TR201901013T4 - BTK inhibitörleri olarak 4-imidazopiridazin-1-il-benzamidler ve 4-imidazotriazin-1-il-benzamidler. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, formüle (I) göre 6-5 üyeli kaynaşık piridin halkası bileşikleriyle veya bunların farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarıyla veya bu bileşikleri ihtiva eden farmasötik bileşimlerle ve bunların terapide kullanımlarıyla ilgilidir. Özellikle, mevcut buluş, 6-5 üyeli bir kaynaşık piridin halkası bileşiğinin, formül I'e göre Bruton Tirozin Kinaz (BTK) aracılı bozuklukların tedavisinde kullanımı ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME BTK INHIBITÖRLERI OLARAK 4-IMIDAZOPIRIDAZIN-1-IL-BENZAMIDLER VE 4- IMIDAZOTRIAZIN-1-IL-BENZAMIDLER Bulus Sahasi Mevcut bulus, 6-5 üyeli bir kaynasik piridin halkasi bilesigi, bu bilesigi içeren farmasötik bilesimler ve bunun terapide kullanimi ile ilgilidir. Özellikle, mevcut bulus, 6-5 üyeli bir kaynasik piridin halkasi bilesiginin, Bruton Tirozin Kinaz (BTK) aracili bozukluklarin tedavisinde kullanimi ile ilgilidir.

Bulusun Alt Yapisi Adaptif bagisiklik cevaplarinin olusturulmasinda B Ienfosit aktivasyonu kilit niteliktedir.

Bozulmus B Ienfosit aktivasyonu, pek çok otoimmün hastaligin ayirici isaretidir ve dolayisiyla bu bagisiklik cevabinin modülasyonu terapötik açidan ilgi çekicidir. B hücre terapilerinin otoimmün hastaliklardaki basarisi yakin zamanda ortaya koyulmustur.

Römatoid artrit (RA) hastalarinin Rituximab (anti-CDZO terapisi) ile tedavisi, su ana kadar kabul edilmis bir klinik terapidir. Daha yakin tarihli klinik deneme çalismalari, Rituximab ile tedavinin ayrica nükseden-iyilesen multipl skleroz (RRMS) ve sistemik göstermektedir. Bu basari, B hücre bagisikligini hedefleyen otoimmün hastaliklarda gelecekteki terapilerin potansiyelini de desteklemektedir.

Bruton tirozin kinaz (Btk), B hücrelerinde ve miyeloid hücrelerde eksprese edilen, Tec ailesine mensup bir non-reseptör protein kinazdir. Btk'nin, mast hücreleri üzerinde B hücre reseptörü (BCR) ve FcsR1 baglanmasi ile aktive olan yolaklari sinyalleme islevi iyi bilinmektedir. Ilave olarak, Tol benzeri reseptör sinyallemesinde bir alt akis (downstream) hedefi olarak Btk'nin bir islevi de önerilmistir. Insanda Btk'daki fonksiyonel mutasyonlar, pro ve pre-B hücre asamasi arasinda bir blokaj ile birlikte B hücre gelisiminde bir kusur ile karakterize olan ve XLA adi verilen primer bagisiklik yetmezligi hastaligina yol açmaktadir. Bu durum, insanlarda B Ienfositlerinin neredeyse tamamen yok olmasina yol açarak bütün siniflarda serum immünoglobulinin belirgin bir sekilde azalmasina sebep olmaktadir. Bu bulgular, otoimmün hastaliklarda oto- antikorlarin üretiminin regülasyonunda Btk'nin kilit rolünü desteklemektedir. Ilave olarak, Btk regülasyonu, pro-enflamatuvar sitokinlerin ve kemokinlerin B hücreleri tarafindan BCR ile endüklenen üretimini etkileyebilmekte olup, bu durum, otoimmün hastaliklarin tedavisinde Btk'nin genis bir potansiyele sahip oldugunu göstermektedir.

Btk'nin FcaR aracili mast hücre aktivasyonu için bildirilen regüle edici rolü ile birlikte, Btk inhibitörleri ayrica alerjik cevaplarin tedavisinde de bir potansiyel gösterebilir Dahasi, Btk'nin ayrica RANKL ile endüklenen osteoklast farklilasmasinda da rol kemik resorpsiyon bozukluklarinin tedavisi için de ilgi çekici olabilir.

Islevsiz B hücrelerinde önemli bir rolü olan diger hastaliklar B hücre maligniteleridir.

Gerçekten de anti-CDZO terapisi; folliküler Ienfoma, diffüz büyük B-hücre Ienfomasi ve kronik Ienfositik Iöseminin tedavisi için klinikte etkili bir sekilde kullanilmaktadir [Lim et regülasyonunda Btk'nin bildirilen rolü, B hücre lenfomalarinin tedavisinde de Btk inhibitörlerinin bir potansiyele sahip oldugunu göstermektedir. Btk inhibisyonunun, kronik aktif BCR sinyallemesi nedeniyle bilhassa B hücre Ienformalarinda anlamli 6-5 üyeli kaynasik piridin halkasi bilesiklerinin bazi siniflari kinaz inhibitörleri olarak tarif edilmistir, örnegin Imidazo[1,5-f][1,2,4]triazin bilesikleri Bildirilen Btk inhibitörlerinin bazilari Src ailesine mensup kinazlar üzerinde seçici degildir. Src ailesine mensup kinazlarin nakavtlarinda, özellikle de çift ve üçlü nakavtlarda önemli advers etkilerin bildirilmesi, Src ailesine mensup kinazlar üzerinde seçici olmayan Btk inhibitörlerinin gelistirilmesi açisindan engelleyici olarak görülmektedir. Hem Lyn yönünden eksik hem de Fyn yönünde eksik fareler, insan yönünden eksik fareler ayrica belirgin nörolojik kusurlar da göstermektedir. Lyn nakavt fareler ayrica alerjik benzeri fenotip göstermekte olup, bu durum Lyn'in, mast hücre duyarliligini ve alerji ile iliskili özellikleri kontrol etmek suretiyle IgE aracili alerjik cevabin genis bir negatif regülatörü olduguna isaret etmektedir [Odom et al., J. Exp. büyümesi (miyeloid genisleme) ve yaygin monosit/makrofaj tümörleri gelistirmektedir mast hücreleri ve miyeloid hücreleri ile birlikte Lyn yönünden eksik farelerde gözlemlenen artmis lg seviyeleri ile uyumludur.

Disi Src nakavt fareler, azalmis folikül gelisimi ve ovülasyon nedeniyle kisirdir [Roby et SrC'I'Fyn'l' ve Src/“Yes” seklindeki çift nakavtlar, hareket ve solunum üzerindeki etkiler ile birlikte siddetli fenotip göstermektedir. Sro“/'Fyn-"Yes"' seklindeki üçlü nakavtlar pp2459-2471]. Src/"Hck" osteopetroz, ekstramedüller hematopoez, anemi, Iökopeni gelistirmistir [Lowell et al., Dolayisiyla Src ailesine mensup kinazlarin birden fazlasini veya tamamini ayni anda inhibe eden bir inhibitör ciddi yan etkilere yol açabilmektedir.

Bulusun detayli açiklamasi Mevcut bulusun amaci, 6-5 üyeli kaynasik piridin halkasi bilesiklerini, bu bilesikleri içeren farmasötik bilesimleri ve bunlarin terapide kullanimini saglamaktir. Özellikle, mevcut bulus, 6-5 üyeli bir kaynasik piridin halkasi bilesiginin, Bruton Tirozin Kinaz (BTK) aracili bozukluklarin tedavisinde kullanimi ile ilgilidir.

Daha spesifik olarak mevcut bulus asagidaki yapiya sahip bir bilesik olan bir bilesigi: veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu saglamaktadir.

Mevcut bulus ayrica terapide kullanilmak üzere asagidaki yapiya sahip bir bilesik olan bir bilesigi: veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu saglamaktadir.

Mevcut bulus ayrica asagidaki yapiya sahip bir bilesik olan bir bilesigin bir kombinasyonunu: veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu ve bir baska ilaci saglamaktadir.

Mevcut bulus ayrica asagidaki yapiya sahip bir bilesik olan bir bilesigi içeren bir farmasötik bilesimi: veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir yardimci maddeyi saglamaktadir.

Burada ayrica formül I'e göre 6-5 üyeli kaynasik piridin halkasi bilesikleri veya bunlarin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlari da tarif edilmektedir. fal \:ZIB Formula I Bu formülde ikameler asagida tarif edildigi sekildedir: X; CH, N, 0 veya S'dir; Y; C(R6), N, 0 veya S'dir; 2; CH, N veya bagdir; A; CH veya N'dir; B1; N veya C(R7)'dir; 82; N veya C(R8)'dir; B3; N veya C(R9)'dur; B4; N veya C(R10)'dur; BC)alkildir; R2; H, (1-3C)alkil veya (3-7C)sikl0alkildir; R3; H, (1-6C)alkil veya (3-7)sikloalkil)'dir; veya R2 ve R3; bagli olduklari N ve C atomu ile birlikte, opsiyonel olarak bir veya birden fazla florin, hidroksil, (1-30)alkil, (1-3C)alk0ksi veya okso ile ikame edilmis bir (3- R4; H veya (1-SC)aIkiIdir; R5; H, halojen, siyano, (1-4C)alkil, (1-SC)alk0ksi, (3-BC)sikloalkildir; R5'in tüm alkil gruplari opsiyonel olarak bir veya birden fazla halojen ile ikame edilir veya R5; (6- 1OC)ariI veya (2-6C)heterosikloalkildir; R6; H veya (1-3C)alkildir; veya R5 ve R6 birlikte bir (3-7C)sikloalkenil veya (2-60)heterosikl0alkenil olusturabilir; bunlarin her biri opsiyonel olarak (1-30)alkil veya bir ya da birden fazla halojen ile ikame edilir; R7; H, halojen veya (1-30)alkoksidir; R8; H veya (1-3C)alkildir; veya R7 ve R8, bagli olduklari karbon atomu ile birlikte bir (6-1OC)aril veya (1-90)heteroaril olusturur; R9; H, halojen veya (1-SC)alkoksidir; R10; H, halojen veya (1-3C)alkoksidir; R11; bagimsiz olarak (1-6C)alkil, (2-öC)alkenil ve (2-60)alkinilden meydana gelen bir gruptan seçilmekte olup, her bir alkil, alkenil veya alkinil, opsiyonel olarak hidroksil, (1- 7C)sikl0alkoksi, (6-10C)aril veya (3-7C)heterosikloalkil arasindan seçilen bir veya birden fazla grup ile ikame edilir; veya R11; (1 -3C)alkiI-C(O)-S-(1-BC)alkildir; veya R11; opsiyonel olarak halojen veya siyano arasindan seçilen bir veya birden fazla grup ile ikame edilen (1-50)heteroarildir.

R12 ve R13; bagimsiz olarak (2-6C)alkenil veya (2-öC)aIkiniIden meydana gelen bir gruptan seçilmekte olup, her ikisi de opsiyonel olarak hidroksil, (1-4C)alkil, (3- YC)sikl0alkiI, [(1-4C)alkil]amino, di[(1-4C)alkil]amin0, (1-SC)alkoksi, (3-TC)sikloalkoksi, (6-1OC)aril veya (3-7C)heterosikloalkil arasindan seçilen bir veya birden fazla grup ile; veya opsiyonel olarak halojen ya da siyano arasindan seçilen bir veya birden fazla grupla ikame edilen (1-SC)heteroaril ile ikame edilir.

