TR201820859T4 - Bitkilerde tohum ve organ büyüklüğünü modüle etme yöntemleri. - Google Patents

Abstract

Bu buluş, tohum ve organ büyüklüğünü kontrol etmek için DA1 ile sinerjik olarak hareket eden bir bitki E3 ubikuitin ligazıyla (burada DA2 olarak bahsedilmektedir) ilgilidir. DA1 ekspresyonu veya aktivitesi eksik bir bitkide DA2 ekspresyonu veya aktivitesinin azaltılmasını içeren ve bitki verimini artırmayı amaçlayan yöntemler sunulmaktadır. Verimi artmış bitkiler ve bu bitkileri üretme yöntemleri de sunulmaktadır.

Description

TARIFNAME BITKILERDE TOHUM VE ORGAN BUYUKLUGUNU MODULE ETME YONTEMLERI Bulusun alani Bu bulus, bitkilerin tohum ve organlarinin büyüklügünü degistirmeye yönelik yöntemlerle, örnegin bitki veriminin iyilestirilmesiyle ilgilidir. Bulusun Arkaplani Tohumlarin ve organlarin büyüklügü, agronomik ve ekolojik açidan 'Önemli olan ve genetik kontrol altinda bulunan bir özelliktir (Alonso- Blanco, C. PNAS USA 96, 4710-7 (1999); Song, X.J. Nat Genet 39, 623-30 (2007); Weiss, J. Int J Dev Biol 49, 513-25 (2005); Dinneny, J .R. Development 131, 1101-10 (2004); Disch, S. Curr Biol 16, 272-9 (2006);Science 289, 85-8 (2000);H0riguchi, G. Plant J 43, 68-78 (2005); Hu, Y Plant J 47, 1-9 (2006); Hu, Y. Plant cell 15, 1951-61 (2003); Krizek, B.A. Dev Genet 25, 224-36 (1999); Mizukami, Y. PNAS USA 97, 942-7 (2000); Nath, U. Science 299, 1404-7 (2003); Ohno, CK. Development 131, 1111-22 (2004); Szecsi, J. Embo J 25, 3912-20 (2006); White, D.W. PNAS USA 103, 13238-43 (2006); Horvath, B.M. Embo J 25, 4909-20 (2006); Garcia, D. Plant cell 17, 52-60 (2005). Belirli bir türde tohum ve organlarin nihai büyüklügü sabittir; ara türlerde tohuin ve organ büyüklügündeki varyasyon ise önemli ölçüde büyüktür ve bu da bitkilerin, tohum ve organ büyümesini koordineli ve zamanli bir sekilde kontrol eden regülasyon mekanizmalarina sahip oldugunu gösterir. Bununla birlikte, tohum ve organ büyüklügü 'Önemli olmasina ragmen, bitkilerde nihai tohum ve organ büyüklügünü kontrol eden moleküler ve genetik mekanizmalar hakkinda az sey bilinmektedir. Tohum büyüklügünün genetik regülasyonu, kantitatif özellik yeri (QTL) haritalamasi kullanilarak domates, soya fasulyesi, misir ve pirinç de dahil olmak üzere, bitkilerde arastirilmistir. Bugüne kadar, yayinlanmis literatürde, pirinç danesi büyüklügü için baslica iki QTL"nin temelinde yer alan iki gen (Song, XJ. Nat Genet 39, 623-30 (2007); Fan, C. Theor. Appl. Genet. 112, 1164-1171 (2006)) tanimlanmis olup bu genlerin mekanizmalari açikliga kavusturulnius durumdadir. Arabidopsis°te, Ler ve Cvi katilimlari arasindaki çaprazlainalarda tohum agirligini ve/veya uzunlugunu etkileyen on bir yer haritalandirilmistir {Alonso-Blanco, 1999 yukarida}, fakat karsilik gelen genler tanimlanmamistir. Son yillarda yürütülen çalismalar, tohum büyüklügünün kontrolünde AP2 ve ARF2°nin yer aldigini ortaya koymustur. Maalesef, bununla birlikte, ap2 ve arf2 mutantlari vahsi tipten daha düsük fertiliteye sahiptir (Schruff, MC. Development 137, 251-261 (2006); Ohto, MA. PNAS USA 102, 3123-3128 (2005); Jofuku, KD. PNAS USA 102, 3117-3122 (2005)). Ek olarak, mutant bitkiler kullanilarak yapilan çalismalar, hücre çogalmasi veya genlesinesi üzerinde etkili olarak organ büyüklügünü etkileyen çesitli pozitif ve negatif regülatörler tanimlamistir {Krizek, B.A. Dev Genet 25, 224-36 (1999); Mizukami, Y. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 942-7 (2000); Nath, U. Science 299, 1404-7 (2003); Ohno, CK. Development 131, 1111-22 (2004); Szecsi, J. Einbo J 25, 3912- (2006); White, D.W. PNAS USA 103, 13238-43 (2006); Horvath, B.M. Embo J 25, 4909-20 (2006); Garcia, D. Plant cell 17, 52-60 (2005). Horiguchi, G. Plant J 43, 68-78 (2005); Hu, Y Plant J 47, 1-9 (2006) Dinneiiy, J.R. Development 131, 1 101-10 (2004)). Ubikuitinle iliskili faaliyetlere katilan birkaç faktörün tohum büyüklügünü etkiledigi bilinmektedir. Büyümeyi kisitlayan bir faktör olan DAl, bir ubikuitin reseptörüdür ve ubikuitini in vitro baglayan iki ubikuitin etkilesim motifi (UlM) içermektedir ve ayrica, dal- 1 mutanti ovüllerin maternal integumentlerini etkilemek suretiyle büyük tohumlar olusturmaktadir (Li ve ark., 2008). BIG BROTHER (BB) E3 ubikuitin ligazini kodlayan bir dal-l (EODl) artiricisindaki mutasyonlar (Disch ve ark., 2006; Li ve ark., 2008), dal-1 tohum büyüklügü fenotipini sinerjik olarak artirmaktadir ve bu da, DAl"in tohum büyüklügünü kontrol etmek için EODl/BB ile birlikte sinerjik olarak faaliyet gösterdigine isaret etmektedir. Pirinçte, bir E3 ubikuitin ligazini kodlayan GRAIN WIDTH AND WEIGHT2 (GW2) için bir kantitatif özellik yeri (QTL), hücre bölüninesini sinirlamak suretiyle dane büyüklügünü kontrol etmektedir (Song ve ark., 2007). Bugdayda bir GW2 homologu tanimlanmistir (Ta-GW2; Bednarek ve ark. 2012). Pirinçte dane büyüklügünü sinirlainak için pirinç qSW5/GW5 tarafindan kodlanan bir bilinmeyen protein gereklidir (Shomura ve ark., 2008; Weng ve ark., 2008). GW5, bir maya iki hibrid eseyinde poliubikuitinle fiziksel olarak etkilesime girmektedir ve bu da, GW5"in ubikuitin-proteazom yolagina katilabilecegini ortaya koyinaktadir (Weng ve ark., 2008). Bununla birlikte, bu iki faktörün pirinçteki maternal ve/veya zigotik dokularda faaliyet gösterip göstermedigi kesin degildir. Hem tohumlarin, hem de organlarin nihai büyüklügünü kontrol eden ilave faktörlerin tanimlanmasi sadece bitkilerde büyüklük kontrol inekanizinalarinin anlasilinasini saglamaz, ayni zamanda 'Örnegin biyoyakit üretmek için mahsul verimini ve bitki biyokütlesini artirinada önemli pratik uygulamalara sahiptir. Bulusun Ozeti Mevcut bulusun sahipleri, gelismekte olan tohumlarin integumentlerinde gerçeklesen hücre çogalmasini sinirlayarak tohum ve organlarin nihai büyüklüklerini regüle eden bir bitki E3 ubikuitin ligazi (DA2 olarak ifade edilmektedir) tanimlainislardir. DA2°nin DAl'le birlikte ve EODl"den bagimsiz sekilde tohum ve organ büyüklügünü kontrol etmek için sinerjik olarak faaliyet gösterdigi beklenmedik sekilde görülmüstür. Bundan dolayi, DA2 ve DAl "in ya da DAl ve EODl"in hedeflenmesi bitki veriminin iyilestirilmesinde faydali olabilir. Bu patent basvurusuyla ele alinan bulus, istemlerde açiklandigi gibidir. Bu patent basvurusunda, bir bitkinin beher birim alan için tohum kütlesini, büyümesini ve/veya biyokütlesini artirmaya yönelik olan ve söz konusu bitkinin hücrelerinde bulunan bir DA2 polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesinin azaltilmasini içeren bir yöntem açiklanmaktadir; burada, bu bitkide DA] ekspresyonu veya aktivitesi eksiktir. Bu patent basvurusunda, ayrica, bir bitkinin beher birim alan için tohum kütlesini, büyümesini ve/veya biyokütlesini artirmaya yönelik olan ve söz konusu bitkinin hücrelerinde bulunan bir DA2 polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesinin azaltilmasini içeren bir yöntem açiklanmaktadir; burada, bu bitkide EODl ekspresyonu veya aktivitesi eksiktir. Bu patent basvurusunda, ayrica, bir bitkinin beher birim alan için tohum kütlesini, büyümesini ve/veya biyokütlesini artirmaya yönelik olan ve söz konusu bitkinin hücrelerinde bulunan bir DA2 polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesinin azaltilmasini içeren bir yöntem açiklanmaktadir; burada, bu bitkide DAl veya EODl ekSpresyonu veya aktivitesi eksiktir. Bu patent basvurusunda, ayrica, bir bitkinin beher birim alani için tohum kütlesini, büyümesini ve/veya biyokütlesini artirmaya yönelik olan ve söz konusu bitkinin hücrelerinde bulunan bir DA2 polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesinin azaltilmasini veya ortadan kaldirilmasini ve ayrica, asagida sayilanlari içereii bir yöntem de açiklanmaktadir: i) söz konusu hücrelerde bulunan bir DAl polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesinin azaltilmasi veya ortadan kaldirilmasi, ii) söz konusu hücrelerde bulunan EODl"in ekspresyoiiu veya aktivitesinin azaltilmasi veya ortadan kaldirilmasi ve/Veya iii) söz konusu hücrelerde bir dominant-negatif DA polipeptidi eksprese edilmesi. Bu patent basvurusunda, ayrica, beher birim alan için tohum kütlesi, büyümesi ve/Veya biyokütlesi artmis bir bitki üretmeye yönelik olan ve asagidakilerden olusan bir yöntem de açiklanmaktadir: DAl ya da hem DAl hem de EODl ekspresyonu veya aktivitesi eksikligi bulunan bir bitki hücresi temin edilmesi, bir DA2 polipepridinin ekspresyonu veya aktivitesini ortadan kaldiran veya baskilayan bir heterolog nükleik asidin transformasyon yoluyla bitki hücresi bünyesine dâhil edilmesi VC bir veya daha fazla transforme edilmis hücreden bitki rejenere edilmesi. Sekillerin Kisa Tanimi Sekil 1, da2-l mutantindaki tohum ve organ büyüklügünü göstermektedir. 1A, Col-O, da2-l ve 358::DA2#1 tohumlarinin pro jektif alanini göstermektedir. Bu tohumlar üç gruba (O,l3, 0,12-O,l3 ve <0,12 mm2) ayrilmistir. Her grup için belirlenen degerler, analiz edilen toplam tohum sayisinin bir yüzdesi olarak ifade edilinektedir. lB; Col-O, da2-1 ve 358: :DA2#1 için meyve basina tohum sayisini göstermektedir. Ana saptaki meyveler (dördüncü ineyveden onuncu meyveye kadar), meyve basina tohum sayisini ölçmek için kullanilmislardir. lC; Col- 0, da2-1 ve 358::DA2#1 için bitki basina tohum agirligini göstermektedir. 1D; Col-O, da2-1 ve 3SSzzDA2#l için bitki basina tohum sayisini göstermektedir. lE; Col-O, da2- 1 ve 358::DA2#1 bitkilerinin boylarini göstermektedir. Degerler (B-E), %100,e ayarlanmis vahsi tip degerine göre ortalama ± SE cinsinden verilinektedir. Vahsi tipe kiyasla, **, P<0,0l ve *, P<0,05 (Student t-testi). Olçek çubuklari: F, lem; G, lmm Sekil 2; 4 günlük Col-O (sol), da2-l (orta) ve 358::DA2#1 (sag) bitkilerini ve Col-O (üst), da2-1 (orta) ve 358::DA2#1 (alt) çiçeklerini göstermektedir. Sekil 3, DA] ve DA2°nin tohum büyüklügünü kontrol etmek için siiierjik olarak faaliyet gösterdiklerini göstermektedir. 3A; Col-O, dal-l, da2-l ve dal-l da2-l "in kuru tohumlarini göstermektedir. 3B; Col-O, da2-1, dal-1 ve da 1-1 da2- 1"in (soldan saga) 10 günlük fideleriiii göstermektedir. 3C; Col- 0, dal-1, da2-l ve dal-1 da2-1°in tohum agirliklarini göstermektedir. 3D; Col-O, dal-kol, da2-1 ve dal-kol da2-l "in tohum agirliklarini göstermektedir. Degerler, % 100 "e ayarlanmis ilgili vahsi tip degerlerine göre ortalama ± SE cinsinden verilmektedir. Vahsi tipe kiyasla **, P<0,0l ve *, P<0,05 (Student t-testi). Olçek çubuklari: A, 0,1mm; B, lm Sekil 4, DAl ve DA2'nin tohum büyüklügünü kontrol etmek için sinerjik olarak faaliyet gösterdiklerini göstermektedir. Sol üst panel, 10 günlük Col-O, dal-l, da2-l ve dal-l da2- 1 fidelerinin kotiledon alanlarini göstermektedir. Sag üst panel, günlük Col-0,da1-kol, da2-l ve dal-kol da2-l fidelerinin kotiledon alanlarini göstermektedir. Sol alt panel; Col-O, dal-1, da2-l ve dal-l da2-l embriyolarinin kotiledonlarinda bulunan palisat hücrelerinin ortalama alanlarini göstermektedir. Sag alt panel Col-O, dal-l, dal-1 da2-l, dal-kol da2-l, dal-kol darl- 1 ve dal-kol darl-l da2-l tohuinlarinin projektif alanini göstermektedir. Degerler, %IOO'e ayarlanmis ilgili vahsi tip degerlere göre ortalama ± SE cinsinden verilmektedir. Vahsi tipe kiyasla **,P<0,01 ve *,P<0,05 (Student t-test,). Olçek çubuklari: A, 0,1mm; B, lm Sekil 5, DAl ve DAZ'nin gelismekte olan tohumlarin maternal integumentlerinde gerçeklesen hücre çogalmasini kontrol etmek için sinerjik faaliyet gösterdiklerini göstermektedir. (SA-5D), sirasiyla, Col-O, dal-l, da2-l ve dal-l da2-l "in olgun Ovüllerini göstermektedir. da2-l mutasyonu, dal-l"in ovül büyüklügünü sinerjik olarak artirmaktadir. Sekil 6; Col-O < Col-O (c/c) F1, da2-lea2-l (d2/d2) F1, Col- 0 projektif alanini (sol panelde) ve ayrica, Col-OXCol-O (c/c) F1, dal-kol da2-1 < dal-kol da2-l(dd/dd) F1, Col-O < dal-kol da2-1 (c/dd) F1, dal-kol da2-l < Col-O (dd/c) F1 tohumlarinin projektif alanlarini (orta panelde) göstermektedir. Sag panel, dal-kol/+ da2-l/+ tohum zarflari içinde dal-kol/+ da2- l/+ (a), dal-kol/+ da2-lda2-l (b), dal-kol/dal-kol da2- l/+(c) ve dal-kol da2-l (d) einbriyolarinin gelismesine yol açan dal-kol da2-l çift mutant polenine sahip dal-kol/+ da2- l/+ bitkilerinin tozlasmadan sonraki projektif tohum alanlarini göstermektedir. dal-kol da2-l çift mutarit poleniyle fertilize edilmis dal-kol/+da2-l/+ bitkilerinden alinan münferit tohumlarin projektif alanlari ölçülmüstür, Bu tohumlarin dal- kol ve da2-1 mutasyonlari için genotipi de belirlenmistir. Bu veriler, daZ-kol ve da2-l mutasyonlarinin bu tohumlarin büyüklüklerinde görülen varyasyonla iliskilendirilmedigini göstermektedirler (P 0.05, Student t-test). Degerler, %100°e ayarlanmis ilgili vahsi tip degerlere göre ortalama ± SE cinsinden verilmektedir. Vahsi tipe kiyasla, **,P<0,01 (Student t-testi). Olçek çubuklari: A-D, 0,5 mm. Sekil 7; C01-0, dal-l, da2-l ve dal-1 da2-1 olgun ovüllerinin pro jektif alanlarini (sol panelde); 6 DAP ve 8 DAP°daki Col- 0, dal-l, daZ-l ve dal-l da2-l tohumlarinin dis integumentlerinde bulunan hücre sayisini (orta panelde) ve ayrica, münferit tohumlar için dis integument boyundan ve hücre sayisindan yola çikilarak hesaplanan, 6 DAP ve 8 DAP"daki C01-0,dal-l, da2-l ve dal-l da2-l tohuinlarinin dis integumentlerindeki ortalama hücre boyunu (sag panelde) göstermektedir. Sekil 8A, DA2 gen yapisini göstermektedir. Baslangiç kodonu (ATG) ve sonlaiinia kodonu (TAA) gösterilmektedir. Kapali kutular kodlama sekansini; açik kutular 5' ve 3' transle edilmemis bölgelerini ve kutular arasindaki çizgiler intronlari göstermektedir. DA2 geninde bulunan T-DNA insersiyon yeri (da2-l) gösterilmektedir. Sekil 8B, DA2 proteiniiiin tahmin edilen bir RING domaini içerdigini göstermektedir. Sekil 9, DA2"nin E3 ubikuitin ligazi aktivitesini göstermektedir. MBP-DAZ ve mutasyona ugratilmis DA2 (MBP-DA2C59S ve MBP-DA2N91L) füzyon proteinleri, E1, E2 ve His-ubikuitin (His-Ub) varliginda E3 ubikuitin ligazi aktivitesi açisindan eseye tâbi tutulmustur. Ubikuitinlenmis proteinler, sirasiyla, anti-His aiitikoruyla (Anti-His) ve anti-MBP antikoruyla (Anti- MBP) immünoblotlama (IB) yoluyla tespit edilmislerdir. Asagidaki ok MBP-DA2 proteinlerini ve yukaridaki ok ubikuitinlenmis MBP-DA2 proteinlerini göstermektedir. Sekil 10; COM°un kendi promotoruyla yönlendirilen DA2 kodlama sekansiyla transforme edilmis da2-l oldugu Col- 0, da2-l, COM#6, COM#8, ve COM#lO tohumlarinin projektif alanlarini (üst panelde); C01-0,da2-l, COM#6, COM#8 ve COM#lO bitkilerinin petal alanlarini (orta panelde) ve ayrica, Col-O, da2-1, COM#6, COM#8 ve COM#10 fidelerinde bulunan DA2 geni ekspresyoiiunun kantitatif gerçek zamanli RT-PCR analizini (alt panelde) göstermektedir. Degerler (D ve E), %100"e ayarlanmis da2-l degerlerine göre ortalama ± SE cinsinden verilmektedir. daZ-l mutantiiia kiyasla, **, P<0,0l (Student t-testi). Sekil 11, DA2°nin ekspresyon patemlerini göstermektedir. llA, DA2 geni ekspresyonunun kantitatif gerçek zamanli RT-PCR analizini göstermektedir. Köklerden (R), saplardan (S), yapraklardan (L), fidelerden (Se) ve çiçek kümelerinden (In) toplam RNA izole edilmistir. llB-llN, pDA2:GUS transgen ekspresyonuyla izlenene DA2 ekSpresyon aktivitesini göstermektedir. Dört GUS eksprese eden hat gözlemlenmistir ve boyama yogunlugu açisindan hafif sekilde farklilik gösterseler de, hepsi benzer bir patem göstermislerdir. Bir 4 günlük fidede (1 IB), bir 10 günlük fidede (1 IC), bir flora] çiçek kümesinde (llD), gelismekte olan petallerde (llE-llG), gelismekte olan stamenlerde (llH ve 111), gelismekte olan karpellerde (llJ-llL) ve gelismekte olan ovüllerde (llM ve llN) GUS aktivitesinin histokimyasal analizi. Olçek çubuklari: B-D, lmm; E-N, 0,1mm. Sekil 12, DA1°in DA2 ile in vitro ortamda dogrudan dogruya etkilesime geçtigini göstermektedir. GST-DAl, GST- DA1R358K, GST-DAl-UIM, GST-DAl-LIM, GST-DAl- LIM+C ve GST-DAl-C, amiloz reçinesi üzerinde irmnobilize edilmis MBP-DA2 kullanilarak düsürüldüler (PD) ve bir anti- GST antikoru kullanilarak immünoblotlama (IB) yoluyla analiz edildiler. Sekil 13, DAl'in ve onun spesifik protein domainlerini içeren türevlerinin sematik bir diyagrainini göstermektedir. Tahmin edilen DAl proteini iki UIM motifi, tek bir LIM domaini ve C- termiiial bölgesi içermektedir. Sekil 14, DAl"in DA2 ile iri ViVO ortamda etkilesime girdigini göstermektedir. Nicotiana benthamiana yapraklari, 3SSzMyc- DAl and 35 SzGFP-DA2 plazmidlerini barindiran Agrobacterium tumefaciens GV3101 hücrelerinin enjekte edilmesiyle transforme edilirler. T0plam proteinler GFP-Trap-A ile immüno-çökeltilmis ve immünoblot, sirasiyla, anti-GFP ve anti-Myc antikorlariyla problanmistir. Immüno-çökeltilmis GFP-DA2 kompleksinde Myc-DAl tespit edilmistir ve bu da, bitkide DA] ve DA2 arasinda fiziksel bir iliski olduguna isaret etmektedir. Sekil 15, da2-l mutantlarinin organ büyüklüklerinde artisi açiga çikardigini göstermektedir. 15A; Col-O, da2- 1 ve 3SSzDA2#1 bitkilerinin petal boyunu (PL), petal genisligini (PW), petal alaniiii (PA), sepal alanini (SA), karpel boyunu (CL), uzun stamen boyunu (LSL) ve kisa stamen boyunu (SSL) göstermektedir. 15B; Col-O, da2-1 ve 3SS:DA2#1 bitkilerinin besinci yaprak alanini göstermektedir. 15C; Col-O, da2-1 ve 3SS:DA2#1 çiçeklerinin agirliklarini göstermektedir. 15D, C01- 0 ve da2-1 petallerinin maksimal genislik bölgesinde yer alan adaksiyal epidermal hücrelerinin büyüklüklerini göstermektedir. 15E, Col-O ve da2-l"in besinci yapraklarinda yer alan palisat hücrelerinin büyüklüklerini göstermektedir. Açmis çiçekler (asaina 14) petallerin büyüklüklerini (15A), çiçek agirligini (C) ve epiderinal hücrelerin büyüklüklerini (15D) ölçmek için kullanilmislardir. Degerler (A-E), %100,e ayarlanmis ilgili vahsi tip degerlere göre ortalama ± SE cinsinden verilinektedir. Vahsi tipe kiyasla **, P<0,0l (Student t-testi). Sekil 16, DAl ve DA2°nin tohum büyüklügünü kontrol etmek için sinerjik faaliyet gösterdiklerini göstermektedir. l6D; Col-O, dal-kol, daZ-l ve dal-koldaZ-l çiçeklerinin petal alanlarini göstermektedir. 16E; Col-O, dal-kol, da2-l ve dal-kolda2-l petallerinin maksimal genislik bölgelerinde bulunan adaksiyal epidermal hücrelerin büyüklüklerini göstermektedir. 'l6F; Col-O, eod1-2, da2-1 ve eodl-2 da2-l"in tohum agirliklarini göstermektedir. 16G; Col-O, eodl-Z, da2-l ve eodl-Z da2-1°in petal alanlarini göstermektedir. Açilmis çiçekler (asama 14) hem petallerin büyüklüklerini (16D ve 16G), hem de epidermal hücrelerin büyüklüklerini (l6E) ölçmek için kullanilmislardir. Degerler (16D-G), %lOO°e ayarlanmis ilgili vahsi tip degerlere göre ortama ± SE cinsinden verilmektedir. Vahsi tipe kiyasla, **, P<0,0l ve *, P<0,05 (Student t-testi). Olçek çubuklari: 0, 1 mm. Sekil 17, DA2°nin gereginden fazla eksprese edilmesinin organ büyümesini sinirladigini göstermektedir. 17A; Col- 0, 358:DA2#2 ve 358:DA2#4,ün petal alanlariiii göstermektedir. l7B; Col-O, 358:DA2#2 ve 358:DA2#4 fidelerinde DA2 ekspresyon seviyelerini göstermektedir. Degerler (A ve B), %100"e ayarlanmis Col-O degerlerine göre ortalama ± SE cinsinden gösterilmektedir. Vahsi tipe kiyasla, **, P<0,()l (Student t testi). Sekil 18, DA2L°nin gereginden fazla eksprese edilmesinin organ büyümesini sinirladigini göstermektedir. 18A, 20 günlük C01-O,3SS:DA2L#1, 358:DA2L#3, 358:DA2L#4, 358:DA2L#5 Ve 3SS:DA2L#6 bitkilerini göstermektedir. 18B, 30 günlük C01- 0,3SS:DA2L#1, 358:DA2L#3, 3SS:DA2L#4, 358:DA2L#5 ve 3SS:DA2L#6 bitkilerini göstermektedir. lSC; Col- 0, 3SS:DA2L#l, 358:DA2L#3, 3SS:DA2L#4, 3SSzDA2L#5 ve 358:DA2L#6 fidelerinde DA2L ekSpresyonuna iliskin RT-PCR analizini göstermektedir. RT-PCR analizi, 2 haftalik fidelerden hazirlanan ilk iplikçikli CDNA üzerinde yapilmistir. CDNA, bir ACTIN2 standardina atif yapilarak standartlastirilmistir. Olçek çubuklari: A, lcm, B, lem Sekil 19, GW2,nin gereginden fazla eksprese edilmesinin tohum ve organ büyümesini sinirladigini göstermektedir. 19A; 30 günlük Col-O, 3SS:GW2#1, 3SS:GW2#2, 358:GW2#3, 3SS:GW2#6 ve 3SS:GW2L#7 bitkilerini göstermektedir. l9B; Col-O, 3SSIGW2#1, 358:GW2#2, 3SS:GW2#3, 358:GW2#6 ve 358:GW2L#7 tohumlarinin projektif alanlarini göstermektedir. 