TARIFNAME KAS HASARINA YÖNELIK ANTIOKSIDAN BILESIKLERIN KULLANIMI Bulusun sahasi Mevcut bulus kas sagligini sürdürmek veya geri kazanmak üzere antioksidan bilesiklerin kullanimi ile ilgilidir. Bu bilesikler kas sagligini sürdürmek veya geri kazanmak üzere bir bilesime yönelik imalatta kullanilabilir, bu sekilde egzersizden kaynakli kas hasari önlenir ve/veya tedavi edilir. Daha spesifik olarak, bu tür bilesim gida, içecekler, takviyeler ve yem içerir. Atletler düzenli olarak yogun ve/veya uzatilmis kas egzersizleri yapar. Çalismalar, yorucu egzersiz sirasinda, reaktif oksijen türlerinin (ROS) olusumunun doku antioksidan savunma sistemini yoran bir düzeye yükseldigini önerir. Sonuç, dokulara, örnegin doku kasina hasara yol açabilen oksidatif strestir. Genel olarak iyi bir kas kosulu, performanslarina, özellikle iskelet kaslarina yönelik zorunlu öneme sahiptir. Egzersiz dolayisiyla, örnegin yorgunluk, düsük dayaniklilik, islev kaybina yol açarak kas sagligini bozar. Antioksidan takviyelerin kullanimi, bu tür hasarlari önlemek üzere sunulmustur (Dietary anti-oxidants and exercise, Journal of Sports Sciences, 2004, 22, 81-94, Powers et aL). US-Bi-G 399 116 kas yorgunlugunu tedavi etmeye yönelik ilave antioksidan (C vitamini) ile salidrozid ve tirosol içeren bilesimleri (içecek, gida veya besinsel takviye) açiklar. SU 1 787 420, kanzbeyin bariyerini geçebilen ve beyin dokusunu oksidatif fenomenlere, özellikle nörodejeneratif hastaliklara karsi koruyabilen oleropin ve hidroksitirosol içeren besinsel takviyeleri açiklar. Bununla birlikte tüm antioksidanlar kas hasarini iyilestirmeye yönelik uygun degildir. Çalismalar bazi antioksidanlarin zorlukla herhangi bir etki verdigini göstermistir. Bu durum birkaç nedeni olabilir. Ilk olarak, antioksidanlarin biyoyararlanimi düsük olabilir. Antioksidanlarin bagirsaklar tarafindan alimi akabinde nispeten düsüktür, yüksek bir antioksidan miktarinin etkili hale dönüsmesine yönelik ihtiyaç ile sonuçlanir. Ikinci olarak, tüm antioksidanlar kas hücrelerinin membranini geçemez. Ilaveten, bazi antioksidanlar kullanim üzerine tüketilir, ayni zamanda bir etkiyi görmek üzere nispeten yüksek bir antioksidan alim miktarini gerektirir. Bu durum, sadece bir saglik perspektifinden (vücutta birçok metabolit) degil ancak ayni zamanda maliyet perspektifinden istenmez. Bazi antioksidanlar, bir sözde antioksidan aginda rejenere edildigi, örnegin E vitamininin C vitamini tarafindan rejenerasyonu bilinir. E vitamini ile ilgili in vivo çalismalar, antioksidan markörler üzerinde herhangi bir önemli etki göstermemistir. Bulusun amaci, iyi bir biyoyararlanima sahip antioksidan aginda yer alabilen, kas iyilesmesine yönelik uygun bir bilesenin saglanmasidir. Bulus istemler ile açiklanir. Sasirtici sekilde, formüle (1) göre yenilebilen bir bilesigin, egzersizden kaynakli kas hasarina yönelik tedavide kullanilabildigi bulunmustur. R ve R1`in ayni anda H olmamasi kosulu ile R, H, OH