Tarifnamenin konusu ayrica, Pro-Enkefalindeki amino asit 133-140 (LKELLETG, DIZI baglanan iki baglayici içeren bir numunedeki Pro-Enkefalin ve Pro-Enkefalin fragmanlarini belirlemek için bir analizdir, burada bahsedilen bölgelerin her biri en az 4 veya 5 amino asit içerir. Bir numunedeki Pro-Enkefalin veya Pro-Enkefalin fragmanlarinin belirlenmesine yönelik analizlerin bir yönünde, bahsedilen analizin analiz duyarliligi saglikli bireylerdeki Pro-Enkefalin veya Pro-Enkefalin fragmanlarmin miktarini belirleyebilir ve < 15 pmol/l, tercihen < 10 pmol/l ve daha tercihen L < 6 pmol/L'dir. Bir numunede Pro-Enkefalin veya bunun fragmanlarinin seviyesini belirlenmesine yönelik analizlerin bir yönünde, bahsedilen baglayici baglanma partnerine en az 107 M4, tercihen 108 M`1 baglanma afinitesi sergiler, tercih edilen afinite sabiti 109 M'l'den düsük, en çok tercihen 1010 M'l'den düsüktür. Teknikte uzman kisilerce bilindigi gibi [K1 ], düsük afinitenin bilesiklerin daha yüksek bir dozunun uygulanmasiyla telafi edilmesi düsünülebilir ve bu durun bulusun kapsami disinda degildir, baglanma afinitesi yukarida açiklandigi gibi belirlenebilir. Mevcut tarifnameye göre bir numunede Pro-Enkefalin veya Pro-Enkefalin fragmanlarinin belirlenmesine yönelik analizlerin bir yönünde, bu tip bir analiz bir sandviç analizi, tercihen bir tam otomatik analizdir. Bir tam otomatik veya manüel ELlSA olabilir. Bir POC-testi (hizmet noktasi) olabilir. Otomatik veya tam otomatik analiz örneklerine asagidaki sistemlerin biri için kullanilabilen analizler dahildir: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptort®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®. Test formatlarinin örnekleri yukarida verilmektedir. Bir numunede Pro-Enkefalin veya Pro-Enkefalin fragmanlarinin belirlenmesine yönelik analizlerin bir yönünde, bahsedilen iki baglayicinin en az biri tespit edilmek üzere isaretlenir. Isaret örnekleri yukarida verilmektedir. Bir numunede Pro-Enkefalin veya Pro-Enkefalin fragmanlarinin belirlenmesine yönelik analizlerin bir yönünde, bahsedilen iki baglayicinin en az biri bir kati faza baglanir. Kati fazlarin örnekleri yukarida verilmektedir. Bir numunede Pro-Enkefalin veya Pro-Enkefalin fragmanlarinin belirlenmesine yönelik analizlerin bir yönünde, bahsedilen isaret kemilüininesan isaret, enzim isareti, Iloresan isaret, radyoiyodin isaretinden olusan gruptan seçilir. Mevcut tarifnamenin bir baska konusu mevcut bulusa göre olan bir analizi içeren bir kittir, burada bahsedilen analizin bilesenleri bir veya daha fazla kap içinde yer alabilir. Bulus ayrica Pro-Enkefalindeki amino asit ve amino asit olan iki farkli bölgeye baglanan iki baglayici içeren bir numunedeki Pro-Enkefalin ve Pro-Enkefalin fragmanlarini belirlemek için bir kit saglamaktadir, burada bahsedilen bölgelerin her biri en az 4 veya amino asit içerir. 