TARIFNAME MEZENKIMAL KÖK HÜCRELERI VE BUNLARIN KULLANIMLARI Bu bulus, koroner ve periferik arter yetersizliginin tedavi edilmesinde kullanima yönelik veya anjiyojenezi gelistirerek veya indükleyerek bir insanda tikali arterlerin tedavi edilmesinde kullanima yönelik mezenkimal kök hücreleri ile Mezenkimal kök hücreleri (MSC'Ier), osteoblastlari, miyositleri, kondrositler ve adipositleri içeren köklerde kolay bir sekilde farklilasabilen çok yetili kök vitro çalismalari, MSC'Ierin kas içindeki (Wakitani, et al., Muscle Nerve, vol. 18,, pg. 1417 (1995)), nöronal benzeri prekursörlerdeki (Woodbury, et al., J. Neurosci. hücre türlerindeki farklilasma yetenegini göstermistir. Ayrica, MSC'Ierin hematopoetik ve embriyonik kök hücrelerinin genislemesine yönelik etkili besleyici katmanlari sagladigi gösterilmistir (Eaves, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., Çesitli hayvan modelleriyle son zamanlarda yapilan çalismalar, MSC'Ierin zarar görmüs kemigin, kikirdagin, menisküsün veya miyokardiyal dokularin onariminda veya yeniden olusturulmasinda faydali olabilecegi göstermistir (DeKok, et al., Clin. Oral Implants Res., vol. 14, pg. 481 (2003)); Wu, et al., Transplantation, vol. et al., Blood Cells Mol. Dis., vol. 27 (2002)). Birkaç arastirmaci, cam kemik al., J. Neurosci. Res., vol. 72, pg. 393 (2003)) ve kardiyak hastaliklar (Tomita, et yönelik tesvik edici sonuçlar ile MSC'Ieri kullanmistir. Önemli bir sekilde, umut verici sonuçlar ayni zamanda cam kemik hastaligina (Horwitz, et al., Blood, vol. (2002)) ve heterolog kemik iligi nakillerinin gelistirilmis yamanmasina (Frassoni, et al., Int. Society for Cell Therapy, SA006 (abstract) (2002); Koc, et al., J. Clin. Oncol., vol. 18, pg. 307 (2000)) yönelik klinik çalismalarda rapor edilmistir. MSC'Ier, bunlarin yüzeyi üzerinde majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sinif CD4O yardimci uyaran molekülleri (Majumdar, et al., J. Biomed. Sci., vol. 10, pg. 228 (2003)) ifade etmez, bu hücrelerin düsük bir immunojen fenotipine sahip oldugunu önerir (Tse, et al., Transplantation, vol. 75, pg. 389 (2003)). MSC'Ier ayni zamanda MHC'den bagimsiz bir sekilde 1-hücreli proliferatif tepkiler gösterir (Bartholomew, et al., Exp. Hematol., vol. 30, pg. 42 (2002); Devine, et al., Cancer MSC'Ierin bu immunolojik özellikleri, bunlarin transplantasyon yamanmasini gelistirebilir ve transplantasyonun akabinde allojenik hücreleri tanimlamak ve reddetmek üzere alici immun sisteminin yetenegini sinirlandirabilir. immun sistemi modüle eden ve lokal stimuli altinda uygun hücre tiplerinde farklilasmaya yönelik yetenekleri ile birlikte hematopoezi destekleyen MSC'Ier tarafindan faktörlerin üretimi, bunlari hücresel transplantasyon çalismalarina yönelik istenen kök hücreler haline getirir (Majumdar, et al., Hematother. Stem Cell Res., vol. 9, Uluslararasi Patent Basvurusu Yayin No. WO 03/059272 A2, anjiyojenez ve vaskülojenezin indüklenmesinde kullanima yönelik bir terapötigi açiklar, terapötik, farmasötik olarak kabul edilebilir bir hücre terapisi ile birlikte kök hücrelerden izole edilen anjiyojenez ve vaskülojenezi indükleyen faktörleri içerir. Basvuru sahipleri mevcut durumda mezenkimal kök hücrelerinin dendritik hücreler (DC1 ve DC2), efektör T-hücreleri (Th1 ve Th2) ve NK hücrelerini içeren izole immun hücre popülasyonlari ile etkilesimlerini incelemistir. Bu tür etkilesimlere bagli olarak, basvuru sahipleri mezenkimal kök hücrelerinin, immun yaniti prosesinde birkaç adimi regüle edebilecek çesitli faktörlerin üretimini regüle edebilecegini bulmustur. Bu nedenle mezenkimal kök hücreleri, immün sistem dahil olmak üzere hastalik durumlari ve bozuklari veya inflamasyon veya alerjik yanitlar dahil olmak üzere hastaliklar, durumlar veya bozukluklarin tedavisinde kullanilabilir. Bu tür hastaliklar, durumlar ve bozukluklar, bunlarla sinirli olmamak üzere otoimmün hastaliklari, alerjiler, artrit, iltihapli yaralar, saçkiran (kellik), jinjivit ve periyodontit dahil olmak üzere periyodontal hastaliklar ve bir immün yaniti dahil olmak üzere diger hastaliklar, durumlar veya bozukluklari içerir. Ayrica yeni kan damarlarinin olusumunu stimüle ederek anjiyojenezi gelistiren vasküler endotelyal büyüme faktörünü veya VEGF'yi üretmek üzere mezenkimal kök hücrelerinin periferik mononükleer kan hücrelerini (PBMC'Ier) stimüle ettigi düsünülür. Ayrica mezenkimal kök hücrelerinin tümör baskilama ve viral enfeksiyona karsi bagisikligi gelistiren Interferon-Beta (IFN-ß) üretmek üzere dendritik hücreleri (DC'Ier) stimüle ettigi düsünülür. Mevcut bulus, koroner ve periferik arter yetersizliginin tedavi edilmesinde kullanima yönelik ve anjiyojenezi gelistirerek veya indükleyerek tikali arterlerin tedavi edilmesinde kullanima yönelik mezenkimal kök hücrelerine yöneliktir, burada mezenkimal kök hücreleri genetik olarak manigüle edilmemis ve allojeneiktir ve burada mezenkimal kök hücreleri, endotelyal büyüme faktörü (VEGFR) üretmek ve böylece anjiyojenezi gelistirmek veya indüklemek üzere periferik mononükleer kan hücrelerini (PBMC'Ieri) stimüle eder. Mevcut bulusun bir düzenlemesinde mezenkimal kök hücreleri, koroner arter hastaligi, iskemik kalp hastaligi ve periferik arter hastaliginin tedavi edilmesinde kullanima yöneliktir. Mevcut bulusun bir düzenlemesinde tikali arterler, ekstremitelerde veya boyundadir, burada örnegin ekstremiteler, kollar, bacaklar, eller ve ayaklardan seçilir. Mevcut bulusun bir düzenlemesinde mezenkimal kök hücreleri, beyni besleyen tikali arterlerin tedavi edilmesinde kullanima yöneliktir, istege bagli olarak bulusun bir düzenlemesinde mezenkimal kök hücreleri, felcin tedavi edilmesinde veya önlenmesinde kullanima yöneliktir. Mevcut bulusun bir düzenlemesinde mezenkimal kök hücreleri, sistemikal olarak veya anjiyojeneze ihtiyaci olan bir doku veya organa dogrudan uygulama ile uygulanacaktir, istege bagli olarak bulusun bir düzenlemesinde sistemik uygulama, intravenöz, intraarteriyel veya intraperitoneal uygulamadir. Ayni zamanda burada bir hayvanda otoimmün hastaliklarinin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem açiklanir. Yöntem, hayvanda hastaligi tedavi etmek üzere etkili bir miktarda hayvana hayvan mezenkimal kök hücrelerinin uygulanmasini içerir. Mevcut açiklamanin bu açisinin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmamasina ragmen mezenkimal kök hücrelerinin otoimmün hastaliklarini baskiladigi en az bir mekanizmanin düzenleyici T-hücrelerinden (TReg hücreleri) ve/veya dendritik hücrelerden (DC) Interlökin-10 (IL-10) salimina neden olarak gerçeklestigi düsünülür. Mevcut açiklamaya göre tedavi edilebilecek otoimmün hastaliklari, bunlarla sinirli olmamak üzere multipl skleroz, Tip 