TARIFNAME ANTI'l'UMDR AKTIVITESI OLAN REKOMBINANT LEKTINLERE BAGLANAN KANSER HUCRESI VE HAZIRLAMA YONTEMI BULUSUN ALANI Bulus, karbonhidrat baglayici proteinlerle ilgili çalisma alani ve daha özel olarak, 'Özel tibbi önemi olan belirli oligosakkaritlere spesifik olarak baglanan bir protein ile ilgilidir. Bulus, Özellikle lektinlerle ve daha Özel olarak klinik önemi olan glikanlari tanima kabiliyetine sahip olan rekombinant fungal Iektinler ve onlarin kanserin teshis edilmesinde, tedavisinde ve arastirmasinda kullanilacak olan uygulamalarin kanser hücreleri üzerindeki antiproliferatif etkisi ilgilidir. BULUSUN GEÇMISI Lektinler in vitro olarak bazi veya tüm kan gruplarinin eritrositlerini aglütine eden proteinler veya glikoproteinlerdir. Çogu organizmada bulunan önemli biyoaktif proteinler grubudur. Lektinler saglik bakim alanlarinda teshis ve tedavi amaçli araçlar olarak kullanilir. Lektinler ayrica glikoproteinlerin saflastirilmasinda, oligosakkarit analizinde ve hücre seleksiyonu proseslerinde kullanilir. Lektinler monosakkaritler veya glikoproteinler veya glikolipidler veya polisakaritlerin seker kismi ile tersine baglanabilir. Hücre yüzeylerindeki karbonhidrat yapilarindaki degisiklikler, kanser sirasinda bir ayirt edici özelliktir. Bu gibi degisiklikler, tüm'orle iliskili karbonhidrat yapilarinin ortaya çikmasina neden olur. Bunlar arasinda, bir disakkarit Galß193GalNac-O-Serl Thr olan Thomsen-Friedenreich antijeninin artmasi bulunur. Normal hücrelerde, bu antijen belirli sekerler, siyalik asit veya sülfatlarla maskelenir. Bazi lektinler, bu degismis yapilari spesifik olarak taniyabilme ve baglanabilme özelligine sahiptir ve apoptoz, sitotoksisite, proliferatif/antiproliferatif aktivite, metastaz, hücre adezyonunun inhibisyonu vs. gibi çesitli fizyolojik etkiler uygulayabilmektedir. Dolayisiyla, bu tip ayrica anti tümör aktiviteleri için kullanilmalari düsünülmektedir. Çok sayida Iektin çesitli kaynaklardan izole olmus ve karakterize edilmistir. Bununla birlikte, moleküler boyut ve seker 'özgüllükleri gibi fiziko-kimyasal özelliklerinde farklilik gösterirler. Ayrica birkaç rekombinant protein de karakterize edilmistir. Marasmius oreades'in rekombinant mantar lektini, 33 kDa'Iik bir moleküler büyüklüge sahiptir ve Galoil, 3Gal ve Galdl, 3Galßl, 4GIcNAc için yüksek bir Goldstein, ve diger. ABD Patent: 6958321). Thomsen-Friedenreich antijenine egilim gösteren fistik lektini klonlandi (V. proteinin bazi mutantlari yaklasik ~28 kDa alt birim moleküler kütlesi ile ayni zamanda E. coli (V. Sharma, M. Vijayan ve A.Surolia, J. Biol. Chem., 271, edilmistir. Pseudomonas aeruginosa'dan L-fukoza göre yüksek baglanma egilimi olan 11.73 kDa 'lik çok daha küçük moleküler kütleye sahip bir lektin de Sari flöresanli Protein-lektin füzyonu olarak E. coli 'de ifade edilmistir Insan kolon kanseri hücreleri üzerinde antiproliferatif aktiviteye sahip olan Agaricus bisporus mantari (ABL) ve sedef hastaligindaki küratif etkisi, Jonathan M. Rhodes tarafindan bildirilmistir; ABD Patenti No. 5607679. Fitopatojenik mantar Sclerotium rolfsii nin sklerotial gövdelerinden saflastirilmis Sclerotium rolfsii lektin (SRL), kompleks karbonhidrat spesifitesi sergiler ve TF antijenine karsi özgüllük gösterir. TF antijeni, onkofetal bir antijendir, bir disakkarit Galß1, SGaNAc bir ser/thr 'dir ve farkli kanserlerde hücre yüzeylerinde eksprese oldugu bilinmektedir. SRL, TF antijenine baglanmanin disinda, sialillenmis ve sülfatlanmis disakkaride de baglanir. Bu Satisha 2008). Baglanma çalismalari, SRL 'nin farkli insan kanser dokularina ve ayrica kültürlenmis hücrelere baglandigini göstermistir. SRL'nin kültürlenmis insan lösemik hücrelerine ve kolon hücrelerine daha fazla baglanmasi, bunlarin antiproliferasyonuna neden olur ve kolon hücrelerinde, söz konusu etkiye apoptozun indüklenmesinin aracilik ettigi gösterilmistir. birlikte, saflastirilmis dogal Iektinin çesitli uygulamalarda