20 Örnekler Antikorlarin Olusturulmasi Peptidler Peptidler sentezlenmistir (J PT Technologies, Berlin, Almanya). Asilama icin peptidler / koniiigw Peptidlerin büyükbas hayvan serum albüminine (BSA) konjügasyonu için bir ek N-ucu sistein kalintisi ile asilama için peptidler sentezlenmistir (JPT Technologies, Berlin, Almanya). Peptidler Sulfo-SMCC (Perbio-science, Bonn, Almanya) kullanilarak kovalent olarak BSA'ya baglanmistir. Baglama prosedürü Perbio elkitabina göre gerçeklestirilmistir. Asilama için peptid Pro-Enkefalin dizisi Antikorlar asagidaki usule göre olusturulmustur: Bir BALB/c faresi gün 0 ve 14'te 100 ug (100 ul tam Freund ek maddesi içinde emülsiyonlastirilmis) ve gün 21 ve 28'de 50 ug (100 ul tam olmayan Freund ek maddesi içinde) peptid-BSA-konjügesi ile asilanmistir. Birlestirme deneyinden üç gün önce, hayvana bir intraperitoneal ve bir intravenöz enjeksiyon olarak 100 ul salin içinde çözülmüs 50 ug konjüge uygulanmistir. Asilaninis fareden splenositler ve miyelom hücresi hatti SP2/0 hücreleri 30 s 37°C'de 1 ml %50 polietilen glikol ile birlestirilmistir. Yikandiktan sonra, hücreler 96 gözenekli hücre kültürü plakalarina ekilmistir. Hibrit klonlar HAT ortami [%20 cenin buzagi serumu ve HAT-takviyesi ile takviye edilmis RPMI 1640 kültür ortami] içinde büyütülerek seçilmistir. Iki hafta sonra HAT ortami üç geçis boyunca HT ortamiyla degistirilmis ve ardindan normal hücre kültürü ortamina geri dönülmüstür. Hücre kültürü üstte kalan fazlari ilk olarak birlesmeden üç hafta sonra antijene özel IgG antikorlari için taranmistir. Pozitif test edilen mikro-kültürler çogaltma için 24 gözenekli plakalara aktarilmistir. Tekrar test edildikten sonra, seçilen kültüler klonlanmis ve sinirlayici seyreltme teknigi kullanilarak tekrar klonlanmis ve izotipler belirlenmistir. (Lane, R.D. "A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. lmmunol. Meth. 81: 223- is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horin. Metab. Res. 28: 11-15,(l996)). Monoklonal antikor üretimi: Antikorlar standart antikor üretme usulleri ile üretilmis (Marx vd., Monoclonal Antibody Production ( ve Protein A-kromatografisi ile saflastirilniistir. Antikor safliklari SDS jel elektroforez analizine göre %95 olmustur. Antikorlarin isaretlenmesi ve kaplanmasi. Tüm antikorlar asagidaki prosedüre göre akridinyum esterle isaretlenmistir: isaretlenmis bilesik (izleyici): ul Akridinyum NHS-ester (asetonitril içinde 1 mg/ml, InVent GmbH, Almanya) (EP 0353971) ile karistirilmis ve 20 dakika oda sicakliginda enkübe edilmistir. Isaretlenmis antikor Bio-Sil SEC üzerinde jel-filtreleme HPLC ile satlastirilmistir. Saflastirilan isaretlenmis antikor (300 mmol/l potasyumfosfat, seyreltilmistir. Nihai konsantrasyon isaretlenmis bilesik olmustur (yaklasik 20 ng isaretlenmis antikor). Akridinyumester kemilüminesani bir AutoLumat LE kullanilarak ölçülmüstür. Kati faz antikor (kaplanmis antikor): Kati faz: Polistiren tüpler (Greiner Bio-One International AG, Avusturya) antikor (1.5 ug sicakliginda 18 saat). %5 büyükbas hayvan serum albümini ile bloke edildikten sonra, tüpler PBS, pH 7.4 ile yikanmis ve vakumla kurutulmustur. Antikor