TR201809609T4 - Aminotiazin bileşikleri. - Google Patents

Abstract

Bu buluş, Formül I'e sahip bir bileşiği veya farmasötik olarak uygun bir tuzunu sağlar.

Description

TARIFNAME AMINOTIAZIN BILESIKLERI Bu bulus yeni aminotiazin bilesiklerine, bilesikleri içeren farmasötik bilesimlere, fizyolojik bozukluklarin tedavisinde kullanima yönelik bilesiklere ve bilesiklerin sentezinde kullanilabilen ara ürünlere ve islemlere iliskindir.

Bu bulus, amiloid öncü proteinin (APP) nörotoksik ve yüksek topaklanma özelligine sahip bir peptid segmenti olan amiloid ß (Abeta) peptidinin yol açtigi Alzheimer hastaliginin ve diger hastalik ve bozukluklarin tedavisi alanindadir. Alzheimer hastaligi, dünya çapinda milyonlarca hastayi etkileyen yikici bir nörodej eneratif bozukluktur. Piyasada bulunan, hastaya sadece geçici semptomatik yararlar saglayan halihazirda onaylanmis maddeler göz önüne alindiginda, Alzheimer hastaliginin tedavisinde önemli bir karsilanmamis gereksinim Alzheimer hastaligi, beyinde Abeta olusumu, topaklanmasi ve çökelmesi ile nitelenir. ß- sekretazin (ß-bölgesi amiloid öncü proteinini bölme enzimi; BACE) tamamen veya kismen engellenmesinin, fare modellerinde plak baglantili ve plaka bagimli patolojiler üzerinde dikkate deger bir etkisi oldugunu göstermistir; bu, Abeta peptidleri seviyelerinde küçük azalmalarin dahi, plak yükünde ve sinaptik eksiklikte uzun süreli önemli bir azalmaya neden olabilecegini, böylece özellikle Alzheimer hastaliginin tedavisinde, önemli terapötik yararlar saglayabilecegini akla getirmektedir. nörodejeneratif hastaliklarin tedavisinde kullanilabilen BACE inhibitörleri olan izotiyoüre türevlerini açiklar. 8,158,620 sayili ABD Patenti, BACE inhibitör aktivitesine sahip olan ve ayrica, Alzheimer tipi demans gibi, Abeta peptidinden kaynaklanan bir nörodejeneratif hastalik için faydali terapötik maddeler olarak belirtilen kaynasmis aminodihidrotiazin türevlerini açiklar.

Merkezi sinir sistemi (CNS) penetrasyonuna sahip BACE inhibitörlerinin, Alzheimer hastaligi gibi Abeta peptidi aracili bozukluklarin tedavisini saglamasi istenmektedir. Bu bulus, BACE inhibitörleri olan bazi yeni bilesikleri saglamaktadir. Buna ek olarak bu bulus, CNS'ye nüfuz eden, gelismis bir yan etki profiline ve gelismis çözünürlük gibi gelismis fizikokimyasal özelliklere sahip bazi yeni bilesikler saglar.

Bu dogrultuda bu bulus, asagidaki Forinül I'e sahip bir bilesigi: veya farmasötik olarak uygun bir tuzunu saglar.

F4<\:NI>IN Â Formü|l Bu bulus ayrica, BACE inhibisyonunda kullanima yönelik Formül I'e sahip bir bilesigi veya farmasötik olarak uygun bir tuzunu saglar.

Bu bulus ayrica, amiloid öncü proteinin BACE aracili bölünmesinin inhibisyonunda kullanima yönelik Formül I'e sahip bir bilesigi veya farmasötik olarak uygun bir tuzunu Bu bulus ayrica, Abeta peptidi üretiminin inhibisyonunda kullanima yönelik Formül l'e sahip bir bilesigi veya farmasötik olarak uygun bir tuzunu saglar.

Buna ek olarak bu bulus, tedavide kullanima yönelik Formül I'e sahip bir bilesigi veya farmasötik olarak uygun bir tuzunu saglar. Buna ek olarak bu bulus, Alzheimer hastaliginin tedavisinde kullanima yönelik Formül I'e sahip bir bilesigi veya farmasötik olarak uygun bir tuzunu saglar. Bu bulus, hafif bilissel bozuklugun Alzheimer hastaligina ilerlemesinin önlenmesinde kullanima yönelik Formül I'e sahip bir bilesigi veya farmasötik olarak uygun bir tuzunu saglar. Bundan baska bu bulus, Formül I'e sahip bir bilesigin veya farmasötik olarak uygun bir tuzunun, Alzheimer hastaliginin tedavisine yönelik bir ilacin üretimi için kullanilmasini saglar. Bu bulus ayrica, Formül l'e sahip bir bilesigin veya farmasötik olarak uygun bir tuzunun, hafif bilissel bozuklugun Alzheimer hastaligina ilerlemesinin önlenmesine yönelik bir ilacin üretimi için kullanilmasini saglar.

Bulus ek olarak, Formül I'e sahip bir bilesik veya farmasötik olarak uygun bir tuzu ile bir veya birden çok farinasötik olarak uygun tasiyici madde, seyreltici madde veya eksipiyan içeren bir farmasötik bilesim saglar. Özel bir düzenlemede bilesim ek olarak, bir veya birden çok baska terapötik madde içerir. Bu bulus, Formül I'e sahip bilesiklerin sentezi için yeni ara ürünleri ve islemleri de kapsar. hafif bilissel bozuklugun Alzheimer hastaligina ilerlemesinin yavaslatilmasini, durdurulmasini veya geri döndürülmesini içerir.

Burada kullanildigi sekliyle "tedavi etme" veya "tedavi etmek" terimleri, mevcut bir semptomun veya bozuklugun ilerlemesinin veya siddetinin yavaslatilmasim, durdurulmasini veya geri döndürülmesini içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, "hasta" terimi bir insani belirtir. seviyelerinin azaltilmasi anlamina gelir.

Burada kullanildigi sekliyle "etkili miktar" terimi, bulusun bilesiginin veya farmasötik olarak uygun bir tuzunun, hastaya tek veya birden çok dozun uygulanmasi üzerine, teshis veya tedavi altindaki hastada istenen etkiyi saglayan miktarina veya dozuna atifta bulunur.