kullanildiginda çözünürlük problemleri vardir, dolayisiyla pratik uygulamalar için gelistirilmis stabiliteye sahip bu Iektin formlarina ihtiyaç vardir. Lektinler bu nedenle tibbi testler alaninda muazzam bir potansiyele sahiptir. Aninda uygulama, tibbi alanda ve gelistirilmis özelliklerde yararli olacak sekilde bazi özelliklere sahip yeni lektinler saglamaya devam eder. BU LUSUN OZETI Mevcut bulus, belirli kanser hücrelerinde benzersiz olarak bulunan bazi seker zincirlerine özgüllügü olan rekombinant lektinleri açiga çikarmaktadir. Mevcut bulus ayrica E. coli 'de ifade edilen iki rekombinant lektin (sirasiyla UC- SS/CSR-1803 ve UC-SS/CSR-1805 veya sadece Rec-2 ve Rec-S olarak adlandirilan) hazirlamak için bir yöntem saglamaktadir. Yöntem, dizileri fitopatojenik bir mantar olan Sclerotium rolfsii (Sathisha et.al., Amino Acids; kasitli modifikasyonlarla elde edilen Iektin genlerin sentezini ve E. coli 'de klonlanmasini kapsamaktadir. Rekombinant lektinler, çözünebilir proteinler olarak ifade edilir ve iyon degisimi ve jel filtreleme kromatografisi teknikleriyle saflastirilir. Mevcut bulus, spesifik olarak, glikoproteinlerde ve hücre yüzeylerinde meydana gelen bazi O-glikosidik olarak baglanan glikanlara Özgü tahmini alt birim kütleleri (Mr saglar, ancak N-bagli glikanlara karsi özgüllük göstermez. N-glikanlari degil, ama O-glikanlari tanima ve insan kan gruplarina karsi özgüllük göstermeme özelligi, bunlari 30/MUM/2008 sayili beklemedeki patent basvurusunda açiklanan diger rekombinant lektinlerden farkli kilar. Ayrica rekombinant lektinlerin Rec-2 ve Rec-B'ün fetuin 'e baglanmadigi, ancak asialofetuin için çok güçlü bir egilim sergiledigi anlasilmistir, böylece burada sözü edilen rekombinant Iektin `den (patent basvurusu 30/MUM/2008) ve dogal Iektin 'den farklilik göstermistir. Bu tanima özelligi sayesinde, malignite sirasinda eksprese edilen belirli hücre yüzey moleküllerine baglanirlar (Sekil 1) ve böylece insan Meme kanseri, kolon kanseri, yumurtalik kanseri dokularina (Sekil 2) ve ayrica kültürlenmis hücreler ve lösemik hücre dizilerine (Tablo I) baglanirlar - Kültürlenmis insan kanser hücrelerine baglanmanin yani sira, rekombinant lektinler, teshis ve terapötik özellikleri sayesinde hücreler üzerinde in vitro antiproliferatif aktivite gösterirler (Tablo 2). Bulus, her seferinde dogal Iektine (S. rolfsii Iectin) benzer sekilde 141 amino asit uzun lektinleri kodlayan Rec-2 ve Rec-3 için DNA dizilerini açiklamaktadir, ancak kimyasal olarak sentezlenen ve E. coli'ye klonlanan birkaç kasitli modifikasyonla (SEO lD birlikte. Klonlanan lektinler, indükleyici lPTG ile indüksiyondan sonra ifade edildi. Eksprese edilen protein, çözünebilir ve her bir durumda aktif formda ortaya çikti. Rekombinant lektinler, anyon degisimi ve moleküler elek kromatografisine basvurularak esansiyel homojenlige kadar saflastirildi. Moleküler agirliklarin kütle spektrometrik ve SDS PAGE tahmini, yaklasik 16,1 kDa'lik bir deger göstermektedir. Izoelektrik odaklama deneyi 6.614'teki PI degerini gösterirken, dogal Iektin 6.219 degere sahiptir, özellik rekombinant proteinlerin çözünürlügünü ve stabilitesini gelistirmede belirgin bir sekilde yardimci olmustur. Gelistirilmis çözünürlük, stabilite ve rekombinant lektinlerin de-sialillenmis TF antijenine baglanmasi, uygulamalarinin üretim kolayligi disinda reaktifler olarak çesitli alanlarda daha büyük etkilere sahiptir. Ayrica burada açiklanan yöntem, E. coli veya maya gibi bir konakçi hücrede eksprese edilen rekombinant bir Iektinin hazirlanmasina yönelik bir yöntemdir. Bu yöntem, toprak kaynakli bir fitotopatojen mantari olan, Sclerotium rolfsii Iektinin (SEO ID I) MALDI MS/MS 'sinden türetilen amino asit dizisine ve konakçi hücrede klonlanmasina dayanan bir Iektin geninin sentezini içerir. Istenen özellikleri elde etmek için dogal Iektinin amino asit dizisi kasten modifiye edildi ve E, coli 'de eksprese edilen rekombinant