TR201901824T4

TR201901824T4 - Rs7 Antikorları

Info

Publication number: TR201901824T4
Application number: TR2019/01824T
Authority: TR
Inventors: Govindan Serengulam; Qu Zhengxing; J Hansen Hans; Goldenberg David
Original assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 2002-03-01
Filing date: 2003-03-03
Publication date: 2019-03-21
Also published as: EP1483295A2; US20170274079A1; WO2003074566A3; US20100221177A1; KR20040089694A; CN100360567C; US8574575B2; CA2478047A1; JP4354280B2; AU2003209447A1; PT3483183T; ES2871905T3; DK3483183T3; CY1124289T1; US20120141372A1; EP2287201B1; EP1483295B1; US20180250406A1; HUE054986T2; US10179171B2

Abstract

Buluş, bir murin RS7 antikoru ile bir epitelyal glikoprotein-1'e (EGP-1) bağlanma için rekabet eden kimerik, insanlaştırılmış ya da insan antikoru ya da bunun antijen bağlayıcı bir parçası; antikoru ya da bunun antijen bağlayıcı parçasını içeren bir antikor füzyon proteini; antikoru ya da bunun antijen bağlayıcı parçasını içeren bir antikor bileşeni içeren bir tanılayıcı ya da terapötik konjugat; bir ya da daha fazla antikoru ya da bunun antijen bağlayıcı parçasını ya da terapötik konjugatı içeren çok değerlikli, çok spesifik bir antikor; en azından antikoru ya da bunun antijen bağlayıcı parçasını içeren bir antikor füzyon proteini; çıplak antikor ya da bunun antijen bağlayıcı parçasını ya da çıplak antikor füzyon proteini ya da kanser tedavisine yönelik bir metotta kullanım için parça; ve bir antikoru ya da bunun antijen bağlayıcı parçasını ya da bir malinite tedavisi için bir metotta kullanım için antikor füzyonunu içeren terapötik bir konjugat ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME RS? ANTIKORLARI Mevcut bulus, bir murin RS7 antikoru ile bir epitelyal glikoprotein-1'e (EGP-1) baglanma için rekabet eden kimerik, insanlastirilmis ya da insan antikoru ya da bunun antijen baglayici bir parçasi; antikoru ya da bunun antijen baglayici parçasini içeren bir antikor füzyon proteini; antikoru ya da bunun antijen baglayici parçasini içeren bir antikor bileseni içeren bir tanilayici ya da terapötik konjugat; bir ya da daha fazla antikoru ya da bunun antijen baglayici parçasini ya da terapötik konjugati içeren çok degerlikli, çok spesifik bir antikor; en azindan antikoru ya da bunun antijen baglayici parçasini içeren bir antikor füzyon proteini; çiplak antikor ya da bunun antijen baglayici parçasini ya da çiplak antikor füzyon proteini ya da kanser tedavisine yönelik bir metotta kullanim için parça; ve bir antikoru ya da bunun antijen baglayici parçasini ya da bir malinite tedavisi için bir metotta kullanim için antikor füzyonunu içeren terapötik bir konjugat ile ilgilidir. BULUSUN ARKA PLANI Insan yapimi baglanma proteinleri, özellikle monoklonal antikorlar ve tasarlanmis antikorlar ya da antikor parçalari, kanser, otoimmün hastaliklar, enfeksiyöz hastaliklar, inflamatuvar hastaliklar ve kardiyovasküler hastaliklar da dahil olmak üzere çesitli insan hastaliklarinin tespitinde ve tedavisinde önemli olarak test olarak, radyoaktif izotoplar ile etiketlenmis antikorlar, teknikte bulunan detektörleri kullanarak bir hastaya enjeksiyondan sonra tümörleri görsellestirmek için test edilmistir. Bir antikorun ya da antikordan türetilmis bir maddenin klinik faydasi, öncelikle belirli bir hedefli antijene baglanma yetenegine baglidir. Seçicilik, izotoplar, ilaçlar, toksinler, sitokinler, hormonlar, büyüme faktörleri, enzimler, konjugatlar, radyonüklidler ya da metaller gibi teshis edici ya da terapötik bir maddenin, bir insan hastaliginin tespit ve tedavi asamalari sirasinda bir hedef bölgeye iletilmesi için degerlidir, özellikle, eger teshis edici ya da terapötik madde, vücuttaki normal dokuya toksik ise. Antikor sistemlerinin potansiyel sinirlamalari, The American Journal of Medicine parametreler, hedef hücrelerin bulundugu bölgede/ bölgelerde spesifik olarak lokalize edilmis enjekte edilen doz miktari ve alim orani, yani