19C; Col-O, 3SS:GW2#1, 358:GW2#2, 358:GW2#3, 358:GW2#6 ve 358:GW2 L#7 fidelerinde GW2 geni ekspresyonuna yönelik kantitatif gerçek zamanli RT-PCR analizini göstermektedir. Degerler (B), %lOO"e ayarlanmis Col- 0 degerlerine göre ortalama ± SE cinsinden verilmektedir. Vahsi tipe kiyasla **, P<0,0l (Student t-testi). Olçek çubuklari: A, lcm Bulusa Konu Olan Yapilara Iliskin Detayli T arifname Bu bulus, örnegin tohum ve organ büyüklügü gibi verimi etkileyen bitki özelliklerinin, DA] veya DAl ve EOD] ekspresyonu veya aktivitesindeki degisikliklerle birlikte bitki E3 ubikuitin ligazi DA2 ekspresyonu veya aktivitesini degistirmek suretiyle degistirilmesine yönelik yöntemlerle ilgilidir. Tercihen, bitkilerde DA2 ve DA] ekSpresyonu veya aktivitesi degistirilmektedir. DA2 ekspresyonu veya aktivitesi; DA] veya DA] ve EOD] ekspresyonu veya aktivitesi alterasyonundan önce, onunla ayni zamanda ya da ondan sonra degistirilebilir. Örnegin, bu bulusun bazi yapilarinda, bir DA2 polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesi, degistirilmis DA] ekspresyonu veya aktivitesinden, degistirilmis EOD] ekspresyonu veya aktivitesinden ya da degistirilmis DAl ve EODl ekspresyonu veya aktivitesinden birine zaten sahip olan bir veya daha fazla bitki hücresinde degistirilebilir. Bu patent basvurusunda, örnegin organ veya tohum büyüklügünü artirmak suretiyle bitki verimini artirmaya yönelik olan ve DA] ya da DA] ve EOD] ekspresyonu veya aktivitesi eksik olan bir bitki saglanmasindan ve ayrica, 0 bitkinin bir veya daha fazla hücresinde DA2 ekspresyonunun azaltilmasindan olusan yöntemler sunulmaktadir. Bu bulusun diger yapilarinda, DA] ya da DA] ve EODl ekspresyonu veya aktivitesi, bir DA2 polipeptidi ekspresyonu veya aktivitesi azalmis bulunan bir veya daha fazla bitki hücresinde azalabilir. Diger yöntemler, söz konusu bitkinin bir veya daha fazla hücresinde DA2 ekspresyonunun azaltilmasini ve ayrica, bir veya daha fazla hücrede DAl ya da hem DAl hem de EODl ekspresyonu veya aktivitesinin azaltilmasini içerebilirler. Bu patent basvurusunda, ayrica, vahsi tip bitkiye kiyasla, beher birim alanda tohum kütlesi, büyümesi ve/Veya biyokütlesi artmis olan bir bitki üretmeye yönelik olan ve asagidakileri kapsayan yöntemler de sunulmaktadir: (a) asagida sayilanlarin transformasyon yoluyla bir bitki hücresine dâhil edilmesi: (i) bir DA2 polipeptidi ekspresyonunu azaltan bir birinci heterolog nükleik asit, (ii) bir DAl polipeptidinden ve bir EODl polipeptidinden birinin ekSpresyonunu azaltan ikinci bir heterolog nükleik asit ve istege bagli olarak (iii) bir DA] polipeptidinin veya bir EOD] polipeptidinin ekspresyonunu azaltan bir üçüncü heterolog nükleik asit ve (b) bitkinin bir veya daha fazla transfornie edilmis hücreden re jenere edilmesi. Beher birim alan için tohum kütlesi, büyümesi ve/Veya biyokütlesi artmis bir bitki üretmeye yönelik diger yöntemler asagidakileri içerebilirler: DA] ya da DA] ve EOD] ekspresyonu veya aktivitesi, tercihen DAl aktivitesi eksik bir bitki hücresi temin edilmesi, bir DA2 polipeptidinin aktivitesini veya ekspresyonunu düsüren bir heterolog nükleik asidin transforinasyon yoluyla bu bitki hücresinin bünyesine dâhil edilmesi ve transforme edilmis hücreden bitki re jenere edilmesi. Rejenerasyonun ardindan, vahsi tip bitkiye kiyasla, hem bir DA2 polipeptid aktivitesi veya ekspresyonu, hem de DA] ya da DA] ve EODl aktivitesi veya ekspresyonu düsük bir bitki seçilebilir. Azalinis DA2 ekspresyonu ve azalmis DAl ya da DAl ve EODl ekspresyonu kombinasyonu, bitkinin tohum ve/veya organ büyüklüklerini sinerjik olarak artimiaktadir ve bu yolla, beher birim alan için tohum kütlesini, büyümeyi ve/Veya biyokütleyi de artirmaktadir. Bitkinin verimle iliskili bir veya daha fazla 'Özellik, azalmis DA2 ekspresyonu veya aktivitesiiiden ve azalmis DA] ya da DA] ve EODl ekspresyonu veya aktivitesinden olusan bir kombinasyonla iyilestirilebilir. Örnegin, DA2 polipeptidi ekspresyonunun azaltilmadigi kontrol bitkilerine veya vahsi tip bitkilere kiyasla, bu bitkilerde yasam süresi, organ büyüklügü ve tohum büyüklügü özelliklerinden biri veya birden fazlasi artirilabilir. Bu patent basvurusunda açiklanan yöntemlerde, DA2, DAl veya EOD] ekspresyonu veya aktivitesi, vahsi tip bitkiye kiyasla, en az %50, en az %60, en az %70, en az %80, en az %%90, en az %95 ya da en az %98 oraninda azaltilabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, ekspresyon veya aktivite sifira kadar ya da hemen hemen sifira kadar azaltilir (yani ekspresyon veya aktivite ortadan kaldirilir). Bu bulusa konu olan yöntemler, bir bitkinin bir veya daha fazla hücresinde bulunan bir DA2 polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesinin degistirilmesini içermektedirler. DA2 polipeptidleri, bitkilerde bulunan E3 ubikuitin ligazlaridir. Ekspresyonu veya aktivitesi bu patent basvurusunda açiklandigi gibi azaltilan DA2 polipeptidleri bir RING domaini (Stone, S.L. ve ark. (2005)), tercihen bir C5HC2, C5NC2 veya C5TC2 RING domaini içerebilirler. Uygun bir RING domaini, SEKANS KOD NO.: 1 ; C(X)2C(X)iiCC(X)4CX2CX7(H/N/T)X6CX2C amino asit sekansini içerebilirler. (SEKANS KOD NO.: 1) Bu bulusa konu olan DA2 polipeptidleri, SEKANS KOD NO.: 2 amino asit sekansini içeren bir RING doinaininden olusurlar: CPTCFLiiY/?iYPSI.bJRSi_K./'R:iCMS/Winx:KIG/S)IC'Z'ECELIIQfRmmP/ N/S/'v'i'l'fNi :':fP'J iH/N/Tji (7/5: [AKUT: &RIO/K)PTQCPEF/'i'iic (SEKANS KOD No:2) Bu bulusun bazi yapilarinda, SEKANS KOD NO.: 2'er temsil edilen RING domaininde 33. pozisyondaki H/N/T artigi T veya N olabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DA2 polipeptidi, Tablo l°de (SEKANS KOD NO.: 3-19) gösterilen bir amino asit sekansina sahip bir RING domaini içerebilir, örnegin Arabidopsis DA2 (SEKANS KOD NO.: 11), Arabidopsis DAL2 (SEKANS KOD NO.: 13) veya Pirinç GW2 (SEKANS KOD NO.: 7) ya da onlarin bir varyanti. Örnegin, bir RING domaini, SEKANS KOD NO.: 20 (Pt_GI-224061326.pr0) ile temsil edilen 59 ilâ 101 artiklarmin, SEKANS KOD NO.: 21 (Rc_GI-255578534.pro) ile temsil edilen 59 ilâ 101 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 22 (VV_GI-147817790.pro) ile temsil edilen 59 ilâ 101 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 23 (Gm GI-356549538.pr0) ile temsil edilen 59 ilâ 101 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 24 (At_Gl-184ll948.pr0) ile teinsil edilen 59 ilâ 101 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 25 (Ta_GI 408743661.pr0) ile teinsil edilen 61 ilâ 103 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 26(HV Gl- l6437l454.pro) ile temsil edilen 61 ilâ 103 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 27 (Bd_Gl-357140854.pr0) ile temsil edilen 61 ilâ 103 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 28 (Os_GI-115445269.pr0) ile teinsil edilen 62 ilâ 104 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 29 (Sb_GI- 242064618.pro) ile temsil edilen 63 ilâ 105 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 30 (Zm_GI-220961719.pr0) ile temsil edilen 65 ilâ 107 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 31 (Ta_GI-408743658.pr0) ile temsil edilen 61 ilâ 103 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 32 (Bd_GI- 357125256.pro) ile temsil edilen 43 ilâ 85 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 33 (Os_GI-218197613.pro) ile temsil edilen 62 ilâ 104 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 34 (Zm_Gl-260935347.pr0) ile temsil edilen 62 ilâ 104 artiklariniu ya da SEKANS KOD NO.: 35 (Sb_GI-242092026.pr0) ile temsil edilen 62 ilâ 104 artiklarinin amino asit sekansina sahip olabilir. Ayrica, uygun RING domain sekanslari, bu patent basvurusunda tarif edilen standart sekans analizi teknikleri (örnegin Basit Modüler Mimari Arastirma Araci (SMART); EMBL Heidelberg, Almanya) kullanilarak tanimlanabilirler. DA2 polipeptidleri, bir birinci konsensus domainini de içerebilir. Birinci konsensus domaini, RING domaininin upstream yönünde (yani N terminal tarafinda) bulunabilir. Bir uygun birinci konsensus domaini, SEKANS KOD NO.: 36 ile ifade edilen amino asit sekansindan olusabilir. Ç'ZQ/AbsenîI'GLY1P/D'I/Nf'v'J-CILIV/El [INS/N) (P/K/RJ Dil/*i'îlîl'iL/ll I'l/'ia'/QII(F(,I'RIIKT.[R/Kl:R/Kll.1i:'v'/'Z.}1F/C]lA/'S/T)KI.ÄPC (SEKANS KOD NO: 36) Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DA2 polipeptidi, Tablo 2"de gösterilen bir DA2 amino asit sekansinin bir birinci konsensus domainini, örnegin SEKANS KOD NO.: 20 ile ifade edilen 20 ilâ 45 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 21 ile ifade edilen 20 ilâ 45 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 22 ile ifade edilen 20 ilâ 45 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 23 ile ifade edilen 20 ilâ 45 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 24 ile ifade edilen 20 ilâ 45 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 25 ile ifade edilen 21 ilâ 46 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 26 ile ifade edilen 21 ilâ 46 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 27 ile ifade edilen 21 ilâ 46 artiklarmi, SEKANS KOD NO.: 28 ile ifade edilen 21 ilâ 46 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 29 ile ifade edilen 21 ilâ 46 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 30 ile ifade edilen 21 ilâ 46 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 31 ile ifade edilen 21 ilâ 46 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 32 ile ifade edilen 4 ilâ 29 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 33 ile ifade edilen 23 ilâ 48 artiklarmi, SEKANS KOD NO.: 34 ile ifade edilen 23 ilâ 48 artiklarini ya da SEKANS KOD NO.: 35 ile ifade edilen 23 ilâ 48 artiklarini içerebilir. Bir DA2 polipeptidi, bir ikinci konsensus domaini de içerebilir. Ikinci konsensus domaini, RING domaininin downstream yönünde (yani C terminal tarafinda) bulunabilir. Ikinci konsensus domaini, SEKANS KOD NO.: 37 ile ifade edilen amino asit sekansindan olusabilir. iN/slrnvurkoivxüiKii/sixtnqxxai:6/31ivjr/IjE/L/Hpsair/Irv /FjiEIÇÇR/IJKl'JîEâiû/Kîi ari'Msabimü-:xiii :it/Q) iiax'A'i (SEKANS KOD NO: 37). Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DA2 polipeptidi, Tablo 2°de gösterilen bir DA2 amino asit sekansinin bir ikinci konsensus domainini, örnegin SEKANS KOD NO.: 20 ile ifade edilen 106 ilâ 141 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 21 ile ifade edilen 106 ilâ 141 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 22 ile ifade edilen 106 ilâ 141 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 23 ile ifade edilen 106 ilâ 141 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 24 ile ifade edilen 106 ilâ 141 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 25 ile ifade edilen 107 ilâ 143 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 26 ile ifade edilen 107 ilâ 143 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 27 ile ifade edilen 107 ilâ 143 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 28 ile ifade edilen 108 ilâ 144 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 29 ile ifade edilen 109 ilâ 145 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 30 ile ifade edilen 111 ilâ 147 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 31 ile ifade edilen 107 ilâ 143 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 32 ile ifade edilen 90 ilâ 125 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 33 ile ifade edilen 108 ilâ 143 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 34 ile ifade edilen 108 ilâ 143 artiklarini ya da SEKANS KOD NO.: 35 ile ifade edilen 108 ilâ artiklarini içerebilir. Uygun birinci ve ikinci domain sekanslarinin ilave örnekleri, bu patent basvurusunda tarif edilen standart sekans analizi teknikleri (örnegin Basit Modüler Mimari Arastirma Araci (SMART); EMBL Heidelberg, Almanya) kullanilarak tanimlabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, ekspresyonu veya aktivitesi bu patent basvurusunda tarif edildigi gibi azaltilan bir DA2 polipeptidi, SEKANS KOD NO.: 2 ile temsil edilen bir RING Domaini, SEKANS KOD NO.: 36 ile temsil edilen birinci konsensus domaini ve SEKANS KOD NO.: 37 ile temsil edilen bir ikinci konsensus domaini içerebilir. Örnegin, bir DA2 polipeptidi, yukarida gösterilen RING domain sekansindan, birinci konsensus doniaini sekansindan ve ikinci konsensus domaini sekansindan olusan herhangi bir kombinasyonu içerebilir. Bir uygun DA2 polipeptidi, Tablo 2"de gösterilen SEKANS KOD NO. 20 ilâ 35°ten herhangi biriyle temsil edilen bir ainino asit sekansini içerebilir ya da bu sekanslardan birinin varyanti olabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DA2 polipeptidi; SEKANS KOD NO.: 28 veya 33 (OsGW2), SEKANS KOD NO.: 24 (AtDA2), SEKANS KOD NO.: 25 veya SEKANS KOD NO.: 31 (TaGW2) ile temsil edilen amino asit sekansini içerebilir ya da bu sekanslardan herhangi birinin E3 ubikuitin ligazi aktivitesi bulunan bir varyanti olabilir. SEKANS KOD NO.: 20 ilâ 35"ten herhangi birinin ya da baska referans DA2 sekanslarinin bir varyanti olan bir DA2 polipeptidi, referans DA2 sekansina en az %20, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %80, en az %90, en az %95 veya en az %98 oraninda sekans özdesligine sahip bir amino asit sekansi içerebilir. SEKANS KOD NO.: 20 ilâ 35°ten herhangi birinin bir varyaiiti olan bir DA2 polipeptidi SEKANS KOD NO.: 2 ile temsil edilen sekansa sahip bir RING doinaini, SEKANS KOD NO.: 36 ile temsil edilen sekansa sahip bir a birinci konsensus domaini ve ayrica, SEKANS KOD NO.: 37 ile temsil edilen sekansa sahip bir ikinci konsensus domaini de içerebilir. Uygun sekanslara verilebilecek 'Örnekler yukarida gösterilmistir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DA2 polipeptidi, SEKANS KOD NO.: 20 ilâ 35"ten herhangi biriyle temsil edilen RING domainini, birinci konsensus domainini ve ikinci konsensus domainini içerebilir. Bir DA2 polipeptidini kodlayan bir nükleik asit, JN896622.] GII408743658 (TaGW2-A) ve `TN896623.1 GI:408743660"dan (TaGWZ-B) olusan gruptan seçilmis bir veritabani girisinde belirtilen bir nükleotid sekansini içerebilir ya da bu sekanslardan birinin varyanti olabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DA2 polipeptidini kodlayan bir nükleik asit, AtDA2, AtDAL2, OsGW2, TaGW2-A veya TaGWZ-B kodlayan nükleotid sekansini içerebilir ya da DA2 aktivitesine sahip bir polipeptidi kodlayan bu DA2 sekanslarindan herhangi birinin bir varyanti olabilir. DA2 polipeptidleri ve kodlayan nükleik asitler, ilgili herhangi bir bitki türünde, 'Özellikle de bugday, arpa, misir, pirinç, soya fasulyesi ve baska zirai bitkiler gibi bir tahil bitkisinde rutin sekans analizi teknikleri kullanilarak tanimlanabilirler. Bu patent basvurusunda, bir bitkinin DA2 ekSpresyonu veya aktivitesinde gerçeklesen azalmanin, DAl aktivitesi veya ekspresyonunu azaltan mutasyonlarin bitkilerin verimle iliskili `Özellikleri üzerindeki etkisini sinerjik olarak artirdigi gösterilmektedir. Bu bulusun tercih edilen yapilarinda, bu patent basvurusunda tarif edilen yöntemler, DAl ekspresyonu veya aktivitesi eksik olan bir bitkide DA2 ekspresyonunun azaltilinasini ya da bir bitkide hem DA] hem de DA2 ekspresyonunun azaltilmasini içerebilirler. DAl polipeptidleri, bitkilerde bulunan ubikuitin reseptörleridir ve hem Li ve ark. (2008) ve Wang ve ark. (2012) referanslarinda, hem de W02009/047525 sayili patent basvurusunda detayli tarif edilmektedirler. Ekspresyon veya aktivitesi bu patent basvurusunda tarif edildigi sekilde azaltilan DA] polipeptidleri, bir LIM domaini, bir korunmus C terminal domaini ve bir veya daha fazla UIM domaini içerebilirler. Bir LIM domaini iki Zn parmak motifi içerebilir ve ayrica, (SEKANS KOD NO. 238); 2002200i6-23IH_/C)(X)2/4w1(X)2Q(X)2Q(X) 14- 2] gC/_H)(X)2/i ,31 C/H/ D/Egx amino asit sekansina sahip olabilir; burada, X simgesi, herhangi bir amino asittir ve Zn koordine edici artiklarin alti çizilmistir. LIM domainindeki Zn koordine edici artiklar C, H, D veya E, tercihen C olabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir LIM domaini CXXC, HXXCXXCXXC ve HXXC motiflerini içerebilir; burada, X simgesi herhangi bir amino asittir. Örnegin, bir LIM domaimi (SEKANS KOD NO.:39); 209220016-23@(X)21Q)(X)2Q(X)2Ç(X)14-2 iHOQzÇX amino &Sit sekansini içerebilir; burada, X simgesi herhangi bir amino asittir ve Zn koordine edici artiklarin alti çizilmistir. Bu bulusun bazi yapilarinda, bir LIM domaini AtDAl LIM domaininin amino asit sekansini içerebilir: QAGQNMEIGHGRFLNCLNSLWEPEQFRÇYGÇSQPISEYEFSTS GNYPFgKAÇY (SEKANS KOD NO.: 40; Zn koordine edici artiklarin alti çizilmistir). Diger LIM domainleri Tablo 3"te gösterilen bir DAl amino asit sekansinin LIM domainini, örnegin SEKANS KOD NO.: 41 (Si_GI- 514815267.pro) ile temsil edilen 141 ilâ 193 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 42 (Bd_GI-357157184.pro) ile temsil edilen 123 ilâ 175 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 43(Br_DAlb.pro) ile temsil edilen 155 ilâ 207 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 44 (Br_DAla.pro) ile temsil edilen 172 ilâ 224 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 45 (At_Gl- 15221983.pr0) ile temsil edilen 172 ilâ 224 attiklarini, SEKANS KOD NO.: 46 (Tc_GI-508722773.pr0) ile temsil edilen 117 ilâ 169 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 47 (Gm_GI-356564241.pr0) ile temsil edilen 117 ilâ 169 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 48 (Gm_GI- 356552145.pr0) ile temsil edilen 121 ilâ 173 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 49 (VV_G1-302142429.pr0) ile temsil edilen 119 ilâ 171 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 50 (VV_GI-359492104.pr0) ile temsil edilen 122 ilâ 174 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 51 (Sl_GI- 460385048.pr0) ile temsil edilen 125 ilâ 177 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 52 (Os_GI-218197709.pr0) ile temsil edilen 516 ilâ 568 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 53 (Os_GI-115466772.pr0) ile temsil edilen 124 ilâ 176 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 54 (Bd_Gl- 357160893.pr0) ile temsil edilen 150 ilâ 202 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 55 (Bd_GI-357164660.pr0) ile temsil edilen 132 ilâ 184 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 56 (Sb_GI-242092232.pr0) ile temsil edilen 124 ilâ 176 attiklarini, SEKANS KOD NO.: 57 (Zm_GI- 212275448.pr0) ile temsil edilen 147 ilâ 199 attiklarini, SEKANS KOD NO.: 58 (At_GI-240256211.pr0) ile temsil edilen 190 ilâ 242 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 59 (At_GI-l45360806.pr0) ile temsil edilen 162 ilâ 214 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 60 (At_GI- 22326876.pr0) ile temsil edilen 1240 ilâ 1291 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 61 (At_G1-30698242.pr0) ile temsil edilen 80 ila 122 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 62 (At_GI-30698240.pr0) ile temsil eden 347 ilâ 402 artiklarini, SEKANS KOD NO.: 63 (At_G1- 15240018.pr0) ile temsil edilen 286 ilâ 341 artiklarini ya da SEKANS KOD NO.: 64 (At_GI-334188680.pr0) ile temsil edilen 202 ilâ 252 artiklarini içerir. LIM domain sekanslari, standart sekans analizi teknikleri (örnegin Basit Modüler Mimari Arastirma Araci (SMART); EMBL Heidelberg, Almanya) kullanilarak tanimlanabilirler. Bir LIM domainine ek olarak, bir DA1 proteini; SEKANS KOD NO.: 41 ile temsil edilen 198 ilâ 504 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 42 ile temsil edilen 180 ilâ 487 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 43 ile temsil edilen 212 ilâ 514 temsil edilen 256 ilâ 587 artiklarinin sekansina en az %20, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %80, en az %90, en az %95 veya en az %98 oraninda amino asit özdesligi bulunan bir amino asit sekansma sahip bir karboksil terminal bölgesi de içerebilir. DAl proteininin karboksil terminal bölgesi, metallopeptidaz motifi HEMMH (SEKANS KOD NO.: 65) içerebilir. The karboksil terminal bölgesi, LIM domaini ve HEMMH motifi arasinda konumlandirilmis bir EK(X)8R(X)4SEEQ (SEKANS KOD NO.: 66) veya EK(X)8R(X)4SEQ (SEKANS KOD NO.: 67) motifi de içerebilir. Bir DAl proteini, bir LIM domainine ve korunmus bir karboksil terminal bölgesine ek olarak, bir UIM] domaini ve bir UIM2 domaini de içerebilir. UIMl ve UIM2 domainleri, DAl proteininin N terminal ve LIM domaini arasinda yer alabilir. Bir UlMl domaini, SEKANS KOD NO.: 68 ile temsil edilen sekansi içerebilir ve bir UIM2 domaini, SEKANS KOD NO.: 69 ile ifade edilen sekansi içerebilir. p---prbAl pb.Sbp-.pp p (SEKANS KOD NO.: 68) p---prbAl pb.Sbp-spp p (SEKANS KOD NO.: 69) burada: p simgesi, bir polar amino asit artigidir, Örnegin C, D, E, H, K, N, Q, R, S veya T; b simgesi, bir büyük amino asit artigidir, örnegin E, F, H, 1, K, L, M, Q, R, W veya Y; simgesi, bir küçük amino asit artigidir, örnegin A, C, D, G, N, P, S, T veya V; 1 simgesi, bir alifatik amino asit artigidir, 'Örnegin 1, L veya V; . simgesi, amino asidin inevcut olmadigini ya da herhangi bir amino asit oldugunu ifade eder ve - simgesi, herhangi bir amino asittir. UIMl ve UIM2 domain sekanslarinin ilave 'Örnekleri, bu patent basvurusunda tarif edilen standart sekans analizi teknikleri (eg. Basit Modüler Mimari Arastimia Araci (SMART), EMBL Heidelberg, Almanya) kullanilarak tanimlabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DAl polipeptidi asagidakileri içerebilir: SEKANS KOD NO.: 39 ile temsil edilen bir LIM domaini, yukarida açiklandigi üzere, bir EK(X)8R(X)4SEEQ veya EK(X)8R(X)4SEQ motifini ve bir HEMMH motifini içeren ve SEKANS KOD NO.: 45 ile temsil edilen 229 ilâ 532 artiklarina en az %20 oraninda sekans özdesligine sahip bir C terminal bölgesi ya da SEKANS KOD NO.: 41 ila 44 veya 46 ila 64lten herhangi biriyle temsil edilen esdeger bir bölge, SEKANS KOD NO.: 66 ile temsil edilen bir UIM domaini ve SEKANS KOD NO.: 67 ile temsil edilen bir UIM domaini. Bir DA] proteini, Tablo 3°te gösterilen bir bitki DA] proteininin bir amino asit sekansini (SEKANS KOD NO.: 41 ilâ 64) içerebilir ya da bu sekanslardan herhangi birinin DAl aktivitesine sahip bir homologu veya varyanti olabilir. Örnegin, bir DAl polipeptidi, Tablo 3°te gösterilen bir amino asit sekansini (SEKANS KOD