R14; bagimsiz olarak halojen, siyano veya (2-6C)alkenil veya (2-6C)alkinil'den meydana gelen bir gruptan seçilmekte olup, her ikisi de opsiyonel olarak hidroksil, (1- 7C)sikl0alkoksi, (heterosikl0alkil arasindan seçilen bir veya birden fazla grup ile ikame edilir.

Su kosullarla: X, Y, Z'nin 0 ila 2 atomu ayni anda bir heteroatom olabilir; X, Y arasindan seçilen bir atom 0 veya 8 oldugunda, 2 bir bagdir ve X, Y arasindan seçilen diger atom 0 veya 8 olamaz; Z; C veya N oldugunda, Y; C(R6) veya N'dir ve X; C veya N'dir; B1, 82, 83 ve B4'ün 0 ila 2 atomu N'dir.

Burada kullanildiklari sekliyle terimler asagidakilere atifta bulunmaktadir: (1-2C)Alkil; metil veya etil olmak üzere, 1 ila 2 karbon atomuna sahip bir alkil grubu anlamina gelir. (1-3C)Alkil; metil, etil, propil veya izopropil olmak üzere, 1-3 karbon atomuna sahip bir dallanmis veya dallanmamis alkil grubu anlamina gelir. (1-4C)Alkil; metil, etil, propil, izopropil, bütil, izobütil, sec-bütil ve tert-bütil olmak üzere 1-4 karbon atomuna sahip bir dallanmis veya dallanmamis alkil grubu olup, (1-3C)alkil gruplari tercih edilir. (1-5C)Alkil; örnegin metil, etil, propil, izopropil, bütil, izobütil, sec-bütil, tert-bütil, pentil ve izopentil olmak üzere 1-5 karbon atomuna sahip bir dallanmis veya dallanmamis alkil grubu olup, (1-4C)alkil gruplari tercih edilir. (1-GC)AlkiI; örnegin metil, etil, propil, izopropil, bütil, tert-bütil, n-pentil ve n- heksil olmak üzere 1-6 karbon atomuna sahip bir dallanmis veya dallanmamis alkil grubu anlamina gelmektedir. (1-50)alkil gruplari tercih edilmekte, (1- 4C)alkil en çok tercih edilmektedir. (1-ZC)AIkoksi, 1-2 karbon atomuna sahip bir alkoksi grubu anlamina gelmekte olup, alkil kismi, daha önce tarif edilenle ayni anlama sahiptir. (1-3C)Alkoksi, 1-3 karbon atomuna sahip bir alkoksi grubu anlamina gelmekte olup, alkil kismi, daha önce tarif edilenle ayni anlama sahiptir. (1-ZC)alk0ksi gruplari tercih edilmektedir. (1-4C)Alk0ksi, 1-4 karbon atomuna sahip bir alkoksi grubu anlamina gelmekte olup, alkil kismi, daha önce tarif edilenle ayni anlama sahiptir. (1-3C)alkoksi gruplari tercih edilmekte, (1-2C)alkoksi gruplari en çok tercih edilmektedir. (2-4C)Alkenil; etenil, 2-propenil, izobutenil veya 2-butenil gibi, 2-4 karbon atomuna sahip bir dallanmis veya dallanmamis alkenil grubu anlamina gelir. (2-6C)Alkenil; etenil, 2-butenil ve n-pentenil gibi, 2-6 karbon atomuna sahip bir dallanmis veya dallanmamis alkenil grubu anlamina gelir. (2-4C)alkenil gruplari tercih edilmektedir. (2-4C)Alkinil; etinil, 2-propinil veya 2-butinil gibi, 2-4 karbon atomuna sahip bir dallanmis veya dallanmamis alkinil grubu anlamina gelir. (2-60)Alkinil; etinil, propinil, n-butinil, n-pentinil. izopentinil, izoheksinil veya n- heksinil gibi, 2-6 karbon atomuna sahip bir dallanmis veya dallanmamis alkinil grubu anlamina gelir. (2-4C)alkinil gruplari tercih edilmektedir. (3-60)Sikloalkil; siklopropil, siklobütil, siklopentil veya sikloheksil olmak üzere, 3-6 karbon atomuna sahip bir sikloalkil grubu anlamina gelir. (3-7C)Sikl0alkil; siklopropil, siklobütil, siklopentil, sikloheksil veya sikloheptil olmak üzere, 13-? karbon atomuna sahip bir sikloalkil grubu anlamina gelir. (2-6C)Heterosikloalkil; 2-6 karbon atomuna, tercihen 3-5 karbon atomuna ve N, O ve/veya S arasindan seçilen ve eger uygunsa bir heteroatom veya bir karbon atomu araciligiyla baglanan bir veya iki heteroatoma sahip bir heterosikloalkil grubu anlamina gelir. Tercih edilen heteroatomlar N veya O'dur. Tercih edilenler piperidin, morfolin, pirrolidin ve piperazin'dir. En tercih edilen (2- GC)heterosikIoalkil pirrolidin'dir. Heterosikloalkil grubu eger uygunsa bir heteroatom ile baglanabilir. (3-7C)Heterosikloalkil; 3-7 karbon atomuna, tercihen 3-5 karbon atomuna ve N, O ve/veya S arasindan seçilen bir veya iki heteroatoma sahip bir heterosikloalkil anlamina gelir. Tercih edilen heteroatomlar N veya O'dur. Tercih edilen (3-7C) heterosikloalkil gruplari azetidinil, pirrolidinil, piperidinil, homopiperidinil veya morfolinil'dir. Daha tercih edilen (3-7C)heterosikloalkil gruplari piperidin, morfolin ve pirrolidindir. Heterosikloalkil grubu eger uygunsa bir heteroatom ile baglanabilir. (3-7C)Sikl0alkil; daha önce tarif edilenle ayni anlama sahip olan ve bir halka karbon atomu vasitasiyla bir ekzosiklik oksijen atomuna baglanan, 3-7 karbon atomuna sahip bir sikloalkil grubu anlamina gelir. (6-1OC)Aril; fenil, naftinil, tetrahidronaftil veya indenil gibi. 6-10 karbon atomuna sahip bir aromatik hidrokarbon grubu anlamina gelir. Tercih edilen (6-1OC)ariI grubu fenil'dir. (1-5C)Heteroaril; 1-5 karbon atomuna ve N, O ve/veya S arasindan seçilen 1-4 heteroatoma sahip bir ikame edilmis veya ikame edilmemis aromatik grup anlamina gelir. (1-50)heteroaril opsiyonel olarak ikame edilebilir. Tercih edilen (1-5C)heteroaril gruplari tetrazolil, imidazolil, tiadiazolil, piridil, pirimidil, triazinil, tienil veya furil'dir, daha çok tercih edilen (1-5C)heter0aril ise pirimidil'dir. (1-90)Heteroaril; 1-9 karbon atomuna ve N, O ve/veya S arasindan seçilen 1-4 heteroatoma sahip bir ikame edilmis veya ikame edilmemis aromatik grup anlamina gelir. (1-9C)heteroaril opsiyonel olarak ikame edilebilir. Tercih edilen (1-9C)heteroaril gruplari kuinolin, izokuinolin ve indoldür. atomu içeren bir alkil grubu ile mono-ikame edilmis bir amino grubu anlamina gelir. Tercih edilen [(1-4C)alkil]amino grubu metilaminodur.

Di[(1-4C)alkil]amino, daha önce tarif edilenle ayni anlama sahip, her biri 1-4 karbon atomu içeren alkil grubu/gruplari ile di-ikame edilmis bir amino grubu anlamina gelir. Tercih edilen di[(1-4C)alkil]amino grubu dimetilaminodur.

Halojen; florin, klorin, bromin veya iyodin anlamina gelir. (1-3C)AlkiI-C(O)-S(1-30)alkil, daha önce tarif edilenle ayni anlama gelen, alkil gruplarinin her birinin 1 ila 3 karbon atomuna sahip oldugu bir alkil-karbonil,tiy0- alkil grubu anlamina gelir. (3-7C)Sikloalkenil, 3-7 karbon atomuna, tercihen 5-7 karbon atomuna sahip bir silkoalkenil anlamina gelir. Tercih edilen (3-7C)sikloalkenil gruplari siklopentenil veya sikloheksenil'dir. Sikloheksenil gruplari en çok tercih edilir. (2-6)Heterosikloalkenil, 2-6 karbon atomuna, tercihen 3-5 karbon atomuna ve N, O ve/veya S arasindan seçilen 1 heteroatoma sahip bir heterosikloalkenil grubu anlamina gelir. Tercih edilen (2-6C)heterosikloalkenil gruplari oksisikloheksenil ve azasikloheksenil grubudur. Çok fonksiyonlu gruplara ait yukaridaki tanimlarda ek noktasi son gruptur. Bir Ikamenin taniminda, bahsi geçen ikamenin "tüm alkil gruplarinin" opsiyonel olarak ikame edilmis oldugu belirtildiginde, bu ayrica bir alkoksi grubunun alkil kismini da içerir.

Formül I'in bir halkasindaki bir daire, halkanin aromatik olduguna isaret eder.

Olusan halkaya bagli olarak, eger X veya Y içinde mevcutsa, nitrojen bir hidrojen tasiyabilir. asilmamasi ve ikamenin bir stabil bilesik ortaya çikarmasi sartiyla belirtilen atom/atomlar üzerindeki bir veya daha fazla hidrojenin, gösterilen grup arasindan yapilan bir seçimle degistirildigi anlamina gelmektedir. Kombinasyonlarin ancak ve ancak stabil bilesikler ortaya çikarmasi halinde, ikamelerin ve/veya degiskenlerin kombinasyonlarina izin verilir. "Stabil bilesik" veya "stabil yapi", faydali derecede bir safliga sahip olacak sekilde, bir reaksiyon karisimindan izolasyona direnebilecek ve etkili bir terapötik ajan olarak formüle edilebilecek kadar dayanikli olan bir bilesik veya yapi olarak tanimlanir. opsiyonel ikame anlamina gelir. 2-il)benzamid ile ilgilidir.

Bulusun bilesigi Btk kinaz aktivitesini inhibe eder. Bulusun bilesigi 10 nM'den az bir ECSO'ye sahiptir.

ECSO terimi, test bilesiginin, in vitro olarak maksimum etkisinin %50 inhibisyonu için gereken konsantrasyonu anlamina gelir.

Kinaz aktivitesinin inhibisyonu, Fosfokimyasallar için Immobilize Metal Tayini (IMAP) adli tayin kullanilarak ölçülebilir. IMAP, fosforile peptit substratlarinin afinite yakalamasina dayanan bir homojen floresans polarizasyon (FP) tayinidir. IMAP, bir protein kinaz tarafindan fosforilasyon ile, trivalan metal kompleksleri ile türevlestirilen lMAP nanopartikülleri adli yapilara baglanan floresin etiketli peptit substratlarini kullanir. Baglanma, peptidin moleküler hareketinin hizinda bir degisiklige yol açar ve substrat peptidine baglanan floresin etiket için gözlenen FP degerinde bir artis ortaya çikarir (Gaudet et al. A homogeneous florescence polarization assay adaptable for a range of protein serine/threonine and tyrosine kinases. J. Biomol. Screen (2003) 8, 164-175).