spesifik olarak baglanmis antikor konsantrasyonunun çevreleyen normal dokulardaki mevcut radyoaktiviteye oranidir. Kan akisina bir antikor enjekte edildiginde, metabolize edildigi ve atildigi gibi birkaç bölmeden geçer. Antikor, vücudun geri kalanindan geçerken hedef hücre antijenini bulabilmeli ve baglanabilmelidir. Antijen hedeflemesini kontrol eden faktörler arasinda yer, boyut, antijen yogunlugu, antijenin erisilebilirligi, patolojik dokunun hücresel bilesimi ve hedefleme antikorlarinin farmakokinetigi bulunur. Tümör hedeflemesini antikorlar ile spesifik olarak etkileyen diger faktörler, hem tümör hem de diger dokularda hedef antijenlerin ekspresyonunu ve radyoaktif etiketli antikorlarin yavas kan klirensinden kaynaklanan kemik iligi toksisitesini içerir. Hedeflenen tümör hücreleri tarafindan biriktirilen hedefleme antikorlarinin miktari, vaskülarizasyondan ve tümörlerin antikor penetrasyonuna karsi engellerden ve ayrica tümör içindeki basinçtan etkilenir. Karaciger, böbrekler ya da kemik iligi gibi hedef olmayan organlar tarafindan spesifik olmayan alim, özellikle kemik iliginin isinlanmasinin siklikla doz sinirlayici toksisiteye neden oldugu radyoimmünoterapi için teknigin baska bir potansiyel kisitlamasidir. Dogrudan hedefleme olarak adlandirilan önerilen bir yaklasim, tanilayici ya da terapötik radyoizotoplari tasiyan antikorlar ile spesifik antijenleri hedeflemek için dizayn edilmis bir tekniktir. Tümörler baglaminda, dogrudan hedefleme yaklasimi, hedef tümörü antijenleri vasitasi ile taniyan, radyo etiketli anti tümör monospesifik bir antikoru kullanir. Teknik, etiketli monospesifik antikorun hastaya enjekte edilmesini ve antikorun, hedef tümörde lokalize olmasina, tanilayioi ya da terapötik yararlar elde etmesini saglar. Baglanmayan antikor vücudu temizler. Bu yaklasim ek memeli hastaliklarini teshis etmek ya da tedavi etmek için kullanilabilir. özellikle tanisal ya da terapötik radyoizotoplari tasiyan antikorlar tarafindan tümör hedefleme eksikliklerinin giderilmesi için dizayn edilmis bir tekniktir (US-5,256,395 166). AES, hem hedef tümörü hem de radyoaktif hapteni taniyan bir radyo etiketli hapten ve bir anti tümör! anti hapten bispesifik baglanma proteini kullanir. Bu deger için ayni zamanda, daha yüksek degerlikli ve daha yüksek spesifiklige sahip baglayici proteinleri olan haptenler de kullanilabilir. Teknik, baglayici proteinin hastaya enjekte edilmesini ve hedef tümörde lokalize olmasina izin vermeyi içerir. Baglanmayan baglayici proteinin kan akisindan ayrilmasi için yeterli bir süre geçtikten sonra, radyo etiketli hapten uygulanir. Hapten, tanilayici ya da terapötik yararlar elde etmek için hedef hücrenin bölgesinde bulunan antikor antijen kompleksine baglanir. Baglanmayan hapten vücudu temizler. Barbet, iki degerlikli bir haptenin, ikincil tümör yüzeyine baglandiginda, bispesifik bir antikor ile çapraz baglanma ihtimalinden bahseder. Sonuç olarak, radyo etiketli kompleks daha kararlidir ve tümörde daha uzun süre kalir. Bu sistem memeli hastaliklarini teshis etmek ya da tedavi etmek için kullanilabilir. Teknikte, dogrudan hedefleme sisteminde yararli olan çok degerlikli, monospesifik baglanma proteinlerinin üretimi için ve bir yakinlik arttirma sisteminde faydali olan çok degerlikli, çok özellikli baglanma proteinlerinin üretimi için hala bir ihtiyaç söz konusudur. Spesifik olarak, hedeflenen antijenlerde arttirilmis alim, kanda konsantrasyon derisimi ve normal dokularin ve hücrelerin toksik ilaçlardan optimum sekilde korunmasini gösteren bir baglayici proteine ihtiyaç duyulmaktadir. 