TR201814974T4 - Zararlı böceklerle mücadele edilmesi için kullanılabilen farklı bakulovirüs türlerinin genomlarını içeren viryonları tıkayan virüs oklüzyon korlarının üretimi. - Google Patents
Zararlı böceklerle mücadele edilmesi için kullanılabilen farklı bakulovirüs türlerinin genomlarını içeren viryonları tıkayan virüs oklüzyon korlarının üretimi. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201814974T4 TR201814974T4 TR2018/14974T TR201814974T TR201814974T4 TR 201814974 T4 TR201814974 T4 TR 201814974T4 TR 2018/14974 T TR2018/14974 T TR 2018/14974T TR 201814974 T TR201814974 T TR 201814974T TR 201814974 T4 TR201814974 T4 TR 201814974T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- obs
- insect
- odvs
- virus
- genomes
- Prior art date
Links
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 title claims abstract description 128
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 123
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title claims abstract description 24
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 120
- 241000629719 Oat dwarf virus Species 0.000 claims abstract description 111
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 63
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 42
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 46
- 241000537219 Deltabaculovirus Species 0.000 claims description 25
- 241000701424 Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus Species 0.000 claims description 25
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 19
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 claims description 11
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 241000195505 Elvirus Species 0.000 claims description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims 2
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract description 44
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 abstract description 18
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 241000951889 Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 6
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 102100029325 ATP-dependent DNA helicase PIF1 Human genes 0.000 description 5
- 241000537221 Alphabaculovirus Species 0.000 description 5
- 101001125884 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Per os infectivity factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 101001125878 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Per os infectivity factor 2 Proteins 0.000 description 5
- 101001125842 Homo sapiens ATP-dependent DNA helicase PIF1 Proteins 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 4
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 241000726306 Irus Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229920002367 Polyisobutene Polymers 0.000 description 3
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001807 normal pulse voltammetry Methods 0.000 description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 3
- CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-m-cresol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1Cl CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001248697 Alaudidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241001213544 Aslia Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 206010060976 Bacillus infection Diseases 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000255791 Bombyx Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101150088096 Elob gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589950 Gemmata Species 0.000 description 1
- 241000948258 Gila Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005253 cladding Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000014105 formulated food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003621 irrigation water Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000019617 pupation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N triacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CC(O)=O ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/60—Isolated nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zararlı böceklerle mücadele etmek üzere kullanılabilen farklı bakulovirüs türlerinin genomlarını içeren viryonları tıkayan virüs oklüzyon korlarının üretimi. Farklı bakulovirüs türlerinin genomlarını eş zamanlı bir şekilde içeren, bakulovirüslerin karakteristiği olan yapısal ve morfolojik özelliklere sahip bir viral oklüzyon korunda (OB) tıkalı olan oklüzyon viryonlarının (ODVler) üretimine yönelik bir yöntem sunulmaktadır. Karışık genom ODV'leri ve OB'leri, iki veya ikiden fazla farklı bakulovirüs türleri kullanılarak böcek hücrelerini veya böcek konaklarını birlikte enfekte ederek üretilebilmektedir. Birlikte enfeksiyona, farklı bakulovirüslerin eş zamanlı inokülasyonu vasıtasıyla veya inokülasyonlar arasındaki bir süre aralığı ile ulaşılabilmektedir, bu da üretilen ODV'lerde ve OB'lerde her bir türün genomlarının farklı oranlarına neden olmaktadır. Üretilen OB'ler, bir insektisidin doğrudan hazırlanmaya veya büyük miktarlarda karışık genom ODV'lerini ve OB'lerini üretmek üzere, ayrıca zararlı böceklerle mücadele etmek için faydalı olan duyarlı böcekleri enfekte etmeye yönelik olarak kullanılabilmektedir.
Description
TEKNIK ALAN
Bulus, bakulovirüslerin belirli türlerine veya suslarlTila duyarllîrblan zararllîlböceklerin istilalarIlZl
kontrol etmek üzere biyolojik Insektisidlerin üretim ve kullanIi alanEile ilgilidir. Daha belirgin
olarak, bulus, aynEi/iryon içerisinde birlikte sarlHEblan en az iki farkIEbakulovirüs türünden
genomlarEiçeren karEUZJ virüs oklüzyon viryonlarII (ODV) üretimine yönelik ve/veya söz
konusu en az bir karlSIKJ virüs oklüzyon viryonunun tllZlandlgÜirüs oklüzyon korlarII (OB'ler)
üretilmesine yönelik bir yöntemin yanElle, bu tarz ODV'Ier ve OB'IerIe, bunlarEIiçeren
bilesimle ve zararIEliaöceklerle mücadele etmek üzere kullanliîiilarlîile ilgilidir.
ÖNCEKI TEKNIK
Bakulovirüsler (Bakuloviridae familyasD] tarIi ve tIi veya veteriner öneme sahip böcekler
dahil olmak üzere, çesitli böcek türlerinin dogal popülasyonlarIa önemli bir mortalite
faktörünü temsil eden böcek patojenlerdir. Bakulovirüsler, dört cinsten birisine
sIIîliandlElhîaktadlE Pulkanatlllârl a/faba/(u/ovi'rüs (nükleopolihedrovirüsler [NPV]),
Betabaku/ow'rûs (Pulkanatlilârl granulovirüsleri [GV]), Gammabaku/oi//rus (Çiftkanatlilârl
NPV'Ieri) ve De/tabacu/ow'rus (Zarkanatlllârl NPV'Ieri). Belirli bakulovirüsler, patojenesiteleri
(ölümcül doz metrikleri ile ölçüldügü gibi), virülans (öldürme hîmve endüstriyel bir ölçekte
biyolojik insektisidlerin temeli olarak gelisimlerine yol açan oklüzyon koru (OB) üretimi gibi
böcek öldürücü özelliklere sahiptir. Bu ürünler, zararlIZböceklerin kontrolünde basarIIJIbir
sekilde kullanilB1aktadlEI(Moscardi 1999). Bir biyolojik insektisid olarak bir alfabakulovirüs
kullanüârak zararlü böcek kontrolünün özellikle basarIIJJZI örnekleri, soyada Ant/camia
gemmata//s kontrolünü (Moscardi 1999) veya pamukta He/itoverpa arm/'gera kontrolünü (Sun
Bakulovirüslerin bir diger faydaIElözelligi, yüksek biyo güvenlik seviyeleri ve transgen
ekspresyon vektörleri olarak gelisimlerine yol açan in vitro sistemlerde hücre kültüründe özel
genlerin oldukça yüksek ekspresyonudur (Summers and Smith, 1987; van Oers, 2011). Çogu
bakulovirüs ekspresyon sistemi, Autographa ca/i'forni'ca MNPV kullan“ dayanmaktadlîl
(Rohrmann, 2008). Rekombinant bakulovirüsler (rBac) mevcut olarak insan dahil olmak üzere
daha büyük hayvanlarla paylastElglarEljönüsüm sonraslîbrotein modifikasyon sistemlerindeki
avantajlarlian dolayEl böcek hücrelerinde yüzlerce ökaryotik proteinin üretimi için
kullanilB1aktadlEl(Miller ve dig., 1997; Ahn ve dig., 2008). rBac tarafIan üretilen proteinler,
insan aslErII üretiminde (Harper ve dig., 2009; Kantoff ve dig., 2010; Madhan ve dig.,
2010), teshis araçlarII gelistirilmesinde ve son zamanlarda potansiyel gen tedavi vektörleri
olarak (Hitchman ve dig., 2011; Kaikkonen ve dig., 2011) bu virüslerin insektisidal
özelliklerini gelistirmek için (Jiang ve dig., 2008) islevsel çalismalarda (van Oers, 2011)
kullanilînaktadlü
Bakulovirüsler, böcek hücrelerinin çekirdeginde çogalan çift sarmal DNA virüsleridir. Dairesel
genom, virüs türlerine bagllîrblarak 80 ve 180 kbp arasIda degiskenlik göstermektedir ve bir
protein nükleokapsidde aslElEsarEIJIhale getirmek ve yogunlastIElnaktEmohrmann, 2008).
Nükleokapsid (NC), düzenleme ve olgunlasma esnasIa bir harici membranEédinmektedir,
bu da bakulovirüslerin prensip bulaslEEl/aruglEblan viryon formasyonuna neden olmaktadlîl
(Sekil 1). Bakulovirüslerin biyolojik döngüsü, morfolojik olarak iki ve islevsel olarak ayrEl
viryonlarlîiçermektedir: (1) böcek hemosöllere enfekte hücrelerin membranlarlEUan asüânan
ve enfekte böcekte enfeksiyona duyarlI]>lan dokularda ve organlarda diger hücreleri enfekte
etmek üzere dagllân asHJDviryonlar (BV), (2) oklüzyon türevi viryonlar (ODV), ortamda
ODV'leri koruyan ve böcekteri böcege iletime olanak saglayan oklüzyon korunu (OB)
olusturan bir proteinaköz matriste tllZlanmaktadB Alfabakulovirüslerin OB'Ieri, polihedrin
proteinini içermektedir ve genel olarak, düzinelerce ODV'Ieri thamaktadlEl Bu virüsler, iki
türden birine ayrllîhaktadlEI(Sekil 1): (i) tek nükleokapsid nükleopolihidrovirüsleri (SNPV), her
bir ODV içerisinde tek bir nükleokapsidi içermektedir veya (ii) çok saylîlla nükleokapsid
nükleopolihidrovirüsleri (MNPV), her bir ODV içerisinde bir veya birden fazla nükleokapsidi
içerebilmektedir.
Bakulovirüsler, büyün çogunlugunun PulkanatlEI oldugu artropod konaklarda sadece
enfeksiyon üretebilmektedir. Omurgalllâr, küfler veya bitkilerde bakulovirüslerin sindiriminden
veya enjeksiyonundan sonra patojenik etkiler gözlemlenmemistir. Bu sekilde, bakulovirüsler,
hedef zararlElböcegin hariç tutulmaslýla insan sagliglElveya diger hayvanlarI sagllglEiçin
minimum risk Içermesinden dolayü biyolojik kontrol maddelerinin gelistirilmesine yönelik
olarak önemli derecede güvenli görülmektedir (Burges ve dig., 1980; Leuschner ve dig.,
2010).
Bakulovirüs bazIEilnsektisidlerin ticarilestirilmesine dair önemli bir durum, genel olarak tek bir
veya bir kaç oldukça yakI iliskili zararIIZböcek türünü enfekte edebilen ve öldürebilen bu
virüslerin yüksek konak özgüllügüdür (Gröner, 1986). Sonuç olarak, iki veya ikiden fazla
zararlüaöcegin bir kompleksinin kontrol edilecegi bitki koruma durumlarIa, iki veya ikiden
fazla farklEbakuIovirüsün OB'Ierini es zamanlEblarak veya ayrüiygulamalarda uygulamak,
degismez bir sekilde zorunludur. ZararlIZböceklerin çok say. türünün kontrolüne yönelik
biyolojik kontrol maddelerin üretimi, neredeyse degismez bir sekilde farkllîlböcek kolonilerinde
çok saylöia bakulovirüs türünün üretimini içermektedir, her birisi kendi maliyetlerini
içermektedir, böylelikle çok saylElh virüs türünü kullanan biyolojik kontrol, genis spektrumlu
bir sentetik insektisid kullan“ klýbsla kontrol maliyeti ile rekabet etmemektedir.
Bakulovirüs OB'leri de hem tek katmanllîkültürlerde hem de süspansiyon kültürlerinde hassas
böcek hücrelerinin kültürlerinden elde edilebilmektedir. Bakulovirüsler, yabancEl gen
ekspresyon vektörleri olarak kullanllâbilmektedir, bu sekilde özellikle böcek hücre
kültürlerinden, fakat ayrlîa böcek larvalarIan, nispeten kolay bir biçimde genis miktarda
rekombinant proteini elde edilmektedir (bakIlZl http://www.pitt.edu/~super7/32011-
ait "Baculovirus expression system" adlßunum).
Diger virüslerden genlerin, konak böcek genomundan veya diger organizmalar. veya
sentetik genlerin genomlarlEtlan eklenmesi, delesyonu veya ara degisimi ile bakulovirüslerin
insektisidal özelliklerini modifiye etmek mümkündür (Inceoglu ve dig., 2006).. Çallginanl
konusu, uzatUBilgl bir konak aralllZla bakulovirüslerin gelistirilmesi olmustur ve bazEl
durumlarda, virüsün, özel bir bakulovirüse dogal bir sekilde geçirgen olmayan konak türlerde
üretken bir enfeksiyonu elde edebilme kabiliyetini etkilemek için genetik modifikasyonu
kullaniEhlgtlB Bir birinci adli olarak, Autographa californ/ca MNPV'nin konak aral[giÇlipek
böcegi kelebegi Bombyx mor/ini içermek üzere helikaz geninin bölgesinde rekombinasyon
yoluyla uzatilBilStB(Kondo and Maeda, 1991; Croizier ve dig., 1992; Kamita and Maeda,
1996; Argaud ve dig., 1998). Sonraki çalismalar, bakulovirüslerde konak arallglîbelirleyen
geneitk faktörleri incelemek üzere benzer yaklasIilarElkullanmlSIlEl(Watanabe ve dig., 2010)
Genel olarak, bu çallgnalar, konak araligiia dahil olan genlerin hali hazüla tanilanmamasEl
ve spesifik bir zararlEböcegi içermek üzere konak arallgill uzatllüiaslîgerekli olan spesifik
genetik modifikasyonlar belirsizligini korumaktadlEl
Bir bireysel böcek hücresi, bir virüsten daha fazlasiîla es zamanlElolarak enfekte
Bakulovirüslerde, biri sokak türü olmak üzere ve biri genetik olarak modifiye edilmis olarak
aynü/irüs türlerinin iki genotipi ile böceklerin birlikte enfeksiyonu, ortamda modifiye edilmis
genotip Israr. olanak saglayabilmektedir (Hamblin ve dig. 1990). Bu sonraki durumda, aynü
virüs türlerinin iki genotipi dahil edilmistir. Çallgmanl yazarlari: gerçekte sadece birlikte
enfeksiyonu gösterilmis olmas. ragmen, birlikte tlEanmanlE] meydana geldigini
göstermektedir.
Benzer bir yaklasIi, WO 88/02030 sayiIJJIPatent DokümanEl/e Amerika Birlesik Devletleri
. Söz konusu
dokümanlarda açiElanan bulus, en az iki genetik olarak ayrübakulovirüsün nükleokapsidlerinin
bir karlglmlüberen bir polihedral inlüzyon koru (oklüzyon korunun (08) bir es anlamllgîblan
PIB) ile ilgilidir. PIB'lerin (mPIB) kariglKl bilesimi, enfekte böcek hücrelerinde polihedrin
üretimini yönlendiremeyen en az bir “rekobimnant” bakulovirüsün nükleokapsidlerini ve
enfekte hücrelerde polihedrin üretimini yönlendirebilen bir sokak türü, mutant veya genetik
olarak modifiye edilmis virüs olabilen en az bir bakulovirüsünün nükleokapsidlerini
içermektedir. Prensip olarak, bulu, farkIEbakulovirüs türlerinin genotip kullanIiEiIe uyumlu
olmasi ragmen, saglanan tek örnek, utographa califom/ca, AcMNPV'sini (bahsi geçen
dokümanlarda AcNPV olarak klgialtllöiaktadli) enfekte eden nükleer polihedroz olan, aynü
türün iki genotipini içeren böcek hücrelerinin enfeksiyonunu açlKIamaktadB KullanHân
virüslerden birisi, bir sokak türü virüstür ve digeri, AcMNPV'nin L-1 varyantElolan bir
rekombinant virüstür, burada polihedrin geni, bir cDNA kodlaylEEihsan toku türü plazminojen
aktivatörü ile degistirilmektedir. WO 88/02030 sayIIIDJatent DokümanII Örnek 2'sine göre,
elde edilen mPIB'ye sahip olan Helioth/s virescens tEiillBarII enfeksiyonu, her iki AcMNPV
genotipinin nükleokapsidlerini içeren yavru PIB'lere neden olmaktadlE Bu özel durumda,
sokak türü virüs oranüorijinal orana göre artmlgtlîJ sokak türü virüsün kademeli artlgloranü
sonraki mPIB yavrusu üzerinden seri geçis yaptiktan sonra bulunmaktadlE Aç[lZ]anan
deneyler, elde edilen PIB'ler, her iki genotipin nükleokapsidlerinin, birlikte tilîlanmadigiü/eya
birlikte tiKland[gI3iiryonlarülçerip içermediginden açilZga bahsetmemektedir; bu önemli durum
dogrulanmamlgtlîl
tarafIan sunulan bilgi, kullanilan her iki genotipin mevcut oldugunu ve deneysel
inokülümde Eiarclîdildugunu göstermektedir, fakat genotipler arasIda fiziksel bir iliskiye dair
bir kanlElsunamamlSIardE belirgin olarak bu iki genotip, tek bir OB'de (PIB) mevcut olmustur
veya bu her iki genotip, tek bir ODV'de mevcut olmamlStlE
Diger yazarlar (Löpez-Ferber ve dig., 2003), aynütürlerin farkllîlgenotiplerinin tek bir
viryonunda birlikte tllaanllîllgiüesfetmistir, fakat önceki durumlarda oldugu gibi en az bir
genotip, sagkalIi için esas olan genlerden mahrum olan kusurlu bir genotip olmustur. Bu
sekilde, kusurlu genotip, tam virüs genotipi ile birlikte enfeksiyona ve replikasyonlarIan ve
iletimlerinden dolayElsonrakinin gen ürünlerinin kullan“ baglEblmaktadlEl Daha güncel
olarak, bir virüs türünün farkIEgenotiplerinin, sonrasIa bir OB'de (Clavijo ve dig., 2009)
tlElalübIan bir ODV'de mevcut olabildigi gösterilmistir, bir baska ifadeyle her birisinin ayrElbir
genotipi içeren nükleokapsidler, bir karlglîl genotip ODV'sini olusturmak üzere bir membranda
birlikte sarlülîblabilmektedir.
