TR201809355T4 - Nüklei̇k asi̇t hi̇bri̇di̇zasyonuna yöneli̇k bi̇leşi̇mler ve yöntemler - Google Patents

Abstract

Birinciye göre akış aşağı olan bir ikinci polinükleotid segmente bitişik bir birinci polinükleotid segmente sahip polinükleotidler sunulmaktadır, burada birinci polinükleotid segment dizisi bir hedef nükleik asit dizisinin belirlenmesine yönelik bir probun segmentinin bir birinci prob dizisine komplementerdir, burada ikinci polinükleotid segmentin dizisi probun bir ikinci prob segmentinin dizisine komplementerdir, ikinci prob segmenti birinci prob segmentine göre akış aşağı konumdadır. Polinükleotidler hedef nükleik asit dizilerinin belirlenmesine yönelik çalışmalarda çift etiketli problar (DLP?ler) ile kullanılabilir.

Description

Tarifname NÜKLEIK ASIT HIBRIDIZASYONUNA YÖNELIK BILESIMLER VE YÖNTEMLER BULUSUN ILGILI OLDUGU SAHA Mevcut bulus nükleik asit hibridizasyonunu içeren yöntemler ve çalismalarin alani ile ARKAPLAN Çift etiketli problar (DLP'ler) bir uçta floresan boyali (raportör) ve diger uçta bir söndürücü molekülü olan polinükleotidleri içerir. Bu tür problar çogunlukla gerçek zamanli PCR içeren çesitli hibridizasyon çalismalarinda kullanilir. DLP kullanan yöntemlerde, probun söndürücüsü raportöre yakin oldugunda, floresan FRET'nin [Floresan Rezonans Enerji Transferi) en yaygin oldugu fizyokimyasal mekanizmalari ile söndürülür Bir söndürücünün söndürme etkililigi raportör ve söndürücü mesafenin artmasi ile hizli bir sekilde azalabilir. Tek bir serbest [bagsiz] intakt DLP molekülündeki söndürücü ve raportör moleküller arasindaki mesafe, kismen prob dizisine bagli olan DLP'nin sekonder yapisina bagli olabilir. Daha fazla sekonder yapisi olan bu DLP'ler, söndürücünün ve raportörün yakin ve söndürme etkililiginin yüksek oldugu bir süper sargili konformasyonda bulunabilir. Sekonder yapisi az olan veya hiç olmayan bu DLP'lerin, söndürücünün ve raportörün ayri ve söndürme etkililiginin azaltilmis oldugu daha gevsek konformasyonda bulunabilir. Daha düsük söndürme etkililigine sahip DLP'ler, raportörün floresanin bir kismi söndürücünün etkisinden 'kaçar'. Yüksek floresanli alt yapi, örnegin düsük çalisma duyarliligi veya sinyal sapmasi ile sonuçlanan düsük sinyal-gürültü oranina yol açan, böylece negatif numunelerden gelen floresan sinyal esigi geçen, gerçek zamanli PCR çalismalarinda istenmez. Arastirilan bir numuneden gelen sinyal esigi astiginda buna bir CT degeri atanir. Numune ayriminin CT degerlerine bagli oldugu otomatik veri analizinde, sinyal sapmasi gösteren negatif numuneler gereksiz tekrar çalismaya neden olan pozitif olarak siniflandirilabilir.

Yüksek floresan altyapili DLP'leri önlemenin bir yolu literatürde belirtildigi gibi DLP'lerin yerine takilan evrensel dupleks problar (AUDP) kullanmaktir. AUDP'de, raportör ve söndürücü birbirine baglanan prob kompleksinin 2 farkli molekülünün sirasiyla 5' ve 3' uçlarina takilir. Bu yüzden söndürücüyü tasiyan prob yerinden çikarilincaya ve floresan serbest birakilincaya kadar raportör ve söndürücü her zaman birbirine yakindir. Ancak AUDP, evrensel yapilari nedeniyle, DLP'lerin sagladigi PCR çalismalarina yönelik daha fazla spesifiklik kapagi sunmaz. bilesimleri ve yöntemleri açiklar. Söz konusu belgede açiklanan problar asagidakileri içeren üç oligonükleotid probunun bir kompleksini içerir: bir birinci oligonükletid prob, bir ikinci oligonükleotid prob ve bir köprüleme oligonükleotid probu. Çogu açidan, birinci ve ikinci problar tercihen hedef nükleik asitin yoklugunda köprüleme oligonükleotidine hibritlesir.

Birinci prob bir interaktif etiket çiftinin bir unsurunu ve ikinci prob interaktif etiket çiftinin diger unsurunu içerir. Yukarida açiklanan klasik hibridizasyon problari ve çalismalarina iliskin sinirlamalarin üstesinden gelmeye, özellikle nükleik asit problarinin, özellikle çift etiketli nükleik asit problarinin performansini gelistirmede etkili bilesimler, yöntemler ve kitler saglamaya yönelik bir ihtiyaç bulunmaktadir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bir açidan, mevcut bulus asagidakileri ihtiva eden bir bilesimin kullanimini saglar: a) nükleik asit probuna hibridizasyona yönelik bir prob sarici, burada prob sarici bir birinci prob sarici segment ve birinciye göre akis asagi olan bir ikinci prob sarici ihtiva li] bir hedef diziyi belirlemeye yönelik bir nükleik asit probu, burada prob bir FRET çiftini ihtiva eder, burada prob bir birinci prob segmenti ve birinci prob segmente göre akis asagi bir ikinci prob segmenti ihtiva eder; burada birinci prob sarici segmentin dizisi birinci prob segmentin dizisinin ters komplementine en az %90 homologdur, burada ikinci prob sarici segmenti ikinci prob segmentin ters komplementine en az %90 homologdur; burada bir numunedeki bir hedef nükleik asitin varligini belirlemek üzere prob/hedef kompleksinin erime sicakligi (Tm) prob/prob sarici kompleksin erime sicakligindan daha büyüktür.