1995), insan meme kanseri ile RS7'nin içsellestirici bir antikorunun in vitro ve in vivo reaktivitesini rapor eder. WO 98/42378, anti CD22 antikorlari kullanilarak B hücresi malinitelerinin immünoterapisi ile ilgilidir. baglayici kisma karsi reaktif olan en az bir baska kola sahip olan iki spesifik bir antikor ya da antikor parçasi ile ilgilidir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulusun altinda yatan problem bagimsiz istemlerin konusu ile çözülür; tercih edilen yapilanmalar ekli bagimli istemlerden alinabilir. Daha spesifik olarak, mevcut bulusun altinda yatan problem, bir birinci y'on içinde, bir epitelyal glikoprotein*1 (EGP-1) baglamak için, hafif zincir tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) dizileri CDR1 KASQDVSIAVA; CDR2 SASYRYT; ve CDR3 QQHYlTPLT; ve agir zincir CDR dizileri CDR1 NYGMN; CDR2 WlNTYTGEPTYTDDFKG ve CDR3 GGFGSSYWYFDV içeren bir murin RS? antikoru ile rekabet eden bir kimerik insanlastirilmis ya da insan antikoru ya da bunun antijen baglayici parçasi ile çözülmekte olup, içerisinde antikor ya da bunun antijen baglayici parçasi, epitel glikoproteini-1'i taniyan bir insanlastirilmis RS? antikorundan ya da bunun parçasindan farklidir ve antikorun ya da bunun parçasinin agir zincir degisken bölgesinin CDR'leri, NYGMN'nin bir amino asit sekansini içeren CDR1; WlNTYTGEPTYTDDFKG'nin bir amino asit sekansini içeren CDR2 ve GGFGSSYWYFDV'nin bir amino asit sekansini içeren CDR3 içerir; ve içerisinde antikorun ya da bunun antijen baglayici parçasinin hafif zincir degisken bölgesinin CDR'leri KASQDVSlAVA'nin bir amino asit sekansini içeren CDR1; SASYRYT'nin bir amino asit sekansini içeren CDR2; ve QQHYlTPLT'nin bir amino asit sekansini içeren CDR3 içerir. Birinci yönün bir yapilanmasinda, kimerik, insanlastirilmis ya da insan antikoru ya da bunun antijen baglayici parçasi, bir murin RS? MAb'in (monoklonal antikor) CDR'lerini ve bir insan antikorunun hafif ve agir zincir degisken bölgelerini içermekte olup, içerisinde insanlastirilmis RS? MAb'inin hafif zincir degisken bölgesinin CDR'leri CDR1 KASQDVSlAVA; CDR2 SASYRYT; ve CDR3 QQHYlTPLT içerir; ve insanlastirilmis RS? MAb'Iarinin agir zincir degisken bölgesinin CDR'leri CDR1 NYGMN; CDR2WINTYTGEPTYTDDFKG ve CDR3 GGFGSSYWYFDV içerir. Mevcut bulusun altinda yatan problem, ikinci bir yönü ile, herhangi bir yapilanmayi içeren birinci yönüne göre bir kimerik, insanlastirilmis ya da insan anti EGP-1 antikoru ya da bunun antijen baglayici bir parçasini içeren bir antikor füzyon proteini ile çözülür. Mevcut bulusun altinda yatan problem, bir üçüncü yönü ile, bir kimerik, insanlastirilmis ya da insan anti EGP-1 MAb ya da bunun antijen baglayici parçasi ya da birinci, ve sirasi ile, ikinci yönün, bunun herhangi bir yapilanmasi da dahil olmak üzere, bir antikor füzyon proteinini içeren bir antikor bileseni içeren bir tanilayici ya da terapötik konjugat ile çözülmekte olup, içerisinde bahse konu antikor bileseni en az bir tanilayici ya da en az bir terapötik maddeye baglanmistir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, bahse konu tanilayici madde, bir foto aktif tanilayici madde, 25 ila 4.000 keV arasinda bir enerjiye sahip bir radyoaktif etiket, bir gama-, beta- ya da bir pozitron yayan izotop, bir paramanyetik iyon, bir ultrason arttirici madde ve bir Iipozomdan olusan gruptan seçilir. ve 7SBr'den olusan gruptan seçilir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, bahse konu terapötik madde, bir radyoaktif etiket, bir immüno modülatör, bir hormon, bir enzim, bir foto aktif terapötik madde, bir sitotoksik madde ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, söz konusu sitotoksik madde bir ilaç ya da bir toksindir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, bahse konu ilaç, anti mitotik, alkilleyici, anti metabolit, anti anjiyojenik, apoptotik, alkaloit ve antibiyotik maddeleri ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen farmasötik özellige sahiptir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, bahse konu ilaç azot hardallari, etilenimin türevleri, alkil sülfonatlar, nitrozüreler, triazenler, folik asit analoglari, antrasiklinler, taksanlar, COX-2 inhibitörleri, pirimidin analoglari, purin analoglari, antibiyotikler, enzimler, epipodofilotoksinler, platin koordinasyon kompleksleri, vinka