Bakulovirüslerinin iki türü ile tek bir böcegin birlikte enfeksiyonu, Autographa ca//forn/'ca
MNPV (AcMNPV) ve Spodoptera eX/'gua MNPV'sini (SeMNPV) (Yanase ve dig., 1998) içeren
deneylerde açManmlgtlE Bu çalisma, bu virüslerden birisinin kopyalanmad[g]|:lve enfekte
böcek içerisinde rekombinasyonlarI üretiminin gözlemlenmemesi ile sonuçlanmlgtlü Benzer
bir sekilde, hücre kültürü çallSinalarlEUa, bakulovirüslerin iki farkIIZItürü ile birlikte
enfeksiyonlar, prensip olarak hücreler için patolojik etkiler aç-an bildirilmistir ve her bir
virüs dahil edilmistir (McCIintock & Dougherty 1987; Salem ve dig., 2012).
Simon ve dig. (2004) tarafEtlan yapllân sonraki is, belirli kosullar aItEtla,
nükleopolihedrovirüslerin iki farklEtürünün (5. exigua MNPV ve 5. #ag/perda MNPV), tek
bas. inoküle oldugunda S. eX/'gua MNPV'ye duyarlßlmayan 5. #uy/parola Iarvalarlül birlikte
enfeksiyonuna olanak saglamak üzere etkilesime geçebildigini göstermistir. Fakat, bu
çallgtna, bu virüslerin, aynEhücrede eszamanIEblarak kopyalanamadlglEl/eya bu virüsler ile
birlikte enfeksiyonun, karlglKl virüs ODV'Ierine veya karlgllZl virüs OB'Ierin birlikte tKbnmasEb
neden olabildigine dair kanlüsunmamlgtlü
Bu sekilde, Yanase ve meslektaslarEIYanase ve dig., 1998) tarafIan bildirilen isler gibi
önceki teknik, farkllîliürlere ait olan bakulovirüslerin, aynElböcegi birlikte enfekte edebildigini
göstermektedir, fakat aynElOB'ye tllZlanan her iki türün nükleokapsidlerini içeren karlglkl
ODV'lerin üretimi için herhangi bir kanlîlsunulmamlîstü Fakat, özellikle birden fazla böcek
türü mevcut oldugunda, ayrDnsektisid uygulamalarIElönIemek için ve zararlEböcekIerIe
mücadele etmek için, birden fazla farklthürü içeren bakulovirüslere dayalEblan, böceklerin
birden fazla türü vasißslýla veya aynElbakuIovirüsün farklElgenotiplerine degisken bir
duyarllIlK] sergileyen böcekler vasitiislîla istilaya duyarIElolan bitkiler için kullanilâbilen
insektisid bilesimlerinin hazüanmasüaydalßlacaktlü DahasÇlbu tarz bilesimler, bilesimlerin,
genis spektrumlu bir sentetik insektisid kullaniüle iliskili maliyetlerle rekabet edebilmesine
olanak saglayan bir yöntem kullanilârak üretilmelidir. Tercihen, üretim yöntemi, farklEböcek
kolonilerinde bakulovirüslerin çok saylöh üretimini önlemelidir, her birisi kendi maliyetini
içermektedir.
Mevcut bulus, bu probleme bir çözüm saglamaktadlEl
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI
Mevcut bulus, mevcut uygulamada tarif edilen, iki filogenetik olarak yakIan iliskiye sahip
çok saylöh nükleopoIihedrovirüslerinin (örnegin, SeMNPV ve SfMNPV), ayrlEla iki uzaktan
iliskili çok say. nükleopoIihedrovirüslerinin (benzer bir sekilde, örnegin AcMNPV ve SfMNPV)
birlikte enfekte olabildigine ve her birisinin, özel bir böcek hücrede üretken bir enfeksiyonu
ürettigine dair bir kan& baglIB Bu, OB'Iere tllZlanan karEKJ virüs ODV'lerine neden
olmaktadlB Karisim virüs OB'Ieri, uzatilüigl bir konak araligilîfenotipine sahiptir ve tek bir 08
inokülümünü kullanarak hedef zararlEliJöceklerle mücadele etmek üzere kullanllâbilmektedir.
Bu sebepten ötürü, bir birinci yönünde, mevcut bulus, aynIEIiryonda birlikte sarIIJJZbIan en az
iki farkllIbakulovirüs türlerinden genomu içeren karEKl virüs oklüzyon viryonlarII (ODV)
üretimine yönelik ve/veya söz konusu karlgüîl virüs oklüzyon viryonlarIan en az birisinin
t[lZland [giÜirüs oklüzyon korlarlElI üretimine yönelik bir yöntemi ifade etmektedir, burada tüm
enfekte edici bakulovirüsler, çok saylâia nükleopolihedrovirüsleridir. Tercihen, aynEODV'de
mevcut olan en az iki farkllîgenom, her birisinin bulaslEEbir bakulovirüs partikülüne neden
olabildigi, farkllîlbir genomu içeren bir ikinci bakulovirüs ile birlikte enfeksiyona ihtiyaç
olmadan, bir hücrede bir tam viral döngüyü üretebildigi genomlardlB Virüs oklüzyon korlarEl
(OB'ler), asaglîliakiler ile üretilmektedir:
a. her bir bakulovirüs genomunun ait oldugu en az bir üretilen oklüzyon viryonunda
birlikte sarüâcak olan bakulovirüs genomlarIEiÇeren bir böcek türünün IarvalarII veya
kültür hücrelerinin birlikte enfekte edilmesi
b. belirli bir türe, aynlîl'eya birbirinden farklEHJir ODV olabilmektedir;
c. enfekte larvalarI yetistirilmesi veya polihedroz ile ölüme kadar hücrelerin
yetistirilmesi;
d. ölümlerinden sonra larvalardan veya yetistirilmis hücrelerden üretilmis OB'lerin izole
edilmesi;
burada hücreler veya Iarvalar, genomlarIlBJ, üretilmis en az bir oklüzyon viryonunda birlikte
sarMßlacag Dîiakulovirüslerden birisi ile enfeksiyona duyarlIlB
Mevcut bulusun bir diger yönü, aynEl/iryonda birlikte sarlÜIblan en az iki farklEbakulovirüs
türünün genomlarIElçeren bir karlglla virüs oklüzyon viryonudur (ODV), burada genomlar,
çok say. nükleopolihedrovirüsün genomudur: mevcut bulusun bir ODV'si.
Benzer bir sekilde, aynElJiryonda birlikte sarlIllîloIan en az iki farklübakulovirüs türünün
genomlarlElEiçeren en az bir ODV'yi tlElayan bir karlgIKl virüs oklüzyon koru (OB), mevcut
bulusun bir yönüdür, burada genomlar, çok sayma nükleopolihedrovirüsün genomudur:
mevcut bulusun bir karlglZlOB'si.
Mevcut bulusun bir diger yönü, mevcut bulusun en az bir ODV'sini ve/veya mevcut bulusun
en az bir OB'sini içeren bir bilesimdir. Bu tarz bir bilesim, mevcut bulusun bir bilesimidir.
Ayrlîla mevcut bulusun bir yönü, mevcut bulusun OB'Ierin kullanlüle/veya zararlElböceklerle
mücadeleye yönelik, mevcut bulusun bir bilesimidir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
Sekil 1, nükleopolihedrovirüslerinin mikroskopik yap-@östermektedin
- Panel a (seklin üst bölümü), bireysel sematik sunumunun, mikrografigin sagIa
gösterildigi oklüzyon korlarII (08) bir mikrografigini göstermektedir. Panelin sag
tarafIa, iki oklüzyon koru sunulmaktadü bu da dairelerin ve dikdörtgenin ODV'leri
(oklüzyon viryonlarmsundugu iç taraflarllîgiöstermektedir.
- Panel b (seklin alt bölümü), ODV'Ierin iki farkIEtürünü temsil etmektedir. Tek bir
nükleopolihedrovirüse (SNPV) tekabül eden soldan birisi, genomik DNA (bir sarmal
olarak temsil edilen) ve birlesik proteinler ile olusturulan tek bir nükleokapsidi (NC)
Içermektedir. Çok say. nükleopolihedrovirüse (MNPV) tekabül eden sag taraftan
birisi, ODV bas. bir nükleokapsidi veya birden fazla nükleokapsidi (NC) (her birisi,
içinde bir sarmalla bir dikdörtgen olarak gösterilmektedir) içermektedir.
Sekil 2 Spodoptera eX/gua nükleopolihedrovirüs varyantlZBeUSZ-A (serit 1) ve Psd içeren
Spodoptera frag/perde? nükleopolihedrovirüs varyantESfNIC-C (2) genomik DNA isleminden
sonra üretilen klîlflhma endonükleaz profilleri. Moleküler isaretleyici (M), Hiperladder I'dir
(Bioline).
Sekil 3. OB'Ierden ekstrakte edilen DNA'nI PstI I ve elektroforez ile isleminden sonra virüs
genomik DNA'nI kElEliama fragmanülizunluk polimorfizmi. Seritler:
M: moleküler aglîliilaisaretleyici Hiperladder I (Bioline)
Serit 1: SeUSZ-A OB'lerden ekstrakte edilen DNA'nI Psd klgifllama profili.
Serit 2: SfNIC-C OB'Ierden ekstrakte edilen DNA'nI Psd kElîlbma profili.
Serit 3: SeUSZ-A ve SfNIC-C ODV'IerIe 5. eX/'gua larvalarII birlikte enfeksiyonundan
sonra üretilen OB'Ierden ekstrakte edilen DNA'I PstI kigifliama profili. Sadece SeUSZ-A
profili gözlemlenmektedir, fakat PCR amplifikasyonu, SfNIC-C DNA mevcudiyetini
0naylamlgtlîl(veri, tekrar #1'den gösterilmektedir).
Serit 4: SeUSZ-A ve SfNIC-C ODV'Ieri ile birlikte enfeksiyon esnasEUa üretilen OB'Ier
kullanüârak 5. frag/perda ikinci dönem IarvalarII inokülasyonundan sonra üretilen
OB'Ierden ekstrakte edilen DNA'nI Psd klîiflbma profili.
Serit 5: Serit 3 ile aynIiEJ fakat veri, tekrar #2 için gösterilmektedir.
Serit 6: Serit 4 ile ayri IE! fakat veri, tekrar #2 için gösterilmektedir.
Sekil 4: [9-0 gen sekanslarlda hedeflenen spesifik primerler kullaniiârak 5p0d0ptera exi'gua
veya 5. #ag/perda larvalarITida üretilen OB'Ierden ekstrakte edilen SeUSZ-A ve SfNIC-C
DNA'nI PCR tespiti.
M: moleküler aglîliiKiisaretleyici Hiperladder I (Bioline)
Serit 1: SeUSZ-A OB'Ierden ekstrakte edilen DNA (herhangi bir spesifik amplifikasyon
ürünü yoktur)
Serit 2: SfNIC-C OB'Ierden ekstrakte edilen DNA.
Serit 3: SeUSZ-A ve SfNIC-C ODV'IerIe 5. exigua IarvalarI birlikte enfeksiyonundan
sonra üretilen OB'Ierden ekstrakte edilen DNA. Tekrar #1'den gelen sonuçlar.
Serit 4: SeUSZ-A ve SfNIC-C ODV'Ieri ile birlikte enfekte olan Iarvalardan OB'Ier
kullaniiârak 5. frug/perda ikinci dönem IarvalarII inokülasyonundan sonra üretilen
OB'Ierden ekstrakte edilen DNA. Tekrar #1'den gelen sonuçlar.
- Serit 5: Serit 3 ile ayn IlEl fakat sonuçlar, tekrar #Z'den gelmektedir.
- Serit 6: Serit 4 ile ayn IE fakat sonuçlar, tekrar #Z'den gelmektedir.
Sekil 5 OB'lerde SeUSZ-A ve SfNIC-C virüslerinin birlikte tllZlanmasüfarklEDB karEIEiilarIa
100 ng SeUSZ-A genomu baslrîla nispi SfNIC-C genomu bollugu. Spodoptera exigua
SfNIC-C OB'lerin 1:1 oranIda karlglmlarian saIIn ODV'ler kullanilarak birlikte enfeksiyona
tekabül etmektedir. Hata çubuklarÇlstandart sapmayügiöstermektedir.
Sekil 6: Birlikte tKbnmE karlgKl virüs OB'Ierinden (AcMNPV+SfMNPV) ekstrakte edilen AcC6
(AcMNPV), SfNIC-B (SfMNPV) ve DNA'dan güçlendirilen PCR ürünlerinin elektroforezi.
Hiperladder I, sol tarafta gösterilen fragman uzunluguna sahip bir moleküler boyut
isaretleyicisini göstermektedir.
Sekil 7: SfNIC-C ve AcC6 virüsleri ile 5. frugiperda IarvalarII birlikte enfeksiyonundan
sonra üretilen karlgllîl virüs OB'Ierinde thhnan karEIKl virüs ODV'lerinin diyagramatik örnegi.
Dikdörtgenler ve daireler, sßslýla bir ön (yan) veya üst (uç) görünümde ODV'leri temsil
etmektedir. Dikdörtgenlerin içerisinde yatay hatlar veya daireler içerisindeki noktalar,
nükleokapsidleri temsil etmektedir, koyu olanlar, tek türlere aittir ve açllîl olanlar, bir diger
türe aittir.
Sekil 8: Uç nokta seyrelti numunelerinden (3 tekrar) ekstrakte edilen DNA'dan güçlendirilen
PCR ürünlerinin elektroforezi. Hiperladder I, moleküler boyut isaretleyicisini (Bioline)
göstermektedir. Nihai iki serit, AcC6 (AcMNPV) ve SfNIC-B (SfMNPV) genomik DNA'ya yönelik
pozitif kontrolleri göstermektedir. Üst seritleri, SfNIC-B spesifik primerler kullanliârak
amplifikasyonlarügösterirken, alt seritler, AcC6 spesifik primerler kullanlßrak amplinkasyonlarlîl
göstermektedir.
Sekil 9: 5. #ugiperda larvalarII tek, es zamanIEi/eya geciktirilmis süperenfeksiyonundan
sonra gözlemlenen larva mortalitesi. Islemler, birinci ve ikinci inokülasyon arasIaki zaman
aral[giIda birinci virüsün bas harfleri ve inoküle ikinci virüsün bas harfleri ile gösterilmektedir,
örnegin Ac125f, ilk olarak AcC6 OB'Ieri ile enfekte edilmis ve daha sonraleUa SfNIC-B
OB'IerIe 12 saat sonra inoküle edilmis Iarvalarügöstermektedir. SütunlarI üzerindeki
degerleri, virüs ile indüklenmis mortalite yüzdesini göstermektedir. Özdes harflerin takip ettigi
degerleri önemli ölçüde farkIiIJIZlgöstermemistir (ANOVA, Tukey, p>0.05).
Sekil 10: Bu virüslerin OB inokülümü kullanilarak tekil enfeksiyonlar, es zamanlßnfeksiyon
ve gecikmis süperenfeksiyonlar (12 - 72 saat) esnasia üretilen OB'Ierden ekstrakte edilen
AcC6 (AcMNPV) genomik DNA ve SfNIC-B (SfMNPV) genomik DNA'nI log oranE] Benzer
harflere sahip olan sütunlar önemli ölçüde farkllülîlgöstermemistir (ANOVA, Tukey, p>0.05).
Sekil 11: Es zamanlüve gecikmis birlikte enfeksiyon deneyinde üretilen karlglEl virüs
OB'lerinden sallEhn ODV'Ierin bilesimi.
BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI
FarkllZlbakulovirüs türlerinin genomlarIEliçereni bakulovirüslerin özelligi olan yaplglal ve
morfolojik özelliklerle aynElviral oklüzyon koru (OB) içerisinde tllZlanan viryonlarI elde
edilebildigi bir yöntem temsil edilmektedir. Mevcut bulusun yöntemi ile elde edilen karlglKl
genom OB'leri, nükleopolihedrovirüslerin farklEtürIerinden veya suslarIan iki veya ikiden
fazla farkllîlienomun bir karlgînlügermektedir.