Etkili bir miktar, teknikte uzman kisi olarak teshis uzmanina giderek, bilinen teknikler kullanilarak ve benzer durumlarda elde edilen sonuçlar gözlemlenerek kolaylikla belirlenebilir. Bir hasta için etkili miktar belirlenirken gidilen teshis uzmani tarafindan, sayilanlarla sinirli olmamak kaydiyla belirli sayida faktör dikkate alinir: hastanin türü; boyutu, yasi ve genel saglik durumu; ilgili spesifik hastalik veya bozukluk; hastaligin veya bozuklugun ilerleme veya siddet derecesi; bireysel hastanin tepkisi; uygulanan özel bilesik; uygulama sekli; uygulanan preparatin biyoyararlanim özellikleri; seçilen doz rejimi; es zamanli ilaç kullaniini ve diger ilgili kosullar.

Bu bulusun bilesikleri, genellikle genis bir dozaj araliginda etkilidirler. Örnegin, günlük dozajlar normal olarak yaklasik 0,01 ila yaklasik 20 mg/kg vücut agirligi araligi içinde kalir.

Bazi durumlarda yukarida belirtilen aralik yeterli dozajdan fazla olabilir, baska durumlarda ise daha da büyük dozlar kabul edilebilir yan etkilerle kullanilabilir ve dolayisiyla yukaridaki dozaj araligi, bulusun kapsamini herhangi bir sekilde sinirlamaya yönelik degildir.

Bu bulusun bilesikleri tercihen, herhangi bir yolla uygulanabilen farmasötik bilesimler olarak formüle edilir; bu ise bilesigi, oral ve parenteral yollar dahil biyolojik olarak yararlanilabilir kilar. En çok tercih edilen sekliyle bu bilesimler, oral uygulamaya yöneliktir. Bu gibi farmasötik bilesimler ve bunlari hazirlamak için islemler teknikte iyi bilinmektedir (Bakiniz örnegin, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21nci Baski, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

Formül I'e sahip bilesikler, burada açiklanan bozukluklarin tedavisinde özellikle yararlidir; ancak Formül I'e sahip bilesikler için bazi gruplar, sübstitüentler ve konfigürasyonlar tercih edilir. Asagidaki paragraflar, tercih edilen bu tür gruplari, sübstitüentleri ve konfigürasyonlari açiklamaktadir. Bu tercihlerin hem bulusun kullanimlarina, hem yeni bilesiklerine uygulanabilecegi anlasilacaktir.

Asagidaki formüle sahip bilesigin cis konfigürasyonu: H3CO N veya farmasötik olarak uygun bir tuzu tercih edilir. 7a-i1]-4-piridil]-5-met0ksi-pirazin-2-karboksamit veya bunun farmasötik olarak uygun bir tuzu daha çok tercih edilir. 7a-i1]-4-piridil]-5-metoksi-pirazin-Z-karboksamit özellikle tercih edilir.

Teknikte siradan uzmanlik sahibi bir kisi bulusun bilesiklerinin, asagidaki Sema A'da gösterildigi gibi, iki kiral merkez içeren bir çekirdekten olustugunu degerlendirecektir: H3CO N Bu bulusun, söz konusu bilesiklerin tüm münferit enantiyomerlerinin veya diasteromerlerinin yanisira, rasematlar dahil söz konusu bilesiklerin enantiyomerlerinin karisimlarini öngörrnesine karsin, Sema A'da gösterilen 1 ve 2 ile isaretlenmis karbon atomlarinda mutlak konfigürasyona sahip bilesikler, bulusun tercih edilen bilesikleridir.

Teknikte siradan uzmanlik sahibi bir kisi bulusun bilesiklerinin, Sema B'de gösterildigi gibi, totomerik formlarda bulunabilecegini degerlendirecektir. Bu patent basvurusunda, bulusun bilesiklerinin spesifik totomerlerinden birine herhangi bir referans verildiginde, hem totomerik formlarini, hem bunlarin tüm karisimlarini kapsadigi anlasilmalidir.

H3CO N Bazi stereokimyasal merkezler, açiklik saglamak amaciyla belirtilmemis olarak birakilmistir ve preparatlarin ve örneklerin ögretisini herhangi bir sekilde sinirlamasi amaçlanmamistir.

Ayrica, münferit izomerler, enantiyomerler ve diastereomerler, teknikte siradan uzmanlik sahibi kisi tarafindan, seçici kristalizasyon teknikleri veya kiral kromatografi gibi usuller vasitasiyla, Formül I'e sahip bilesiklerin sentezinin uygun herhangi bir noktasindan ayrilabilir veya ayristirilabilir (Bakiniz örnegin, J . Jacques, ve digerleri, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981 ve E.L. Eliel and S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). "Izomer 1" ve "izomer 2" adlandirmalari, kira] kromatografiden sirasiyla birinci ve ikinci ayristirilan bilesiklere atifta bulunur ve eger kiral kromatografi sentezde erken baslatilmissa, ayni adlandirma müteakip ara ürünlere ve örneklere uygulanir.

Buna ek olarak, asagidaki preparatlarda açiklanan bazi ara ürünler, bir veya birden çok azot koruyucu grup içerebilir. Degisken koruyucu grup, özel reaksiyon kosullarina ve uygulanacak özel dönüsümlere bagli olarak, her ortaya çikista ayni veya farkli olabilir. Koruma ve korumanin kaldirilmasi kosullari teknikte uzman kisilerce iyi bilinmektedir ve literatürde açiklanmistir (Bakiniz örnegin, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

Bazi kisaltmalar asagidaki gibi tanimlanmistir: "APP", amiloid öncü proteini belirtir; belirtir; "F12", Ham F 12 ortamini belirtir; "FBS", Fetal Sigir Serumunu belirtir; "FRET", floresans rezonansiyla enerji transferini belirtir; "HB-PS", HEPES-tamponlanmis fizyolojik tuzlu suyu belirtir; "HEK", insan embriyonik böbregi belirtir; "HEPES", 2-[4-(2- hidroksietil)piperazin-1-il]etansülfonik asidi belirtir; "HPLC", yüksek performansli sivi kromatografisini belirtir; "lC5d', bir maddenin mümkün olan maksimum inhibitör yanitinin % 50'sini üreten konsantrasyonunu belirtir; "JohnPhos", ditert-bütil-(Z-fenilfenil)fosfani belirtir; trombosit kaynakli amiloid öncü proteini belirtir; "RFU", bagil Iloresans birimini belirtir; belirtir.

Bulusun bilesikleri veya bunlarin tuzlari, teknikte bilinen çesitli prosedürler vasitasiyla hazirlanabilir; bunlardan bazilari asagidaki Preparatlarda ve Örneklerde gösterilmistir. Formül sentetik asamalari farkli sekillerde birlestirilebilir. Asagidaki preparatlardaki ve ömeklerdeki her asamanin ürünleri, teknikte iyi bilinen geleneksel usullerle alinabilir; bu usuller, ekstraksiyon, buharlastirina, çökeltme, kromatografi, filtrasyon, toz haline getirme ve kristalizasyonu içerir. Reaktif maddeler ve baslangiç malzemeleri, teknikte siradan uzmanlik sahibi kisi tarafindan kolaylikla elde edilebilir.