alkaloitleri, ornatilmis üreler, metil hidrazin türevleri, adrenokortikal baskilayicilar, antagonistler, endostatin, taksoller, kamptotesinler, doksorubisinler ve bunlarin analoglari ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, bahse konu toksin, risin, abrin, alfa toksin, saporin, ribonükleaz (RNaz), DNaz l, Stafilokokal enterotoksin-A, sekerci boyasi antiviral protein, jelonin, difterin toksini, Psödomonas eksotoksin ve Psödomonas endotoksinden olusan gruptan seçilir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, bahse konu immüno modülatör, bir sitokin, bir kök hücre büyüme faktörü, bir lenfotoksin, bir hematopoetik faktör, bir koloni uyarici faktör (CSF), bir interferon (IFN), bir kök hücre büyüme faktörü, eritropoietin, trombopoietin ve bunlarin bir kombinasyonunu içeren gruptan seçilir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, bahse konu Ienfotoksin tümör nekroz faktörüdür (TNF), bahse konu hematopoietik faktör bir interlökindir (lL), bahse konu koloni uyarici faktör granülosit koloni uyarici faktör (G-CSF) ya da granülosit makrofaj koloni uyarici faktördür (GM-CSF), bahse konu interferon interferonlar-oi, -ß ya da -y'dir, ve bahse konu kök hücre büyüme faktörü "S1 faktörü" olarak adlandirilir. Üçüncü yönün bir yapilanmasinda, bahsedilen immüno modülatör. IL-1, lL-2, lL-3, IL- 6, lL-10, lL-12, lL-18, IL-21, interferon-y, TNF-oi'yi ya da bunlarin bir kombinasyonunu Üçüncü yönün bir uygulamasinda söz konusu radyoaktif etiket, 32P, 33P, 47Sc, 64Cu, kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilir. Mevcut bulusun altinda yatan problem, bir dördüncü yönde, bir ya da daha fazla kimerik, insanlastirilmis ya da insan anti EGP-1 antikorlari ya da bunlarin antijen baglayan parçalarini ya da bunlarin herhangi bir yapilanmasi da dahil olmak üzere birinci, ikinci ve üçüncü yöne göre terapötik konjugatlari, ya da bir hapten molekülüne karsi bir benzesime sahip olan bir ya da daha fazla hapten baglayici bölgeleri içeren bir çok degerlikli, çoklu spesifik antikor tarafindan çözülür. Mevcut bulusun altinda yatan problem, bir besinci yönde, en az bir kimerik, Insanlastirilmis ya da insan anti EGP-1 MAb ya da bunun antijen baglayici bir parçasini ya da bunlarin herhangi bir yapilanmasi da dahil olmak üzere, birinci ikinci ve üçüncü yönlerin herhangi birinin terapötik konjugatini, ve en az bir ikinci MAb ya da bunun bir parçasini içeren bir antikor füzyon proteini ile çözülür. Besinci yönün bir yapilanmasinda, bahse konu ikinci antikor ya da bunun parçasi, CEA, CSAp, Tn, Le (y), MUC-1-4, Tag-72, EGFR, HER2/neu, PSMA, PSA, AFP, HCG, HCG-beta, ferritin, PAP, PLAP, EGP-2, histon, sitokeratin, Tenascin, CanAg, böbrek kanseri G 250, VGFR1, VGFR2, VEGF, P1GF, insülin benzeri büyüme faktörü, onkojen ürünler ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilen bir antijen ile reaktiftir. Mevcut bulusun altinda yatan problem, bir altinci yönde, en az bir çiplak kimerik, Insanlastirilmis ya da insan anti EGP-1 MAb ya da bunun antijen baglayici bir parçasi ya da kanserin tedavisi için bir metotta kullanim için bunlarin herhangi bir yapilanmasi da dahil olmak üzere, birinci ikinci ve besinci yönlerin herhangi birinin bir çiplak antikor füzyon proteini ya da bunun bir parçasi ile çözülür. Mevcut bulusun altinda yatan problem, bir yedinci yönde, bir kimerik, insanlastirilmis ya da insan anti EGP-1 MAb ya da bunun antijen baglayici bir parçasi ya da bunlarin herhangi bir yapilanmasi da dahil olmak üzere, birinci, ikinci, üçüncü, dördüncü, besinci ya da altinci yönlerin herhangi birinin antikor füzyon proteini ile çözülmekte olup, içerisinde bahse konu kimerik, insanlastirilmis ya da insan anti EGP-1 MAb ya da bunun antijen baglayici parçasi ya da antikor füzyon proteini bir malinitenin tedavisinin bir metodunda kullanim Için en az bir terapötik madde ile baglanmistir. Buna göre, mevcut bulusun bir amaci, insan küçük hücreli olmayan akciger