Yanase ve meslektaslarIlEki (Yanase ve dig., 1998) gibi önceki çallgnalarda bulunan
sonuçlarEla aksine, mevcut bulusta sunulan deneyler, bakulovirüslerin iki tür, belirgin olarak
çok saylZ'lb nükleopolihedrovirüslerin iki türü ile tek bir böcegin birlikte enfeksiyonunun, aynEl
hücrelerde her iki virüsün çogalmasi ve hatta, aynljbklüzyon viryonunda (ODV) farkIü/iral
genomlarlElügeren nükleokapsidlerin paketlenmesine neden olabilmektedir.
Bu sebepten ötürü, farkIEgenomlarlE, OB'lerin ve konak arallglII patojenezite, virülansü
üretimi gibi insektisidal özellikleri aç-dan farkliEEl gösteren iki veya ikiden fazla bakulovirüs
türü ile enfeksiyona duyarllîilan bir böcek türünün birlikte enfeksiyonu vaslüslýla üretilebilen
bireysel ODV'Ierde es zamanlEblarak mevcut olabilmektedir. Bunlar, normal morfoloji ve
boyuta sahip virüs oklüzyon korlarIa (OB) tlElanabiImektedir ve bilesen bakulovirüslerinden
birisi ile enfeksiyona duyarlEböcek türlerini enfekte edebilmektedir.
Birden fazla nükleokapsidi (ve bu sekilde, birden fazla bakulovirüs genomunu) içeren
ODV'ler, çok say. nükleopolihedrovirüsünün özelligi olurken, tek nükleopolihedrovirüsler,
her bir ODV'de sadece bir nükleokapsid mevcudiyeti ile karakterize edilmektedir. Bu sekilde,
mevcut bulusun yöntemini uygulamak için, kullanllân tüm bakulovirüsler, çok saylîlia
nükleopolihedrovirüsler (MNPV) olmaIIlEl
Mevcut basvurunun örnekleri, mevcut bulusun yönteminin, filogenetik olarak yakI iliskiye
sahip bakulovirüslerle (örnegin SeMNPV ve SfMNPV) ve uzaktan iliskili bakulovirüslerle
(benzer bir sekilde, örnegin AcMNPV ve SfMNPV) Isleyebildigini göstermektedir. Her iki
durumda, bakulovirüsler birlikte enfekte olabilmektedir ve her birisi, özel bir böcek
hücresinde üretken bir enfeksiyon üretmektedir. Bakulovirüsler hakkIaki mevcut bilgiye
göre, mevcut bulusun yöntemi, bunlarI tümünün çok sayida nükleopolihedrovirüsleri olmasü
kosuluyla, herhangi bir bakulovirüs kombinasyonu ile uygulanabilmektedir. Bir aynüarvaya
inoküle edilen tüm bakulovirüslerin, mevcut basvurunun örneklerinden oldugu gibi
alfabakulovirüsleri olmasEitercih edilmektedir. Alfavirüsler, aynElfilogenetik gruba (Örnek 1'de
oldugu gibi, burada Grup II'ye ait olan iki alfabakulovirüs kullanUBiaktadB veya farle
gruplara (ÖrnekLER 2 ve 3'te oldugu gibi, burada Grup I'in bir alfabakulovirüsü ve Grup II'nin
bir alfabakulovirüsü kullanilü1aktadli) ait olabilmektedir.
Olasükombinasyonlarl örnekleri, söz konusu Örneklerde bulunabilmektedir: Spodoptera
frugiperda, çesitli ekonomik olarak önemli bitkinin bir yllZlajlepidopteran böcegidir.
Spodoptera #ag/perde; çoklu nükleopolihedrovirüs (SfMNPV), oldukça dair bir konak aral[gb
sahip oldugu (aslIa, Spodoptera frug/perda, Spodoptera /itura ve Spodoptera eX/guada
ölümcül bir enfeksiyonunu üretebilmesi) için, tek bir kontrol maddesi ile daha fazla zararlEI
böcek türünü kontrol etmek üzere daha genis bir spektruma sahip insektisidal madde ile
kombinasyon halinde kullanIiEtavsiye edilmektedir. Bu amaca yönelik olarak, 5. frag/;varda
dahil olmak üzere en az 32 Iepidopteran türünün larvalarIEenfekte edebilen ve öldürebilen
Autagrapha califam/ca çoklu nükleopolihedrovirüsün (AcMNPV), ilgi çekici bir ortak olacagIZI
görülmektedir. Fakat, tüm konak türleri, AcMNPV ile ölümcül enfeksiyona yüksek oranda
duyarlEdegildir. Örnek 3, SfMNPV ile AcMNPV'nin es zamanlEénfeksiyonunun, AcMNPV ile
Islenen böceklerde elde edilen mortaliteyi arttlßbildigini göstermektedir, bu sekilde söz
konusu iki virüsün genomuna sahip karEKI ODV'Ieri içeren OB'leri içeren bilesimler, elde
edilen sonuçlarügelistirebilmektedir.
Mevcut bulusun yöntemi, en az bir oklüzyon viryonunda (ODV) birlikte sarIDIblacak olan
bakulovirüs genomlarlîüe böcek IarvalarII veya böcek hücresinin birlikte enfekte edilmesi ile
uygulanabilmektedir.
Mevcut bulusun yönteminde, bakulovirüs genomlarü böcek larvalari veya tercihen
nükleokapsidleri olusturan böcek hücresi kültürlerine saglanmaktadlîlûnoküle edilmektedir).
Inoküle nükleokapsidler, ODV'Ieri olusturan bir zarf ile sari]]]1_1ruplarda birlestirilebilmektedir
veya yukar- açlKland[g]Ügibi, enfekte böcek içerisinde veya hücre kültüründe enfeksiyonun
hücreden hücreye iletim için in w'vo üretilen virüs partikülleri olan asil]]:iviry0nlarl:i(BV)
olusturabilmektedir. DolaylîlEa, inoküle ODV'Ier, serbest ODV'Ier (oklüzyon korlarIa
tllZianmamaktadiE) olabilmektedir veya oklüzyon korlarIEi(OB) olusturan bir proteinaköz
matrisinde tllZianabilmektedirler, her bir 08, çesitli ODV'leri içermektedir.
Böcekler ve hücre kültürleri, BV'Ier kullanüârak inoküle edilebilmektedir. BV'Ier inoküle
edildiginde, bir kaç farkIIZBV kümesi de inoküle edilmelidir; her bir BV kümesi, belirli bir
bakulovirüs türünün genomuna sahip nükleokapsidleri içermektedir. Inoküle edilecek BV
kümesi sayEDaynElDDV'de birlikte sarIIJJZblan farklElbakulovirüs türlerinin genom say_ esit
olacaktlEl Bu sebepten ötürü, inokülüm olarak BV kullaniübir virüs türüne ait genomlarEl
(nükleokapsidler) içeren BV'Ierin ve aynEDDV'Ierde birlikte sarii]]:blan diger virüs türünde
(veya türlerinde) genomlarü(nükleokapsidler) içeren BV'lerin inoküle edilmesi gerektigini
belirtmektedir.
Her bir BV, tek bir nükleokapsidi içerdigi ve her bir nükleokapsid, tek bir genom kopyasIü
içerdigi için, farklElbakulovirüs türlerinden BV'lerin formunda olan farklElbakulovirüs türlerinin
nükleokapsidlerini inoküle ederek mevcut bulusun yönteminin uygulanmasübelirli bir virüs
türünde genomun bireysel kopyalarIlZlçeren nükleokapsidlerin, ODV'Ieri olusturmak üzere
saril]]bldugu ve bir böcek konaglübir böcek Iarvasmveya bir böcek hücre kültürüne inoküle
etmek üzere kullanllglübir diger olasürapllândlîilnaya benzerdir. Mevcut bulusun yönteminin
bu yapilândlEinasiEUa, belirli bir virüs türüne ait olan bakulovirüs genomuna sahip ODV'Ier,
böcek larvalarlülieya böcek hücre kültürlerini es zamanlüalarak inoküle edecek sekilde veya
belirli bir süre arallgiIan sonra, birincisinden farklEblan bir diger virüs türüne ait genomu
içeren nükleokapsidleri içeren ODV'IerIe veya BV'Ierle kullanlEnaktadlE Bu tarz bir
yapllând Etna, özellikle bulusun yöntemi ilk defa uygulandlgißtla tercih edilecektir.
Fakat sonraki durum, Örnek 3'te görülebildigi üzere, mevcut bulusun yönteminin adIiIIIar
uygulanmasEile elde edilen OB'lerde tllZlanan ODV'lerin, yeni ODV'Ieri ve OB'Ieri elde etmek
üzere saglllZlEIlarvalarElinoküle edecek sekilde kullanIEglElve Örnekte ve ilgili Sekillerde
görülebildigi üzere, ek inokülasyon ve OB üretimi turlarEilçin kullanllân bazElDDV'Ierin, birden
fazla genom türünü içerdigi, bir baska ifadeyle birinci turda inoküle edilen iki veya ikiden fazla
farklEbakulovirüs türüne ait genomlarlEl, enfeksiyonun bir birinci turundan elde edilen bazEI
ODV'lerde birlikte sariIJIbldugu ve Iarvalarlîinoküle edecek ve mevcut bulusun yöntemini
tekrardan uygulayacak sekilde kullanllâbildigi mevcut bulusun yönteminin uygulanmaslZl
gerekli degildir.
Öncesinde açllZlandlglEl üzere, ODV'Ier (ve bu sekilde, ODV'Ier içerisinde sarll]]Ilolan
nükleokapsidler), oklüzyon korlarlEUa (OB'ler) tiElalElolan veya oklüzyon korlarIa tllZlalü
olmayan (sonraki durumda, ODV'ler burada serbest ODV'ler olarak ifade edilmektedir) böcek
larvalarIEinoküIe edecek sekilde kullanllâbilmektedir. Böcek hücre kültürlerinin durumunda,
ODV'Ier, OB'Ierden saIIEIZtan sonra inokülasyon için kullanllâbilmektedir. OB'Ierden sallBhn
ODV'Ier, buradan sonra serbest ODV'Ier olarak ifade edilmektedir.
OB'ler, inokülasyon için kullanIEglEtla, bir ayn Ebklüzyon korunda t[Elanan tüm ODV'Ier, tek
bir türe ait olabilmektedir, bir baska ifadeyle tüm ODV'Ier, tek bir virüs türünün genomuna
sahip nükleokapsidleri içermektedir ve tüm ODV'Ier, aynEl türün genomuna sahip
nükleokapsidleri içermektedir. Fakat, aynEl oklüzyon korunda dahil edilen ODV'lerin,
nükleokapsidleri içerisindeki genomlarla ilgili farkIEbiIesimIere sahip olmasEüa mümkündür,
bunlardan bazlglgtek bir türün genomlarIEiçermektedir, digerleri, aynEtüre ait olan, fakat
birincisinden farklEI olan genomlarEl içermektedir ve farklEl nükleokapsidlerin ODV'leri
olusturmak üzere birlikte sarUJIbldugu digerlerini içermektedir, en az bir veya bir kaç ODV,
aynEDDV'nin diger nükleokapsidlerinin türlerinin genomundan farkIEbir türe ait olan bir
genomu içermektedir. Her iki türde OB, mevcut bulusun yöntemini uygulayacak sekilde
inoküle edilebilmektedir. Bu sekilde, mevcut bulusun olasElbir yapUândlElnasü inoküle
nükleokapsidlerin, oklüzyon korlarIa dahil olan ODV'Ieri olusturacak sekilde sar-[gIEi/e en
az bir inoküle oklüzyon korunun, birden fazla bakulovirüs türüne ait genomu içeren
nükleopkapsidlerin birlikte sarlIliîbldugu en az bir ODV'yi içerdigi bir yapliândlünadlîl
Bir diger olasEl/apüândlülna, aynEbklüzyon korunda tüghllîblan tüm ODV'lerin, aynEtürün
genomuna sahip olan nükleokapsidleri içerdigi bir yapilândlEnadlEl Sonraki durumda, OB'Ierin
çesitli kümeleri, böcek larvalarlElElnoküIe edecek sekilde kullanüEnalIlîl her bir küme, belirli
bir virüs tipinin veya türlerinin genomlarIEIÇeren nükleokapsidlerini içermektedir.
Yukarlâb aç[lZIand[glJizere, BV'Ier veya serbest ODV'Ier, mevcut bulusun amaçlarlEla yönelik
böcek hücrelerinin inoküle edilmesi için kullanllâbilmektedir. Bu, inoküle genomlarI
çogalmasEl/e yeni virüs partiküllerinin üretimi için kullanllân sisteme bagl- Yetistirilmis
böcek hücrelerinin farkllZbakulovirüs türlerinin genomlarEile in vitro inokülasyonu için, BV'Ier
veya serbest ODV'Ier, hücreleri enfekte etmek üzere kullanilâbilmektedir.
FarkllZlbakuIovirüs genomlarlEa birlikte enfekte edilecek olan böcek hücreleri, bir böcek
konagII (bir böcek larvasDZldokularII bir bölümü oldugunda, BV'Ier veya serbest ODV'ler
veya farkllîlbakulovirüs türlerinin OB'IerI veya farkIEIbakulovirüs türlerinin genomlarII
karlglEillarIEliçeren OB'ler, inokülasyon için kullanllâbilmektedir, fakat inokülasyon yolu,
kullanIi için partikül türünün seçimi akIa tutulmalllîl
- Bakulovirüs genomlarIElçeren virüs partikülleri enjekte edildiginde, BV'Ier veya serbest
ODV'Ier kullanllâbilmektedir. Hemokoelik enjeksiyon tercih edilmektedir.
- Nükleokapsidler, böcek larvalari oral olarak inoküle edildiginde, BV'Ier, serbest ODV'Ier
veya OB'Ier kullanüâbilmektedir. BV'Ier, bu yol ile enfeksiyon için en az etkili partiküllerdir.
Serbest ODV'Ier kullanüâbilmektedir, fakat bunlarlEJ, oklüzyon korlarÇl dogada böcek
için, oklüzyon korlarIia tllZlanmalarlJercih edilmektedir. Oral inokülasyon kullan.lg]ia,
oklüzyon korlarüböceklere saglanan bir sulu süspansiyonda uygulanmaktadßveya katEl
veya yarEkatEformda uygulanabilmekte, diyet veya böcek larvastharafIan sindirilen
diger maddeler ile karlîstlîllâbilmektedir.
Bir larva veya böcek kültür hücrelerinin böcek hücreleri enfekte oldugunda, daha sonraleUa
ODV'Iere ve OB'Iere dahil edilen diger nükleokapsidlere neden olmaktadIEIlar. Mevcut bulusa
göre, böcekler veya böcek hücreleri, farklEIbakulovirüs türlerinin genomlarEile birlikte enfekte
edildiginde, üretilen ODV'lerin bir fraksiyonu, karEsIlKl virüs ODV'Ieridir, burada en az bir
nükleokapsid, aynlîl ODV'de birlikte sarllIlZl olan diger genom kopyalarüblan (diger
nükleokapsidlerden) farklEbIan bir genom kopyasIElçermektedir, bir baska ifadeyle farkllîl
bakulovirüs türlerinin genomlarÇlayn BDDV'de birlikte sarllhiaktadE
YukarlElh açUZIandfg'lEüzere, tllZbndElZlarllarEKl virüs ODV'Ier veya OB'ler, zararlEböceklerle
mücadele etmek üzere bir biyolojik kontrol maddesi olarak kullanllâbilen büyük miktarlarda
karlglKl genom OB'Ierini üretmek üzere duyarllZI böcekleri enfekte edecek sekilde
kullantlâbilmektedir. Bu, bakulovirüsleri içeren bir insektisidi kullanarak yönetilebilen böcek
türü say-a bir artlga olanak saglamaktadlîl böylelikle iki farklElnsektisidin uygulanmasü
gerekli olmamaktadlîl iki veya ikiden fazla zararlElböcek türü, bir aynElbitkide, mahsulde veya
yetistiricilikte mevcut oldugunda (veya kontrol edilmesi gerektiginde) farklEbir bakulovirüs
türünü içermektedir. Önemli ölçüde, bu tarz karElKl virüs OB'Ieri, bir aynElböcek kolonisinden
elde edilebilmektedir, bu da her birisinin maliyetli oldugu farklüböcek kolonilerinde
bakulovirüslerin çok saylöh türünün üretimi ile iliskili maliyetlerin katlanmalelEönlemektedir.