Bir baska açidan, mevcut bulus asagidakileri ihtiva eden bir bilesim sunmaktadir: a) nükleik asit probuna hibridizasyona yönelik bir prob sarici, burada prob sarici bir birinci prob sarici segment ve birinciye göre akis asagi olan bir ikinci prob sarici ihtiva b] bir hedef diziyi belirlemeye yönelik bir nükleik asit probu, burada prob bir FRET çiftini ihtiva eder, burada prob bir birinci prob segmenti ve birinci prob segmente göre akis asagi bir ikinci prob segmenti ihtiva eder; burada birinci prob sarici segmentin dizisi birinci prob segmenti dizisinin ters komplementine göre %90 ila %96 homologdur, ve burada ikinci prob sarici segmentin dizisi ikinci prob segmenti dizisinin ters komplementine göre %90 ila %96 homologdur.

Bazi açilardan, mevcut bulus bir numunedeki bir hedef nükleik asitin varligini belirlemeye yönelik bir yöntem saglar. Yöntem asagidaki adimlari ihtiva eder: a) bir prob bir prob sariciya kaynastirildiginda bir tespit sicakliginda birinci düzeydeki bir floresan sinyalinin belirlenmesi; b] numunenin prob saricinin varliginda prob ile temas ettirilmesi, burada prob sarici bir birinci prob sarici segment ve birinciye göre akis asagi bir ikinci sarici segment ihtiva eder, burada prob hedef nükleik asidi belirlemeye yönelik bir nükleik asit probudur, burada prob bir birinci prob segmenti ve birinci prob segmentine göre akis asagi bir ikinci prob segmenti ihtiva eder, burada birinci prob sarici segmentin dizisi birinci prob segmenti dizisinin ters komplementine en az %90 homologdur, burada ikinci prob sarici segmentin dizisi ikinci prob segmentin dizisinin ters komplementine en az %90 homologdur, burada prob ayrica bir FRET çiftini ihtiva eder, burada birinci ve ikinci prob segmentleri, bir prob/prob sarici kompleks olusturmak üzere bir hedef nükleik asitin yoklugunda, sirasiyla birinci ve ikinci prob segmentlere kaynastirilabilir, burada hedef nükleik asitin varliginda, prob bir prob/hedef kompleksi olusturmak üzere tercihen hedef nükleik aside kaynastirilabilir; c] tespit sicakliginda, probun floresan sinyalindeki bir degisimin belirlenmesi; burada prob sarici proba hibritlendiginde florofor bir floresan sinyalini içerir, burada floresan sinyali hedef nükleik asitin numunede bulundugu birinci düzeyden daha fazladir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1 bir proba hibritlenen mevcut bulusun bir “prob saricisinin" bir düzenlemesinin bir sematik ifadesidir.

Sekil 2 mevcut bulusun bazi düzenlemelerinin sematik bir ifadesidir: SEQ ID NO: 1'de belirtilen bir diziye sahip bir prob SEQ ID NO: 2. Florofor 0,- Söndürücüde belirtilen bir diziye sahip bir prob sarici ile gösterilir.

Sekil 3 bir düzenlemede, bir prob sariciyi ve bir probu gösteren bir sematik ifadedir, burada prob bir hedef diziye hibritlenir.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bir açidan, mevcut bulus hedef nükleik asit dizilerinin belirlenmesine yönelik kullanilan bir nükleik asit probuna hibridizasyonuna yönelik bir polinükleotid (burada bir “prob sarici” olarak da refere edilir) saglar. Genellikle, prob sarici, belirli kosullar altinda, nükleik asit probunun hem akis yukari hem de akis asagi bölgelerine hibritlenir.

SEKIL 1 komplementer baz çifti olusturma (3) ile bir DLP'ye (2]hibritlenen prob saricinin sarici birinciye (4] göre akis asagi olan bir ikinci polinükleotid segment (5) ile bitisik olan bir birinci polinükleotid segmente [4] sahip tek Zincirli polinükleotiddir. Birinci polinükleotid segmentin (4) dizisi, ayrica birinci prob segmente [6] göre akis asagi olan bir ikinci prob segmenti (7) içeren probun [2) bir birinci prob segmentini (6] tanimlayan bir birinci prob dizisini komplementerdir, ikinci prob segment (7] ayrica bir nükleik asit dizisi içerir. Prob saricinin [1) ikinci polinükleotid segmentinin (5) dizisi probun (2) ikinci prob segmentinin (7) dizisine komplementerdir. SEKIL 1'de prob [2], sirasiyla 5' ve 3' uçlarinda, bir raportör (8) bir söndürücü (9] içeriyor olarak gösterilir.

Genellikle, birinci prob segmenti, ikinci prob segmenti veya her ikisi probun bir dizideki hedefe spesifik bir sekilde hibridizasyonunu olanakli kilmak üzere bir hedef diziye tamamen veya yeterince komplementerdir.

Bazi düzenlemelerde, bir prob saricinin birinci ve ikinci polinükleotid segmentlerinin dizileri bir probun birinci ve ikinci prob segmentlerinin dizilerine tamamen komplementerdir, diger düzenlemelerde, bir prob saricinin bir prob ile hibridizasyonu tamamen komplementer olan diziler ile ilgili segmentlerinin tavlanmasi ile sinirli degildir.

