kimerik protein saglar.

Bulusun bir onuncu yönü, besinci yönün ekspresyon yapisini içeren bir konak hücre saglar.

Bulusun bir on birinci yönü, besinci yönün ekspresyon yapisini içeren, M. phaseoli'na'nin bir transgenik fungusunu saglar. 01 678-P-0004 Teknikte uzmanligi olan bir kisi, mevcut bulusun, amaçlari yerine getirmek ve bahsedilen sonlari ve avantajlari ayni zamanda bunlarin içinde olanlari elde etmek için iyi uyarlandigini kolaylikla anlayacaktir. Burada tarif edilen uygulamalar bulusun kapsami üzerinde sinirlandirmalar veya kisitlama olarak amaçlanmaz.

Mevcut bulusun bu ve diger özellikleri, yönleri ve avantajlari, asagidaki açiklamaya ve istemlere atfen daha iyi anlasilir hâle gelecektir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Spesifikasyona dâhil edilen ve spesifikasyonun bir parçasini olusturan eslik-eden sekiller, mevcut bulusun uygulamalarini ve baska açiklamalari gösterir ve tarifname ile birlikte, bulusun prensiplerini açiklama görevi görür.

Sekil 1, PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 1'in pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

Sekil 2, PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 4'ün açiklamasinin pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

Sekil 3, PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 7'nin açiklamasinin pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

Sekil 4, PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ 1D NO: lO'un açiklamasinin pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

Sekil 5, PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis 01 678-P-0004 agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ lD NO: l3'ün açiklamasinin pektat liyazinln polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ ID NO: 16'nin açiklamasinin pektat liyazinln polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 19'un açiklamasinin pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 22'nin açiklamasinin pektat liyazinln polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 28'in açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ lD NO: 31'in açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ lD NO: 34'ün açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenldlr.

PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ ID NO: 37'nin açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir. 01 678-P-0004 PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ lD NO: 40'in açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ 1D NO: 43'ün açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 46'n1n açiklamasinin pektinesterazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 49'un açiklamasinin pektinesterazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 55'in açiklamasinin pektinesterazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 58'in açiklamasinin ramnogalaktüronazinln polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 61'in açiklamasinin ramnogalaktüronazinln polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI 01 678-P-0004 Burada saglanan tanimlar ve/veya yöntemler mevcut bulusu tanimlar ve teknikte normal uzmanligi olan kisilere mevcut bulusun pratiginde kilavuzluk eder.

Aksinin ifade edildigi yerler disinda, terimler ilgili teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan geleneksel kullanima göre anlasilacaktir. Tanimlarin ve/veya yöntemlerin herhangi birinin baska bir yerde bulunan herhangi bir referansta saglanan tanimlarin ve/veya yöntemlerin herhangi biri ile tutarsiz oldugunun bulunmasi ölçüsünde, bu basvuruda açik bir sekilde saglanan/uyarlanan söz konusu tanimin ve/veya yöntemin burada kullanilacagi anlasilir. "Bir", "biri" veya göndergeleri içerir. Benzer sekilde, "veya" sözcügünün, baglam açik bir sekilde aksini göstermedikçe "ve" sözcügünü içermesi amaçlanir. Bundan dolayi, "A'yi veya B'yi içeren", A'yi veya B'yi veya A'yi ve B'yi içerdigi anlamina gelir.

Nükleik asitler veya polipeptitler için verilen tüm baz boyutlarinin veya amino asit boyutlarinin ve tüm moleküler agirlik veya moleküler kütle degerlerinin yaklasik oldugu ve açiklama için saglandigi ilaveten anlasilacaktir. Burada tarif edilenlere benzer veya es-deger yöntemlerin ve materyallerin mevcut açiklamanin pratiginde veya testlerinde kullanilabilmesine ragmen, uygun yöntemler ve materyaller asagida tarif edilir.

Mevcut bulus ve ilgili açiklama, pektin parçalanmasina dâhil edilen M. phaseolina genlerinin nükleotid dizilerini saglar. Genler, gidayi, hayvan yemini, kâgidi, sivi yag ekstraksiyonunu, tekstili, atik suyu içeren bir endüstride kullanimda olan veya bir endüstrinin ilgisini çeken pektin parçalama enzimi aktivitesine sahip olan proteinleri sifreler. Bulusun genleri ve açiklamanin diger genleri, bunlarin tanimlanmasi, karakterizasyonu, modifikasyonu ve çesitli endüstriyel proseslerde kullanim yöntemleri burada asagida tarif edilir.

M. phaseoli'na genomik DNA'sinin nükleotid dizileri, bir tüm-genom rastgele saçma DNA dizileme çalisinasi ile elde edilmistir. Genoinik DNA, enfekte olmus Hint keneviri (Core-horus türleri) bitkisinden izole edilmis M. phaseoli'na ms6'nin bir izolatindan hazirlanmistir. Üretilen nükleotid dizileri, Newbler birlestirici ile 01 678-P-0004 contig'ler ve iskeleler olusturmak için birlestirilmistir. Nükleotid dizileri ilk olarak, yazilim programlari, örnegin, Augustus, Glimmer M (The Institute of Genome Research, Rockville, Md.) ve varsayimsal kodlama bölgelerini, intronlari ve uç-birlestirme baglanti-yerlerini tanimlayabilen, Evidence Modeler (EVM), ile notlarla açiklanmistir. Nükleotid dizilerinin ilave otomatiklestirilmis ve manüel iyilestirmesi, kodlama bölgelerinin ve diger gen özelliklerinin kesin karakterizasyonunu aritmak ve olusturmak için gerçeklestirilmistir.

Pektin parçalama enzimlerini sifreleyen bulusun genomik dizileri ve açiklamanin dizileri primer olarak, M. phaseoli'na genomik DNA'sinin nükleotid dizilerini ve diger mikroorganizmalarin bilinen enzim genlerinin nükleotid dizilerini karsilastirma ile tanimlanmistir. Bu M. phaseolina genlerinin nükleotid dizileri, okuma çerçeveleri, ekzonlarin ve intronlarin pozisyonlari, enzimlerin yapisi ve çesitli endüstrilerde bunlarin potansiyel kullanisliligi, örnegin, gidanin ve yemin, içeceklerin, tekstillerin ve deterjanlarin yapimina dâhil edilenler, bilinmemektedir.

M. phaseoli'na'dan 14000'den fazla cDNA parsiyel olarak veya tam olarak dizilenmistir. Bunlar arasinda, pektin parçalanmasinda varsayimsal rolleri olan yeni enzimleri sifreleyen yirmi-bir cDNA kesfedilmistir.

Açik okuma çerçeveleri (ORF'Ier), M. phaseolina mRNA'sindan türetilen cDNA kütüphanelerinin klonlarinin tam veya parsiyel dizilenmesini takiben analiz edilir ve dizi analizi yazilimi kullanilmasi ile ve veri tabanlarinda (halka açik/özel) bilinen dizilere homolojiyi belirleme ile ilaveten analiz edilir.