lektinler elde edildi. Mevcut bulus, modifiye edilmis amino asit dizileri olan, fakat kanser dokularina, in vitro kültürlenmis hücrelere ve onlarin kültürlenmis hücrelere apoptotik aktivitesine yönelik baglanma özelliklerine göre dogal lektin ile yakin benzerliklere sahip iki rekombinant Iektini açiklamaktadir. Bununla birlikte, bu iki Iektin, dogal Iektine kiyasla, uygulamalar için daha iyi çözünürlük ve stabiliteye ve arzu edilen seker özgüllük özelliklerine sahiptir. Çözünür bir protein olarak ifade edilen rekombinant lektin, iyon degisimi ve jel filtreleme kromatografisi teknikleriyle saflastirilir. Amino asit dizisi SEQ ID 2 ve 3 yukaridaki tüm özelliklere sahip olan böyle bir Iektini temsil eder. Yukaridaki özellikleri olan protein için amino asidi kodlayan nükleik asit molekülü de uygulamanin kapsami dahilindedir. SEQ böyle bir nükleik asidi temsil eder. Diziler ayrica, , tüm dizinin herhangi bir pozisyonunda herhangi bir ikame, delesyon, ekleme veya modifikasyon, asetilasyon, nitrasyon, glikasyon, sülfonasyon vs gibi bir modifikasyon dahil olmak üzere, nükleotid veya amino asit dizilerinde herhangi bir degisikligi de öngörmektedir ve ayrica anlik uygulamada açiklanan özellikleri degistirmeyen dizilerin 5' veya 3' ucundaki kisaltmalari da içermektedir. Bir taraftan, biyotinile edilmis bir formda veya bir florojenik kromofor ile modifiye edilen bu rekombinant lektin, kanser hücrelerinin veya kanserle iliskili spesifik antijenlerin saptanmasi için kullanilabilir. Rekombinant lektinin büyüme modülatör etkisi, anti-tümör ajanlar olarak kanser tedavisinde potansiyel bir uygulamaya sahip olabilir. Diger taraftan, rekombinant Iektin, kanser tedavisinde ve arastirmasinda kullanilabilir. Uygulama özellikle, Iektine (S. rolfsii) benzer bir 141 amino asit uzun modifikasyonla kimyasal olarak sentezlenmis ve E. coli içine klonlanmistir. Bahsedilen rekombinant Iektini üretme yöntemi de açiklanmistir. Klonlanmis Iektin, indükleyici IPTG ile indüklendikten sonra ifade edilir. Spesifik olarak mevcut bulus, SEQ ID 2 veya 3 'ün bir amino asit dizisini içeren bir Iektin proteini saglar. Bulusa ait Iektin proteini, SEQ lD 1'in Iektinine kiyasla daha iyi çözünürlük ve stabilite özelliklerine sahiptir. Mevcut bulus ayrica kanser tedavisinde kullanim için bu bulusun lektin proteinini ve bu bulusun Iektin proteininin kanser hücrelerinin in vitro tespitinde kullanimini saglar. Mevcut bulus ayrica mevcut bulusun bir lektin proteinini kodlayan bir nükleik asit molekülü saglar, öyle ki, burada adi geçen nükleik asit molekülü DNA veya RNA `dir, tercihen burada nükleik asit molekülü SEQ lD 1.1 veya 2.1 'dir. Mevcut bulus ayrica, 5' ila 3' yönünde islevsel olarak bagli bir rekombinant vektör saglar: bir konakçi hücrede çalisan bir promoter; bu bulusun nükleik asit dizisinin bir lektin proteinini kodladigi bir yapisal nükleik asit dizisi; ve bir sonlandirma sinyali. Ek olarak, mevcut bulus, mevcut bulusun vektörünü içeren dönüstürülmüs bir konakçi hücre saglar. Hali hazirda mevcut bulus, asagidakileri içeren bir rekombinant Sclerotium rolfsii lektin proteini üretmek için bir islem saglar: lektin proteinini kodlayan mevcut bulusun rekombinant vektörünü içeren bir konakçi hücreyi kültürlemek; rekombinant lektin proteinini eksprese etmek; ve sözü edilen lektin proteinini kültürden ayirmak. SEKILLERIN KISA AçiKLAMAsi Sekil 1: Insan normal istirahat PBMC'lerinin (1), PHA-aktive PBMC'lerin (2), MoIt-4 (3) ve Jurkat hücrelerinin (4) membranlarindan izole edilen dogal SRL reseptörlerinin karsilastirmali profilleri. Membran proteinleri (40 ug) SDS- PAGE (%10 jel) ile çözüldü ve nitroselüloz membranina blotlandi. SRL etkilesimli proteinler, biyotinlenmis lektin ile problanmistir ve streptavidin-HRP reaksiyonu ile görsellestirildikten sonra standart moleküler agirlik protein markerleri (M) ile karsilastirilmistir. H & E boyama ile karsilastirildiginda, Rec 2 ve Rec 3 ve dogal lektinin