veya CH30 olabilir; R1, H veya (CH2)nOR2 olabilir burada: n 1, 2 veya 3'tür (CH2)m OGlukoz H3C02 burada m, 1, 2 veya 3'tür. Formüle (1) göre uygun bilesiklerin örnekleri, hidroksitirosol ve bunun asetati, oleropin, tirosol ve bunun asetati, homovanilik alkol ve/veya katekoldür. Ayrica bu bilesiklerin karisimlari kullanilabilir. Bu bilesigin C vitamininin kullanimi ile rejenere edilebildigi sasirtici bir sekilde bulunmustur. Bu, formüle (1) göre bilesigi, oksidatif stresten kaynakli kas hasarini önlemek veya tedavi etmek üzere bir bilesime yönelik imalatta kullanima uygun hale Tercih edildigi üzere, R, OH'dir. Daha tercihen en az hidroksitirosol veya bunun asetati bilesim içinde kullanilir. Hidroksitirosol, amfifil olmasina yönelik ilave avantaja sahiptir. Bu, aköz ve yag bilesimleri içinde, örnegin intraselüler ve ekstraselüler sivilar ve Formüle (1) göre bilesik, egzersizden kaynakli kas hasarini tedavi etmeye veya önlemeye yönelik bir bilesimin imalatina yönelik kullanilabilir. Bu bilesim salidrozid içermez. Bulusun bir diger açisi, bulusa göre kullanimdir, burada kas iyilesmesine yönelik uygun bilesen, insan tüketimine yönelik uygun bir besinsel ürün içinde kullanilir. Herhangi bir besinsel ürün, örnegin gida, içecek veya diyet takviyesi uygun olabilir. Besinsel ürün, bir çigneme sakizi degildir. Tercih edildigi üzere, formüle (1) göre antioksidan bilesik atletler tarafindan alima yönelik spor besinsel ürünlerde mevcuttur. Atletlerin, genel popülasyona yönelik tavsiye edilen diyet talimatlarinin ötesinde özel gidalar ve gida içerik maddelerinden faydalanabilecegi bilinir. 'Spor besinsel ürünler` terimi burada, özellikle atletlere yönelik adapte edilen herhangi bir gida veya içecegi belirtmek üzere kullanilir. Bulusun amacina yönelik uygun spor besin maddesinin birçok türü, örnegin spesifik diyet takviyeleri, spor içecekleri veya spor gidalari bulunur. Spor içecekleri hipotonik, hipertonik veya izotonik olabilir. Spor içecekleri likit formda, konsantreler olarak veya toz olarak (bir likit, örnegin su içinde çözülmek üzere) mevcut olabilir. Spor gidasi bar, tablet veya jel formunda olabilir. Diyet takviyesi, bir hap veya bir kapsül formunda olabilir. Besin ayrica alisilagelmis katki maddeleri, örnegin tatlandiricilar, Iezzetlendiriciler, seker, yag, emülgatörler, koruyucu maddeler içerebilir. Besin maddesi ayni zamanda, W002/45524ite açiklandigi üzere (hidrolizlenmis) proteinler gibi diger aktif bilesenleri içerebilir. Ayni zamanda diger antioksidanlar besin maddesi içinde, örnegin flavonoidler, karotenoidler, ubikinonlar, rutin, Iipoik asit, katalaz, glutatyon (GSH) ve örnegin C ve E gibi vitaminler veya bunlarin öncüllerinde mevcut olabilir. Formüle (1) göre bir bilesik ve C vitamini veya bunun öncüllerinin kombinasyonu, bir sinerjik etki göstermistir. Tercih edildigi üzere, hidroksitirosol veya bunun asetati, C vitamini ile kombine edilir. Formüle (1) göre bir bilesik ve C vitamini