Bu, mevcut bulusta açlKlanan insektisit türünün üretim maliyetlerini azaltmaktadlE
Mevcut basvurunun Örnek 3'ünde gösterildigi üzere, iki farkllZbakulovirüs ile es zamanllZl
enfeksiyonunki gibi bazEUurumlarda, enfekte larvalarda elde edilen mortalite, tek baslEla
belirli bir bakulovirüs türü ile elde edilenden (örn. SfMNPV'nin SfNIC-B genotipine sahip
kariglînilarda AcC6 ile es zamanlübirlikte enfeksiyon ile elde edilen mortaliteye sahip
AcMNPV'nin genotipi AcC6 ile elde edilen mortaliteye klýbsla) daha yüksek çEEinlISIIE Bu
sebepten ötürü, mevcut bulusun yöntemi ve söz konusu yöntem ile elde edilen bulusun
karisim virüsü OB'Iere sahip bilesimler, sadece bir zararlEböcek türünün, bir bitkiyi veya
mahsulü sindirdigi belirli durumlarda faydaiiîiolabilmektedir ve iki virüs türünün, zararIIZI
böcegin öldürülmesi olasHJgiIEiarttiâcak olmasiEUan dolayEive ayriEia, zararIElböcegin
mortalitesinin prevalansII ve bu sekilde kontrol önleminin etkililiginin arttiîilîhas. yarIi
etmek için belirli bir bakulovirüs türüne böcek duyarIHJIjiEiiiakkHaki süpheler mevcuttur.
Dahaslgi konak böcegin birlikte enfeksiyonu es zamanlEbIarak veya birinci inokülasyon ve
ikinci bakIvirüs türleri ve/veya sonraki inokülasyonlar arasIiaki belirli bir süre araligiian
sonra uygulanabilmektedir. Bu prosedür, birlikte enfekte böcekte üretilen ODV'lerde ve
OB'Ierde her bir türün genomunun farklEbranIarlEia neden olmaktadB Ek olarak, mevcut
basvurunun örnekleri ayriEh her bir bakulovirüs türünün inokülasyon siüsIlEi, nihai OB
bilesiminde her bir türün genom oranlühtkileyebildigini göstermektedir. Bu sebepten ötürü,
mevcut bulusun yönteminin uygulandigiü (inokülasyonlar arasIaki süre ve farklEi
bakulovirüslerin inokülasyon süsü; kosullarlîibasit bir sekilde çesitlendirerek, her bir
bakulovirüsün farkliîbranlariEa OB bilesimlerinin elde edilmesi mümkündür.
Mevcut bulusun yönteminde degistirilebilen bir diger degisken, böcekleri inoküle etmek için
kullanilân her bir bakulovirüs oranIEI Her bir bakulovirüsün inoküle genomlarII say-I
oranlZlzl veya elde edilecek olan karigllîi ODV'lerde veya karigliîi OB'Ierde mevcut bir genom
kopyasi sahip olmasEgereken tüm bakulovirüslerin inoküle edilmesi kosuluyla farkliZbir
oranda olabilmektedir.
Bu sekilde, mevcut bulusun yöntemi ayriîla arzu edildigi gibi, birinci bakulovirüsün
inokülasyonu ve ikinci (veya sonraki bir) bakulovirüsün inokülasyonu arasIaki süre araligilîi
ve/veya (virüsler zamanla ayrEI bir sekilde inoküle edildiginde) farklEi bakulovirüsün
inokülasyon sßsDe/veya bir böcegi inoküle edecek sekilde kullanilân her bir bakulovirüsün
genom kopyalarII oranEdegistiriIerek her bir bakulovirüs genotipinin farklEbranlarlILla OB
bilesimlerinin üretimine olanak saglamaktadlü Bu sebepten ötürü, bir bakulovirüsün
inokülasyonu ve ikinci (veya sonraki) bakulovirüsünün inokülasyonu arasüdaki süre araligiisîla
es zamanlEinoküIasyon ve ayrünokülasyon, mevcut bulusun yönteminin yapÜândlEinalarIiB
ayrlEia her bir bakulovirüsün aynüiniktarda (121 oranDJgenom kopyasII inokülasyonu veya
1:1'den farkllIliiir oranda inokülasyon, mevcut bulusun yapiiândünalarlü
Belirli bir türe ait olan bakulovirüs genomunu içeren nükleokapsidler, böcek larvalarlBJÜ/eya
kültür hücrelerini, diger bakulovirüs genomu (veya ikiden fazla tür inoküle edildiginde ve
üretilen kariSJKJ ODV'lerde genomlarII en az bir kopyasi sahip olmasEiiJekIendiginde, diger
bakulovirüs genomlarD] dahil olmak üzere nükleokapsidlere göre zamanIElayrEbir sekilde
inoküle edecek sekilde kullanliâbilmektedir. Mevcut bulusun yönteminin bu yapllândlîiinasü
böcek Iarvalarü/eya kültür hücreleri, inoküle türlerinkinden farkIÜJIan belirli bir türe ait olan
bakulovirüs genomuna sahip nükleokapsidleri içeren BV'IerIe veya ODV'lerIe inokülbe
edildiginde mümkündür. Böcekler, her bir belirli türe ait nükleokapsidlerin slßlünokülasyonu
ile iki veya ikiden fazla bakulovirüs türü ile birlikte enfekte edildiginde, birinci ve sonuncu
inokülasyon arasHaki sürenin gecikmesi, birinci enfeksiyonun belirtilerinin ortaya çiiZmasü
için gerekli süreden daha düsük olmalIEI Ölümden önceki olagan enfeksiyon belirtileri,
uyusukluk, histe azalma oranÇIderi renginde degisimler ve bain/irüslerde konak bitkilerin
apik bölümlerine deplasmanEiiçermektedir, bu tarz belirtilerin mevcudiyeti, belirgin hastaliglI
bir göstergesi olarak düsünülebilmektedir.
Bu sebepten ötürü ve Örnek 3'te gösterilen deneylerin sonuçlariEia göre, zamanla farkIIZI
bakulovirüsler ayrE'sekilde inoküle edildiginde, ikinci (veya nihai) inokülasyon yer aldiglIa,
farkIEbir bakulovirüs türünün genomuyia nükleokapsidlerin inokülasyonuna göre 48 saatin
asaglglüb inmesi ve daha çok tercih edilecek sekilde birinci bakulovirüsün inokülasyonundan
sonra 24 saatten daha fazla olmamasühatta daha çok tercih edilecek sekilde 16 saatten
daha fazla olmamasiiiiercih edilmektedir. Bu, birinci inokülasyondan (enfeksiyon) sonraki süre
arttiKça, hücrelerin, ikinci bir bakulovirüse alglgl olmayljkesmesinden kaynaklanmaktadiEl Bu
sekilde, viryonlar ve/veya oklüzyon korlarÇI birden fazla bakulovirüs türünün
nükleokapsidlerini içerecek sekilde elde edilecegi zaman, özellikle birinci bakulovirüsün
enfeksiyondan sonra 16 ila 24 saatten daha fazla olan ikinci bakulovirüs inokülasyonu
gecilmesi tercih edilmemektedir.
Ayrüa, mevcut bulusun yöntemine ait olan, belirli bir türe ait bakulovirüs genomuna sahip
nükleokapsidlerin, en az bir oklüzyon viryonunda birinci olanla thbnacak olan diger
bakulovirüs genomlar- sahip nükleokasptilerle es zamanIElolarak, kültürlenmis böcek
hücrelerini veya böcek larvalarIEInoküle edecek sekilde kullanIEgiEbir yapilândiîiinadE Bu
yapiiândülna, BV'Ierin, ODV'lerin veya OB'Ierin formunda olan nükleokapsidlerle uyumludur
ve bu durumda, ODV'Ier (OB'lerde serbest veya tiEianmlg) sadece aynEltürün genotiplerini ve
karlgllîl ODV'Ieri içermektedir (ODV'ler, farklEbakulovirüs türlerinin genomlarIEiçermektedir,
burada en az bir genom, digerlerinden farkIIlD. KarlSlKl OB'ler, ayrlîla tüm tlEbnmlSl
ODV'Ierin, tüm birlikte tlEbnmlSlODV'Ierin aynEtürleri olan tek bir türe ait olan genomlarEl
içerdigi OB'ler de kullan ilâbilmektedir.
Mevcut bulusun yöntemi, böcek hücre kültürleriyle uyguland [glIa, herhangi bir böcek hücre
dizisi, genomlarlEJ, üretilecek olan ODV'Ierde veya OB'Ierde mevcut olmasEl gereken
bakulovirüslerin her iki (veya daha fazla) türü ile enfeksiyona duyarlEloldugu zaman
kullanllâbilmektedir. Böcek hücre kültürlerinin ve duyarIEbldukIarEl/irüslerin bir listesi, Lynn
(2007) referansIan temin edilebilmektedir. 5. Üugiperda'dan hücre dizileri (Sf9 ve Sf21)
ve Tr/chop/usian/den High5 en yaygI olarak kullanllân olmas. ragmen, herhangi bir diger
böcek hücre dizisi de karEiEJ ODV'Ieri ve karEIEJ OB'leri elde edecek sekilde
kullanllâbilmektedir. Bakulovirüsün belirli bir türüne ait ODV'lerIe veya BV'Ierle ve
bakulovirüsün farkIEIbir türüne ait ODV'IerIe veya BV'lerIe enfekte edilmesi, bu hücre dizisine
bulaslîlîblan her ikisi, karlgllîl ODV'Ierin ve karlgKl OB'Ierin üretimine iletecektir. En enfekte
hücrelerin (kullanilân hücre dizisine ve virüslere baglüilarak enfeksiyondan 5 ila 7 gün sonra)
içerisindeki polihedrayElgörmek mümkün oldugunda, her iki hücre ve ortam. çlKlariIIhasEl
gerekecektir. KarlSIKlOB'Ier, düsük hlîlßantrifüjleme ile toplanacaktlEI(King ve dig., 1992).
Bir böcek konak, OB'Ieri üretecek sekilde kullanIigiIa, mevcut bulusun yönteminde
kullanllân böcek türleri, genomlarIEl, üretilecek olan OB'Ierde mevcut olmasügerektigi
bakulovirüslerin iki (veya daha fazla) türüne duyarlüiierhangi bir böcek olabilmektedir. Böcek,
böceklerin genel olarak bakulovirüs enfeksiyonuna duyarlEl oldugu asama olan larva
asamasIa olmaIIE Böcekler genel olarak, pupal asamasi ulasmadan önce birkaç defa
deri degistirmektedir; iki ardlglE deri degistirme durumu arasliîdaki her bir asama (veya alt
asama) genel olarak demoninasyonun, spesifik bir dönemde bireysel Iarvalara uygulanan
dönem olarak bilinmektedir. Bir böcegin dönem sayEEltürIere ve çevresel kosullara baglIlEl
Son olasEldönemlerde (mümkün, en az dödüncü dönem) larvalar genel olarak büyük
boyutlarübüyük miktarlarda OB'Ierin üretimine olanak sagladiglüçin OB'Ieri üretmesi tercih
edilmektedir.
Mevcut basvuruda kullanI[g]l:lüzere, “inokülasyon” terimi, virüslerin (mevcut bulusun
yönteminin “patojenleri”) böceklere uygulanmasIElifade etmektedir. Bu tarz uygulama,
dogrudan enjeksiyonla (virüsler, oklüzyon korlarlEUa t[lZlanmayan serbest viryonlarI
formunda oldugunda tercih edilmektedir) olabilmektedir veya dogada meydana geldigi gibi
sindirim ile olusabilmektedir, burada larvalar, yapraklarda mevcut olan ve kontamine yaprak
dokusu ile sindirilen bakulovirüs OB'Ieri sindirmektedir: bu, “oral inokülasyon" veya “aglâfan
inokülasyon” durumudur. Bu ikinci inokülasyon türü için, OB'Ieri içeren bir slîljsüspansiyon
(tercihen sulu) Iarvalara oral olarak, örnegin mevcut basvurunun Örnek 2 ve 3'ünde oldugu
Hughes ve Wood'un, 1986, damlatarak besleme yöntemiyle uygulanmaktadlrîl veya OB'Ier,
böcek IarvasEilIe tüketilen bir sübstratükontamine edecek sekilde kullanlEnaktadlB bu sekilde
örnegin Iarvalara saglanan diyetle karlStlEIân katüleya yarEllatEliormda uygulanmaktadlBlar.
Daha sonrasIa, mevcut bulusun yöntemi, olasElbir yapllândlîmada, asaglêllaki adllarEl
içeren karlSIKIOB'lerin üretimine yönelik bir yöntem olarak belirlenebilmektedir:
a) es zamanlühokülasyon vasltiislýla veya birinci enfeksiyonun belirtilerinin ortaya çllîmaslîl
için gerekli süreden daha düsük bir süre gecikmesiyle sßlünokülasyon vasüsüa iki
farklElbakulovirüs türü ile böcek IarvalarII birlikte enfekte edilmesi, ve
b) polihedrozdan dolayEbeIirgin bir sekilde hastaI[IZl veya ölüm durumu gelisene kadar
inoküle larvalari gerekli kosullarda yetistirilmesi.
Ölü Iarvalarla üretilen OB'ler, örnegin suda bulunan ölü IarvalarI ögütülmesi, elde edilen
süspansiyonun filtrelenmesi, OB'Ierin, süspansiyondan ayrHÜias- ve sedimentasyon,
santrifüjleme veya iliskili bir teknik (tercihen, OB'Ierin ayrllB1alelI hlîlandlElIIhasElve
santrifüjleme ile 5-. bßküß'iaslllile çökmesine (çökertme) olanak saglanmasüieya neden
olunmasü/e OB topag süpernatanttan ayrüüiasll dahil oldugu teknikte bilinen herhangi
bir teknik ile ölü Iarvalardan saflastlîllârak izole edilebilmektedir. Izole OB'Ier, bir sulu
çözeltide yeniden süspanse edilebilmektedir, bu da oda lelakl[giIa veya sogutma (0° ila 6°
C) altlEUa veya formülasyondan önce dondurma kosullarEd-80°C ila 0°) altüda depolanabilen
OB'Ierin bir 5qu süspansiyonuna neden olmaktadlE Dondurma kosullarÇlOB'Ierin, uzun bir
dönem için depolanmasüamaçlandgilüba tercih edilmektedir. Alternatif olarak, OB'Ierin sulu
süspansiyonu Iiyofilize edilebilmekte ve oda leiakHgl-a veya sogutma aItIia
depolanabilmektedir.
Serbest (tünmamlg) ODV'Ierin elde edilmesi halinde, örnegin Örnek 2'de oldugu gibi bir
alkalin çözeltisi kullanüârak bunlarI alkalin Iizisine tabi tutulmasüvasüslýla üretilen
OB'Ierden sal-bilmektedirler.
Öncesinde bahsi geçtigi üzere, mevcut bulus, ilk defa, farklübakulovirüs türlerinin genomlarIlZl
içeren viryonlarEithbyan bakulovirüs oklüzyon korlarII (08) bir üretim yöntemini
saglamaktadlE Bu tarz OB'ler, zararllîböceklerin biyolojik kontrolü için, biyolojik insektisidler
olarak mevcut biçimde ticarilestirilen sadece bir virüs türünün genomlariüliîiçeren OB'lere
klýasla alternatif bir çözüm olarak kullanllâbilmektedir. Bu sekilde, en azIan bazIZiDDV'Ierin,
farklEbakulovirüs türlerinin genomlarIEiçerdigi, genomlarliîl, çoklu nükleopolihedrovirüslerin
genomlariîbldugu bu tarz OB'ler, mevcut bulusun bir yönüdür. AyrlEla OB'leri içeren bilesimler,
mevcut bulusun bir diger yönüdür. ZararlEböceklerin biyolojik kontrolü için bu tarz OB'lerin ve
ayrlîia bunlarEIiçeren bilesimlerin kullanIiiZI mevcut bulusa ait, özellikle mevcut bulusun
OB'lerinin, zararlEböceklerle mücadele etmesi amaçlanan formülasyonun aktif içerigi oldugu
bir diger yöndür.
Mevcut bulusun yönteminin uygulanmasIan sonra, Örnek 2'de görülebildigi üzere, karlglKi
bir OB'de tiKlanan tüm ODV'Ierin bir genotip karm- sahip olmasiEla gerek yoktur; bazllârü
sadece bir türün genomuna sahip olan nükleokapsidleri içerecektir, diger ODV'Ier, tüm
genomlarlEl, bakulovirüsün bir ikinci türüne ait oldugu nükleokapsidleri içerecektir ve bir
üçüncü tür, karlgilîl virüs ODV'leri olacaktlü burada en az iki farklEtürün genomlarüayniîl
viryonda mevcut olacaktE Bu tarz bir ODV karEEi. sahip bir 08, mevcut bulusun bir
OB'sinin bir örnegi olarak Sekil 7'de temsil edilmistir. Iki veya ikiden fazla farkIEitürün
genomunun tllZandlgiEien az bir ODV'yi içeren tüm OB'lerin, mevcut bulusun kapsamlîile
kapsandEgiiEliZbelirtmek gerekmektedir, fakat bir aynEDB içerisinde mevcut tüm ODV'Ierin,
mevcut bulusun bir OB'si olacak olan OB'nin farklElgenomlariElEiçermesi gerekli degildir.