Baska bir deyisle, polinükleotid (baska bir deyisle prob sarici) spesifik olarak proba baglandigi takdirde, tavlama segmentlerinin dizilerinin tamamen komplementer olmasi gerekmeyebilir; bir veya daha fazla evrensel baz, örnegin inosin veya 5-nitroindol içerebilir ve kismen komplementer olmayan bir haz veya bir dizi içerebilir.

Bir düzenlemede, prob saricinin birinci polinükleotid segmentinin dizisi probun birinci prob segmentinin dizisinin ters komplementine homologdur. Bir diger düzenlemede, birinci polinükleotid segmentin dizisi ile birinci prob segmentin dizisinin ters komplementi arasindaki bir homoloji yüzdesi en az yaklasik %90, örnegin, yaklasik %90 ila yaklasik 100 ve yaklasik %94 ila yaklasik %96'dir. Bazi düzenlemelerde, birinci polinükleotid segmentinin dizisi probun birinci prob segmentinin dizisinin ters komplementidir.

Bir diger düzenlemede, prob saricinin ikinci polinükleotid segmentinin dizisi probun ikinci prob segmentinin dizisinin ters komplementine homologdur. Bir diger düzenlemede, ikinci polinükleotid segmentin dizisi ile ikinci prob segmentin dizisinin ters komplementi arasindaki bir homoloji yüzdesi en az yaklasik %90, örnegin, yaklasik %90 ila yaklasik 100 ve yaklasik %94 ila yaklasik 96'dir. Bazi düzenlemelerde, ikinci polinükleotid segmentinin dizisi probun ikinci prob segmentinin dizisinin ters komplementidir.

Tercih edilen düzenlemelerde, prob sarici bir raportör ve bir söndürücü içeren bir DLP'ye hibritlenebilir. Örnegin, bazi düzenlemelerde, DLP bir uçta floransan boyali [raportör] ve diger uçta bir söndürücü molekülü olan tek zincirli polinükleotiddir. Herhangi bir teoriye bagli kalmadan, söndürücü raportöre fiziksel olarak yakin oldugunda, Iloresan Floresan Rezonans Enerji Transferi'nin [FRET) en yaygin oldugu fizyokimyasal mekanizmalar ile söndürülür. Mevcut tarifnamenin prob saricisi belirli kosullar altinda DLP'nin hem akis yukari hem de akis asagi segmentlerine hibritlenebilir, böylece raportörü ve söndürücüyü birbirine yakin konumlandirir [Sekil 1). Bu "sarma" floresan molekülü ile floresan söndürmenin etkililigini artirabilir, böylece örnegin bir PCR döngüsünün belirlenme adimi sirasinda serbest form DLP'nin (baska bir deyisle hedef deteksiyonda sinirlanmayan veya takilmayan) serbest form DLP'nin floresan altyapisini azaltir. Bu hatali bir pozitif sonuca neden olabilen sinyal sapmasinin ortadan kaldirilmasini veya önemli ölçüde azaltilmasini saglar. Ayrica, DLP ile prob sarici arasindaki etkilesim tersine çevrilebilir - örnegin moleküller bir PCR döngüsünde denatürasyon adiminda ayrilir, DLP'nin sonraki hedef deteksiyon döngüsüne yönelik uygunlugunu saglar.

Prob sariciyi tasarlamada, örnegin interaktif etiketleri [örnegin raportör/söndürücü) olan bir DLP ile kullanima yönelik olarak, prob saricinin akis yukari ve akis asagi segmentleri ve bir deteksiyon sicakligi altinda, DLP bir hedefe bagli olmadiginda, prob sarici ve probun baglantili ve probun etiket parçalari birbirine yakin olmasini saglayacak yeterli uzunlukta olmalidir. Kullanilan çalisma kosullarina bagli olarak, prob saricinin birinci ve ikinci polinükleotid segmentleri en az 3 nükleotid uzunlugunda, örnegin yaklasik 3 ila yaklasik 50 nükleotid, yaklasik 5 ila 30 nükleotid, yaklasik 9 ila yaklasik 20 ve yaklasik 11 ila yaklasik nükleotid uzunlugunda olabilir. Bir düzenlemede, her segment ayri ayri yaklasik 9 ila 1 1 nükleotid uzunlugundadir. Ayrica, daha fazla uzunluktaki prob sarici segmentler de kosullarina bagli olarak kullanilabilir. Bir prob saricinin her polinükleotid segmentinin gerçek uzunlugu prob ve/veya hedef dizilere referans ile seçilebilir, bu sekilde prob, bir deteksiyon adimi sirasinda hedef bulunmadiginda prob sariciya bagli kalir.

SEKIL 2'de gösterilen bazi düzenlemelere göre prob saricida/prohda, prob saricinin birinci ve ikinci polinükleotid segmentleri her biri toplam 30 nükleotidlik bir toplam uzunluga sahip bir tek Zincirli polinükleotid olan, probun ilgili segmentlerine tamamen komplementer olan her biri 1 1 nükleotid uzunluguna sahip olarak gösterilir.