içeren bir bilesim, yenidir ve bulusun bir diger açisidir. Formüle (1) göre bilesigin, etkili bir miktarda mevcut olmasi gerekir. Genel olarak bilesigin, bir etki olusturmak üzere porsiyon basina 1 mg ile 3 gram, tercih edildigi üzere porsiyon basina 10mg ila 1 gram arasi gereklidir. Bu durum, agirlik, yas, diyet aliskanliklari ve egzersiz yogunlugu gibi birçok faktöre dayanir. Bir antioksidanin etkisi, belirli markörler vasitasiyla ölçülebilir. Kas egzersizinde, Iipit oksidasyonu ve protein oksidasyonu meydana gelir. Lipit oksidasyonuna yönelik ölçülecek uygun markörler, örnegin malondialdehit (MDA) ve izoprotanlardir. Protein oksidasyonu miktarina yönelik uygun bir markör örnegin protein karbonillerdir. Formüle (1) göre bilesigi içeren besin maddesi, egzersizden önce, bu sirada veya bundan sonra yenebilir. Bu durumda, bu, egzersizden önce kullanilir, tercih edildigi üzere bu, yaklasik bir saat önce yenir. Bu durumda, bu, egzersizden sonra kullanilir, tercih edildigi üzere bu, bundan sonra bir saat içinde, daha tercihen egzersizden hemen sonra yenir. Insanlarin tüketimine yönelik uygun besinsel ürünlere ilave olarak, ayni zamanda evcil hayvan gidalari dahil olmak üzere hayvanlara yönelik yemlerde formüle (1) göre bilesigin kullanilmasi mümkündür. Bu akabinde, kas kuvvetlerine yönelik kullanilan hayvanlara, örnegin (yaris) atlarina veya köpeklerine (diger bir deyisle yaris köpekleri veya kizak köpekleri) yönelik özellikle uygundur. Bulus buradan sonra asagidaki sinirlayici olmayan örnekler ile açiklanir. Örnekler Örnek 1: Organ banyosu deneyleri Erkek Lewis siçanlari (12 ila 14 haftalik arasindaki) kullanilmistir. Dekapitasyondan sonra, diyafram hizli sekilde eksize edilmistir ve küçük seritler (yaklasik 2 mm en ve 1 cm uzunlukta) kesilmistir ve akabinde pH 7.4 olmak üzere bir %95 02 ve %5 C02 karisimi ile gaz ile doldurulmus Krebs tamponu içeren termostat ile ayarlanmis organ banyolari içine monte edilmistir. Her bir diyafram seridi, dikey olarak bir izometrik transdüsere baglanmistir. Krebs tamponu bilesimi bu (mM) olmustur: NaCl (117.5), KCI sirasinda, tampon her 15 dakika degistirilmistir. Saha stimülasyonu, platin elektrotlar ile her bir kasin tüm uzunlugu boyunca olusturulmustur. Deneyin basinda, seritler sicakliga bagimli bozulmayi minimuma indirmek üzere oda sicakliginda 45 dakika boyunca yikanmistir. Bundan sonra, su banyosu 37°C"de (deneylerin baslamasindan 15 dakika önce) açilmistir. Her bir serit ilk olarak, kasilma kontraksiyonlari (1 Hz) kullanilarak bunun optimal uzunluguna (Lo) ayarlanmistir. Darbe süresi daima 10 ms'dir. Ilk olarak Pt (1 Hz'lik bir stimülasyonda kasilma gerilimi) ve Pc (250 ms süre, 100 Hz"lik bir stimülasyonda maksimum spesifik gerilim) belirlenmistir. Bundan sonra, diyafram kas seritlerinin artan stimulus frekanslarina tepkisi, 250 ms katarinda uygulanan 10, 20, 33, 50 ve 100 Hz darbelerin uygulanmasi ile Lo'da degerlendirilmistir. 