Ayrlîla her bir tllZbnmSODV'inin sadece tek bir türün genomlarIElçerdigi, fakat en az iki
farkIEliürün genomlariEiEiçeren ODV'Ierinin birlikte t[lZiand[g]i]DB'ler, mevcut bulusun OB'lerdir.
Benzer bir sekilde, mevcut bulusun bilesimleri, birlikte sarIIJIblan iki veya ikiden fazla farklEl
çok sayiElh nükleopolihedrovirüs türünün genomlarlüçeren en az bir ODV'nin tilZiandgün az
bir OB'i içerenlerdir ve tek bir türün genomlar. sahip nükleokapsidleri içeren ODV'lerin
tlElandlgiüfakat her bir ODV'nin farklijbir türe ait oldugu en az bir OB'yi içeren bilesimlerdir.
Tüm OB'lerin, mevcut bulusun kapsamEIle kapsanacak olan bilesimin farklEtürlerinin birlikte
tllaanmlg bakulovirüslerine sahip olmaslîgereklidir. AsIIa, Örnekler 2 ve 3'te görülebildigi
üzere, mevcut bulusun yönteminin uygulanmasÇl bunlar. en az bir fraksiyonunun, virüs
türlerinin tek bir tipini içerebildigi yavru OB'lere neden olmaktadlü bir baska ifadeyle bazEl
OB'ler, inoküle edilmis sadece bir bakulovirüs türünün genomlarIEiiçermektedir ve bazEI
OB'ler, her bir ODV'nin, sadece bir genotipin genomlarIElçerdigi ODV'leri içerebilmektedir,
fakat bir aynEDB'de dahil olan farkIlZDDV'lerin genotipleri farklEblabilmektedir. Ek olarak,
mevcut bulusun karlgllZ] ODV'Ieri içeren bilesimler ayrlaa mevcut bulusun bilesimleridir ve
mevcut bulusun kapsamüberisinde kapsanmaktadlEl
Mevcut bulusun yöntemi ile elde edilen oklüzyon korlarlZI bakulovirüslerin OB'Ierinin
karakteristigi olan özelliklere sahip oldugu için, mevcut basvurunun örneklerinde kullanllân
filtrasyon teknigi ve farklEIsantrifüjIeme gibi teknikte bilinen herhangi bir teknik ile
üretilebildikleri enfekte Iarvalardan ekstrakte edilebilmekte ve/veya saflastlEIlâbilmektedirler.
Bunlar, arzu edildigi gibi, zararlEböcekIerin istilalarüle mücadele etmek üzere kullanIiEiçin
uygun olan farklEbiIesimlere neden olan katEi/eya slîlîformülasyonlar olarak (örnegin, bir
sulu, toz veya granüler formülasyon olarak) formüle edilebilmektedir.
Mevcut bulusun bilesimleri, tek bas. bilesen virüslerinden birisine klîiasla tek bir 08
inokülüm türünü kullanarak enfekte edebildikleri ve öldürebildikleri böcek türü say-I
özelligine sahiptir. Buna, tek baslEIa virüs türlerinin bilesenlerininkinden farkIÜJIan bir konak
aral[g]lEla sahip olan farkIEi/Irüs türlerinin karlglEilarIEiçeren ODV'Ier ve OB'Ier kullanilârak
ulasüüiaktadß Bu sebepten ötürü, mevcut bulusun OB'leri ve/veya mevcut bulusun
bilesimleri, zararIEböceklerle mücadele edecek sekilde kullanllâbilmektedir. Özellikle, karlgK]
virüs OB'Ierinin veya karisim virüs ODV'lerinin tek bir uygulamaslîkullanllârak iki veya ikiden
fazla zararllîlböcek türüyle mücadele edecek sekilde kullanllâbilmektedir. ZararIlZIböcek
istilalarIdan korumayül'eya bu istilalarI kontrolünü gerektiren substrat, bir bitki, bir mahsul,
bir yetistirme alanÜ/eya bir depolanmlg ürün veya benzeri veya bir zararlEböcegin bir glfila
kaynagEblan bir diger substrat olabilmektedir. Genel olarak, OB'Ierin veya mevcut bulusun
ve/veya mevcut bulusun bir bilesiminin, bir zararllîlböcekle mücadele edecek sekilde
kullanlEhasEhaIinde, insektisit formülasyonunun aktif içerigi (veya aktif içeriklerinden birisi)
olacaktlE
Örnegin, 08 bilesimleri, sulu süspansiyonlarliîl formunda oldugunda, bitkilere
püskürtülebilmektedirler. Biyolojik insektisidler olarak kullanüâcak olan 08 bilesimleri de
havayla püskürtme, toprakla püskürtme, toz uygulamasü sulama suyunda uygulama gibi
diger yöntemler vasltiisüla, sis, bugu vaslßslýla veya virüs ile öldürülen böceklerin veya
bunlari parçalarII Inokülasyonu vaslßlea uygulanabilmektedir.
Mevcut bulusun OB bilesimlerinde, tarlsal olarak uygun eksipiyanlar ve/veya adjuvanlar gibi
diger bilesikler mevcut olabilmektedir, özellikle arzu edilen uygulama yöntemine göre uygun
formda uygulanacak olan bilesim preparasyonuna olanak saglamasIan dolayEladjuvanIar
olarak görülebilen bilesikler mevcut olabilmektedir. Ayrlîa bilesim, örnegin bir suni gübreyi
veya bir diger pestisidi veya OB'lerin bulaslamjllüittlüi [gllZHJilinen bir bilesigi içerebilmektedir.
Yukari aç[lZland[giEilizere, serbest ODV'ler, oral olarak inoküle edildiklerinde bir enfeksiyona
mahal verebilmektedir. Bu sekilde, mevcut bulusun karlglE virüs ODV'Ierini içeren bilesimler
de biyolojik Insektisidler, ayrlEh karElKl virüs OB'lerini ve karlgEl virüs ODV'leri Içeren
bilesimler olarak kullanllâbilmektedir. ZararllZlböceklerle mücadele etmek üzere mevcut
bulusun OB bilesimlerinin kullannldlîliiakka verilen kapsamlar da mevcut bulusa ait, örnegin
karlSlEl virüs ODV'Ierini içeren bilesimler ve kargllg virüs OB'lerini ve serbest karEK] virüs
ODV'lerini içeren bilesimleri: uygulama yöntemlerine, zararlEböcek istilalarIan korunmaya
veya bunlarla mücadele etmeye yönelik substratlar, aynEbilesimde mevcut olabilen diger
bilesikler için uygulanabilmektedir.
Mevcut basvurunun Örneklerinde görülebildigi üzere, farklEtürde genomlarüçeren viryonlar,
mevcut bulusun OB'lerini üretmek üzere böceklere (tercihen enjeksiyon vasltiislýla)
asllânacak sekilde kullanüâbildikleri için mevcut bulusun yönteminin uygulanmasEliçin
kullanlgllîblabilmektedir. Bunlar, birlikte enfeksiyon deneyleri için kullanüâbilmektedir veya
arzu edilen uygulama kosullarlEla ve her bir bakulovirüs uygulama slßsEl/eya OB'lerin elde
edilen bilesiminde her bir bakulovirüsün arzu edilen oranDle kargllîl OB'leri elde edecek
sekilde uygulanan iki bakulovirüslerin uygulamasüarasIaki gecikmeye baglüolarak bir
karlglkî OB bilesimini elde etmek üzere her bir virüs türünün oranIlearar verecek sekilde
faydallZbilgiyi saglayabilen deneylerin sonucu olabilmektedirler. Bu sebepten ötürü, iki veya
ikiden fazla çoklu nükleopolihedrovirüs türünün genomlarIlZiçeren oklüzyon viryonlarlîtla
(ODV'ler) mevcut bulusun bir yönüdür.
Bulus, asagßiaki örneklerle ve sekillerle daha kapsamlElîiir sekilde açllZlanacaktIE
ÖRNEKLER
PCR deneyleri, asagldh Tablo 1'de gösterilen primerler kullanüârak uygulanmlStE
Primerler Sekanslar (Genomdaki nükleotidleri) Amplifikasyonun
güçlendirmeye yönelik amacü
fragman Iokalizasyonu
Seie0.1 5'-CTATAGCTCGACGCTCGGTG- 3' SeUSZ-A'nl ieO geni (nt SeUSZ-A DNA'nI
Seie0.2 5'-ATCGTCTICGATACCGCGAG-3' SeUSZ-A'nl ieO geni (nt SeUSZ-A DNA'nI
Sfie0.1 5'-ATGAGTA'I'I'AATCATGA`ITC-3 ' SfNIC-B'nin ieO geni (nt SfNIC-C'nin DNA'nI
Sfie0.2 5'-TCITGGCAAATGT|'ACACTG-3' SfNIC-B'nin ieO geni (nt SfNIC-C'nin DNA'nI
qSe5.F S'-AGCAGCGAGCCAATGCAGTA-3' SeUSS-A'nISfS geni (nt SeUSZ-A DNA's-
(Ileri) (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) 6274-6293) kantifikasyonu
qSe 5.R 5'- CTFCTIGCAACCGCTCGTIC-3' SeUSZ-A'nIseS geni (nt SeUSZ-A DNA's-
(Geri) (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6) 6354-6373) kantifikasyonu
qSfCcath.2F
qSszf36.2R
Ac.1 (Ileri)
Ac.2 (Geri)
sm (Ileri)
'-ACGCCGCG'ITTAGTAACAGC-3'
(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7)
'-TAAAACTATTTCTTGCAATC-3'
(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8)
(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9)
(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10)
`-ACGCCG`I'I'CAAAGACACGAG-3'
(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 11)
SfNIC-C'nin silinmis
bölgesinin yakIigEi
C'nin silinmis bölgesinin
yakIEgiEl
özgün geni ac97 (nt 84850-
84869)
AcC6'n özgün geni ac97 (nt
SfNIC-B'nin özgün geni sf43
SfNIC-C'nin DNA'sII
ka ntifikasyonu
SfNIC-C'nin DNA'sII
ka ntifikasyonu
AcC6 DNA's-
ka ntifikasyonu
AcC6 DNA's-
ka ntifikasyonu
SfNIC-B'nin DNA'sII
ka ntifikasyonu
Sf.2 (Geri) 5'-CCGCI l IGCCTI'CGACATAG-3' SfNIC-B'nin Özgün geni Sf43 SfNIC-B'nin DNA`S|EJI
(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 12) (nt
ka ntifikasyonu
AcDNApol.1 (Ileri) 5`-CAAATGTAGAATCTGTGTCG-3' AcC6'nI DNA polimeraz geni Hücre kültürü
DNA'sII tespiti.
AcDNApoI.2 (Geri) 5`-CAGCCATCACAAACACGCGC-3' AcC6'nI DNA polimeraz geni Hücre kültürü
DNA'sII tespiti.
SfDNApoI.3 5'-CAACGACATCAATAGAGTGC-3' SfNIC-B'nin DNA polimeraz Hücre kültürü
DNA'lelI tespiti.
SfDNApoI.4 5'-AAATA'I'I'GCTAAGCACATCG-3' SfNIC-B'nin DNA polimeraz Hücre kültürü
DNA'leiI tespiti.
- DNA ekstraksivonu, sindirimi ve analizi
Viryonlar,
sodyum dodesil sülfata sahip 109 OBs/ml içeren 100 |Jl OB süspansiyonu karlgtlEIilârak ve
60°C'de 10 dakikaligllüla inkübe edilerek OB'Ierden saIlEmStlEI Çözülmemis OB'Ier ve diger
çöküntü, düsük hlZIIZIsantrifüjleme (3,800 x 9, 5 dakika) ile çiEarUBilStE Viryonlarüçeren
süpernatant, 50°C'de 1 saatligine 25 ul proteinaz (K) (20 mg/ml) ile islenmistir. Viral DNA,
doymus fenol ile iki defa ve kloroform ile bir defa ekstrakte edilmistir ve alkol çöküntüsü ile
(Tris-EDTA, pH 8) süspanse edilmistir. DNA konsantrasyonu, 260 nm'de optik sogurum
okunarak öngörülmüstür.
Endonükleaz kEBhma analizi için, 2 ug viral DNA, 10 U enzimi Psd (Takara) ile karlgtlEllB'ilgl
ve 37°C'de 12 saatligine inkübe edilmistir. Reaksiyonlar, 4 pl yükleme tamponu eklentisi
(%025 aglülikynacim cinsinden bromofenol mavisi, %40 aglBiiEyhacim cinsinden sakaroz) ile
durdurulmustur. Elektroforez, 10 ila 24 saatligine 20 V'de TAE tamponunda (0.04 M
Trisasetat, yatay %1 agaroz jeller kullanilârak uygulanmlStlE DNA
fragmanlarÇletidyum bromür ile boyanmlStlee bir UV transillüminatöründe görsellestirilmistir
(Chemi-Doc, BioRad, California, ABD).
- Örnek 1: S. exiaua MNPV (SeMNPV) ve S. fruaiperda MNPV'nin (SfMNPV) pif
genleri arasIdaki uyumluluk
Bu örnekte, iki bakulovirüs türünün, aynEl hücrede kopyalanabildigine ve ODV'de
konumlandEIlân ve bakulovirüslerin peroral iletimi Için temel olan iki proteini (PIF1 ve PIF2)
paylasabildiklerine dair kanEHEunmaktadlÜ
A) Mevcut örnegin deneylerinde kullanllân iki virüs, asaglki gibidir:
- Spadoptera exigua MNPV (SeMNPV), SeUSZ-A varyantlZl SeMNPV'nin
SeUSZ-A varyantÇl nükleopolihedrovirüs SeMNPV'nin en az dört genotipik
varyantI en az dört genotipik varyantlarII (Muhoz ve dig., 1999) bir heterojen
karlgmlüçeren, pancar kurdunun (Spodoptera eX/gua) larvalarIEenfekte eden
ve öldüren insektisid Spod-X® (Certis ABD, LLC) biyoinsektisidin temeli olan
Florida'dan SeUS-2-A izolatIan kaynaklanmaktadlîl SeUSZ-A, islenmis IarvalarI
yaklaslKJ olarak %10'unu öldürmüs olan OB'Ierin bir düsük dozunu (LDIO) sindiren
. eX/'gua/nlEl larvalarlElI in v/i/o klonlamasElIe elde edilmistir. SeUSZ-A, SeUSZ
izolatlîida mevcut daha bol varyanttlElve sadece 5. eX/'gua IarvalarEiJçin etkisizidir.
Bu varyant ayrlEla Se301 hücre dizisinde in vitro çogalabilmektedir.
- Spodoptera frugiperda MNPV (SfMNPV), SfNIC-C varyantü SfNIC-C
varyantü en az dokuz genotipik varyantlarII bir heterojen karlglînlIEliçeren
(SimÖn ve dig., 2004b), genetik olarak ve fenotipik olarak karakterize edilen
SfMNPV'nin bir Nikaragua izolatIan kaynaklanmaktadß (Simön ve dig.,
edilmistir (Simon ve dig., 2004b). Bu varyant, p/'fJ ve p/'fZ genlerini elimine eden
bir ~16 kb genomik delesyona sahiptir, bu da bur varyantlEl, sindirim ile etkisiz
oldugu anlam. gelmektedir, fakat duyarIlZI konak böceklerine inokülüm
enjeksiyonundan sonra bir üretken enfeksiyonunu üretebilmektedir. Bu varyantÇl
hücre dizilerinde (Sf21 ve Sf9) çogalabilmektedir.
SeMNPV ve SfMNPV, alfabakulorivürslerin Hlogenetik olarak iliskili bir grubuna aittir
(Grup II; Herniou ve dig., 2004), enfekte edebildikleri konak türlerde farklUJE
gösterebilmektedirler. SeMNPV, 5. eX/'gua larvalari özgü olurken, SfMNPV, 5.
enfekte edebilmektedirler. SfMNPV ile 5. ex/gua'nl ölümcül enfeksiyonu, bir kaç
OB'Ierin üretimine neden olmaktadE ve böcek derisi, ölümden sonra
parçalanmamaktadlEl(Simön ve dig., 2004a).
B) Genomik DNA'nI endonükleaz klîlflhma analizi ile SeUSZ-A ve SfNIC-C'nin
farklüâsliü
SeUSZ-A ve SfNIC-C, elektroforez Psz'î (Takara) klglnhmasüle genomik DNA islemi,
bundan sonra bir agaroz jelinde elektroforez ile farklllâsabilmektedir. Her bir genomik
DNA'dan elde edilen klgflhma profilleri net bir sekilde ayrIlB ve bir numunede söz
konusu genomlardan birisinin (veya her ikisinin) mevcudiyetinin tanIiIanmas. olanak
saglamaktadlîl(bkz. Sekil 2).
C) SeUSZ-A kullanüârak p/fJ/p/'Q tamamlama deneyleri ve delesyon genotipi SfNIC-C.