Istege bagli bir asamada, Formül l'e sahip bir bilesigin farmasötik olarak uygun bir tuzu, örnegin bir hidroklorür tuzu, Formül I'e sahip uygun bir serbest bazin, uygun bir çözücü maddedeki uygun bir farmasötik olarak kabul edilebilir asitle standart kosullar altinda reaksiyonundan olusabilir. Buna ek olarak, bu tür tuzlarin olusumu, bir azot koruyucu grubun korumasinin kaldirilmasi üzerine es zamanli olarak gerçeklesebilir. Bu tür tuzlarin olusturulmasi teknikte iyi bilinmektedir ve takdir edilmektedir. Bakiniz örnegin, "Salt R.J., ve digerleri, "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical NeW S.M., ve digerleri, "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977).

Asagidaki preparatlar ve örnekler, bu bulusu daha fazla açiklamaktadir.

Preparat 1 (tert-Bütoksikarbonilamino) tert-bütil karbonat >roiro`NJLoJ< Hidroksilamin hidroklorür ( çözeltisinin bir karisimi, -5°C'a sogutulmustur. Heptan/MTBE'de (5:1, 1,1 L) bir çözelti olarak bulunan önceden sogutulmus (-5°C) bir di-t-bütildikarbonat (3,55 Kg, 16,3 mol), trietilamin (1,67 Kg, 16,5 mol) çözeltisi, 2 saat boyunca yavasça ilave edilmistir. Reaksiyon, - °C'ta 1 saat boyunca karistirilmis ve ardindan gece boyunca oda sicakligina isitilmis ve karistirilmistir. Katmanlar ayrilmis ve organik katman, doymus sulu amonyum klorür (2 L) ve doymus sulu sodyum klorür (1 L) çözeltisi ile iki kez yikanmis, sodyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve bir beyaz kati madde olarak kristalize olan bir yag verecek sekilde konsantre edilmistir. Kati madde, bir buz-su banyosu içinde heptan (1 L) ile karistirilmis ve baslik ürününü (1360,2 g, % 73) verecek sekilde filtre edilmistir. lH NMR (dö- Preparat 2 (tert-Bütoksikarbonil)-[(4-metoksifenil)metil]amino] tert-bütil karbonat Bir 20 L'lik reaktöre, azot altinda (tert-bütoksikarbonilamino) tert-bütil karbonat (812,9 g, 4-met0ksi-benzen ( yüklenmistir. Karisim gece boyunca 40°C'ta karistirilmistir. lH NMR analizi tamamlanmamis reaksiyon göstermistir. Ek potasyum NMR analizi, reaksiyonun hala tamamlanmamis oldugunu göstermistir. Ek potasyum karbonat (482 g, 3,49 mol) ilave edilmis ve karisim, 40°C'ta karistirilmistir. Gece boyunca reaksiyondan sonra lH NMR analizi, reaksiyonun tamamlandigini, baslangiç malzemeleri kalmadigini göstermistir. Su (5 L) ve MTBE (5 L) ilave edilmis ve katmanlar ayrilmistir.

Organik katman su (3x3 L) ile yikanmis, sodyum sülfat üzerinde kurutulmus ve baslik bilesigini ( 5 7,20 Preparat 3 N-[(4-Met0ksifenil)metil]hidroksilamin hidroklorür 1,4-di0ksan (2,8 L) içinde çözündürülmüs ve bir hidrojen klorür çözeltisi (dioksan içinde 4 M, 3,15 L, 12,4 mol), 1 saat 30 dakika boyunca damla damla ilave edilmistir. Çözelti gece boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Baslik ürünü, filtrasyon vasitasiyla bir beyaz kati Preparat 4 2-(Alil(tert-bütoksikarbonil)amino)asetik asit dimetilformamit ( ve 2-propen-1-amin (24 g, 426 mmol) içeren bir yuvarlak tabanli siseye, dimetilformamit (40 mL) içinde bir etil 2- bromoasetat (60,2 g, 360 mmol) çözeltisi damla damla ilave edilmistir. Reaksiyon, ortam sicakligina isitilmis ve 14 saat boyunca karistirilmistir. Kati maddeler filtrasyon vasitasiyla giderilmis ve dietil eter ile yikanmistir. Doymus sulu sodyum klorür çözeltisi (1 L) filtrata ilave edilmis ve katmanlar ayrilmistir. Sulu katman, dietil eter ile ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik fazlar birlestirilmis, magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve çözücü madde, bir kalinti verecek sekilde düsük basinç altinda giderilmistir. Ham kalintinin etanol (500 ml) ve trietilamin (40 g, 395 mmol) içinde OOC'taki bir çözeltisine, di-t- butildikarbonat (105 g, 467 ininol) tek kisim halinde ilave edilmistir. Reaksiyon, oda sicakligina isitilmis ve 14 saat boyunca karistirilmistir. Reaksiyon, düsük basinç altinda konsantre edilmis ve su ( ile seyreltilmis ve dietil eter ile ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik fazlar birlestirilmis, magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve bir kalinti verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Bu kalinti, metanol ( içine alinmis ve 2 N sodyum hidroksit ( ilave edilmistir. Elde edilen çözelti, 3 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Hacim, düsük basinç altinda yaklasik olarak 200 ml azaltilmis ve elde edilen çözelti, hidroklorik asit (12 N) kullanilarak pH 4'e asitlestirilmistir. Elde edilen soluk turuncu kati madde, filtrasyon vasitasiyla toplanmis, su ile yikanmis ve baslik bilesigini (50 g, % 65) Preparat 5 tert-Bütil N-alil-N-[2-(metoksI(metil)amino)-2-0kso-etil]karbamat 0°C'taki tetrahidrofurana (asetik asit (49,6 g, 156 mmol) ilave edilmistir. Reaksiyon, oda sicakliginda 3 saat boyunca karistirilmis ve ardindan 0°C'a sogutulmustur. Daha sonra N,O-dimetilhidr0ksilamin hidroklorür (28 g, 283 mmol), trietilamin (33 mL, 237 mmol) ve tetrahidrofuran ( ilave edilmistir. Buz banyosu kaldirilmis ve reaksiyon, oda sicakliginda 3 saat boyunca karistirilmis ve düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Elde edilen kati madde, suda çözündürülmüs ve etil asetat ile ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik fazlar birlestirilmis, sodyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve çözücü madde, bir kalinti verecek sekilde düsük basinç altinda giderilmistir. Kalinti, heksanda % 0-50'lik aseton gradyani ile ayristirilarak, baslik bilesigini (32 g, % 54) verecek sekilde silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. Iki Preparat 6 4-Kloro-N-metoksi-N-metil-piridin-2-karboksamit (silis jeli kurutma borusu kullanilmistir) susuz diklorometanda ( süspansiyon haline getirilmistir. Elde edilen çözelti 0°C'a sogutulmus ve N-metilmorfolin (, edilmistir. Bu ilave islemi bittikten sonra, reaksiyon oda sicakligina isitilmis ve gece boyunca karistirilmistir. Su ( ilave edilmis ve katmanlar ayrilmistir. Sulu katman, diklorometan ( ile yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik katmanlar birlestirilmis, tuzlu su ( ile yikanmis ve susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur. Çözücü madde, koyu bir yag verecek sekilde düsük basinç altinda giderilmistir. Bu, izoheksanda % 0-50'lik etil asetat gradyani kullanilarak, baslik bilesigini (23,7 g, % 46) verecek sekilde silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS (m/e) 201/203.