insan kanserli dokularina baglanma paterni. Immünhistokimya için biyotinlenmis Lektin proteininin amino asit dizisi, 8. rolfsii 'den (SEO ID 1) izole edilen; Rekombinant Iektin Rec 2 Protein Dizisi, aninda uygulama. Bu Iektin için kodlanan amino asit sayisi 141 'dir ve SEO ID 2 tarafindan temsil edilir. Degistirilmis / tadil edilmis pozisyonlar dizide vurgulanmistir. Rekombinant Iektin Rec 3 Protein Dizisi, aninda uygulama. Bu Iektin için kodlanan amino asit sayisi 141'dir ve SEO ID 3 tarafindan temsil edilir. Degistirilmis / tadil edilmis pozisyonlar dizide vurgulanmistir. Çoklu dizi hizalamasi, SEQ lD 1-3'ün. Sekil 4: Aninda uygulamanin Iektinini kodlayan bir DNA dizisi, SEQ ID 1.1 BamHl (GGATCC) kisitlama bölgelerini içeren ---- nükleotitlerdir. SEQ ID: 1.1; GENIN ADI; UC-SS/CSR-; SEQ lD: 2.1; GENIN ADI: UC- BU LUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Mevcut bulus, E. coli'de, amino asit dizisindeki dogal S. rolfsii Iektine daha yakin olan ve burada Rec-2 ve Rec-3 olarak adlandirilan iki yeni varyant için klonlanmis genleri açiklar, ancak yine de yüzey yüklerinde farklilik gösterir. Dogal Iektin ile karsilastirildiginda proteinlerin daha iyi çözünürlügünü ve stabilitesini arttirmak için yüzey yükü kasitli olarak degistirilmistir. Birkaç degisiklikle S. rolfsii lektini kodlayan iki lektin geni kimyasal olarak sentezlenir ve E. coli 'de ifade edilir. Rekombinant Iektinler, geleneksel kromatografik yöntemlerle saflastirilir ve yaklasik 16,000 Da'lik moleküler kütleye sahip olduklari gösterilir. Burada tarif edilen iki rekombinant Iektin, kan grubu spesifitesi kapsaminda farklidir, tüm insan kan gruplarini tanir ve TF antijenini ve onun sifreli formlarini tanimak için özel yetenege sahiptir. Iki kan grubunun spesifik olmayan rekombinant Iektinleri, seker baglanmasi, hücre baglanmasi ve apoptotik ozellikler kazandirilmasinda dogal 8. rolfsii Iektin ile daha yakindan benzesmektedir. Bununla birlikte, rekombinant lektinler, dogal iyi stabilite ve çözünürlük Özelliklerine sahip olurlar. Rekombinant lektinlerin kullanimina yonelik çesitli uygulamalar asagidaki gibi olabilir: Kanser hücre baglayici 'özellikleri düsünüldügünde, R1 ve R2, kanser tedavisi için ilaç uygulama ajanlari olarak kullanilabilir ve ayrica mikrobiyaI/viral patojenlerin saptanmasinda tani araçlari olarak da kullanilabilir. Bu rekombinant lektinler, biyolojik sivilarda bulunan belirli glikoproteinlerin ve glikokonjugatlarin saptanmasi için kullanilabilir. Lektinler, desialillenmis TF antijeni gibi kansere bagli hücre yüzeyi karbonhidratina karsi substrat spesifikligi sergiler, bu rekombinant lektinlere baglanan glikoproteinlerin ve glikokonjugatlarin fizyolojik ve biyokimyasal öneminin saflastirilmasi için egilim matrisleri olarak kullanilabilirler. Rekombinant lektinler, rekombinant lektinlerin saflastirilmasi için füzyon partnerleri olarak kullanilabilir. Bulus simdi tercih edilen metod bilimi ve düzenlemeler yoluyla açiklanacaktir: Lektin Genin yapisi ve klonlanmasi: Toprak mantari Sclerotium rolfsii 'den saflastirilan Iektinin MALDI MS / MS ve x-isini kristalografisinden elde edilen amino asit dizisi, gen yapisinin temelini olusturdu. Bu diziye karsilik gelen gen SEQ lD 1, standart protokoller izlenerek kimyasal olarak sentezlendi. Birlestirilen gen önce bir pU057 vektörüne eklenmistir. Eklenen kisim, plazmid 'in Ndel ve BamHl ile sindirilmesiyle serbest birakildi ve daha sonra 'önceden sindirilmis Ndel ve BamHl süzülen pET20b 'ye yeniden klonlandi. Ligasyondan sonra, ekspresyon için E. coli DE3 (GOLD) konakçi susunu transforme etmek üzere plazmid kullanildi. Rekombinant klonlar Nde I ve Bam Hl ile sindirimden sonra eklenen kismin salinmasi için analiz edildi. IPTG ile indüksiyon sonrasinda rekombinant E. coli 'nin SDS-PAGE analizi, beklenen ~16 kDa proteinini gösterdi. Hücre büyümesi Rekombinant E. coli 'nin tek bir kolonisi, 5 ml LB-Amp içine inoküle edilerek gece