Bulusun bilesigi, kendileri de bu bulusun kapsamina giren tuzlar olusturabilir. Bu bulusun bilesigine yapilan atiflarin, aksi belirtilmedikçe, bunun tuzlarina da atifta bulundugu anlasilacaktir. Burada kullanildigi sekliyle "tuz(lar)" terimi, inorganik ve/veya organik asitler ile olusturulan asidik tuzlari ve ayrica inorganik ve/veya organik bazlar ile olusturulan bazik tuzlari belirtir. Bulusun kapsami içinde kullanilan bu tür asidik ve bazik tuzlar farmasötik olarak kabul edilebilir (yani toksik olmayan, fizyolojik olarak kabul edilebilir) tuzlardir. Bulusun bilesiginin tuzlari, örnegin, tuzun çökeldigi bir vasat içinde veya sulu bir vasat içinde, bulusun bilesiginin bir miktar, örnegin esdeger bir miktar asit veya baz ile reaksiyona sokulmasi ve ardindan Iiyofilizasyon uygulanmasi suretiyle olusturulabilir. Örnek niteligindeki asit ilave tuzlari asetatlari, askorbatlari, benzoatlari, benzensülfonatlari, bisülfatlari, boratlari, butiratlari, sitratlari, kamforatlari, kamforsülfonatlari, fumaratlari, hidroklorürleri, hidrobromürleri, hidroiyodürleri, Iaktatlari, maleatlari, metansülfonatlari, naftalensülfonatlari, nitratlari, oksalatlari, fosfatlari, propiy0natlari, salisilatlari, suksinatlari, sülfatlari, tartaratlari, tiyosiyanatlari, toluensülfonatlari (tosilatlar olarak da bilinir) ve benzerlerini içerir. Ilave olarak, bazik farmasötik bilesiklerden farmasötik olarak faydali tuzlarin olusturulmasi için genellikle uygun oldugu düsünülen asitler örnegin P. Stahl et al., Camille G. (eds.) Handbook of Pharmaceutical `Salts. Properties, Selection and Use (2002) Zurich: Wiley-VCH; S.

Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York; ve The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C. websitesi) içinde ele alinmistir. Örnek niteligindeki bazik tuzlar, amonyum tuzlarini, sodyum, Iityum gibi alkali metal tuzlarini, potasyum tuzlarini, kalsiyum ve magnezyum tuzlari gibi alkalin toprak metali tuzlarini, disikloheksilaminler, t-bütil aminler gibi organik bazli tuzlari (örnegin organik aminler) ve arginin, Iizin gibi amino asitli tuzlari ve benzerlerini içerir. Bazik nitrojen içeren gruplar, düsük alkil halidler (örn. metil, etil ve bütil klorürler, bromürler ve iyodürler), dialkil sülfatlar (örn. dimetil, dietil ve dibütil sülfatlar), uzun zincirli halidler (örn. desil, Iauril ve stearil klorürler, bromürler ve iyodürler), aralkil halidler (örn. benzil ve fenetil bromürler) ve digerleri gibi ajanlarla kuaternize edilebilir.

Formül I'in bilesikleri asimetrik veya kiral merkezleri içerebilir ve dolayisiyla farkli stereoizomerik formlarda mevcut olabilir. Diastereomerik karisimlar, örnegin kromatografi ve/veya fraksiyonal kristalizasyon gibi, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen yöntemler ile, fiziksel kimyasal farkliliklarina dayanilarak bireysel diastereomerlerine ayrilabilir. Enansiyomerler, enansiyomerik karisimin, uygun bir optik olarak aktif bilesik (örn. bir kiral alkol veya Mosher asit klorür gibi kiral yardimci) ile reaksiyon yoluyla bir diastereometik karisima dönüstürülmesi, diastereomerlerin ayrilmasi ve bireysel diastereomerlerin karsilik gelen saf enansiyomerlere dönüstürülmesi (örn. hidrolize edilmesi) ile ayrilabilir.

Bulusun bilesiginin bireysel stereoizomerleri örnegin diger izomerleri büyük ölçüde içermeyebilir veya örnegin rasematlar olarak diger bütün veya seçilen diger stereoizomerle karistirilabilir.

Bulusun bilesigi hidratlari veya solvatlari olusturabilir. Teknikte uzman kisiler, yüklü bilesiklerin, su ile liyofilize edildiginde hidratli türler olusturdugunu veya uygun bir organik çözücü içeren bir çözelti içinde konsantre edildiginde solvatli türler olusturdugunu bilmektedir. Bu bulusun bilesigi, bilesigin hidratlarini veya solvatlarini Bulusun bilesigi, solvatlanmamis olarak veya su, etanol ve benzerleri gibi farmasötik olarak kabul edilebilir çözücülerle solvatlanmis formlarda mevcut olabilecek olup, bulusun hem solvatlanmis hem de solvatlanmamis formlari kapsamasi amaçlanmistir. olarak iliskilendirilmesi anlamina gelmektedir. Bu fiziksel iliskilendirme, hidrojen baglanmasi da dâhil olmak üzere, degisen derecelerde iyonik ve kovalent baglanmayi içerir. Belirli durumlarda, örnegin bir veya birden fazla çözücü molekülü, kristalin katinin kristal kafesi içine dâhil edildiginde, solvat izolasyon kabiliyetine sahip olacaktir. sinirlayici olmayan örnekleri etanolatlari, metanolatlari ve benzerlerini içerir. "Hidrat" bir solvat olup, burada çözücü molekülü H20'dur.

Mevcut bulus ayrica bulusun bilesigini veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarini, farmasötik olarak kabul edilebilir yardimci maddelerle ve opsiyonel olarak diger terapötik ajanlarla karisim halinde ihtiva eden bir farmasötik bilesim ile de ilgilidir.

Yardimci maddeler, bilesimin diger maddeleri ile uyumlu olmak ve bunu kullananlar için zararli olmamak bakimindan "kabul edilebilir" olmalidir.

Bulus ayrica bulusun bir bilesigini bir veya birden fazla baska ilaç ile kombinasyon halinde içerir.

Bilesimler, örn. oral, sublingual, subkütan, intravenöz, intramusküler, nazal, lokal veya rektal ve benzeri uygulama için uygun olanlari, tamami uygulama için birim dozaj formunda olacak sekilde içerir.

Oral uygulama için, aktif madde, tabletler, kapsüller, tozlar, granülatlar, çözeltiler, süspansiyonlar ve benzeri gibi ayri birimler halinde sunulabilir.

Parenteral uygulama için, bulusun farmasötik bilesimi, birim doz veya çoklu doz kaplar içinde, örn. enjeksiyon sivilari, önceden belirlenmis miktarlarda, örnegin kapali flakonlar ve ampuller içinde sunulabilir ve ayrica dondurularak kurutulmus (Iiyofilize edilmis) sekilde, kullanim öncesinde yalnizca steril sivi tasiyicinin, örn. suyun ilavesini gerektirecek biçimde saklanabilir.

Aktif ajan, örn. standart referans olan Gennaro, A.R. et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th Edition., Lippincott Williams & Wilkins, 2000, bkz. özellikle Part 5: Pharmaceutical Manufacturing) içinde tarif edildigi sekilde, bu tür farmasötik olarak kabul edilebilir yardimci maddelerle karistirildiginda, haplar, tabletler gibi kati dozaj birimleri halinde sikistirilabilir veya kapsüller ya da supozituvarlar halinde islenebilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir sivilar araciligiyla aktif ajan bir sivi bilesim olarak, örn. bir enjeksiyon preparati olarak, bir çözelti, süspansiyon, emülsiyon formunda veya bir sprey, örn. bir nazal sprey olarak uygulanabilir.

Kati dozaj birimleri yapmak için, dolgular, renklendiriciler, polimerik baglayicilar ve benzerleri gibi geleneksel katki maddelerinin kullanimi düsünülmektedir. Genel olarak, aktif bilesigin islevi ile etkilesmeyen herhangi bir farmasötik olarak kabul edilebilir katki maddesi kullanilabilir. Bulusun aktif ajaninin kati bilesimler olarak kendisi ile birlikte uygulanabilecegi uygun tasiyicilar, uygun miktarlarda kullanilan Iaktozu, nisastayi, selüloz türevlerini ve benzerlerini veya bunlarin karisimlarini içerir. Parenteral uygulama için, propilen glikol veya bütilen glikol gibi farmasötik olarak kabul edilebilir dagitma ajanlari ve/veya islatma ajanlari içeren sulu süspansiyonlar, izotonik salin çözeltileri ve steril enjektabl çözeltiler kullanilabilir.

Bulus ayrica burada daha önce tarif edildigi gibi bir farmasötik bilesimi, bahsi geçen bilesim için uygun olan ambalaj materyali ile kombinasyon halinde içermekte olup, bahsi geçen ambalaj materyali, bilesimin burada daha önce tarif edilen kullanima yönelik olarak kullanilmasi için talimatlari içerir.

Aktif maddenin veya bunun farmasötik bir bilesiminin tam dozu ve uygulama rejimi ilgili bilesige, uygulama yoluna, ilacin uygulanacagi her bir gönüllünün yasina ve durumuna Genel olarak, parenteral uygulama, absorpsiyona daha bagimli olan diger uygulama yöntemlerine kiyasla daha düsük dozajlar gerektirir. Ancak, Insanlar için bir dozaj tercihen her bir kg vücut agirligi için 0.0001-25 mg içerir. Istenen doz, tek doz olarak veya gün boyunca uygun araliklarla uygulanan çoklu alt dozlar seklinde ya da kullanicilarin kadin oldugu durumlarda, adet döngüsü boyunca uygun günlük araliklarla uygulanan dozlar halinde sunulabilir. Dozaj ve ayrica uygulama rejimi, kadin ve erkek kullanicilar arasinda farklilik gösterebilir.

Bulusun bilesiginde atomlar dogal izotopik bolluklarini gösterebilir veya atomlarin biri veya birden fazlasi, ayni atom numarasina, ama dogada baskin sekilde bulunan atomik kütle veya kütle numarasindan farkli olan bir atomik kütle veya kütle numarasina sahip belirli bir izotop içinde yapay olarak zenginlestirilebilir. Mevcut bulusun, bulusun bilesiginin tüm uygun izotopik varyasyonlarini içermesi amaçlanmistir. Örnegin, hidrojenin (H) farkli izotopik formlari, protiyum (H) ve döteryumu (2H) içerir. Protiyum, dogada bulunan baskin hidrojen izotopudur. Döteryum için zenginlestirme, in vivo yarilanma ömrünün artirilmasi veya dozaj gerekliliklerinin azaltilmasi gibi çesitli terapötik avantajlar getirebilir veya biyolojik numunelerin karakterizasyonu için bir standart olarak faydali bir bilesik saglayabilir. Bulusun izotopik olarak zenginlestirilmis bir bilesigi, teknikte uzman kisilerin iyi bildigi geleneksel teknikler veya burada Semalar ve Örnekler içinde tarif edilenlere benzer prosesler ile, izotopik olarak zenginlestirilmis uygun reaktifler ve/veya ara ürünler kullanilarak, gereksiz deneylere girisilmeden hazirlanabilir.

Bulusa göre bilesik, terapide kullanilabilir.