Bu açiklamanin baglaminda, spesitîkasyon boyunca kullanilan çok sayida terim, farkli bir anlama sahip oldugu açik bir sekilde gösterilmedikçe, gösterilen anlamlara sahiptir.

Burada kullanildigi sekliyle, "gen" terimi, M. phaseoli'na fungusunun genomik dizileri, özellikle bir dizi enzimin polipeptidini sifreleyen polinükleotid dizisi, 01 678-P-0004 olarak tanimlanir. Terim ilaveten, upstream, downstream ve/veya intron nükleotid dizilerini içeren nükleotid asit moleküllerini içerebilir. amino asitleri kodlayan bir dizi nükleotid üçlüsü anlamina gelir ve üçlü dizi, özel bir organizma için uygun kodon kullanim bilgisi kullanilarak proteine aktarilabilir.

Bir "kodlama dizisi" veya "kodlama bölgesi", dizi eksprese edildiginde, bir gen ürününü, örnegin, bir amino asidi veya polipeptidi, üretmek için gerekli olan dizi bilgisine sahip olan bir nükleik asit molekülünü ifade eder. Kodlama dizisi, aktarilmis bölgeler içinde aktarilmamis diziler (örn., intronlar veya 5' veya 3' aktarilmamis bölgeler) içerebilir veya bu tarz araya- giren aktarilmamis dizilerden (örn., cDNA'da oldugu gibi) yoksun olabilir.

Burada kullanildigi sekliyle, bir "polinükleotid", bir nükleotid dizisidir, örnegin, bir nükleik asit fragmanidir. Bir polinükleotid, tek- veya çift-sarmalli olan, opsiyonel olarak sentetik, dogal-olmayan veya degistirilmis nükleotid bazlari içeren, bir RNA veya DNA polimeri olabilir. Bir DNA polimeri formundaki bir polinükleotid, cDNA'nin, genomik DNA'nin, sentetik DNA'nin bir veya birden fazla segmentinden veya bunlarin karisimlarindan olusturulabilir. Mevcut bulusun bir izole edilmis polinükleotidi ayrica, SEQ ID NO: 1'de veya bu tarz dizinin komplemanindan da türetilebilir. Açiklamanin bir izole edilmis polinükleotidi 59 ve 62'den veya bu tarz dizilerin komplemanindan da türetilebilir. bilesim veya madde dogada bulundugunda, bu bunun orijinal ortamindan degistirildiginde veya uzaklastirildiginda veya her ikisi de yapildiginda, bu "izole edilmistir". Örnegin, bir canli bitkide veya hayvanda dogal olarak bulunan bir 01 678-P-0004 polinükleotid veya bir polipeptit "izole edilmemistir", ancak, terimin burada kullanildigi sekliyle, bunun dogal hâlinin birlikte-var olan inateryallerinden ayrilmis ayni polinükleotid veya polipeptit "izole edilmistir".

Bir polipeptidi veya proteini ifade etmek için burada kullanildiginda mikrobiyal veya memeli) ekspresyon sistemlerinden türetildigi anlamina gelir. rekombinant polipeptitleri veya proteinleri ifade eder. Çogu bakteriyel sistemde, örn., Escherichia coli"de, eksprese edilen polipeptitler veya proteinler, glikosilasyon modifikasyonlarindan yoksun olacaktir; funguslarda eksprese edilen polipeptitler veya proteinler glikosile edilecektir. plazmidi, faji, kozmidi, mayayi veya virüsü, bir yapay kopyalama dizisini (ARS) veya bir yapay kromozomu ifade eder. "Vektör" teriminin ayrica, bunun baglanmis oldugu bir baska nükleik asidi tasiyabilen bir nükleik asit molekülünü ifade etmesi de amaçlanir. Vektörün bir tipi, bunun içine ilave DNA segmentlerinin baglanabildigi bir dairesel çift-sarmalli DNA kivrimini ifade eden bir "plazmid'dir". Vektörün bir baska tipi, burada ilave DNA segmentlerinin Viral genom içine baglanabildigi bir Viral vektördür. Belirli vektörler (örn., bir bakteriyel replikasyon orijinine sahip olan bakteriyel vektörler ve epizomal memeli vektörleri) içine bunlarin uygulandigi bir konak hücre içinde otonom replikasyon yapabilir. Diger vektörler, konak hücreye uygulanmasi üzerine bir konak hücrenin genomuna entegre edilebilir ve böylece konak genomu ile birlikte kopyalanir. Dahasi, belirli vektörler, bunlarin operatif olarak bagli oldugu genlerin ekspresyonunu yönlendirebilir. Bu tarz vektörler burada, "rekombinant ekspresyon vektörleri" (veya basitçe, "ekspresyon vektörleri") olarak ifade edilir.

Genel olarak, rekombinant DNA tekniklerinde yararlanilan ekspresyon vektörleri siklikla, plazinidler formundadir. Mevcut spesifikasyonda, "plazmid'I ve "vektör", plazmid en yaygin sekilde kullanilan vektör formu oldugundan, birbiri ile 01 678-P-0004 degistirilebilir bir sekilde kullanilabilir. Bununla birlikte, bulusun, es-deger fonksiyonlar görevi gören, bu tarz baska ekspresyon vektörleri formlarini, örnegin, viral vektörleri (öm., replikasyon kusurlu retrovirüsleri, adenovirüsleri ve adeno-iliskili virüsleri), içermesi amaçlanir. nükleotidlere operatif olarak bagli, bulusun bir polipeptidini sifreleyen bir polinükleotidi içeren bir lineer veya dairesel DNA molekülü olarak tanimlanir. genetik elemanin (elemanlarin), örnegin, promotörlerin veya hizlandiricilarin veya RNA'ya, mRNA'ya aktarilan ve proteine aktarilan ve promotöre veya uygun transkripsiyon baslatma ve sonlandirma dizilerine operatif olarak bagli olan bir kodlama dizisinin, bir birlesimini içerebilir. dizisinin kodlama dizisine göre bir uygun pozisyona konumlandirildigi, böylece kontrol dizisinin bir polipeptidin kodlama dizisinin ekspresyonunu yönlendirdigi, bir konfigürasyonu gösterir.

Burada kullanildigi sekliyle, "konak hücre" terimi, mevcut bulusun bir polinükleotidini içeren bir nükleik asit yapisi veya ekspresyon vektörü ile transformasyona, transfeksiyona, transdüksiyona ve benzerlerine yatkin olan herhangi bir hücre tipini içerir. transkripsiyonel birim içeren ve rekombinant transkripsiyonel birim içinde DNA segmenti veya sentetik gen tarafindan sifrelenen heterolog polipeptitleri veya proteinleri ve RNA'yi eksprese edecek olan kültürlenmis hücreler anlamina gelir.

Hücreler prokaryotik veya ökaryotik olabilir. 01 678-P-0004 Burada kullanildigi sekliyle, "polipeptit", peptit baglari ile birbirine bagli ve 100 amino asitten daha uzun olan bir diziye sahip olan amino asitlerin bir tek lineer zinciridir.

Burada kullanildigi sekliyle, "promotör" terimi, bir downstream genin transkripsiyonunu yönlendirme islevi gösteren bir nükleik asit dizisini ifade eder.