boyunca 37 C°de çalkalanarak büyümeye birakildi. Gece boyunca yetistirilen kültür, Fermentasyon Ortamina inoküle edildi ve yaklasik ~2.0 'lik bir CD 'ye ulasana kadar 37 C°'de büyütüldü, daha sonra kültürler daha sonra ile indüklendi ve gece boyunca 20 C°'de büyütüldü. Hücre ekstratinin hazirlanmasi Gece boyunca yetistirilen kültürler, 8000 rpm'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi ve topaklanmis hücreler (4 gs), 40 mL 50 mM Tris-HCI pH 8.0 içinde, 1 mM PMSF ve 1 mM EDTA ihtiva eden süspansiyon ile birlikte bekletildi. Hücre süspansiyonu, sonikatör kullanilarak 20 dakika süreyle selenlendi. Hücreler 12000 rpm'de, 4 C° 'de 10 dakika santrifüje edildi. Süpematant daha sonra saflastirma için kullanildi. Proteinin saflastirilmasi DEAE-selüloz kromatografi: 50 mM Tris-HCl tamponu pH 8.0 içindeki süpernatant (400 mg protein), 50 mM Tris-HCI tamponu pH kolonuna yüklendi. Söz konusu kolon 2 kolon hacminde tampon ile yikandi, ardindan kolonun, 75 mM NaCl ve 200 mM NaCl içeren tampon b ile asamali olarak elüsyonu yapildi. Lektinin, 300 mM NaCl iceren tampon ile elüsyonu yapildi. Bu fraksiyon 216 mg protein içeriyordu. PEI kromatografi: DEAE elüt (216 mg), 50 mM Tris-asetat tamponu pH 8.0 ile dengelenen FPLC sistemi kullanilarak 2 mI/dak akis hizinda 15 dakika içinde %0-100'l'uk bir dogrusal NaCI gradyan uygulanarak ayirt edildi ve %98 B (60 mg) 'de protein ayrildi. Ayrilan protein, suya karsi diyaliz edildi ve amonyum bikarbonat tamponu kullanilarak ayni PEI kolonu üzerinde yeniden saflastirildi. PEI kolonu 20 mM amonyum bikarbonat tamponu pH 8.0 ile dengelendi ve protein kolona yüklendi. Baglanan protein, 20-500 mM amonyum bikarbonat tamponundan tampon gradyani kullanilarak ayirt edildi. Ayrirt edilen protein (30 mg) suya karsi diyaliz edildi, Iiyofilize edildi ve daha sonra -20 C° 'da saklandi. Jel filtrasyon kromatografisi: Rekombinant proteinin nihai saflastirilmasi islemi, AKTA Prime arti saflastirma sisteminde 25 mM TBS, pH 7.2 ile dengelenmis Superdex G-75 üzerinde jel filtrasyon kromatografisi ile elde edildi. Proteinin eksprese edilmesi ve proteinin saflastirilmasi %15 SBS PAGE üzerinde kontrol edildi ve elde edilen sonuçlar burada verilmistir. 16 kDa'lik bir moleküler büyüklüge karsilik gelen büyük bir Coomassie mavi Iekelenebilir protein bandi vardi. ORNEKLER çözünürlük çalismalari: Saflastirilmis rekombinant lektinler, suya karsi genis ölçüde diyalize ve bekletildi, santrifüj isleminden sonra berrak süpernatanda protein içerigi ve hemaglütinasyon aktivitesi belirlendi. Çözünürlük ve hemaglütinasyon aktiviteleri dogal lektin ile karsilastirildi. Histokimyasal çalismalar: Insan kolon epitelyal kanserinin teyit edilmis vakalarinin doku kesitlerine isik mikroskobu ile gözlendi. Doku kesitleri rutin olarak hematoksilin ve eozin kullanilarak boyandi ve lektin histokimyasal çalismalari, kanserli dokularin bes pm'lik doku kesitleri kullanilarak standart protokoller ile gerçeklestirildi. Histokimyasal çalismalar için kullanilan her 5 um kalinligindaki kolon kanseri dokularinin kesitleri, döner mikrotom yari otomatik (Leica RM 2145) kullanilarak elde edildi ve 1 saat boyunca 60 C°de bir kizakli isitici üzerinde isiti Iarak deparafinlestirildi. Doku kesitleri, her biri bes dakika boyunca iki ksilen degisimi içinde tutularak yeniden hidratlandi, daha sonra her biri üç dakika boyunca mutlak ve % 95 alkole aktarildi. Normal veya kanserli durumda olan dokularin durumunu dogrulamak için rutin bir prosedür olarak, doku kesitleri hematoksilin ve eozin (H ve E) lekeleri ile boyandi. Doku kesitleri, rehidrasyondan sonra, 20-25 dakika boyunca bazofilik hematoksilin ile muamele edildi, ardindan % 1 HC1, asit- alkol daldirma yapildi ve doku kesitleri akan musluk suyu altinda hafifçe yikandi. Daha sonra kesitler 2 dakika eozin ile karsit boyama yapilarak boyandi, su ile yikandi, kurutuldu ve ksilen içine daldirildi ve DPX (Distren 80 Dibutil Ftalat