Bazi düzenlemelerde, prob sarici tek bir etiket parçasi çiftine sahip bir DLP'yi sarar. Diger düzenlemelerde, DLP bir çiftten fazla etiket parçasi içerir. Ayrica, özellikle bir unsurun diger unsurun birden fazla molekülünü etkileyebildigi veya bunlardan etkilenebildigi durumda, bir etiket çiftinin unsurlari arasinda bire bir moleküler baglantiya yönelik hiçbir gereksinim bulunmamaktadir. Etiket parçalari etkilesebilir bu sekilde en az bir parça bir baska etiket parçasinin en az bir fiziksel olarak ölçülebilir özelligini yakinliga-bagli bir sekilde degistirebilir. Etiket çiftinin karakteristik sinyali probun prob sariciya veya hedefe bagli olup olmadigina bagli olarak algilanabilir düzeyde farklidir. Bazi düzenlemelerde, bir etiket çifti iki veya daha fazla söndürme parçasi ile çift olusturulan bir floresan parçasi içerir. Örnegin, SEKIL 1'e refere edildiginde, tercih edilen etiket parçalari tek bir FRET çiftidir, daha çok tercih edildigi üzere bir florofor (8) ve söndürücüdür (9). Bu düzenlemede, karakteristik sinyal belirli bir dalga uzunlugunun floresanidir. Prob, prob sariciya bagli oldugunda, söndürücü parça floresani raportör parçadan söndürebilir, burada, raportör parça uygun bir isik frekansi ile uyarildiginda, nispeten çok düsük veya yaklasik sifir olabilen bir floresan sinyali bir birinci düzeyde belirlenebilir. Prob, prob sariciya bagli olmadiginda, söndürücü parça floresani, prob ve prob saricinin birbirine bagli oldugu durumdaki kadar etkili bir sekilde söndüremez, burada raportör parça uygun bir isik frekansi ile uyarildiginda, tercihen birinci düzeyden daha fazla olan ikinci bir düzeyde belirlenebilir. Ayrica, bir hedef dizisi bulundugunda, üçüncü düzeyde bir sinyal belirlenebilir, burada üçüncü düzey birinci veya ikinci düzeyden daha fazladir.

Bazi düzenlemelerde, prob sarici, çalisma kosullari sirasinda, proba deteksiyon kosullari altinda yeterince kuvvetli olarak tersine baglanir, bu sekilde probun ve hedef dizisinin hibridizasyonu, bulundugunda, prob saricinin prob ile etkilesimine termodinamik olarak tercih edilir.

Bazi düzenlemelerde, floresan boyalari asagidakiler ile sinirli olmamak kaydiyla sunlari içerir: FAM, BODIPY FL, Cy3m, Cy3.5“^, Cy5T”, Cy5.5“^, EDANS, floresin, HEX, [AEDANS, IOE, Oregon GreenTM, [LC)Red640, (LC]Red705, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamin, Texas RedTM veya bunlarin kombinasyonlari.

Diger düzenlemelerde, söndürücü boyalar asagidakiler ile sinirli olmamak kaydiyla sunlari içerir: BHQ-ITM, BHQ-ZT”, BHQ-ST”, DABCYL, altin nanopartikülleri gibi metal kümeleri ve Bir düzenlemede, interaktif etiketler asagidakiler ile sinirli olmamak kaydiyla örnegin FAM/BHQ-l, floresin/tetrametilrodamin, floresin/floresin, floresin/QSY7, iloresin/LC RED640, floresin/LC Red705 IAEDANS/iloresin, EDANS/DABCYL, BODIPY FL/BODIPY FL, TET/BHQ-1,]OE/BHQ-1, HEX/BHQ- 1, Oregon Green/BHQ-l, TAMRA/BHQ-Z, ROX/BHQ-Z, Cy3/BHQ-2, Cy3.5/BHQ-2, Texas Red/BHQ-Z, Texas Red/BHQ-Z, Cy5/BHQ-3 ve Cy5.5/BHQ-3'ü içerir.

Bazi düzenlemelerde, prob ayrica bir raportör enzimi ve uygun inhibitörü içeren diger yararli etiket çiftlerini içerir.

Bir diger düzenlemede, prob sarici, sirasiyla bir FAM ve bir BHQ1 ile 5' ve 3' son etiketli bir DLP'ye hibritlenebilir.

Ikinci segment SEKIL 1'de gösterildigi gibi birinci segmente bitisik ve hemen akis asagi oldugunda, diger düzenlemelerde, prob sarici ayrica birinci polinükleotid segment ve ikinci polinükleotid segment arasinda bir ayirici içerebilir.

Burada “ayirici" terimi, prob saricinin birinci polinükleotid segmentine takilan bir birinci uca ve ikinci polinükleotid segmentine takilan bir ikinci uca refere eder. Bu yüzden, ayirici molekülü birinci ve ikinci segmentleri ayirir, fakat her ikisine takilir. Ayiricilar dogrudan sentetize edilebilir veya tercihen spesifik konumlarda prob sariciya bütün olarak takilir.

Ayirici içindeki baglayicilar asagidakiler ile sinirli olmamak kaydiyla karbon-karbon tekli baglar, karbon-karbon çiftli baglar, karbon-nitrojen tekli baglar veya karbonoksijen tekli baglari içerir. Mevcut tarifnamede kullanima uygun ayiricilar Örnegin yapisal unsur olarak bazlari ve deoksiribozu içeren adenin, sitosin, guanin ve timin içeren nükleotidleri içerir.