özgünlügü: Farkli antikorlarin çapraz reaktiviteleri tablo 2'de listelenmektedir. Asilama için peptid (C)EEDDSLANSSDLLK (C)LKELLETG (C)TGDNRERSHHQDGSDNE (C)SDNEEEVS Pre-Pro-Enkefalin-dizisi 119-125 121-134 133-140 139-155 152-159 Antikor çapraz reaktiviteleri asagidaki gibi belirlenmistir: Antikor adi NT-MRPENK NM-MRPENK MR-MRPENK MC-MRPENK CT-MRPENK 300 iil PBS, pH 7,4, içindeki 1 ug peptid pipetle polistiren tüplere aktarilmis ve 1 saat oda sicakliginda enkübe edilmistir. Enkübasyondan sonra tüpler PBS, pH 7,4, içinde %5 BSA kullanilarak 5 kez (her biri 1 ml) yikanmistir. Isaretlenmis antikorlarin her biri eklenmis (PBS, pH ve 2 saat oda sicakliginda enkübe edilmistir. 5 kez yikandiktan sonra (her biri 1 m1 yikama çözeltisi (20 mmol/l PBS, pH 7.4, %0.] Triton X 100)), kalan lüininesan (isaretlenmis antikor) AutoLumat LE 953 kullanilarak ölçülmüstür. Referans madde olarak MRPENK-peptidi kullanilmistir (%100). peplid : NO-Ö) MRPENK MRPENK ; MRPE'NK I MRPENK MRPENK Tüm antikorlar, asilama için kullanilan peptidlere benzer sekilde, MRPENK peptidine baglanmistir. NT-MRPENK-antikoru hariç (EEDDSLANSSDLLK ile %10 çapraz tepkime), hiçbir antikor, antikor asilamasi için kullanilmayan MR-PENK peptidleriyle çapraz tepkime sergilememistir. Pro-Enkefalin Immünoanalizi: 50 ul numune (veya kalibratör) pipetle kaplanmis tüplere aktarilmis, isaretlenmis antikor (200 ul) eklendikten sonra, tüpler 2 saat 18-25 °C'de enkübe edilmistir. Baglanmamis izleyici 5 kez (her biri 1 ml) yikama çözeltisi (20 mmol/l PBS, pH 7.4, %0.1 Triton X- 100) ile yikanarak uzaklastirilmistir. Tüpe-baglanmis isaretlenmis antikor Luminumeter LE 953 ve 1000 pmol/l'lik sabit bir MRPENK konsantrasyonu kullanilarak ölçülmüstür. Farkli antikor kombinasyonlarinin sinyal (/gürültü (MRPENK olmadan RLU) orani tablo 4'te verilmektedir. Tüm antikorlar herhangi bir baska antikorla bir sandviç kompleksi olusturabilmistir. Sürpriz bir sekilde, en yüksek sinyal/gürültü orani (en iyi duyarlilik) MR-MRPENK- ve CT-MRPENK antikoru birlestirilerek elde edilmistir. Ardindan, bu antikor kombinasyonu ek incelemeler için MRPENK-immünoanalizi gerçeklestirmek için kullanilmistir. MR-MRPENK antikoru kaplanmis tüp antikoru olarak ve CT-MRPENK antikoru isaretlenmis antikor olarak kullanilmistir. Kati faz NT- NM- MR- MC- CT- antikoru MRPENK MRPENK MRPENK MRPENK MRPENK Isaretlenmis antikor MRPENK MRPENK MRPENK MRPENK MRPENK Kalibrasyon: pH 8.0, içinde seyreltilmis sentetik MRPENK seyreltileri kullanilarak kalibre edilmistir. Pro-Enkefalin kontrol plazmasi ICI-Diagnostics, Berlin, Almanya'dan temin edilebilir. Sekil 1, bir tipik Pro-Enkefalin doz/sinyal egrisini göstermektedir. Standart egri Pro- Enkefalin. Analiz duyarliligi 20 tespit 0-kalibratör (MRPENK eklenmeden) + 2SD) 5,5 pmol/L olmustur. Popülasyon çalismasi Usuller 1991-1994'te Malmö Diyet ve Kanser Çalismasi baslangiç muayenesi esasli popülasyonun 2559 kadin katilimcisinin açlik plazmasinda Pro-Enkefalin ölçülmüstür (yas 58 ± 6 ve %59 