. ex/guanlül dördüncü dönem IarvalarÇlSeUSZ-A ve SfNIC-C ODV'Ierin bir karlglEliII
(her bir virüsün OB'lerinin esit sayllârüarlgtlîllârak elde edilmektedir) intrahemokoelik
enjeksiyon ile inoküle edilmistir. Enjekte larvalar, ölüm ve elde edilen OB'Ier, öncesinde
açllZIanan yöntem ile toplanana (Caballero ve dig., 1992) kadar Greene ve dig. (1976)
tarafIan açlKland[gll:lüzere bugday tohumu, maya ve soya fasulyesine baglElyarEl
sentetik diyette bireysel olarak yetistirilmistir. KElacasÇl steril suda kadavralarI
homojeneizasyonundan ve filtrasyon ve diferansiyel santrifüjleme ile elde edilen
süspansiyondan saflastülnadan sonra ölü Iarvalardan ekstrakte edilmislerdir.
Bu OB'Ierden ekstrakte edilen DNA analizi, SeUSZ-A varyantII mevcudiyeti ile tutarlEl
olmustur, fakat klîlfliama profilinde herhangi bir SfNIC-C kanlülîlgözlemlenmemistir
(Sekil 3, aynüjeneyin birinci ve ikinci tekrar. tekabül eden Seritler 3 ve 5). Varyanta
özgü primerler (Tablo 1: Sfie0.1 ve Sfie0.2, bir baska ifadeyle SEKANS KIMLIK
NUMARASI:3 ve SEKANS KIMLIK NUMARASI:4) kullanarak PCR amplifikasyonu, küçük
miktarda SfNIC-C genomik DNA'nlEl, enjekte 5. exi'gua larvalarIda (Sekil 4, seritler 3 ve
) üretilen OB'Ierden ekstrakte edilen DNA mevcut oldugunu ortaya çlKlarmlStB
Bu OB'Ier, 107 ve 109 OBs/mL konsantrasyonlaria 5. #uç/perda ikinci Iarvalara
beslenmistir. Inoküle larvalar, diyette bireysel olarak yetistirildiginde, sßsbîla %30 ve
taraflûdan öldürülmüs 5. frag/perda larvalarütian toplanan OB'lerden DNA'nI PCR'si ve
Psd analizleri, tek baslEla SfNIC-C genotip mevcudiyeti ile tutarlEblmustur; SeUSZ-A
DNA mevcudiyetini gösterecek herhangi bir kan[El gözlemlenmemistir. Bu sonuç,
genotipe özgü primerlerle (sßsMa Seie0.1 ve Seie0.2, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1
ve SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2) yüksek derecede duyarlElkantitatif (gerçek zamanlIII
PCR teknigi (qPCR) kullanlßrak onaylanmlSIB SeUSZ-A'nlEl genom fragmanlar..
herhangi bir amplifikasyonu tespit edilmemistir (bkz. Sekil 4, seritler 10 ve 12).
Bu sonuçlar, SeUSZ-A'nlEl, 5. frugwerda larvarlarHa çogalamad[glIEböstermektedir,
bu da deneysel karlglKl virüs popülasyonundan SeUSZ-A varyantII elimininasyonuna
neden olmustur. Bu sonuçlar ayrIEla SfNIC-C genotipinin, bu proteinlerin yoksunlugunda
olasIJJImayan perol olarak inoküle 5. frugiperda IarvalarII orta baglBak hücrelerinde
primer enfeksiyonunu baslatmak üzere SeUSZ-A ile üretilen PIF1 ve PIF2
proteinlerinden avantaj saglayabildigini göstermektedir. Bu sekilde, SfNIC-C'yi içeren
ODV'Ierin, PIF1 ve PIF2'yi edinebildigi tek yol, SfNIC-C ve SeUSZ-A olmasElhalinde, aynEl
. eX/'gua hücresinde es zamanlüolarak çogaltllâcaktß Her bir virüsün genomlarEl
araledaki pif-1/pif-2 bölgesinin rekombinasyonunu içeren alternatif bir hipotez, 5.
frug/perda IarvalarIa (tek basEla SfNIC-C genotipini içeren) üretilen OB'lerin ikin
jenerasyonunun, 5. #ag/perol; larvalarIa aglîdan etkisizdir, bu da PIF1 ve PIF2
proteinlerinin, birlikte enfekte 5. exi'gua IarvalarIa üretilen OB'lerin inokülasyonundan
sonra SfNIC-C genotipi ile üretildigini göstermektedir.
Bu sebepten ötürü, bu yöntemle, mucitler, bakulovirüslerin iki yaklEdan iliskili türü ile 5.
eX/'gua hücrelerinin birlikte enfeksiyonunu göstermistir: SeMNPV ve SfMNPV.
Bu sonuçlardan, asag-kilerin sonucuna varuâbilmektedir:
(a) Bir 5. eXi'gua hücresi, iki virüs türü ile es zamanIIZI olarak enfekte
edilebilmektedir, her ikisi de çogalabilmektedir.
(b) PIF1 ve PIF2 proteinleri, 5. #ugiperda IarvalarIa SfNIC-C (p/'fgenlerinden
mahrumdurlar) aglîdan bulaslEIIIglIERurtarabilmektedir.
Ç) Spodoptera eX/'gua IarvalarIa ardlgllîl geçislerden sonra karEllZJ virüs OB'lerinde
tlElanmlgSeUSZ-A ve SfNIC-C Etarü
SeUSZ-A ve SfNIC-C'nin ODV'Ierinin karlgliîlilarlîlile enjekte edilmis olan Iarvalarda
üretilen karisim virüs OB'leri (bkz. Bölüm C), aglîtlan 5. eX/gua IarvarlarIa altürdlglkî
geçisi (Pi ila PG) içeren bir deneyde inokülüm olarak kullanmlgtlîlßeçis 0, PO: SeUSZ-A
085 ve SfNIC-C OB'lerin 1:1 oranIda karlgliîlilarian sal-n ODV'Ier kullanllârak 5.
eX/'gua larvalari birlikte enfeksiyonu ile elde edilmektedir).
Her bir geçiste (PO ila Pö) toplanan OB'Ierde nispeten bol olan bu virüslerdeki degisimleri
belirlemek için, DNA, OB numunelerinden ekstrakte edilmistir ve bir ABI PRISM 7900HT ED
döngüleyicide SYBR Green (Takara) ile qPCR'ye tabi tutulmustur. DNA, her bir geçiste
numune aI-n OB'lerden ekstrakte edilmistir ve qPCR kantiûkasyonuna tabi tutulmustur;
sonuçlar, 100 nanogram SeUSZ-A genomik DNA bas. SfNIC-C genomik DNA nanogramlarü
olarak gösterilmektedir.
SeUSZ-A DNA'nI amplifikasyonu için, spesifik primerler kullanHB1lg±LEl(qSe5.F ve qSe5.R,
sÜsMa SEKANS KIMLIK NUMARASI:5 ve SEKANS KIMLIK NUMARASI:6), SeMNPV'ye özgün
se5 geninde hedeflenmistir. SfNIC-C DNA'nI amplifikasyonuna, bu virüste 16 kb delesyonun
yukar- yönde ve asaglîlyönde 50 nükleodini (nt) güçlendirmis olan spesifik primerler
(qSfCcath.2F ve qSszf36.2R, sßsma SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7 ve SEKANS KIMLIK
NUMARASI:8) kullanilârak ulasilüilgtü Kalibrasyon egrileri, öncesinde bahsi geçen primer çifti
kullanliârak SeUSZ-A veya SfNIC-C DNA'nlEi klonlanmEl fragmanlarIEiçeren plazmid DNA
amplifikasyonu ile üretilmistir. Plazmid DNA, spektrofotometri ile ölçülmüs ve 10'1 ng a 10`9
ng DNA bölgesinde bir kalibrasyon egrisini üretmek üzere on kat seri seyreltiye tabi
tutulmustur. Primer hibridizasyon slîlakligiEI60°C olmustur ve uzatma süresi 30 saniye
olmustur.
Tek virüs OB'Ierinden ekstrakte DNA sadece, ilgili virüsü hedef alan primerleri Içeren qPCR
reaksiyonlarIa pozitif amplifikasyon üretmistir. PÜ'I OB'Ierinden ekstrakte edilmis DNA
numunelerinin, SeUSZ-A DNA'nI %95.13±1.25'ini (ortalama ± standart hata [SE]) ve SfNIC-
C DNA'nI %4.87±1.25'ini içerdigi öngörülmüstür. P1, Pz, P3, P4, Ps ve Pg'da numunesi alin
düsmüstür.
- Örnek 2: Iki bakulovirüs türünün genomlarII birlikte tEIZianmasEive birlikte
sarmnaslîl
Bu deneylerde kullanilân iki virüsleri asagIki gibi olmustur:
- Autographa californica çoklu nükleopolihedrovirüs (AcMNPV). AcMNPV,
A/phabacu/ovirus geninin türüdür. Grup I NPV'lere ait olan, BV membranIda bir
glikoprotein (GP64) mevcudiyeti ile karakterize edilen bir çoklu kapsid virüsüdür. Mevcut
çallginada, tamamen slîeialanmlgbirinci bakulovirüs genomu olan klonlanmlglgenotip AcC6
Sf9 hücre dizilerinde iyi çogalmaktadlîlve 5. frugiperda IarvalarIda bir üretken ölümcül
enfeksiyonu üretebilmektedir.
- Spodoptera frugiperda çoklu nükleopolihedrovirüs (SfMNPV). Bu, BV'de F
proteininin mevcudiyeti ile karakterize edilen bir Grup II NPV'dir (Herniou ve dig., 2004)
ve bu sekilde, AcMNPV'den filogenetik olarak mesafelidir. Mevcut çallSi'nada, SfNIC-B
isimli, Nikaragua'dan sokak türü izolatta (SfNIC) mevcut en bol genotip olan in vitro klon
kullanüüilstlîlßimön ve dig., 2004b). SfNIC-B, bir tam genomdur (GenBank erisim
bulas-E
A) SfNIC-B ve AcMNPV genomlarIlîÇeren karlgllîl virüs ODV'Ierin ve OB'Ierin üretimi
KarlSIKl virüs ODV'Ieri ve OB'Ieri üretmek için, 5. #ugiperda dördüncü dönem IarvalarÇI
damlatllârak besleme yöntemi kullanilârak her bir virüsün 5x107OB/ml bir
konsantrasyonunda bir 1:1 oranIda SfNIC-B OB'lerin ve AcMNPV OB'lerin karElElilarElle
inoküle edilmistir (Hughes & Wood, 1986). 5. frug/'perda larvalarüher iki virüse duyarlIlEI 24
kadar karanlltha kontrol edilen lebkllEta (25 °C) Örnek 1'de kullanüân yarElsentetik
laboratuvar diyetinde bireysel olarak yetistirilmistir. OB'ler, enfekte kadavralardan
toplanmlStlEl ve öncesinde açHZJandEglEüzere filtrasyon ve santrifüjleme ile saflastlEllB'ilStlEl
(MuFioz ve dig., 1998).
Bu OB'lerde her iki virüsün mevcudiyetini onaylamak için, genomik DNA ekstrakte edilmistir
ve SfNIC-B DNA'ylîlgüçlendirmek üzere SfDNApoI.3 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:15) ve
SfDNApoI.4 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:16) primerleri veya AcMNPV DNA'yEgüçIendirmek
üzere AcDNApol.1 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:13) ve AcDNApoI.2 (SEKANS KIMLIK
NUMARASI:14) primerlerini kullanarak PCR amplifikasyonuna tabi tutulmustur.
AcMNPV DNA amplifikasyonu, 704 bp bir ürüne neden olurken, SfNIC-B DNA'nI
amplifikasyonu, 964 hp bir ürününe neden olmustur (Sekil 6). OB'Ierden ekstrakte edilmis
DNA numunelerinde her iki virüsün genomik DNA mevcudiyetinin tespiti, her iki virüsün,
inoküle böceklerde çogald [gilügiöstermektedin
ODV'Ierde her iki virüsün birlikte sarllüiaslîlve OB'lerde birlikte tllâanmayEgöstermek için,
ODV'Ier, 28 °C'de 30 dakika esnasIda 0.1 M sodyum karbonat çözeltisinin bir esit hacmi
kullanilârak alkalin Iizisi ile 08 süspansiyonun (IOSOB/ml) islenmesi vaslüslîla salümaktadEl
ODV'Ier, öncesinde açlEIandlgiEüzere (King ve dig., 1992) Sf9 hücreleri (Invitrogen, Kat no.
B825-01) kullanllârak plak deneyine tabi tutulmustur. Bundan dolayüseri seyreltiler (10'1 -
106) uygulanmlgtiîlve her bir süspansiyonun 200 ul hacimleri, bir hücre kültürü çanagII
haznelerinde 106 Sf9 hücrelere yerlestirilmistir. Inoküle hücreler, 1 saatligine bir orbital
çalkay- inkübe edilmistir. Daha sonraletla ortam çilZiarHBrlSIlE ve %10 fetal buzagEl
serumu ile TCIOO'de 2 ml %1 agaroz, her bir hazneye yerlestirilmistir. Daha sonrasIa,
hücre kültürü plaklarDS ila 6 günlügüne 28 °C'de inkübe edilmistir. Net olarak izole edilmis
plaklar toplanmlgi proteinaz (K) ile islenmis ve SfNIC-B'ye özgü primerler (SfDNApol.3 ve
SfDNApoI.4) veya AcMNPV'ye özgü primerler (AcDNApoI.1 ve AcDNApoI.2) kullanilarak PCR
ile analiz edilmistir.
Genel olarak, üç tekrardan sonra, klonlarI %3.82±2.73'ü (ortalama ± standart sapma) tek
bas. AcMNPV'yi içerirken, plaklarI yaklasiKl olarak %48.1±8.9'u, tek bas. SfNIC-B'yi
içermis ve plaklarI kalan yaklasiiZI %48.1±6.5'i, her iki virüsün bir karEiüIEiçermistir.
Deneyin her bir tekrarIa ve ortalama olarak (± standart sapma) elde edilen sonuçlar,
asaglEIiaki Tablo 2'de gösterilmektedir.
Virüs Tekrar %1 (n) Tekrar %2 (n) Tekrar %3 (n) Ortalama ± S.S.
n, uygulanan her bir tekrarda AcMNPV, SfMNPV veya her iki virüsün mevcudiyeti ile analiz edilmis hücre kültürü
plaklarII say_ 55., standart sapmaygöstermektedir.
Elde edilen karEIEvirüs ODV'Ieri tiiZiayan bir karlSIKlvirüs OB'nin bir sematik örnegi, Sekil 7'de
görülebilmektedir. Bu, sadece her iki virüsün, aynEDDV'de mevcut olmasEhaIinde mümkün
olacaktlEi bu da aynEiiiücrede çogalan her iki virüsün, aynIZiDDV'de birlikte sariiliîbldugunu ve
aynElDB'de birlikte tiEiaIlIrbldugunu göstermektedir.
Bu sonuçlar, Sf9 hücrelerinde uç nokta seyrelti deneyi ile istatistiksel olarak onaylanmlgtß
(King ve dig., 1992). Tek bir ODV ile enfeksiyona, düsük ODV konsantrasyonlar- sahip Sf9
hücrelerinin enfeksiyonundan sonra ulasiiB1lgtlEi Dolaylgiýla, haznelerin, ODV'nin etkisiz bir
dozu ile inoküle edilmemesi olasiIJJZlarD Poisson dagiDEiilEb göre hesaplanabilmektedir.
Bundan dolayüODV'Ier, her iki virüsle inokülasyondan sonra ölen 5. #uç/perde? IarvalarlEUan
elde edilen bir 109 OB/ml süspansiyonundan sallEinlStlEl Bu ODV'Ierin uç nokta seyrelti
deneylerinin sonuçlariZiTablo 3'te sunulmaktadE
Tablo 3. Uç nokta seyrelti deneyinin
P(1) %14 %11 %5
P(2) %1 % 1 %1
P(3) %0 %0 %0
Pozitif hazneler, bakIvirüs enfeksiyonunun (OB'Ier) patolojik belirtilerine sahip en az bir hücreyi içerenlerdir.
P(O) her bir tekrarda, enfeksiyon belirtileri olmadan bir hazneye sahip olunmasi dair hesaplanmlglolaslillîtlîl
P(1), P(2) ve P(3), Poisson daglEllîiiEile öngörüimüstür ve özel bir haznede hücrelerin, süslîla bir, iki veya üç
ODV ile enfekte edilmesi olaleJglElEifade etmektedir.