Ayrica, bir nükleotid, yukarida belirtilen bazlarin en az birini (örnegin inosin] kullanarak bir baz çifti olusturabilen, teknikte bilinen herhangi bir yapay bazi da içerebilir. Tercih edilen ayiricilar degisken bir uzunluga sahip olabilen timin ayiricilari da içerir. Ayirici ayrica, tercihen birinci ve ikinci segmentlere takilmaya yönelik her uçta, uygun reaktif gruplara sahip olabilir. Bu tür reaktif gruplar arasinda örnegin hidroksi-, tiyol-, aldehid-, amid- ve tiyoamid-gruplar yer alabilir. Ayrica, ayirici yan zincirlere veya diger sübstitüsyonlara sahip olabilir. Aktif grup teknikte bilinen uygun yöntemler ile reaksiyona sokulabilir, örnegin, tercihen birinci ve ikinci prob sarici segmentler arasinda ayiriciya sahip tek bir bitisik prob sarici olusturmak üzere ayirici ve prob saricinin bir segmenti arasinda bir kovalent bag.

Bir düzenlemede, prob sarici bir polimeraz ile polimeraz uzantisini önlemek üzere degistirilen bir 3' uç içerir. Bir diger düzenlemede, prob sarici bir fosfat grubu, bir fosfat esteri veya bir tersine çevrilen 3'--3' bag ile degistirilen bir 3' uç içerir. Diger bloklama yöntemleri ve tipleri teknikte uzman kisiler tarafindan bilinir ve 3' ucunun polimeraz uzantisini önlemek üzere prob sarici ile kolaylikla kullanilabilir.

Bazi düzenlemelere göre prob saricilarin ve DLP'lerin sinirlayici olmayan örnekleri Tablo 1'de verilir.

Tablo 1: DLP ve sarici dizilerinin örnekleri.

Oligonükleotid fonksiyonu Oligonükleotid dizisi (5' ila 3') HIV Deteksiyon probu 1 FAM/ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT/BHQ-1 [SEQ ID No:1] HIV Prob sarici 1 TCATTGATGGTATCCCATTCTGfosfat (SEQ ID No:2) Teknikte siradan uzmanliga sahip bir kisi kompleks solüsyonlardaki nükleik asit moleküllerinin davranisinin kesinlikle her zaman tahmin edilebilecegi, dolayisiyla, ampirik test belirli çalisma kosullari altinda optimal olarak çalismak üzere bulusa göre prob saricilari ve/veya problari özellestirmede çok yararlidir.

Diger açilardan, mevcut bulus istem 5'te açiklandigi gibi prob sariciyi ve probu içeren bir bilesim saglar.

Açiklamalarin bazi yapilanmalarinda bilesim asagidakileri ihtiva eder: a) bir nükleik asit probuna hibridizasyonuna yönelik bir prob sarici, burada prob sarici bir birinci prob sarici segment ve birinciye göre akis asagi olan bir ikinci prob sarici ihtiva eder, ve b] bir hedef diziyi belirlemeye yönelik bir nükleik asit probu, burada prob bir birinci prob segmenti ve birinci prob segmente göre akis asagi bir ikinci prob segmenti ihtiva Bazi düzenlemelerde, birinci polinükleotid segmentinin dizisi birinci prob segmentinin dizisine komplementerdir, burada ikinci polinükleotid segmentin dizisi ikinci prob segmentin dizisine komplementerdir.

Bir düzenlemede, birinci polinükleotid segmentinin dizisi probun birinci prob segmenti dizisinin ters komplementidir. Bir diger düzenlemede, prob saricinin ikinci polinükleotid segmentinin dizisi probun ikinci prob segmenti dizisinin ters komplementidir.

Tercih edilen düzenlemelerde, prob nükleik asit zinciri, bir deteksiyon sicakliginda bir hibridizasyon kosulu altinda, özellikle, bir proba/prob sarici TM'e sahip bir prob/prob sarici kompleks olusturmak üzere bir hedef nükleik asit zinciri olmadiginda prob sarici nükleik asit zincirine tersine çevrilerek tavlanir, burada hedef nükleik asit zincirinin varliginda, prob nükleik dizisi bir prob/hedefT olusturmak üzere tercihen hedef nükleik asit dizisine tavlanir.

Tercihen, prob/hedef TM prob/prob sarici TM'den daha fazladir. Bir diger düzenlemede, prob/prob sarici TM deteksiyon sicakligindan daha fazladir.

Bazi düzenlemelerde, burada prob bir sinyal-olusturma raportörü (örnegin bir florofor) içerir, prob, prob sariciya tavlandiginda bir birinci düzeyde bir raportör sinyal belirlenebilir. Diger düzenlemelerde, birinci düzey bir hedef dizinin bulundugundan belirlenen bir sinyalden daha azdir.

Bir düzenlemede, prob ayrica bir raportör ve bir söndürücü içerir.

Herhangi bir özel teoriye bagli kalmadan, probun/prob sarici zincirinin ayrilmasinin prob/hedef sarmalin olusumunun termodinamikleri ile yönlendirilir. Prob/hedef sarmalinin olusumu çalisma kosullari altinda prob/prob sarici çiftinin çekiminin üstesinden gelebilir.

Prob saricilari ve problari içeren mevcut bulusun nükleik asit molekülleri DNA, RNA veya kombinasyonlarindan hazirlanabilir. Ayrica, prob dizileri ile hibridizasyonuna katilan tek Zincirli segmentlerin yani sira, diger düzenlemelerde, nükleik asit molekülleri ayrica çift Zincirli olan nükleik asit bölgeleri de içerebilir. Ayrica, nükleik asit molekülleri modifiye nükleotidler içerebilir. Modifiye internükleotid baglar, örnegin hibridizasyon dayanikliligini ve direncini spesifik olmayan degradasyona ve nükleazlara degistirmek üzere deoksiribonükleotidleri ve ribonükleotidleri içeren nükleik asit moleküllerde yararlidir.