1 diyabet, romatoid artrit, üveit, otoimmün tiroid hastaligi, inflamatuvar bagirsak hastaligi, otoimmün Ienfoproliferatif hastalik (ALPS), demyelinizan hastalik, otoimmün ensefalomyeliti, otoimmün gastrit (AIG) ve otoimmün glomerüler hastaliklari içerir. Ancak mevcut açiklamanin kapsaminin burada bahsedilen spesifik hastaliklarin tedavisi ile sinirli olmadiginin anlasilmasi gerekir. Bir düzenlemede mezenkimal kök hücrelerinin uygulanacagi hayvan, bir memelidir. Memeli, insan veya insan olmayan primatlar dahil olmak üzere bir primat olabilir. Genel olarak, mezenkimal kök hücre (MSC) terapisi örnegin asagidaki diziye dayanir: MSC-içeren dokunun toplanmasi, izolasyonu ve MSCilerin genisletilmesi ve biyokimyasal veya genetik manipülasyon ile veya bunlar olmadan MSC'Ierin hayvana uygulanmasi. Uygulanan mezenkimal kök hücreleri homojen bir bilesim olabilir veya MSC'Ier içinde zenginlestirilmis bir karistirilmis hücre popülasyonu olabilir. Homojen mezenkimal kök hücre bilesimleri, bitisik ilik veya periosteal hücreler kültürlenerek elde edilebilir ve mezenkimal kök hücre bilesimleri, bitisik ilik veya periosteal hücreler kültürlenerek elde edilebilir ve mezenkimal kök hücreleri, essiz monoklonal antikorlar ile belirlenen spesifik hücre yüzeyi belirleyicileri ile belirlenebilir. Mezenkimal kök hücrelerinde zenginlestirilmis bir hücre popülasyonunun elde edilmesine yönelik bir yöntem örnegin U.S. Patent No. ,486,359ida açiklanir. Mezenkimal kök hücrelerine yönelik alternatif kaynaklar, bunlarla sinirli olmamak üzere kan, deri, kordon kani, kas, yag, kemik ve perikondriyumu içerir. Mezenkimal kök hücreleri, çesitli prosedürler araciligiyla uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri, örnegin intravenöz, intraarteriyel veya intraperitoneal uygulama ile sistematik olarak uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri, otologöz, allojeneik veya ksenogenik içeren kaynaklarin bir spektrumundan olabilir. Mezenkimal kök hücreleri, bir hayvanda bir otoimmün hastaligini tedavi etme üzere yeterli bir miktarda uygulanir. Mezenkimal kök hücreleri, yaklasik yaklasik 5x106 hücre/kg miktarinda uygulanabilir. Uygulanacak mezenkimal kök hücrelerin miktari, hastanin yasi, agirligi ve cinsiyetini, tedavi edilecek otoimmün hastaligi ve bunun kapsamini ve siddetini içeren birçok faktöre baglidir. Mezenkimal kök hücreleri, kabul edilebilir bir farmasötik tasiyici ile birlikte uygulanabilir. Örnegin, mezenkimal kök hücreleri, enjeksiyona yönelik farmasötik olarak kabul edilebilir bir sivi ortaminda bir hücre süspansiyonu olarak uygulanabilir. ayni zamanda bir hayvanda bir inflamatuvar yanitin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem açiklanir. Yöntem, hayvanda inflamatuvar yaniti tedavi etmek üzere etkili bir miktarda hayvan mezenkimal kök hücrelerinin uygulanmasini içerir. Mevcut açiklamanin bu açisinin kapsaminin herhangi bir teorik çikarim ile sinirlandirilmamasina ragmen, mezenkimal kök hücrelerinin, düzenleyici T- hücrelerine (TReg) T-hücre maturasyonunu gelistirdigine, böylece inflamatuvar tepkileri kontrol ettigine inanilir. Ayni zamanda, mezenkimal kök hücrelerinin T yardimci 1 hücrelerini (Th1 hücreleri) inhibe ettigine böylece örnegin psoriyazis ile iliskili olanlar gibi belli inflamatuvar reaksiyonlarda Interferon-y (IFN-y) ekspresyonunu düsürdügüne inanilir. Bir açiklamada tedavi edilebilecek inflamatuvar yanitlar, psoriyazis ile iliskili olanlardir. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, inflamasyonu azaltmak üzere mezenkimal kök hücreleri beyinde mikrogliya ve/veya astrositler ile temas kuracak sekilde bir hayvana uygulanabilir, böylece mezenkimal kök hücreleri. Alzheimer hastaligi, Parkinson hastaligi, felç veya beyin hücresi hasarlari gibi hastaliklar veya bozukluklarda aktive edilmis gliyal hücrelerden kaydaklanan nörodejenerasyonu sinirlandirir. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, psoriyazis, kronik dermatit ve kontakt dermatitte meydana gelebilecegi üzere inflamasyonu azaltmak üzere mezenkimal kök hücreleri cildin epidermindeki kerotinositler ve Langerhans hücreleri ile temas edecek sekilde bir hayvana uygulanabilir. Bu düzenlemenin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmamasina ragmen mezenkimal kök hücrelerinin epidermideki kerotinositler ve Langerhans hücreleri ile temas edebilecegi ve tümör nekroz faktörü-alfanin (TNF-oi) azaltilmis ifadesine ve artan düzenleyici T-hücresi (Treg hücre) popülasyonuna neden olan bir sekilde T- hücresi reseptörleri ve sitokin salgilama progillerinin ifadesini degistirebilecegi düsünülür. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, bunlarla sinirli olmamak üzere osteoartrit ve romatoid artrit ve www.arthritis.orq/conditions/diseases web sitesinde listelenen diger artritik hastaliklar dahil olmak üzere artrit ve artrit benzeri durumlarda meydana geldigi üzere kemikteki inflamasyonu azaltmak üzere kullanilabilir. Bu düzenlemenin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmasinin amaçlanmamasina ragmen mezenkimal kök hücrelerinin sinovyal sivi içinde hafiza T-hücreleri tarafindan Interlökün-17 salgilasini inhibe edebilir. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, sirasiyla inflamatuvar bagirsak hastaligi ve kronik hepatit sirasinda bagirsak ve karaciger içindeki iltihaplanmayi sinirlandirmak üzere kullanilabilir. Mevcut açiklamanin bu açisinin kapsaminin, teorik herhangi bir çikarim ile sinirlandirilmamasina ragmen, mezenkimal kök hücrelerin, yüksek Interlökin-1O (IL-10) salgilamasini ve düzenleyici T- hücrelerinin (Treg hücreleri) olusumunu gelistirdigine inanilir. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, yanik yaralanmasi, ameliyat ve nakiller dahil olmak üzere sepsis ve travma gibi patolojik durumlarda asiri nötrofil ve makrofaj aktivasyonunu inhibe etmek üzere kullanilabilir. Bu bulusun kapsaminin herhangi bir çikarim ile sinirlandirilmamasina ragmen, mezenkimal kök hücrelerin, lL-10 gibi baskin sitokinlerin salgilanmasini gelistirdigine ve makrofaj migratuar inhibitör faktörünü inhibe ettigine inanilir. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, kornea, lens, pigment epitelyum ve retina, beyin, spinal kord, hamile rahim ve plasenta, yumurtalik, testisler, adrenal korteks, karaciger ve kil folikülleri dahil olmak üzere göz gibi immün ayriclalikli yerlerde inflamasyonu kontrol etmek üzere kullanilabilir. Bu bulusun kapsaminin herhangi bir çikarim ile sinirlandirilmamasina ragmen, mezenkimal kök hücrelerin, IL-10 gibi baskin sitokinlerin salgilanmasini ve Treg hücrelerinin olusumunu gelistirdigine inanilir. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, diyalik ve/veya glomerülonefrit sirasinda son asama böbrek hastaligi (ESRD) enfeksiyonlarini kontrol etmek üzere kullanilabilir. Bu düzenlemenin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmasinin amaçlanmamasina ragmen mezenkimal kök hücrelerinin glomerüler yapilanmayi stimüle edilen vasküler endotelyal büyüme faktörünü veya VEGF"yi ifade etmek üzere periferik mononükleer kan hücrelerini indükledigi düsünülür. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, influenza, hepatit C, Herpes Simplex Virüsü, vaksinia virüsü enfeksiyonlari ve Epstein-Barr virüsü gibi viral enfeksiyonlari kontrol etmek üzere kullanilabilir. Bu düzenlemenin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmamasina ragmen, mezenkimal kök hücrelerin, Interferon-Beta (IFN-ß) salgilanmasini gelistirdigine inanilir. Diger bir açiklamada mezenkimal kök hücreleri, Leishmania enfeksiyonlari ve Helicobacter enfeksiyonlari gibi parazitik enfeksiyonlari kontrol etmek üzere kullanilabilir. Bu düzenlemenin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmamasina ragmen, mezenkimal kök hücrelerin T yardimci 2 (Th2) hücrelerine araci oldugu ve böylece ß-hücreleri tarafindan artan Immünoglobulin E (IgE) üretimini gelistirdigi düsünülür. Mezenkimal kök hücreleri, yukarida açiklandigi üzere insan ve insan olmayan primatlar dahil olmak üzere bir memeliye uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri ayni zamanda yukarida açiklandigi üzere sistematik olarak uygulanabilir. Alternatif olarak osteoartrit veya romatoid artrit durumunda mezenkimal kök hücreleri, dogrudan bir artritik ekleme uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri, bir hayvanda bir inflamatuar yaniti tedavi etmek üzere yeterli bir miktarda uygulanir. Mezenkimal kök hücreleri, yaklasik 1x105 hücre/kg ile yaklasik 1x107 hücre/kg, tercihen yaklasik 1x106 hücre/kg ila yaklasik 5x106 hücre/kg miktarinda uygulanabilir. Uygulanacak mezenkimal kök hücrelerin tam dozaji, hastanin yasi, agirligi ve cinsiyetini, tedavi edilen inflamatuvar yaniti ve bunun kapsamini ve ciddiyetini içeren birçok faktöre baglidir. Mezenkimal kök hücreleri, yukarida açiklandigi üzere farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile birlikte uygulanabilir. Mevcut açiklamanin diger bir açiklamasina göre burada bir hayvanda kanserin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem, hayvanda kanseri tedavi etmek üzere etkili bir miktarda hayvan mezenkimal kök hücrelerinin uygulanmasini içerir. Mevcut açiklamanin bu açisinin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmasinin amaçlanmamasina ragmen mezenkimal kök hücrelerinin karsiliginda bir tümör baskilayici olarak islev gören lFN-ß salgilamaya neden olan dendritik hücreler ile etkilesime girdigi düsünülür. Tedavi edilebilecek kanserler, bunlarla sinirli olmamak üzere hepatosellüler karsinom, rahim agzi kanseri, prostat kanseri, fibrosarkom, medülloblastom ve astrositomu içerir. Ancak mevcut açiklamanin kapsaminin herhangi bir türdeki kanser ile ile sinirli olmadiginin anlasilmasi gerekir. Hayvan, yukarida açiklandigi üzere insan ve insan olmayan primatlar dahil olmak üzere bir memeli olabilir. Mezenkimal kök hücreleri, hayvana hayvanda kanseri tedavi etmek üzere etkili bir miktarda uygulanir. Genel olarak mezenkimal kök hücreleri, yaklasik yaklasik 5X'106 hücre/kg miktarinda uygulanabilir. Uygulanacak mezenkimal kök hücrelerin tam miktari, hastanin yasi, agirligi ve cinsiyeti, tedavi edilen kanser türü ve bunun kapsami ve siddeti dahil olmak üzere birçok faktöre baglidir. Mezenkimal kök hücreleri, yukarida açiklandigi üzere farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile birlikte uygulanabilir ve sistemik olarak uygulanabilir. Alternatif olarak mezenkimal kök hücreleri, dogrudan tedavi edilen kansere uygulanabilir. Mevcut açiklamanin diger bir açiklamasina göre burada bir hayvanda bir alerjik hastalik veya bozuklugun tedavi edilmesine yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem, hayvanda alerjik hastalik veya bozuklugu tedavi etmek üzere etkili bir miktarda hayvan mezenkimal kök hücrelerinin uygulanmasini içerir. Mevcut açiklamanin bu açisinin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmasinin amaçlanmamasina ragmen mezenkimal kök hücrelerinin bir akut alerjik yanittan sonra uygulanmasi durumunda mast hücresi aktivasyonu ve degranülasyonunun inhibisyonunu sagladigi düsünülür. Ayni zamanda mezenkimal kök hücrelerinin bazofil aktviasyonunu azaltarak düzenledigi ve sitokinler, örnegin TNF-oi, kemokin, örnegin Interlökin-8 ve monosit kemoatraktan proteini veya MCP-1, Iipid aracilari, örnegin Iökotrienleri inhibe ettigi ve histamin, heparin, kondroitin, sülfatlar ve katepsin gibi baslica aracilari inhibe ettigi düsünülür. Tedavi edilebilecek alerjik hastaliklar veya bozukluklar, bunlarla sinirli olmamak üzere astim, alerjik rinit, atopik dermatit ve kontakt dermatiti içerir. Ancak mevcut açiklamanin kapsaminin spesifik olarak herhangi bir alerjik hastalik veya bozukluk ile ile sinirli olmadiginin anlasilmasi gerekir. Mezenkimal kök hücreleri, hayvana hayvanda alerjik hastalik veya bozuklugu tedavi etmek üzere etkili bir miktarda uygulanir. Hayvan bir memeli olabilir. Memeli, insan veya insan olmayan primatlar dahil olmak üzere bir primat olabilir. Genel olarak mezenkimal kök hücreleri, yaklasik 1x105 hücre/kg ila yaklasik miktarinda uygulanabilir. Tam dozaj, hastanin yasi, agirligi ve cinsiyeti, tedavi edilen alerjik hastalik veya bozukluk ve bunun kapsami ve siddeti dahil olmak Mezenkimal kök hücreleri, yukarida açiklandigi üzere farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile birlikte uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri, sistematik olarak örnegin intravenöz veya intraarteriyel uygulama ile uygulanabilir. Mevcut açiklamanin diger bir açisina göre burada bir hayvanda yara iyilesmesinin gelistirilmesine yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem, hayvana hayvanda yara iyilesmesini gelistirmek üzere etkili bir miktarda hayvan mezenkimal kök hücrelerine uygulamayi içerir. Mevcut açiklamanin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmasinin amaçlanmamasina ragmen yukarida bahsedildigi üzere mezenkimal kök hücrelerinin, Treg hücrelerinin ve dendritik hücrelerin Interlökin-10 (IL-10) salgilamasina neden oldugu düsünülür. lL-10, bir yarada inflamasyonu sinirlandirir veya kontrol eder, böylece bir yaranin iyilesmesini gelistirir. Ayrica mezenkimal kök hücreleri, diger hücre türleri tarafindan salgilama faktörlerini indükleyerek yara iyilesmesini ve kiriklarin iyilesmesini gelistirebilir. Örnegin mezenkimal kök hücreleri, periferik mononükleer kan hücreleri (PBMCller) tarafindan vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) prostaglandin Ez (PGE2)-aracili salimini, ayrica büyüme hormonu, insülin, insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1), insülin benzeri büyüme faktörü baglama proteini-3 (IGFBP-S) ve endotelin-1'in PGEg-aracili salimini indükleyebilir. Mezenkimal kök hücreleri, hayvanda yara iyilesmesini gelistirmek üzere etkili bir miktarda hayvana uygulanir. Hayvan bir memeli olabilir ve memeli, insan veya insan olmayan primatlar dahil olmak üzere bir primat olabilir. Genel olarak mezenkimal kök hücreleri, yaklasik 1x105 hücre/kg ila yaklasik 1x107 hücre/kg, tercihen yaklasik 1x106 hücre/kg ile yaklasik 5x106 hücre/kg miktarinda uygulanabilir. Uygulanacak mezenkimal kök hücrelerinin tam miktari, hastanin yasi, kilosu ve cinsiyeti ve tedavi edilen yaranin ölçüsü ve siddeti dahil olmak üzere çesitli faktörlere baglidir. Mezenkimal kök hücreleri, yukarida açiklandigi üzere farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile birlikte uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri, yukarida açiklandigi üzere sistematik olarak uygulanabilir. Alternatif olarak mezenkimal kök hücreleri, örnegin mezenkimal kök hücrelerini içeren bir sargi veya rezervuar üzerinde bir sivi içinde olmak üzere dogrudan bir yaraya uygulanabilir. Mevcut açiklamanin diger bir açisina göre burada bir hayvanda fibrözün tedavi edilmesine veya önlenmesine yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem, hayvanda fibrözü tedavi etmek veya önlemek üzere etkili bir miktarda hayvan mezenkimal kök hücrelerinin hayvana uygulanmasini içerir. Mezenkimal kök hücreleri, bunlarla sinirli olmamak üzere karaciger sirozu, son asama böbrek hastaligi ile iliskili böbrek fibrözü ve akciger fibrözü dahil olmak üzere hayvanda fibrözü tedavi etmek veya önlemek amaciyla hayvana uygulanabilir. Mevcut açiklamanin kapsaminin spesifik herhangi bir türdeki fibröz ile ile sinirli olmadiginin anlasilmasi gerekir. Mezenkimal kök hücreleri, hayvanda fibrözü tedavi etmek veya önlemek üzere etkili bir miktarda hayvana uygulanir. Hayvan bir memeli olabilir ve memeli, insan veya insan olmayan primatlar dahil olmak üzere bir primat olabilir. Genel olarak mezenkimal kök hücreleri, yaklasik 1x105 hücre/kg ila yaklasik 'Ix107 hücre/kg, tercihen yaklasik 1x106 hücre/kg ila yaklasik 5x106 hücre/kg miktarinda uygulanabilir. Uygulanacak mezenkimal kök hücrelerinin tam miktari, hastanin yasi, kilosu ve cinsiyeti ve tedavi edilen veya önlenen fibrözün kapsami ve siddeti dahil olmak üzere çesitli faktörlere baglidir. Mezenkimal kök hücreleri, yukarida açiklandigi üzere farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile birlikte uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri ayni zamanda yukarida açiklandigi üzere sistematik olarak uygulanabilir. Mevcut bulusun diger bir amaci, bir hayvanin dokusu veya organinda anjiyojenezi gelistirmektir, burada bu tür bir doku veya organin anjiyojeneze ihtiyaci vardir. Bu nedenle mevcut bulusun diger bir açisina göre burada bir hayvanin organi veya dokusunda anjiyojenezin gelistirilmesine yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem, hayvanin bir organinda veya dokusunda anjiyojenezi gelistirmek üzere etkili bir miktarda hayvan mezenkimal kök hücrelerinin uygulanmasini içerir. Anjiyojenez, önceden mevcut olan mikrovasküler yataktan yeni kan damarlarinin olusumudur. Anjiyojenezin Indüksiyonu, koroner ve periferik arter yetersizligini tedavi etmek üzere kullanilir ve bu nedenle koroner arter hastaligi, iskemik kalp hastaligi ve periferik arter hastaliginin tedavisine invazif olmayan ve iyilestirici bir yaklasim olabilir. Anjiyojenez, kalp disindaki doku ve organlardaki hastaliklarin ve bozukluklarin tedavisinde ayrica kalp disindaki organlarin gelisimi ve/veya idamesinde bir rol oynayabilir. Anjiyojenez, dermal ülserlerin yani sira iç ve dis yaralarin tedavisinde bir rol oynayabilir. Anjiyojenez ayni zamanda embriyonik vaskülatörün gelisiminin yani sira embriyo implantasyonu ve plasental büyümüde bir rol oynar. Anjiyojenez ayni zamanda kikirdak rezorbsiyonunun kemik olusumu ile birlestirilmesine yönelik esastir ve dogru büyüme plagi morfojenezine yönelik esastir. Ayrica anjiyojenez, yeterli besin ve gaz tasimasi saglamak üzere yogun bir vasküler agin gerekli oldugu karaciger gibi yüksek metabolik organlarin basarili bir sekilde islenmesine ve idamesine yönelik gereklidir. Mezenkimal kök hücreleri, çok çesitli prosedürler ile anjiyojeneze ihtiyaci olan doku veya organa uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri, örnegin intravenöz, intraarteriyel veya intraperitoneal uygulama ile sistematik olarak uygulanabilir veya mezenkimal kök hücreleri, dogrudan anjiyojeneze ihtiyaci olan bir doku veya organa, örnegin anjiyojeneze ihtiyaci olan bir doku veya organa dogrudan enjeksiyon ile uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri, otologöz, allojeneik veya ksenogenik içeren kaynaklarin bir spektrumundan olabilir. Bu açiklamanin kapsaminin herhangi bir teorik düsünce ile sinirlandirilmasinin amaçlanmamasina ragmen mezenkimal kök hücrelerinin, bir hayvana uygulandiginda yeni kan damarlarinin olusumunu stimüle edilen vasküler endotelyal büyüme faktörünü veya VEGFiyi üretmek üzere periferik mononükleer kari hücrelerini (PBMC'Ier) stimüle ettigi düsünülür. Bir düzenlemede hayvan, bir memelidir. Memeli, insan veya insan olmayan primatlar dahil olmak üzere bir primat olabilir. Mevcut açiklamaya göre mezenkimal kök hücreleri, anjiyojenez araciligiyla hafifletilebilen, tedavi edilebilen veya önlenebilen herhangi bir hastalik veya bozuklugun tedavisinde, hafifletilmesinde veya önlenmesinde kullanilabilir. Bu nedenle örnegin mezenkimal kök hücreleri, ekstremiteler, diger bir ifadeyle kollar, bacaklar, eller ve ayaklar ayrica boyun ve çesitli organlardakiler dahil olmak üzere tikali arterleri tedavi etmek üzere bir hayvana uygulanabilir. Örnegin mezenkimal kök hücreleri, beyni besleyen tikali arterleri tedavi etmek üzere kullanilabilir, böylece felç tedavi edilebilir veya önlenebilir. Ayni zamanda mezenkimal kök hücreleri, embriyonik ve dogum sonrasi kornealarda kan damarlarini tedavi etmek üzere kullanilabilir ve glomerüler yapilanma saglamak üzere kullanilabilir. Diger bir düzenlemede mezenkimal kök hücreleri, iç ve dis olmak üzere yaralarin tedavisinde ayrica bunlarla sinirli olmamak üzere diyabet ve orak hücre anemisi gibi hastaliklardan kaynaklanan dermal ülserler dahil olmak üzere ayaklarda, ellerde, bacaklarda ve kollarda bulunan dermal ülserlerin tedavisinde kullanilabilir. Ayrica anjiyojenezin embriyo implantasyonunda ve plasenta olusumunda bulunmasi nedeniyle mezenkimal kök hücreleri, embriyo implantasyonunu