Enfekte olmayan haznelerin yaklasllîi olarak %90'E1Ie sonuçlanmßi bir seyrelti seçilmistir, bu
da tek bir ODV'nin, enfekte haznelerin yaklasllZl olarak %10'unda bir enfeksiyonun
baslatllîhasian sorumlu olacagü/e iki veya ikiden fazla ODV'nin, haznelerin %1'nden daha
azIa enfeksiyondan sorumlu olacagEliJir durumu yanleinaktadlÜ
Seçilmis seyreltide (enfekte olmayan haznelerin %90'0] enfekte olmus olan tüm hazneler,
yukarida açlKlandfgElgibi PCR ile analiz edilmistir. Tüm durumlarda, her iki virüsün
mevcudiyeti onaylanmigtlEl (Sekil 8), olas- teorisinin, her iki virüsün, bu enfeksiyonlarü
baslatan tek ODV'lerinde mevcut oldugunu gerektirdigi bir durumdur.
- Ornek 3: Birinci ve ikinci virüsün inokülasyon arasIdaki aralEIiI enfekte
böceklerdeki farklEivirüs türlerinin birlikte sarllînasII ve birlikte tllaanmasII
grevalanslüatkilemektedir
A) Bu deneylerde kullanllân iki virüsler, asaglöhki gibi olmustur:
- Autographa californica çoklu nükleopolihedrovirüs (AcMNPV): klonlanmlgl
genotip AcC6
- Spadoptera frugiguerda çoklu nükleopolihedrovirüs (SfMNPV): klonlanmlgl
genotip SfNIC-B
B) Çift olarak enfekte edilmis 5. frug/;oerda IarvalarIa geçici duyarliEIKl penceresi: larva
mortalitesine dair etkiler
Böcek mortalitesinde iki farklElvirüs türü ile enfeksiyon arasiElzlaki aralllZl etkisini
belirlemek için, güncel olarak derisi degisen 5. Üugi'perda dördüncü dönem IarvalarÇl
damlatllârak besleme yöntemi (Hughes & Wood, 1986) kullanlßrak bir 5 x 107 OB/ml
birinci virüsün bir süspansiyonu ile oral olarak inoküle edilmistir. Inoküle edilmis
böcekler, 25 °C'de yarElsentetik laboratuvar diyetinde bireysel olarak yetistirilmistir.
Inokülasyondan 12, 24, 48 veya 72 saat sonra, bu larvalarlEl, ikinci virüsün OB'lerinin
aynükonsantrasyonunda beslenmesine izin verilmistir. Tüm durumlarda, 24 larva
grubu, her bir islemde kullanllîhlgtlîlve deney, birinci inokülüm olarak AcC6 OB'Ier ve
ikinci inokülüm olarak SfNIC-B OB'Ier ve tam tersi kullanllârak üç defa uygulanmlSIlEl
Bir defa veya iki defa inoküle edilmis Iarvalar, pupasyona veya ölüme kadar yarlZl
sentetik laboratuvar diyetinde bireysel olarak yetistirilmistir.
Polihedroz hastal[glIan dolaylîilnortalite prevalansÇldeneysel islemler (Varyans Analizi:
mortalite yüzdesine önemli derecede farklllilZl gösteren üç gruptan birisine
sIlflhndlîllîhlStElUukey dürüstçe anlamlEtlark testi, P50.05) (Sekil 9):
- (i) tek baslîila AcC6 OB'Ier ile islenmis Larvalar: bu silem, virüs mortalitesinin en
düsük prevalans. neden olmustur.
- (ii) tek basima SfNIC-B OB'Ier ile, karElEiilarda her iki virüsün OB'Ierinin es zamanllZl
uygulamaslIile veya SfNIC-B OB'ler ile, bundan sonra AcMNPV OB'Ier vasltâslýla
islenmis larvalar: tüm bu islemler, benzer bir sekilde yüksek mortalite prevalanlela
neden olmustur.
- (iii) ilk olarak AcC6 OB'Ier ve daha sonrasIa SfMNPV OB'Ier ile islenmis larvalar:
mortalite prevalanslîtek bas. AcC6 OB'Ier ile islenmis larvalarda gözlemlenenden
hafifçe, fakat önemli ölçüde daha yüksek olmustur.
Bu sonuçlar, aynülnomentte her iki virüsün es zamanllIénfeksiyonuna klýlasla, 12 ila 72
saatlik gecikmelerin, öncesinde AcC6 OB'Ier ile islenmis olan böceklerde SfNIC-B
OB'Ierin ölümcül etkisinde önemli bir azalmaya neden oldugunu göstermektedir.
Enfeksiyonlar arasIaki süre gecikmesi, karlglEJ OB'lerin üretiminde elde edilen
mortaliteyi optimize etmek üzere önemli bir faktördür.
C) FarkllZlaralllZJarda farklü/irüs türleri ile inoküle edilmis larvalarda üretilen OB'lerin
bilesimi.
Birinci ve ikinci inokülasyon islemleri aras-aki geçici aral[lZl DNA ekstraksiyonu,
bundan sonra öncesinde açlßandgllgibi virüse özgü primerler kullanüârak (bkz. Tablo
1) her bir virüs DNA'sII qPCR kantifikasyonu ile belirlendigi üzere yavru OB'Ierde her
bir virüsün oranlarIEletkilemektedir. Bu sonuçlar. Istatistiksel analizi, bes ayrEl
grubunun mevcudiyetini tanllamlStlElWaryans analizi: Fms =187.57; p<0.001):
(i) Tek bas. AcC6
(ii) Tek baslEb SfNIC-B
(iii) es zamanlEbIarak her iki virüsle ve SfNIC-B OB'IerIe ilk islemleri içeren tüm
islemlerle islenmis Iarvalar
(iv) ilk olarak AcC6 OB'Ieri ile ve 12 veya 24 sonra SfNIC-B OB'Ieri ile islenmis
(v) ilk olarak AcC6 OB'Ieri ile ve 48 veya 72 sonra SfNIC-B OB'Ieri ile islenmis
Ilk olarak AcC6 OB'Ier ile ve 24 veya 48 saat sonra SfNIC-B OB'Ier ile enfekte edilmis
larvalar, her bir virüsün yaklasIKl olarak bir 1:1 oranIEiçeren yavru OB'Ieri üretmistir.
Larvalar, iki farkIElvirüs türü ile inoküle edildiginde, her iki virüs, virüs tarafian
öldürülmüs böceklerden toplanan yavru OB'Ierde degismez bir sekilde mevcut olmustur.
D) ODV'Ierde farkllîlirüsün birlikte sarllîhasII ve OB'Ierde birlikte thbnmanI etkileri
ODV'Ierin virüs bilesimi, Örnek 2'de açiElandigiEgibi plak deneyi ile analiz edilmistir.
Birinci ve ikinci inokülasyon arasIdaki süre, tek bir türün veya her iki türün
genomlarII (viryonlarIIEl) oranIlîlarttEilgiEiçin, inokülasyonlar arasEtlaki süreye ve
birinci veya ikinci virüsün benzerligine göre birlikte degiskenlik göstermistir (Sekil 11).
Örnegin, AcC6 OB'lerle bir inokülasyondan 24 saat sonra, SfNIC-B ile inokülasyon,
karlSlKlvirüs viryonlarEßerisinde her iki virüsü içeren ODV'Ierin yaklaslßolarak %50'si ile
yaklasllZl olarak %50 AcC6 genomlarIEIve %50 SfNIC-B genomlarIlIliçeren yavru
OB'Iere neden olmustur.
Refera nsla r
Ahn, M., Song, M., Oh, E., Jamal, A., Kim, H., Ko, K., Choo, Y., Kim, B. & Ko, K. (2008)
Production of therapeutic proteins with baculovirus expression system in insect cell.
Entomological Research 38: 571-878.
Arella, M., Devauchelle, G. & Belloncik, S. (1983) Dual infection of a Iepidopterean cell
line with the cytoplasmic polyhedrosis virus (CPV) and the Chilo iridescent virus (CIV).
Annales de I'Institut Pasteur/ Virologie 134: 455-463.
Argaud, O., Croizier, L., Lopez-Ferber, M. & Croizier, G. (1998) Two key mutations in
the host-range specificity domain of the p143 gene of Autographa californica
nucleopolyhedrovirus are required to kill Bombyx mori larvae. Journal of General
Virology 79: 931-935.
Ayres, M.D., Howard, S.C., Kuzio, J., Lopez-Ferber, M. & Possee, R.D. (1994) The
complete DNA sequence of Autographa californica nuclear polyhedrosîs virus. Virology
202: 586-605.
Burges, H.D., Croizier, G. & Huber, J. (1980) A review of safety tests on baculoviruses.
Entomophaga 25: 329-339.
Caballero, P., Zuidema, D., Santiago-Âlvarez, C., Vlak, J.M., 1992. Biochemical and
biological characterization of four isolates of Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis
virus. Biocontrol Science and Technology, 2: 145-157.
Clavijo, G., Williams, T., Simon, O., MuFioz, D., Cerutti, M., Lopez-Ferber, M. &
Caballero, P. (2009) Mixtures of complete and pif1- and pif2-deficient genotypes are
required for increased potency of an insect nucleopolyhedrovirus. Journal of Virology
Croizier, G., Croizier, L., Argaud, O. & Poudevigne, D. (1994) Extension of Autographa
californica nuclear polyhe-drosis-virus host range by interspecific replacement of a
short DNA-sequence in the P143 helicase gene. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America. 91: 48-52.
Garzon, S. & Kurstak, E. (1972). Infection double inhabituelle de cellules d'un
arthropode par le virus de la polyédrie nucléaire (VPN) et le virus irisant de Tipula
(TIV). Comptes Rendus de I'Académie des Sciences. D 275, 507-509.
Gröner. A. 1986. Specificity and safety of baculoviruses. In The Biology of
Baculoviruses. Vol. I. Granados, R.R. and Federici, B.A. (eds). Boca Raton, FL.: CRC
Hamblin, M., Vanbeek, N.A.M., Hughes, P.R. & Wood, H.A. (1990) Coocclusion and
persistence of a baculovirus mutant Iacking the polyhedrin gene. Applied and
Harper, DM. 2009. Currently approved prophylactic HPV vaccines. Expert Review of
Vaccines 8: 1663-1679.
Herniou, E.A., Olszewski, J.A., O'Reilly, D.R. & Cory, J.S. (2004) Ancient coevolution of
Hitchman, R.B., Locanto, E., Possee, R.D. & King, L.A. (2011) Optimizing the
baculovirus expression vector system. Methods 55: 52-57.
Hughes, P.R. & Wood, H.A. (1986) In vivo and in vitro bioassay methods for
baculoviruses. In The Biology of Baculoviruses. Vol. II. Granados, R.R. and Federici,
B.A. (eds). Boca Raton, FL.: CRC Press, s. 1-30.
baculoviruses: a historical overview and future outlook. Advances in Virus Research.
68: 323-360.
Jarvis, D.L. Baculovirus-insect cell expression systems (2009). Methods Enzymol.
463:191-222.
Jiang, H., Han, Y., Hu, L., Zhang, J. & Hu, Y. (2008) Advances in application of
recombinant insect viruses as biopesticides. Acta Entomologica Sinica 51: 322-327.
Kaikkonen, M.U., YIa-Herttuala, S. & Airenne, K.J. (2011) How to avoid complement
attack in baculovirus-mediated gene delivery. Journal of Invertebrate Pathology 107:
571-579.
Kamita, S.G. & Maeda, S. (1996) Abortive infection of the baculovirus Autographa
californica nuclear polyhedrosis virus in Sf-9 cells after mutation of the putative DNA
Kanthong, N., Khemnu, N., Pattanakitsakul, S.-N., Malasit, P. & Flegel, T. (2010)
Persistent, tripIe-virus co-infections in mosquito cells. BMC Microbiology 10: 14.
Kantoff, P.W., Higano, C.S., Shore, N.D. Berger, E.R. Small, E.J. Penson, D.F., Redfern,
C.H., Ferrari, A.C., Dreicer, R. Sims, R.B. ve dig. 2010. SipuleuceI-T immunotherapy for
castration-resistant prostate cancer. New England Journal of Medicine 363: 411-422.
King, L.A. & Possee, R. (1992) The baculovirus expression system. A Iaboratory guide.
London, United Kingdom: Chapman & Hall.
Kondo, A. & Maeda, S. (1991) Host range expansion by recombination of the
baculoviruses Bombyx mori nuclear polyhedrosis-virus and Autographa californica
Leuschner, R.G.K., Robinson, T.P., Hugas, M., Cocconcelli, P.S., Richard-Forget, F.,
Klein, G., Licht, T.R., Nguyen-The, C., Querol, A., Richardson, M., Suarez, J.E., Thrane,
U., Vlak, J.M. & von Wright, A. (: a generic
risk assessment approach for biological agents notified to the European Food Safety
Authority (EFSA). Trends in Food Science & Technology 21: 425-435.
Lynn DE. (2007) Available Iepidopteran insect cell lines. Methods in molecular biology
(Clifton, NJ) 388: 117-138.
Lopez-Ferber, M., Simon, O., Williams, T., Caballero, P. (2003). Defective or effective?
Mutualistic interactions between virus genotypes. Proceedigns of the Royal Society B
Madhan, S., Prabakaran, M. & Kwang, J. (2010) Baculovirus as vaccine vectors.
Current Gene Therapy 10: 201-213.
McClintock, J.T. & Dougherty, BM. (1987) Superinfection of baculovirus-infected
gypsy-moth cells with the nuclear polyhedrosis viruses of Autographa californica and
Limantria dispar. Virus Research 7: 351-364.
Miller, D.W. (1991) Mixed baculovirus compositions and uses thereof. US Patent
Moscardi, F. (1999) Assessment of the application of baculoviruses for control of
Lepidoptera. Annual Review of Entomology 44: 257-289.
MuFioz, D., Castillejo, J.I. & Caballero, P. (1998) Naturally occurring deletion mutants
are parasitic genotypes in a wild-type nucleopolyhedrovirus population of Spodoptera
Parks, W.P., Casazza, A.M., Alcott, J. & Melnick, J.L. (1968) Adeno-associated satellite
virus interference with replication of its helper. Journal of Experimental Medicine 127:
91-108.
Rohrmann, GF. (2008) Baculovirus Molecular Biology. Bethesda, MD: National Library
of Medicine, ABD.
Salem, T., Cheng, X.H. & Cheng X.W. (2012) AcMNPV enhances infection by ThorNPV
Simon, O., Williams, T., Lopez-Ferber, M. & Caballero, P. (2004a) Virus entry or the
primary infection cycle are not the principal determinants of host specificity of
Simon, O., Williams, T., Löpez-Ferber, M. & Caballero, P. (2004b) Genetic structure of
a Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus population: High prevalence of deletion
Simon, O., Williams, T., Lopez-Ferber, M. & Caballero, P. (2005a) Functional
importance of deletion mutant genotypes in an insect nucleopolyhedrovirus population.
Simon, O., Chevenet, F., Williams, T., Caballero, P. & Lopez-Ferber, M. (2005b)
Physical and partial genetic map of Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus
(SfMNPV) genome. Virus Genes 30: 403-417.
Simon, O., Palma, L., Beperet, I., Murîoz, D., Lopez-Ferber, M., Caballero, P. &
Williams, T. (2011) Sequence comparison between three geographically distinct
Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus isolates: Detecting positively
selected genes. Journal of Invertebrate Pathology 107: 33-42
Simon, O., Palma, L., Williams, T., Lopez-Ferber, M. & Caballero, P. (2012) Analysis of
a naturaIIy-occurring deletion mutant of Spodoptera frugiperda multiple
nucleopolyhedrovirus reveals sf58 as a new per os Infectivity factor of Iepidopteran-
infecting baculoviruses. Journal of Invertebrate Pathology 109: 117-126.
Summers, M.D. & Smith, G.E. (1987) A manual of methods for baculovirus vectors and
Insect cell-culture procedures. Texas Agricultural Experiment Station Bulletin: 1-56.
Sun, X.1. & Peng, H.Y. (2007) Recent advances in biological control of pest insects by
using viruses in China. Virologica Sinica 22: 158-162.
Van Oers, M. 2011. Opportunities and challenges for the baculovirus expression
system. Journal of Invertebrate Pathology 107: 53-515.
Watanabe, S., Ohta, M., Kokuho, T., Mori, H. & Inumaru, S. (2010) Rapid and accurate
method for isolation of recombinant baculovirus with an expanded host range. Journal
of Bioscience and Bioengineering 110: 66-68.
Yanase, T., Yasunaga, C., Hara, T. & Kawarabata, T. (1998) Coinfection of Spodoptera
exigua and Spodoptera frugiperda cell lines with the nuclear polyhedrosis viruses of
Autographa californica and Spodoptera exigua. Inter-virology 41: 244-252.