Nükleotidler arasindaki baglar fosfodiester baglarin, örnegin peptid baglarin disinda baglar içerebilir. Modifiye internükleotid baglar teknikte iyi bilinir ve metilfosfonatlar, fosforotioatlar, fosforoditionatlar, fosforoamiditler ve fosfat ester baglar içerir. Defosfo- baglar nükleotidler arasinda köprüler olarak da bilinir ve siloksan, karbonat, karboksimetil ester, asetamidat, karbamat ve tioeter köprüler içerir. Örnegin N-vinil, metakriloksietil, metakrilamid veya etilenimin internükleotid baglar içeren “Plastik DNA”, mevcut bulusun nükleik asit moleküllerinde de kullanilabilir. Nükleazlar ile degradasyona direnci nedeniyle ve dogal nükleik asitler ile daha kuvvetli bir hibrit olusturdugunda “Peptid Nükleik Asit” Bazi açilardan, mevcut bulus bir numunedeki en az bir hedef nükleik asit zincirini belirlemeye yönelik bir yöntem saglar. Yöntem asagidakileri içerir: istem 5'te tanimlandigi gibi bir prob saricinin varliginda numuneye bir prob ile temas etme.

Bir düzenlemede, prob sarici birinciye göre akis asagi olan bir ikinci polinükleotid segmenti ile bitisik bir birinci polinükleotid segmente sahip bir polinükleotiddir ve prob bir hedef diziyi belirlemeye yönelik bir nükleik asittir, burada prob bir birinci prob segmenti ve birinci prob segmente göre akis asagi bir ikinci prob segmenti içerir; burada birinci polinükleotid segmentin dizisi birinci prob segmentin dizisine komplementerdir, burada ikinci polinükleotid segmentinin dizisi ikinci prob segmentin dizisine komplementerdir, burada prob ayrica bir florofor ve bir söndürücü içeren bir FRET çifti içerir.

Bir diger düzenlemede, birinci ve ikinci prob segmentleri, bir deteksiyon sicakliginda bir hibridizasyon kosulu altinda, özellikle, bir proba/prob sarici TM'e sahip bir prob/prob sarici kompleks olusturmak üzere bir hedef nükleik asit zinciri olmadiginda sirasiyla prob saricinin birinci ve ikinci polinükleotid segmentlerine spesifik olarak ve tersine nükleik asit zincirine tersine çevrilerek tavlanabilir, burada hedef nükleik asit zincirinin varliginda, prob bir prob/hedefTM olusturmak üzere tercihen hedef nükleik asit dizisine tavlanabilir.

Bazi düzenlemelerde, yöntem ayrica deteksiyon sicakliginda probun floresan sinyalindeki bir degisikligin belirlenmesini içerir.

Diger düzenlemelerde, prob, prob sariciya tavlandiginda bir birinci düzeyde bir floresan sinyali deteksiyon sicakliginda belirlenir, burada deteksiyon sicakligindaki floresan sinyali hedef nükleik asit dizisinin numunede bulundugu birinci düzeyden daha fazladir.

Diger düzenlemelerde, bu bulus uyarinca çalismalar multiplekslenebilir, baska bir deyisle birden fazla hedef nükleik asit analiti bir çalismada belirlenebilir. Tipik olarak, bir multipleks çalismasinda, kovalent olarak takilan boyalarinin yapisinda farklilik gösteren birden fazla spesifik nükleik asit probu, incelenecek karisima eklenir. Boyalar her spesifik nükleik asit probundan fark edilebilir floresan sinyaller üretmek üzere seçilebilir. Nükleik asit problarinin farkli boya kombinasyonlarinin sinyalleri ayni zamanda ilgili hedef nükleik asitleri belirlemek ve/veya miktarini tespit etmek üzere es zamanli olarak kaydedilebilir.

Bir düzenlemede, yöntem bir gerçek zamanli PCR'dir. Bir diger düzenlemede, yöntem ayni çalismada birçok prob sarici, problar ve/Veya hedefler içeren bir multiplekslenen bir çalismadir. Bazi düzenlemelerde, yöntem iki veya daha fazla farkli prob ve ilgili prob saricilari içeren bir multiplekslenen, gerçek zamanli PCR'dir.

Homojen çalismalarin yani sira, mevcut tarîfnamenin nükleik asit molekülleri, diger düzenlemelerde, nükleik asit mikrodizilerde yapilan çalismalarda kullanilabilir, böylece hedef nükleik asit analitin yüzlerce nükleik asit dizilerinden ve bazi durumlarda on binlerce nükleik asit dizilerinden olusan nükleik asit dizilerinin bir karisimi olabilir. Bu durum özellikle ifade analizine yönelik geçerlidir, burada bir biyolojik sistemde bulunan RNA dizilerinin çogu veya tamami, örnegin bir hücre kültüründen belirli bir hücre tipi, analiz edilir. Tipik olarak, mRNA dizileri çalismadaki analitler olarak kullanimlarindan önce evrensel primerler ile ters transkripsiyon PCR ile çogaltilabilir. Bu düzende analitte bulunan tüm nükleik asit dizileri mikrodiziye uygun prob sarici ile birlikte es zamanli olarak uygulanir, böylece analitteki tüm nükleik asit dizilerinin, dizide etkilesimini tüm nükleik asitler ile etkilesimini saglar. Diger durumlarda, hedef nükleik asit analiti, sinirli sayida en fazla yüz nükleik asit dizisini ve bazi durumlarda sadece bir nükleik asit dizisini içerir.