karsinomuna karsi yetistirilmis olan murin MAb R87-3G11 tarafindan epitelyal glikoprotein-1 (EGP-1) olarak tanimlanmis olan bir tümör ile iliskili antijeni taniyan bir monospesifik monoklonal antikor ya da bunun parçalarini saglamaktirRS7 antijeni, Akciger Tümörü ve Farklilasma Antijenleri Üzerine 3. Uluslararasi IASLC Çalistayinin (3rd International IASLC Workshop on Lung Tumorand Differentiation Antigens) önerisini takiben EGP-1 (epitelyal glikoprotein-l) olarak adlandirilmistirEGP-1 ile iliskili en az bir epitop, alternatif olarak literatürde TROP2 olarak adlandirilir. Tercih edilen bir yapilanmada, mevcut bulusun antikoru ya da antikor parçasi, Stein (infra) daha önceki diger çalismalar tarafindan açiklanan murin RS? antikoru ile ayni epitopu baglar. Alternatif olarak, antikor ya da parça, Stein tarafindan açiklanan murin RS7 antikorunun bagladigi epitoptan ayri bir epitopu baglayabilir. Tercih edilen bir yapilanmada, anti EGP-1 ya da anti TROP2 antikoru ya da bunun parçasi, bir kimerik, insanlastirilmis ya da tamamen insan RS? antikoru ya da bunun parçasidir. Mevcut bulusta tasarlanmis olan, istemlerde tarif edildigi sekli ile bir insanlastirilmis antikor ya da bunun parçasi olup, içerisinde insanlastirilmis RS? Mab'in hafif zincir degisken bölgelerinin tamamlayicilik belirleyici bölgeleri (CDR'Ier), KASQDVSIAVA'nin bir amino asit sekansini içeren CDR1; SASYRYT'nin bir amino asit sekansini içeren CDR2; QQHYITPLT'nin bir amino asit sekansini içeren CDR3 içerir. istemlerde tarif edildigi sekli ile mevcut bulusun bir baska yapilanmasi bir insanlastirilmis antikor ya da bunun parçasi olup, içerisinde insanlastirilmis RS? MAb'nin agir zincir degisken bölgesinin CDR'leri, NYGMN'nin bir amino asit sekansini içeren CDR1; WlNTYTGEPTYTDDFKG'nin bir amino asit sekansini içeren CDR2 ve GGFGSSYWYFDV'nin bir amino asit sekansini içeren CDR3 içerir. Ayni zamanda burada açiklanan, bir murin RS7 MAb'nin CDR'lerini ve bir insan antikorunun hafif ve agir zincir degisken bölgelerinin çerçeve bölgelerini (FR) içeren bir insanlastirilmis antikor ya da bunun parçasi olup, içerisinde insanlastirilmis RS? Mab'in hafif zincir degisken bölgelerinin CDR'Ieri, KASQDVSIAVA'nin bir amino asit sekansini içeren CDR1; SASYRYT'nin bir amino asit sekansini içeren CDR2; QQHYITPLT'nin bir amino asit sekansini içeren CDR3 içerir; ve insanlastirilmis RS? MAb'nin agir zincir degisken bölgesinin CDR'leri, NYGMN'nin bir amino asit sekansini içeren CDR1; WlNTYTGEPTYTDDFKG'nin bir amino asit sekansini içeren CDR2 ve GGFGSSYWYFDV'nin bir amino asit sekansini içeren CDR3 içerir. Yine tercih edilen, insanlastirilmis antikor ya da bunun parçasinin ayrica bir insan antikorunun hafif ve agir zincir sabit bölgelerinin FR'Ierini de içermesidir. Tercih edilen bir yapilanmada, insanlastirilmis antikor ya da parça, RS7 murin antikorunda karsilik gelen bir konumda bulunan bir amino asit artigi ile ornatilmis en az bir amino asit içeren bir hafif ve/ veya agir zincirin FR'sini içerir. Ornek olarak, ornatilmis amino asitlerden en az biri, tercihen, sekil SB'deki murin agir zincir degisken bölgesinin artik 38, 46, 68 ve 91'inden olusan gruptan seçilmis bir konumdadir ve/ veya ornatilmis amino asitlerden en az biri, tercihen, sekil 3A'daki murin hafif zincir degisken bölgesinin artik 20, 85 ve 100"L'inden olusan gruptan seçilmis bir konumdadir Ayni zamanda, istemlerde tarif edildigi sekli ile mevcut bulusta tarif edilen, en az iki EGP-1 MAb ya da bunlarin parçalarini içeren bir antikor füzyon proteini ya da bunun parçasi olup, içerisinde MAb ya da parçalar, mevcut bulusun anti EGP-1'i ya da bunun parçalarindan seçilmistir. Ilgili bir damarda, antikor füzyon proteini ya da bunun parçasi, mevcut bulusun anti EGP-1 antikorlarinin herhangi birinin en az bir birinci anti EGP-1 MAb ya da bunun parçasini ve mevcut bulustaki anti EGP antikorlarindan ya da bunlarin parçasinda farkli olan, en az bir ikinci MAb ya da bunun