NO.: 41 ilâ 64) içerebilir ya da bu sekanslardan birinin DAl aktivitesine sahip varyanti olabilir. Örnegin, bir DAl polipeptidi; bir AtDAl, AtDARl, AtDARZ, AtDAR3, AtDAR4, AtDARS, AtDAR6, AtDAR7, BrDAla, BrDAlb, BrDARl, BrDARZ, BrDAR3-7, BrDALl, BrDAL2, BrDAL3, OsDAl, OsDARZ, OsDAL3, OsDALS, PpDALl , PpDALZ, PpDAL3, PpDAL4, PpDALS, PpDAL6, PpDAL7, PpDAL8, SniDALl, SmDAL2 veya ZmDAl, tercihen AtDAl, AtDARl BrDAla, BrOAlb, OsDAl veya ZmDAl amino asit sekansini ya da bu sekanslardan birinin bir homologu veya varyantini içerebilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DAl polipeptidi, AtDAl (AT1G19270; NP_173361.1 Gl: 15221983) ainino asit sekansini içerebilir ya da bu sekansin DAl aktivitesine sahip varyanti olabilir. Yukarida belirtilen karakteristik özellikleri içeren diger DAl protein sekanslari standart sekans analiz araçlari kullanilarak taninilanabilir. Sektörde bilgi ve beceri sahip bir kisi, ilgili herhangi bir bitki türünde DAl proteinlerini kodlayan nükleik asit sekanslarini kolayca belirleyebilecektir. Ilgili bir bitki türünde bulunan bir DA] proteini, bu patent basvurusunda belirtilen bir DAl proteini referans amino asit sekansinin bir varyanti olan bir amino asit sekansina sahip olabilir. Örnegin SEKANS KOD NO.: 41 ilâ 64"ten herhangi biri gibi bir referans DAl sekansinin bir varyanti olan bir DAl polipeptidi, referans sekansa en az %20, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %80, en az %90, en az %95 veya en az %98 oraninda sekans özdesligine sahip bir amino asit sekansiiii içerebilir. Bir bitki türünde gerçeklesen belirli amino asit sekansi varyantlari, l amino asit, 2, 3, 4, 5-10, 10-20 20-30, 30-50 veya 50°den fazla ainino asit insersiyonu, adisyonu, sübstitüsyonu veya delesyonuyla bu patent basvurusunda belirtilen bir referans sekanstan farkli olabilirler. Bu bulusun bazi yapilarinda, SEKANS KOD NO.: 45 ile temsil edilen AtDAl sekansinin bir varyanti olan bir DAl polipeptidi, QENEDIDRAIALSLLEENQE (SEKANS KOD NO.: 70) sekansina sahip bir UlMl domainini ve ayrica, DEDEQIARALQESMVVGNSP (SEKANS KOD NO.: 71) sekansina sahip bir UIM2 domainiiii içerebilir. SEKANS KOD NO.: 45 ile teinsil edilen AtDAl sekansinin bir varyanti olan bir DAl polipeptidi, asagidaki sekansa sahip bir LIM domaini içerebilir: ICAGCNMEIGHGRFLNCLNSLWHPECFRCYGCSQPISEYEFSTS GNYPFHKAC (SEKANS KOD NO.: 72) Bir DA] polipeptidini kodlayan bir nükleik asit, NM_]0]785.3 (31242562170 (AtDAl); NM_001057237.1 GI:]]5454202 (OsDAl); BT085014.] GI: 238008663sten (ZmDAl) olusan gruptan seçilmis bir veritabani girisinde belirtilen bir nükleotid sekansini içerebilecegi gibi, bu sekanslardan birinin bir aktif DA] polipeptidini kodlayan varyanti da olabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir DA] polipeptidini kodlayan bir nükleik asit; AtDAl (NM_101785.3 GI: 42562170), ZmDA] (BT085014.] GI: 238008663), OsDA] (NM_00]057237.1 GI:115454202) ile temsil edilen nükleotid sekansini içerebilecegi gibi, bu sekanslardan herhangi birinin DA] aktivitesini durduran bir polipeptidi kodlayan bir varyanti da olabilir. DA] polipeptidleri ve kodlayan nükleik asitler, bitki türlerinde, 'Özellikle de bugday, arpa, misir, pirinç ve baska zirai bitkiler gibi tahil bitkilerinde rutin sekans analizi teknikleri kullanilarak tanimlanabilirler. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir bitkinin bir veya daha fazla hücresinde gerçeklesen DA] aktivitesi, o bir veya daha fazla hücrede bir dominant-negatif DAl polipeptidi ekspresyonuyla azaltilabilir (örnegin, bakiniz: Li ve ark. (2008); W02009/047525; Wang ve ark. 2012). Bir dominant negatif DA] polipeptidi eksprese eden bir bitki, bir dal-1 fenotipine sahip olabilir. Bir DAl polipeptidinin bir dominant negatif alleli; A. thaliana DA] amino asit sekansinin 358. pozisyonunda, Z. mays DA] amino asit sekansinin 333. pozisyonunda ya da baska bir DA] ainino asit sekansinin esdeger pozisyonunda bulunan bir korunmus R artiginda, 'Örnegin bir sübstitüsyon veya delesyon gibi bir mutasyona sahip bir DAl polipeptidi içerebilir. Örnegin, bir DAl polipeptidinin bir dominant negatif alleli, A. thaliana DAl amino asit sekansinin 358. pozisyonuna ya da Z. inays DAl amino asit sekansinin 333. pozisyonuna esdeger bir pozisyonda bir korunmus R artigi mutasyonu içerebilir. Bu bulusun tercih edilen yapilarinda, korunmus R artigi, K°yi sübstitûe edebilir. A. thaliana DAlsin SEKANS KOD NO.: 45 ile temsil edilen 358. pozisyonuna ya da Z. inays DA] "in SEKANS KOD NO.: 57 ile temsil edilen 333. pozisyonuna esdeger bir DAl amino asit sekansinda yer alan korunmus R artigi, DAl amino asit sekansi bünyesinde SEKANS KOD NO:57 ile temsil eden R333"e ve SEKANS KOD NO.:45 ile temsil edilen R358"e tekabül eden pozisyonda bulunmaktadir, yani DAl proteininin diger motifleri ve domainlerine göre ayni pozisyondadir. Korunmus R artigi, C terminal bölgesinin LIM domaini ve HEMMH peptidaz motifi arasinda yer alir ve DA] proteinlerinde yer alan ayni sekans baglaminda tamamen korunur. Korunmus R artigi, C terminal bölgesindeki bir EK(X)8R(X)4SEEQ (SEKANS KOD NO.: 66) veya EK(X)8R(X)4SEQ (SEKANS KOD NO.: 67) motifinde bulunabilir. Korunmus R artigi, bu korunmus C terminal bölgelerini standard sekans analizini ve hizalama araçlarini kullanarak hizalamak suretiyle belirlenebilir ve ayrica, Tablo 3'e konu olan sekanslardaki bir okla tanimlanir. Bir DA proteininin bir dominant negatif allelini kodlayan nükleik asit, geleneksel herhangi bir teknik kullanilarak üretilebilir. Örnegin, A. thaliana DAl "in R358"ine veya Zea inays DAl ,in R3337üne, örnegin K"ye esdeger pozisyondaki korunmus R artigini degistirmek için, bir DAl polipeptidi kodlayan bir nükleik asit üzerinde yer hedefli mutagenez kullanilabilir. In vitro mutagenez için kullanilan reaktifler ve kitler ticari piyasada mevcuttur. Bu bulusun bazi yapilarinda, bu patent basvurusunda tarif edilen bir dominant negatif DAl polipeptidini kodlayan bir nükleik asit, örnegin bir konstitütif, indüklenebilir, doku spesifik veya gelisimsel spesifik proinotor gibi bir promotor'ün örnek teskil ettigi bir heterolog regüle edici sekansa operabl bagli olabilir. Dominant negatif DA] polipeptidi kodlayan nükleik asit, bir veya daha fazla vektörde bulunabilir. Örnegin, bitki fenotipini degistirmek için, bir DAl proteininin dominant negatif allelini kodlayan mutasyona ugratilmis nükleik asit, asagida tarif edildigi üzere bir ekspresyon vektörüne kodlanabilir ve bitki hücrelerinde de ekSprese edilebilir. Bu bulusun diger yapilarinda, bir bitkideki bir endojen DAl nükleik asidine bir mutasyon eklenebilir ve böylece, mutant DAl nükleik asidinin kodladigi DAl polipeptidi dominant negatif aktiviteye sahip olabilir. Bir dominant negatif DAl polipeptidi kodlayan nükleik asit, ayni bitki türünde veya orijinal olarak izole edildigi varyetede ya da farkli bir bitki türünde veya varyetesinde (yani bir heterolog bitki) eksprese edilebilir. Bu patent basvurusunda, ayrica, bir bitkide DA2 ekspresyonunun azaltilmasi veya ortadan kaldirilmasinin, EODl ekspresyon veya aktivitesini azaltan mutasyonlarin bitkilerin verimle iliskili özellikleri üzerindeki etkisini artirdigi da gösterilmektedir. Bu patent basvurusunda tarif edilen yöntemler, EODl ekspresyonu veya aktivitesi eksik olan bir bitkide DA2 ekspresyonu veya aktivitesinin azaltilmasini ya da bir bitkide hem DA2 hem de EODl ekspresyonu veya aktivitesinin azaltilmasini içerebilir. Bu bulusun tercih edilen yapilariiida, bu bitkide DAl aktivitesi de eksiktir ya da bu yöntem, ilave olarak bitkide DAl ekspresyonunun azaltilinasini veya ortadan kaldirilmasini da içerebilir. EOD] polipeptidleri, bitkilerde bulunaii E3 ubikuitin ligazlaridirlar ve Disch ve ark. (2006) ve Li ve ark. (2008) referanslarinve ve ayrica, W02009/047525 sayili patent basvurusunda detayli tarif edilmektedirler. Ekspresyonu veya aktivitesi bu patent basvurusunda tarif edildigi gibi azaltilan bir EOD] polipeptidi, bir EOD domaini içerebilir. Uygun bir EOD domaini, SEKANS KOD NO.: 73 ile temsil edilen ainino asit sekansindan olusabilir; Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, Tablo 4°te de gösterildigi üzere, bir EODl polipeptidi; SEKANS KOD NO.: 74 (Zm_GI- 223973923pr0) ile temsil edilen 195 ilâ 237 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 75 (Sb_GI-242042045.pr0) ile temin edilen 195 ilâ 237 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 76 (Zm_Gl-226496789.pr0) ile temsil edilen 195 ilâ 237 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 77 (Os_Gl-222624282.pro) ile temsil edilen 218 ilâ 260 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 78 (Os_GI-115451045.pro) ile temsil edilen 196 ilâ 238 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 79(Bd_GI-357113826.pr0) ile temsil edilen 197 ilâ 239 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 80 (Sl_G1-460410949.pro) ile temsil edilen 193 ilâ 235 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 81 (Rc_GI-255582236.pr0) ile temsil edilen 187 ilâ 229 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 82 (Pt_GI-224059640.pr0) ile temsil edilen 150 ilâ 192 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 83 (Gm_GI-356548935.pr0) ile temsil edilen 194 ilâ 236 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 84 (Gm_Gl-356544176.pro) ile temsil edilen 194 ilâ 236 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 85 (Vv_GI- 359487286.pro) ile temsil edilen 194 ilâ 236 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 86 (Tc_GI-508704801.pro) ile temsil edilen 189 ilâ 231 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 87 (Pp_GI-462414664.pr0) ile temsil edilen 192 ilâ 234 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 88 (Cr_GI- 482561003.pr0) ile temsil edilen 190 ilâ 232 artiklarinin, SEKANS KOD NO.: 89 (At_GI-22331928.pro) ile temsil edilen 195 ilâ 237 artiklarinin ya da SEKANS KOD NO.: 90 ile temsil edilen 195 ilâ 237 (Sl_Gl-46037055 l pro) artiklarinin bir amino asit sekansina sahip bir EOD domainini içerebilir. Ilave uygun EOD domain sekanslari, bu patent basvurusunda tarif edilen standart sekans analizi teknikleri (örnegin Basit Modüler Mimari Arastirma Araci (SMART); EMBL Heidelberg, Almanya) kullanilarak tanimlabilir. Ekspresyonu veya aktivitesi bu patent basvurusunda tarif edildigi gibi azaltilan bir EODl polipeptidi, Tablo 45te belirtilen SEKANS KOD NO. 74 ilâ 90°dan herhangi biriyle temsil edilen bir amino asit sekansini içerebilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir EODl polipeptidi, SEKANS KOD NO.: 89 (AtEODl) veya SEKANS KOD NO.: 77 veya 78 (OSEODI) ile temsil edilen amino asit sekansini içerebilir ya da E3 ubikuitin ligazi aktivitesini durduran bu sekansin bir varyanti olabilir. SEKANS KOD NO.: 74 ilâ 90 ile temsil edilen sekanslardan herhangi birinin bir varyanti olan bir EODl polipeptidi veya baska bir referans EOD] sekansi, referans EOD] sekansina en az %20, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %80, en az %90, en az %95 veya en az %98 oraninda sekans özdesligine sahip bir amino asit sekansi içerebilir. SEKANS KOD NO.: 74 ilâ 90 ile temsil edilen sekanslardan herhangi birinin bir varyanti olan bir EOD polipeptidi, SEKANS KOD NO.: 73 ile temsil edilen sekansa sahip bir EOD domaini de içerebilir. Uygun sekanslara verilebilecek 'Örnekler yukarida belirtilmektedir. Bir EOD] polipeptidi kodlayan bir nükleik asit XM_002299911.1 GI:224059639 (PtEODl); XM_002531864. 1 GI:255582235 (RcEODl); XM_002279758.2 (31359487285 (VVEOD1); XM_003542806.1 GI:356548934 (GmEODla); XM_003540482.1 GI:356544175 (GmEOle); XM_002468372.] GI:242042044 (SbEODl); NM_001147247.1 GI:226496788 (ZmEODl) veya NP_001030922.1 GI: 79316205°ten (AtEOD1; At3g63530) olusan gruptan seçilmis bir veritabani girisinde belirtilen bir nükleotid sekansini içerebilir ya da bu sekanslardan birinin varyanti olabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir EODl polipeptidi kodlayan bir nükleik asit, AtEODl veya OsEODl kodlayan nükleotid sekansini içerebilir ya da bu sekanslarin EODl aktivitesine sahip bir polipeptidi kodlayan herhangi birinin bir varyanti olabilir. Ekspresyonu veya aktivitesi bu patent basvurusunda tarif edildigi gibi azaltilan EODl polipeptidleri ve kodlayan nükleik asitler ilgili herhangi bir bitki türünde, 'Özellikle de bugday, arpa, misir, pirinç ve diger zirai bitkiler gibi bir tahil bitkisinde rutin sekans analizi teknikleri kullanilarak kolayca tanimlanabilir. Bu patent basvurusunda, ayrica, bitkilerdeki DA2 mutasyonunun, DAl ve EODl mutasyonlarindan olusan kombinasyonlarin bitkilerin veriinle iliskili 'Özellikleri üzerindeki etkisini sinerjik olarak artirdigi da gösterilinektedir. Bu patent basvurusunda tarif edilen yöntemler belirli bitki türleriyle sinirli degildirler ve ayrica, DA2, DAl veya DAl ve EODl ekspresyonu veya aktivitesi herhangi bir ilgili bitki türünde, bu patent basvurusunda tarif edildigi sekilde azaltilabilir. Ilgili bir bitki türünde bulunan bir DAl, DA2 veya EODl polipeptidi bu patent basvurusunda belirtilen bir ilgili DAl, DA2 veya EODl referans amino asit sekansinin bir varyanti olan bir amino asit sekansina sahip olabilir. Bu patent basvurusunda belirtilen bir referans sekansin bir varyanti olan bir DAl, DA2 veya EODl polipeptidi, referans sekansa en az %20, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %80, en az %90, en az %95 veya en az %98 sekans özdesligine sahip bir amino asit sekansi içerebilir. Bir bitki türünde bulunan belirli ainino asit sekansi varyantlari, l amino asit, 2, 3, 4, 5-10, 10-20 20-30, 30-50 veya 50°den fazla amino asit insersiyonu, adisyonu, sübstitüsyonu veya delesyonuyla bu patent basvurusunda belirtilen bir referans sekanstan farkli olabilirler. Ilgili bir bitki türünde bulunan bir DAl, DA2 veya EODl nükleik asidi, bu patent basvurusunda belirtilen bir ilgili DAl, DA2 veya EODI referans nükleotid sekansinin bir varyanti olan bir nükleotid sekansina sahip olabilir. Örnegin, varyant nükleotid sekansi, bu patent basvurusunda belirtilen bir referans DA `1 , DA2 veya EODl sekansinin bir homologu veya alleli olabilir ve ayrica, nükleik asitte bulunan bir veya daha fazla nükleotidin, örnegin 2, 3, 4, 5-10, 10-20 20-30, 30-50 veya 50"den fazla gibi bir veya daha fazla adisyonu, insersiyonu, delesyonu veya sübstitüsyonuyla referans DAl, DA2 veya EODl nükleotid sekansindan farkli olabilir ve bu da, kodlanan polipeptidde bir veya daha fazla amino asit adisyonuna, insersiyonuna, delesyonuna veya sübstitüsyonuna yol açabilir. Elbette, nükleik asitte gerçeklesen ve kodlanan amino asit sekansinda hiçbir farkliliga sebep olinayan degisiklikler de bu patent basvurusunun kapsamina dahildir. Bir DA 1 , DA2 veya EODl kodlayan nükleik asit, referans nükleik asit sekansina en az %20 veya en az %30 oraninda sekans özdesligine, tercihen en az %40, en az %50, en az %60, en az 65%, en az %70, en az %80, en az %90, en az %95 veya en az %98 oraninda sekans özdesligine sahip bir sekans içerebilir. Sekans özdesligi yukarida açiklanmaktadir. Sekans benzerligi ve özdesligi, yaygin olarak, GAP algoritmasina (Wisconsin Package, Accelerys, San Diego ABD) referans yapilarak açiklanmaktadir. GAP, eslesme sayisini maksimuma çikaran ve bosluk sayisini minimuma indiren iki tam sekansi hizalayan Needleman and Wunsch algoritmasini kullanmaktadir. Genelde, bir bosluk oldurnia cezasinin = 12 ve bosluk genisletme cezasinin = 4 oldugu varsayilan parametreler kullanilmaktadir. GAP"in kullanilmasi tercih edilebilir, ancak örnegin genelde varsayilan parametreleri kullanan BLAST ("Altschul ve ark. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405- 410" referansindaki yöntemi kullanmaktadir), FASTA ("Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448" referansindaki yöntemi kullanmaktadir) veya Smith-Waterman algoritinasi (Smith and Watermaii (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197) veya yukaridaki "Altschul ve ark. (1990)" referansinin TBLASTN programi gibi diger algoritmalar da kullanilabilir. Özellikle de, psi-Blast algoritmasi (Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402) kullanilabilir. Sekans karsilastirmasi, bu patent basvurusunda tarif edilen ilgili sekansin tam uzunlugu üzerinden yapilabilir. Uygun varyant amino asit ve nükleotid sekanslari, ilgili herhangi bir bitki türünde standart sekans analizi teknikleri kullanilarak tanimlanabilirler. Bu patent basvurusunda belirtilen bir referans DAl, DA2 veya EODl nükleik asit sekansiiiin bir varyanti olan bir DAl, DA2 veya EODl nükleotid sekaiisi, bu nükleik asit sekansi veya onun komplemaniyla birlikte kati kosullar altinda selektif olarak hibridize edilebilirler. Kati kosullar, örnegin yaklasik %80-%90 oraninda özdes sekanslarin hibridizasyonu için 42°C sicaklikta ve 0,25M NazHPO4, pH 7,2, %6,5 SDS, %10 dekstran sülfat içinde gece boyunca hibridizasyonu ve 55°C sicaklikta 0,1X SSC, %0,1 SDS içinde bir nihai yikainayi içermektedir. Yaklasik %90°dan daha fazla oranda özdes sekanslari tespit etmek için, uygun kosullar 65°C sicaklikta ve 0,25M NazHPO4, pH 7,2, %6,5 SDS, %10 dekstran sülfat içinde gece boyunca hibridizasyonu ve 60°C sicaklikta ve 0,1X SSC, %0,1 SDS içinde bir nihai yikamayi içermektedir. Bir 5x SSPE (nihai 0,9 M NaCl, 0,05M sodyum fosfat, 0,005M EDTA pH 7,7) çözeltisi, 5X Denhardt çözeltisi, %0,5 SDS, 50°C veya 65°C sicaklikta gece boyunca kosulu, özellikle de bitki nükleik asit preparatlariyla uygun olabilecek bir alternatiftir. Gerektigi takdirde, yikama islemleri 65°C sicaklikta 0,2x SSC/%0,l SDS içinde ya da 50- 60°C sicaklikta 1x SSC/%0,1 SDS içinde yapilabilir. Bu patent basvurusunda tarif edilen nükleik asitler, kismen veya tainainen sentetik olabilirler. Özellikle de, dogada kendiliginden birlikte bulunmayan (bitisik olinayan), ligate edilmis veya baska sekilde yapay olarak birlestirilmis bu nükleik asitler, söz konusu nükleik asit sekanslarinda rekombinant olabilirler. Alternatif olarak, örnegin bir otomatik sentezleyici kullanilarak dogrudan dogruya sentezlenmis olabilirler. Bir DA2 nükleik asit ve bir DAl ve/Veya EODl nükleik asit ekspresyonu, herhangi bir uygun teknik kullanilarak bir bitkinin bir veya daha fazla hücresinde azaltilabilir veya ortadan kaldirilabilir. Bir bitkide bir DA2 polipeptidinin ve bir DAl ve/Veya EODl polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesini azaltmaya yönelik yöntemler, sektörde iyi bilinmektedirler ve asagida daha detayli tarif edilmektedirler. Bu bulusun bazi yapilarinda, aktif DA2, DAl ve/Veya EODl polipeptidinin ekspresyonu, polipeptidi kodlayan veya bu tür bir nükleik asit sekansinin ekspresyonunu regüle eden bir bitki hücresindeki nükleik asit sekansina bir mutasyon eklemek suretiyle azaltilabilir, tercihen ortadan kaldirilabilir. Bu mutasyon, DA2, DA] ve/Veya EODl polipeptidinin ekspresyonu veya fonksiyonunu sekteye ugratabilir. Uygun mutasyonlar, knock-out ve knock-down niutasyonlarini içerir. Bu bulusun bazi yapilarinda, bir mutasyon, DAl'in bir dominant negatif alleliiii üretebilir. Ardindan, bir bitki mutasyona ugratilmis hücrelerden rejeiiere edilebilirler. Nükleik asitler, bir veya daha fazla nükleotid insersiyonu veya delesyonu yoluyla mutasyona ugratilabilirler. Hedef genlerin mutagenezi, inaktivasyonu veya knockout"i için kullanilan teknikler sektörde (örnegin, bakiniz: In Vitro Mutagenesis Protocols; Methods in Molecular Biology (2nd edition) Ed Jeff Braman; Sambrook J ve ark. 2012. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition) CSH Press; Current Protocols in Molecular Biology; Ed Ausubel ve ark. (2013) Wiley) iyi bilinmektedir. Bu bulusun bazi yapilarinda, genom editleme teknikleri, örnegin RNA kilavuzlu nükleaz teknikleri, örnegin CRISPR, Çinko-parmak nükleazlari (ZFN"ler) ve transaktivatör benzeri effektör nükleazlari (TALEN°ler) kullanilarak bir hedef EODl, DA2 veya DAl genine mutasyonlar ekleiiebilir (Urnov, FD. ve ark. Nature reviews. Genetics 11, 636-646 (2010); Jourig, J .K. ve ark. Nature reviews. Molecular cell biology 14, 49-55 (2013); Gasiunas, G. ve ark. PNAS USA 109, E2579-2586 (2012); Cong, L. ve ark. Science 339, 819-823 (2013)). Ekspresyonu veya aktiviteyi düsüren sekans mutasyonlari, vahsi tip nükleotid sekansina kiyasla bir veya daha fazla nükleotidin bir delesyonunu, insersiyonunu veya sübstitüsyonunu; bir gen amplifikasyonunu ya da metilasyonun artmasi veya azalmasini, örnegin hiperinetilasyonu içerebilir. Bir veya daha fazla mutasyon, nükleik asit sekansinin kodlama yapan veya yapmayan bir bölgesinde olabilir. Komponenti kodlayan genin kodlama bölgesindeki mutasyonlar, tam boy aktif proteinin translasyonunu, yani trunkatlayici proteinleri önleyebilirler ya da tam boy, ancak inaktif veya bozulinus fonksiyonlu proteinlerin translasyonuna, yani mis-sens mutasyonlarina izin verebilirler. Örnegin bir regüle edici elemanda bulunan koinponenti kodlayan genin kodlama yapinayan bölgelerinde yer alan, örnegin metilasyon gibi mutasyonlar veya epigenetik degisikliker, gen transkripsiyonunu önleyebilirler. Bir veya daha fazla sekans mutasyonu içeren bir nükleik asit, aktiviteyi azaltan veya ortadan kaldiran bir varyant polipeptidi kodlayabilecegi gibi, örnegin bir regüle edici elemanin degistirilmis aktivitesi yoluyla hücre bünyesinde az miktarda ekspresyon olan veya hiç ekspresyon olinayan bir vahsi tip polipeptid kodlayabilir. Bir veya daha fazla sekans mutasyonu içeren bir nükleik asit, mutasyona ugratilmamis sekanstan bir, iki, üç, dört veya daha fazla mutasyona sahip olabilir. Örnegin, SEKANS KOD NO.: 89 ile temsil edilen 44. pozisyona tekabül eden bir pozisyonda, örnegin bir delesyon, insersiyon veya sübstitüsyon gibi bir mutasyoii, örnegin bir A ilâ T sübstitüsyonu eklemek suretiyle EODl aktivitesi azaltilabilir, tercihen ortadan kaldirilabilir. Bir EODl polipeptid sekansinda bulunan ve SEKANS KOD NO.: 89 ile temsil edilen 44. pozisyona esdeger olan bir pozisyon, Tablo 4°te gösterilen standart sekans analizi ve hizalama araçlari kullanilarak tanimlanabilir. DAZ, DAl ve EODl kodlama sekanslari, ilgili herhangi bir bitki türünde standart sekans analizi teknikleri kullanilarak, örnegin bu patent basvurusunda belirtilen referans sekanslarla karsilastirma yapilarak tanimlanabilirler. Sektörde bilgi ve beceri sahibi kisiler bir aktif DA2, DAl ve/Veya EODl polipeptidi ekspresyonunu ortadan kaldirmak için uygun mutasyoiilari kolayca anlayacaklardir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir dominant negatif DA] polipeptidi eksprese eden ve istege bagli olarak i) bir EODl supresör nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asidi ya da ii) EOD] ekspresyonu veya aktivitesini azaltan bir mutasyoiiu içeren bir bitki hücresine DA2 ekspresyonu veya aktivitesini azaltan veya ortadan kaldiran bir mutasyoii eklenebilir. Bu bulusuii bazi yapilarinda, söz konusu bitkinin hücreleri içerisinde bir supresör iiükleik asit, örnegin bir supresör RNA veya RNAi molekülü kodlayan veya traiiskribe eden bir heterolog nükleik asit eksprese etmek suretiyle bir bitki hücresinde gerçeklesen bir DAl, DAZ ve/veya EODl polipeptidi ekspresyonu azaltilabilir. Supresör RNA, bitki hücrelerinde kendi hedef polipeptidinin (yani DAl, DA2 veya EODl) ekspresyonunu baskilamaktadir. Bu patent basvurusunda tarif edilen nükleik asitler, kismen veya tamamen sentetik olabilirler. Özellikle de, dogada kendiliginden birlikte bulunmayan (bitisik olmayan), ligate edilmis veya baska sekilde yapay olarak birlestirilmis bu nükleik asitler, söz konusu nükleik asit sekanslarinda rekombinant olabilirler. Alternatif olarak, örnegin bir otoinatik sentezleyici kullanilarak dogrudan dogruya sentezlenmis olabilirler. Elbette nükleik asit çift veya tek iplikçikli, cDNA veya genomik DNA ya da RNA olabilir. Nükleik asit, tasarimina bagli olarak kismen veya tamamen sentetik olabilir. Dogal olarak, sektörde bilgi ve beceri sahibi kisi, nükleik asit RNA içerdiginde, gösterilen sekansa yapilan referansin, U ile ikame edilen T ile birlikte RNA esdegerine referans olarak yorumlanmasi gerektigini anlayacaktir. "Heterolog" terimi, söz konusu nükleotidlerin genlerinin/sekanslarinin veya söz konusu geni/sekansi regüle eden bir sekansin, bitkinin bahsi geçen hücrelerine veya onlarin bir öncülüne genetik mühendislik araçlari veya rekombinant araçlar kullanilarak, yani insan müdahalesiyle eklendigini göstermektedir. Bir bitki hücresine heterolog olan nükleotid sekanslari 0 tip, varyete veya türde dogada kendiliginden olusmayabilirler (yani eksojen veya yabanci olabilirler) ya da hücrelerin alt-selüler veya genomik ortaminda kendiliginden olusinayan sekanslar olabilirler ya da hücrelerde kendiliginden olusmayan, yani dogal olmayan bir regüle edici unsura operabl bagli sekanslar olabilirler. Bitki hücrelerinde bulunan bir hedef polipeptidin ekspresyonunun baskilaninasi sektörde iyi bilinmektedir. Uygun bir supresör nükleik asit, hedef genin ekspresyonuiiu azaltinak amaciyla, DAl, DA2 ve/Veya EODl genine kiyasla, antisens veya sens yönünde veya her iki yönde sokulan hedef DAl, DA2 ve/Veya EODl geninin hepsi veya bir kisminin bir k0pyasi olabilir. Örnegin, "van der Krol ve ark., (1990) The Plant Cell 2, 291-299; Napoli ve ark., (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang ve ark., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588 ve US-A-5,231,020" referanslarina bakiniz. Bu yaklasima iliskin ilave gelistirmeler WO95/34668 (Biosource) sayili patent basvurusunda ve "Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16, 123675- 3684 ve Voinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: pg 553" referanslarina bulunabilir. Bu bulusun bazi yapilarinda, supresör nükleik asit, DAl, DA2 ve/veya EODl polipeptidi ekspresyonunun bir sens supresörü olabilir. Uygun bir sens supresör nükleik asit, bir çift iplikçikli RNA olabilir (Fire A. ve ark. Nature, Vol 391, (1998)). dsRNA aracili susturma, gene özgüdür ve genelde RNA interferansi olarak adlandirilir (RNAi). RNAi, iki basamakli bir prosestir. Ilk olarak, 5' terminal fosfat ve 3' kisa çikintilarla (~2nt) yaklasik 21-23nt uzunlukta kisa müdahaleci RNA°lar (siRNA"lar) elde etmek amaciyla, dsRNA hücre içerisinde klevajlanir. siRNA°lar ilgili mRNA sekansini spesifik olarak tahrip etmek için hedef alirlar (Zamore PD. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001). siRNA°lar (bazen mikroRNA°lar olarak da adlandirilirlar), komplementer RNA°lara baglanmak ve proteinin içine mRNA eliminasyonu (RNAi) tetiklemek ya da mRNA translasyonu areste etmek suretiyle gen ekspresyonunu asagi regüle ederler. siRNA, uzun çift iplikçikli RNA"lardan proseslenerek türetilebilirler ve dogada bulunduklarinda, tipik olarak eksojen kaynaklidirlar. Kisa firketelerin proseslenmesiyle türetilen mikro-müdahaleci RNA"lar (miRNA), protein kodlamasi yapmayan küçük RNA"1ar tarafindan endojen olarak kodlanirlar. Hem siRNA hem de miRNA, kismen komplenienter hedef sekanslarini barindiran mRNA'larin translasyonunu RNA klevaji olmadan inhibe edebilir ve tam komplementer sekanslari barindiran mRNA"lari degrade edebilirler. Dolayisiyla, mevcut bulus, RNAi sekanslarinin, DAl, DA2 ve/Veya EODl polipeptidinin ekspresyonunu baskilamak amaciyla DAl, DA2 ve/Veya EODl nükleik asit sekansina dayanan bir kullanimini sunmaktadir. Örnegin, bir RNAI sekansi, bu patent basvurusunda belirtilen bir referans DA2, DA] veya EODl nükleotid sekansinin bir fragmanina tekabül edebilir ya da onlarin bir varyanti olabilir. siRNA moleküller, tipik olara çift iplikçiklidirler ve bir hedef gen fonksiyonunun RNA aracili asagi regülasyonunun etkinligini optimize etmek amaciyla, siRNA molekülünün boy ve sekansinin, mRNA hedefinin siRNA ile taninmasina aracilik eden RISC kompleksiyle dogru siRNA taninmasini ve böylece siRNA"nin bir konakçi cevabini azaltacak kadar kisa olmasini saglayacak sekilde seçilmesi tercih edilmektedir. miRNA ligandlari, tipik olarak tek iplikçiklidirler ve ligandlarin bir firkete olusturmasina olanak taniyan, kisinen komplementer bölgelere sahiptirler. miRNA7lar, DNA'dan transkribe edilen, ancak proteine transle edilmeyen RNA sekanslaridirlar. Bir miRNA kodlayan bir DNA sekansi, miRNA7dan daha uzundur. Bu DNA sekansi, miRNA sekansini ve bir yaklasik ters komplemani içermektedir. Bu DNA sekansi bir tek iplikçikli RNA molekülü içine transkribe edildiginde, miRNA sekansi ve onun ters-komplemani kismen çift iplikçikli bir RNA segmenti için çift olustururlar. microRNA sekanslarinin tasarimlari, "John ve ark., PLoS Biology, ll(2), 1862-1879, 2004" referansinda tartisilmaktadir. Tipik olarak, siRNA veya miRNA"nin etkilerini taklit etmesi hedeflenen RNA molekülleri, 10 ve 40 arasinda ribonükleotide (veya oiilarin sentetik analoglarina), daha tercihen 17 ve 30 arasinda ribonükleotide, daha tercihen 19 ve 25 arasinda ribonükleotide ve en çok tercihen 21 ve 23 arasinda ribon'ûkleotide sahiptirler. Bu bulusun çift iplikçikli siRNA kullanilan bazi yapilarinda, bu molekül, ömegin bir veya iki (ribo)nükleotidin simetrik 3' çikintilarina, tipik olarak deT 3' çikintisiiiin bir UU'suna sahip olabilir. Bu patent basvurusunda sunulan açiklama esasinda, sektörde bilgi ve beceri sahibi bir kisi, örnegin siRNA bulucu (Ambion) gibi kaynaklari kullanarak uygun siRNA ve miRNA sekanslarini kolayca tasarlayabilir. siRNA ve miRNA sekanslari, gen asagi regülasyonuna sebep olmak için sentetik olarak üretilip eksojen olarak ekleiiebilecekleri gibi, ekspresyon sistemleri (örnegin vektörler) kullanilarak da üretilebilirler. Bu bulusun tercih edilen bir yapisinda, siRNA, sentetik olarak sentezlenmektedir. Daha uzun çift iplikçikli RNA"lar, siRNA°lar üretmek için hücre içerisinde proseslenebilirler (örnegin, bakiniz: Myers (2003) Nature Biotechnology 21 :324-328). Daha uzun dsRNA molekülü, Örnegin bir veya iki (ribo) nükleotidin simetrik 3' veya 5' çikintilarina ya da küt uçlara sahip olabilirler. Daha uzun dsRNA molekülleri, 25 nükleotid veya daha uzun olabilirler. Tercihen, daha uzun dsRNA molekülleri ve 30 arasi nükleotid uzunlugundadirlar. Daha tercihen, daha uzun dsRNA molekülleri 25 ve 27 arasinda nükleotid uzunlugundadirlar. En çok tercihen, daha uzun dsRNA molekülleri 27 nükleotid uzunlugundadirlar. 30 veya daha fazla nükleotid uzunlugunda olan dsRNA"lar, vektör pDECAP kullanilarak eksprese edilebilirler (Shinagawa ve ark., Genes and Dev., 17, 1340-5, 2003). Hücredeki bir kisa firkete RNA inolekülünün (shRNA) ekspresyonu baika bir alternatiftir. shRNA"lar, sentetik siRNA'lardan daha uygundurlar. Bir shRNA, küçük bir ilmik sekansiyla bölünen kisa ters çevrilmis tekrarlardan olusur. Bir ters çevrilmis tekrar, gen hedefine komplementerdir. Hücre içerisinde, shRNA, DICER tarafindan hedef genin mRNA"sini degrade eden ve ekspresyonu baskilayan bir siRNA içerisine proseslenir. Bu bulusun tercih edilen bir yapisinda, shRNA, bir vektörden transkripsiyon yoluyla (bir hücre içerisinde) endojen olarak üretilmektedir. shRNA"lar, `Örnegin insan Hl veya 7SK promotoru veya bir RNA polimeraz II proinotoru gibi bir RNA polimeraz III promotorunun kontrolü altinda bir hücrenin shRNA sekansini kodlayan bir vektörle transfekte edilmesi suretiyle o hücre içerisinde üretilebilirler. Alternatif olarak, shRNA, bir vektörden transkripsiyon yoluyla eksojen olarak sentezlenebilir (in vitro). Ardindan, shRNA, hücrenin içerisine dogrudan dogruya eklenebilir. Tercihen, shRNA inolekülü, DAl, DA2 ve/veya EODl°in bir kisini sekansini içerir. Örnegin, shRNA sekansi 40 ve 100 arasi baz uzulugundadir, daha tercihen 40 ve 70 arasi baz uzunlugundadir. Firketenin gövdesi, tercihen 19 ve 30 arasi baz çifti uzunlugundadir. Bu gövde, firkete yapisini stabilize etmek içiii G-U eslemeleri içerebilir. siRNA molekülleri, daha uzun dsRNA inolekülleri veya miRNA molekülleri, bir nükleik asit sekansi transkripsiyonuyla rekombinant olarak yapilabilir, tercihen bir vektör bünyesinde bulunabilir. Tercihen, siRNA inolekülü, daha uzun dsRNA molekülü veya miRNA molekülü, bu patent basvurusunda belirtilen bir referans DA2, DA] veya EODl nükleotid sekansinin bir kismi sekansini ya da onlarin bir varyantini içermektedir. Bu bulusun diger yapilarinda, supresör nükleik asit, DAl, DA2 ve/veya EODl polipeptid ekSpresyonunun birbir anti-sens supresörü Olabilir. Anti-sens sekanslari gen ekspresyoiiunu asagi regüle etmek için kullanildiklarinda, bir nükleotid sekansi bir "ters yönde" bir proinotorun kontrolü altina alinir ve böylece, transkripsiyon, hedef genin "sens" iplikçikliginden transkribe edilmis normal mRNA"ya kompleinenter RNA verir. Örnegin, "Rothstein ve ark., 1987; Smith ve ark., (1988) Nature 334, 724-726; Zhaiig ve ark., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, English ve ark., (1996) The Plant Cell hücresi 8, 179-188" referanslarina bakiniz. Antiseiis teknolojisi "Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149 ve Flavell (1994) PNAS USA 91, 3490-3496" referanslarinda da gözden geçirilmektedir. Bir anti-sens supres'or nükleik asit, bu patent basvurusunda belirtilen bir referans DA2, DAl veya EODl nükleotid sekansin bir fragmani olan bir nükleotid sekansinin en az 10 nükleotidinden olusan bir anti- sens sekansindan olusabilir ya da onlarin bir varyanti olabilir. Bir hedef sekans ekspresyonunun asagi regülasyonu için kullanilan sekansta ve hedef sekansta tam sekans özdesligi olmasi tercih edilebilir; bununla birlikte, toplam sekans tamamlayiciligi veya benzerligi sart degildir. Bir veya daha fazla nükleotid, hedef genden kullanilan sekansta farklilik gösterebilir. Dolayisiyla, mevcut bulusa uygun olarak bir gen ekspresyonu asagi regülasyonunda kullanilan bir sekans, kullanilabilir olanlar arasindan seçilmis bir vahsi tip sekans (örnegin gen) ya da bu tür bir sekansin varyanti olabilir. Sekansin bir açik okuma çerçevesi içermesi ya da transle edilebilir bir RNA"yi açikça belirtmesi gerekmez. Ilgili anti-sens ve sens RNA molekülleri için hibridize etmeye yeterli miktarda homoloji olmasi tercih edilebilir. Kullanilan sekans ve hedef gen arasinda yaklasik %5, %10, %15 veya %20 oraninda veya daha fazla uyumsuzluk oldugunda bile gen ekspresyonu asagi regülasyonu olabilir. Homolojinin gerçeklesecek gen ekspresyonu asagi regülasyonu için yeterli olmasi etkili olacaktir. Bir supresör RNA molekülü; DA2, DAl ve/veya EODl polipeptidini kodlayan bir nükleik asit sekaiisinin sens veya anti-sens iplikçiginin -40 nükleotidini içerebilir. Supresör nükleik asitler, heterolog promotorlara, örnegin dokuya özgü veya indüklenebilir promotorlara operabl bagli olabilirler. Örnegin, nihai tohum büyüklügünü artirmak amaciyla, gelismekte olan ovül ve tohumlarda bulunan iki veya daha fazla DAl, DA2 ve/Veya EODl nükleik asidi spesifik olarak asagi regüle etmek için integuinent ve tohum spesifik promotorlar kullanilabilirler. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bir dominant negatif DAl polipeptidi kodlayan bir nükleik aside ve istege bagli olarak, bir EODl supresör nükleik aside sahip olan bir bitki hücresinde DA2 supresör nükleik asit eksprese edilebilir. Supres'or nükleik asit ve/veya bir dominant negatif DA] polipeptidi kodlayan nükleik asit, bir veya daha fazla vektörde bulunabilir. Bu patent basvurusunda tarif edilen supresör nükleik asit(ler)i ve/veya dominant negatif DAl polipeptidini kodlayan nükleik asit, yukarida tarif edildigi üzere, bir heterolog regüle edici sekansa, örnegin bir konstitütif, indüklenebilir, doku spesifik veya gelisimsel spesifik proinotor gibi bir promotora operabl bagli olabilir. Bu patent basvurusunda tarif edilen supres'or nükleik asit(lar)i ve/veya dominant negatif DAl polipeptidlerini kodlayan nükleik asit, bir nükleik asit yapisi veya vektörü üzerinde bulunabilir. Bu yapi veya vektör, tercihen bir bitki hücresine transformasyon ve/veya o hücre içerisinde ekspresyon için uygundur. Bir vektör, digerlerinin yani sira, kendi kendine aktarilabilir veya mobilize edilebilir olabilen veya olmayabilen ve ayrica, selüler genoma entegrasyon yoluyla ya da ekstrakromazomal olarak (örnegin bir replikasyon orijinine sahip, otonom replike olan plazmid) mevcut olinak suretiyle prokaryotik veya ökaryotik konakçiyi, özellikle de bir bitki konakçiyi transforme edebilen çift veya tek iplikçikli dogrusal veya dairesel formda herhangi bir plazmid, kozmid, faj veya Agrobacterium ikili vektörü olabilir. Spesifik olarak, Actinomyces ve ilgili türlerden, bakterilerden ve ökaryötik (örnegin damarli bitki, memeli, maya veya mantar) hücrelerinden seçilebilen iki farkli organizinada dogal veya kasitli olarak replike olabilen bir DNA vehikülünü ifade eden mekik vektörler de dâhildir. Yukarida tarif edilen nükleik asidi içeren bir yapi veya vektörün, özellikle de bu vektör genoma rekombinasyon için bu nükleik asidi hücrelere eklemek kullanilacaksa, bir promotor veya baska bir regüle edici sekans içermesi gerekmez. Yapilar ve vektörler; kanamisin, higromisin, fosfinotrisin, klorsülfüron, inetotreksat, gentamisin, spektinomisin, imidazolinonlar, glifosat ve d-amino asitleri gibi antibiyotiklere karsi direnç gibi seçilebilir fenotipler sunan genlerden olusan seçilebilir genetik niarkerler de içerebilirler. Sektörde bilgi ve beceri sahibi kisiler, örnegin bir mikrobiyal hücrede veya bitki hücresinde vektörler insa edebilir ve rekombinant gen ekspresyonu için protokoller tasarlayabilirler. Promotor sekanslari, terminat'or fragmanlar, poliadenilasyon sekanslari, artirici sekanslar, marker genleri ve uygun diger sekanslar da dâhil olinak üzere, uygun regüle edici sekanslari içeren uygun vektörler seçilebilir veya insa edilebilir. Daha detayli bilgiler için, Örnegin "Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sainbrook ve ark., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press andProtocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel ve ark. eds. John Wiley & Sons, 1992" referanslarina bakiniz. Bitkiler üzerinde daha önce büyük basariyla kullanilan spesifik prosedür ve vektörler "by Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721), and Guerineau and Mullineaux, (1993) Plant transformation and expression vektörs. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121- 148" referanslarinda tarif edilmektedir. Bir hücreye seçilmis bir gen yapisi eklerken sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerin iyi bildikleri belirli bazi mülahazalar göz önünde bulundurulmak zorundadir. Sokulacak nükleik asit, transkripsiyonu yönlendirecek etkili regüle edici elemanlar içeren bir yapi içerisinde birlestirilinelidir. Yapiyi hücre içine tasiyacak bir yöntem olmalidir. Bu yapi hücre meinbrani içerisine tasindiktan sonra, endojen kromozoma] malzemeye entegrasyon gerçeklesecek veya gerçeklesmeyecektir. Son olarak, hedef hücre tipi, tercihen bitkilerin tamamina re jenere edilen hücrelerdir. Supresör nükleik asidi veya dominant negatif DAl polipeptidini kodlayan nükleik asit ekspresyonunu artiran bir yapi ve transformasyon kullanilmasi tercih edilmektedir. Genin tek bir kopyasinin bitki hücresinin genomuna entegre edilmesi fen susturma etkilerini en aza indirmek için faydali olabilir. Benzer sekilde, entegrasyon karmasikliginin kontrol edilmesi bu açidan faydali olabilir. Örnegin EPl407000Bl sayili EP Patentine göre bir ininimal gen ekspresyon yapisi kullanan bitki hücrelerinin transformasyonu bu açidan özellikle önemlidir. Bu patent basvurusunda tarif edilen özelliklere sahip transgenik bitkiler üretmek amaciyla bitki hücrelerine nükleik asit yapilari ve vektörler eklemek için sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerin iyi bildikleri teknikler kullanilabilir. Agrobakteri transformasyonu, sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerin bitki türlerini transforme etmek için yaygin kullandiklari yöntemlerden biridir. Uygun, verimli transgenik bitkilerin üretimi, su an sektörde gerçeklestirilen rutin bir islemdir (örnegin "Toriyama, ve ark. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang, ve ark. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang, ve ark. (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, ve ark. (1989) Nature 338, 274-276; Datta, ve ark. (1990) Bio/Technology 8, 736-740; Christou, ve ark. (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, ve ark. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao, ve ark. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li, ve ark. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, ve ark. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871- 884; Fromm, ve ark. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon- Kamm, ve ark. (1990) Plant Cell 2, 603-618; D'Halluin, ve ark. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505;Walters, ve ark. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel, ve ark. (1993) Biotechnology 11, 194- 200; Vasil, 1. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks, ve ark. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers, ve ark. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; WO92/l4828; Nilsson, O. ve ark. (1992) Transgenic Research 1, 209-220" referanslarina bakiniz). Agrobakteri transformasyonunun verimsiz veya etkisiz oldugu durumlarda, örnegin bazi gimnosperm türlerinde, mikroprojektil veya partikül bombardimani (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616), elektroporasyon (EP 290395, WO 8706614), mikroenjeksiyon (WO 92/09696,WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green ve ark. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), dogrudan dogruya DNA alimi (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), lipozom aracili DNA alimi (örnegin Freeman ve ark. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)) veya V0rteks1eme yöntemi (örnegin Kindle, PNAS ABD 87: 1228 (1990d)) gibi diger yöntemler tercih edilebilir. Bitki hücrelerinin transformasyonu için kullanilan fiziksel yöntemler "Oard, 1991, Biotech. AdV. 9: 1-11" referansinda gözden geçirilinektedir. Alternatif olarak, transforinasyon prosesinin etkinligini artirmak için, örnegin Agrobakteri kapli mikropartiküllerle bombardiinan (EP-A- 486234) gibi ya da Agrobakteriyle es-kültivasyonu takiben yaralanina indüklemek için mikroprojektil bombardiinani (EP-A-486233) gibi farkli tekniklerden olusan bir kombinasyon kullanilabilir. Transformasyonu takiben, sektörde de standart oldugu üzere, örnegin tek hücrelerden, kallus dokusundan veya yaprak disklerinden bir bitki rejenere edilebilir. Bitkilerin hücrelerinden, dokularindan ve organlarindan hemen hemen her türlü bitki tamamen rejenere edilebilir. Kullanima hazir teknikler "Vasil ve ark., Cell Culture and Soinatic Cell Genetics of Plants, Vol 1, 11 and 111, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984 ve Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989" referanslarinda gözden geçirilmektedir. Hem belirli bitki türlerini transforme etme etkinligine, hem de bu bulusu seçtigi belirli bir metodolojiyle uygulayan kisinin deneyimi ve tercihine göre belirli bir transformasyon teknolojisi seçenegi belirlenecektir. Sektörde bilgi ve beceri sahibi kisiler, nükleik asidi bitki hücrelerine eklemek için seçilen belirli bir transformasyon sisteminin, ne bulus açisindan, ne de bitki rejenerasyonu için seçilen teknik açisindan bir gereklilik veya bir sinirlama oldugunu anlayacaktirlar. Transformasyonu takiben, DA2 ekspresyonu azaltilmis ve ayrica, DAl veya DAl ve EODl ekspresyonu veya aktivitesi azaltilmis bir bitki hücresi tanimlanabilir ve/veya seçilebilir. Bitki hücresinden bir bitki re jenere edilebilir. Yukarida tarif edildigi gibi, DA2 aktivitesi veya ekspresyonu azaltilmis ve ayrica, DAl ya da hem DAl hem de EODl ekspresyonu veya aktivitesi eksik bir bitki, ürün veya onun soyundan gelen bitkiler üretmek için eseyli çogaltilabilir veya büyütülebilir. Bir veya daha fazla hücreden rejenere edilmis bitkinin ürünü veya onun soyundan gelenler, eseyli çogaltilmis veya büyütülmüs olabilirler. DAl, DA2 ve/veya EODl amino asit ya da nükleik asit sekansi, bir bitkide bir veya daha fazla DAl, DA2 ve/veya EODl polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesini, o bitki yukarida belirtildigi gibi 58 büyütülmeden veya eseyli çogaltilmadan önce, bu islemler sirasinda veya sonrasinda tespit etmek için bir moleküler inarker olarak kullanilabilir. Bir yöntem asagidakileri içerebilir: bitkilerden olusan bir popülasyon saglanmasi, bu popülasyonda yer alan bir veya daha fazla bitkide bir DAl, DA2 ve/Veya EODl polipeptidinin ekSpresyon miktarinin belirlenmesi ve bu popülasyonda, DAl, DA2 ve/Veya EOD] polipeptidi ekspresyonu söz konusu popülasyonun diger üyelerine göre azaltilmis bir veya daha fazla bitki belirlenmesi. Bitkilerden olusan popülasyon, yukarida tarif edildigi gibi üretilebilir. Bu bulusun bazi yapilarinda, bir yöntem asagidakileri içerebilir: progeni bitkilerden olusan bir popülasyon üretmek içiii bir birinci ve bir ikinci bitkinin melezlenmesi; popülasyonda yer alan progeni bitkilerde bir veya daha fazla DAl, DA2 ve EODl polipeptidinin ekspresyonunun tespit edilmesi ve bu popülasyonda, DAl, DA2 ve/Veya EODl polipeptidi ekspresyonu kontrollere kiyasla azaltilmis bir progeni bitkinin tespit edilmesi. Birinci ve ikinci bitkilerin biri veya ikisi, yukarida tarif edildigi gibi üretilebilir. DA2 ve DAl ve/Veya EODI polipeptidi ekspresyonu kontrollere (Örnegin popülasyonun diger üyeleri) kiyasla azaltilmis bir progeni bitkide, kontrollere nazaran tohum ve/Veya organ büyüklügünün arttigi görülebilir ve bu bitki daha yüksek bitki verimine sahip olabilir. Bu bulusun bazi yapilarinda, bir DA2 polipeptidi ekspresyonu veya aktivitesi yukarida tarif edildigi gibi azaltilabilen ve DAl ve/Veya EODl eksikligi olan bir bitki veya bitki hücresini taniinlamak amaciyla, bir bitkide bulunan bir veya daha fazla DAl ve/Veya EODl polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesini teSpit etmek için DA] ve EODl amino asit veya nükleik asit sekanslari bir moleküler marker olarak kullanilabilirler. Bir yöntem asagidakileri içerebilir: bitkilerden olusan bir popülasyon saglanmasi, bu popülasyonda yer alan bir veya daha fazla bitkide bir DAl ve/Veya EODl polipeptidinin ekspresyon miktarinin belirlenmesi ve bu popülasyonda, DAl ye/veya EODl polipeptidi ekspresyonu söz konusu popülasyonun diger üyelerine göre azaltilmis bir veya daha fazla bitki belirlenmesi. Belirlenen bitkilerde, DA2 ekspresyonu veya aktivitesi yukarida tarif edilen yöntemlere göre azaltilabilir. Bir bitki veya progeni bitki, i) 0 bitkinin bir veya daha fazla hücresinde bulunan DAl, DA2 ve/veya EODl polipeptidi miktarini ölçmek; ii) o bitkinin bir veya daha fazla hücresinde bulunan DAl, DA2 ve/Veya EODl mRNA miktarini ölçmek ya da iii) o bitkinin bir veya daha fazla hücresinde DAl, DA2 ve/Veya EODl polipeptidi kodlayan nükleik asidi sekanslainak ve bir veya daha fazla inutasyon mevcudiyetinde tanimlamak suretiyle belirlenebilir. Bu bulusun bazi yapilarinda, DAl, DA2 ve/Veya EODl ekspresyonu miktari protein seviyesinde tespit edilebilir. Bir yöntem asagidakileri içerebilir: bitkilerden olusan bir popülasyon saglanmasi, bu popülasyonda yer alan bir veya daha fazla bitkide DA 1 , DA2 ve/Veya EODl polipeptidi miktarinin belirlenmesi ve bu popülasyonda, bir DAl , DA2 ve/Veya EODl polipeptidi miktari söz konusu popülasyonun diger üyelerine göre azaltilinis bir veya daha fazla bitki belirlenmesi. Bitkide DAl, DA2 veya EODl polipeptidine baglanan ve diger antijenlere az miktarda baglanan veya hiç baglanmayan antikorlar kullanilarak, 'Örnegin Western blotlama gibi immünolojik teknikler kullanilabilinesi uygundur. Örnegin, bir bitki hücresinde bulunan bir DAl, DA2 ve/veya EODl polipeptidinin miktari, bitki hücresini içeren bir numuneyi DAl, DA2 veya EODl polipeptidine karsi yönlendirilmis bir antikorla veya baska bir spesifik baglanma üyesiyle teinas ettirmek ve ayrica, DAl, DA2 veya EODl polipeptidinin numuneye baglanip baglanmadigini belirlemek suretiyle tespit edilebilir. Spesifik baglanma üyesine baglanma miktari, hücrede eksprese edilen DAl, DA2 veya EODl polipeptidi miktarinin göstergesidir. DA 1, DA2 ve/veya EOD] polipeptidi miktari, bitkinin bir veya daha fazla hücresinde, tercihen bitkinin topragin üzerinde kalan bir kismi veya dokusundan alinan hücrelerinde, `örnegin filizlerdeki vaskülatür ve primer ve sekonder meristemlerde tespit edilebilir. Bu bulusun diger yapilarinda, DAl, DA2 veya EODl polipeptidi ekspresyonu nükleik asit seviyesinde tespit edilebilir. Örnegin, bir DAl, DA2 veya EODl polipeptidi kodlayan nükleik asit miktari teSpit edilebilir. Verimle iliskili özellikleri artirilmis bir bitki üretme yöntemi asagidakileri içerebilir: bitkilerden olusan bir popülasyon saglanmasi, söz konusu popülasyonda yer alan bir veya daha fazla bitkinin bir hücresinde DAl, DA2 veya EODl polipeptidi kodlayan nükleik asidin, örnegin mRNA'nin seviyesinin veya miktarinin belirlenmesi ve bu p0pülasy0nda, nükleik asit kodlayan bir DAl, DA2 veya EODl miktarinin söz konusu popülasyonun diger üyelerine kiyasla azaltildigi bir veya daha fazla bitkinin tespit edilmesi. Bir bitki hücresinde nükleik asit kodlama seviyesi veya miktari, örnegin 0 hücrede transkribe edilmis kodlaina nükleik asit miktarini belirleyerek tespit edilebilir. Bu, Northern blotlaina veya RT-PCR gibi standart teknikler kullanilarak yapilabilir. Alternatif olarak, bir DAl, DA2 veya EODl polipeptidinin ekspresyon veya aktivitesini etkileyen sekans varyasyonlarinin mevcudiyeti tespit edilebilir. Büyüme ve/veya biyokütle özellikleri artmis bir bitki üretmek için kullanilan baska bir yöntem asagidakileri içerebilir: bitkilerden olusan bir popülasyon saglanmasi, söz konusu popülasyonda yer alan bir veya daha fazla bitkinin bir hücresinde bir DAl, DA2 ve/veya EODl polipeptidi kodlayan bir nükleik asit içerisinde bir veya daha fazla sekans varyasyonu, örnegin poliinorfizmler, mutasyonlar veya hipermetilasyon bölgeleri bulunup buluninadiginin belirlenmesi, burada, kodlanan DA] , DA2 ve/veya EOD] polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesini azaltan bir veya daha fazla sekans varyasyonundan bahsedilmektedir ve bu popülasyonda, DAl, DA2 ve/Veya EODl ekspresyonu veya aktivitesini söz konusu popülasyonun diger üyelerine kiyasla azaltan bir veya daha fazla sekans varyasyonuna sahip bir veya daha fazla bitki tespit edilmesi. DAl, DA2 ve/Veya EODl polipeptidler ve kodlayan nükleik asit, yukarida daha detayli tarif edilmektedir. Bir nükleik asit içerisinde bir veya daha fazla sekans varyasyonu bulunup bulunmadigi, bir veya daha fazla bitki hücresinde varyant nükleik asit sekansi olup olmadigini tespit etmek ya da nükleik asit sekansi tarafindan kodlanan varyant polipeptid olup olmadigini tespit etmek suretiyle belirlenebilir. Tercih edilen nükleik asit sekansi varyasyonu tespit teknikleri; ARMSTM-allel spesifik amplifikasyon, OLA, ALEXTM, COPS, Taqman, Molecular Beacons, RFLP ve restriksiyon yeri temelli PCR ve F RET tekniklerini içermektedir. Sektörde, bir bitki hücresinde bir DA 1, DA2 veya EOD] polipeptidini kodlayan bir nükleik asidin miktarini ya da bir DAl , DA2 veya EODl polipeptidini kodlayan bir nükleik asitte sekans varyasyonu bulunup bulunmadigini tespit etmeye yönelik birçok uygun yöntem vardir (örnegin, bakiniz: (örnegin bakiniz: Molecular Cloiiing: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook & Russell (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press NY; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel ve ark. eds. John Wiley & Soiis (1992); DNA Cloning, The Practical Approach Series (1995), series eds. D. Rickwood and B.D. Hames, IRL Press, Oxford, UK and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, ve ark. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.)). Sekans varyasyonu tespitine yönelik birçok güncel yöntem "Nollau ve ark., Clin. Chem. 43, 1114-1120, 1997" referansinda ve ayrica, örnegin "Laboratory Protocols for Mutasyon Detection", Ed. by U. Landegren, Oxford University Press, 1996 and "PCR", 2nd Edition by Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997" gibi standart ders kitaplarinda gözden geçirilmektedir. Tercih edilen polipeptid sekansi varyasyon teknikleri, örnegin ABD ve Kanada"da Stockton Press tarafindan ve Birlesik Kra111k°ta Macmillan Reference tarafindan basilan "A Practical Guide to ELISA by D M Kemeny, Pergamon Press 1991", "Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition, C P Price & D J Newman, 1997" gibi referanslarla sektörde iyi bilinen immünoeseyleri içermektedir. Bu bulusun bazi yapilarinda, nükleik asit veya onun amplifiye edilmis bir bölgesi, orada polimorfizm veya mutasyon olup olmadigini tanimlamak veya tespit etmek için sekanslanabilir. Bir polimorfizm veya mutasyon, örnegin sekans veri tabanlarinda belirtildigi gibi, elde edilen sekansi DAl, DA2 veya EODPin bilinen sekansiyla karsilastirmak suretiyle tanimlanabilir. Alternatif olarak, kontrol hücrelerinden alinan ilgili nükleik asidin sekansiyla da karsilastirilabilir. Özellikle de, fonksiyonu azaltan, ancak tamamen ortadan kaldirmayan bir veya daha fazla polimorfizm veya mutasyon olup olmadigi tespit edilebilir. Bir dizi standart teknikten herhangi biri kullanilarak sekanslaina yapilabilir. Ainplifiye edilmis bir ürünün sekanslanmasi, 'Örnegin izopropanolle çökeltmeyi, tekrar süspanse etmeyi ve bir TaqFS+ Dye terminatör sekanslama kiti (Örnegin GE Healthcare UK Ltd. ABD firmasindan) kullanarak sekanslamayi içerebilir. Uzatma ürünleri, bir AB] 377 DNA sekanslayici üzerinde elektroforeze tâbi tutulabilir ve Sequence Navigator yazilimi kullanilarak veri analizi yapilabilir. Azaltilinis bir DAl, DA2 ve/veya EODl ekspresyonuna sahip oldugu teSpit edilen bir progeni bitki, kontrollere kiyasla artmis veya iyilestirilmis verimle iliskili özellikler, örnegin artmis tohum veya organ büyüklügü açisindan test edilebilir. Tanimlanan progeni bitki, tohum büyüklügü, organ büyüklügü ve/veya bitki verimi açisindan kontrollerle kiyaslanarak test edilebilir. Bu patent basvurusunda tarif edildigi gibi üretilen bir bitkide DA2 ekspresyonu veya aktivitesi eksik olabilir ve ayrica, DAl ekspresyonu veya aktivitesi, EODl ekspresyonu veya aktivitesi ya da hem DAl hem de EODl ekspresyonu veya aktivitesi de eksik olabilir. Bitkilerde DA2, DAl ve EODl ekspresyonu veya aktivitesi, mutasyonla ya da bitkide sekans kodlayan bir veya daha fazla nükleotidle ve/Veya bir supresör nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit ekspresyonuyla azaltilabilir veya ortadan kaldirilabilir. Bu bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, bitkide DAl aktivitesi, bir dominant negatif DAl polipeptidi kodlayan bir heterolog nükleik asit ekspresyonuyla azaltilir veya ortadan kaldirilir. Dolayisiyla, bir bitki, 'Örnegin bir siRNA veya shRNA gibi bir supresör nükleik asit kodlayan ya da bir veya daha fazla DAl, DA2 ve EODl°in ekspresyonunu azaltan ya da bir dominant negatif DA] polipeptidi kodlayan heterolog nükleik asit içerebilir. Bir bitkide, mutasyonlardan, supres'or nükleik asitlerden olusan herhangi bir kombinasyon bu patent basvurusunda tarif edildigi gibi kullanilabilir. Örnegin, bir bitki i) DA2 aktivitesi veya ekspresyonunu azaltan bir mutasyon, EODl ekspresyonunu azaltan bir supresör nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit ve ayrica, bir dominant negatif DAl polipeptidi kodlayan bir nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit; ii) DA2 ekspresyonu veya aktivitesini azaltan bir supresör nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit, EODl ekspresyonunu azaltan bir mutasyon ve ayrica, bir dominant negatif DAl polipeptidi kodlayan bir nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit; iii) EODI ve DA2 ekspresyonunu azaltan supres'or nükleik asitleri kodlayan heterolog nükleik asitler ve ayrica, bir dominant negatif DAl polipeptidi kodlayan bir nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit ya da iv) EODl ve DA2 aktivitesi veya ekspresyonunu azaltan mutasyon ve ayrica, bir dominant negatif DAl polipeptidi kodlayan bir nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit içerebilir. Bu bulusun diger yapilarinda, bir bitki i) DA2 aktivitesi veya ekspresyonunu azaltan bir mutasyon ve ayrica, DAl ekspresyonunu azaltan bir supres'or nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit; ii) DA2 ekspresyonu veya aktivitesini azaltan bir supresör nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit ve ayrica, DAl ekspresyonunu azaltan bir mutasyon; iii) DAl ve DA2 ekSpresyonunu azaltan supresör nükleik asitleri kodlayan heterolog nükleik asitler; iv) DAl ve DA2 aktivitesi veya ekspresyonunu azaltan mutasyonlar ya da V) DA2 aktivitesi veya ekspresyonunu azaltan bir mutasyon veya DA2 ekspresyonunu azaltan bir supresör nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit ve ayrica, bir dominant negatif DAl polipeptidi kodlayan bir nükleik asit kodlayan bir heterolog nükleik asit içerebilir. Dominant negatif DAl polipeptidi ve/veya supresör nükleik asitleri kodlayan heterolog nükleik asitler, ayni veya farkli ekSpresyon vektörleri üzerinde olabilecekleri gibi, geleneksel teknikler kullanilarak bitki hücresinin bünyesine dâhil edilebilirler. Bu patent basvurusunda tarif edilen kullaniin için uygun bitkilere verilebilecek örnekler; tek çenekli ve çift çenekli damarli bitkileri, örnegin bir zirai bitkiyi veya tahil bitkisini, 'Örnegin Lithospermuin erythrorhizon, Taxus spp, tütün, kabakgiller, havuç, lahana, karpuz, kirinizi biber, üzüm asmasi, marul, çilek, kolza tohumu lahana, seker pancari, bugday, arpa, misir, pirinç, soya fasulyesi, bezelye, sorgum, ayçiçegi, domates, patates, biber, kasimpati, karanfil, keten, kenevir ve çavdardan olusan bir gruptan seçilmis bitkiyi içermektedir. Yukarida tarif edildigi gibi üretilen bir bitki, ürün veya o bitkinin soyundan gelen baska bir bitki üretmek için eseyli çogaltilmis veya büyütülmüs olabilir. Bir veya daha fazla hücreden rejenere edilmis bitkinin ürünü veya onun soyundan gelen baska bitkiler, eseysiz çogaltilmis veya büyütülmüs olabilirler. Bu patent basvurusunda, ayrica, bir veya daha fazla hücresinde DA2 polipeptidi eksPresyonu veya aktivitesi azaltilinis veya ortadan kaldirilmis olan bir transgenik bitki de açiklanmaktadir; burada, bu bitkide, DAl veya hem DA] hem de EODl ekspresyonu veya aktivitesi eksiktir. Bu bitki, bir veya daha fazla DA2, DAl ve EOD1"in ekspresyonu veya aktivitesini azaltan veya ortadan kaldiran bir eksojen nükleik asit içerebilir. Bu bulusun bazi yapilarinda, transgenik bitki, DAl aktivitesini azaltan bir dominant negatif DAl polipeptidi eksprese edebilir. Bu bulusun bazi yapilarinda, bu bitkinin DAl, DA2 ve EODl ekspresyonu azaltilmis veya ortadan kaldirilmis olabilir ya da DA2 ve EODl ekspresyonu azaltilmis veya ortadan kaldirilmis olabilir ve bu bitki, bir dominant negatif DAl eksprese edebilir. Bu bulus, bu patent basvurusunda tarif edilen bir yöntemle üretilmis bir bitkiye ek olarak, bu tür bir bitkinin, tohumun, kendilenmis veya hibrid progeninin ve soyundan gelenlerin herhangi bir klonunu ve ayrica, bunlardan herhangi birinin herhangi bir parçasi veya üreme yapilarini, örnegin ister eseyli ister eseysiz üreme veya çogaltmada kullanilabilecek budanmis parçalari ve tohumu içermektedir. Bu bulus, ayrica, bu tür bir bitkinin eseyli çogaltilmis bir ürünü veya klonu olan veya soyundan gelen bir bitkiyi ya da bu tür bitkinin, ürünün, klonun veya soyundan gelenin herhangi bir parçasini veya üreine yapisini içermektedir. Yukarida tarif edilen bir yöntem kullanilarak uygun bir bitki üretilebilir. Bu bitkinin verimi kontrol vahsi tip bitkilere (yani DA2 ve DA] ya da DA2, DAl ve EODl ekspresyonu veya aktivitesi azaltilmamis özdes bitkiler) kiyasla artmis olabilir. Örnegin, beher birim alan için tohum (örnegin dane) kütlesi veya diger bitki ürünleri, kontrol bitkilerine kiyasla artmis olabilir. Örnegin, bir bitkide verimle iliskili bir veya daha fazla özellik iyilestirilebilir. Verimle iliskili `Özellikler yasain süresini, organ büyüklügünü ve tohum büyüklügünü içerebilir. DA2 polipeptidiiii kodlayan nükleik asit ekspresyonunun ortadan kaldirilmadigi veya azaltilinadigi kontrol bitkileriyle (yani DA2 ve istege bagli olarak DAl ve/veya EODl ekspresyonunun azaltilmadigi veya ortadan kaldirilinadigi 'özdes bitkiler) kiyaslandiginda, Bitkide veriinle iliskili bir özellik iyilestirilebilir, artirilabilir veya gelistirilebilir. Bu patent basvurusunda, DAl,in in Vivo ortamda DA2 ile fiziksel olarak etkilesiine girdigi gösterilmektedir. Etkilesimi sekteye ugratan veya ona inüdahale eden bilesenler, tohum veya organ büyüklügünü artirma ve bitki verimini iyilestirme konusunda faydali olabilirler. Bitki verimini artiran bir bilesigi belirlemek için kullanilan bir yöntem; bir test bilesiginin bir DA2 polipeptidinin bir DA1 polipeptidine baglanmasi üzerindeki etkisini tespit etmeyi içerebilir ve baglanmanm azalmasi veya ortadan kalkmasi, o bilesigin bitki verimini artirmak için faydali olabileceginin göstergesidir. DA1 ve DA2 polipeptidleri, yukarida daha detayli tarif edilmektedirler. DA1 ve DA2 polipeptidleri, izole edilmis olabilirler ya da bir bitki hücresinde rekoinbinant veya endojen olarak eksprese edilebilirler. DA1/DA2 baglanmasini azaltan veya ortadan kaldiran bir bilesik, bitkilerin verimi artiracak sekilde isleme tâbi tutulmalarmda faydali olabilir. Bu patent basvurusunda kullanildiginda, "ve/veya" ifadesi, belirtilen iki özellik veya bilesenden her birine iliskin, digerini kapsayan veya kapsamayan spesifik bir açiklama olarak kabul edilmelidir. Örnegin "A ve/veya B" ifadesi, bu patent basvurusunda sanki her biri ayri ayri ele alinmis gibi (i) A, (ii) B ve (iii) A ve B'den her birine iliskin spesifik bir açiklama olarak alinmalidir. Baglam aksini ifade etmedikçe, yukarida belirtilen Özelliklere iliskin tarifnameler ve tanimlar, bu bulusun herhangi belirli bir özelligi veya yapisiyla siiiirli degildirler ve tarif edilen tüm Özellik ve yapilara esit sekilde uygulanirlar. Bu bulusun diger özellik ve yapilari, yukarida "olusan" terimiyle ikame edilen "içeren" terimiyle ifade edilmis özellik ve yapilari ve ayrica, yukarida "özünde olusan" terimiyle ikame edileii "içeren" teriiniyle ifade edilmis 'Özellik ve yapilari sunmaktadir. Deneyler 1. Yöntemler 1.1 Bitki malzemeleri ve b'ûv'ûtme kosullari Kullanilan vahsi tip hatti Arabidopsis ekotip Columbia (Col-O) idi. Tüm mutantlarin arkaplani C01-0°d1. da2-l (SALK_150003) ArabidOpsis Stok Merkezi NASC ve ABRC koleksiyonlarindan elde edildi. T-DNA insersiyonu PCR ve sekanslama yoluyla teyit edildi. Tohumlarin yüzeyi %100 izopropanolle 1 dakika ve %10 (h/h) çamasir suyuyla 10 dakika süreyle sterilize edildi; steril suyla en az üç kez yikandi; 4°C sicaklikta ve karanlikta 3 gün boyunca tabakalandi; %0,9agar ve %1 glukozla GM vasati 'uzerine disperse edildi ve ardindan, 22°C sicaklikta büyütüldü. Bitkiler, 22°C sicaklikta uzun gün kosulu (16 saat gündüz/ 8 saat gece) altinda büyütüldüler. 1.2 Yapilar ve transformasvon pDA2zDA2 yapisi, bir PCR-temelli Geçit sistemi kullaiiilarak yapildi. DA2°nin 'l960bp promotor sekaiisi, DA2pr0GW-F ve DA2pr0GW-R primerleri kullaiiilarak amplifiye edildi. Ardindan, PCR ürünleri pCR8/GW/TOPO TA klonlama vektörüne (Invitrogen) klonlandilar. DA2CDS-pMDCl 10 plazmidini elde etmek için, DA2 CDS amplifiye edildi ve sonrasinda, PCR ürünleri Geçit vektörü pMDCl lO,un AscI ve Kpnl yerlerine kloiilaiidilar. Bunun ardindan, pDA2zDA2 yapisini olusturmak için, DA2 promotoru LR reaksiyonuyla DA2CDS- pMDCl 10°a alt-klonlaiidi. Plazmid pDA2zDA2, Agrobacteriuni turnefacieiis GV3101 kullanilarak da2-l inutant bitkilere eklendi ve traiisformantlar, vasat içeren higromisin (30ug/ml) üzerinde seçildiler. 