Burada ayrica, Btk aracili hastaliklarin veya Btk aracili saglik sorunlarinin tedavisinde kullanilacak bir ilacin üretimi için genel formül l'e sahip, 6-5 üyeli kaynasik piridin halkasi bilesiklerinin veya bunlarin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarinin kullanimi da tarif edilmektedir.

Burada ayrica, T hücrelerinin önemli bir rol oynadigi kronik B hücre bozukluklarinin tedavisinde kullanilacak bir ilacin üretimi için genel formül l'e sahip, 6-5 üyeli kaynasik piridin halkasi bilesiklerinin veya bunlarin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarinin kullanimi da tarif edilmektedir.

Burada ayrica, Btk aracili hastaliklarin veya saglik sorunlarinin tedavisinde kullanilacak bir ilacin üretimi için genel formül I'e sahip, 8-amino-imidazo[1,5-a]pirazin ve 4-amino- imidazo[1,5-f][1,2,4]triazin bilesikleri gibi 6-5 üyeli kaynasik piridin halkasi bilesiklerinin kullanimi da tarif edilmektedir. Bunlar, kronik aktif B hücre reseptör sinyallemeden kaynaklanan B hücre lenfomalarinin tedavisini içermektedir, ancak bunlarla sinirli degildir.

Bulusa göre bilesik, Bruton Tirozin Kinaz (Btk) aracili bozukluklar gibi hastaliklari tedavi etmek veya önlemek için terapilerde kullanilabilir. Burada kullanildigi sekliyle Btk aracili bozukluklar veya Btk aracili saglik sorunlari, B hücrelerinin, mast hücrelerinin, miyeloid hücrelerinin veya osteoklastlarin merkezi bir rol oynadigi herhangi bir hastalik durumu veya baska bir menfî durum anlamina gelir. Bu hastaliklar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, immün, otoimmün ve enflamatuvar hastaliklari, alerjileri, enfeksiyöz hastaliklari, kemik resorpsiyon bozukluklarini ve proliferatif hastaliklari içerir.

Mevcut bulusun bilesigi ile tedavi edilebilen veya önlenebilen immün, otoimmün ve enflamatuvar hastaliklar, romatizmal hastaliklari (örn., romatoid artrit, psoriatik artrit, enfeksiyöz artrit, progresif kronik artrit, deforme edici artrit, osteoartrit, traumatik artrit, gut artriti, Reiter sendromu, polikondrit, akut sinovit ve spondilit), glomerülonefriti (nefrotik sendromlu veya nefrotik sendromsuz), otoimmün hematolojik bozukluklari (örn. hemolitik anemi, aplazik anemi, idiyopatik trombositopeni ve nötropeni), otoimmün gastriti ve otoimmün enflamatuvar bagirsak hastaliklarini (örn. ülseratif kolit ve Crohn hastaligi), konaga karsi greft hastaligini, allogreft reddini, kronik tiroiditi, Grave hastaligini, sklerodermayi, diyabeti (tip I ve tip Il), aktif hepatiti (akut ve kronik), pankreatiti, primer billiyer sirozu, miyastenia gravisi, multipl sklerozu, sistemik Iupus eritematozusu, psöryazisi, atopik dermatiti, kontakt dermatiti, egzamayi, cilt yaniklarini, vasküliti (örn. Behçet hastaligi) kronik böbrek yetmezligini, Stevens-Johnson sendromunu, enflamatuar agriyi, idiyopatik spruyu, kaseksiyi, sarkoidozu, Guillain- Barre sendromunu, üveiti, konjonktiviti, kerato konjonktiviti, ortakulak iltihabini, periodontal hastaligi, pulmoner interstisyel fibrozu, astimi, bronsiti, riniti, sinüziti, pnömokonyozu, pulmoner yetmezlik sendromunu, pulmoner amfizemi, pulmoner fibrozu, silikozu, kronik enflamatuvar pulmoner hastaligi (örn. kronik obstrüktif akciger hastaligi) ve solunum yollarindaki diger enflamatuvar veya obstrüktif hastaliklari içerir.

Tedavi edilebilecek veya önlenebilecek alerjiler, baskalarinin yani sira, gidalara, gida katkilarina, böcek zehirlerine, ev tozu akarlarina, polene, hayvan materyallerine ve temas alerjenlerine karsi alerjileri, tip I asiri duyarlilik alerjik astimi, alerjik riniti, alerjik konjon ktiviti içerir.

Tedavi edilebilecek veya önlenebilecek enfeksiyöz hastaliklar, baskalarinin yani sira, sepsisi, septik soku, endotoksik soku, Gram-negatif bakteriler ile sepsisi, sigellozu, menenjiti, serebral malaryayi, zatürreeyi, tüberkülozu, viral miyokarditi, viral hepatiti (hepatit A, hepatit B ve hepatit C), HIV enfeksiyonunu, sitomegalovirüsten kaynaklanan retiniti, influenzayi, herpesi, ciddi yaniklarla iliskili enfeksiyonlarin tedavisini, enfeksiyonlardan kaynaklanan miyaljileri, enfeksiyonlara sekonder kaseksiyi ve lentivirüs, kaprin artritik virüs, visna-maedi virüsü, felin bagisiklik yetmezligi virüsü, bovin bagisiklik yetmezligi virüsü veya kanin bagisiklik yetmezligi virüsü gibi veteriner viral enfeksiyonlari içerir.

Tedavi edilebilecek veya önlenebilecek kemik resorpsiyon bozukluklari, baskalarinin yani sira, osteoporozu, osteoartriti, traumatik artriti, gut artritini ve çoklu miyelomla iliskili kemik bozukluklarini içerir.

Tedavi edilebilecek veya önlenebilecek proliferatif hastaliklar, baskalarinin yani sira, non-Hodgkin lenfomayi (özellikle diffüz büyük B-hücreli lenfoma (DLBCL) ve manto hücreli lenfoma (MCL) alt tipleri), B hücreli kronik lenfositik Iösemiyi ve olgun B hücreli akut Ienfoblastik Iösemiyi (ALL), özellikle de ALL'yi içerir. Özellikle, bulusun bilesigi, kronik aktif B hücre reseptör sinyallemeden kaynaklanan B hücre lenformalarinin tedavisi için kullanilabilir.

Kinaz aktivitesinin inhibisyonu, Fosfokimyasallar için Immobilize Metal Tayini (IMAP) kullanilarak ölçülebilir. IMAP, fosforile peptit substratlarinin afinite yakalamasina dayanan bir homojen floresans polarizasyon (FP) tayinidir. IMAP, bir protein kinaz tarafindan fosforilasyon ile, trivalan metal kompleksleri ile türevlestirilen IMAP nanopartikülleri adli yapilara baglanan floresin etiketli peptit substratlarini kullanir.

Baglanma, peptidin moleküler hareketinin hizinda bir degisiklige yol açar ve substrat peptidine baglanan floresin etiket için gözlenen FP degerinde bir artis ortaya çikarir.

Btk aktivitesi ayrica Ramos hücreleri gibi B hücre çizgilerinde veya primer hücre tayinlerinde de belirlenebilir, örn. PBMC veya insan, maymun, siçan veya fareden tam kan ya da maymun, siçan veya fareden izole edilen splenositler. Btk aktivitesinin inhibisyonu, anti-lgM ile endüklenen MIP, H202 ile endüklenen Btk ve PLCv2 fosforilasyon (Ramos hücreleri) veya anti-IgM ile endüklenen B hücre çogalmasi veya primer B hücreleri (PBMC ve splenositler) üzerinde CD86 ekspresyonu ölçülerek arastirilabilir.

Btk aktivitesinin regülasyonu, ayrica aktivasyon FcsR ile endüklenen degranülasyon, sitokin üretimi ve CD63 ile endüklenen hücre yüzey ekspresyonu sonrasinda insan, maymun, siçan veya fare mast hücreleri üzerinde de belirlenebilir. Dahasi, Btk aktivitesinin regülasyonu, M-CSF ile tedavi sonrasinda osteoklastlara farklilastirilan CD14+ monositler üzerinde belirlenebilir ve RANKL ile aktive edilebilir.

Btk inhibitörlerinin aktivitesi, in vivo uygulama sonrasinda fare splenositleri içinde arastirilabilir. Tipik bir deneyde farelere bilesigin uygulanmasindan 3 saat sonra ötenazi uygulanabilir. Splenosit izolasyonu için tedavi edilen farelerden dalaklar ekstrakte edilebilir. Splenositler 96 kuyulu kültür plakalari içinde plakalanabilir ve baska bilesik eklenmeden anti-IgM ile uyarilabilir. Anti-IgM ile endüklenen B hücre stimülasyonu ve bunun Btk inhibitörleri ile inhibisyonu, B hücre çogalmasi, MIP1B üretimi veya CD19+ splenosit B hücreleri üzerinde CD86 ekspresyonu ile ölçülebilir.

Btk inhibitörlerinin etkililigi ayrica fare kolajeni ile endüklenen artrit modelinde, hastalik baslangici sonrasi tedavi baslangici, hastalik puaninin ölçülmesi, kemik hasari ve kikirdak hasarinin X-isini analizi ve eklemlerin histolojisi ile bir terapötik protokol kullanilarak da arastirilabilir.

Btk inhibitörlerinin, aktive edilmis mast hücrelerinin regülasyonu üzerindeki etkililigi, pasif kütanöz anafilaksi modeli kullanilmak suretiyle in vivo olarak arastirilabilir.

Btk inhibitörlerinin kemik resorpsiyonu üzerindeki In vivo etkisi siçan OVX modeli kullanilarak arastirilabilir. Bu modelde ovariyektomi yapilmis hayvanlar, bir Btk inhibitörü kullanilarak regüle edilebilecek olan osteoporoz semptomlari gelistirmektedir.

Genel Sentez Mevcut bulusun 8-amino-imidazo[1,5-a]pirazin türevi ve 4-amino-imidazo[1,5- f][1,2,4]triazin türevleri, organik kimya tekniginde iyi bilinen yöntemlerle hazirlanabilir.

Bkz. örnegin J. March, 'Advanced Organic Chemistry 4th Edition, John Wiley and Sons. Sentez dizileri sirasinda, ilgili moleküllerin herhangi biri üzerindeki duyarli veya reaktif gruplari korumak gerekli olabilir ve/veya istenir. Bu, T.W Greene and P.G.M Wutts 'Protective Groups in Organic Synthesis' 3rd Edition, John Wiley and Sons, 1999 içinde tarif edilenler gibi, geleneksel koruma gruplari araciligiyla basarilir. Koruyucu gruplar, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak uygun bir müteakip basamakta opsiyonal olarak uzaklastirilir.

Reaksiyon ürünleri, eger istenirse, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, filtrasyon, distilasyon, kristalizasyon, kromatografi ve benzeri konvansiyonel teknikler kullanilarak opsiyonel olarak izole edilir ve saflastirilir. Bu tür materyaller, fiziksel sabitler ve spektrum verileri de dâhil olmak üzere konvansiyonel araçlar kullanilarak opsiyonel olarak karakterize edilir.

R1-R5'in daha önce tanimlanmis anlamlara geldigi, Formül I'in 8-amino-imidazo[1,5- a]pirazin bilesikleri, sema I'de gösterilen genel sentez yolu ile hazirlanabilir.