gelistirmek ve düsük yapmayi önlemek üzere kullanilabilir. Ayrica mezenkimal kök hücreleri, dogmamis hayvanda vaskülatürün gelisimini arttirmak üzere insanlar dahil olmak üzere dogmamis hayvana uygulanabilir. Diger bir düzenlemede mezenkimal kök hücreleri, dogru büyüme plagi marfojenezini gelistirmenin yani sira kikirdak resorbsiyonu ve kemik olusumunu gelistirmek amaciyla dogmus veya dogmamis bir hayvana uygulanabilir. Mezenkimal kök hücreleri, bir hayvanda anjiyojenezin gelistirilmesinde etkili olan bir miktarda uygulanir. Mezenkimal kök hücreleri, yaklasik 1x105 hücre/kg ila yaklasik 1x107 hücre/kg, tercihen yaklasik 1x106 hücre/kg ila yaklasik 5X1O6 hücre/kg miktarinda uygulanabilir. Uygulanacak mezenkimal kök hücrelerin miktari, hastanin yasi, agirligi ve cinsiyeti, tedavi edilecek, hafifletilecek veya önlenecek hastalik veya bozukluk ve bunun kapsami ve siddeti dahil olmak üzere çesitli faktörlere baglidir. Mezenkimal kök hücreleri, kabul edilebilir bir farmasötik tasiyici ile birlikte uygulanabilir. Örnegin, mezenkimal kök hücreleri, enjeksiyona yönelik farmasötik olarak kabul edilebilir bir sivi ortaminda bir hücre süspansiyonu olarak uygulanabilir. Enjeksiyon lokal. diger bir ifadeyle dogrudan anjiyojeneze ihtiyaci olan doku veya organa veya sistemik olabilir. Mezenkimal kök hücreleri, bir terapötik ajani kodlayan bir veya daha fazla polinükleotid ile genetik olarak islenebilir. Polinükleotidler, uygun bir ifade araci araciligiyla mezenkimal kök hücrelerine dagitilabilir. Mezenkimal kök hücrelerini genetik olarak islemek üzere kullanilabilen ifade araçlari, bunlarla sinirli olmamak üzere retroviral vektörler, adenoviral vektörler ve adeno ile iliskili virüs vektörlerini Bir terapötik ajani kodlayan uygun bir polinükleotidin seçilmesi, tedavi edilen hastalik veya bozukluk ve bunun kapsami ve siddeti dahil olmak üzere çesitli faktörlere baglidir. Terapötik ajanlari kodlayan polinükleotidler ve uygun ifade araçlari, ayrica U.S. Patent No. 6,355,239 içinde açiklanir. Yukarida bahsedilen terapiler ve tedavilerde kullanildiginda mezenkimal kök hücrelerinin, bunlarla sinirli olmamak üzere büyüme faktörleri, sitokinler, antiinflamatuar ilaçlar gibi ilaçlar ve dendritik hücreler gibi mezenkimal kök hücreleri disindaki diger hücreleri içeren teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen diger terapötik ajanlar ile kombinasyon halinde kullanilabilir ve hiyalüronik asit gibi hücrelere yönelik çözünür tasiyicilar ile veya uygun olmasi halinde kolajen, jelatin gibi kati matrisler veya diger biyouyumlu polimerler ile kombinasyon halinde uygulanabilir. Burada açiklanan yöntemlerin birkaç sekilde ve teknikte iyi bilinen çesitli modifikasyonlar ve permütasyonlar ile gerçeklestirilebileceginin anlasilmasi gerekir. Ayni zamanda hücre türleri arasindaki eylem veya etkilesim modlarina yönelik belirtilen herhangi bir teorinin bu tarifnameyi herhangi bir sekilde kisitlayici olarak yorumlanmamasi gerektigi ancak bunlarini açiklamanin yöntemleri tam olarak anlasilabilecek sekilde sunuldugunu anlasilabilir. Bulus bu noktada çizimlere göre açiklanacaktir, burada: Sekil 1 MSC'Ier dendritik hücre fonksiyonlarini modüle eder. (A) HLA- DR ve CD11c'ye karsi antikorlari kullanan yetiskin monositik DC1 hücrelerinin ve HLA-DR ve CD123'e (IL-3 reseptörü) karsi antikorlari kullanan plazmasitoid DCZ hücrelerinin akis sitometrik analizi. (---): izotip kontrolü; (_): FITC/PE bagli antikorlar. (B) MSC'Ier TNF-oi salgilamasini (primer y-ekseni) gösterir ve sirasiyla aktiflestirilmis DC1 ve D02'den 1L- salgilamasini (sekonder y-ekseni) yükseltir. (C) Yetiskin DC1 hücreleri ile kültürlenen MSC`Ier T hücreleri tarafindan lFN-v salgilamasini (primer y-ekseni) gösterir ve tek basina MSC veya DC ile karsilastirildiginda IL-4 düzeylerini (sekonder y-ekseni) yükseltir. MSC'Ierin varliginda pro- inflamatuar IFN-y'nin düsük üretimi ve anti-inflamatuar lL-4"ün yüksek üretimi, bir anti-inflamatuar fenotipe dogru T hücre popülasyonunda bir degisiklik göstermistir. Sekil 2 MSC'Ier pro-inflamatuar efektörü T hücresi fonksiyonunu inhibe eder. (A) FITC-bagli CD4 (x-ekseni) ve PE bagli CD25 (y-ekseni) antikorlari ile MSC+PBMC kültüründe (MSC+PBMC) PBMC'Ier veya bitisik olmayan fraksiyon boyanarak TReg hücre sayilarinin (% olarak) akis sitometrik analizi. Geçisler, altyapi olarak izotip kontrol antikorlarina bagli olarak ayarlanmistir. Grafikler, 5 bagimsiz deneyi temsil eder. (B) MSC'Ierin varliginda olusturulan TH1 hücreleri düsük seviyede IFN-y (primer y-ekseni) salgilamistir ve MSC'Ierin varliginda olusturulan TH2 hücreleri hücre kültürü süpernatantlari içinde yüksek miktarlarda lL-4 (sekonder y-ekseni) salgilamistir. (C) MSC'Ier 24-gözlü bir plaka içinde 0, 24 veya 48 saat boyunca kültürlenen saflastirilmis NK hücrelerinde IFN-y salgilamasini gösterir. Gösterilen veriler bir deneydeki 0rtalama±SD sitokin salgilamasidir ve 3 bagimsiz deneyi temsil eder. Sekil 3 MSC'Ier yüksek sayida TReg hücre popülasyonuna ve yüksek GITR ekspresyonuna sebep olur. (A) PBMC veya MSC + PBMC (MSC ile PBMC orani 1:10) kültürlerinden (3 gün boyunca ayrica herhangi bir uyari olmadan kültürlenen) bir CD4+ CD25+ TReg hücre popülasyonu, 2- adimli bir manyetik izolasyon prosedürü kullanilarak izole edilmistir. Bu hücreler isinlanmistir (diger herhangi bir proliferasyonu bloke etmek üzere) ve karistirilmis bir Ienfosit reaksiyonunda (MLR) uyaricilar olarak kullanilmistir burada cevap verenler fitohemaglutinin (PHA) (2.5 mg/ml) varliginda allojeneik PBMC'Ierdir (uyarici ile cevap veren orani 1:100). Hücreler 48 saat boyunca kültürlenmistir akabinde 3H timidin eklenmistir ve eklenen radyoaktivite 24 saat sonra hesaplanmistir. Sonuçlar, MSC'Ierin (yol 3) varliginda olusturulan TReg popülasyonununun MSC'Ierin (yol 2) yoklugunda olusturulan TReg hücrelerine fonksiyonel olarak benzer oldugunu göstermistir. (B) PBMC'Ier MSC'Ierin (MSC ile PBMC orani 1:10) yoklugunda (üst taslak) veya varliginda (taban taslagi) 3 gün boyunca kültürlenmistir, akabinde bitisik olmayan fraksiyOn toplanmistir ve FlTC-etiketli GITR ve PE-etiketli CD4 ile immunohistokimyasal boyanmistir. Sonuçlar, MSCIerin varliginda kültürlenen hücrelerdeki GITR ekspresyonunda iki katindan daha fazla bir artis gösterir. Sekil 4 MSC'Ier PGEz'yi üretir ve bloklama PGEz'si MSC-araciligi immuno-modülatör etkileri tersine çevirir. (A) Çesitli konsantrasyonlarda PGE2 blokerleri NS-398 veya indometazin (lndometh.) varliginda veya yoklugunda kültürlenen MSC'Ierden elde edilen kültür süpernatantlarinda PGE2 salgilamasi (ortalama±SD). Inhibitör konsantrasyonlari uM cinsindedir ve sunulan veriler 24 saatlik kültürden sonra elde edilen degerlerdir (B) gerçek zamanli RT-PCR kullanilarak MSCiler ve PBMC'Ierdeki COX-1 ve COX-2 ekspresyonu. PBMCIer ile karsilastirildiginda MSC'Ier önemli derecede daha yüksek seviyelerde COX-2`yi ifade etmistir ve MSC'ler PBMC'Ierin varliginda kültürlendiginde, MSC'Ierin içinde COX-2 ekspresyonunda 3-kati seklinde bir artis olmustur. 