2 dakikalik bir iyilestirme periyodu kontraksiyonlar arasinda kullanilmistir. Kuvvet-frekans protokolünün bitiminde, bir yorulma protokolü uygulanmistir. Seritler 5 Hz'de 6 dakika boyunca stimüle edilmistir. Bu stimülasyon protokolünden sonra, hidroksitirosol (HT) veya kontrol (araç, etanol) 5 dakika boyunca inkübe edilmistir. Akabinde, hidrojen peroksit (HzOz) veya kontrol (MIIIIQ) 10 dakika boyunca inkübe edilmistir. Bundan sonra, bunlar yeniden belirlenmistir: Pt, Po, kuvvet-frekans ve yorulma. Hidroksitirosol, Cayman Chemical, Ann Arbor, ABD tarafindan satin alinmistir. Hidrojen peroksit Sigma, St. Louis, ABD tarafindan elde edilmistir. Diger tüm kimyasal maddeler, analitik derece safliga sahiptir. Sekil 1, kas kuvveti üzerinde H202 etkisini gösterir. H202 doz bagimli sekilde, kontrol ile kiyasla tüm uygulanan stimülasyon frekansinda kuvveti düsürür. Veri, en azindan çift kopya ölçümlere dayanarak ortalama olarak ifade edilir. Sekil 2, HT'nin H202 aracili kas hasarina karsi koruyucu etkisini gösterir. HT, HzOz korur. H202 inkübasyon olmaksizin 300 uM HT kas fonksiyonunu dahi korur. Veri, en azindan çift kopya Ölçümlere dayanarak ortalama olarak ifade edilir. Sekil 3, HT'nin H202 aracili kas hasarina karsi koruyucu etkisini gösterir. HT doz bagimli sekilde H202 ile indüke edilen kuvvette düsüse karsi korur. Stimülasyon frekansi 50 Hz ve H202 konsantrasyonu 1 mM'dir. Veri, en azindan 2 çift kopya ölçümlere dayanarak ortalama olarak ifade edilir. Örnek 2: SüLürme deneyleri ve Iipoik asit ile kiyaslama. Materyaller Hidroksitirosol, Cayman Chemical, Ann Arbor, ABD tarafindan elde edilmistir. Tirosol ve K02 Fluka, Buchs, Isviçre tarafindan satin alinmistir. Homovanilik alkol, 2- metoksifenol, fenol ve dihidrorhodamin- Sigma, St. Louis, ABD tarafindan elde edilmistir. Katekol, Janssen Chimica, Geel, Belçika tarafindan elde edilmistir. Lipoik asit, Asta Medicac AG, Frankfurt, Almanya tarafindan satin alinmistir. Nitrojen monoksit, AGA, Hamburg, Almanya tarafindan satin alinmistir. Diger tüm kimyasal maddeler, analitik derece safliga sahiptir. ONOOH süpürme Bilesiklerin ONOOH indüklü DHR-123 oksidasyonuna karsi koruma, Kooy et al (Peroxynitrite-mediated oxidation of dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med, süpürücünün çesitli konsantrasyonlari 37°C'de 100 mM sodyum fosfat tamponu (pH 7.4) içinde inkübe edilmistir. Akabinde, ONOOH hizli vortekslenirken tüp içine 10 pl*lik bir alikot pipetleme yoluyla eklenmistir, 0.7 pM'lik bir nihai konsantrasyona ulasilmistir. Floresans ölçümleri sirasiyla 500 ve 536 nm dalga boylarinin eksitasyonu ve yayilmasi ile gerçeklestirilmistir. Etkiler, BHR- oksidasyonunun %50 inhibisyonunu veren Süpürücünün konsantrasyonu olarak ifade edilir. 02--süpürme 02", 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.8) içinde ksantin ( ve ksantin oksidaz (X0) ( reaksiyonu yoluyla olusturulmustur. 