Promotör genel olarak, içinde hedef genin eksprese edilmekte oldugu konak hücreye uygun olacaktir. Diger transkripsiyonel ve translasyonel regülatör nükleik asit dizileri (ayni zamanda "kontrol dizileri" olarak da adlandirilirlar) ile birlikte promotör verilen bir geni eksprese etmek için gereklidir. Genel olarak, transkripsiyonel ve translasyonel regülatör dizileri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, promotör dizilerini, ribozomal baglama yerlerini, transkripsiyonel baslatma ve durdurma dizilerini, translasyonel baslatma ve durdurma dizilerini ve hizlandirici veya aktivatör dizileri, içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, "in-vitro" terimi genel olarak, bir canli organizma disinda bir yapay ortamda gerçeklesen, genel olarak bir organizmanin, gerçeklestirilecek olan daha detayli veya daha uygun bir analize izin vermek amaciyla bunlarin olagan biyolojik baglamindan izole edilmis olan bilesenleri kullanilarak bir laboratuvarda yürütülen, bir biyolojik reaksiyonu ifade eder. degistirilebilir bir sekilde kullanilir ve normalde, bir dizi hizalama programi kullanilarak hizalandiginda, bulusa ait polipeptitlerin herhangi birini sifreleyen nükleik asit dizisi veya bulusa ait polipeptidin amino asit dizisi arasindaki nükleik asit veya amino asit dizisi özdesliginin düzeyini ifade eder. Örnegin, burada kullanildigi sekliyle, %80 homoloji, bir tanimlanmis algoritma tarafindan belirlenen %80 dizi özdesligi ile ayni sey anlamina gelir ve bu dogrultuda verilen bir dizinin bir homologu, verilen dizinin bir uzunlugu boyunca 01 678-P-0004 Dizi özdesliginin emsal düzeyleri, burada tarif edildigi üzere, verilen bir diziye, öm., bulusa ait polipeptitlerin herhangi biri için kodlama dizisine, bunlarla sinirli Iki dizi arasindaki özdesligi belirlemek için kullanilabilen emsal bilgisayar programlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, BLAST programlari takimini, örn., BLASTN, BLASTX ve TBLASTX, BLASTP ve TBLASTN, WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST internet sitesinde halka açiktir, içerir.

Dizi arastirmalari tipik olarak, GenBank DNA Dizilerindeki ve diger halka açik veri tabanlarindaki nükleik asit dizilerine kiyasa verilen bir nükleik asit dizisini degerlendirirken, BLASTN programi kullanilarak yürütülür. BLASTX programi, GenBank DNA Dizilerindeki ve diger halka açik veri tabanlarindaki amino asit dizilerine karsi tüm okuma çerçevelerinde aktarilmis olan nükleik asit dizilerini Iki veya daha dazla dizi arasindaki "özdeslik %'si'ni" belirlemek için seçilmis dizilerin bir tercih edilen hizalamasi, örnegin, CLUSTAL-W programi, kullanilarak yapilir.

Burada kullanildigi sekliyle, "primer" terimi, bir hedef nükleik asit dizisini baglayabilen ve nükleik asit sentezini hazirlayabilen bir oligonükleotiddir. Burada tanimlandigi üzere bir amplitîkasyon oligonükleotidi tercihen, 10 ila 50, en tercihen 15 ila 25 nükleotid uzunlugunda olacaktir. Mevcut bulusun ampliükasyon oligonükleotidleri kimyasal olarak sentezlenebilir.

Nükleotid dizilerini içeren nükleik asitleri ifade etme için spesifikasyon boyunca kullanilan kisaltma, geleneksel bir-harfli kisaltmalardir. Böylelikle, bir nükleik aside dâhil edildiginde, dogal olusumlu sifreleyen nükleotidler asagidaki sekilde kisaltilir: adenin (A), guanin (G), sitozin (C), timin (T) ve urasil (U). Ayrica, aksi belirtilmedikçe, burada sunulan nükleik asit dizileri, 5'-› 3' yönündedir. 01 678-P-0004 Burada kullanildigi sekliyle, "komplementer" terimi ve bunun türevleri, A'nin T veya U ile ve C'nin G ile eslestigi iyi-bilinen kurallar ile nükleik asitlerin eslesmesine atfen kullanilir. Kompleman, "parsiyel" veya "tam" olabilir. Parsiyel komplemana, nükleik asit bazlarinin yalnizca bazlari baz eslesme kurallarina göre eslesirken; tam veya toplam koinplemanda, tüm bazlar eslesme kuralina göre eslesir. Nükleik asit sarmallari arasindaki komplemanin derecesi, teknikte iyi bilindigi üzere nükleik asit sarmallari arasindaki hibridizasyonun etkililigi ve gücü üzerine anlamli etkilere sahip olabilir. Bu, nükleik asitler arasindaki baglamaya dayanan saptama yönteminde özellikle olabilir.

Bulusun DNA dizileri, dizileme reaksiyonlari ile üretilmistir ve yanlis- tanimlanmis nükleotidler, içeri yerlestirmeler ve/veya silinmeler olarak var olabilen minör hatalar içerebilir. Bununla birlikte, mevcut oldugunda, bu tarz ininör hatalar, dizilerin endüstriyel olarak ilgilenilen bir enzimi sifreleyen M. phaseolina'nin bir geni olarak tanimlanmasini bozmamalidir ve bulusun kapsamina spesifik olarak dâhil edilir.

Endüstriyel olarak ilgilenilen M phaseolina'nin enzimlerini Sifreleyen genomik nükleotid dizileri ve kodlama dizileri mevcut bulus tarafindan kapsanir. Bu dogrultuda, bir uygulamada, bir tanimlanmis genin açik okuma çerçevesinin (ORF) bir nükleotid dizisini tanimlayan SEQ 1D NO: 2 saglanir. Bir baska uygulamada, SEQ ID NO: 1 ile tanimlanan genin genomik dizileri saglanir.

Açiklamaya uygun sekilde, her biri bir tanimlanmis genin açik okuma çerçevesinin (ORF) bir nükleotid dizisini tanimlayan SEQ ID NO.`lari: 2, 5, 8, 11, herhangi bir karisimi/kombinasyonu saglanir. Açiklama ayrica, SEQ 1D NO.'lar1: bunlarin herhangi bir karisimi/kombinasyonu ile tanimlanan genlerin genomik dizilerini de saglar. 01 678-P-0004 ve/Veya bunlarin fragmanlarinin en az birini içeren ve/Veya bunlarin en az sifreleyen herhangi bir nükleotid dizisini veya bunun fragmanini; (iii) SEQ ID izah edilen nükleotid dizilerinin komplemanina orta-sertlikteki kosullar, öm., filtreye-bagli DNA'ya bir uygun/etkili 6x sodyum klorür/sodyum sitrat (SSC) miktari içinde bir uygun/etkili sicaklik düzeyinde, 45°C'de (yaklasik olarak) hibridizasyonu, akabinde bir uygun/etkili SDS miktari, örnegin, 0,2xSSC/%0,1 SDS, içinde, bir uygun/etkili sicaklik düzeyinde, örnegin, 50 ila 65°C'de (yaklasik olarak) bir veya birden fazla yikama, altinda veya hayli-sert kosullar, öm., filtreye-bagli nükleik aside bir uygun/etkili SSC miktari, örnegin, 6x SSC, içinde bir uygun/etkili sicaklik düzeyinde, 45°C'de (yaklasik olarak) hibridizasyonu, akabinde bir uygun/etkili SDS miktari, örnegin, 0,1 X SSC/%0,2 SDS, içinde, bir uygun/etkili sicaklik düzeyinde, örnegin, 68°C'de (yaklasik olarak) bir veya birden fazla yikama, altinda veya teknikte uzmanligi olan kisiler için asikâr olan diger hibridizasyon kosullari altinda (bakiniz, örnegin, Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York) hibridize olan herhangi bir nükleotid dizisini ifade eder.