Genellikle, mikrodizilerin analizinde, olusturulan floresan sinyaller, dizisi ve ona takilan prob dizisi üstündeki bir noktanin konumunun bilinen iliskisi yoluyla diziye özgü sonuçlara dönüstürülür.

Mevcut tarifnamenin nükleik asit moleküllerinin uygulamalari klinik taniyi içeren in vitro tani, moleküler biyoloji sahalarinda arastirma, yüksek çiktili ilaç taramasi, veteriner tanisi, zirai-genetik test, çevresel test, gida testi, endüstriyel proses izleme, adli tip ve sigorta testi in vitro tani sahalarini içerir. Iri vitro tani ve klinik tam bir patojenin [örnegin Virüs, bakteri), hastaligin veya durumun, gelisim ve/veya ciddiyet asamasinin ve hastanin tedaviye yanitini belirlemek üzere vücuttan alinan nükleik asit numunelerinin analizi ile ilgilidir. Yüksek çiktili ilaç taramasinda ve gelistirmesinde nükleik asitler, ilaç ana maddelerini tespit etmek üzere yüksek numuneli bir sayisal ayarda bir veya daha fazla bilesige maruz kalmasindan sonra biyolojik sistemlerini tepkisini analiz etmek amaciyla antijenler, antikorlar, reseptörler, vb. gibi diger ajanlara benzer sekilde kullanilir. Veteriner tanisi ve zirai genetik testi in vitro taniya benzer insan olmayan bir hayvan veya bir bitki türlerinden numuneleri ve zirai genetik ürünlere ve proseslere yönelik kalite kontrol yöntemleri saglamayi içerir. Çevresel test isleminde, toprak, su, hava, vb. gibi bir çevresel ortamin kirliligini belirten organizmalar ve toksinleri analiz edilebilir. Gida test islemi bir kalite kontrol yöntemi olarak örnegin bakteri, mantar, vb. gibi organizmalarin miktarinin belirlenmesini içerir.

Endüstriyel proses izlemesinde, nükleik asitler, bir üretim prosesinin dogru kontrolünü göstermek ve/veya bu tür prosesler kontrol disinda oldugunda bir sinyal olusturmak üzere belirlenir ve/veya miktari tayin edilir. Sigorta testinde, bir müsterinin risk kategorisini belirlemek veya adaylari onaylamaya yardimci olmak üzere tarama testlerinde tespit edilir.

Teknikte uzman bir kisi mevcut tarifnamenin prob saricilarinin ve problarinin nükleik asitlerin ve yeni uygulamalarin deteksiyonunun ve/veya miktarinin belirlenmesinin çesitli diger uygulamalara yönelik kullanilabilir.

Bir düzenlemede, prob saricilari ve problari içeren mevcut tarifnamenin nükleik asit molekülleri plazma donasyonlarini ve/veya plazma üretimini test etmeye yönelik çalismalarda kullanilabilir. Örnegin, bazi düzenlemelerde, çalismalar plazma donasyonlarinin PCR testini ve/veya HIV, HCV, parvovirüs, bakteri, levür, vb. içeren ancak bunlarla sinirli olmayan enfeksiyöz ajanlarin varligina veya yokluguna yönelik üretimi Bazi düzenlemelerde, bir biyolojik kaynaktan (örnegin kan, semen, tükürük, ürin, spinal sivi, cilt) alinan RNA molekülleri [örnegin mRNA, viral genomik RNA) belirlenir ve/veya miktari tayin edilir. Tipik olarak, RNA molekülleri, bulundugunda, cDNA moleküllerine dönüstürülür ve/veya belirlenecek hedef nükleik asit analitini saglamak üzere PCR ile daha da çogaltilir.

Diger düzenlemelerde, ilaç gelistirmede gerekli olan etkililik, güvenlik profili, etki mekanizmasi ve ilaç adaylarinin diger özellikleri hakkinda veri saglayan, bir ilaç adayinin veya ilaç adaylarinin karisimlarinin farkli konsantrasyonlarina maruz kalma gibi farkli çevresel kosullar altinda bir biyolojik sistemden elde edilen mRNA numuneleri ile çalismalar yapilir.

Bazi düzenlemelerde, mevcut tarifnamenin nükleik asit molekülleri bir numunede bulunabilen DNA hedeflerini belirlemek veya miktarini tayin etmek üzere (örnegin viral genomik DNA, DNA polimorfizmalar) kullanilabilir.

Asagidaki örnekler sadece bulusun anlasilmasi amaciyla sunulmaktadir. ÖRNEKLER HlV'i Belirleme HIV RNA'nin varligi plazma numunelerinde standart protokolleri kullanan gerçek zamanli PCR (RT-PCR] teknolojisi kullanilarak belirlenmistir. HIV negatif olan normal insan plazma numuneleri negatif kontroller olarak kullanilmistir.

Plazmadan özütlenen HIV RNA bir adim tamponlar, Mg2+ iyonlar, dNTPs, DMSO, MMLV ters transkriptaz, Taq polimeraz, HIV Spesifik primerler ve prob sarici 1 olan veya olmayan prob 1 içeren bir ana karisimin varliginda bir adim ters-transkriptaz, gerçek zamanli PCR çogaltmasina tabi tutulur. Ters-transkriptaz, gerçek zamanli PCR reaksiyonu prob/prob sarici eritme sicakliklarina göre termal döngü kosullari altinda AB 7300 [Applied Biosystems, Foster City, CA) kullanilarak gerçeklestirilir. PCR amplifikasyonu sonrasinda, olusan floresan sinyali teknikte bilinen Dizi Deteksiyon Sistemi [SDS] yazilimi [Applied Biosystems, Foster City, CA] kullanilarak analiz edilir.