parçasini içerir. Ornek olarak, ikinci antikor ya da bunun parçasi, karsinom ile iliskili bir antikor ya da bunun parçasi olabilir. Tercih edilen baska bir yapilanma, iki farkli epitop baglayici anti EGP-1 antikorlari ya da bunlarin parçalarini içeren bir füzyon proteini ya da bunun parçasidir. Mevcut bulusun bir amaci, RS? antijeni `üzerinde birden fazla epitopu taniyan ya da RS? antijeni ve bir hapten molekül'u için benzesime sahip olan çok spesifik bir antikor ve bunun parçalarinin saglanmasidir. Son baglayici protein, bir hedef antijenin önceden hedeflenmesi için faydalidir. Buna göre, bir tanilayici maddenin, bir terapötik maddenin, ya da bir bunlarin bir kombinasyonunun bir hedefe iletilmesinin asagidakileri içeren: (i) bir denege, bir çoklu degerlikli, çoklu spesifik MAb'nin ya da bunun parçasinin verilmesi; (ii) bir baglayici olmayan proteinin denegin kan akisini temizlemesi için yeterli bir miktar beklemek; ve (iii) bahse konu denege, bahse konu antikorun bir baglama alanini baglayan bir tanilayici madde, bir terapötik madde, ya da bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir tasiyici molekülün verilmesini içeren bir metodu ayni zamanda tarif edilmektedir. Bu açiklamanin bir baska amaci, EGP-1 antijenini eksprese eden hedeflenmis bir hastaliga bir tanilayici ya da terapotik bir madde iletme metodu sunmaktir. Ornek olarak, bir hedefe, bir tanilayici ya da terapötik madde ya da bunlarin bir kombinasyonunun iletilmesinin asagidakileri içeren: (i) en az bir terap'otik ve/ veya tanilayici maddeye baglanmis olan bir anti EGP-1 antikoru ya da bunun parçasini içeren bir bilesimin saglanmasi ve (ii) bahse konu bilesimin ihtiyaci olan bir denege verilmesini içeren bir metodu tarif edilmektedir. Tercihen, tanilayici ya da terapötik madde, bir izotop, ilaç, toksin, immüno, modülatör, hormon, enzim, büyüme faktörü, radyonüklid, metal, kontrast madde ve tespit edici maddeden olusan gruptan seçilir. Bir tanilayici maddeyi, terap'otik bir maddeyi ya da bunlarin bir kombinasyonunu bir hedefe iletme metodu asagidakileri içerir: (i) bir denege, bir hedef EGP-1 antijenine ve bir hapten molekülüne karsi bir benzesime sahip olan bir ya da daha fazla hapten baglayici alanina sahip bir ya da daha fazla antijen baglayici alani içeren bir çoklu degerlikli, çoklu spesifik antikor ya da bunun parçasinin verilmesi,(ii) bir baglayici olmayan antikor ya da parçanin bir miktarinin bir denegin kan akisini temizlemesi için yeterli bir miktarda beklemek, ve (iii) bahse konu denege bir tanilayici madde, bir terap'otik madde, ya da bunlarin bir karisimini içeren bir hapten verilmesi. Mevcut bulusun bir baska amaci, istemlerde tarif edildigi sekli ile, mevcut bulusun antikorlarindan herhangi birinin bir anti EGP-1 MAb'sini ya da bunun parçasini ya da antikor füzyon proteinini ya da bunun parçasini içeren, bir kanser hücresini hedefleyen tanilayici ya da terapötik konjugatin saglanmasi olup, içerisinde anti EGP-1 antikoru yada bunun parçasi en az bir tanilayici ya da terapötik maddeye baglanir.Uygun bir terap'otik madde, bir anti mitotik, alkilleyici, anti metabolit, anti anjiyojenik, apoptotik, alkiloit antibiyotik ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen farmasötik özellige sahip bir ilaçtir. Ayni zamanda tercih edilen, bir nitrojen hardali, etilenimin türevi, alkil sülfonat, nitrozüre, traizen, folik asit analogu, antrasiklin, taksan, COX-2 inhibitörü, tirosin kinaz inhibitörü, pirimidin analogu, purin analogu, antibiyotik, enzim, epipodofilotoksin, platinim koordinasyon kompleksi, vinka alkaloid, ornatilmis üre, metil hidrazin türevi, adrenokortikal baskilayici, antagonist, endostatin taksol, kamptotesin, doksorubisin, doksorubisin analogu ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilen bir terapötik maddedir. Tercihen, tanilayici madde, 25 ila 4000 keV arasinda tercih edilen bir foto aktif radyonüklid ve bir kontrast madde içeren gruptan seçilir. Ayni