Raum-Ni \ ` _ ` R/ O N\R2 Poci R/ Brcimmasyon Hidrojen Pîlf'IRJQRPV-'CODH ' Ps ajani Birlestirme alani Ö / R5 y R5 v R/N / NH'û'PrOH K/N / Pd katilizorleri i\/N k/N / Rgn/Pg RÄN/Pg_ ::mk asi it R4 /F'g Islevsellest rme p,, F” R3 \ R3 \ R3 R3 \ VI vii ix i Sema I 3-kloropirazin-2-karb0nitril'in (II) indirgenmesi, (3-klor0pirazin-2-il)metanamin (III) saglamak için uygun bir katalizör sistemi ve çözücü, örnegin Raney-Nickel varliginda hidrojenasyon ile elde edilebilir. Bu, uygun sekilde amino ile korunmus amino asit ile reaksiyona sokulabilir. Cbz-N(R2)CR3R4)COOH'un reaksiyonu, N-((3-kloropirazin-2- il)metil)amid (IV) olusturmak için DMF, THF veya DCM gibi bir çözücü içinde, DIPEA, N-metilmorfolin, 4-DMAP veya trietilamin gibi bir baz varliginda ve PyBOP, TBTU, EDCI veya HATU gibi bir eslestirme reaktifi varliginda gerçeklestirilebilir. Kloropirazin siklizasyonu (IV), 8-kloroimidazo[1,5-a]pirazin türevleri (V) saglamak için isitma kosullari altinda fosfor oksiklorid gibi yogusma reaktifleri kullanilarak gerçeklestirilebilir.

Müteakip brominasyon, formül Vl'nin bilesiklerini elde etmek için uygun sicaklikta DCM veya DMF gibi uygun bir çözücü içinde bromin veya N-bromosuksinimid kullanilarak elde edilebilir. 8-Amin0imidazo[ içinde, artirilmis sicaklikta izopropanol içinde amonyak (gaz) kullanilarak bilesiklerden (VI) hazirlanabilir. Formül lX'un bilesikleri, uygun bir paladyum katalizör sistemi ve çözücü varliginda uygun bir boronik asit veya pinakol ester (VIII) kullanilarak formül Vll'nin bilesiklerinden hazirlanabilir, örnegin dioksan/su içinde potasyum karbonat varliginda bis(difenilfosfino)ferrosen paladyum(ll)klorür kompleksi veya tetrakis (trifenilfosfin)paladyum(0) formül lX'un bilesiklerini saglar. Son olarak, bilesiklerin koruyucu grubunun Formül IX ile klivajlanmasi, islevsellestirme sonrasinda, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak önceden tanimlanmis anlamlara sahip uygun basliklar ile formül I'in bilesiklerini saglayan korunmamis amini ortaya çikarmaktadir. Böyle bir koruyucu stratejinin bir örnegi, %33 HBr/HOAc veya kons. HCI ile koruyucunun uzaklastirilmasi sonrasinda, kullanilan amino asitlerden amini korumak için benziloksikarbonil koruyucu grubun kullanimidir.

HN(R2)CR3R4)COOH amino asitleri ticari olarak mevcuttur veya bunlar, benziloksikarbonil veya tert-bütiloksikarbonil gibi koruyucu gruplari saglamak için, uzman bir organik kimyacinin iyi bildigi yöntemler kullanilarak kolayca hazirlanabilir.

Pinakol esterleri olusturmak veya boronik asitleri ya da pinakol esterlerini 1- bromoimidazo[1,5-a]pirazin-8-amin ile eslestirmek için paladyum katalizörleri ve kosullari, uzman bir organik kimyaci tarafindan iyi bilinmektedir, bkz. örnegin Ei-ichi Negishi (Editor), Armin de Meijere (Associate Editor), Handbook of Organopalladium Chemistry for Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 2002.

Rq-Rs'in daha önce tanimlanmis anlamlara geldigi, Formül l'in 4-amino-imidazo[1,5- f][1,2,4]triazin bilesikleri, sema Il'de gösterilen genel sentez yolu ile hazirlanabilir.

H7N N/ Pumnyininlicooii HRN N/ 0 \22 H!" N/ Fg'eakmi MIN N/ F Birlestirme alani / / Q R4 R3 R4 N R4 N R3 \ R3 \ R5 v R5 v 0 NH, i/z N-L 1 /B im) = /a_.

Pisisiidilriiwm i.' r î` Korumasii RN/N / N" " OH \N/N / Pd kataiizörieri \,`/N / _" \,,/N / /î'g /PQ baz /PQ islevseilestirme /R' R4 N R4 N BOYGHIK asit R4 N R" r.

Baslangiç materyali 3-amin0-6-(amin0metiI)-1,2,4-triazin-5(4H)-on (X) etil bromopiruvat, dibenzilamin ve aminoguanidin karbonatin bir yogusma reaksiyonu, ardindan da Pd-C katalizörü üzerinde hidrojenasyon yoluyla debenzilasyon ile hazirlanabilir [Mitchel, W.L. et al., J. Heterocycl. Chem. 21 (1984) pp697]. Bu, daha sonra uygun sekilde amin ile korunmus amino asit ile reaksiyona sokulabilir. Cbz- il)metil)amid (XI) olusturmak için DMF, THF veya DCM gibi bir çözücü içinde, DIPEA, N-metilmorfolin, 4-DMAP veya trietilamin gibi bir baz varliginda ve PyBOP, TBTU, EDCI veya HATU gibi bir eslestirme reaktifi varliginda gerçeklestirilebilir. Amino- triazinon siklizasyonu (Xl), 2-amin0imidazo[1,5-f][1,2,4]triazin-4[3H]-on türevleri (Xll) saglamak için isitma kosullari altinda fosfor oksiklorid gibi yogusma reaktifleri kullanilarak gerçeklestirilebilir. Müteakip iyodinasyon, formül Xlll'ün bilesiklerini elde etmek için uygun sicaklikta DCM veya DMF gibi uygun bir çözücü içinde iyodin veya N- iodosuksinimid kullanilarak elde edilebilir. 2-aminoimidazo[1.5-f][1,2,4]triazin-4(3H)-on türevleri (XIII) içinde 2-amino grubunun uzaklastirilmasi, imidazo[1,5-t][1,2,4]triaziri- olusturmak için oda sicakliginda DMF/THF gibi çözücüler içinde t-bütil nitrit kullanilarak gerçeklestirilebilir. 4-Amino-imidazo[1,5-f][1,2,4]triazin türevleri (XV), piridin içinde fosfor oksiklorür, 1,2,4-triazol ve ardindan oda sicakliginda izopropanol içinde amonyak(gaz) ile amonoliz kullanilarak bilesiklerden (XIV) hazirlanabilir. Formül XVI'nin bilesikleri, uygun bir paladyum katalizör sistemi ve çözücü varliginda uygun bir boronik asit veya pinakol ester (VIII) kullanilarak formül XV'in bilesiklerinden hazirlanabilir, örnegin dioksan/su içinde potasyum karbonat varliginda bis(difenilfosfino)ferrosen paladyum(ll)klorür kompleksi veya tetrakis (trifeniIfosfin)paladyum(0) formül XVI'nin bilesiklerini saglar. Son olarak, bilesiklerin koruyucu grubunun Formül XVI ile klivajlanmasi, islevsellestirme sonrasinda, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak önceden tanimlanmis anlamlara sahip uygun basliklar ile formül l'in bilesiklerini saglayan korunmamis amini ortaya çikarmaktadir. Böyle bir koruyucu stratejinin bir örnegi, %33 HBr/HOAc veya kons. HCI ile koruyucunun uzaklastirilmasi sonrasinda, kullanilan amino asitlerden amini korumak için benziloksikarbonil koruyucu grubun kullanimidir.

HN(R2)CR3R4)COOH amino asitleri ticari olarak mevcuttur veya bunlar, benziloksikarbonil veya tert-bütiloksikarbonil gibi koruyucu gruplari saglamak için, uzman bir organik kimyacinin iyi bildigi yöntemler kullanilarak kolayca hazirlanabilir.

Pinakol esterleri olusturmak veya boronik asitleri ya da pinakol esterlerini 5- iodoimidazo[1,5-f][1,2,4]triazin-4-amin ile eslestirmek için paladyum katalizörleri ve kosullari, uzman bir organik kimyaci tarafindan iyi bilinmektedir, bkz. örnegin Ei-ichi Negishi (Editor), Armin de Meijere (Associate Editor), Handbook of Organopalladium Chemistry for Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 2002.

Bulusun bir bilesiginin veya bunun tuzlarinin ya da solvatlarinin bireysel stereoizomerinin söz konusu oldugu durumda, mevcut bulus, yukarida bahsi geçen stereoizomeri, diger steroizomeri büyük ölçüde ihtiva etmeyecek sekilde, yani %5'ten az, tercihen %2'den az ve özellikle %1'den az olacak sekilde içerir. Stereoizomerlerin herhangi bir orandaki karisimlari, örnegin iki enansiyomeri büyük ölçüde esit miktarlarda ihtiva eden bir rasemik karisim da mevcut bulusun kapsamina dâhildir.

Kiral bilesikler için, saf stereoizomerlerin elde edildigi asimetrik sentez yöntemleri, örn. kiral endüksiyon ile sentez, kiral ara ürünlerden baslayan sentez, enantiyo-seçici enzimatik dönüsümler, kiral vasatlar üzerinde kromatografi kullanilarak stereoizomerlerin ayrilmasi teknikte iyi bilinmektedir. Bu tür yöntemler "Chirality in tarif edilmistir. Geometrik izomerlerin sentezi için benzer yöntemler de teknikte iyi bilinmektedir. Mevcut bulusun, bir serbest baz formunda olabilecek olan 8-amin0- imidazo[1,5-a]pirazin türevi, bir farmasötik olarak kabul edilebilir tuz formunda reaksiyon karisimindan izole edilebilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar ayrica bulusun bilesiginin serbest bazinin, hidrojen klorür, hidrojen bromür, hidrojen iyodür, sülfürik asit, fosforik asit, asetik asit, propiyonik asit, glikolik asit, maleik asit, malonik asit, metansülfonik asit, fumarik asit, suksinik asit, tartarik asit, sitrik asit, benzoik asit ve askorbik asit gibi bir organik veya inorganik asit ile muamele edilmesiyle elde edilebilir.

Mevcut bulusun 8-amino-imidazo[1,5-a]pirazin türevi ve 4-amin0-imidazo[1,5- t][1,2,4]triazin türevleri ayrica amorf formlar olarak da mevcuttur. Çoklu kristalin formlar da mümkündür. Tüm fiziksel formlar, mevcut bulusun kapsami içine dâhil edilmistir.

Solvatlarin hazirlanmasi genellikle bilinmektedir. Dolayisiyla örnegin M. Caira et al., J. antifungal flukonazol'ün solvatlarinin hazirlanmasini da tarif etmektedir. Solvatlarin, hemisolvatin, hidratlarin ve benzerlerinin benzer preparatlari E. C. van Tonder et al., AAPS PharmSciTech., 5(1), article 12 (2004) ve A. L. Bingham et al, Chem. Commun. niteligine sahip bilesigin istenen miktarlarda istenen çözücü içinde (organik veya su veya bunlarin karisimlari) oitam sicakligindan daha yüksek bir sicaklikta çözündürülmesini ve çözeltinin, kristaller olusturmaya yetecek bir hizda sogutulmasini içermekte olup, bunlar daha sonra standart yöntemlerle izole edilir. Örnegin IR spektroskopisi gibi analitik teknikler, kristaller içinde çözücünün (veya suyun) bir solvat (veya hidrat) olarak varligini gösterir.