3 bagimsiz deneyin 1 tanesinden temsili veri gösterilir. MSC+PBMC kültürleri, bir trans-gözlü hazne plakasinda ayarlanmistir, burada MSC'Ier taban haznesinin üzerinde ve PBMC'Ier üst hazne üzerinde kaplanmistir. (C) PGE2 blokerleri indometazin (Ind.) veya NS-398'in varligi, kontroller ile karsilastirildiginda aktiflestirilmis DC'lerden (El) TNF-oi salgilamasini ve TH1 hücrelerinden (7) IFN-y salgilamasini yükseltir. Veriler, MSC'Ier ve PGE2 inhibitörlerinin yoklugunda olusturulan kültürlerden degisiklik %'si olarak hesaplanmistir. (D) MSC-IPBMC birlikte kültürü ( ve NS-398'in varligi, PHA-muameleli PBMC'Ier üzerinde MSC-aracili anti-proliferatif etkilerini tersine çevirir. Gösterilen veriler, bir deneydendir ve 3 bagimsiz deneyi temsil eder. Sekil 5 Temel MSC sitokin salgilamasi, allojeneik PBMC"Ierin varliginda yükseltilir. Önceden karakterize edilen insan MSC'Ieri kullanilarak, PBMC'Ierin (MSC ile PBMC orani 1:10) varliginda (çizikli çubuklar) yoklugunda (açik çubuklar) 24 saat boyunca kültürlenen MSC'Ierin kültür süpernatanti içindeki sitokinler 1L-6 ve VEGF, Iipid araci PGEz ve matriks metalloproteinaz 1 (pro MMP-1) seviyeleri analiz edilmistir. MSC'Ier temel olarak 1L-6, VEGF ve PGE2 üretmistir ve bu faktörlerin seviyeleri birlikte kültür üzerine artmistir böylece MSC'Ierin, bir inflamatuar ayarinda immun fonksiyonlarin modüle edilmesinde bir role sahip olabilecegi önerilir. Sekil 6 MSC'Ier doza bagimli bir sekilde mitojen-indüklü T-hücresi proliferasyonunu gösterir. Artan sayilardaki allojenik PBMC`Ier, 72 saat boyunca PHA (2.5 mg/ml) varliginda veya yoklugunda 96-gözlü bir plakanin üzerinde kaplanan sabit sayilardaki MSC'Ier (2,000 hücre/göz) ile inkübe edilmistir ve 3H timidin eklentisi belirlenmistir (dakika basina sayi veya cpm cinsinden). Burada MSC'Ierin varliginda PHA-muameleli PBMCIerin proliferasyonunun doz bagimli bir inhibisyonu vardir. 3 bagimsiz deneyden 1 tanesinin temsili sonuçlari gösterilir. Benzer sonuçlar, LeBIanc, et al., Scand J. Immunol., vol. 57, pg. 11 (2003) tarafindan rapor edilmistir. Sekil 7 islemin teklif edilen MSC mekanizmasinin sematik diyagrami. MSC'Ier, dogal (DC'ler-yollari 2-4; ve NK- yolu 6) ve uyarlanabilir (T- yollari 1 ve 5 ve B-yolu 7) immun sistemlerden hücreleri etkileyerek bunlarin immuno-modülatör etkilerini düzenler. Istilaci bir patojene yanit olarak, yetiskin DC"Ier potansiyel giris yerine göç eder, yetiskin hale gelir ve koruyucu efektör T hücreleri (hücre-aracili TH1 veya hümoral TH2 bagisikligi) olmak üzere T hücrelerine (antijene özel ve yardimci uyarici sinyaller araciligiyla) naif yetenegini elde eder. MSC-DC etkilesimi sirasinda, direkt hücre-hücre temasi araciligiyla veya salgilanan faktör araciligiyla MSC'Ier, DCilerin hücre-araciligi bir yaniti (yol 2) baglama yetenegini sinirlandirarak veya bir hümoral tepkiyi (yol 4) baglama yetenegini gelistirerek immun yanitinin sonucunu degistirebilir. Ayni zamanda, yetiskin efektör T hücreleri mevcut oldugunda, MSC'Ier, THi (yol 1) yanitlarinin dengesini TH2 yanitlarina (yol 5) dogru ve muhtemelen yüksek bir IgE üreten B hücre aktivitesine (yol 7), GVHD ve otoimmun hastalik semptomlarinin baskinligina yönelik istenen sonuçlara dogru degistirmek üzere bunlarla etkilesime girebilir. TReg popülasyonunun (yol 3) yüksek bir olusumuna sebep olma konusundaki yetenekleriyle MSC'Ier, toleransli bir fenotip ortaya çikarabilir ve bunlarin yerel mikro- çevresinde seyirci iltihaplanmasini azaltarak bir alici birime yardimci olabilir. Kesikli çizgi (----). sunulan mekanizmayi temsil eder. Bulus bu noktada asagidaki örneklere göre açiklanacaktir; ancak mevcut bulusun kapsaminin bununla sinirlandirilmayacagin anlasilmalidir. Materyaller ve Yöntemler Insan MSCilerinin kültürü açiklandigi üzere kültürlenmistir. Kisaca ilik numuneleri, anonim donörlerin iliak kanadindan toplanmistir akabinde Poietics Technologies, Div of Cambrex Biosciences tarafindan bilgilendirilerek onaylanmistir. MSC'Ier, %1 antibiyotik-'antimyotik solüsyonu (Invitrogen, Carlsbad, California) ve %10 fetal bovin serum (FBS, JRH BioSciences, Lenexa, Kansas) içeren tam Dulbecco's Modified Eagle's Medium-Low Glucose (Life Technologies, Carlsbad, California) içinde kültürlenmistir. MSC'Ier yapisik bir tek katman olarak büyümüstür ve tripsin/EDTA (37°C'de 3 dakika boyunca %0.05 tripsin) ile ayrilmistir. Kullanilan bütün MSC'Ier, çoklu soy potansiyeline yönelik önceden karakterize edilmistir ve mezenkimal soylar (kondrositik, adipojenik ve osteojenik) içinde farklilasmaya iliskin kapasiteyi sürdürmüstür (Pittenger, et al., Science, vol. 284, pg. 143 (1999)). Dendritik Hücrelerin izolasyonu Periferik mononükleer kan hücreleri (PBMC'Ier), Poietics Technologies, Div of Cambrex Biosciences'tan (Walkersville, MD) elde edilmistir. Monositik soyun (CD1C+) dendritik hücrelerinin (DC'Ier) prekursörleri, Dzionek, et. al., J. lmmunol., kullanilarak PBMC'Ierden pozitif olarak seçilmistir. Kisaca, CDic'yi ifade eden B hücreleri, üreticinin talimatlarina (Miltenyi Biotech, Auburn, California) göre manyetik boncuklar kullanilarak, akabinde B-hücresi kaybina ugrayan fraksiyonu biyotin-etiketli CD1c (BDCA1*) ve anti-biyotin antikorlari ile etiketleyerek ve bunlari manyetik kolonlar kullanilarak etiketlenmemis hücre fraksiyonundan ayirarak manyetik olarak CD19+ hücrelerinden yoksun hale getirilmistir. Plazmasitoid soyun DC'Ierinin prekursörleri, pozitif olarak etiketlenmis antikor kapli hücrelerin (BDCA2*) immun-manyetik siralamasi ile PBMC'Ierden izole edilmistir(MiItenyi Biotech, Auburn, California). MSC-DC kültürü Birçok deneyde, insan MSCfleri ve DC'leri, çesitli zaman dilimlerinde esit sayilarda kültürlenmistir ve hücre kültürü süpernatanti toplanmistir ve tekrar degerlendirilene kadar -80°C'de saklanmistir. Seçilen deneylerde, MSC'ler, 3 gün boyunca yetiskin DC1 veya DC2 hücreleri ( ile kültürlenmistir ve akabinde kombine edilen kültürler (MSC'ler ve DC'Ier), herhangi bir proliferasyonu önlemek üzere isinlanmistir. Akabinde, saflastirilmis antikor, naif, allojenik T hücreleri (CD4*,CD45RA*), isinlanan MSC"Ier/DC'Iere eklenmistir ve 6 gün daha kültürlenmistir. Yapisik olmayan hücre fraksiyonu (saflastirilmis T-hücreleri) akabinde kültürlerden toplanmistir, iki kere yikanmistir ve 24 saat daha PHA ile yeniden uyarilmistir, akabinde hücre kültürü süpernatantlari toplanmistir ve ELISA tarafindan salgilanan IFN-v ve IL-4'e