3SSzDA2 yapisi, bir PCR-temelli Geçit sistemi kullanilarak yapildi. PCR ürünleri, TOPO enzimi kullanilarak pCR8/GW/TOPO TA klonlania vektör'ûne (invitrogen) alt-klonlandilar. Ardindan, DA2 geni, 355 promotorunu (Curtis and Grossiiiklaus, 2003) içeren Geçit Ikili Vektörü pMDC32 içine alt-klonlanir. Plazinid 3SS:DA2, Agrobacterium tuinefaciens GV3101 kullanilarak C01-0 bitkilerine eklendi ve transformantlar, higromisiii (30ug/ml) içeren vasat üzerinden seçildiler. DA2°nin 1960 bp promotor sekansi amplifiye edildi ve PCR ürünleri, T4 DNA ligazi kullanilarak pGEM-T vektör'ûne (Promaga) klonlaiidi Ve sekanslandi. Ardindan, transformasyoii plazmidipDA2zGUS elde etmek amaciyla, DA2 proniotoru, pGreen-GUS ikili vektörünün (Curtis and Grossniklaus, 2003) Sacl ve NcoI yerlerine sokuldu. Plazmid pDA2zGUS, Agrobacterium tumefaciens GV3101 kullanilarak Col-O bitkilerine eklendi ve transformantlar, kaiiamisin (50ug/iiil) içeren vasat üzerinde seçildiler. 3581GW2 yapisi, bir PCR- temelli Geçit sistemi kullanilarak yapildi. PCR ürünleri, TOPO enzimi kullanilarak pCR8/GW/TOPO TA klonlama vektörüne (invitrogen) alt- klonlandilar. Ardindan, GW2 geni, 358 promotorunu (Curtis and Grossniklaus, 2003) içeren pMDC32 Geçit Ikili Vektörüne alt- klonlandi. Plazmid 35 SIGW2, Agrobacterium tuinefaciens GV3101 kullanilarak Col-O bitkilerine eklendi ve transformantlar, higromisin (30ug/ml) içeren vasat üzeriiide seçildiler. 1.3 Morfoloiik ve selüler analiz Ortalama tohum agirligi, 500"lük seriler halindeki olgun kuru tohumlari bir elektronik analiz terazisi (METTLER MOLEDO AL104 ÇIN) kullanilarak ölçmek suretiyle tespit edildi. Her tohum lotu için, bes numune serisinin agirliklari ölçüldü. Tohumlarin fotografi bir Leica CCD (DFC420) kullanilarak bir Leica mikroskopu (LEICA SSAPO) altinda çekildi ve tohum büyüklügü, linage J yazilimi kullanilarak Ölçüldü. Petallerin (asama 14), yapraklarin ve kotiledonlarin alan ölçümleri, Image J yazilimi kullanilarak, dijital bir görüntü elde etmek için organlari tarainak ve ardindan, alani, uzunlugu ve genisligi hesaplamak suretiyle yapildi. Yaprak, petal ve embriyo hücre büyüklükleri DIC görüntülerinden yola çikilarak ölçüldü. Çiçeklerde (asama 14) biyokütle akümülasyonu organlarin tartilmasiyla ölçüldü. 1.4 GUS boyama Nuinuiieler (pDA2:GUS); l mM X-gluk, 100 mM Na3PO4 tamponu, her biri 3mM K3Fe(CN)6/K4FC(CN)6, IOmM EDTA ve %0,1 N0didet-P40"tan olusan bir çözelti içerisinde boyandilar ve oda sicakliginda 6 saat süreyle iiikübe edildiler. GUS boyamasindan sonra, %70 etanol kullanilarak klorofil çikartildi. 1.5 RNA izolasyonu, RT-PCR ve Kantitatif gercek zamanli RT- PCR analizi T0plam RNA, bir RNeasy Bitki Mini kiti (TIANGEN, Çin) kullanilarak Arabidopsis köklerinden, saplarindan, yapraklarindan, fidelerinden ve çiçek küinelerinden ekstrakte edildi. Ters transkripsiyon (RT)-PCR, tarif edildigi gibi (Li ve ark., 2006) gerçeklestirildi. CDNA numuneleri, ACTlN2-F ve ACTlN2-R primerleri kullanilarak aktin transkript miktari üzeriiiden standartlastirildi. Kantitatif gerçek zamanli RT-PCR analizi, Lightcycler 480 SYBR Green Master (Roche) kullanilarak bir Lightcycler 480 cihaziyla (Roche) yapildi. ACTIN7mRNA dahili kontrol olarak kullanildi ve nispi mRNA miktarlari karsilastirma esik döngüsü yöntemi kullanilarak hesaplandi. 1.6 E3 ubikuitin ligazi aktivitesi esevi MBP-DAZ yapisi olusturmak için, DA2 kodlama sekansi, pMAL- C2 vektörünün BainHI ve PstI yerlerine klonlandi. Çoklu-yer yönlendirmeli mutagenez kitinin (Stratagene) kullaniin talimati takip edilerek mutasyona ugratilmis DA2 (DA2C59S ve DA2N91L) olusturuldu. MBP-DA2 ve mutasyona ugratilmis MBP-DAZ eksprese eden bakteriyel lizatlar, 0,4 1nM IPTG ile 2 saat süreyle indüklenmis E. coli BL21°den hazirlandilar. Bakteriler, TGH lizis tamponu (50 mM HEPES [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1,5 mM MgC12, l inM EGTA, %1 Triton X-100, %10 gliserol ve proteaz inhibitörü kokteyli [Roche]) içerisinde lize edildiler ve ultrasona tâbi tutuldular. Lizatlar santrifûjlenerek teinizlendiler ve 4°C sicaklikta 30 dakika süreyle amiloz resini (New England Biolabs) kullanilarak inkübe edildiler. Boncuklar, kolon tamponuyla (20 1nM Tris pH 7,4, 200 1nM NaCl, 1 mM EDTA) yikandilar ve reaksiyon tamponuyla (50 mM Tris pH 7,4, mM DTT, 5 mM MgC 12, 2 mM ATP) dengelendiler. 110 mg El (Boston Biochem), 170 ng E2 (Boston Biochem), l pg His-ubikuitin (Sigma-Aldrich) ve 2 pg DA2-MBP veya inutasyona ugratilinis DA2- MBP füzyon proteini, bir 20ul reaksiyon tamponu içerisinde 30°C sicaklikta 2 saat süreyle inkübe edildi. Poliubikuitinlenmis proteinler, Hisse karsi bir antikorla (Abmart) ve MBPaye karsi bir antikorla (New England Biolabs) immünoblotlama yoluyla tespit edildiler. 1.7 In vitro protein-protein etkilesimi Spesifik protein domainleri içeren DAl, dal-1 ve DAl türevlerinin kodlaina sekanslari, GST-DAl, GST-DA1R358K, GST-DAl-UIM ve GST-DAl-LIM+C yapilari olusturmak için pGEX-4T-1 vektörünün BamHI ve NotI yerlerine ve ayrica, GST-DAl-LIM ve GST-DAl- C yapilari elde etmek için pGEX-4T-1 vektörünün EcoRI ve Xhol yerlerine klonlandilar. Protein-protein etkilesimini test etmek amaciyla, yaklasik 15 tig of MBP-DA2 füzyon proteini içeren bakteriyel lizatlar, yaklasik 30 tig GST-DAl, GST-DA1R358K, GST-DAl-UIM, GST-DAl-LIM, GST- DAl-LIM+C veya GST-DAl-C füzyon proteini içerem lizatlarla birlestirildiler. Birlestirilen her bir çözeltiye, 4°C sicaklikta 1 saat süreyle sürekli sallanarak 20 pl amiloz reçinesi (New England Biolabs) ilave edildi. Boncuklar TGH tainponuyla birçok kez yikandilar ve izole edilmis proteinler, bir %10 SDS-poliakriamid jel üzerinde ayrildilar ve sirasiyla anti-GST (Abinart) ve anti-MBP antikorlari (Abmart) kullanilarak Westein blot analiziyle tespit edildiler. 1.8 ES-imm'i'ino-çökeltme DAl ve DAl-C"nin kodlaina sekansi, transformasyon plazinidi 3SSzzMyc-DA1 ve 3SSzzMyc-DAl-C elde etmek için pCAMBIAl300-221-Myc vektörün'ûn KpnI ve BamHI yerlerine klonlandi. PCR ürünleri, TOPO enzimi kullanilarak pCR8/GW/TOPO TA klonlama vektörüne (invitrogen) alt-klonlandilar. Ardindan, DA2 geni, 358 promotorunu ve GFP genini (Curtis aiid Grossniklaus, 2003) içeren pMDC43 Geçit Ikili Vektörüne alt-klonlandi. PCR ürünleri, TOPO enzimi kullanilarak pCRS/GW/TOPO TA klonlama vektörüne (invitrogen) alt-klonlandilar. Ardindan, PEXlO geni, 358 proinotorunu ve GFP genini içeren pH7FWG2 Geçit Ikili Vektöii'ine alt-klonlandilar. Nicotiana benthainiana yapraklari, 3SS:MyC-DA1 ve 3SSiGFP- DA2 plazinidlerini barindiran Agrobacterium tumefaciens GV3101 hücreleri enjekte edilerek daha önce tarif edildigi gibi (Voinnet ve ark., 2003) tranforme edildiler. Toplam protein, ekstraksiyon tamponuyla (50 HM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, %20 gliserol, %2 Triton X-100, lmM EDTA, 1 X tam proteaz inhibitörü kokteyli (Roche) ve MG132 20ug/m1) ekstrakte edildi ve GFP-Trap-A (Chromotek) kullanilarak 4°C sicaklikta 1 saat süreyle inkübe edildi. Boncuklar, yikama tamponuyla (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, %0,1 Triton X-100 ve 1 x tam proteaz inhibitörü kokteyli (R0che)) 3 kez yikandilar. Immünopresipitatlar, %10 SDS- poliakriamid jelinde ayrildilar ve sirasiyla anti-GFP (Beyotime) ve anti-Myc (Abmart) antikorlari kullanilarak Western blot analiziyle tespit edildiler. 1.9 Erisim numaralari Bu patent basvurusunda bahsedilen Arabidopsis genleri için ArabidOpsis Genome Initiative lokusu belirleyicileri asagidaki gibidir: At1g19270 (NP_173361.1 GI: 15221983) (DAl), At4g36860 (NP_195404.6 Gl:240256211) (DARl),Atlg78420 (NP_001 185425.] GI:334183988) (DA2), At1g17145 (NP_564016.1 Glzl8394446) (DA2L) ve At3g63530 (NP_001030922.1 GI: 79316205) (EODl/BB). 2. Sonuçlar 2.1 daZ-l mutanti büyük tohumlar vermektedir Tohum büyüklügünün ubikuitin aracili kontrol mekanizmalarini daha iyi anlayabilmek için, birden fazla iiiikrodizi çalismasinda Arabidopsis ovülleri ve/veya tohumlarinda eksprese edilmis bazi tahmini ubikuitin ligazi genlerinin geiiel kullanima açik T-DNA insersiyon hatlarini topladik ve onlarin tohum büyüme fenotiplerini arastirdik. Buradan yola çikarak degistirilmis tohum büyüklügüne sahip birden fazla T- DNA insersiyon mutanti tanimladik. Bu mutantlardan birini, iri tohum büyüklügü mutantlariiiin kesif sirasina atif yaparak da2-l olarak isimlendirdik (DA, Çincede "büyük" anlamina gelmektedir). Vahsi tip tohumlarla kiyaslandiginda, da2-l "le üretilen tohumlar daha büyük ve daha agirdilar (Sekil 1A, 3C ve 3D). Vahsi tiptekilerle kiyaslandiginda, da2-1°de meyve basina tohum sayisi ve bitki basina tohum verimi nispeten daha yüksekti (Sekil lB ve IC). Bunun aksine, vahsi tiptekilerle karsilastirildiginda, da2-l "de beher bitki için toplam tohum sayisi anlamli düzeyde artmis degildi (Sekil 1D). da2-1 bitkileri, olgun asamadaki vahsi tip bitkilerden daha uzunlardi (Sekil IE). Buna ek olarak, vahsi tip bitkilere kiyasla, da2-l mutaiit bitkilerinde hem daha büyük çiçek ve yapraklar olustugu, hem de biyokütlenin arttigi görüldü (Sekil 2; Sekil 15). da2-l mutant petal ve yaprak büyüklüklerinin artma sebebi hücrelerin daha büyük olmasi degildi (Sekil 15) ve bu da, sebebin daha yüksek petal ve yaprak hücresi sayisi olduguna isaret etti. 2.2 DAZ, tohum büv'ûklügünü kontrol etmek için DA] ile sineriik olarak faaliyet gösterir, ancak bunu E0D19den bagimsiz yapar da2-1 mutanti zayif, ancak dal-Pe benzer bir tohum büyüklügü fenotipi gösterdi (Li ve ark., 2008) ve bu da, DAl ve DAZ'nin ortak bir yolakta islev gördüklerine iliskin bir gösterge sagladi. DA] ve DA2 arasinda genetik bir etkilesim olup olmadigini test etmek amaciyla, bir dal-1 da2-1 çift mutaiiti olusturduk ve onun tohum büyüklügünü tespit ettik. Her ne kadar da2-l mutanti vahsi tipten nispeten daha büyük ve agir tohumlara sahip olsa da (Sekil 1A, 3C ve 3D), da2-l mutasyonu, da 1 -1 ,in tohum büyüklügü ve agirlik fenotiplerini sinerjik olarak artirdi (Sekil 3A ve 3C) ve bu da, DAl ve DA2 arasinda tohum büyüklügü açisindan sinerjik bir genetik etkilesim oldugunu ortaya koydu. Tohum büyüklügüiide gerçeklesen degisiklikler, embriyolarin Ve elde edilen fidelerin büyüklükleriiie yansidi (Sekil 3B). Ayrica, 10 günlük fidelerin kotiledon alanini da ölçtük. da 1-1 "in kotiledon büyüklügünde da2-l mutasyonuyla gerçeklesen sinerjik bir artis da gözlemlendi (Sekil 38 ve 4). dal-1 alleli tarafindan kodlaiian inutant protein, en yakiii iliskili aile üyesi olan DAl ve bir DAl-iliskili proteine (DARl) karsi negatif bir aktiviteye sahipti (Li ve ark., 2008). dal-kol ve darl-l tek inutantlari belirgin bir tohum büyüklügü fenotipi göstermezken, çift dal-kol darl-l T-DNA iiisersiyoii mutantlari dal -l fenotipleri gösterdi (Li ve ark., 2008). dal-l ve da2- 1 tohum büyüklügünü artirmak için sinerjik olarak faaliyet gösterdigi için, dal-kol "in da2-l fenotiplerini sinerjik olarak artirabilecegi beklenebilir. Buiiu test etniek amaciyla, dal-kol da2-l çift mutaiitini olusturduk. Sekil 3D°de de gösterildigi üzere, dal-kol mutasyonu, da2-1'in tohum büyüklügü ve agirlik fenotiplerini de sinerjik olarak artirdi. 10 günlük fidelerin kotiledon alanlarini da ölçtük. dal- kol mutasyonu, da2-1°in kotiledon büyüklügü fenotipini sinerjik olarak artirdi (Sekil 4, sag üst). Benzer sekilde, dal- kol mutasyonunun da2-1 petal büyüklügünde siiierjik bir artisa sebep oldugu da gözlemlendi (Sekil 16D). Bu sonuçlar, hein DA] hem de DA2,ni11 eszamanli kesilmesiniii sinerjik etkilerini de göstermektedir. Embriyo hücrelerinin ve petal epidermal hücrelerin büyüklüklerini de ölçtük. Parental hatlarinda yapilan ölçümlerle kiyaslandiginda, dal-1 da2-1 ve dal-kol da2-1 çift niutantlarinda hücre büyüklügü artmadi (Sekil 4 sol alt; Sekil 16E) ve bu da, DAl ve DA2"nin hücre proliferasyonu proseslerini sinirlamak için sinerjik olarak faaliyet gösterdiklerine iliskin bir gösterge sundu. dal-1 da2-l çift mutanti, dal-kol da2-1 çift mutantlarindan daha büyük tohuinlara sahipti (Sekil 3C, 3D ve 4) ve bu da, dal -1 allelinin dal-kol den daha kuvvetli fenotiplere sahip oldugunu belirten önceki raporumuzla tutarlidir (Li ve ark.,2008). dal-l tohumlarinin büyüklükleri, dal-kol darl-l çift mutant tohumlarininkine benzerdi, çünkü dal-l alleli, DAl ve DAR1"e karsi negatif bir aktiviteye sahiptir (Sekil 4 sag alt) (Li ve ark., 2008). Bundan dolayi, dall da2- 1 çift mutant tohumlariiiin büyüklüklerinin dal-kol darl-l da2-l üçlü mutant tohumlarinin büyüklüklerine benzer olabilecekleri beklenebilir. Bundan dolayi, bir dal-kol darl-l da2-1 üçlü mutanti olusturduk ve tohum büyüklügünü inceledik. Sekil 4"te de gösterildigi üzere, dal-kol darl-l da2-l üçlü mutant tohumlariiiin büyüklükleri, dal-l da2-l çift mutant tohumlarininkiyle karsilastirilabilir ve denk düzeydeydi, ancak dal-kol da2-1çift mutant tohumlarininkinden büyüktü. Dolayisiyla, bu genetik analizler, dal-l allelinin hem DAl hem de DARl üzerinde negatif bir etkisi oldugunu daha da destekleniektedir (Li ve ark., 2008). BIG BROTHER°a (BB) karsi allelik olan bir dal-l artiriciyi (EODl) daha önce taniinlainistik (Disch ve ark., 2006; Li ve ark., 2008). eodl mutasyonlari, dal-Fin tohum büyüklügü fenotipini sinerjik olarak artirdi (Li ve ark., 2008). Benzer sekilde, dal-l ve dalkol, da2-l°in tohuin büyüklügü ve agirlik fenotiplerini de sinerjik olarak artirdi (Sekil 3A, 3C ve 3D). Bundan dolayi, DA2 ve EOD1°in ortak bir yolakta islev görüp görmeyecegini sorguladik. DA2 ve EODl arasinda genetik iliskiler olup olmadigini teSpit etmek için, bir eodl-2 da2-l çift mutantini analiz ettik. Parenteral hatlariyla kiyaslandiginda, eodl-2 ve da2-1 arasindaki genetik etkilesim, aslinda, hem tohum agirligina, hem de petal büyüklügüne katkida bulundu (Sekil 16) ve bu da, DA2'nin tohum ve organ büyümesini EODI "den bagimsiz olarak etkileyecek sekilde islev gördügüne iliskin bir gösterge sundu. 2.3 DA2. tohum büyüklügünü etkilemek için maternal olarak faaliyet gösterir Matemal ve/veya zigotik dokularin rohumlarin büyüklüklerini etkiledigini göz önünde bulundurarak DA2,nin matemal veya zigotik olarak islev görüp görmedigini sorguladik. Bunu test etmek için, vahsi tip ve da2-l arasinda karsilikli çapraz deneyler yaptik. Sekil 6"da da gösterildigi üzere, da2-l "in tohum büyüklügü üzerindeki etkisi, ancak ve sadece inaternal bitkiler da2-l mutasyonu için homozigot olduklarinda gözlemlendi. Polen donörünün genotipine bakilmaksizin, inaternal da2-1 bitkilerinin ürettikleri tohumlar, inateriial vahsi tip bitkilerin ürettiklerinden tutarli sekilde daha büyüklerdi. Bu sonuç, da2-l°in tohum büyüklügünü etkilemek için inaternal olarak faaliyet gösterebildigini göstermektedir. DAl°in de tohum büyüklügünü kontrol etmek için maternal olarak islev gördügünü daha önce göstermistik (Li ve ark. 2008). dal-kol mutasyonu da2-l"in tohum büyüklügü fenotipini sinerjik olarak artirdigi için (Sekil 3D), vahsi tip ve dal-kol da2-l çift mutanti arasinda da karsilikli çapraz deneyler yaptik. Benzer sekilde, dal-kol da2-l°in tohum büyüklügü üzerindeki etkisi, ancak ve sadece dal-kol da2-1 matemal bitki olarak hareket ettiginde gözlemlendi (Sekil 6). dal-kol/+ da2-l/+ bitkilerinin, dal-kol da2-1 çift mutaiit poleniyle çiftlestirilmesi, dal -kol/+ da2-1/+ tohum zarflari içerisinde dal-kol da2-l,da1kol/dal-kol da2-1/+,dal-k01/+ da2-lda2-1 ve dal-kol/+ da2-l/+ embriyolarinin olusmasina yol açmaktadir. dal-kol da2- 1 çift mutant poleiiiyle fertilize edilen ve dal-kol ve da2-1 mutasyonlariyla genotiplenen dal-kol/+ da2-l/+ bitkilerinden alinmis münferit tohumlarin büyüklüklerini de ölçtük. Elde ettigimiz sonuçlar, dal-kol ve da2-l inutasyonlarinin bu tohumlarin büyüklüklerindeki varyasyonla iliskilendirilmedigini göstermektedir (Sekil 6). Bu analizler birlikte DAl ve DA2 için embriyo ve endosperm genotiplerinin tohum büyüklügünü etkilemediklerini ve ayrica, tohum büyümesini kontrol etmek için ana bitkinin sporofitik dokusunda DA] ve DA2 olmasi gerektigini göstermektedirler. 2.4 DA2,maternal integumentlerde hücre proliferasvonunu etkilemek için DA] ile sineriik olarak faaliyet gösterir Karsilikli çapraz deneyler, DAl ve DA2"nin tohum büyüklügünü tespit etmek için maternal olarak islev gördüklerini gösterdi (Sekil 6) (Li ve ark., 2008). Ovülü saran integumentler maternal dokulardir ve fertilizasyondan sonra tohumun büyümesini fiziksel olarak kisitlayabilen tohum zarfini olustururlar. Birtakim çalismalar, ovüllerin integument büyüklügünün tohum büyüklügünü belirledigini göstermistir (Schruff ve ark., 2006; Adainski ve ark., 2009). Bundan dolayi, DA] ve DA27nin tohum büyüklügünü kontrol etmek için matemal integumentler araciligiyla faaliyet gösterip göstermediklerini sorguladik. Bunu test etmek için, einaskülasyondan sonra 2. günde vahsi tip, dal-1, da2-1 ve dal-1 da2-l"den aliiian olgun ovülleri inceledik. dal-l ovüllerinin büyüklükleri, vahsi tip ovüllerinkinden dramatik olarak daha fazlaydi (Sekil 5 ve 7) ve bu da, önceki bulgularimizla tutarliydi (Li ve ark., 2008). da2-1 ovülleri de vahsi tip ovüllerden daha büyüktü (Sekil 5 ve 7). da2-l mutasyonu, dal-Pin ovül büyüklügü fenotipini sinerjik olarak artirdi ve bu da, tohum büyüklügündeki sinerjik etkilesimleriyle tutarl iydi . 6 DAP ve 8 DAPsde, vahsi tip, dal-1, da2-1 ve dal-l da2-l"de gelismekte olan tohumlarin dis integument hücre sayisini arastirdik. Vahsi tip tohumlarda, 6 DAP"de dis integument hücreleriiiin sayisi, 8 DAP"deki sayiya benzerdi (Sekil 7 orta panel) ve bu da, 6 DAP"de vahsi tip tohumlarin dis integumentlerindeki hücrelerin bölünmeye tamamen son verdiklerini gösterdi. Benzer sekilde, 6 DAP"de, dal 1, da2-1 ve dal-1 da2-l tohumlarinin dis integuinentlerindeki hücreler, hücre proliferasyonunu tainamen durdurdular. dal-l ve da2- l tohumlarindaki dis integument hücrelerinin sayisi, vahsi tip tohumlarinkine kiyasla anlamli düzeyde artti (Sekil 7). da2-l mutasyonu, dal-Pin dis integument hücre sayisini sinerjik olarak artirdi. Vahsi tip, dal-l, da2-l ve dal-l da2-l tohumlarin tozlasmadan sonra 6. ve 8. günlerde dis integument hücre boyunu da arastirdik. dal-l, da2-l ve dal-l da2-l dis iiitegumentlerinde yer alan hücreler, vahsi tip dis integumentlerinkinden anlamli düzeyde daha kisaydilar (Sekil 7 sag panel) ve bu da, integunientlerde hücre proliferasyonu ve hücre genislemesi arasinda bir dengeleme mekanizmasi olduguna iliskin gösterge sundu. Dolayisiyla, bu sonuçlar, DA2snin matemal integumentlerde hücre proliferasyonunu kisitlamak için DAl ile sinerjik olarak sinerjik olarak hareket ettigini göstermektedirler. 