02°- radikalleri nitro mavi tetrazolyum (NBT, 50 uM) yoluyla saptanmistir. NBT, 02°- yoluyla bunun formazanina azalmaya ugrar. Bu azalmanin orani 2 dakika boyunca 560 nm'de Spektrofotometrik olarak görüntülenmistir. Bir Süpürücünün çesitli konsantrasyonlari eklenmistir ve 37°C'de inkübe edilmistir. Reaksiyon, XO'nun eklenmesi ile baslatilmistir. 02-- süpürme potansiyeli, NBT (IC50) azaltiminda %50'Iik bir düsüs veren süpürücü konsantrasyonu olarak ifade edilir. Süpürücünün XO aktivitesi üzerine olasi bir inhibitör etkisine yönelik ayarlamak üzere Süpürücünün en yüksek konsantrasyonu 37°C'de inkübe edilmistir ve akabinde ürat olusumu orani 2 dakika boyunca 293 nm'de ölçülmüstür. Süpürme testlerinin sonuçlari asagidaki tablo 1'de gösterilir. Tablo 1. Test edilen bilesiklerin ONOO- ve 02°- Süpürme aktiviteleri. IC50 degerleri ± SEM (uM cinsinden), n=3 gösterilir. Oleropin 2.3 ± 0.5 6.0 ± 0.5 Tirosol 99 ± 16 200 Lipoik asit (karsilastirmali örnek) 200 100 Örnek 3: Askorbat ile hidroksitirosol (HT) rejenerasyonu HT oksidasyonu (Cayman Chemical, Ann Arbor, ABD) 37°C'de, pH 7.4 olmak üzere 50 uM HT ve 5 U/ml tirosinaz (Sigma, St. Louis, ABD) içeren 145 mM olan bir fosfat tamponu içinde gerçeklestirilmistir. Tirosinaz ve HT inkübasyonu, bir kuinon (HTQ) olusumuna yol açar. Reaksiyonlar spektrofotometrik olarak ve yüksek performansli likit kromatografi (HPLC) yoluyla görüntülenmistir. Spektrumlar 240 nm/dakikalik bir tarama hizinda kaydedilmistir. Inkübasyon karisimlarinin HPLC analizi. bir Supelcosil LCS18 kolonu kullanilarak gerçeklestirilmistir. Kolon dakika basina 1 ml olan bir akis hizi ile kullanilmistir. Askorbatin HTQ ile reakte etmeye yönelik kabiliyeti asagidaki gibi belirlenmistir. Ilk olarak, HTQ iki buçuk dakika boyunca olusturulmustur. Akabinde, HTQ'ya eklenmistir ve karisim üçüncü dakikada el ile HPLC'ye hemen enjekte edilmistir. Sekil 4, sadece HT'nin (kontrol) HPLC ölçümünün sonuçlarini gösterir. Sekil 5, tirokinazin HT'ye eklenmesinin etkisini gösterir, bu sekilde bunun kionunun olusumu (kontrol) gösterilir. Sekil 6, askorbatin bir HT ve tirokinaz karisimina eklenmesinin etkisini gösterir. Bu, HT'nin yeniden olusturuldugunu ve hiçbir HTQ'nun üç dakikadan sonra daha fazla mevcut olmadigini gösterir. HT'nin askorbat ile rejenerasyonu meydana gelmistir Örnek 4: Hidroksitjrosol içeren kurabiye tarifi. Aktif içerik maddeleri: 10-50 mg hidroksitirosoI/porsiyon basina (tipik olarak 309) Içerik maddesi (9) Bugday unu 41.0 Yag/Tereyagi 20.5 Tam yumurta (likit) 18.0 Limon Aromasi gerektigi kadar Pisirme ajani gerektigi kadar Tüm içerik maddeleri, bir tatli gevrek hamur isi olusturmak üzere karistirilarak yavas bir biçimde eklenir. Daha sonra, hamur isinin yaklasik olarak 5 mm bir kalinliga yassilastirilmasinin öncesinde, hamur isi en az 2 saat boyunca soguk tutulur (4°C). Parçalar kesip çikarilir ve pisirme öncesinde yüzey üzerine yumurta sarisi ile firçalanir. Pisirme, 180 °C'de bir fan firini içinde 15 dakika boyunca meydana gelebilir. TR TR TR TR TR TR TR TR