Ksilen), susuz kalici bir destek ortami yardimiyla hazir hale getirildi ve isik mikroskobu (Carl Zeiss Jenalumar) kullanilarak gözlendi ve fotografla ndi. Histokimyasal boyama, Danguy ve Gabius tarafindan, Gabiot ve Gabius 'de (1993) tarif edildigi gibi biyotinlenmis lektinler kullanilarak gerçeklestirilmistir. Tüm reaktifler boyamadan önce oda sicakligina dengelendi. Doku kesitleri boyama prosedürü sirasinda hiçbir zaman kurumaya birakilmadi. Çalisma ayni zamanda biyotinlenmis lektini hariç tutarak hazirlanan kontrol slaytlarini da içermektedir. Endojen peroksidaz aktiviteyi bloke etmek için, rehidrasyondan sonra doku kesitleri, oda sicakliginda 30 dakika boyunca % 0.3 hidrojen peroksit içeren metanol ile inkübe edildi. Kesitler daha sonra 5 dakika boyunca su ile ve daha sonra 5 dakika boyunca TBST (pH 7.2) ile durulandi. Doku kesitleri, PBS pH 7.2 ile durulandiktan sonra, BSA ile spesifik olmayan baglanma bölgelerini bloke etmek için 15 dakika boyunca 0.1 M PBS çözeltisi içinde % 1 periodatla muamele edilmis BSA ile inkübe edildi. Kesitler daha sonra 5 dakika boyunca TBST ile durulandi. Biyotinilatlanmis lektinler (PBS içinde 20 ug/ml), tam olarak baglanmayi kolaylastirmak için kesitleri tamamen örtmek ve 1 saat inkübe etmek için dikkatli bir sekilde uygulandi. Kesitler daha sonra 5 dakika süreyle TBST ile durulandi. Bu doku kesitleri daha sonra oda sicakliginda 30 dakika süreyle PBS, pH 7.2'de streptavidin-HRP (1 -›1000 seyreltme) ile inkübe edildi. Kesitler daha sonra 5 dakika süreyle iki TBST, pH 7.2 degisimi ile durulandi. Streptavidin-HRP konjugasyonundan sonra, imalatçi kilavuzlarina göre hazirlanan tampon çözeltide (pH 7.5) DAB Kromojen/H202 substratinda doku kesitleri gelistirildi. Doku kesitleri 10 dakika inkübe edildi ve daha sonra 5 dakika süreyle su ile nazikçe durulandi. Slaytlar kurumaya birakildi ve ksilen içine daldirildi ve daha sonra DPX içine yerlestirildi. Kesitler daha sonra normal ve kanser dokulari tarafindan boyama yogunlugunu gözlemlemek ve incelemek için isik mikroskobu (Carl Zeiss Jenalumar) altinda incelendi ve fotograflari çekildi. Hücre yüzey antijenlerin tanimlanmasi: Rekombinant lektin ile normal lenfositlere kiyasla aktive ve transforme lenfositler üzerinde eksprese edilen neoglikanlarin tanimlanmasi; PHA ve dönüstürülmüs hücreler tarafindan aktivasyon üzerine Ienfositlerde eksprese edilen neoglikoproteinlerin tanimlanmasi için, etkilesim çalismalari biyotinlestirilmis lektin ile ilgili hücre membran proteinleriyle gerçeklestirilmistir. Hücre Membran Proteinlerinin izolasyonu: Insan periferik lenfositleri, saglikli bir vericiden toplanan kandan hazirlandi. EDTA ( içeren cam santrifüj tüpüne toplanan kan örnegi (20 ml) ve normal lenfositler FicoII-Hypaque (Pharmacia) gradyaninda santrifüj edilerek ayrildi. Normal Ienfositlerin bir kismi, C02 inkübatöründe 72 saat boyunca % 10 FCS ile takviye edilmis RPMI-164O ortaminda PHA ( ile inkübe edilerek aktive edildi. Aktive edilmis hücreler santrifüj edilerek toplandi ve CD25 reseptörlerinin ekspresyonu kontrol edilerek aktivasyon teyit edildi. Normal Ienfositler, aktive edilmis lenfositler ve I'osemik hücre siralari; MoIt-4 ve Jurkat, son olarak, glutamin (2 mM), isiyla inaktive edilmis FCS (%10), penisilin ortaminda muhafaza edildi. Kültürler, nemlendirilmis atmosferde (%95 hava ve %5 002) 37 C°de tutuldu. Bu kültürlenmis hücrelerden elde edilen membran proteinleri, "Pierce Membran Protein Ekstraksiyon Reaktifi kiti" yöntemi (Mem-PER, Prod # 89826) kullanilarak izole edildi ve protein içerikleri, Bio-Rad'in DC-Protein kestirim Kiti kullanilarak tahmin edildi. Izole edilmis membran proteinleri nihayet kloroform- metanol çökeltmesiyle konsantre edildi ve çökeltilen proteinler havada kurutuldu ve daha ileride kullanilmak üzere 4 C°'d e saklandi. Elektroforez ve Western Blotting: Poliakrilamid jel elektroforezi, 120 voltta 60 dakika boyunca %10 jelde bir minijel sistemi (Hoefer Scientific Instruments. ABD) kullanilarak SDS ortaminda gerçeklestirildi. Proteinler, poliakrilamid jellerinden Nitro Selüloz membranlarina, 3 saat boyunca 4 C°da 75 mA'da %20 metanol içeren transfer tamponu ( kullanilarak bir yari-siyirma kurutma ekipmaninda aktarildi. Membranlar bloke edici solüsyon (%3 p-BSA) ile transfer edildikten sonra doyuruldu ve TBST ile yikandi. Lektin baglanmasi, oda sicakliginda, 20 ug/ml'lik (TBST 'de hazirlanmis) nihai konsantrasyonda biyotin bagli lektin ile 4 saat boyunca gerçeklestirildi. Iyice yikandiktan sonra, leke oda sicakliginda 1 saat boyunca Streptavidin-HRP (TBST 'de 1:1000) ile ink'ube edildi ve fazla Streptavidin-HRP, TBST ile yikandi. Son olarak, lektin- glikoprotein bantlari DAB kromojenik sistem ile gelistirilerek görsellestirilmistir. Bu bulgularin sonuçlari, mevcut rekombinant lektinin, Iösemik hücreler üzerinde ve ayrica aktive olmus lenfositler 'üzerinde benzersiz olarak ifade edilen neoglikanlarin bazilarina baglanma yetenegine sahip oldugunu göstermektedir. SDS PAGE ve lektin blotting Yumurtalik kist sivisi örneklerinden elde edilen proteinler, Laemmli ve arkadaslari tarafindan San Francisco, ABD'deki Hoefer Scientific lnstruments kullanilarak ve tarif edildigi gibi %10 jel içinde SDS PAGE ile ayrildi. Elektroforez islemi 110 volt altinda 70 dakika boyunca gerçeklestirildi. Elektroforez fraksiyone protein bantlari çözüldükten hemen sonra, yari- kuru blot tertibati kullanilarak nitro selüloz zar `üzerine blotlandi. Blotlanmis zar, damitilmis su ile yikandi ve Iekeleme etkinligini dogrulamak ve standart proteinlerin yerini isaretlemek amaciyla Ponceau reaktifi ile boyandi. Son olarak, leke % içeren TBS ile yikandi ve spesifik olmayan baglanmayi önlemek için gece boyunca TBST içinde %3 P-BSA ile muamele edildi. TBST ile yikandiktan sonra, blot 4-6 saat boyunca 37 C° 'de biyotinlenmis Iektinler (TBST içinde 20 tig/ml) ile inkübe edildi. Fazla miktardaki ve baglanmamis lektin, membranin TBST ile yikanmasiyla uzaklastirildi ve daha sonra membranlar bir saat süreyle Streptavidin-HRP (TBST içinde 1 tig/ml) ile inkübe edildi. Bagli olmayan Streptavidin-HRP, TBST ile yikanarak ortamdan uzaklastirildi. Lektin baglayici glikoproteinler, DAB sistemi kullanilarak peroksidaz aktivitesi için Iekelenerek görsellestirildi. PBMC 'ler ve kültürlü I'ösemik ve kolon kanseri hücrelerinde Proliferatif ve Antiproliferatif aktivite Insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC 'Ier) üzerinde SRL 'nin proliferatif / antiproliferatif aktivitesi, Wang ve arkadaslari tarafindan [1992] açiklandigi gibi bazi modifikasyonlarla yeni izole edilmis insan PBMC'leri kullanilarak tritiyatlanmis timidin birlestirme deneyi ile belirlenmistir. PBMC'ler, saglikli donörlerin taze toplanan kan örneklerinden izole edildi ve hücreler daha önce tarif edildigi gibi RPMl 1640 eksiksiz ortami içinde muhafaza edildi. Hücreler %10 FCS içeren RPMI ortami ile seyreltildi ve daha sonra 96 kuyucuklu mikroplakalarda (NUNC Danimarka) tohumlandi (1x105 hücre/50 uI/kuyucuk). RPMI 1640 ortami içinde SRL'nin çesitli konsantrasyonlari (10, 5, ve 37 C' 'de, nemlendirilmis, %5'Iik bir C02 atmosferde, 72 saat boyunca inkübe edildi. Toplam inkübasyon periyodundan on sekiz saat önce, 10 ul'lik bir son hacimde her kuyucuga 1 i.iCi tritiyatlanmis timidin eklenmis ve inkübasyon 18 saat daha devam ettirilmistir. Son olarak, hücreler bir cam filtre kagidi (Amersham Biosciences) üzerinde hücre hasat makinesi (NUNC, Danimarka) kullanilarak toplandi, damitilmis su ile iyice yikandi ve mikro-firin içinde kurutuldu. Filtre diskleri, 600 ul toluen bazli sintilasyon kokteyli içeren sintilasyon siselerine (Tarsons, Hindistan) aktarildi. Son olarak, eklenen tritiyatlanmis timidin, dakika basina sayim (CPM) yapan bir ß-sintilasyon sayaci (Packard Bioscience Ltd.) ile ölçülmüstür. Lektin-reseptör aracili proliferatif aktiviteyi teyit etmek için, deneyler, musin