Tercihen, burada açiklanan DNA dizilerinin komplemanlarina hibridize olan polinükleotidler, gen ürünlerini, örn., enzim genlerinin veya bunlarin fragmanlarinin biri tarafindan sifrelenen bir gen ürününe fonksiyonel olarak es- deger olan gen ürünlerini, sifreler.

Yukarida tarif edildigi üzere, açiklamanin gen dizileri, yalnizca SEQ ID NO.'lari: 01 678-P-0004 amino asit dizilerini sifreleyen dejenerat nükleotid dizilerini içermez ayni zamanda M. phaseolina disindaki organizmalarda aktarildiginda, SEQ lD 63'ün amino asit dizilerinin birini içeren bir polipeptidi veya bunun bir fragmanini üretecek olan dejenerat nükleotid dizilerini de içerir. Teknikte uzmanligi olan bir kisi, M. phaseolina'da veya diger organizmalarda gen dizilerini kullanirken, uygun bilecektir. Örnegin, Candida albi'cans'da, CTG kodonu, lösin rezidüsü yerine bir serin rezidüsünü sifreler.

Bulusun nükleotid dizileri, M. phaseoli'na genomunun bir genetik, Iiziksel veya dizi haritasinin gelistirilmesine yardimci olmak için genetik belirteçler ve/veya dizi belirteçleri olarak kullanilabilir. Bulusun nükleotid dizileri ve karsilik gelen gen ürünleri ayrica, M. phaseolina'nin varligini saptamak için de kullanilabilir.

Teknikte iyi bilinen hibridizasyon yöntemleri ve antikor-temelli yöntemler, bulusun nükleotid dizilerinin ve karsilik gelen gen ürünlerinin varligini ve konsantrasyonunu belirlemek için kullanilabilir.

Nükleotid dizileri ayrica, enzimlerin bir enfeksiyon sirasinda bir konagin istilasinda bir rol oynayabilecegi gerçegi göz önünde bulunduruldugunda, terapötik etkilere sahip olabilen enzimlerin inhibitörlerini tanimlamak için de kullanilabilir.

Bir baska uygulamada, yukarida tarif edilen M. phaseolina'nm nükleotid dizilerine ek olarak, M. phaseoli'na'da ve diger fungal türlerde bulunabilen bulusun genlerinin homologlari veya ortologlari da dâhil edilir. F ilamentöz funguslardaki homologlar veya ortologlar özellikle tercih edilir. Bu enzim genleri teknikte iyi bilinen moleküler biyoloji teknikleri ile tanimlanabilir ve izole edilebilir. 01 678-P-0004 Burada kullanildigini sekliyle, "Funguslar" terimi, Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota ve Zygomycota subelerini (Hawksworth DL, Kirk PM, Sutton BC, Pegler DN. Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi (8th Ed). 1995; CAB International, Wallingford, United Kingdom. 616p) ve inayalari içerir.

Ascomycota'nin temsili gruplari, örn., Neurospora, Pem'cilli'um, Aspergi'llus'u, içerir. Basidiomycota'nin temsili gruplari, yemeklik mantarlari, paslari ve isleri (ekin hastaligi), içerir. Chytridiomyeota'nin temsili gruplari, Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces'i içerir. Zygomycota'nin temsili gruplari, örn., Rhizopus ve Mucor'u, içerir.

Filamentöz funguslar, kitinden, selülozdan, glukandan, kitozandan, mannandan ve diger kompleks polisakkaritlerden olusan bir vejetatif miselyum ile karakterize edilir. Vejetatif büyüme, hifal elongasyon ile yapilir ve karbon katabolizmasi zorunlu bir sekilde aerobiktir.

Bu dogrultuda, mevcut bulus ayrica genlerin polinükleotidlerine hibridize olabilen fungal nükleotid dizileri de saglar. Açiklama, asagidakileri içeren ve/Veya asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisine en az %50 özdes olan bir nükleotid dizisini içeren ve/veya böyle bir nükleotid dizisinden olusan bir karisimi/kombinasyonu. 52, 55, 58 ve 61'i ve/veya bunlarin herhangi bir karisimini/kombinasyonunu içeren ve/veya bunlardan olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisinden olusan ve/veya bu tarz nükleotid dizisini içeren bir ikinci nükleik aside orta-sertlikteki 01 678-P-0004 kosullar altinda hibridize olan bir fungal nükleotid dizisi içeren bir izole edilmis nükleik asit de içerir. gruptan seçilen bir amino asit dizisine en az %50 özdes olan bir polipeptidi sifreleyen bir fungal nükleotid dizisi içeren bir izole edilmis nükleik asit de içerir.

Açiklamaya uygun sekilde nükleotid dizileri daha ilaveten, SEQ ID No. 2, 5, 8, nükleotid dizilerine en az %40 özdes olan fungal nükleotid dizileri içerir.

Homolog genleri izole etmek için, yukarida tarif edilen M. phaseoli'na gen dizisi, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, M. phaseolina'yi, içeren, söz konusu organizmadan elde edilen mRNA'dan yapilan bir cDNA kütüphanesini taramak için etiketlenebilir ve kullanilabilir. Bu dogrultuda, SEQ ID No. 2, 5, 8, 11, 14, herhangi birini içeren, tercihen saptanabilir bir sekilde etiketlenmis, nükleik asit problari açiklamaya dâhil edilir. Hibridizasyon kosullari tercihen, CDNA kütüphanesi bundan etiketlenmis dizinin türetildigi organizma tipinden farkli bir organizmadan türetildiginde, bir düsük-sertlikte olabilir. CDNA taramasi ayrica, ayni tür içinde alternatif olarak uçlari-birlestirilmis transkriptlerden türetilen klonlari da tanimlayabilir. Alternatif olarak, etiketlenmis prob, yine, uygun sekilde sertlikteki kosullar kullanilarak, söz konusu organizmadan türetilen bir genomik kütüphaneyi taramak için kullanilabilir. Düsük sertlikteki kosullar teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinecektir ve bundan kütüphanenin ve etiketlenmis dizilerin türetildigi spesifik organizmalara bagli olarak tahmin edilebilir bir sekilde çesitlilik gösterecektir (Details in Sambrook J, Russell DW.

Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third edition, 2001, Cold Spring 01 678-P-0004 Harbor Press, N.Y. ve Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology,1994; Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York).