Preparat 7 1-(4-Klor0piridin-2-il)etanon Susuz tetrahidrofurana (, azot altinda karistirilarak metil magnezyum bromür (dietil tetrahidrofuran ( içindeki bir çözeltisi, sicaklik 0 ve -15°C arasinda tutularak 20 dakika boyunca damla damla ilave edilmistir. Bu ilave tamamlandiktan sonra, reaksiyon 0°C'ta 45 dakika boyunca karistirilmistir. Reaksiyon daha sonra -15°C'a sogutulmus ve dikkatle damla damla su ( ilave edilerek, yavasça söndürülmüstür. Doymus sulu amonyum klorür çözeltisi ( ilave edilmistir. Katmanlar ayrilmis ve sulu katman, dietil eter ( ile iki kez yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur. Birlestirilmis organik hülasalar susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve çözücü madde, bir sari yag (18,6 g) halinde baslik bilesigini verecek sekilde, düsük basinç altinda giderilmistir. ES/MS .

Preparat 8 2-Bromo-1-(4-kloro-2-piridil)etanon çözündürülmüstür. Bir hidrojen bromür çözeltisi (asetik asitte % 32) (34 mL) ilave edilmis, ardindan yavasça brom ( ilave edilmistir. Elde edilen çözelti 3,5 saat boyunca 75°C'a isitilmis ve ardindan hemen bir buz banyosunda sogutulmustur. Sogutulmus reaksiyon karisiinina, çözeltinin pH'ini 7'ye ayarlamak için, karistirilarak doymus sulu sodyum hidrojen karbonat (1 L), ardindan kati sodyum hidrojen karbonat yavasça ilave edilmistir. Daha sonra etil asetat ( ilave edilmis ve katmanlar ayrilmistir. Sulu katman, etil asetat (3 X ile yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik hülasalar birlestirilmis, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve bir kahverengi kristal yapili kati madde verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Izole edilen kati madde, izoheksan ile toz haline getirilmis ve baslik bilesigini (21 g) verecek sekilde, vakum altinda daha çok kurutulmustur. Izoheksanda kalan ürün, baslik ürününden ek ,5 g verecek sekilde, izoheksan gradyaninda % 0 ila 40 diklorometan kullanilarak, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla geri kazanilir; böylece 26,5 g, % 72'lik bir birlesik verim elde edilir. ES/MS (in/e) 234/.

Preparat 9 1-(4-Kloro-2-piridil)-2-(dialilamin0)etan0n N-Alilprop-Z-en-l -amin (15,8 g, 158,2 mmol), karistirilarak azot altinda susuz tetrahidrofuranda ( ilave edilmis ve elde edilen çözelti 0°C'a sogutulmustur. 2-brom0-1-(4-kloro-2-piridil)etanonun (26,5 g, 113,0 mmol) susuz tetrahidrofurandaki ( bir çözeltisi damla damla ilave edilmistir (bu ilave sirasinda, reaksiyonun rengi renksizden sariya, turuncuya ve sonunda kirmiziya dönüsmüstür). 1,5 saat sonra su ( ilave edilmis ve çözücü madde, düsük basinç altinda giderilmistir. Elde edilen sulu çözelti, etil asetat (5>< ile ekstraksiyona tabi tutulmustur. Birlestirilen organik hülasalara susuz sodyum sülfat ilave edilmistir. Elde edilen süspansiyon, ince bir silika jel ve diatom topragi yastigindan filtre edilmistir. Yastik etil asetat (1 L) ile yikanmistir. Filtrat daha sonra, baslik bilesigini (23,6 g) verecek sekilde düsük basinç altinda konsantre edilmistir. ES/MS (m/e) . Bu ara ürün sinirli stabiliteye sahiptir, depolanmaz ve ek saflastirmaya tabi tutulmadan dogrudan kullanilir.

Preparat 10 c] izoksazol susuz tolüende (metil] hidroksil amin hidroklorür (27,9 g, 146,9 mmol), trietilamin ( etoksit ( ardisik olarak ilave edilmistir. Elde edilen reaksiyon karisimi, azot altinda 70°C`a isitilmistir. 8 saat sonra reaksiyon sogutulmus ve bir hafta sonu boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Daha sonra dietil eter (l 1) ve su ( ilave edilmistir. Çökelen kati madde, bir diatom topragi yastigi vasitasiyla filtre edilmistir. Yastik, dietil eter ( ile yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur. Birlestirilen organik fazlar, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmus ve bir kahverengi yag verecek sekilde filtre edilmistir. Bu, kloroformda bir % 0 ila 20'lik tetrahidrofuran gradyani kullanilarak, baslik bilesigini bir soluk kahverengi yag (17,5 g, % 40) halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS (m/e) 386/388 Preparat l 1 c] izoksazol-S-karboksilat c]izoksazol (1 7,5 g, 45,35 mmol), karistirilarak azot altinda susuz diklorometanda ( çözündürülmüstür. N,N-Dimetilbarbitürik asit (38,24 g, 244,89 mmol) ve tetrakis(trifenilfosfin)paladyum (5,24 g, 4,53 mmol), bir azot akimi altinda ilave edilmis ve azot, birkaç dakika boyunca çözeltide fokurdatilmistir. Elde edilen çözelti daha sonra, azot altinda 2 saat boyunca 30°C'a isitilmistir. Ardindan reaksiyon, oda sicakligina sogutulmustur. ve elde edilen karisim, 2 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, kehribar renginde yari kati bir madde verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir; bu madde daha sonra, etil asetat ( içinde yeniden çözündürülmüstür. Elde edilen çözelti, doymus sulu sodyum bikarbonat çözeltisi (2>< ile yikanmistir. Organik faz, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve koyu bir yag verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Yag, izoheksan gradyaninda % 0 ila 70'lik etil asetat kullanilarak, baslik bilesigini sari bir köpük (14,8 g, % 73) halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS (m/e) .