yönelik analiz edilmistir. NK hücrelerinin izolasyonu NK hücrelerinin saflastirilmis popülasyonlari, bir primer reaktif olarak biyotin-bagli monoklonal antikorlarin (anti - CD3, -CD14, -CD19, -CD36 ve anti-lgE antikorlari) sekonder etiketleme reaktifi olarak Mikroboncuklara baglanan anti-biyotin monoklonal antikorlari ile bir karisimiyla manyetik olarak etiketlenen NK olmayan hücreler tüketilerek elde edilmistir. NK hücreleri Içeri geçerken manyetik olarak etiketlenen NK olmayan hücreler, manyetik bir alanda MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, California) kolonlarinda tutulmustur ve toplanmistir. TReg hücre popülasyonunun izolasyonu TReg hücre popülasyonu, 2 adimli bir izolasyon prosedürü kullanilarak izole edilmistir. Birinci CD4+T olmayan hücreler, biyotin etiketli antikorlar ve anti- biyotin mikroboncuklarinin bir karisimiyla dolayli bir sekilde manyetik olarak etiketlenmistir. Etiketlenen hücreler akabinde, bir MACS kolonu (Miltenyi Biotech, Auburn, California) üzerinde ayirma ile tüketilmistir. Akabinde, CD4+CD25+ hücreleri. CD25 mikroboncuklari ile direkt olarak etiketlenmistir ve önceden zenginlestirilmis CD4*'ten pozitif seçim ile izole edilmistir. T hücre fraksiyonu. Manyetik olarak etiketlenen CD4+CD25+ T hücreleri, kolon üzerinde tutulmustur ve manyetik alandan kolonun uzaklastirilmasindan sonra ayristirilmistir. MSC'Ierin varliginda olusturulan yüksek CD4+CD25+ popülasyonunun dogada baskin olup olmadigini belirlemek üzere CD4+CD25+ TReg hücre popülasyonlari, 2 adimli bir manyetik izolasyon prosedürü kullanilarak PBMC veya MSC+PBMC (MSC ile PBMC orani 1:10) kültürlerinden (3 gün boyunca tekrar bir uyari olmadan kültürlenmistir) izole edilmistir. Bu hücreler, diger herhangi bir proliferasyonu bloke etmek üzere isinlanmistir ve karistirilmis bir Ienfosit reaksiyonunda (MLR) uyaricilar olarak kullanilmistir burada cevap verenler, PHA (2.5 tig/ml) varliginda allojeneik PBMC'Ierdir (uyarici ile cevap veren orani 12100). Kültür, 48 saat boyunca uygulanmistir akabinde 3H timidin eklenmistir. Eklenen radyoaktivite 24 saat sonra hesaplanmistir. PBMC"Ier MSC'lerin (MSC ile PBMC orani 1:10) yoklugunda veya varliginda kültürlenmistir. akabinde yapisik olmayan fraksiyon toplanmistir ve FITC-etiketli glukokortikoid-indüklü TNF reseptörü veya GITR ve PE -etiketli CD4 ile immunohistokimyasal boyanmistir. TH1I TH2 hücrelerinin olusumu Periferik mononükleer kan hücreleri (PBMCiler), monositleri uzaklastirmak üzere 2x106 hücreler/ml'de 45 dakika boyunca 37°C'de kaplanmistir. Yapisik olmayan fraksiyon, MSCilerin varliginda veya yoklugunda TH1 (IL-2 (4 ng/ml) IL-12 (5 ng/ml) + anti-IL-4 (1 ug/ml)) veya TH2 (IL-2 (4 ng/ml) + IL-4 (4 ng/ml) + anti-IFN-y (1 ug/ml)) kosullari altinda 3 gün boyunca plaka-bagli anti-CD3 (5 ug/ml) ve anti- CD28 (1 ug/ml) antikorlarinin varliginda inkübe edilmistir. Hücreler yikanmistir ve akabinde 24 veya 48 saat daha PHA (2.5 ug/ml) ile yeniden uyarilmistir, akabinde IFN-y ve IL-4 seviyeleri, ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) tarafindan kültür süpernatantlari içinde ölçülmüstür. MSC'Ierin kültür süpernatanti içindeki VEGF, PGEz ve pro-MMP-1 seviyelerinin analizi. Önceden karakterize edilen insan MSC'Ieri kullanilarak, Interlökin-G (IL-6), VEGF, seviyeleri, PBMC'Ier (MSC ile PBMC orani 1:10) varliginda veya yoklugunda 24 saat boyunca kültürlenen MSC'Ierin kültür süpernatanti içinde analiz edilmistir. P_BMC'Ierin Proliferasvong Saflastirilmis PBMC"Ier, Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, Oslo, Norveç) üzerinde leukopack santrifüjleme (Cambrex, Walkersville, Maryland) ile hazirlanmistir. Ayrilan hücreler, mitojen PHA (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) varliginda 48 saat boyunca MSC'Ierin (bunlarin ayarlanmasini saglamak üzere PBMC eklenmeden önce 3-4 saat boyunca kaplanmistir) varliginda veya yoklugunda kültürlenmistir (üç kopya halinde). Seçili deneylerde, PBMC'Ier, PGE2 inhibitörleri lndometazin (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) veya NS-938 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, Michigan) içeren ortamda yeniden süspanse edilmistir. (3H)-timidin eklenmistir (bir 200 pl kültür içinde 20 ul) ve hücreler, otomatik bir toplayici kullanilarak 24 saatlik ek bir kültürden sonra toplanmistir. MSC'Ier veya PGE2 blokerlerinin etkileri, PHA varliginda kontrol yanitinin (%100) yüzdesi olarak hesaplanmistir. Nicel RT-PCR Hücre pelletlerinden alinan toplam RNA, ticari olarak temin edilebilir bir kit (Qiagen, Valencia, California) kullanilarak ve üreticinin talimatlarina göre hazirlanmistir. Kirletici genomik DNA, DNA-içermeyen kit (Ambion, Austin, Texas) kullanilarak uzaklastirilmistir. Nicel RT-PCR, bir MJ Research Opticon saptama sistemi (South San Francisco, California) üzerinde 0.5 uM konsantrasyonda primerler ile QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, California) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Farkli kosullar altinda kültürlenen hücrelerdeki ekspresyon seviyelerindeki ilgili degisiklikler, iç kontrol olarak ß-aktin kullanilarak Ct degerlerinde (kesisme noktasi) fark ile hesaplanmistir. COX-1 ve COX-2 spesifik primerlerine yönelik dizi asagidaki gibidir: COX-1: 5'-CCG GAT GCC AGT CAG GAT GAT G-3'(ileri), 5'-CTA GAC AGC CAG ATG CTG ACA G-3' (ters); COX-2: 5'- ATC TAC CCT CCT CAA GTC CC-3'(ileri), 5'-TAC CAG AAG GGC AGG ATA CAG-3' (ters). Artan sayilardaki allojenik PBMC'ler, 72 saat boyunca PHA (2.5 ug/ml) varliginda 96-gözlü bir plaka üzerinde kaplanan sabit sayilardaki MSC*Ier (2,000 hücre/göz) ile inkübe edilmistir ve 3H timidin eklentisi (dakika basina sayi veya cpm) oranlarinda kültürlenmistir. Sonuçlar Mevcut çalismalarda, insan MSC'Ierinin dendritik hücreleri (DC1 ve DC2), efektör T hücrelerini (TH1 ve TH2) ve NK hücrelerini içeren immun hücre popülasyonlari ile etkilesimi incelenmistir. MSC'lerin her bir immun hücre tipiyle etkilesimi, MSC'lerin immun yanit prosesinde birkaç adimi modüle edebilecegini önererek spesifik sonuçlara sahip olmustur. MSC immun-modülatör etkileri modüle eden ve bunlardan sorumlu olan salgilanan faktörlerin üretimi degerlendirilmistir ve prostaglandin sentezi dahil edilmistir. Miyeloid (D01) ve plazmasitoid (DC2) prekursörü dendritik hücreleri, sirasiyla BDCA1* ve BDCAZ* hücrelerinin immun-manyetik siralanmasi ile izole edilmistir sirasiyla) ile veya DC2 hücrelerine yönelik IL-3 (10 ng/ml) ile yetiskin hale getirilmistir. Akis sitometrisi kullanilarak, DC1 hücreleri HLA-DR+ ve CD11c*'dir, böylece DC2 hücreleri HLA-DR+ ve CD123*'dir (Sekil 1A). Inflamatuar ajani bakteriyel Iipopolisakkarit (LPS, 1 ng/ml) varliginda, Üretilen DC1 hücreleri, TNF- ci seviyelerini