Ilaveten, bir homolog gen dizisi, söz konusu gen içindeki amino asit dizilerine göre tasarlanan iki dejenerat oligonükleotid primer araci kullanilarak bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçeklestirme ile izole edilebilir. Reaksiyon için sablon, söz konusu organizmadan hazirlanan mRNA'nin ters transkripsiyonu ile elde edilen cDNA olabilir. PCR ürünü alt-klonlanabilir ve çogaltilmis dizilerin bir homolog enzim geni dizisinin dizilerini temsil ettigini garanti etmek için dizilenebilir.

PCR fragmai akabinde, teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinen çesitli yöntemler ile bir tam boy cDNA klonunu izole etmek için kullanilabilir. Altematif olarak, etiketlenmis fragman bir genomik kütüphaneyi taramak için kullanilabilir.

Açiklamaya uygun sekilde, M phaseoli'na gen dizileri, özel olarak arzu edilebilen kimyasal ve/veya fiziksel karakteristikler gösteren modifiye edilmis veya yeni enzimleri gelistinnede kullanilabilir. M phaseoli'na'nin ve diger filamentöz funguslarin enzimleri arasinda amino asit dizilerinin asikâr ilgililiginden/benzerliginden dolayi, bir baska fungusun bir enzimin yapisi, M phaseolina enzimin yapisini tahmin etmek ve yararli ve üstün özellikler için M. phaseoli'na enziminin akla uygun modifikasyonuna yardimci olmak için kullanilabilir. Saglanan diziler ayrica, enzimlerin talep edilen proseslerde daha iyi performans göstermesine olanak saglayan karakteristikleri olan yeni enzimlerin akla uygun modifikasyonu veya tasariini için preparatör materyaller olarak da kullanilabilir.

Gen nükleotid dizileri, rastgele ve yere-yönlendirilmis mutajenez teknikelri veya yönlendirilmis moleküler evrim teknikleri örnegin, bunlarla sinirli kalmamak 01 678-P-0004 kaydiyla, (Arnold FH. Protein engineering for unusual environments. Curr. oligonükleotide-yönlendirilmis mutajenez (Reidhaar-Olson JF, Sauer RT.

Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of Drinkwater NR. recA-dependent and recA-independent N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis at a plasmid-encoded herpes simplex virus thymidine kinase gene in E. coli. Mutat Res. 1987;178:l-10), yere-yönlendirilmis mutajenez (Kunkel TA.

Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. hataya-yatkin PCR (Cadwell RC, Joyce GF. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods Appl. 1992;2:28-33), kaset mutajenezi (Stauss Hj, Davies H, Sadovnikova E, Chain B, Horowitz N, Sinclair C. Induction of cytotoxic T lymphocytes with peptides in vitro: identification of candidate T-cell WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro 820 Numarali ABD Patentleri'nde tarif edildigi üzere yöntemler ile, ile belirlenebilir.

Bir uygulamada, SEQ 1D NO: 2'de gösterilen 747 hp uzunlugundaki polinükleotid, yaklasik 26 kDa'luk bir hesaplanmis moleküler kütle ile, SEQ ID NO: 3'te oldugu üzere, 248 amino asitlik polipeptidi sifreleyen bir açik okuma çerçevesi gösteren pektat liyaz proteinini sifreleyen tam boy cDNA klonudur.

SEQ ID NO: 2'nin SMART analizi yoluyla, bu dizi içinde Pfam pektat liyazi alaninin varligini ortaya çikarir. Pektat liyazi, bunlarin indirgemeyen uçlarinda 4- deoksi-alfa-D-gluk-4-enüronosil gruplari tasiyan oligosakkaritler üretmek için 01 678-P-0004 pektatin eliminasyonlu klevajini katalizleyen bir ekstraselüler enzimdir. Bu enzim, pektinin parçalanmasina dâhil edilir.

Açiklama ayrica, (a) genlerin yukaridaki dizilerinin ve/veya bunlarin komplemanlarinin herhangi birini içeren bir nükleotid dizisini içeren ve/veya bu tarz bir nükleotid dizisinden olusan nükleik asit vektörleri; (b) kodlama dizilerinin ekspresyonunu yönlendiren bir regülatör eleman ile operatif olarak bagli olan genlerin yukaridaki kodlama dizilerinin herhangi birinden olusan ve/veya bunlarin herhangi birini içeren bir nükleotid dizisi içeren ekspresyon yapilari ve (c) konak hücrelerde kodlama dizilerinin ekspresyonunu yönlendiren bir regülatör eleman ile operatif olarak bagli olan kodlama bölgelerini içeren, genin yukaridaki dizilerinin herhangi birini içeren ve/veya bunlarin herhangi birinden olusan rekombinant konak hücreler ile de ilgilidir.

Polinükleotid dizilerini rekombinant DNA yöntemlerinden yararlanarak modifiye etmek için teknikler, teknikte iyi bilinir. Çesitli diziler, bilinen tekniklere, örnegin, restriksiyona, komplementer restriksiyon yerlerini birlestiimeye ve baglamaya, çikintilarda doldurma ile küt uç-yapmaya ve küt-uç ligasyonuna veya benzerlerine, uygun sekilde birlestirilebilir. Poli baglayicilar ve uyarlayicilar, uygun oldugunda, kullanilabilir ve DNA vektörlerinin ve ekspresyon yapilarinin birlesmesinin kolayligina olanak saglamak için bilinen teknikler ile uygulanabilir veya uzaklastirilabilir. Çok sayida vektör, klonlama ve genetik manipülasyon için mevcuttur. Normalde, klonlama, E. 0011' içinde gerçeklestirilebilir.

Bulusun bir baska uygulamasinda, bulusun bir enzim gen dizisini içeren vektörler ilaveten, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, E. coli' hücrelerini, filamentöz fungal hücreleri, inaya hücrelerini ve Bacillus hücrelerini, içeren, bir veya birden fazla konak hücre türünde vektörlerin transferine, idamesine ve propagasyonuna olanak saglayan replikasyon fonksiyonlari içerebilir. Vektör kendi kendine-replikasyonu garanti etmek için herhangi bir araç içerebilir. Alternatif olarak, vektör, konak hücre içine uygulandiginda, genom içine entegre edilen ve içine bunun entegre 01 678-P-0004 edilmis oldugu kromozom (kromozomlar) ile birlikte kopyalanan bir vektör olabilir. Vektör seçimi tipik olarak, vektörün içine vektöiün uygulanacagi konak hücre ile uygunluguna bagli olacaktir.

Bulusun ekspresyon yapisi, bir promotör, bulusun bir gen dizisini sifreleyen bir nükleotid dizisi, bir transkripsiyon sonlandirma dizisi ve seçilebilen belirteç (opsiyonel) içerir ve/veya bunlardan olusur. Bu ekspresyon yapisini bir konak hücre içine uygulamak için teknikte bilinen herhangi bir yöntein kullanilabilir.