Mevcut bulus ayrica mevcut bulusun izotopik olarak etiketlenmis bilesiklerini de kapsamakta olup, bunlar burada anilanlarla aynidir, ancak bir veya birden fazla atom, dogada baskin sekilde bulunan atomik kütle veya kütle numarasindan farkli olan bir atomik kütle veya kütle numarasina sahip bir atom ile degistirilir. Bulusun bilesikleri içine dâhil edilebilecek olan izotoplarin örnekleri, sirasiyla oksijen, fosfor, florin ve klorinin izotoplarini içerir.

Bulusun izotopik olarak etiketli olan belirli bilesikleri (örn. 3H ve 14C ile etiketlenenler), bilesik ve/veya substrat doku dagilim tayinlerinde faydalidir. Tritiye (yani 3H) ve karbon- 14 (yani 14C) izotoplari, hazirlanmalarinin ve tespit edilmelerinin kolay olmasi nedeniyle özellikle tercih edilir. Dahasi, döteryum (yani 2H) gibi daha agir izotoplarin ikamesi, metabolik stabilitenin daha fazla olmasindan kaynaklanan bazi terapötik avantajlar saglayabilir (örn. artmis in-vivo yarilanma Ömrü veya azalmis dozaj gereklilikleri) ve dolayisiyla bazi durumlarda tercih edilebilir. Bulusun izotopik olarak etiketlenmis bilesikleri genellikle asagida Semalarda ve/veya Örneklerde açiklananlara benzer prosedürler takip edilmek suretiyle, izotopik olarak etiketlenmis uygun bir reaktifin, izotopik olmayan bir sekilde etiketlenmis bir reaktif ile ikame edilmesiyle hazirlanabilir.

Bulus asagidaki örneklerle tasvir edilmistir. Örnekler Asagidaki örnekler bulusun tasvir edici örnekleri olup, bulusun kapsamini herhangi bir sekilde sinirlandirmaz. Reaktifler ticari olarak mevcuttur veya Iiteratürdeki prosedürlere göre hazirlanir.

Kütle Spektrometrisi: Elektron Sprey spektrumlari, Akis Enjeksiyonu kullanilarak alternatif pozitif ve negatif iyon modunda Applied Biosystems API-165 tek kuadli kütle spektrometresi üzerinde kaydedilmistir. Kütle araligi 120-2000 Da olup, 0.2 Da'lik bir adim hizi ile taranmistir ve kapiler voltaj 5000 V'ye ayarlanmistir. Nebülizasyon için N2- gazi kullanilmistir.

LC-MS spektrometre (Waters) Detektörü: PDA (200-320 nm), Kütle detektörü: ZQ Eluent: A: %005 trifloroasetik asit ile asetonitril, B: %005 trifloroasetik asit ile asetonitril /su = 119 (v/v) LCMS Yöntemi (A) Kolon 1: Ch romolith Performansi, RP-18e, 4.6x100 mm, Gradyan yöntemi: Akis: 4 mL/dakika Zaman (dakika) A (%) B (%) 3.60 0 100 Zaman (dakika) A (%) B (%) 4.00 0 100 4.05 100 0 6.00 100 O LCMS Yöntemi (B) Kolon 2: XBridge C18, 3.5pm, 4.6x20mm Gradyan yöntemi: Akis: 4 mI/dakika Zaman (dakika) A (%) B (%) 1.60 0 100 3.10 0 100 3.20 100 0 .00 100 0 UPLC: Water acquity UPLC sistemi; Kolon: BEH C18 1.7 um, 2.1 X 100 mm, Detektör: PDA (200-320 nm), Kütle detektörü: SQD asetonitril /su = 119 (v/v) Yöntem UPLC (A) UPLC (B) UPLC (C) mL/dakika mL/dakika mL/dakika Yöntem Yöntem 60 100 mL/dakika Yöntem 40 80 mL/dakika Yöntem 0 60 mL/dakika Preparatif HPLC, 5 mI/dakikalik bir akis hizinda, 500 pl'lik enjeksiyon hacminde, oda sicakliginda 210 nm'lik UV Tespitte bir kolon üzerinde gerçeklestirilmistir (50 x 10 mm Kimyasal terminolojiye göre uygulama boyunca asagidaki kisaltmalar kullanilmistir: HATU O-(7-AzabenzotriazoI-1-il)-1,1,3,3-tetrametilüronyumheksafloro fosfat Cbz Benziloksikarbonil DMF N,N-Dimetilf0rmamid DCM Diklorometan EtOAc Etil asetat DIPEA N,N-Diizopr0piletilamin THF Tetrahidrofu ran EtOH Etanol EDCI.HCI 1-(3-DimetilaminopropiI)-3-etilkarbodiimid. hidroklorür 4-DMAP 4-Dimetilamino piridin PyBOP O-BenzotriazoI-1-iI-oksi-trispirrolidinofosfonyum heksaflorofosfat TBTU O-Benzotriazol-1-iI-N,N,N',N'-tetrametilür0nyum tetrafloroborat HBr Hidrojen bromür HCI Hidrojen klorür HOAc Asetik asit Z Benziloksikarbonil Pro Prolin POCI3 Fosfor oksiklorür HPLC Yüksek Basinçli Sivi Kromatografi LIHMDS Lityum heksametildisilazid MeOH Metanol n-BuLi n-Bütillityum C02 Karbondiyoksit Örneklerdeki son ürünlerin adlari Chemdraw Ultra (Versiyon 9.0.7) kullanilarak üretilmistir.

(Sl-Benzil 2-(8-amino-1-promoimidgon .5-a]girazin-3-il)piroliqin-1-karpoksilat (a) f3-Klorogirazin-2-il)metangminhicjroklorig Raney Nikeli (su içinde %50 sulu karisim, 70 g, 409 mmol) eklenmistir. Ortaya çikan karisim, oda sicakliginda 4 bar hidrojen altinda bir gece karistirilmistir. Raney Nikeli, dekalit üzerinde filtrasyon ile uzaklastirilmistir ve filtrat, düsük basinç altinda konsantre edilmistir ve toluen ile birlikte buharlastirilmistir. Geri kalan kahverengi kati, 50°C'de etil asetat içinde çözülmüstür ve buz banyosunda sogutulmustur. Dietil eter (1.14 L) içindeki 2M hidrojen klorid solüsyonu 30 dakikada eklenmistir. Karisim oda sicakliginda hafta sonu boyunca karistirilmistir. Kristaller, filtrasyon ile toplanmistir, dietil eter ile yikanmistir ve 40°C'de düsük basinç altinda kurutulmustur. Elde edilen kahverengi kati ürün, 60°Cide metanol içinde çözülmüstür. Karisim filtrelenmistir ve kismen konsantre edilmistir, oda sicakligina sogutulmustur ve dietil eter (1000 ml) eklenmistir. Karisim oda sicakliginda bir gece karistirilmistir. Olusan katilar filtrasyon ile toplanmistir, dietil kIoropirazin-2-il)metanamin.hidrokloridi vermek üzere 40°C'de düsük basinç altinda kurutulmustur. (b) (S)-benzil 2-((3-kloropirazin-2-il)metiIkarbamoiI)pirolidin-1-karboksilat Diklorometan (metanamin.HCI (9.57 9, 21.26 mmol) eklenmistir ve reaksiyon karisimi O°C'ye sogutulmustur. 0°C`de 15 dakika karistirildiktan sonra HATU (8.49 9, 22.33 mmol) eklenmistir. Karisim O°C'de 1 saat ve akabinde oda sicakliginda bir gece karistirilmistir. Karisim, 0.1 M HCI solüsyonu, %5 NaHCOs, su ve tuzlu su ile yikanmistir, sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve vakum ile konsantre edilmistir. Ürün, 5 g (8)-benzil 2-((3-klor0pirazin-2- il)metilkarbamoil)pirolidin-1-karboksilati (%627) vermek üzere silika jel kromatografisi (hepten/etil asetat = 114 %v/v) kullanilarak saflastirilmistir. (c) (8)-Benzil 2-(8-kloroimidazo[1,5-a1pirazin-3-il)pirolidin-1-karboksilat (S)-Benzil 2-((3-kloropirazin-2-il)metilkarbamoil)pirolidin-1-karboksilat (20.94 mmol, 6.9 ml, 7.17 9) eklenmistir ve reaksiyon karisimi, sicaklik 5°C civarinda tutulurken sogutulmustur. Reaksiyon karisimi 60-65°C'de bir gece reflükse edilmistir. Reaksiyon karisimi, süspansiyonda buz kalmayana kadar 15 dakika karistirilan sari bir süspansiyonu (pH ~8-9) vermek üzere su (250 ml)/kirilmis buz (500 ml) içindeki amonyum hidroksit %25 içine dikkatli bir sekilde dökülmüstür. Etil asetat eklenmistir, katmanlar ayrilmistir ve aköz katman, etil asetat (3x) ile özütlenmistir. Organik katmanlar kombine edilmistir ve tuzlu su ile yikanmistir, sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve 7.5 9 ham ürünü vermek üzere buharlastirilmistir. Ham vermek üzere silika jel kromatografisi (hepten/etil asetat = 1/4 %v/v) ile saflastirilmistir. (d) (Sl-Benzil 2-(1-bromo-B-kloroimidzgon,5-algirazin-3-iIlpirolidin-1-karboksilat N-Bromosüksinimid (-benzil solüsyonuna eklenmistir. Reaksiyon oda sicakliginda 3 saat karistirilmistir. Karisim, karistirilmis su ( karisimi içine dökülmüstür (yavasça). Karisim akabinde bir ayirma hunisine transfer edilmistir ve özütlenmistir. Su katmani, 2x145 mL etil asetat ile özütlenmistir. Kombine organik katmanlar, 3x300 mL su, 300 mL tuzlu su ile yikanmistir, sodyum sülfat üzerinde kloroimidazo[1,5-a]pirazin-3-il)pirolidin-1-karboksilati (%82.13) vermek üzere silika jel kromatografisi (etil asetat/hepten = 3/1 %v/v) kullanilarak saflastirilmistir. (e) (Sl-Benzil 2-(8-gmino-1-bromoimida_zo[1 .5-a]pirazin-3-il)pirolic_lin-1-kaLboksila_t mmol, 8.95 9), basinçli bir kap içinde 2-propanol (113 ml) içinde süspanse edilmistir. 2- propanol (50 ml), önceden tartilmis bir balon (tapasi ve karistirma çubugu olan) içinde - 78°C'ye sogutulmustur ve bunun içine amonyak gazi (646 mmol, 11 g) 15 dakika boyunca verilmistir. Ortaya çikan solüsyon, basinçli kap içindeki süspansiyona eklenmistir. Kap kapatilmistir ve oda sicakliginda karistirilmistir ve basinçta hafif artis gözlenmistir. akabinde süspansiyon 110°C'ye isitilmistir. bu da basincin 4.5 bar'a çikmasi ile sonuçlanmistir. Berrak solüsyon 110°C, 4.5 bar'da bir gece karistirilmistir. 18 saat sonra basinç 4 bar'da kalmistir. Reaksiyon karisimi vakum ile konsantre edilmistir, kalinti, etil asetat içinde süspanse edilmistir ve akabinde su ile yikanmistir.