Preparat 12 tert-Bütil N-alil-N-[2-(4-kloro-2-piridil)-2-0kso-etil]karbamat -10°C'ta (metanol buz banyosu) azot altinda olan bir karistirilmis tetrahidrofuran çözeltisine mmol) tetrahidrofuran (60 mL) içindeki bir çözeltisi, ilave islemi sirasinda sicakligin 0°C`in üzerine çikmamasi saglanarak, damla damla ilave edilmistir. 40 dakika sonra çözelti, açik turuncu renklidir ve sicakligin 0°C'1n üzerine çikmamasi saglanarak, tetrahidrofuran (27 mL) mmol) yeniden ilave edilmistir. Ilave islemi tamamlandiktan sonra, elde edilen kahverengi renkli çözelti, oda sicakligina sogumaya birakilmistir. 2 saat sonra, doymus sulu amonyum klorür çözeltisi, ardindan küçük hacimde su ilave edilerek reaksiyon söndürülmüstür. Etil asetat ilave edilmis ve katmanlar ayrilmistir. Sulu katman, etil asetat (4X) ile yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik katmanlar birlestirilmis, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve kahverengi bir yag verecek sekilde konsantre edilmistir.

Ham ürün, izoheksan gradyaninda % 0 ila 30 etil asetat kullanilarak, baslik bilesigini bir açik soluk sari yag (10,1 g, % 66) halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS (ni/e) .

Preparat 13 c] izoksazol-S-karboksilat Tolüende (-2- 34,12 mmol) ve titanyum (IV) etoksit ( ilave edilmistir. Elde edilen çözelti, azot altinda 70°C'a isitilmistir. 3,5 saat sonra reaksiyon, oda sicakligina sogutulmustur. Su ve etil asetat ilave edilmis ve elde edilen süspansiyon, diatom topragindan filtre edilmistir. Diatom topragi yastigi etil asetat ile iyice yikanmistir. Fazlar ayrilmis ve organik faz tuzlu su ile yikanmis, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve turuncu bir yag verecek sekilde konsantre edilmistir. Yag, izoheksan gradyaninda % 0 ila etil asetat kullanilarak, baslik bilesigini (11,72 g, % 81) açik sari bir yag halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS (m/e) .

Preparat l4 c] izoksazol-5 -karboksilat Tolüene (metil]-3,3a,4,6- mmol), tris(dibenzilidenaseton)dipaladyum (0) (3,0 g, 3,2 mmol), benzofenon imin (7,4 mL, 42,3 mmol) ve sodyum t-bütoksit (6,1 g, 63,4 mmol) birlikte ilave edilmistir. Elde edilen karisim, bir azot gazi atmosferi altinda sivi azot ile dondurularak gazdan tamamen arindirilmis ve ardindan, bir su banyosunda vakum altinda oda sicakligina eritilmistir. Islem 4 kez tekrarlanmistir. Reaksiyon daha sonra, azot altinda karistirilarak 1,5 saat boyunca 75°C`a isitilmistir. Reaksiyon oda sicakligina sogutulmus ve etil asetat ile seyreltilmistir. Elde edilen süspansiyon, bir diatom topragi yastigi vasitasiyla filtre edilmis ve yastik, etil asetat ile iyice yikanmistir. Çözücü maddeler, ara ürün olarak imin verecek sekilde buharlastirilmistir. Bu, metanol ( ve hidroksilamin hidroklorür (5,9 g, 84,6 mmol) ilave edilmistir. Elde edilen karisim daha sonra, 1,5 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon sulu sodyum hidrojen karbonat ile söndürülmüs ve metanol düsük basinç altinda giderilmistir. Geriye kalan sulu katman bundan sonra, etil asetat (2x) ile ekstraksiyona tabi tutulmustur. Birlestirilen organik katmanlar tuzlu su ile yikanmis, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve turuncu bir yag verecek sekilde düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Ham ürün, diklorometanda % 0 ila 10'luk metanol çözeltisi içinde bir 2 M amonyak gradyani kullanilarak, baslik bilesigini kahverengi bir sakiz ve ürünü içeren karisik fraksiyonlar halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. Karisik fraksiyonlar birlestirilmis ve dikloroinetan içinde metanol çözeltisinde % 0 ila 5'lik bir 2 M amonyak gradyani kullanilarak, baslik bilesigini (6,72 g, % 75) açik kahverengi bir kati madde halinde ek ürün verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi kullanilarak, iki parti halinde ayrica saflastirilmistir. ES/MS (m/e) .

Preparat 15 c] izoksazol-5 -karboksilat c]izoksazol-S-karboksilat (3,06 g, 7,17 mmol) 250 mL'lik bir balonun içine konulmus ve karistirilarak azot altinda etil asetat (16 mL) ilave edilmistir. Elde edilen süspansiyona, 1- propanfosfonik asit siklik anhidrür (etil asetat içinde 2 agirlikça % 50) (11 mL, 17,92 mmol), trietilamin ( ilave edilmistir. Elde edilen çözelti, azot altinda 75 °C'a isitilmistir. 1 saat sonra reaksiyon, oda sicakligina sogutulmustur. Etil asetat ve doymus sulu sodyum hidrojen karbonat çözeltisi ilave edilmistir.

Katmanlar ayrilmis ve sulu faz, etil asetat (2x) ile yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur.

Birlestirilen organik katmanlar, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve baslik ürününü, kehribar renginde bir köpük (3,1 1 g, % 92) halinde verecek sekilde konsantre edilmistir. ES/MS (m/e) .

Preparat 16 c]izoksazol-S-karboksilat (3,11 g, 6,64 mmol), karistirilarak tritlorasetik asidin (10 mL) içine alinmis ve elde edilen çözelti 50°C'a isitilmistir. 1,5 saat sonra reaksiyon sogutulmus ve düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Elde edilen koyu yag, diklorometan/metanol çözeltisinde yeniden çözündürülmüs ve iki iyon degistirme kolonuna (25 g) yüklenmistir. Malzeme metanol, ardindan metanol çözeltisinde 2 M amonyak ile ayristirilmistir. Temel fraksiyon, yogun bir kahverengi yag (1,71 g, % 88) verecek sekilde düsük basinç altinda konsantre edilmistir. ES/MS (m/e) .