kadin). Baslangiç PENK'yi (log-dönüstürülmüs PENK'nin her bir standart sapma artisi basina tehlike orani) 12 yildan uzun bir orta takip süresi sirasinda çalisma son noktalarinin her birinin birinci olayi zamaniyla iliskilendirrnek için Çok- degiskenli ayarlanmis (tüm geleneksel kardiyovasküler risk faktörleri, diyabet risk faktörleri ve kanser analizinde ayrica kanser kalitimi) Cox orantili tehlike modelleri kullanilmistir. Son noktalar Isveç Ulusal Hastane Taburcu Kaydi, Isveç Miyokard Enfarktüsü Kaydi, Malmö Inme Kaydi ve Isveç Kanser Kaydi araciligiyla elde edilmistir. Bu kayitlar araciligiyla son noktalarin elde edilmesi onaylanmis ve dogru olduklari bulunmustur (bkz., ayrica Belting Vd. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 1-10. . Calismadaki kadinlarin klinik özellikleri Tanimlayici Istatistikler N Ortalama Std. Sapma Tanimlayici Istatistikler N Ortalama Std. Sapma Sekil 2: kadin popülasyonunda Pro Enkefalin frekans dagilimi: Ortalama deger 47,2 pmol/L, standart sapma: 1.2 pmol/L. X ekseni PENK konsantrasyonunun dogal logaritmasidir (Logarithmus Naturalis (LN)). Tüm sonuçlar analiz ölçümü içinde olmus, en düsük PENK konsantrasyonu 9 pmol/L olmustur. Bu sonuçlar kullanilan analizin uygun oldugunu gösterir (analiz duyarliligi 5.5 pmol/L). PEN K ve meme kanseri tahmini Pro-Enkefalin ve meme kanseri arasindaki iliski degerlendirilmistir (Tablo 6). Kadinlarda Pro-Enkefalin ve meme kanseri arasinda kuvvetli bir iliski olmustur. Tam olarak ayarlanmis bir modelde, Pro-Enkefalinde her bir SS artisi %28,6'11k bir risk azalmasiyla iliskilendirilmis veya Pro-Enkefalinde her bir SS azalisi (revPENK) ilerideki meme kanserinde %40'11k bir risk artisi ile iliskilendirilmistir (tablo 5) ve Pro-Enkefalinin üst ve alt çeyrekleri meme kanseri riskinde 3-kattan yüksek bir fark göstermistir (bkz., tablo 7 ve sekil 3). Denklemdeki Degiskenler° B SE Wald df Sig, Exp(B) CINSIYET halihazirda_sigara_içen ,330 HER_CANCER_0 ,034 1,139 2,886 2,127 MEME KANSERI 1 SS P- basina HR degeri 4 (2140/ 135) 1.6) 1,007 1,027 1,045 1,392 1,035 Çeyrek Çeyrek3 Çeyrek2 Çeyrek] Egilim Meme kanseri oranina karsi baslangiç Pro-Enkefalin için Çok-degiskenli Cox orantili Tehlike modelleri. Sekil 3: Kadinlarda toplam meme kanseri teshisini gösteren Kaplan Meier grafikleri, pmol/l), çeyrek 4 (54.1 pmol/l'nin üstü). Düsük PENK bir uzun dönemli meme kanseri olusmasi riskini göstermektedir. Baslangiç gününde (kan numunesi alimi) kanser geçmisi olan tüm kadinlar dahil edilmediginden, Pro-Enkefalin ileride meme kanseri gelismesi için yüksek oranda gösterge teskil eder. Genel olarak, Q 1'deki kadinlar Q 4'teki kadinlara göre 3.6 kat daha artmis meme kanserine yakalanma riski tasimaktadir. Pro Enkefalin ve Pro Nörotensin Kombinasyonu Son dönemde artan Pro-Nörotensinin meme kanseri için yüksek oranda gösterge teskil ettigi gösterilmis oldugundan, meme kanseri tahmini için her iki biyo-isaret birlestirilmistir. Örnekler Pro-Nörotensin analizi Antikorlar yukarida açiklandigi gibi