Katmanlar ayrilmistir ve aköz katman etil asetat ile özütlenmistir. Kombine organik katmanlar su, doymus sodyum klorid solüsyonu ile yikanmistir, sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve 7.-benzil 2-(8-amino-1-bromoimidazo[1,5-a]pirazin-3- iI)pir0Iidin-1-karboksilati (%86) vermek üzere konsantre edilmistir. mi 3! i i_ .__ mi, E"- (a) (S)-Benzil 2-(8-amino-1-(4-(piridin-2-ilkarbamoil)fenil)imidazo[1,5-a1pirazin-3- il)pirolidin-1-karboksilat mg), 2N aköz potasyum karbonat solüsyonu (2.37 mmol, ve dioksan ( karisimi içinde süspanse edilmistir. Nitrojen karisima püskürtülmüstür, akabinde Reaksiyon karisimi mikrodalgada 140°C'de 20 dakika isitilmistir. Reaksiyon karisimina su eklenmistir, akabinde etil asetat (2x) ile özütleme yapilmistir. Kombine organik katman, tuzlu su ile yikanmistir, magnezyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve buharlastirilmistir. Ürün, 97.1 mg (S)-benzil 2-(8-amino-1-(4-(piridin-2- ilkarbamoil)fenil)imidazo[1,5-a]pirazin-3-iI)pirolidin-1-karboksilat (%77) saglamak üzere elüent olarak diklorometan/metanol = 9/1 %v/v ve silika jel kullanilarak saflastirilmistir. (b) (8)-4-(8-Amino-3-(pirolidin-2-il)imidazol1,5-algirazin-1-iI)-N-(piridin-2- il benzamid (8)-benzil 2-(8-amino-1-(4-(piridin-2-ilkarbamoil)fenil)imidazo[1,5-a]pirazin-3-il)pirolidin- 1-karboksilat (0.146 mmol, 78 mg) içine %33 hidrobromik asit/asetik asit solüsyonu (11.26 mmol, 2 ml) eklenmistir ve karisim oda sicakliginda 1 saat bekletilmistir. Karisim su ile seyreltilmistir ve diklorometan ile özütlenmistir. Aköz faz, 2N sodyum hidroksit solüsyonu kullanilarak nötralize edilmistir ve akabinde diklorometan ile özütlenmistir.

Organik katman magnezyum sülfat üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve 34 mg (S)- vermek üzere buharlastirilmistir.

Referans Örnek 1 iI)-N-(piridin-2-il)benzamid 0.197 mmol, but-2-en0ik asit hidroklorür (9.45 mg, ilave edilmistir. Bu karisim oda sicakliginda 30 dakika çalkalanmistir. Karisim su ile yikanmis, magnezyum sülfat ile kurutulmus ve vakumda konsantre edilmistir. Artik, preparatif HPLC ile saflastirilmistir. Ürünü içeren fraksiyonlar toplanmis ve 7.1 mg (S,E)-4-(8-amino-3-(1-(4-(pirrolidin-1- verim) saglamak üzere kuruyana kadar indirgenmistir. Veriler: UPLC (C) Rt : 1.25 dakika; m/z *. iI benzamid Bu bilesik, basliktaki bilesigi saglamak üzere (10.5 mg, %180), Referans Örnek 1'de tarif edilene benzer bir sekilde, ara ürün 2b ve 2-butinoik asitte tarif edilen bilesikten hazirlanmistir. Veriler: LCMS (B) Rt: 2.08 dakika; m/z *. Örnek 3 Tayin Yöntemleri Btk enzim aktivitesi Btk enzim aktivitesi, asagida belirtildigi sekilde IMAP (immobilize metal iyon afinitesi bazli floresans polarizasyonu) kullanilarak ölçülür.

Btk enzimi (His-Btk (Millipore katalog no 14-552), KR tamponu (10 mM Tris-HCI, 10 mM MgClg, % içinde 0.4 U/mL'ye seyreltilir.

Test bilesiklerinin 2 mM'den 63.2 nM'ye log10 seri seyreltmesi %100 DMSO içinde yapilir. DMSO içindeki seyreltmeler daha sonra KR tamponu içinde 50 kat seyreltilir.

Son bilesik konsantrasyonu, tayinde 10 i.iM ila 0.316 nM araligindadir.

KR tamponunda 5 pL/kuyuluk test bilesigi (tayinde son DMSO konsantrasyonu %1'dir), pL/kuyuluk 0.4 U/mL Btk enzimi ile karistirilir (tayindeki son konsantrasyon 0.1 U/mL'dir). Test bilesikleri ve Btk enzimine oda sicakliginda 60 dakika ön inkübasyon uygulanir, daha sonra KR tamponu içinde 5 uL/kuyu 200 nM Floresin etiketli substrat peptidi (Blk/Lyntide substrati, örn. #R7188/#R7233, Molecular Devices) ilave edilir.

Tayinde son peptit substrat konsantrasyonu 50 nM'dir. Kinaz tayini KR tamponu içinde uL/kuyu 20 uM ATP ilave edilerek baslatilir (Btk IMAP tayininde son ATP konsantrasyonu 5 um ATP, Km ATP'dir). Oda sicakliginda 2 saat inkübasyonun ardindan enzim reaksiyonu 40 uL/kuyu IMAP Ilerleyici Baglanma Çözeltisi (1:600 Ilerleyici Baglanma Çözeltisi ile %75 1x tampon A ve %25 1x tampon B kullanilarak tedarikçilerin (Molecular Devices) protokolüne göre) ilave edilerek durdurulur.

Karanlikta oda sicakliginda 60 dakikalik inkübasyon sonrasinda FP sinyali okunur.

Fosforile substrat peptidinin boncuklara baglanmasindan ötürü dönmedeki farkliliklari belirlemek için paralel ve dik filtreler kullanilarak 535 nm'de floresans ölçülür. Degerler, ATP ile ve ATP olmadan kontrollerin okunmasindaki farkliliklarin yüzdesi olarak hesaplanir (AmPi). EC50 degerleri, Aktivite Bazi kullanilarak deneysel sonuçlarin egri uydurmasi ile belirlenir.

Bütün örnekler 10 uM veya daha düsük bir EC50'ye sahiptir.

Tablo 1 EC50 Btk aktivite degerleri E050 Örnek 210nM <100nM 1 <10 nM 2 Burada örnek 1 bir referans örnektir.

Lck enzim aktivitesi Lck enzim aktivitesi, asagida belirtildigi sekilde IMAP (immobilize metal iyon afinitesi bazli floresans polarizasyonu) kullanilarak ölçülür. seyreltilir.

Test bilesiklerinin 2 mM'den 63.2 nM'ye Iog10 seri seyreltmesi %100 DMSO içinde yapilir. DMSO içinde seyreltmeler daha sonra KR tamponu içinde 50 kat seyreltilir ve bunun 5 ul'si tayinde kullanilarak, tayinde 10 uM ila 0.316 nM'Iik bir son bilesik konsantrasyon araligi elde edilir.

KR tamponunda 5 uL/kuyuluk test bilesigi (tayinde son DMSO konsantrasyonu %1'dir), pL/kuyuluk 0.4 U/mL Lck enzimi ile karistirilir (tayindeki son konsantrasyon 0.1 U/mL'dir). Test bilesikleri ve Lck enzimine oda sicakliginda 60 dakika ön inkübasyon uygulanir, daha sonra KR tamponu içinde 5 uL/kuyu 400 nM Floresin etiketli substrat Tayinde son peptit substrat konsantrasyonu 100 nM'dir. Kinaz tayini KR tamponu içinde 5 uL/kuyu 24 pM ATP ilave edilerek baslatilir (Lck IMAP tayininde son ATP konsantrasyonu 6 pM ATP, Km ATP'dir). Oda sicakliginda 2 saat inkübasyonun ardindan enzim reaksiyonu 40 uL/kuyu lMAP Ilerleyici Baglanma Çözeltisi (1:600 Ilerleyici Baglanma Çözeltisi ile %75 1x tampon A ve %25 1x tampon B kullanilarak tedarikçilerin (Molecular Devices) protokolüne göre) ilave edilerek durdurulur.

Karanlikta oda sicakliginda 60 dakikalik inkübasyon sonrasinda FP sinyali okunur.

Fosforile substrat peptidinin boncuklara baglanmasindan ötürü dönmedeki farkliliklari belirlemek için paralel ve dik filtreler kullanilarak 535 nm'de floresans ölçülür. Degerler, ATP ile ve ATP olmadan kontrollerin okunmasindaki farkliliklarin yüzdesi olarak hesaplanir (AmPi). E050 degerleri, Aktivite Bazi kullanilarak deneysel sonuçlarin egri uydurmasi ile belirlenir.

Tablo 2 E050 Lck aktivite degerleri EC50 Örnek 21pM 1,2 Burada örnek 1 bir referans örnektir.

Src enzim aktivitesi Src enzim aktivitesi, asagida belirtildigi sekilde IMAP (immobilize metal iyon afinitesi bazli floresans polarizasyonu) kullanilarak ölçülür. seyreltilir.

Test bilesiklerinin 2 mM'den 63.2 nM'ye Iog10 seri seyreltmesi %100 DMSO içinde yapilir. DMSO içinde seyreltmeler daha sonra KR tamponu içinde 50 kat seyreltilir ve bunun 5 ul'si tayinde kullanilarak, tayinde 10 uM ila 0.316 nM'Iik bir son bilesik konsantrasyon araligi elde edilir.

KR tamponunda 5 uL/kuyuluk test bilesigi (tayinde son DMSO konsantrasyonu %1'dir), uL/kuyuluk 0.8 U/mL Src enzimi ile karistirilir (tayindeki son konsantrasyon 0.2 U/mL'dir). Test bilesikleri ve Src enzimine oda sicakliginda 60 dakika ön inkübasyon uygulanir, daha sonra KR tamponu içinde 5 uL/kuyu 400 nM Floresin etiketli substrat Tayinde son peptit substrat konsantrasyonu 100 nM'dir. Kinaz tayini KR tamponu içinde 5 uL/kuyu 16 uM ATP ilave edilerek baslatilir (Src IMAP tayininde son ATP konsantrasyonu 4 um ATP, Km ATP'dir). Oda sicakliginda 2 saat inkübasyonun ardindan enzim reaksiyonu 40 pL/kuyu IMAP Ilerleyici Baglanma Çözeltisi (1:600 Ilerleyici Baglanma Çözeltisi ile %75 1x tampon A ve %25 1x tampon B kullanilarak tedarikçilerin (Molecular Devices) protokolüne göre) ilave edilerek durdurulur.

Karanlikta oda sicakliginda 60 dakikalik inkübasyon sonrasinda FP sinyali okunur.

Fosforile substrat peptidinin boncuklara baglanmasindan ötürü dönmedeki farkliliklari belirlemek için paralel ve dik filtreler kullanilarak 535 nm'de floresans ölçülür. Degerler, ATP ile ve ATP olmadan kontrollerin okunmasindaki farkliliklarin yüzdesi olarak hesaplanir (AmPi). EC50 degerleri, Aktivite Bazi kullanilarak deneysel sonuçlarin egri uydurmasi ile belirlenir.

Tablo 3 EC50 Src aktivite degerleri EC50 Örnek 21uM 1,2 Burada örnek 1 bir referans örnektir.