Fungal hücreler, kendi basina bilinen bir sekilde, protoplast olusumunu, protoplastlarin transformasyonunu ve hücre duvarinin yenilenmesini içeren bir proses ile transforme edilebilir. Aspergi'llus ve T ri'choderma konak hücrelerinin transformasyonu için uygun prosedürler, EP 238 023'te ve Yelton MM, Hames J E, Timberlake WE. Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. transforme etmek için uygun yöntemler Malardier L, Daboussi MJ, Julien J, Roussel F, Scazzocchio C, Brygoo Y. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum.

DM, Guarentc L. High-effîciency transformation of yeast by electroporation. In: Abelson JN ve Simon MI (eds), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated tarafindan tarif edilen prosedürler kullanilarak transforme edilebilir.

Endüstriyel uygulamalar için, mevcut bulusun enzimleri bir fungal hücre tarafindan üretilir. Tercihen, ekspresyon konak hücresi, büyük ölçekte endüstriyel fermentasyonda kullanilmakta olan bir filamentöz fungal hücredir. Uygun hücre hatlari veya konak sistemleri, eksprese edilen yabanci proteinin dogru modifikasyonunu ve islenmesini temin etmek için seçilebilir. Tercihen, bunlarin 01 678-P-0004 endojen proteinlerinin etkili salgilamasini yapabilen bir ekspresyon konagi seçilir.

Bir konak hücre ayrica, salgilanmis enzim kültür vasati içinde parçalanabileceginden, ekstraselüler proteaz aktivitelerindeki eksiklikler için de seçilebilir.

Mevcut bulus ayrica, mevcut bulusun bir polipeptidini üretmek için, asagidakileri içeren, yöntemler ile de ilgilidir: (i) bunun dogal-tip formunda, polipeptidin üretimi için elverisli olan kosullar altinda polipeptidi üretebilen bir hücreyi yetistirme ve (ii) polipeptidi geri-kazanma. Tercih edilen bir yönünde, hücre, M. phaseolina'dir.

Açiklama ayrica, bir polipeptidi üretmek için, asagidakileri içeren, yöntemler ile de ilgilidir: (i) polipeptidin üretimi için elverisli olan kosullar altinda bir konak polipeptidi sifreler ve (ii) polipeptidi geri-kazanma.

Ekspresyon konak hücreleri veya transformantlar, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak proteinlerin büyümesi ve ekspresyonu için uygun bir besin vasati içinde yetistirilebilir. Örnegin, hücre bir uygun vasat içinde ve polipeptidin eksprese edilmesine ve/veya izole edilmesine izin veren kosullar altinda gerçeklestirilen laboratuvar veya endüstriyel fermentörler içinde sallama flask kültivasyonu ve (sürekli, kesikli, beslemeli-kesikli fermentasyonlari veya kati hâl fermentasyonlarini içeren) küçük-ölçekte veya büyük-ölçekte ferinentasyon ile yetistirilebilir. Kültivasyon, teknikte bilinen prosedürler kullanilarak, karbon ve nitrojen kaynaklari ve inorganik tuzlar içeren bir uygun besin vasati içinde gerçeklesir (bakiniz: More Gene Manipulations in Fungi. Bennett J W, Lasure L., (eds). 1991; Academic Press, San Diego, CA). Polipeptit besin vasatina 01 678-P-0004 salgilandiginda, polipeptit vasattan dogrudan geri-kazanilabilir. Polipeptit vasata salgilanmadiginda, bu hücre lizatlarindan geri-kazanilabilir.

Polipeptitler, polipeptitlere spesifik teknikte bilinen yöntemler kullanilarak saptanabilir. Bu saptama yöntemleri, spesifik antikorlarin kullanimini, bir enzim ürününün olusumunu veya bir enzim substratinin kaybolmasini içerebilir. Bir enzim analizi, polipeptidin aktivitesini belirlemek için kullanilabilir. Üretilen polipeptit teknikte bilinen yöntemler kullanilarak geri-kazanilabilir.

Polipeptit, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, filtrasyonu, sentrifügasyonu, ekstraksiyonu, sprey ile kurutmayi, buharlastirmayi ve presipitasyonu veya bunlarin kombinasyonunu, içeren geleneksel prosedürler ile besin vasatindan çesitli yöntemlerde geri-kazanilabilir.

Mevcut bulusun polipeptitleri ve açiklamanin diger polipeptitleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kromatografi yöntemini (örnegin, iyon degisimi, afinite, hidrofobik, kromato-odaklanma ve boyut dislama), elektroforetik prosedürleri (örnegin, izoelektrik odaklanma), diferansiyel çözünürlügü (örnegin, amonyum sülfat presipitasyonu), SDS-PAGE'i veya büyük ölçüde saf polipeptitler elde etmek için ekstraksiyonu (bakiniz, details in Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications. Janson JC, Rydén L. (eds(). 1989; VCH Publishers Inc., New York), içeren teknikte iyi bilinen çesitli prosedürler ile saflastirilabilir. gen ürünleri (örn., RNA veya proteinler) ile de ilgilidir. Enzim gen ürünleri sifrelenen bu RNA'yi ve proteinleri de içerir. Enzimler, SEQ 1D NO.'lar1: 3, 6, 9, 01 678-P-0004 ve/veya bunlardan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içerir.

Enzimler, pektat liyazini. pektat liyazi C'yi, pektinesterazi ve ramnogalaktüronazi içeren ve/veya bunlardan olusan gruptan seçilen bir enzimin aktivitelerinin en az birini gösterir. Enzim gen ürünleri, örn, sentetik teknikler ile veya teknikte iyi bilinen teknikler kullanilarak rekombinant DNA teknolojisinin yöntemleri ile, kolaylikla üretilebilir (Bakiniz, Creighton TE. Proteins: Structures and Molecular Principles, 1983; W. H. Freeman and Co., N.Y.).

Açiklamanin yöntemleri ve bilesimleri ayrica, fonksiyonel olarak es-deger gen ürünlerini temsil eden proteinleri ve polipeptitleri de içerir. Bu tarz fonksiyonel olarak es-deger gen ürünleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, SEQ ID NO. 3, edilen bir amino asit dizisine sahip olan polipeptitlerin dogal varyantlarini, içerir.

Bu tarz es-deger gen ürünleri, örn., yukarida tarif edilen enzim gen dizileri tarafindan sifrelenen amino asit dizileri içindeki amino asit rezidülerinin silinmelerini, eklenmelerini veya Sübstitüsyonlarini içerebilir, ancak bir sessiz degisim ile sonuçlanir, böylelikle bir fonksiyonel olarak es-deger ürün üretir.

Amino asit sübstitüsyonlari, dâhil edilen rezidülerin polaritesindeki, yükündeki, çözünürlügündeki, hidrofobisitesindeki, hidrofilisitesindeki ve/Veya amfipatik dogasindaki benzerlige göre yapilabilir.