SEKANS LISTESI
<110> UNIVERSIDAD PÜBLICA DE NAVARRA Consejo Superior De Investigaciones
Cienti'ficas Instituto de Ecologi'a, A.C. ASSOCIATION POUR LA RECHERCHE ET LE
DEVELOPPEMENT DES METHOD ES ET PROC-ESSUS INDUSTRIELS (ARMINES)
<120> ZARARLI BÖCEKLERLE MÜCADELE ETMEK ÜZERE KULLANILABILEN FARKLI
BAKULOVIRÜS TÜRLERININ GENOMLARINI IÇEREN VIRYONLARI TIKAYAN VIRÜS
OKLÜZYON KORLARININ ÜRETIMI
<130> PCT-724
<160> 16
< 170› BISSAP 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<223> /moI_tipi:"DNA" /not="IIeri primer Seie0.1, SeUSZ-A'nI DNA'nI miktar ölçümü için”
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<223> /mol_tipi="DNA" /n0t="Geri primer Seie0.2, SeUSZ-A'nI DNA'nI miktar ölçümü için”
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<223> /mol_tipi="DNA" /n0t="I|eri primer Sfie0.1, SfNIC-C'nin DNA'nI miktar ölçümü için”
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<223> /mol_tipi="DNA" /n0t="Geri primer Sfie0.2, SfNIC-C'nin DNA'nI miktar ölçümü için”
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1.20
<223> /m0I_tipi="DNA" /n0t="Ileri primer qSe5.F, SeUSZ-A'nin DNA'nI miktar ölçümü için
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<223> /mol_tipi="DNA" /not="Geri primer qSe5.F, SeUSZ-A'nin DNA'nI miktar ölçümü için
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<223> /mol_tipi="DNA" /n0t="IIeri primer qSfCcath.2F, SfNI C-C'nin DNA miktar ölçümü için
/organizma="Yapay Sekans"
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221>
<222> 1"20
<223> /m0l_tipi="DNA" /not="Geri primer qSszf36.2R, SfNIC -C'nin DNA miktar ölçümü
/0rganizma="Yapay Sekans“
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<400> 9
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..21
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
<400> 12
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
/n0t="Ileri primer AcDNApoI.1, cel 1 kültür plaklarIda AcC6 DNA algüânmasüiçin "
/0rganizma="Yapay Sekans“
<400> 13
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
/n0t="Geri primer AcDNApol.2, cel 1 kültür plaklarIa AcC6 DNA algHânmasEliçin"
/organizma="Yapay Sekans“
<400> 14
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
/n0t="IIeri primer SfDNApoI.3, hücre kültür plaklarlia SfNIC-B DNA algHânmasEIiçin"
/organizma="Yapay Sekans“
<400> 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<221> kaynak
<222> 1..20
Claims (1)
- ISTEMLER AynEl/iryonda birlikte sarl]]]]3lan en az iki farklEbakulovirüs türünden genomlarEiçeren karlgilîl virüs oklüzyon viryonlarII (ODV) üretimine yönelik ve/veya söz konusu karlgliîl en az bir virüs oklüzyon viryonunun tilZland [gllîiiirüs oklüzyon korlarII üretimine yönelik bir yöntem olup, burada tüm enfekte edici bakulovirüsler, çoklu nükleopolihedrovirüstür ve burada virüs oklüzyon korlarüasag-kiler ile üretilmektedir: a. üretilen en az bir oklüzyon viryonunda birlikte sarltllîlolan bakulovirüs genomlarlýla bir böcek türünün IarvalarII veya kültür hücrelerinin birlikte enfekte edilmesi, burada belirli bir türe ait olan her bir bakulovirüs genomu, aynEl veya birbirinden farklEli>ir ODV'de olabilmektedir; b. polihedroz dolaylglýla ölüme kadar enfekte IarvalarI yetistirilmesi veya hücrelerin kültürlenmesi; c. ölümlerinden sonra Iarvalardan üretilen OB'Ierin veya kültürlenmis hücrelerin izole edilmesi; burada hücreler veya larvalar, genomlarIlEI, üretilen oklüzyon viryonlarlütian en az birinde sarilliîblacagEbakulovirüslerden herhangi biri ile enfeksiyona duyarlIE AynEODV'de dahil olan en az iki farklEgenomun her birinin, bir enfektif bakulovirüs partikülüne neden olabilen, farklIIbir genomu içeren bir ikinci bakulovirüs ile birlikte enfeksiyona ihtiyaç duymadan bir hücrede bir tam viral döngüyü üretebilen genomlar Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem olup, burada bakulovirüs genomlarÇl saglanmaktadlEl veya nükleokapsidleri olusturan böcek hücrelerine veya böcek vasilîiisüla sarilßiaktadß i) asHJEIryonlarI (BV'ler) olusturulmasÇlveya ii) ODV'lerin olusturulmaslÇlburada ODV'ler, oklüzyon korlarIa tlElanabilmektedir veya oklüzyon korlarIda tilZlanmayan serbest ODV'lerin olusturulmasü Bakulovirüs genomlarlEllEi, oklüzyon korlarIda tiElanan ODV'leri olusturarak sariIJEildugu ve en az bir inoküle oklüzyon korunun, birden fazla türde genomun birlikte sarüIiZbIdugu en az bir ODV'yi içerdigi, Istem 1 veya 3'e göre yöntem. Istemler 1, 3 veya 4'ten herhangi birine göre yöntem olup, belirli bir türe ait bakulovirüs genomuna sahip nükleokapsidler, asagEIhki sekilde böcek hücrelerine veya böcek IarvalarlEb inoküle edilmektedir a. en az bir oklüzyon viryonunda birinci olan ile sarlIIElolacak olan diger bakulovirüs genomlar- sahip nükleokapsidlerle es zamanliîcblarak, veya b. en az bir oklüzyon viryonunda birinci olan ile sar|]]]IloIacak olan diger bakulovirüs genomlar- sahip nükleokapsidlere göre zamanla ayrÜbir sekilde. Belirli bir türde bakulovirüs genomuna sahip nükleokapsidlerin, farkllIbir bakulovirüs türünün genomuna sahip birinci inoküle nükleokapsidlerine göre 48 saatten daha az bir süre araligilîiçerisinde böcek hücresi kültürüne veya böcek Iarvalar. inoküle edildigi, Istem 5'e göre yöntem. Istemler 1 veya 3 ila 6'dan herhangi birine göre yöntem olup, burada nükleokapsidler, böcek larvalari inoküle edilmektedir ve burada i) nükleokapsidler, asil]]]1iryonlarlEl(BV'ler) veya serbest ODV'lerin formundadlEl ve enjeksiyon ile böcek IarvalarlEla inoküle edilmektedir, veya ii) nükleokapsidler, böcek larvalarlEb oral olarak inoküle edilmektedir ve oklüzyon korlarIa tiEianan ODV'Ieri olusturarak sarllüiaktadlü Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre karlgilîl OB'Ierin üretilmesine yönelik yöntem olup, asaglki adllarübermektedir a) eszamanlünokülasyon veya birinci enfeksiyonun belirtilerinin ortaya çiEmasEl için gerekli süreden daha az bir süre gecikmesi ile sßllînokülasyon vasltâslsîla iki farklübakulovirüs türü ile böcek larvalarlElE] birlikte enfekte edilmesi, ve b) polihedroz dolaylgýla belirgin hastalEgla veya ölüme kadar gerekli kosullarda inoküle Iarvalar yetistirilmesi. Dördüncü dönem Spodoptera exi'gua IarvalarIa her iki bakulovirüsün birlikte enfeksiyonu ve polihedroz dolaylîlýla belirgin hastaligh veya ölüme kadar böcegin yetistirilmesi ile karakterize edilen, Spadoptera eX/'gua çoklu nükleopolihedrovirüsün (SeMNPV) bakulovirüs varyantD SeUSZ-A'nI ve Spodoptera frug/perda çoklu nükleopolihedrovirüsün (SfMNPV) varyantüSfNIC-C'nin kariglKi OB'lerinin üretilmesine yönelik bir yöntem. Spodaprera #ugiperda larvalariBha her iki bakulovirüslerin birlikte enfeksiyonu ve daha sonrasIa polihedroz dolayElýla ölüme kadar böcegin yetistirilmesi ile karakterize edilen, Autagrapha ca//fom/'ca çoklu nükleopolihedrovirüsün (AcMNPV) varyantDÄcCö ve Spodoptera #ugiperda çoklu nükleopolihedrovirüsün (SfMNPV) varyantEBfNIC-B'nin karlglZlODV'lerin ve karlgElOB'lerin üretimine yönelik bir yöntem. Nükleokapsidlerin, böcek larvalari inoküle edildigi ve üretilen OB'lerin, suda ölü ayrilB1aleia ve sedimantasyon, santrifüjleme veya ilgili bir teknik ile çöktürülmesine olanak saglanmasEl/eya neden olunmasEl/e OB topaklarII süpernatanttan ayrilmasi] vaslüslýia izole edildigi, Istemler 1 ila 10'dan herhangi birine göre yöntem. Nükleokapsidlerin, böcek larvalari inoküle edildigi ve serbest, t[lZlaIl:lolmayan ODV'lerin, üretilen izole OB'leri alkalin lizise tabi tutarak elde edildigi ek bir adIiEl içeren, Istemler 1 ila 9'dan herhangi birine göre yöntem. Aynü/iryonda birlikte sari]]]]blan en az iki farklElbakulovirüs türünden genomlarEiçeren, genomlarlEi, çoklu nükleopolihedrovirüslerin genomlarlîiildugu, bir karigElvirüs oklüzyon viryonu (ODV). AcMNPV'nin varyantEiAcCö'nI en az bir genom kopyasIEive SfMNPV'nin varyantlZl SfNIC-B'nin en az bir genom kopyasIEteren, Istem 13'e göre bir ODV. Istem 13'e göre en az bir oklüzyon viryonunun tllZland [glElbir kariSlKi virüs OB'si. Istem 15'e göre karlgEl virüs OB'lerini ve/veya Istem 13 ila 14'ten herhangi birine göre ODV'Ieri içeren bir bilesim. Ek olarak, her birinin, tek virüs türünden genomlarüiçerdigi OB'leri içeren, Istem 16'ya göre bir bilesim. ZararlEHJöceklerin kontrolü için, Istem 15'e göre karEJZ] virüs OB'Ierinin veya Istemler 16 veya 17'ye göre bir bilesimin kullanlü Iki veya daha fazla zararlüböcek türünün es zamanlüinücadelesine yönelik, Istem 18'e göre kullanIi.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP2013/069678 WO2015039704A1 (en) | 2013-09-23 | 2013-09-23 | Production of virus occlusion bodies that occlude virions comprising genomes of different species of baculoviruses that can be used to combat insect pests |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201814974T4 true TR201814974T4 (tr) | 2018-10-22 |
Family
ID=49237202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/14974T TR201814974T4 (tr) | 2013-09-23 | 2013-09-23 | Zararlı böceklerle mücadele edilmesi için kullanılabilen farklı bakulovirüs türlerinin genomlarını içeren viryonları tıkayan virüs oklüzyon korlarının üretimi. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10301602B2 (tr) |
| EP (1) | EP3049516B1 (tr) |
| JP (1) | JP6339206B2 (tr) |
| AR (1) | AR097734A1 (tr) |
| BR (1) | BR112016005883B1 (tr) |
| ES (1) | ES2693153T3 (tr) |
| HR (1) | HRP20181748T1 (tr) |
| HU (1) | HUE040033T2 (tr) |
| MX (1) | MX358863B (tr) |
| PL (1) | PL3049516T3 (tr) |
| PT (1) | PT3049516T (tr) |
| TR (1) | TR201814974T4 (tr) |
| UY (1) | UY35742A (tr) |
| WO (1) | WO2015039704A1 (tr) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5071748A (en) * | 1986-09-09 | 1991-12-10 | Genetics Institute, Inc. | Mixed baculovirus compositions and uses thereof |
| ES2008204A6 (es) | 1986-09-09 | 1989-07-16 | Genetics Inst | Metodos para producir cuerpos de inclusion polihedrica de composicion mezclada (pib),para coinfectar insectos huespedes y para producir proteinas heterologas en insectos. |
| JPH0324006A (ja) | 1989-06-22 | 1991-02-01 | Kyodo Shiryo Kk | ウイルスを活性成分とする殺虫剤及びその調製法 |
-
2013
- 2013-09-23 TR TR2018/14974T patent/TR201814974T4/tr unknown
- 2013-09-23 WO PCT/EP2013/069678 patent/WO2015039704A1/en not_active Ceased
- 2013-09-23 JP JP2016543325A patent/JP6339206B2/ja active Active
- 2013-09-23 US US15/024,207 patent/US10301602B2/en active Active
- 2013-09-23 HR HRP20181748TT patent/HRP20181748T1/hr unknown
- 2013-09-23 PL PL13766513T patent/PL3049516T3/pl unknown
- 2013-09-23 HU HUE13766513A patent/HUE040033T2/hu unknown
- 2013-09-23 PT PT13766513T patent/PT3049516T/pt unknown
- 2013-09-23 BR BR112016005883-6A patent/BR112016005883B1/pt active IP Right Grant
- 2013-09-23 EP EP13766513.9A patent/EP3049516B1/en active Active
- 2013-09-23 MX MX2016003745A patent/MX358863B/es active IP Right Grant
- 2013-09-23 ES ES13766513.9T patent/ES2693153T3/es active Active
-
2014
- 2014-09-23 UY UY0001035742A patent/UY35742A/es not_active Application Discontinuation
- 2014-09-23 AR ARP140103514A patent/AR097734A1/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| UY35742A (es) | 2015-04-30 |
| US10301602B2 (en) | 2019-05-28 |
| WO2015039704A1 (en) | 2015-03-26 |
| PL3049516T3 (pl) | 2019-02-28 |
| AR097734A1 (es) | 2016-04-13 |
| HUE040033T2 (hu) | 2019-02-28 |
| EP3049516B1 (en) | 2018-07-25 |
| JP6339206B2 (ja) | 2018-06-06 |
| JP2016538873A (ja) | 2016-12-15 |
| HRP20181748T1 (hr) | 2018-12-28 |
| MX358863B (es) | 2018-09-05 |
| ES2693153T3 (es) | 2018-12-07 |
| BR112016005883A2 (tr) | 2017-09-19 |
| BR112016005883B1 (pt) | 2022-07-12 |
| PT3049516T (pt) | 2018-11-14 |
| MX2016003745A (es) | 2016-07-06 |
| EP3049516A1 (en) | 2016-08-03 |
| US20160230148A1 (en) | 2016-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6846482B2 (en) | Insect control agent | |
| Gramkow et al. | Insecticidal activity of two proteases against Spodoptera frugiperda larvae infected with recombinant baculoviruses | |
| CN107873052B (zh) | 用于害虫控制管理的组合物和方法 | |
| Mitsuhashi et al. | Further research on the biological function of inclusion bodies of Anomala cuprea entomopoxvirus, with special reference to the effect on the insecticidal activity of a Bacillus thuringiensis formulation | |
| Demir et al. | Characterization of a new isolate of Malacosoma neustria nucleopolyhedrovirus (ManeNPV) from Turkey | |
| Rabalski et al. | An alphabaculovirus isolated from dead Lymantria dispar larvae shows high genetic similarity to baculovirus previously isolated from Lymantria monacha–an example of adaptation to a new host | |
| CN103153051A (zh) | 含昆虫病原病毒特别是杆状病毒和硫酸纤维素的植物保护产品 | |
| CN113116890A (zh) | 5-Pyridoxolactone用于制备治疗家蚕核型多角体病毒的药物中的应用 | |
| TR201814974T4 (tr) | Zararlı böceklerle mücadele edilmesi için kullanılabilen farklı bakulovirüs türlerinin genomlarını içeren viryonları tıkayan virüs oklüzyon korlarının üretimi. | |
| Kuzio et al. | An overview of the molecular biology and applications of baculoviruses | |
| Demir et al. | A highly effective nucleopolyhedrovirus against Malacosoma spp.(Lepidoptera: Lasiocampidae) from Turkey: isolation, characterization, phylogeny, and virulence | |
| Larem | Diversity and Host Interaction of Phthorimaea operculella granulovirus | |
| CN102174481B (zh) | 斜纹夜蛾基因工程病毒1号及其构建方法 | |
| Tsuruta et al. | Morphological properties of the occlusion body of Adoxophyes orana granulovirus | |
| Narayanan | Microbial control of insect pests: role of genetic engineering and tissue culture | |
| CN100529064C (zh) | 鳞翅目害虫核型多角体病毒的改造方法 | |
| CN102174480B (zh) | 斜纹夜蛾基因工程病毒2号及其构建方法 | |
| US10362788B2 (en) | Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus (HearSNPV) genotypes, method of producing same and use as a biological control agent | |
| CN101522894A (zh) | 重组黑胸大蠊浓核病毒及其应用 | |
| US7009090B1 (en) | Plants and feed baits for controlling damage from feeding insects | |
| Wennmann | Diversity of baculoviruses isolated from cutworms (Agrotis spp.) | |
| Asser-Kaiser | On the inheritance and mechanism of baculovirus resistance of the codling moth, Cydia pomonella (L.) | |
| Moore et al. | The use οf νiruses for controlling pest species οf insects | |
| van der Beek | On the origin of the polyhedral protein of the nuclear polyhedrosis virus of Autographa californica | |
| D'Amico et al. | Interactions between nucleopolyhedroviruses and polydnaviruses in larval lepidoptera. Chapter 8 |