FynT enzim aktivitesi FynT enzim aktivitesi, asagida belirtildigi sekilde IMAP (immobilize metal iyon afinitesi bazli floresans polarizasyonu) kullanilarak ölçülür.

FynT enzimi (Biomol katalog no SE-287), KR tamponu (10 mM Tris-HCI, 10 mM MgClg, seyreltilir.

Test bilesiklerinin 2 mM'den 63.2 nM'ye log10 seri seyreltmesi %100 DMSO içinde yapilir. DMSO içinde seyreltmeler daha sonra KR tamponu içinde 50 kat seyreltilir ve bunun 5 ul'si tayinde kullanilarak, tayinde 10 iJM ila 0.316 nM'lik bir son bilesik konsantrasyon araligi elde edilir.

KR tamponunda 5 pL/kuyuluk test bilesigi (tayinde son DMSO konsantrasyonu %1'dir), pL/kuyuluk 0.5 U/mL FynT enzimi ile karistirilir (tayindeki son konsantrasyon 125 ng/mL'dir). Test bilesikleri ve FynT enzimine oda sicakliginda 60 dakika ön inkübasyon uygulanir, daha sonra KR tamponu içinde 5 pL/kuyu 400 nM Floresin etiketli substrat Tayinde son peptit substrat konsantrasyonu 100 nM'dir. Kinaz tayini KR tamponu içinde 5 pL/kuyu 0.8 uM ATP ilave edilerek baslatilir (FynT IMAP tayininde son ATP konsantrasyonu 4 um ATP, Km ATP'dir). Oda sicakliginda 2 saat inkübasyonun ardindan enzim reaksiyonu 40 uL/kuyu IMAP Ilerleyici Baglanma Çözeltisi (1:600 Ilerleyici Baglanma Çözeltisi ile %75 1x tampon A ve %25 1x tampon B kullanilarak tedarikçilerin (Molecular Devices) protokolüne göre) ilave edilerek durdurulur.

Karanlikta oda sicakliginda 60 dakikalik inkübasyon sonrasinda FP sinyali okunur.

Fosforile substrat peptidinin boncuklara baglanmasindan ötürü dönmedeki farkliliklari belirlemek için paralel ve dik filtreler kullanilarak 535 nm'de floresans ölçülür. Degerler, ATP ile ve ATP olmadan kontrollerin okunmasindaki farkliliklarin yüzdesi olarak hesaplanir (AmPi). E050 degerleri, Aktivite Bazi kullanilarak deneysel sonuçlarin egri uydurmasi ile belirlenir.

Tablo 4 EC50 FynT aktivite degerleri E050 Örnek Tablo 4 E050 FynT aktivite degerleri EC50 Örnek 21uM 1,2 Burada örnek 1 bir referans örnektir.

Lyn enzim aktivitesi Lyn enzim aktivitesi, asagida belirtildigi sekilde IMAP (immobilize metal iyon afinitesi bazli floresans polarizasyonu) kullanilarak ölçülür.

Lyn enzimi (Millipore katalog no 14-510), KR tamponu (10 mM Tris-HCI, 10 mM MgCIz, seyreltilir.

Test bilesiklerinin 2 mM'den 63.2 nM'ye Iog10 seri seyreltmesi %100 DMSO içinde yapilir. DMSO içinde seyreltmeler daha sonra KR tamponu içinde 50 kat seyreltilir ve bunun 5 ul'si tayinde kullanilarak, tayinde 10 uM ila 0.316 nM'Iik bir son bilesik konsantrasyon araligi elde edilir.

KR tamponunda 5 uL/kuyuluk test bilesigi (tayinde son DMSO konsantrasyonu %1'dir). uL/kuyuluk 250 mU/mL Lyn enzimi ile karistirilir (tayindeki son konsantrasyon . Test bilesikleri ve Lyn enzimine oda sicakliginda 60 dakika ön Inkübasyon uygulanir, daha sonra KR tamponu içinde 5 uL/kuyu 400 nM Floresin etiketli substrat peptidi (BIk/Lyntide substrati, örn. #R7188/#R7233, Molecular Devices) ilave edilir.

Tayinde son peptit substrat konsantrasyonu 100 nM'dir. Kinaz tayini KR tamponu içinde 5 uL/kuyu 8 uM ATP ilave edilerek baslatilir (Lyn IMAP tayininde son ATP konsantrasyonu 2 um ATP, Km ATP'dir). Oda sicakliginda 2 saat inkübasyonun ardindan enzim reaksiyonu 40 uL/kuyu IMAP Ilerleyici Baglanma Çözeltisi (1:600 Ilerleyici Baglanma Çözeltisi ile %75 1x tampon A ve %25 1x tampon B kullanilarak tedarikçilerin (Molecular Devices) protokolüne göre) ilave edilerek durdurulur.

Karanlikta oda sicakliginda 60 dakikalik inkübasyon sonrasinda FP sinyali okunur.

Fosforile substrat peptidinin boncuklara baglanmasindan ötürü dönmedeki farkliliklari belirlemek için paralel ve dik filtreler kullanilarak 535 nm'de floresans ölçülür. Degerler, ATP ile ve ATP olmadan kontrollerin okunmasindaki farkliliklarin yüzdesi olarak hesaplanir (AmPi). EC50 degerleri, Aktivite Bazi kullanilarak deneysel sonuçlarin egri uydurmasi ile belirlenir.

Claims (1)

1. ISTEMLER 1. Asagidaki yapiya sahip bir bilesik olan bir bilesik: veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzudur. 2. istem 1'e göre bilesik olup, asagidaki yapiya sahiptir:/ \ 3. Istem 1'e göre bilesik olup, burada bilesik, asagidaki yapiya sahip bir bilesigin farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzudur: 4. Istem 3'e göre bilesik olup burada farmasötik olarak kabul edilebilir tuz asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilir: asetat, askorbat, benzoat, benzensülfonat, bisülfat, borat, butirat, sitrat, kamforat, kamforsülfonat, fumarat, hidroklorür, hidrobromür, hidroiyodür, Iaktat, maleat, metansülfonat, naftalensülfonat, nitrat, oksalat, fosfat, propionat, salisilat, suksinat, sülfat, tartarat, tiyosiyanat ve toluensülfonat. 5. Terapide kullanilmak üzere asagidaki yapiya sahip bir bilesik olan bir bilesik: Veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzudur. . istem 5'e göre kullanim için bilesik olup, burada bilesik asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilen bir Bruton Tirozin Kinaz (Btk) aracilili bozuklugun tedavisinde kullanilmak içindir: romatoid artrit, psoriatik artrit, enfeksiyöz artrit, progresif kronik artrit, deforme edici artrit, osteoartrit, traumatik artrit, gut artriti, Reiter sendromu, polikondrit, akut sinovit, spondilit, nefrotik sendromlu glomerulonefrit, nefrotik sendromsuz glomerulonefrit, otoimmün hematolojik bozukluklar, hemolitik anemi, aplazik anemi, idiyopatik trombositopeni, nötropeni, otoimmün gastrit, otoimmün enflamatuvar bagirsak hastaliklari, ülseratif kolit, Crohn hastaligi, konaga karsi greft hastaligi, allogreft reddi, kronik tiroidit, Grave hastaligi, skleroderma, tip I diyabet ve tip II diyabet, akut aktif hepatit, kronik aktif hepatit, pankreatit, primer billiyer siroz, miyastenia gravis, multipl skleroz, sistemik Iupus eritematozus, psöryazis, atopik dermatit, kontakt dermatit, egzama, cilt yaniklari, vaskülit, Behçet hastaligi, kronik böbrek yetmezligi, Stevens-Johnson sendromu, enflamatuar agri, idiyopatik spru, kaseksi, sarkoidoz, GuilIaIn-Barré sendromu, üveit, konjonktivit, kerato konjonktivit, ortakulak iltihabi, periodontal hastalik, pulmoner interstisyel fibroz, astim, bronsit, rinit, sinüzit, pnömokonyoz, pulmoner yetmezlik sendromu, pulmoner amfizem, pulmoner fibroz, silikoz, kronik enflamatuvar pulmoner hastalik, kronik obstrüktif akciger hastaligi, proliferatif bir hastalik, non-Hodgkin reseptör sinyallemesinden kaynaklanan B hücreli lenfoma ve çoklu miyelomla iliskili bir kemik bozuklugu. . Istem 5'e göre kullanim için bilesik olup, burada bilesik, bir Bruton Tirozin Kinaz (Btk) aracili bozuklugun tedavisinde kullanilmak içindir ve burada Btk aracili bozukluk B hücreli kronik Ienfositik Iösemidir. . Istem 5'e göre kullanim için bilesik olup, burada bilesik, bir Bruton Tirozin Kinaz (Btk) aracili bozuklugun tedavisinde kullanilmak içindir ve burada Btk aracili bozukluk manto hücreli Ienfomadir. 9. Istemler 5 ila 8'den herhangi birine göre bilesik olup, burada bilesik asagidaki yapiya sahiptir: 10. Istemler 5 ila 8'den herhangi birine göre bilesik olup, burada bilesik, asagidaki yapiya sahip bir bilesigin farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzudur: 11.Istem 10'a göre bilesik olup burada farmasötik olarak kabul edilebilir tuz asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilir: asetat, askorbat, benzoat, benzensülfonat, bisülfat, borat, butirat, sitrat, kamforat, kamforsülfonat, fumarat, hidroklorür, hidrobromür, hidroiyodür, Iaktat, maleat, metansülfonat, naftalensülfonat, nitrat, oksalat, fosfat, propionat, salisilat, suksinat, sülfat, tartarat, tiyosiyanat ve toluensülfonat. 12. Asagidaki yapiya sahip bir bilesik olan bir bilesigin kombinasyonu: veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu ve bir baska ilaçtir. 10 13. Istem 12'ye göre kombinasyon olup, bilesik asagidaki yapiya sahiptir: 14. istem 12'ye göre kombinasyon olup, burada bilesik, asagidaki yapiya sahip bir bilesigin farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzudur: 15. istem 14'e göre bilesik olup burada farmasötik olarak kabul edilebilir tuz asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilir: asetat, askorbat, benzoat, benzensülfonat, bisülfat, borat, butirat, sitrat, kamforat, kamforsülfonat, fumarat, hidroklorür, hidrobromür, hidroiyodür, laktat, maleat, metansülfonat, 10 naftalensülfonat, nitrat, oksalat, fosfat, propionat, salisilat, suksinat, sülfat, tartarat, tiyosiyanat ve toluensülfonat. 16. Asagidaki yapiya sahip bir bilesik olan bir bilesigi: veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir yardimci maddeyi ihtiva eden bir farmasötik bilesimdir. 17. istem 16'ya göre bilesim olup, burada bilesik asagidaki yapiya sahiptir: 18. istem 16'ya göre bilesim olup, burada bilesik, asagidaki yapiya sahip bir 10 bilesigin farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzudur: 19. Istem 18'e göre bilesik olup burada farmasötik olarak kabul edilebilir tuz asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilir: asetat, askorbat, benzoat, benzensülfonat, bisülfat, borat, butirat, sitrat, kamforat, kamforsülfonat, fumarat, hidroklorür, hidrobromür, hidroiyodür, Iaktat, maleat, metansülfonat, naftalensülfonat, nitrat, oksalat, fosfat, propionat, salisilat, suksinat, sülfat, tartarat, tiyosiyanat ve toluensülfonat.