Preparat 17 karboksilat mmol) diklorometan (susuz) (13 mL) içinde karistirilarak çözündürülmüs ve di-t- bütildikarbonat (1,28 g, 5,86 mmol), ardindan trietilamin ( ilave edilmistir. Elde edilen çözelti, 1 saat 45 dakika boyunca oda sicakliginda karistirilmistir.

Reaksiyon diklorometan ile seyreltilmis ve tuzlu su ila yikanmistir. Organik katman susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve baslik ürününü, soluk sari bir köpük (2,05 g, niceliksel) halinde verecek sekilde, düsük basinç altinda buharlastirilmistir. ES/MS Preparat 1 8 c] izoksazol-S-karboksilat karboksilat (2,05 g, 5,88 mmol), azot altinda karistirilarak susuz tetrahidrofuran ( içinde çözündürülmüstür. Benzoil izotiosiyanat ( ilave edilmis ve reaksiyon, oda sicakliginda azot altinda karistirilmistir. 2 saat sonra reaksiyon soluk sari bir yag verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Yag, izoheksanda bir % 20 ila halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS Preparat 19 1 -karboksilat c]izoksazol-S-karboksilat (2,14 g, 3,86 mmol), etanol (40 mL) içinde çözündürülmüs ve büyük bir Parr hidrojenleme sisesine konulmustur. Bir azot atmosferi altinda paladyum hidroksit (karbon üzerinde agirlikça % 20, 877 mg) ilave edilmis ve ardindan bir Parr hidrojenleme aygitina konulmus ve 50 psi'de 24 saat boyunca hidrojenlenmistir. Reaksiyon süspansiyonu etanol ile seyreltilmis ve diatom topragi vasitasiyla filtre edilmistir. Yastik etil asetat ile yikanmistir. Birlestirilen filtratlar, baslik ürününü (2,03 g, % 96) verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir; bu ürün, ek saflastirmaya tabi tutulmadan kullanilmistir. ES/MS (m/e) .

Alternatif Preparat 19 4,08 mmol) susuz tetrahidrofuran (27 mL) içinde çözündürülmüstür. Benzoil izotiosiyanat ( ilave edilmis ve elde edilen karisim, oda sicakliginda azot altinda 2 saat boyunca karistirilmistir. Çözücü madde daha sonra, sari bir kati köpük verecek sekilde, düsük basinç altinda giderilmistir. Bu malzeme, izoheksan gradyaninda % 0 ila 100 etil asetat kullanilarak, baslik bilesigini beyaz bir kati madde (2,1 g, niceliksel) halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla satlastirilmistir. ES/MS (in/e) .

Preparat 20 tert-Bütil 3 -(4-asetamido-2-piridil)-3-amino-4-(hidr0ksimetil)pirolidin- 1 -karboksilat karboksilat (2,026 g, 5,82 mmol) sonikasyon vasitasiyla etanol ( içinde çözündürülmüstür. Elde edilen çözelti, 85 bar basinçta ve % 100 hidrojen üretimi ile çalisan bir akim hidroj eneratöründe, karbon midi kartusu üzerinde desteklenen paladyum hidroksitten (agirlikça % 20), 70°C'ta 3 ml/dakika da iki kez geçirilmistir. Etanol, baslik bilesigini ek saflastirma uygulanmadan kullanilan, düsük düzeyde safsizliklar içeren beyaz bir köpük (1,98 g) halinde verecek sekilde, düsük basinç altinda giderilmistir. ES/MA (m/e) .

Preparat 21 Rasemik (cis)-tert-Bütil 7a-(4-asetamido-2-piridil)-2-benzamid0-4,4a,5,7- tetrahidropirolo[3,4-d] [1 ,3]tiazin-6- karboksilat Tetrahidrofuran (80 mL) içinde karistirilmis bir tert-bütil 3-(4-asetamido-2-piridil)-3- (benzoilkarbamo tioilamin0)-4-(hidr0ksimetil)pirolidin-l-karbamat çözeltisine (5,16 g, 8,53 çözelti oda sicakliginda karistirilmistir. 4 saat sonra ek olarak 1,1'-karb0nildiimidazol (968,52 mg, 5,97 mmol) ilave edilmis ve reaksiyona, oda sicakliginda devam edilmistir. Ek 3,5 saat sonra, imidazol ekleme ara ürünü tam olarak olusmustur, (ES/MS . Bu durumda reaksiyon 75°C'a isitilmis, bir silis jeli kurutma borusu kullanilarak nem giderilmis ve karisim gece boyunca karistirilmistir. Reaksiyon oda sicakligina sogutulmus ve etil asetat ile seyreltilmistir. Elde edilen çözelti su ile yikanmis, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve sari bir yag verecek sekilde düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Kalinti, izoheksan içinde % 0 ila 100'lük bir etil asetat gradyani kullanilarak, baslik bilesigini (3,31 g, % 78) açik sari bir kati madde halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS (in/e) .

Preparat 22 HNIÄNJOKC 2-il]benzamit süspansiyon haline getirilmistir. TriIloroasetik asit (, açik bir çözelti verecek sekilde ilave edilmistir. Çözelti oda sicakliginda 2 saat boyunca karistirilinis ve çözücü madde düsük basinç altinda giderilmistir. Elde edilen kalinti, metanol içinde yeniden çözündürülmüs ve bu çözelti bir iyon degistirme kolonuna (50 g) yüklenmistir. Kolon metanol (3 kolon hacmi) ile, ardindan metanol çözeltisinde (3 kolon hacmi) 2 M amonyak ile ayristirilmistir. Temel yikamalar birlestirilmis ve baslik bilesigini (2,90 g, niceliksel) verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir. ES/MS (m/e) .

Preparat 23 tetrahidropirolo[3 ,4-d] [1 ,3]tiazin-2-il]benzamit 1,4-di0ksan (- -Ilor0-2-klor0pirimidin ( ilave edilmistir. Elde edilen çözelti, 18 saat boyunca 100°C'ta karistirilarak nemi giderilmistir.10 Çözücü madde, kahverengi bir yag verecek sekilde düsük basinç altinda giderilmistir. Kalinti, izoheksan içinde % 0 ila 100'lük bir etil asetat gradyani kullanilarak, baslik bilesigini (2,60 g, saflastirilmistir. ES/MS (m/e) .