2.5 DA2 bir fonksiyonel E3 ubikuitin ligazi kodlar Atlg78420 geninin yedinci eksonunda, T-DNA insersiyonuyla da2- 1 mutasyonu tanimlandi (Sekil 8A). T-DNA insersiyon yeri, T-DNA spesifik ve komsu primerleri kullanilarak ve PCR ürünleri sekanslanarak PCR ile bir kez daha teyit edildi. Atlg78420°nin tam boy mRNA,si, da2-l mutantinda yari kantitatif RT-PCR kullanilarak tespit edileinedi. da2-1 bitkilerinde, kendi promotorunun kontrolü altinda Atlg78420 CDS eksprese ettik ve 62 transgeiiik bitki izole ettik. Hemen hemen tüm transgenik hatlar, da2-l fenotiplerinin tamamlandigini gösterdi (Sekil 10) ve bu da, Atlg78420"nin DA2 geni olduguna isaret etti. DA2 fonksiyonunu, özellikle de fonksiyon fenotipleriiiin kazanimini da karakterize etmek amaciyla, vahsi tip bitkilerde CaMV 358 proinotorunun kontrolü altinda DA2°nin kodlama bölgesini eksprese ettik ve 77 transgenik bitki izole ettik. DA2,nin gereginden fazla eksprese edilmesi tohum büyüklügünde, beher bitki için tohum veriininde ve beher bitki için tohum sayisinda azalmaya sebep oldu (Sekil 1A, lC ve 1D). Buna ek olarak, vahsi tiple kiyaslandiginda, DA2"yi gereginden fazla eksprese eden çogu transgenik bitkinin çiçek ve yapraklari küçüktü, meyve ve bitki boylari kisaydi ve ayrica, biyokütleleri de düsmüstü (Sekil IE, 2 ve 15). Bu sonuçlar, DA2inin tohum ve organ büyümesini sinirlainadaki rolünü de desteklemektedir. DA2 geninin, bir tahmini RING domaini içeren bir 402 amino asitli protein (59-101) kodladigi tahmin edilmektedir (Sekil 8B; Tablo 1). DA2"nin E3 ubikuitin ligazi aktivitesine sahip olup olmadigini arastirmak amaciyla, maltoz baglama proteini (MBP) kullanarak bir füzyon proteini olarak Escherichia coli içerisinde DA2 eksprese ettik ve MBP-DA2 proteinini çözünebilir fraksiyonlardan saflastirdik. Bir El ubikuitin aktive edici enzim, bir E2 konjüge edici enzim, His- ubikuitin ve MBP-DA2 mevcudiyetinde, bir anti-His antikoru kullanilarak yapilan Western blotlamayla bir poliubikuitinasyon sinyali gözlemlendi (Sekil 9, soldan besinci serit). Anti-MBP blot analizi de, MBP-DA2"nin ubikuitinlendigini gösterdi (Sekil 9, soldan besinci serit). Bununla birlikte, E1, E2, His-ubikuitin veya MBP- DA2"den herhangi birinin yoklugunda, hiçbir poliubikuitinasyon tespit edilinedi (Sekil 9, soldan birinci ilâ dördüncü seritler) ve bu da, DA2'nin fonksiyonel bir E3 ubikuitin ligazi oldugunu gösterdi. RING motifi, RING parmak proteinlerinin E3 ubikuitin ligazi aktivitesi için gereklidir (Xie ve ark., 2002). Bundan dolayi, DA2 E3 ligazi aktivitesi için bir intakt RING parinak domaini gerekip gerekmedigini test ettik. Sistein-59,u Serine (C59S) mutajenize etmek suretiyle tek bir amino asit sübstitüsyon alleli üretildi, çünkü bu inutasyonun RING doinainini sekteye ugrattigi tahmin edilmekteydi (Tablo 1 ve 2). Bir in vitro ubikuitinasyon eseyi, DA2°nin C59S mutantinda E3 ligazi aktivitesinin ortadan kaldirildigini gösterdi (Sekil 9, soldan altinci serit) ve bu da, DA2 E3 ubikuitin ligazi aktivitesi için bir intakt RING domaini gerektigine isaret etti. Ayrica, vahsi tip Col-O bitkilerinde DA2 C59S(3SS:DA2C59S)"yi gereginden fazla eksprese ettik ve 69 transgenik bitki izole ettik. Transgenik bitkilerde DA2 C59S ekspresyon seviyeleri yüksek olmasina ragmen, transgenik bitkilerin tohum büyüklükleri, vahsi tip bitkilerin büyüklükleriyle karsilastirilabilir ve denk düzeydeydi ve bu da, DA2 C59S mutasyonunun tohum büyümesinde DA2 fonksiyonunu etkiledigine isaret etti. Arabidopsis°te, üç adet RING tipi, yani RING-HZ, RING-HCa ve RING-HCb ve ayrica, bes adet modifiye edilmis RING tipi, yani RING-C2, RING-V, RING-D, RING-S/T ve RING-G tanimlanmistir (Stone ve ark., 2005). Pirinç GW2"de bulunan yeni bir RING domaini tipi (C5HC2) teklif edilmistir (Song ve ark., 2007). DA2°nin tahmin edilen RING domaininde yer alan sisteinlerin aralayicisi pirinç GW2°nin RING domainindekine (C5HC2) benzer olsa da, DA2"nin RING domaininde bir asparajin artigiyla (Asn-9l) ikame edilen bir korunmus histidin artigi yoktu (Tablo 1 ve 2). Bu amino asit sübstitüsyonu, Örnegin soya fasulyesi ve kolza tohumu gibi çift çenekli bitkilerde DA2 homologlarinin tahmini RING domaininde de gözlemlendi (Tablo 1). Bundan dolayi, bu asparajin artiginin (Asn-9l) kendi E3 ubikuitin ligazi aktivitesi için çok önemli olup olmadigini sorguladik. Asn-9l"i Lösine (N91 L) mutajenize etmek suretiyle bir tek amino asit sübstitüsyonu alleli üretildi. Bir in vitro ubikuitinasyon eseyi, DA29nin N9lL mutantinin E3 ligazi aktivitesine sahip oldugunu gösterdi (Sekil 9, soldan yedinci serit) ve bu da, DA2 E3 ligazi aktivitesi için Asn-9l 'in gerekli olmayabilecegine isaret etti. Bu sonuçlar, DA2°nin RING doinainiiiin GW2°de bulunan bir varyanti olabilecegini iddia etmektedir. Ayrica, vahsi tip bitkilerde DA2 N91L(358:DA2N91L)'yi gereginden fazla eksprese ettik ve 26 transgenik bitki izole ettik. Transgenik bitkilerin tohumlari, vahsi tip tohumlardaii daha küçüktü ve bu da, DA2 N91L"nin tohumun büyümesini kisitlayabilecegini akla getirdi. 2.6 Arabidopsis DA2 Homologlari Kolza tohumu, soya fasulyesi, pirinç, misir ve arpa da dâhil olmak üzere, Arabidopsis ve tahil bitkilerinde, DA2 ile RING domaini disinda anlamli düzeyde homoloji paylasan proteinler bulunmaktadir (Tablo 2). ArabidOpsis"te bulunan bir tahmini protein ve DA2 arasinda kapsamli bir amino asit benzerligi vardir ve bu protein DA2 benzeri protein (DA2L; Atlg'l7145) olarak adlandirilmaktadir. Tipki 3SS:DA2 bitkileri gibi, DA2L°yi gereginden fazla eksprese eden hatlarda küçük bitki ve organlar görüldü (Sekil 18) ve bu da, DA2 ve DA2L"nin benzer fonksiyonlara sahip olduguna iliskin bir gösterge sundu. Diger bitki türlerindeki benzer proteinler ve DA2 arasinda %39,2-%84,5 oraninda amino asit sekansi özdesligi vardi (Tablo 2). Brassica napus"ta bulunan homolog, DA2 ile en yüksek oranda amino asit sekansi özdesligine (%84,5) sahipti (Tablo 2). Pirinç GW2 ve Arabidopsis DA2 arasindaki amino asit sekansi özdeslikleri %43,l oranindaydi (Tablo 2). GW2°nin gereginden fazla eksprese edilmesi pirinçte dane genisligini düsürdügü için (Song ve ark., 2007), DA2 ve GW2"nin tohum büyüklügü kontrolü konusunda benzer fonksiyon gösterip göstermedigini soguladik. Bundan dolayi, vahsi tip bitkilerde GW2"yi gereginden fazla eksprese ettik. Tipki 3SStDA2 ve 3SS:DA2L transgeiiik hatlarinda oldugu gibi, GW2"yi gereginden fazla eksprese eden Arabidopsis transgenik bitkilerinin tohum ve organlari vahsi tip bitkilerden daha küçüktü ve bu da, tohum ve organ büyümesi koiitrolünde ArabidOpsis DA2 ve piriiiç GW2 için korunmus fonksiyona isaret etti. 2.7 DA2 ve DA] benzer ekspresvon paternleri gösterir DA2sniii ekspresyon paternini tespit etmek amaciyla, köklerden, saplardan, yapraklardan, fidelerden ve çiçek kümelerinden alinan RNA"lar kantitatif gerçek zamanli RT-PCR analiziyle analiz edildiler. Test edilen tüm bitki organlarinda DA2 mRNA tespit edildi (Sekil 11A). DA2"nin doku Spesifik ekSpresyon paternleri, bir DA2 promotortGUS füzyonu (pDA2tGUS) içeren transgenik bitkilerin GUS aktivitesi için histokimyasal esey kullanilarak incelendiler. Köklerde, kotiledonlarda, yapraklarda ve çiçek küinelerinde GUS aktivitesi tespit edildi (Sekil 118 ve llC). Yaprak primordiumlarinda ve köklerde nispeten yüksek GUS aktivitesi tespit edildi (Sekil llB ve llC). Çiçeklerde, yasli flora] organlara kiyasla genç floral organlarda nispeten daha kuvvetli DA2 ekspresyonu gözlemlendi (Sekil llD- llL). Beiizer sekilde, yasli ovüllere kiyasla, genç ovüllerde daha yüksek GUS aktivitesi tespit edildi (Sekil llM ve llN). Bu da, DA2 ekspresyonunun geçici ve mekansal olarak regüle edildigini göstermektedir. 2.8 DA] DA2 ile in vitro ve in vivo ortamda etkilesime girer Yaptigimiz genetik analizler, DAl°in tohum ve organ büyümesini kisitlamak için DA2 ile birlikte sinerjik olarak hareket ettigini göstermektedirler. Bundan dolayi, bir in vitro etkilesiin/pull-down deneyi kullanarak DA1"in E3 ubikuitin ligazi DA2 ile etkilesime geçip geçmedigini degerlendirdik. DAl bir GST füzyon proteini olarak ekSprese edilirken, DA2 bir MBP füzyon proteini olarak eksprese edilinektedir. Sekil 12,de de gösterildigi üzere (soldan birinci ve ikinci seritler), GST-DAI, MBP-DAZ'ye bagliyken, GST-DAI, bir negatif kontrole (MBP) bagli degildir. Bu sonuç, DAl"in in vitro ortamda DA2 ile fiziksel olarak etkilesime geçtigine isaret etmektedir. DAl; iki ubikuitin etkilesim motifi (UIM), bir tek LIM domaini ve son derece korunmus C-terminal bölgesi içerinektedir (Sekil 13) (Li ve ark., 2008). Ayrica, DAl ve DA2 arasindaki etkilesim için hangi DAl domaininin gerekli oldugunu da sorguladik. Escherichia coli içerisinde, spesifik protein doinainlerini içeren bir dizi DAl türevi eksprese edildi: yalnizca iki UlM domaini içeren DAl-UIM, yalnizca LIM domaini içeren DAl-LIM, yalnizca LIM doinaini ve C-terminal bölgesini içeren DA 1 -LlM+C ve ayrica, yalnizca C-terminal bölgesini içeren DAl-C, GST füzyon proteinleri olarak eksprese edildiler (Sekil 13). DA2, bir MBP füzyon proteini olarak eksprese edildi ve pull-down deneylerde kullanildi. Sekil 12°de de gösterildigi üzere, GST-DAl- LIM+C ve GST-DAl-C, MBP-DA2 ile etkilesime girdi, ancak GST- DAl-UIM ve GST-DAl-LIM, MBP-DATye baglanmadi. Bu sonuç, DA 21 'in korunmus C-terminal bölgesinin DA2 ile etkilesime geçtigine isaret etmektedir. dal-1 allelinin kodladigi mutant proteinin (DA1R358K) C-terminal bölgesinde bir mutasyona sahip oldugunu göz önünde bulundurarak (Sekil 13) (Li ve ark., 2008), DA1R358K mutasyonunun DA2 ile etkilesimleri etkileyip etkilemedigini sorguladik. MBP-DAZ ile pull- down deneylerde bir GST-DA1R358K füzyon proteini kullanarak, DA1R358K°de bulunan mutasyonun DAl ve DA2 arasindaki etkilesimi etkileinedigini gösterdik (Sekil 12, soldan üçüncü serit). Bitkilerde DA] ve DA2 arasindaki muhtemel iliskiyi daha detayli arastirmak amaciyla, onlarin in Vivo etkilesimlerini tespit etmek için es-immüno-çökeltme analizini kullandik. Nicotiana benthainiana yapraklarinda kisa bir süre için eszamanli 3582Myc- DAl ve 3SSrGFP-DA2 ekspresyonu yaptik. Nicotiana benthainiana yapraklarinda kisa süreli 3582GFP ve 3582MyC-DA1 es- ekspresyonu bir negatif kontrol olarak kullanildi. GFP-DA2 ve GFP"yi immüno-çökeltmek için, toplam proteinler izole edildi ve ayrica, GFP-Trap-A agaroz boncuklariyla inkübe edildi. Çökeltiler, sirasiyla anti-GFP ve anti-Myc antikorlari kullanilarak tespit edildiler. Sekil l4"te de gösterildigi üzere, Myc-DAl, immüno-çökeltilmis GFP-DA2 kompleksinde tespit edilirken, negatif kontrolde (GFP) tespit edilmedi ve bu da, bitkilerde DAl ve DA2 arasinda fiziksel bir iliski olduguna isaret etti. Pull-down eseyinde DAl°in C-terminal bölgesi DA2 ile etkilesime geçtigi için (Sekil 12), bitkilerde DA1"in C-terminal bölgesinin DA2 ile etkilesime geçip geçmedigini de sorguladik. Es-immüno-çökeltme analizi DAl°in C-terminal bölgesinin (Myc-DAl-C) GFP-DA2 kompleksinde tespit edildigini, ancak negatif kontrolde (PEXlO-GFP, bir RING-tipi E3 ubikuitin ligazi) tespit edilmedigini gösterdi (Platta ve ark., 2009; Kaur ve ark., 2013). Dolayisiyla, bu sonuçlar DA2 ile in vitro ve in vivo ortamda etkilesim için DAl "in C-terminal bölgesine ihtiyaç duyulduguna isaret etmektedir. Dainarli bitkilerde tohum büyüklügü evrimsel uyum için önemli bir belirleyici faktördür ve ayrica, tahil evcillestirmede önemli bir agronomik özelliktir (Gomez, 2004; Orsi ve Tanksley, 2009). Tohum büyüklügünü kontrol etmek için matemal hareket eden birtakim faktörler, örnegin ARF2/MNT, AP2, KLU/CYP78A5, EOD3/CYP78A6 ve DAl tanimlanmistir. Bununla birlikte, bu faktörlerin tohum büyüklügü kontrolündeki genetik ve moleküler mekanizinalari hemen hemen hiç bilinmeniektedir. Ubikuitin reseptörü DAl ,in tohum büyüklügünü kontrol etinek için E3 ubikuitin ligazi EODl/BB ile birlikte sinerjik olarak hareket ettigini daha önce gösterdik (Li ve ark., 2008). Bu çalismada, Arabidopsis DA2°yi tohum büyüklügü. kontrolüne katilan baska bir RING E3 ubikuitin ligazi olarak tanimladik. Genetik analizler, DA2°nin nihai tohum büyüklügünü kontrol etmek için DAl ile birlikte sinerjik olarak çalistigini, ancak bunu E3 ubikuitin ligazi EODl°den bagimsiz olarak yaptigini göstermektedirler. DAl "in DA2 ile fiziksel olarak etkilesime geçtigini de ortaya çikardik. Elde ettigimiz sonuçlar, Arabidopsis'te nihai tohum büyüklügünü kontrol eden ve DAl, DA2 ve EODl"i içeren bir ubikuitin temelli sistemi tanimlamaktadirl ar. 2.9 DA2, tohum büyüklügünü kontrol etmek için maternal olarak hareket eder da2-1 fonksiyon kaybi mutanti tohum ve organlarin büyük olmasini saglarken, DA2,yi gereginden fazla eksprese eden bitkiler küçük tohum ve organlar verdiler (Sekil 1A) ve bu da, DA2°nin tohum ve organ büyüklügü kontrolü için negatif bir faktör olduguna isaret etti. DA2"nin tohum ve organ büyümesini nasil kontrol ettigi konusunda hiçbir sey bilininemesine ragmen, Arabidopsis DA2'nin yakin zamanda organ büyümesi için bir pozitif regülatör olarak teklif edilinis olmasi sasirticidir (Van Daele ve ark., 2012). Bu çalismada, DA2"nin tohum ve organ büyümesi kontrolü için negatif bir faktör olarak faaliyet gösterdigini kanitlayacak yeterli delile sahibiz. da2-1 fonksiyon kaybi mutanti, tohum ve organlarin büyük olinasini sagladi (Sekil 1 ilâ 4). da2-1 mutasyonunun dal-1 ve dal-kol tohum ve organ büyüklügü fenotiplerini sinerjik olarak artirmasi da bunu desteklemektedir (Sekil 1 ilâ 4). da2-1 mutasyonu, eod1-2 tohum ve organ büyüklügü fenotiplerini de artirdi ve bu da, da2- 1 inutasyonunun tohum ve organ büyümesini destekledigini bir kez daha gösterdi. da2-1 mutanti, integumentlerde daha fazla hücre barindiran büyük ovüller olusmasini sagladi ve ayrica, da2- 1 inutasyonu dal-1 ovül büyüklügü fenotipini sinerjik olarak artirdi (Sekil 6). Buna ek olarak, DA2 and DA2L'yi gereginden fazla eksprese eden çogu transgenik bitki, vahsi tip bitkilerden daha küçüktü (Sekil 2; Sekil S9). Bu transgenik bitkilerin organ büyüme fenotipleri, kendi ilgili ekspresyon seviyeleriyle iliskiliydi (Sekil S4 ve S9). Bundan dolayi, verilerimiz DA2"nin tohum ve organ büyüklügü için bir negatif regülatör olarak islev gördügünü açikça göstermektedirler. Büyük organlara sahip birtakim Arabidopsis mutantlari da büyük tohumlar gelistirdi (Krizek, 1999; Mizukami ve Fischer, 2000; Schruff ve ark., 2006; Li ve ark., 2008; Adamski ve ark., 2009) ve bu da, organ büyüklügü ve tohum büyümesi arasinda muhtemel bir bag oldugunu ortaya koydu. Bunun aksine, büyük organlara sahip birtakim diger mutantlarda, normal büyüklükte tohumlar görüldü (Hu ve ark., 2003; White, 2006; Xu ve Li, 2011) ve bu da, organ ve tohum büyüklügünün her durumda pozitif iliskili olmadigina isaret etti. Bu sonuçlar, tohum ve organlarin kendi ilgili büyüklüklerini kontrol edecek hem ortak hem de ayri yolaklari oldugunu ortaya koymaktadirlar. Karsilikli çapraz deneyler, DA2"nin tohum büyümesini etkilemek için maternal olarak hareket ettigini ve ayrica, DA2 için embriyo ve endosperm genotiplerinin tohum büyüklügünü etkileniedigini gösterdi (Sekil 6). OVülü saran integumentler, maternal dokulardir ve fertilizasyondan sonra tohum zarfini olustururlar. Örnegin arf2, dal- ] ve klu ovüllerinde görülenler gibi inaternal integuinent büyüklügündeki degisikliklerin tohum büyüklügündeki degisikliklere katkida bulunduklari bilinmektedir (Schruff ve ark., 2006; Li ve ark., 2008; Adamski ve ark., 2009). Olgun da2-l ovülleri, olgun vahsi tip ovüllerden daha büyüklerdi (Sekil 5 ve 7). da2-1mutasyonu, dal- l ovüllerinin integument büyüklügünü de sinerjik olarak artirdi. Dolayisiyla, maternal integument büyüklügünü kontrol etmenin, nihai tohum büyüklügünü belirlemeye yönelik kilit mekanizmalardan biri oldugu bu çalismalardan elde edilen genel bir anafikirdir. Bugüne kadar izole edilen tohum büyüklügü kontrolü bitki inatemal faktörlerinin (Örnegin KLU, ARF2 ve DAl) integument büyüklügünü etkilemesi de bu düsünceyle tutarlidir (Schruff ve ark., 2006; Li ve ark., 2008; Adamski ve ark., 2009). Integument veya tohum zarfi büyüklügü, koordine iki prosesle, yani hücre proliferasyonu ve hücre genislemesiyle tespit edilir. Olgun ovüllerin integumentlerinde bulunan hücre sayisi, fertilizasyondan soiira tohum zarfi büyüine potansiyelini belirler. Örnegin, arf2 mutantlari daha fazla hücre barindiran büyük ovüller olusturdu ve bu, büyük tohumlara yol açti (Schruff ve ark. 2006); öte yandan, klu mutantlari daha az hücre barindiran küçük ovüllere sahipti ve bu, küçük tohumlarla sonuçlandi (Adamski ve ark., 2009). Elde ettigimiz sonuçlar, hem dal-l ve da2-l tohumlarinin integumentlerinde vahsi tip tohumlarinkinden daha fazla hücre bulundugunu, hem de dal-l ve da2-l"in integumentlerde hücre proliferasyonunu desteklemek için sinerjik olarak hareket ettiklerini göstermektedirler. dal-1, da2-1 ve dal-1 da2-l tohumlarinin dis integumentlerinde bulunan hücrelerin vahsi tip integumentlerdekilerden daha kisa olduklarini da gözlemledik; bu da, matemal integumentte hücre proliferasyonu ve hücre elongasyonu arasinda muhtemel bir deiigeleme mekanizmasi oldugunu akla getirdi. Dolayisiyla, tohum büyümesi üzerinde fiziksel bir kisit olarak hareket eden matemal integument veya tohum zarfinin nihai tohum büyüklügü için bir üst limit belirleyebilmesi muhtemeldir. 2.10 Tohum büyüklügünün ubikuitin aracili kontrolü için genetik bir çerçeve DA2, daha önce tarif edilen bitki RING doinainlerinin herhangi birinden farkli bir tahmini RING domainine sahip bir protein kodlar. DA2"nin RING domaini, pirinç GW2"ninkiyle (C5HC2) en yüksek oranda homoloji paylasan domaindi, ancak bir asparajin artigiyla ikame edilmis bir korunmus metal ligand ainino asit (bir histidin artigi) içermiyordu (Song ve ark., 2007). DA2°nin RING domaininin GW2°de bulunanin bir varyanti olmasi hâlâ mümkündür. E3 ubikuitin ligazlarinda, müteakip proteazomal degradasyon için genelde onlari hedef alan birçok RING tipi domain bulunmaktadir (Smalle ve Vierstra, 2004). Rekombinant DA2"nin E3 aktivitesini bir in vitro ubikuitin-ligaz eseyinde test ettik ve DA23nin bir fonksiyonel E3 ubikuitin ligazi oldugunu gösterdik; bu da, DA2"nin 26S proteazom araciligiyla ubikuitin-bagimli degradasyon için hücre proliferasyonunun pozitif regülatörlerini hedef alabildigini akla getirdi. Arabidopsis°te ve diger bitki türlerinde, DA2 ile RING domaini disinda homoloji paylasan proteinler bulunmaktadir. ArabidOpsisîe, DA2 benzeri protein (DA2L), DA2 ile kapsamli bir amino asit benzerligine sahiptir. Tipki 3581DA2 bitkileri gibi, DA2L°yi gereginden fazla eksprese eden hatlarda da küçük bitkiler görüldü (Sekil 18) ve bu da, DA2 ve DA2L"nin benzer islev görebileceklerine isaret ettti. Pirinçte DA2 homologu, tohum büyüklügü için bir negatif regülatör olarak hareket ettigi bilinen RING tipi (C5HC2) protein GW2,dir (Song ve ark., 2007). Bununla birlikte, pirinçte, GW2"nin tohum büyüklügü kontrolündeki genetik ve moleküler mekanizmalari büyük ölçüde bilinmemektedir. Ubikuitin baglama aktivitesine sahip bir ubikuitin reseptörü olan DA1"i, daha önce, tohuin büyüklügü için bir negatif regülatör olarak tanimladik (Li ve ark., 2008). Modifiye edici bir incelemede, E3 ubikuitin ligazi BB"ye allelik olan (Disch ve ark., 2006) bir dal- l artiricisi (EODl) tanimlandi (Li ve ark., 2008). Çift eod1-2 dal- 1 mutantlarina iliskin analiz, DAl ve EOD2 arasindaki sinerjik genetik etkilesimleri ortaya çikardi (Li ve ark., 2008) ve bu da, onlarin ortak bir hedef(ler)in aktivitesini modüle etmek suretiyle tohum büyümesini kontrol edebileceklerini akla getirdi. Her ne kadar dal-l ve eodl- 2 arasindaki genetik etkilesimler tohum ve organ büyüklügünü de sinerjik olarak artirmis olsalar da, yaptigimiz genetik analizler, DA2°nin tohum büyümesini etkilemek için EOD1°den bagimsiz hareket ettigini göstermektedirler ve bu da, DA2 ve EOD1°in, DAl yoluyla ortak regülasyonla birlikte degradasyon için farkli büyüme stimülatörlerini hedef alabileceklerini akla getirmektedir. Dolayisiyla, elde ettigimiz bulgular, tohum ve organ büyüklügünün üç adet ubikuitin iliskili proteinle, yani DA1,DA2 ve EODl ile kontrol edilmesine iliskin bir çerçeve olusturmaktadirlar. Buna ek olarak, GW2"nin gereginden fazla eksprese edilmesinin, ArabidOpsis"te tohum ve organ büyümesini sinirladigini gözlemledik; bu da, Arabidopsis ve pirinçte inuhtemel bir korunmus fonksiyon bulunabilecegine iliskin gösterge sunmaktadir. DAl ve EOD1°in GW2 ve pirinç homologlarindan olusan kombinasyonun pirinçte dane büyüklügü üzerindeki etkilerini arastirmak ilginç olabilirdi. 2.11 Tohum büyüklügü kontrolünde DAl ve DA25nin muhtemel bir moleküler mekanizmasi Elde ettigimiz sonuçlar, E3 ubikuitin ligazi DA2"nin, ubikuitin reseptörü DA] ile in vitro ve in Vivo ortamda etkilesime girdigini göstermektedirler (Sekil 12-14). Bununla birlikte, DA2°nin proteazomal degradasyon için DA1"i hedef almasi muhtemel degildir, çünkü DAl geninin bir T-DNA sokulmus mutanti (dal-k01)da2-l"in tohum büyüklügü fenotipini sinerjik olarak artirmaktadir (Sekil 3 ve 4). Bununla birlikte, birçok baska ubikuitin modifikasyonu tipi, proteinleri proteazomdan bagimsiz bir sekilde regüle etmektedir (Schnell ve Hicke, 2003). Örnegin, inonoubikuitinasyon, sinyalleme proteinlerinin, endositozun ve histon modifikasyonunun aktive edilmesine karisinaktadir (Schnell ve Hicke, 2003). Hayvanlarda, ubikuitin reseptörü epslS°in monoubikuitinasyonu, E3 ligazlarinin eps15 ve Nedd4 ailesi arasindaki etkilesime baglidir (Woelk ve ark., 2006). Bunun aksine, ubikuitin reseptörlerinin bir E3-bagimsiz monoubikuitinasyonu da rapor edilmistir (Hoeller ve ark., 2007). DAl'in DA2 ile etkilesime geçtigini göz önünde bulundurarak, DA2'nin DA1"i ubikuitinleyip ubikuitinleyemeyecegini ya da monoubikuitinleyip monoubikuitinleyemeyecegini test ettik. E1, E2 ve ubikuitin mevcudiyetinde, DA2-His, bir E3 ubikuitin ligazi aktivitesine sahipti. Bununla birlikte, E1, E2, ubikuitin ve DA2-His (E3) mevcudiyetinde, reaksiyon kosullarimiz altinda hiçbir ubikuitinlenmis DAl-HA tespit edilmedi. Ubikuitin reseptörleri, UIM doinainleri yoluyla E3"lerin poliubikuitinleninis sübstratlariyla etkilesime geçebilirler ve proteazomla kendi degradasyonlarini kolaylastirabilirler (Verma ve ark., 2004). DA1,in UIM doinainlerinin ubikuitin baglayabildiklerini daha önce gösterdik (Li ve ark., 2008). DAl, kendi C-terminal bölgesi araciligiyla DA2 ile girdigi etkilesimle birlikte ele alindiginda (Sekil 12 ve 14), DA2°nin ubikuitinlenmis sübstratlarinin proteazomla degradasyonuna aracilik etmede rol oynayabilir. Mekanizmalardan biri DAl,in DA2 ile etkilesime girmesini içerebilir ve bu da, DAlsin DA2"nin ubikuitinlenmis sübstrat(1ar)1ni spesifik olarak tanimasina yardimci olur. DAl, daha sonra, UIM domaini araciligiyla ubikuitinlenmis sübstrat(lar)in poliubikuitin Zincirlerini baglayabilir ve ubikuitinlenmis sübstrat(lar)in degradasyonuna aracilik edebilir. Tohum verimini iyilestirmek dünya genelinde tahil üreticileri için önemli bir hedeftir ve tohumlarin büyüklügü, genel tohum veriminin önemli bir bilesenidir. DA2iyi, tohum büyüklügünü etkilemek için DAlale sinerjik olarak islev gören Önemli bir tohum büyüklügü regülatörü olarak tanimladik. DAl, ayrica, tohum büyümesini etkilemek için EODl ile birlikte sinerjik olarak hareket eder. Bir dominant negatif dal- lmutasyonunun (Zindal-l) gereginden fazla eksprese edilinesinin misirin tohum kütlesini artirdigi rapor edilmistir (Wang ve ark., 2012); bu da, farkli tohum tahillarinin DAl, DA2 ve EODl etkilerini, bu tahillarda tohum büyüklügünü artiracak sekilde genetik olarak degistirmek amaciyla birlestirmek için bir umut olduguna isaret etmektedir. TR TR