Yukarida tarif edilen gen ürünü kodlama dizilerinin diger modifikasyonlari bir seçilen konak hücre içinde, örn., ekspresyon için, ölçek-büyütme için, Vb., daha uygun olan polipeptitler üretmek için yapilabilir. Örnegin, sistein rezidüler disülfit köprülerini elimine etmek amaciyla silinebilir veya bir baska amino asit ile sübstüte edilebilir. 01 678-P-0004 Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, mevcut bulusun, kati formdaki, enzimlerini içerir. Kati formdaki enzimler veya enzim granülati, örnegin, kati deterjanda ve hayvan yeminde, kullanilabilir. Enzimlerin kati formlarini yapmak için yöntemler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, prillestirme (bir mumlu materyal içinde sprey ile sogutma), ekstrüzyon, aglomerasyon veya granülasyon (bir inert materyal ve baglayicilar ile seyreltme), teknikte iyi bilinir. Bulusun bir enziminin bir kati formunu, karistirilmis toz, tabletler ve benzerleri formunda, içeren kati enzimatik bilesimler tasarlanir.

Mevcut açiklama, ekli istemlerin içerigine ayni zamanda yukaridaki açiklamaninkine dâhil edilir. Bu bulusun bir ayirt-edicilik derecesi ile bunun tercih edilen formunda tarif edilmis olmasina ragmen, tercih edilen formdaki mevcut açiklamanin yalnizca örnek olarak yapilmis oldugu ve yapinin detaylarinda ve parçalarin kombinasyonunda ve dizilimlerinde çok sayida degisime basvurulabilecegi anlasilir.

Asagidaki örnegin, bulusun orada tarif edilen spesifik uygulamalar ile sinirlandirilinasi için herhangi bir niyet olmadan, bulusu ve baska açiklamayi Örnek 1 M. phaseolina'dan Genomik DNA'nin Izolasyonu Genomik DNA, Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA.

Practical Streptomyces Genetics, 2000; John Innes Foundation, Norwich, UK, pp. 162-208, tarafindan tarif edilen prosedürler kullanilarak M. phaseoli'na susu msö'dan izole edilmistir. Özet olarak, miselyumlar inoküle etme kivrimi kullanilarak bir stok Petri plakasindan kazinmistir ve bir konikal flask içinde bir sivi patates-dekstroz vasati içine inoküle edilmistir. Konikal flask, 30°C'de yaklasik 72 saat boyunca sallama olmadan inkübe edilmistir. Miselyumlar hava- 01 678-P-0004 vasat ara-yüzünde yüzey üzerinde büyümüstür. Miselyumlar, bir steril kürdan kullanilarak hasat edilmistir ve steril kâgit havlular arasina yerlestirilmistir ve bir kaçi fizyolojik çözelti (Sodyum fosfat tamponu, pH 7,0) ile yikanmistir.

Miselyumlar, fazla siviyi uzaklastirmak için sikilmistir ve hasat edilmis miselyumlar 30 dakika boyunca hava ile kurumaya birakilmistir. Yari-kuru miselyumlar, sivi nitrojen içine yerlestirilmistir ve ince toz üretmek ve son olarak Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces tarif edilen protokol izlenerek DNA'yi izole etmek için ögütülmüstür.

Ornek 2 Primerlerin tasarlanmasi ve sentezi Çalismada kullanilan primerler, manüel olarak düzenlenmis transkriptomdan ve M. phaseoli'na 1ns6'sin1n genomik dizisinden tahmin edilen "gen modelleri'nden", dizileri tam ORF'ler ile manüel olarak seçme veya burada benzer genlerin diger bitkilerden basarili bir sekilde izole edilmis oldugu veri tabanlarinin kullanilmasi ile, tasarlanmistir. Transkriptomdan elde edilen nükleotid dizilerinin karsilastirmali biyoenformatik analizi, ilgili genlerin homologlarmi tanimlamak için ve genin uygun tanimlanmasi için NCBl BLAST, BLASTP, RPS-BLAST, BLASTX ve PSI-BLAST kullanilarak yürütülmüstür. Nükleotid dizisi hizalamalari, çok sayida dizi "gen havuzu'ndan" bulundugunda, clustalW versiyon 1.82 kullanilarak gerçeklestirilmistir. Gen spesifik primerler (hem ileri hem de geri), manüel olarak veya Primer 3 plus araci yoluyla seçilmistir ve primerler istege özel sentezlenmistir.