zamanda tarif edilen, mevcut bulusun bir anti EGP-1 MAb'sini ya da bunun parçasini içeren bir MAb'i ya da onun parçasini kodlayan nükleik asidi; bahse konu MAb'Iari ya da bunlarin parçalarinin en az ikisini içeren bir antikor füzyon proteini ya da bunun parçasini; mevcut bulusun anti EGP-1 antikorlarinin ve parçalarinin MAb ya da parçalarini içeren en az bir birinci anti EGP-1 MAb ya da bunun parçasini ve burada tarif edilen anti EGP-1 MAb ya da bunun parçasindan farkli olan en az bir ikinci MAb ya da bunun parçasini içeren bir antikor füzyon proteinini ya da bunun parçasini; ya da burada tarif edilen herhangi bir antikorun bahse konu MAb'sini ya da bunun parçasini içeren en az bir birinci MAb ya da bunun parçasini ve burada tarif edilen herhangi bir antikorun MAb'sinden ya da bunun parçasindan farkli olan en az bir ikinci MAb'yi ya da bunun parçasini içeren bir antikor füzyon proteinini ya da bunun parçasini içeren bir DNA sekansi olup, içerisinde ikinci MAb, EGP-2, MUC 1 ila 4 arasindakiler, A33, CSAp, CEA, Le(y) Tn, Tag-72, PSMA, PSA, EGFR, HER2/neu, AFP, HCG, HCG-beta, ferritin, PAP, PLAP, EGP-2, histon, sitokeratin, Tenascin, CanAg, böbrek kanseri G 250, VGFR1, VGF2, PAM4 antijen, onkojen ürünleri, ya da bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilmis olan bir antikor ile reaktiftir. Ikinci MAb, bunun yerine VEGF (vasküler endotel büyüme faktörü) ve P1GF (plasenta büyüme faktörü) gibi tümörler ile iliskili vasküler endotel antijenleri ile reaktif olabilir. Ikinci antikorun seçimi, tümör hücresi tipine baglidir. Ornek olarak, anti PSMA ya da anti PSA antikorlari, prostat kanserini, anti CEA ya da anti MUC1, MUC2, MUC3 ve MUC4 antikorlari gögüs, yumurtalik, akciger ve kolon kanserini, EGFR kolon ve bas ve boyun kanserlerini, anti CSAp antikorlari kolon ve yumurtalik kanserini ve anti HER/neu gögüs, yumurtalik ve öteki kanserleri tedavi etmek ya da teshis etmek için kullanilabilir. Bunlar sadece örnek olarak verilmistir ve sinirlayici olmalari amaçlanmamistir. Ayni zamanda, bu DNA sekansini içeren ekspresyon vektörleri ve konak hücreler de mevcut bulusun tercih edilen yapilanmalaridir. Ayni zamanda burada açiklanan, bir malinitenin teshis ve tedavisi için metotlardir. Ornek olarak, kanserin teshis edilmesi ya da tedavi edilmesi için bir metot asagidakileri içerir: (i) buna ihtiyaci olan bir denege, bir EGP-1 hedef antijenine karsi benzesime sahip olan bir ya da daha fazla antijen baglayici alanlarini ve bir hapten molekülüne karsi benzesime sahip olan bir yada daha fazla hapten baglama alanlarini içeren bir çoklu degerlikli, çoklu spesifik antikor ya da parça verilmesi; (ii) baglayici olmayan proteinin bir miktarinin denegin kari akisini temizlemesi için yeterli bir miktarda süre beklenmesi; ve (iii) bahse konu denege, bahse konu antikorun bir baglama alanini baglayan, bir tanilayici madde, bir terap'otik madde, ya da bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir hapten verilmesi. Benzer sekilde, bir malinitenin teshisi ve tedavisi için metotlar, bir anti EGP-1 füzyon proteinin ya da bunun bir parçasinin ya da bir EGP-1 MAb ya da bunun parçasini içeren bir terapötik konjugatin bir terapotik olarak etkili miktarinin verilmesini içerebilir olup, içerisinde EGP-1 MAb ya da bunun parçasi ya da antikor füzyon proteini ya da bunun parçasi, farmasbtik olarak uygun bir eksipiyan içerisindeki en az bir terap'otik madde ile baglidir. Ilgili bir damarda, çiplak anti EGP-1 füzyon proteinleri ve bunlarin parçalarini içeren çiplak anti EGP-1 antikorlari ve bunlarin parçalari, ayni zamanda bir malinitenin tedavisinde de kullanilabilir. Çiplak anti EGP-1 antikorlari, bir malinitenin in vitro teshisi için, 'örnek olarak immünolojik testler ya da immünohistokimya ile kullanilabilir, ancak bu, AES gibi bir ön hedefleme teknolojisini içermedigi sürece in vivo teshis için kullanilamaz .Bununla birlikte, etiketli EGP-1 antikorlari, bir malinitenin in vivo