Preparat 24 d][1,3]tiazin-2-amin Bir metanol (-6-(5-Iloropirimidin- lityum hidroksit (1,3 g, 52,8 mmol) ilave edilmistir. Reaksiyon, 8 saat boyunca 70°C'a isitilmis ve ardindan, gecenin geri kalaninda oda sicakliginda tutulmustur. Bu süre içinde beyaz bir kati madde çökelmis ve filtrasyon vasitasiyla toplanmistir. Filtre edilen kati madde, az miktarda metanol ile yikanmis ve baslik bilesigini (1,1 g, % 59) verecek sekilde kurutulmustur. ES/MS . Filtratta kalan madde, iyon degisim kromatografisi kullanilarak geri kazanilmistir. Metanol filtrati iyon degistirme kolonuna dogrudan yüklenmis (50 g) ve inetanol (3 kolon hacmi), ardindan metanol çözeltisi içinde 2 M amonyak (3 kolon hacmi) ile ayristirilmistir. Temel eluent, baslik bilesiginden % 70 saflikta ek 700 g verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir. ES/MS .

Preparat 25 tetrahidropirolo[3,4-d] [l ,3]tiazin-2-il]karbamat çözeltisine, diklorometan (9 mL) içinde di-t-bütildikarbonat (1,16 g, 5,30 mmol) ilave edilmistir. Süspansiyon bir hafta sonu boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, diklorometan ve tuzlu su çözeltisi arasinda bölünmüstür. Organik faz ayrilmis ve daha fazla tuzlu su çözeltisi ile yikanmistir. Organik katman, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve sari bir yag verecek sekilde düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Kalinti, diklorometan içinde metanoldeki bir % 0 ila 5'lik 2 M amonyak gradyani kullanilarak, baslik bilesigini (rasemat, 1,60 g, % 20 kalinti dimetilformamit/ diklorometan ile birlikte) ek saflastirmaya tabi tutulmadan kullanilan açik bir sakiz halinde verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS (m/e) .

Preparat 26 flnîgißk (8 mL) içinde çözündürülmüstür. Ardindan, l-propanfosfonik asit siklik anhidrür (etil asetat çözeltisinde 2 agirlikça % 50) ( ve 5- metoksipirazin-2-karboksilik asit (454 mg, 2,95 mmol) ilave edilmistir. Elde edilen çözelti, azot altinda 1 saat 20 dakika boyunca 80°C'a isitilmistir ve daha sonra, oda sicakligina sogutulmustur. Karisim, etil asetat ve doymus sulu sodyum hidrojen karbonat çözeltisi ile seyreltilmis ve katmanlar ayrilmistir. Sulu katman, etil asetat ile yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik katmanlar birlestirilmis, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve kahverengi bir kati madde verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Kalinti, izoheksan içinde % 0 ila 75'lik bir etil asetat gradyani kullanilarak, baslik bilesigini (576 g, % 44) verecek sekilde, silisjeli kolon kromatografisi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS (m/e) .10 Preparat 27 {N gNANJLOJ< H3CO N Rasemik (cis)-tert-bütil N-[(4aR,7aR)-6-(5-floropirimidin-Z-il)-7a-[4-[(5-met0ksi pirazin-Z- vasitasiyla, bilesen enantiyomerlerine ayrilmistir; Mobil Faz: % 24 metanol (% 0,1 amonyak) % 76 COgg Akim: UV 220 nm'de 70 mL/dakika; 35°C; enjeksiyon basina 12 mg). Ayrisan ikinci izomer (izomer 2), baslik bilesigidir (207 mg, % 36). ES/MS (m/e) .

F{~/*”ÃÇANH, Bir diklorometan (14 mL) içinde rasemik (cis)-tert-bütil N-[6-(5-Ilor0pirimidin-2-i1)-7a-[4- i1]karbamat (487 mg, 837,30 umol) çözeltisine, tritloroasetik asit ( Ilave edilmis ve karisim, 1,5 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon diklorometan ile seyreltilmis ve doymus sulu sodyum hidrojen karbonat ila yikanmistir. Katmanlar ayrilmis ve sulu katman, diklorometan ile yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik katmanlar birlestirilmis, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve beyaz bir kati madde verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Kati madde, diklorometan içinde metanolde bir % 0 ila 5'lik 2 M amonyak gradyani kullanilarak, baslik bilesigini (126 mg, % 31) verecek sekilde, silis jeli kolon kromatografîsi vasitasiyla saflastirilmistir. ES/MS d][1,3]tiazin-7a-il]-4-piridil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamit H3CO N Bir diklorometan (6 mL) içinde tert-bütil N-[(4aR,7aR)-6-(5-floropirimidin-Z-il)-7a-[4-[(5- mmol) ilave edilmistir. Elde edilen çözelti, 1,5 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir.

Reaksiyon daha sonra, dikloroinetan ile seyreltilinis ve doymus sulu sodyum hidrojen karbonat çözeltisi ila yikanmistir. Katmanlar ayrilmis ve sulu katman, diklorometan ile yeniden ekstraksiyona tabi tutulmustur. Organik katmanlar birlestirilmis, susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis ve beyaz bir kati madde verecek sekilde, düsük basinç altinda konsantre edilmistir; bu madde, baslik bilesigini (186 mg, niceliksel) verecek sekilde, 35°C'ta 5 saat boyunca bir vakum firininda kurutulmustur. ES/MS (m/e) d][l,3]tiazin-7a-il]-4-piridil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamitin alternatif hazirlama sekli vasitasiyla bilesen enantiyomerlerine ayrilmistir; Mobil Faz: asetonitrilin metanole (metanol içinde 20 mM amonyak çözeltisi) orani 124; Akim: degisken UV dalga boyu saptamasinda 30 mL/dakika; enjeksiyon basina 8 mg). Ayrisan ikinci izomer, baslik bilesigidir (92 mg, % 73). ES/MS d][1,3]tiazin-7a-i1]-4-piridil]-5-metoksi-pirazin-2-karb0ksamit hidrokiorür H300 N asetonitril ( içinde çözündürülmüs, ardindan 0,] M sulu hidrojen klorür çözeltisi ( ilave edilmistir. Elde edilen çözelti gece boyunca bir dondurarak kurutma cihazina yerlestirilmis, baslik bilesigi beyaz bir kati madde (61 mg, % 51) halinde elde edilmistir. olusturacak sekilde, DMSO içinde hazirlanmistir. Stok çözeltisi, on noktali bir seyreltme egrisi elde edilecek sekilde, DMSO içinde seri olarak seyreltilmistir; nihai bilesik konsantrasyonlari, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanli bir levhada in vitro enzimatik ve tam hücre deneyierini yürütmeden önce, 10 uM ila 0,05 nM araligindadir. huBACEl Fc'nin Ekspresyonu ve Saflastirilmasi Insan BACE 1'i (erisim numarasi: AF 190725), RT-PCR vasitasiyla toplam beyin cDNA'sindan klonlanmistir. Amino asit dizileri #1 ila 460'a karsilik gelen nükleotit dizileri, cDNA kodlamasi insan IgGi (Fc)p01ipeptidine yerlestirilmistir (Vassar ve digerleri, Science, ve insan Fc'sinin huBACEl :FC olarak adlandirilan bu füzyon proteini, pJB02 vektörünün içinde olusturulmustur. Insan BACE1(1-460):Fc, (huBACElzFc) HEK293 hücrelerinin içine geçici olarak eksprese edilmistir. Her yapilanmadan 250 ug cDNA, Fugene 6 ile karistirilmis ve 1 litre HEK293 hücresine ilave edilmistir. Transfeksiyondan dört gün sonra kosullandirilmis ortam, saflastirma amaciyla toplanmistir. huBACEl :Fc, Protein A kromatogratisi vasitasiyla saflastirilmistir. Enzim, - 80°C'ta küçük alikuotlar halinde depolanmistir. (Bakiniz Yang, ve digerleri, J.