ile önceden inkübe edilmis SRL kullanilarak gerçeklestirilmistir. SRL (10 ug/ml), 1 saat boyunca 37 C° 'da musin (100 pl içinde 12.5 ug) ile Önceden inkübe edildi ve hücre proliferasyon analizi için kullanildi. Sadece lektinsiz hücreler ve musin olan hücreler içeren uygun kontroller dahil edildi. Sonuçlar üç kopya halinde yapilan üç bagimsiz deneyi temsil etmektedir. SRL 'nin MoIt-4 lösemik hücre sirasi üzerinde proliferatif/antiproliferatif etkisi, daha önce tarif edildigi gibi tritiyatlanmis timidin birlestirme deneyi ile belirlenmistir. SRL'nin MOIt-4 Iösemik hücre sirasi üzerinde proliferatif/antiproliferatif etkisi, daha önce tarif edildigi gibi tritiyatlanmis timidin birlestirme deneyi ile belirlenmistir. Hücreler 96 kuyucuklu bir doku kültürü plakasinda tohumlandi (1 x 105/kuyucuk) ve Iektin tedavisinden önce 3 saat boyunca ortama alismalari için birakildi. Her bir kuyucuga 50 ul RPMI ortami içinde SRL'nin seri konsantrasyonlari 6.25 pg/ml 'den 100 ug/ml arasinda eklendi ve 72 saat inkübe edildi. Diger tüm test adimlari daha önce açiklandigi gibi ayni kaldi. Lektin bloklama testi için, SRL (100 ug/ml), 37 C°`de 1 saat boyunca 100 ul toplam hacimde 12.5 iJg musin ile önceden inkübe edildi ve analiz için kullanildi. Rekombinant Dizileri Gen dizileri ve asagidaki biyolojik aktiviteye sahip olan proteinler: tüm insan kan gruplarini tanir ve seker baglanmasi, hücre baglanmasi ve apoptotik özellikler getirmede dogal S. rolfsii lektini ile benzesen TF antijenini ve sifreli formlarini tanimak için özel yeteneklere sahiptir, dogal Iektinlere göre daha iyi stabilite ve çözünürlük özelliklerine sahip olmasi uygulama kapsamindadir. Rekombinant molekülleri kodlayan nükleotit molekülleri, DNA veya RNA olabilir. Yukarida belirtilen özelliklerin proteinler, kasitli veya rastgele mutasyonlarla elde edilmis olsun, anlik uygulama kavrami kapsamindadir. Rekombinant lektinlerin farkli kültürlenmis hücrelere baglanmasi Tablo 1 'de sunulmaktadir. Tablo1. Rekombinant Iektinlerin Kültürlenmis lösemik (Molt 4 & Jurkat), Ovarian (PA 1) ve kolon (COLO 205) hücrelerine baglanmasi ve musin ile baglanma inhibisyonu Hücre % pozitif hücreler Rec 2 Rec 3 Dogal Lektin+Musin 0.24 0.30 0.24 Lektin+Musin 0.89 1.02 0.50 Lektin+Musin 2.5 4.28 1.63 Lektin+Musin 0.87 1.08 0.99 Her durumda R2 ve R3 'ün Molt 4, Jurkat (lösemik hücreler), PA-1 (yumurtalik hücreleri) ve COLO 205 (kolon hücreleri) ile baglanmasi %90 'dan daha büyüktür ve baglanma musin tarafindan ortadan kaldirilabilir. Baska bir uygulama olarak, söz konusu bu kültürlenmis hücreler üzerindeki immünomodülatbr etki açiklanmaktadir. Hem R2 hem de R3, kültürlenmis hücreler üzerinde anti-proliferatif aktivite uyguladi, yumurtalik hücreleri (%50) ve kolon hücreleri (%40) ile karsilastirildiginda, lösemik hücreler üzerinde ise en yüksek etkiyi (%60) göstermistir. Büyüme modülatör etkileri kanser tedavisinde potansiyel uygulama yapabilir (Tablo 2). Tablo 2. MTT tayini ile k'L'ilt'ürIenmis hücreler 'üzerinde rekombinant Bulusun tercih edilen uygulamalarinin birinde, eksprese edilen Iektin proteini (SEQ ID 2 ve 3), modifikasyonuna/substitüsyonuna göre dogal Iektin proteininden farklidir. pozisyonlarda en az bir amino asit Bunlar arasinda pozisyon degisiklikleri Tablo 3 'te gösterilmistir. Tablo 3. Dogal Iektin sekansina kiyasla Rec 2 ve Rec 3 için degistirilen amino asit pozisyonlari Lektin Degisen amino asit pozisyonlari Dogal Ac-T N T E E 81 T D T O Q 82 V D 8 Q Q Rekombinant lektin dizileri, kanser hücrelerinin veya kansere bagli spesifik antijenlerin saptanmasinda kullanilmak üzere yaygin olarak bilinen yöntemler kullanilarak biyotinile edilebilir veya florojenik kromofor ile birlestirilebilir. Rekombinant lektinin büyüme modülatör etkisi, kanser tedavisindeki yerini bulmustur. Ayrica, mevcut tedavide kanser tedavisi için bir ilaç dagitim ajani olarak rekombinant Iektin 'in kullanilmasi öngbrulmüstür. TR TR TR TR TR TR TR