Bu çalismada kullanilan tüm oligonükleotidler, saglayici tarafindan sentezlenmistir ve HPLC ile saIlastirilmistir ve Integrated DNA Technologies (IDT) firmasindan temin edilmistir. 100 pmol'lük stok çözeltisi, otoklavlanmis ddHZO içinde hazirlanmistir ve kullanim için alikotlar hâlinde, -20°C`de saklanmistir. 01 678-P-0004 PCR için primerler olarak kullanilan Oligonükleotidlerin Dizileri 1iyazi liyazi liyazi liyazi 1iyazi 1 iyazi liyazi liyazi SEQ Primer Dizisi Çogaltilmis Ileri TCATCACCGACCCACAATCGC (SEQ ID NO: 64) Revers CTTAGCAAGCGGGAGCCGTC (SEQ ID NO: 65) Ileri CAGACAACGGCGTCGACAGT (SEQ Revers ACGGACCACATCCAACGCGA (SEQ ID NO: 67) Ileri ATGCCCTGGTACCCTGCCCC (SEQ Revers GAAAGGTCCCGGGCTCACGC (SEQ ID NO: 69) Ileri CCGCTCCTCTGTGCGTTGTTGAA (SEQ ID NO: 70) ACAGCGATAGAGCCGCAACACG (SEQ (SEQ ID NO: 72) Revers CGAAAGCCAGCCCAAGCGAC (SEQ ID NO: 73) Ileri GGCAAGCATCCTCTCTCCGGC (SEQ ID NO: 74) Revers CCTGAGGCCCATCGTCCGAGT (SEQ ID NO: 75) Ileri TCCCTGCCTCTCCATCCTACCCT (SEQ ID NO: 76) Revers CCAACCGTGTGGCCGTCGAA (SEQ ID NO: 77) Ileri ACATGCAGTTCAAGTACGCCGCT (SEQ ID NO: 78) Revers GCAGGGGCCCACACCTCTTG (SEQ ID NO: 79) 01 678-P-0004 Gen ID Primer Dizisi Çfignaltilmis adi urun (bp) Ileri TCCAAGGCAGAGCCTCCGAAACA (SEQ lD NO: 81) Ileri ACAGACCCCATCACATCCGCCA (SEQ ID NO: 82) liyazi C Revers 1790 (SEQ 1D NO: 83) Ileri CTGTCCTCCAGCAGCAGCCTC Pektat (SEQ ID NO: 84) 1133 liyazi C Revers CGAGCAACCCGTCGAGGTCAA (SEQ ID NO: 85) Q . . . . Çogaltilmis Gen Adi ID Primer Dizisi ürün (bp) Ileri CATGAAGGCCACCACCCTCGC (SEQ ID liyazi C Revers CCGAACCCTGGCTCGGGCAT (SEQ ID Pektat 37 Ileri ACCCCCACGCCGAACAATACC (SEQ ID 1534 liyazi C NO: 88) Revers CCGCCAAGTCTATCCGCTCGC (SEQ ID Ileri GGCTTCGGTGGACCGTCCTAT (SEQ ID liyazi C Revers CCACCCGCTCCGCCCTTAAA (SEQ ID Ileri AGGAGATGGGCTGCCGTCCT (SEQ ID Pektat 43 NO: 92) 1051 liyazi C Revers GCTCAGCAAGCGTCCAACCCA (SEQ Pektinest Ileri TCCCGTGCCATGGTAGCCTTT (SEQ ID 46 1352 eraz NO: 94) 01 678-P-0004 Pektinest Pektinest Pektinesteraz Ramnogalaktü Ramnogalaktü Q Priiner Dizisi Çogaltilmis Revers GCTGGCCACCACAATCCACA (SEQ ID Ileri TGGCCTCTTGATCAGGCTCGT (SEQ 1D Revers GCGGTGACCCATCCCTGCTT (SEQ ID Ileri TCGTCCACCGGTACCACGTT (SEQ ID (SEQ ID NO: 99) Primer Dizisi CCTCG (SEQ [D NO: TTGCAT (SEQ ID NO: GGACTT (SEQ ID NO: CAACACG (SEQ ID NO: AGAAC (SEQ ID NO: Çogaltil 01 678-P-0004 Q . . . . Çogaltilmis Gen Adi ID Primer Dizisi ürün (bp) CTCGCT (SEQ ID NO: Örnek 3 M. phaseoli'na ms6'dan elde edilen pektat liyazinin, Pektat liyazi C'nin, pektinesterazin ve ramnogalaktüronazin amplifikasyonu, klonlanmasi ve dizilenmesi Toplam RNA, önceden Chomczynski P ve Sacchi N, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction (Anal büyütülmüs üç günlük miselyumdan izole edilmistir. RNA'nin kalitesi veya bütünlügü standart prosedürler uyarinca agaroz jel elektroforezi ile kontrol edilmistir ve Therrno Scientific Nano Drop 2000 kullanilarak kantifiye edilmistir. cDNA birinci sarmali, üreticinin talimatlari izlenerek SuperScript III Revers transcriptase (Invitrogen) kullanilarak sentezlenmistir. Gen, gen spesifik primerler kullanilarak PCR ile cDNA'dan çogaltilmistir. PCR reaksiyonu (50 uL), 1 uL CDNA, her bir primerden 20 pmol, 5 uL 10X PCR Taponu, 5 uL 2,5 mM dNTP karisimi ve 1,0 ünite PfuTaq DNA polimerazi, içennistir. PCR asagidaki kosullar kullanilarak Thermal Cycler (Applied Biosystems) içinde gerçeklestirilmistir: 95°C'de 5 dakika ("dk") boyunca ilk denatürasyon akabinde 95°C'de 30 saniye ("s") boyunca denatürasyonun, 59-61°C'de 30 s boyunca tavlamanin ve 72°C'de hedeflenen genin uzunlugunda bagli olarak 1 ila 2,0 dk boyunca uzamanin 35 siklusu, son olarak 72°C'de 7 dk boyunca bir nihai uzama. PCR ürünü, 1X TAE tamponu kullanilarak %1 agaroz jel ile analiz edilmistir ve amplikon üreticinin talimatlari izlenerek QIAGEN gel extraction kit kullanilarak jelden ayristirilmistir. Saflastirilmis PCR ürünü, pCR®8/GW/TOPO® TA Cloning kit'e (Invitrogen) baglanmistir ve kompetan E. coli hücrelerine (Invitrogen) transforme edilmistir. Plazmidler, üreticinin talimatlari izlenerek QlAprip Spin Miniprep Kit 01 678-P-0004 (QIAGEN) kullanilarak varsayimsal kolonilerden izole edilmistir. Içeri yerlestirmenin varligi, gen spesifik primerler kullanilarak kontrol edilmistir ve pozitif plazmidler Dizileme'ye tabi tutulmustur. Örnek 4 Dizinin Analizi Nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla, BLASTN ve BLASTP programlari ile analiz edilmistir. Diger bitkilerden bildirilen diziler ClustalW ile hizalanmistir.

Filogenetik analiz, Komsu Birlestirme (NJ) kullanilarak yürütülmüstür.

Claims (15)

1. ISTEMLER Bir izole edilmis polinükleotid dizisidir, SEQ ID NO: l'de veya 2'de izah edilen nükleotid dizisine veya bunun komplemanina en az %80 özdes olan bir nükleotid dizisi içerir, burada söz konusu polinükleotid bir pektat liyazini sifreler.
2. Orta-sertlikteki kosullar altinda SEQ ID NO: 1'de veya 2'de izah edilen bir nükleotid dizisini veya bunun komplemanini içeren bir izole edilmis polinükleotid dizisine hibridize olan bir izole edilmis nükleik asit probudur, burada söz konusu polinükleotid bir pektat liyazini sifreler ve burada söz konusu orta-sertlikteki kosullar, filtreye-bagli DNA'ya 6x sodyum klorür/sodyum sitrat (SSC) içinde yaklasik 45°C'de hibridizasyonu, akabinde yaklasik 50 ila yaklasik 65°C'de 0,2xSSC/%0,l SDS içinde bir veya birden fazla yikamayi içerir.
3. Istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi veya istem 2'ye göre izole edilmis nükleik asit probudur, bu genomik DNA'dir.
4. Istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi veya istem 2'ye göre izole edilmis nükleik asit probudur, bu cDNA'dir.
5. Istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi veya istem 2'ye göre izole edilmis nükleik asit probudur, bu RNA'dir.
6. Istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi veya istem 2'ye göre izole edilmis nükleik asit probudur, bu tek-sarmallidir.
7. Bir nükleik asit molekülüdür, bir heterolog proteini veya peptidi sifreleyen bir kodlama dizisi içindeki durdurma kodonu ile kesintiye-ugratilmamis, istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi içerir.
8. 8. Bir rekombinant vektördür, istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi içerir.
9. 9. Bir ekspresyon yapisidir, istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi içerir, burada polinükleotid dizisi, bir konak hücre içinde nükleotid dizisinin ekspresyonunu kontrol eden transkripsiyonel veya translasyonel regülatör sinyallerini veya her ikisini içeren bir regülatör nükleotid dizisi ile operatif olarak iliskilendirilir.
10. 10. Bir genetik olarak mühendislik uygulanmis konak hücredir, istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi içerir.
11. 11. Bir polipeptit yapmanin bir yöntemidir, asagidaki adimlari içerir: i. istem 9'a göre bir ekspresyon yapisi ile transforme edilmis bir hücrenin polipeptidi üretmek için etkili olan kosullar altinda kültürlenmesi ve ii. polipeptidin izole edilmesi.
12. 12. Bir izole edilmis polipeptittir, SEQ ID NO: 3'te izah edilen bir amino asit dizisine en az %80 özdes olan ve pektat liyazinin katalitik aktivitesini gösteren bir amino asit dizisi içerir.
13. 13. Bir kimerik proteindir, bir ikinci polipeptidin bir amino asit dizisine bir kovalent bag vasitasiyla kaynastirilmis istem 12'ye göre bir polipeptit
14. 14. Bir konak hücredir, istem 9'a göre ekspresyon yapisi içerir.
15. 15.M. phaseolina'nin bir transgenik fungusudur, istem 9'a göre ekspresyon yapisi içerir.