BACEl FRET Deneyi Test bilesiklerinin seri seyreltmeleri yukarida açiklandigi gibi hazirlanmistir. Bilesikler ayrica, KH2P04 tampon içinde 20x seyreltilmistir. Her seyreltmeden on uL, reaksiyon karisimini içeren, karsilik gelen bir düsük protein baglayici siyah levhanin A ila H sirasindaki her mg/mL Bovin Serum Albümin ve 15 uM FRET substrati) (Bakiniz Yang, ve digerleri, J. iyice karistirilmistir. Reaksiyonu baslatmak için, substrati ve test bilesigini içeren levhaya, KH:Fc'den (Bakiniz Vasser ve RFU'su, bir levha çalkalayicida kisaca karistirildiktan sonra uyarim dalga boyunda (355 nm) ve emisyon dalga boyunda (460 nm) kaydedilmistir. Reaksiyon levhasi, alüminyum folyo ila örtülmüs ve oda sicakliginda, 16 ila 24 saat boyunca karanlik nemli bir firinda tutulmustur.

Inkübasyonun sonunda RF U, zaman 0'da kullanilan ile ayni uyarim ve emisyon ayarlariyla kaydedilmistir. RFU'nun zaman 0'daki ve inkübasyon sonundaki farki, bilesik tedavisi altindaki BACE] 'in aktivitesini temsil eder. RFU farklari, inhibitör konsantrasyonuna karsi çizilmis ve bir egrinin, IC50 degerlerini elde etmek üzere, dört parametreli lojistik denklemine Örnek 2'nin bilesigi, temelde yukarida açiklandigi gibi test edilmis ve BACEl için 0,90 nM (± 0,36, n=10) Ortalama ± SEM'lik bir lC50 sergilemistir.

Bu veriler, Örnek 2'nin bilesiginin, saflastirilmis rekombinant BACEl in vitro enzim aktivitesini engelledigini göstermektedir.

Birincil Nöronal Deney PDAPP Beta-Sekretaz Aktivitesinin Inhibisyonunun ölçümü için tam hücre deneyi Bir dogrulayici tam hücre deneyi, PDAPP transgenik embriyonik farelerden üretilmis birincil Birincil kortikal nöronlar, Embriyonik Gün 16 PDAPP embriyolarindan hazirlanmis ve 96 hücre/kuyucuk). 2 gün in VitrO'dan sonra kültür ortami, B27 takviyesi ve 2 uM (nihai) Ara-C10 (Sigma, C] ile degistirilmistir. In vitro gün 5'te nöronlar, istenen konsantrasyonda inhibitörlerin (DMSO içinde seyreltilmis) mevcudiyetinde/ yoklugunda 24 saat boyunca 37°C'ta inkübe edilmistir. lnkübasyonun sonunda kosullandirilmis ortam, beta-sekretaz aktivitesi kaniti için örnegin Abeta peptidleri analizi vasitasiyla analiz edilmistir. Toplam Abeta peptidleri (Abeta l-X), monoklonal 266 bir yakalama antikoru ve biyotinlenmis 3D6 bildirim antikoru olarak kullanilarak, bir sandviç ELISA vasitasiyla ölçülmüstür. Alternatif olarak Abeta 1-40 ve Abeta 1-42 peptidleri, için bir yakalama antikoru olarak kullanilarak, bir sandviç ELISA vasitasiyla ölçülür. Hem Abeta 1-40, hem Abeta 1-42 ELISA'lar, bildirim antikoru olarak biyotinlenmis 3D6 kullanmistir (antikorlarin tanimi için bakiniz J ohnson-Wood ve digerleri, Proc. Natl. Acad. birakilan Abeta'nin konsantrasyonu, bu kosullar altinda BACEl aktivitesine karsilik gelir.

Abeta azaltma etkisi için IC50 degerlerini elde etmek üzere, 10 noktali inhibisyon egrisi çizilmis ve dört parametreli lojistik denklemine uymasi saglanmistir. Örnek 2'nin bilesigi, temelde yukarida açiklandigi gibi test edilmis ve asagidaki aktiviteyi sergilemistir. Abeta1_40'1 azaltmaya yönelik ICso = . Abetai-42'yi azaltmaya yönelik IC50 = .

Bu veriler, Örnek 2'nin bilesiginin, tam hücrelerde Abeta 1-40 ve Abeta1.42 üretimini engelledigini göstermektedir.

Claims (1)

1. ISTEMLER Asagidaki formüle sahip bir bilesik veya farmasötik olarak uygun bir tuzu: Istem l'e göre bilesik veya tuz olup, bu N-[2-[(4aR,7aR)-2-amin0-6-(5- metoksi-pirazin-2-karb0ksamittir. Istem 1 veya Istem Z'ye göre bilesik olup, bu N-[2-[(4aR,7aR)-2-amin0-6-(5- metoksi-pirazin-2-karb0ksamittir. Istem 1 ila 3'ten herhangi birine göre bir bilesik veya farmasötik olarak uygun bir tuzu olup, tedavide kullanima yöneliktir. Istem 1 ila 3'ten herhangi birine göre bir bilesik veya farmasötik olarak uygun bir tuzu olup, Alzheimer hastaliginin tedavisinde kullanima yöneliktir. Istem 1 ila 3'ten herhangi birine göre bir bilesik veya farmasötik olarak uygun bir tuzu ile birlikte bir veya birden çok farmasötik olarak uygun tasiyici madde, seyreltici madde veya eksipiyan içeren bir farmasötik bilesim.