olusturulmustur. Isaretleme antikoru (LA) P-NT 1- 19'a (H-CSDSEEEMKALEADFLTNMH (DIZI ID NO: 24)) karsi olusturulmus ve kati faz antikoru (SPA) P-NT 44-62 peptidine (CNLNSPAEETGEVHEEELVA (DIZI ID NO: 25)) karsi olusturulmustur. Insan Pro-Nörotensin miktarinin tayini için immünoanaliz Akridinyum ester isaretlemesine dayanan bir sandviç kaplanmis tüp lüminesan iininünoanaliz teknolojisi kullanilmistir. isaretlenmis bilesik (izleyici): 10 nl Akridinyum NHS-ester (asetonitril içinde lmg/ml, InVent GmbH, Almanya) (EP 0353971) ile karistirilmis ve 20 dakika oda sicakliginda enkübe edilmistir. Isaretlenmis LA Bio-Sil SEC üzerinde jel-filtreleme HPLC ile satlastirilmistir. Saflastirilan LA (300 mmol/l potasyumfosfat, 100mm01/1 NaCl, mmol/L Na-EDTA, 5 g/l büyükbas hayvan serum albümini, pH 7.0) içinde seyreltilmistir. Nihai konsantrasyon isaretlenmis bilesik olmustur (yaklasik 20 ng isaretlenmis antikor). Akridinyumester kemilüminesani bir AutoLumat LE kullanilarak ölçülmüstür.20 Kati faz: Polistiren tüpler (Greiner Bio-One International AG, Avusturya) SPA (1.5 ug SPA/ ile kaplanmistir (oda sicakliginda 18 saat). %5 büyükbas hayvan serum albümini ile bloke edildikten sonra, tüpler PBS, pH 7.4 ile yikanmis ve vakumla kurutulmustur. Kalibrasyon: Analiz Pro-Nörotensin içeren insan serumu seyreltileri kullanilarak kalibre edilmistir. Yüksek Pro-Nörotensin immünoreaktivitesi olan bir insan serumu havuzu (InVent Diagostika, Hennigsdorf, Almanya) at serumu (Biochrom AG, Almanya) ile seyreltilmistir (analiz standartlari). Standartlar insan Pro-Nörotensin kalibrasyon cihazi (lCI-Diagnostics, Berlin, Almanya) kullanilarak kalibre edilinistir. Alternatif olarak, analiz sentetik veya rekombinant P-NT 1-117 veya bunun fragmanlariyla kalibre edilebilir (bkz., ayrica Ernst vd., 2006). ProNT Immünoanalizi: 50 ul numune (veya kalibrasyon maddesi) pipetle SPA kaplanmis tüplere konulmus, edilmistir. Baglanmamis izleyici 5 kez (her biri 1 ml) yikama çözeltisi (20 mmol/l PBS, pH 7.4, %0.1 Triton X-lOO) ile yikanarak uzaklastirilmistir. Tüpe-baglanmis LA Luminumeter LE 953 kullanilarak ölçülinüstür. Sonuçlar kalibrasyon egrisinden hesaplanmistir. Kadin popülasyonunda Pro-Enkefalin ve PNT'nin birlesik analizi: Pro-enkefalin ve Pro-Nörotensin arasinda herhangi bir önemli korelasyon olmamistir (p=0.56). Her iki biyo-isaretin kullanildigi bir birlesik modelde, her ikisinin de meme kanseri tahmininde bagimsiz oldugu bulunmustur. Bir tam olarak ayarlanmis modelde, PNT'de her bir SS artisinin ileride meme kanseri için eklendikten sonra, PNT olmayan duruma göre PENK daha kuvvetli hale gelmis ve Pro- Enkefalinde her bir SS artisi için %30,8'lik bir risk azalmasi göstermis veya Pro- Enkefalindeki her bir SS azalisi (reVPENK) ilerideki meme kanseri için %44,5'1ik bir risk artisi ile iliskilendirilmistir (tablo 8). Tablo 8: Meme kanseri tahmini için birlesik PNT ve PENK analizi. Denklemdeki Degiskenler B SE Wald df Sig. Exp(B) Exp(B) için current_smoker0 En düsüge karsi en artmis PNT