Sonuçlar 40'tan düsük CT degerleri olan HIV pozitif plazma numunelerinde HIV deteksiyonunu gösterir. Negatif kontroller prob saricinin varliginda belirlenen esik altinda kalan düsük floresan alt yapisina sahipti. Prob sarici bulunmadiginda, negatifkontrollerdeki floresan alt yapi yanlis pozitifsonuçlar olusturan 40'tan düsük CT degerinde belirlenen esigi asan bazi numuneler ile yüksekti.

Dizi LISTESI <110> Grifols Therapeutics Inc.

Wronska, Danuta Schouest, Katherine <120> COMPOSITIONS, METHODS, AND KITS FOR NUCLEIC AClD HYBRIDIZATION <1SÜ> US 61.626.773 <180> 3 <170> Patentln version 3 5 <2iû> 1 <21' > 30 <212> DNA <713> Artificial Sequence <22Ü> <40û> 1 <210> 2 <21' > 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence (220› <223> Poiyviucleotde ["probe wrappev'1i <4ÜÜ> 2 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 3

Claims (1)

1. ISTEMLER Bir bilesimin kullanimi olup özelligi asagidakileri ihtiva etmesidir: a) bir nükleik asit probuna hibridizasyonuna yönelik bir prob sarici, burada söz konusu prob sarici bir birinci prob sarici segment ve birinciye göre akis asagi olan bir ikinci prob sarici segment ihtiva eder; ve b] bir hedef dizisini tespit etmeye yönelik bir nükleik asit probu, burada söz konusu prob bir FRET çiftini ihtiva eder, burada prob bir birinci prob segmenti ve birinci prob segmente göre akis asagi bir ikinci prob segmenti ihtiva eder; burada birinci prob sarici segmentin dizisi birinci prob segmentin dizisinin ters komplementine göre en az %90 homologdur, burada ikinci prob sarici segmentin dizisi ikinci prob segmentin dizisinin ters komplementine göre en az %90 homologdur; burada probun/hedef kompleksin erime sicakligi [Tm], bir numunedeki bir hedef nükleik asidin varligini belirlemek üzere prob/prob sarici kompleksinin erime sicakligindan daha yüksektir. lstem 1'e göre sunulan bir kullanim olup özelligi birinci ve ikinci prob sarici segmentleri dizisinin sirasiyla, birinci ve ikinci prob segmentleri dizilerinin ters komplementlerine %100 homolog olmasidir. Istem 1'e göre sunulan bir kullanim olup özelligi prob saricinin ayrica birinci ve ikinci prob sarici segmentleri arasinda bir ayirici ihtiva etmesidir. lstem 1'e göre sunulan bir kullanim olup özelligi FRET çiftinin bir florofor ve bir söndürücü olmasidir. Bir numunede bir hedef nükleik asitin varligini belirlemeye yönelik bir yöntem olup özelligi yöntemin asagidakileri ihtiva etmesidir: a) bir prob bir prob sariciya kaynastirildiginda bir tespit sicakliginda birinci düzeydeki bir floresan sinyalini belirleme; b] numunenin prob saricinin varliginda prob ile temas ettirilmesi, burada prob satici bir birinci prob sarici segment ve birinciye göre akis asagi bir ikinci sarici segment ihtiva eder, burada prob hedef nükleik asidi belirlemeye yönelik bir nükleik asit probudur, burada prob bir birinci prob segmenti ve birinci prob segmentine göre akis asagi bir ikinci prob segmenti ihtiva eder, burada birinci prob sarici segmentin dizisi birinci prob segmenti dizisinin ters komplementine en az %90 homologdur, burada ikinci prob sarici segmentin dizisi ikinci prob segmenti dizisinin ters komplementine en az %90 homologdur, burada prob ayrica bir FRET çiftini ihtiva eder, burada birinci ve ikinci prob segmentleri, bir prob/prob sarici kompleksi olusturmak üzere bir hedef nükleik asitin yoklugunda, sirasiyla birinci ve ikinci prob sarici segmentlere kaynasabilmektedir, burada hedef nükleik asitin varliginda, prob bir prob/hedef kompleksi olusturmak üzere tercihen hedef nükleik aside kaynasabilmektedir, tespit sicakliginda, probun floresan sinyalindeki bir degisikliginin belirlenmesi; burada prob sarici proba hibritlendiginde florofor bir floresan sinyaline sahiptir, burada söz konusu floresan sinyali hedef nükleik asitin numunede bulundugu birinci düzeyden daha fazladir. lstem 5'e göre sunulan yöntem olup özelligi FRET çiftinin bir florofor ve bir söndürücü olmasidir. Asagidakileri ihtiva eden bir bilesim: a) bir nükleik asit probuna hibridizasyona yönelik bir prob sarici, burada prob sanci bir birinci prob sanci segment ve birinciye göre akis asagi olan bir ikinci prob sarici segment ihtiva eder,- ve b) bir hedefdiziyi tespit etmeye yönelik bir nükleik asit probu, burada prob bir FRET çiftini ihtiva eder, burada söz konusu prob bir birinci prob segmenti ve birinci prob segmente göre akis asagi bir ikinci prob segmentini ihtiva eder; burada birinci prob sarici segmentin dizisi, birinci prob segmenti dizisinin ters komplementine göre %90 ila %96 homologtur, ve burada ikinci prob sarici segmentin dizisi ikinci prob segmenti dizisinin ters komplementine göre %90 ila %96 homologtur.