Claims (13)

ISTEMLER

1. Bir bitkinin birim alan basina tohum kütlesini, büyümesini ve/veya biyokütlesini artirmaya yönelik olan bir yöntem olup, söz konusu bitkinin hücrelerindeki bir DA2 polipeptidinin ekspresyonunu veya aktivitesini azaltmayi içerir; burada, DA2 polipeptid, SEKANS KOD NO.: 2 ile temsil edilen bir RING domaini içerir ve ayrica, bu bitki azaltilmis DAl ya da azaltilmis DAl ve EODl ekSpresyonuna veya aktivitesine sahiptir;burada, DA2 polipeptidinin ekspresyonu veya aktivitesi: (a) bitki hücresinin DA2 polipeptidini kodlayan veya onun ekspresyonunu regüle eden nükleotid sekansina bir mutasyon eklemek ve mutasyona ugratilmis hücreden bitki re jenere etmek (b) DA2 polipeptidi ekspresyonunu azaltan bir supresör nükleik asit ekSprese eden bir heterolog nükleik asidi söz konusu bitki hücresinin bünyesine dâhil etmek suretiyle azaltilir.

2. Istcm 1”e uygun yöntem olup, söz konusu bitkinin hücrelerinde bir DA] polipeptidi ve/veya bir EOD polipeptidi ekspresyonunun veya aktivitesinin azaltilmasini içerir; burada, DAl polipeptidi ve/Veya EOD polipeptidi ekspresyonu veya aktivitesi: (a) bitki hücresinin DAl polipeptidini ve/Veya EOD polipeptidini kodlayan veya onun ekspresyonunu regüle eden nükleotid sekansina bir mutasyon eklemek ve mutasyona ugratilmis hücreden bitki rejenerc etmek; (b) DA] polipeptidi ve/Veya EOD polipeptidi ekspresyonunu azaltan bir supresör nükleik asit eksprese eden bir heterolog nükleik asidi, söz konusu bitki hücrelerinin bünyesine dâhil etmek ya da (c) söz konusu bitkinin hücrelerinde bir doininant negatif DAl polipeptidi eksprese etmek suretiyle azaltilir.

3. Istem 1 veya 2'den herhangi birine uygun bir yöntem olup; burada, bitki hücrelerinde gerçeklesen DA2 polipeptidi ekspresyonu veya

4. Birim alan basina tohum kütlesi, büyümesi ve/Veya biyokütlesi artmis bir bitki üretmeye yönelik olan bir yöntem olup, DAl ya da hem DA] hem de EODl ekspresyonunda veya aktivitesinde eksik olan bir bitki hücresi saglamayi, bitki hücresinin bünyesine SEKANS KOD NO.: 2 ile temsil edilen bir RING domaini içeren bir DA2 polipeptidi ekspresyonu veya aktivitesini azaltan bir heterolog nükleik asit dâhil etmeyi ya da SEKANS KOD NO.: 2 ile temsil edilen bir RING domaini içeren bir DA2 polipeptidi ekspresyonu veya aktivitesini azaltan bir inutasyon eklemeyi ve bir veya daha fazla transfore edilmis hücreden bitki rejenere etmeyi içerir.

5. Istem 4”e uygun bir yöntem olup; burada, heterolog nükleik asit, söz konusu bitki hücresine DA2 polipeptid ekspresyonunu azaltan bir supresör nükleik asit eksprese eder ve/veya burada, heterolog nükleik asit, bitkinin hücresinde bir DA2 polipeptidi ekspresyonunu veya

6. Onceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem olup; burada, bu bitkinin kendi büyüklügü, tohum büyüklügü ve/Veya organ büyüklügü, vahsi tip bitkilere kiyasla artmistir.

7. Istem l ilâ 6”dan herhaiigi birine uygun olan bir yöntem olup, azaltilmis DA2 ekspresyonuna veya aktivitesine sahip bitkinin ürün veya soydas bitkilerini eseysiz çogaltinayi veya büyütmeyi içerir.

8. Onceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem olup; burada, DA2 polipeptidi SEKANS KOD NO.: 36 ile temsil edilen bir birinci konsensus domaini içerir ve/Veya burada, DA2 polipeptidi SEKANS KOD NO.: 37 ile temsil edilen bir ikinci konsensus domaini içerir.

9. Önceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem olup; burada, DA2 polipeptidi SEKANS KOD NO.: 20 ilâ 35 ile temsil edilenlerden herhangi biriyle en az %20 oraninda sekans Özdesligine sahip bir aniino asit sekansi içerir.

10. Önceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem olup; burada, DAl proteini SEKANS KOD NO.: 41 ilâ 64 ile temsil edilenlerden herhangi biriyle en az %20 oraninda sekans özdesligine sahip bir sekans içerir.

11. Önceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem olup; burada, EODl polipeptidi SEKANS KOD NO.: 74 ilâ 90 ile temsil edilenlerden herhangi biriyle en az %20 oraninda sekans özdesligine sahip bir sekans içerir.

12. Istem 1 ilâ 1 l”den herhangi birine uygun bir yöntem olup; burada, bitki istege bagli olarak daiiiarli bir bitkidir; burada bu bitki Lithospernium erythrorhizon, Taxus spp, tütün, kabakgiller, havuç, lahana, kavun, kirmizi biber, üzüm asmasi, marul, çilek, kolza tohumu lahana, seker pancari, bugday, arpa, misir, pirinç, soya fasulyesi, bezelye, sorgum, ayçiçegi, domates, patates, biber, kasimpati, karanfil, keteii, kenevir ve çavdardan olusan bir gruptan seçilmis zirai bir bitkidir.

13. Hem SEKANS KOD NO.: 2 ile temsil edilen bir RING domaini içeren bir DA2 polipeptidi ekspresyonu veya aktivitesi azaltilmis, hem de bir DAl polipeptidi ya da bir DAl ve bir EODl polipeptidi ekspresyonu veya aktivitesi azaltilmis bir bitki olup; burada, bahsi geçen bir veya daha fazla DA2, DAl ve EODl polipeptidinin ekspresyoiiu veya aktivitesi, 0 bitkinin bir veya daha fazla hücresinin bünyesine bir heterolog nükleik asit dâhil etmek suretiyle azaltilir; burada, heterolog nükleik asit, bir veya daha fazla polipeptidin ekspresyonunu azaltan bir supresör nükleik asit eksprese eder ve burada, bu bitkinin birim alan basina tohum kütlesi, büyümesi ve/veya biyokütlesi, vahsi tipe kiyasla artmistir.