çeyregi meme kanseri olusmasi için 2.56 katlik bir risk göstermistir ve en yüksege karsi en düsük PNT üzerinde Pro Enkefalin çeyregi (rev:ters En düsük PNT ve en yüksek Pro-Enkefalin çeyregine karsi en yüksek PNT çeyregi ve en düsük Pro-Enkefalin çeyregi kombinasyonu 6.17'lik bir birlesik risk sergilemistir (bkz., Tablo 9: Meme kanseri tahmini için birlesik PNT ve PENK analizi. Denklemdeki Degiskenler B SE Wald df Sig. Exp(B) %95,0 Cl Q_PENK_rev 23,361 3 ,000 Sekil 4: Meme kanseri tahmini için Pro-Enkefalinin birlesik analizinin açiklama örnegi: En düsük Pro-Enkefalin (1.) çeyregi ve en yüksek (4.) Pro-Nörotensin çeyregindeki kadinlar birlestirilmistir (grup 3). Bu artmis risk grubu içinde kadinlarin yaklasik Grup 2, 3. Pro-Nörotensin çeyregi ve 2. Pro-Enkefalin çeyregi ve ek olarak 2. Pro- Nörotensin çeyregi ve 3. Pro-Enkefalin çeyregindeki kadinlarin bir kombinasyonudur. Bu orta risk grubu içinde kadinlarin yaklasik %7,48'inde müteakip 15 yil içinde meme kanseri olusmustur. Grup 1, 1. Pro-Nörotensin çeyregi ve 4. Pro-Enkefalin çeyregindeki kadinlarin bir koinbinasyonudur. Bu düsük risk grubu içinde kadinlarin yaklasik %3,08'inde müteakip yil içinde meme kanseri olusmustur. Grup 1 ve grup 3 arasindaki tehlike riski yaklasik 6,17'dir. Akciger kanseri Pro-Enkefalin kadinlarda akciger kanserini de tahmin etmektedir. Gözlem periyodu sirasinda 40 kadinda akciger kanseri olusmustur. Pro-Enkefalin sigara içen ve içmeyen kadinlarda farkli degildir (p=0.44). Beklendigi gibi, sigara akciger kanseri için kuvvetli bir risk tahmin isaretidir (p<0.0001). Sürpriz bir sekilde, sigara içmek denklemin bir parçasi olmasina ragmen, düsük Pro-Enkefalin 3.2 katlik bir akciger kanseri olusmasi riski göstermistir (tablo 10 a ve 10 b). Tablo 10a ve 10b: Kadinlarda akciger kanseri tahmininde PENK. Kadinlar üç grup halinde bölünmüs (bkz, tablo 10 a) ve ardindan akciger kanseri olusumu için analiz edilmistir (bkz, tablo 10 b). rev = en yüksek grup (tertil 3), rev (1): tertil 2 ve rev(2) = en düsük grup (tertil 1). PENK [pmol/L] PENK Yüzde Dilimi Grubu pmolL Orta Minimum Maksimum Denklemdeki Degiskenler B SE Wald df Sig. Exp(B) Denklemdeki Degiskenler B SE Wald df Sig. Exp(B) T_PENK_females_rev 6,698 2 ,035 SEKILLERIN AÇIKLAMASI Sekil 1: bir tipik Pro-Enkefalin doz/sinyal egrisini göstermektedir. Standart egri Pro- Enkefalin. Sekil 2: kadin popülasyonunda Pro Enkefalin frekans dagilimi: Sekil 3: Kadinlarda toplam meme kanseri teshisini gösteren Kaplan Meier grafikleri, pmol/l), çeyrek 4 (54.1 pmol/l'nin üstü). Düsük PENK bir uzun dönemli meme kanseri olusmasi riskini göstermektedir. Baslangiç gününde (kan numunesi alimi) kanser geçmisi olan tüm kadinlar dahil edilmediginden, Pro-Enkefalin ileride meme kanseri gelismesi için yüksek oranda gösterge teskil eder. Genel olarak, Q l'deki kadinlar Q 4'teki kadinlara göre 3.6 kat daha artmis meme kanserine yakalanma riski tasimaktadir. Sekil 4: Meme kanseri tahmini için Pro-Enkefalinin birlesik analizinin açiklama örnegi: TR