azaltir anca MSC'ler mevcut oldugunda (incelenen oranlar 1:1 ve taraftan, DCZ hücreleri, LPS varliginda IL-10 üretmistir ve bunun seviyeleri MSC2DC2 birlikte kültürü (1:1) üzerinde 2-kattan daha fazla arttirilmistir (Sekil 18). Bu nedenle, MSCiler, daha tolerojenik bir fenotipe dogru kültürde aktiflestirilen DC'lerin sitokin profilini modifiye etmistir. Ayrica, MSC"Ier ile kültürlendiginde aktiflestirilen DCyler, pro-inflamatuardan anti-inflamatuar T hücresi fenotipine MSC-aracili bir degisikligi önererek IFN-y'yi artirabilmis ve naif CD4*T hücreleri tarafindan salgilanan IL-4 seviyelerini yükseltebilmistir (Sekil Artan IL-10 salgilamasini düzenleyici hücrelerin olusmasinda bir rol oynamasi hücreler (TReg), PBMC'Ier ve MSC'Ierin ortak kültürlerinde akis sitometrisi ile ölçülmüstür. PBMCSIerin 3-5 gün boyunca MSC'Ier ile kültürlenmesi üzerine, PBMC'Ierin anti-CD4 ve anti-CD25 antikorlari (Sekil 2A) ile boyanmasi ayrica MSC-indüklü bir tolerojenik yanitin desteklenmesiyle belirlendigi üzere TReg hücre sayilarinda bir artis olmustur. Ifade edilen MSC`Ierin varliginda olusturulan CD4+CD25+ TReg hücre popülasyonu, gluokortikoId-indüklü TNF reseptörünün (GITR), TReg hücre popülasyonlari üzerinde ifade edilen bir hücre yüzeyi reseptörünün seviyelerini arttirmistir ve allojeneik T hücresi proliferasyonunun (Sekil 3A,B) baskilamasi nedeniyle dogada baskin olmustur. Akabinde, MSC'Ier , T hücresi farklilasisini etkilemek üzere bunlarin direkt yetenegi konusunda arastirilmistir. Antikor seçimli saflastirilmis T hücreleri (CD4+ Th hücreleri) kullanilarak, IFN-v üreten TH1 ve IL-4 üreten TH2 hücreleri, MSCflerin varliginda veya yoklugunda olusturulmustur. MSC'ler, farklilasma sirasinda mevcut oldugunda, TH1hücreIeri tarafindan IFN-v salgilamasinda düsüs ve TH2 hücreleri tarafindan IL-4 salgilamasinda artis olmustur (Sekil 28). Th hücrelerinin efektör TH1 veya TH2 tiplerinde (veri gösterilmez) farklilasmasindan (3 günde) sonra MSC'Ier kültüre eklendiginde IFN-v veya IL-4 seviyelerinde herhangi bir önemli degisiklik görülmemistir. Bu deneyler, MSC'Ierin T hücresi farklilasimini direkt olarak etkileyebildigini ve T hücresi sitokini salgilamasini hümoral bir fenotipe dogru degistirebildigini önerir. Benzer bir sekilde, MSC'Ier, saflastirilmis NK hücreleri (CD3-, CD14-, CD19-. CD36-) ile 1:1'Iik bir oranda farkli zaman periyotlari (0-48 saat) boyunca kültürlendiginde, kültür süpernatantinda (Sekil 2C) düsük IFN-y salgilamasi olmustur, böylece MSCilerin ayni zamanda NK hücre fonksiyonunu da modüle edebilecegi önerilir. Önceki çalisma, MSC'lerin çözünebilir faktörler ile T-hücresi fonksiyonlarini modifiye ettigini göstermistir (LeBIanc, et al., Exp. Hematol., vol. 31, pg. 890 olarak lL-6, prostaglandin E2, VEGF ve proMMP-i'i içeren birkaç faktörü salgiladigi ve her birinin seviyesinin PBMCIer (Sekil 5) ile kültürlenme üzerine arttigi gözlemlenmistir. TNF-a inhibisyonuna ve DC,Ier tarafindan IL-1O üretiminin artisina sebep olan MSC-türevli faktörleri arastirmak amaciyla, aktiflestirilen DC'Ier tarafindan TNF-oi üretimini inhibe ettiginin gösterilmesi nedeniyle prostaglandin E2'nin potansiyel rolü arastirilmistir (Vassiliou, et al., Cell. saatlik kültürü) kosullu ortam, yaklasik olarak içermistir. PGE2 salgilamasinin bilinen indükleyicilerinin, örnegin MSC`Ier tarafindan PGEg'nin temel bir salgilanmasini gösteren kültür süpernatanti Içinde TNF-oi, IFN-v veya IL-1ß"nin (veri gösterilmez) saptanabilir herhangi bir varligi bulunmamistir. hMSC'Ier tarafindan PGE2 salgilamasi, PGEz üretiminin bilinen inhibitörleri, NS-398 (5 uM) ve indometazin (4 uM) varliginda %60-90 inhibe edilmistir (Sekil 4A). Esas olarak aktif sikloksijenaz enzim 1 (COX-1) ve indüklenebilir sikloksijenaz enzim 2'nin (COX-2) enzimatik aktivitesinin (Harris. et salgilanmasinin saliniminin meydana gelmesi nedeniyle trans-gözlü kültür sistemi kullanilarak MSCIer ve PBMC'Ierin içinde COX-1 ve COX-2'ye yönelik mRNA ifadesi analiz edilmistir. MSC'Ier, PBMC'Ier ile karsilastirildiginda önemli derecede daha yüksek seviyede COX-2'yi ifade etmistir ve ekspresyon seviyeleri, MSC'Ier ve PBMC'Ierin (MSC ile PBMC orani 1:10) 24 saat boyunca birlikte kültürü üzerine 3-kati olarak artar (Sekil 48). MSC-PBMC birlikte kültürü (Sekil ) üzerinde PGE2 salgilamasindaki artisin COX-2 yukari regülasyonu ile aracilik edildigini öneren bir sekilde COX-1 seviyelerinde az degisik görülmüstür. DC'ler ve T-hücreleri üzerinde MSC'nin immunmodülatör etkilerinin PGE2 aracili olup olmadigini arastirmak üzere, MSC'Ier, PGE2 inhibitörleri NS-398 veya indometazin varliginda aktiflestirilmis dendritik hücreleri (DC1) veya TH1 hücreleri ile kültürlenmistir. NS-398 veya indometazin varligi, sirasiyla DC1'Ier tarafindan TNF-ci salgilanmasini ve TH1 hücrelerinden (Sekil 40) IFN-y salgilanmasini arttirmistir, immun hücre tipleri üzerinde MSC etkilerinin, salgilanan PGE2 aracili olabilecegi önerilir. Son çalismalar, MSC`lerin çesitli stimuli tarafindan indüklenen T-hücresi proliferasyonunu inhibe ettigini göstermistir (DeNicoIa, et al., Blood, vol. MSC'Ierin doza bagimli bir sekilde mitojen-indüklü T hücre proliferasyonunu inhibe ettigi (Sekil 6) ve PGEzinhibitörleri NS-398 (5 uM) veya indometazin (4 uM) mevcut oldugunda, inhibitörlerin olmadigi kontroller (Sekil 4D) ile karsilastirildiginda kültürleri içeren MSCde PHA-muameleli PBMC'ler tarafindan (3H) timidin eklenmesinde %70 seklinde bir artis oldugu gözlemlenmistir. Kisaca, diger immun hücre tipleriyle (Sekil 7) MSC etkilesiminin bir modeli sunulur. Yetiskin T hücreleri mevcut oldugunda, MSC'ler bunlarla direkt olarak etkilesime girebilir ve pro-inflamatuar lFN-v üretimini (yol 1) inhibe edebilir ve düzenleyici T hücresi fenotipini (yol 3) ve anti-inflamatuar TH2 hücrelerini (yol 5) gelistirebilir. Ayrica, MSC'Ier, PGE2 salgilayarak, pro-inflamatuar DC1 hücreleri (yol 2) inhibe ederek ve anti-inflamatuar DC2 hücrelerini (yol 4) veya düzenleyici DC'Ieri (yol 3) gelistirerek DC'Ier araciligiyla T hücresi immun yanitinin sonucunu degistirebilir. Karsilik olarak TH2 bagisikligina dogru bir degisiklik, IgE/lgG1 alt tip antikorlarinin (yol 7) yüksek olusumuna dogru B hücre aktivitesinde bir degisiklik önerir. MSCiler. NK hücrelerinden IFN-v salgilanmasini inhibe etme konusundaki yetenekleriyle NK hücre fonksiyonunu (yol 6) modifiye edebilir. MSC:Immun hücre etkilesimlerinin bu modeli, diger birkaç laboratuvarda gerçeklestirilen deney ile uyumludur (LeBIanc, et al., Exp. Hematol., vol. 31, pg. 890 (2003); Tse, et al., (2002)). Sunulan mekanizmalarin diger incelemesi çalisma halindedir ve hayvan çalismalari bu noktada MSC uygulamasinin in vivo etkilerini incelemek üzere gereklidir. TR TR TR TR TR TR TR TR