teshisi ve tedavisi için kullanilabilir. Ornek olarak, burada tarif edilen, bir denekteki bir kanser hücresinin tedavisi için asagidakileri içeren bir metottur: (i) bir denege bir anti EGP-1 MAb ya da bunun parçasini ya da bir antikor füzyon proteini ya da bunun bir parçasinin terapbtik olarak etkili bir miktarinin verilmesi, (ii) EGP-1 MAbrnin ya da bunun parçasinin ya da antikor füzyon proteinin ya da bunun parçasinin bir farmas'otik olarak uygun eksipiyan içinde formüle edilmesi. Benzer sekilde, ayni zamanda, çiplak MAb'Ierin ve bunlarin parçalarinin, konjuge edilmis MAb'Ier ve bunlarin parçalari ya da füzyon proteinleri ya da bunlarin parçalari ile karisimlari da teshis ve tedavi için bu bulusta tasarlanmistir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, rekabetçi baglama deneylerinde mRST, cAb-Vi< #23 (cRSY) ve CAb-VK konsantrasyonlari, sabit bir miktarda biotinlenmis mR87 antikorunun baglanmasi ile rekabet etmek için kullanilmistir. Sonuçlar, VK #1 hafif zincirinin RS7 antijenini baglamadigini göstermektedir. Sekil 2, 5' RACE tarafindan klonlanmis olan RS? VK'yi (A) ve RT-PCR tarafindan klonlanmis olan RS? VH'yi (B) kodlayan DNA ve amino asit sekanslarini göstermektedir. Farz edilen CDR bölgelerinin alti çizilmistir ve gösterilmistir. Nükleotid artiklari sira ile numaralandirilir. Kabat'in lg molekülü numaralandirmasi, amino asit artiklari için kullanilmistir. (B)'de, artiklarin bir harf (üstte) ile numaralandirilmasi önce gelen artigin numarasi arti harftir, örnek olarak, N52'yi takip eden T için numara 52A'dir; 182'yi takip eden N, N ve L için numaralar sirasi ile 82A, 828 ve 82C'dir. Sekil 3, (A) insan SA-1A'cl, murin RS7 ve hR87 VK zincirlerinin ve (B) insan RF-TSB, murin RS? ve hRS7 VH zincirlerinin amino asit sekans hizalamasini gösterir. (A)'da, noktalar RS7'deki artiklarin SA-1A'cl'deki karsilik gelen artiklar ile ayni oldugunu belirtir. Kisa çizgiler, hizalamaya yardimci olmak için eklenen bosluklari temsil eder. Kutular, CDR bölgelerini temsil eder. HRS7'nin hem N- hem de C-terminal artiklari (alti çizili) kullanilan evreleme vektörü ile sabitlenmistir. Bu nedenle, RS7'nin karsilik gelen terminal artiklari, insan sekansininki ile karsilastirilmaz. Kabat'in numaralandirma semasi kullanilmistir. (B)'de, noktalar RS7'deki artiklarin RF-TS3'teki karsilik gelen artiklar ile ayni oldugunu belirtir. Kisa çizgiler, hizalamaya yardimci olmak için eklenen bosluklari temsil eder. Kutular, CDR bölgelerini temsil eder. hRS7'nin hem N- hem de C-terminal artiklari (alti çizili) kullanilan evreleme vektör'u ile sabitlenmistir. Bu nedenle, RS7'nin karsilik gelen terminal artiklari, insan VH sekansininki ile karsilastirilmaz. Sekil 4, (A) insanlastirilmis RS7 VK ve (B) insanlastirilmis RS? VH için DNA ve amino asit sekanslarini göstermektedir. Amino asit sekanslarinin kalin ve alti çizili bölümleri, Kabat numaralandirma semasi ile tanimlanan CDR'leri belirtir. Sekil 5, (A) insanlastirilmis RS? VK için hafif zincir cDNA ve amino asit sekanslarini ve insanlastirilmis RS? VH için agir zincir cDNA ve amino asit sekanslarini göstermektedir. Amino asit sekanslarinin alti çizili bölümleri, sekresyon için lider peptit sekansini göstermektedir. ""*, durdurma kodonunu göstermektedir. Sekil 6, rekabetçi baglama deneylerinde mRS7, cRS? ve hRS7'nin bir karsilastirmasini göstermektedir. Rekabetçi Abs'nin degisken konsantrasyonlari, sabit bir miktardaki Biotinlenmis RS7'nin Ag kapli 96 kuyucuklu ELlSA plakalarina baglanmasi ile rekabet etmek için kullanilmistir. hRS7, RS? ve cRSY'nin bloklama aktivitesine mukayese edilebilir bir aktivite göstermistir. Sekil 7, insanlastirilmis RS7 VK için hafif zincir cDNA ve amino asit sekanslarini göstermektedir. Amino asit sekanslarinin alti çizili bölümleri, sekresyon için lider peptit sekansini göstermektedir. ""*, durdurma kodonunu göstermektedir. Ayni zamanda lizin artiklarinin da alti çizilidir. Sekil 8, insanlastirilmis RS7 VK için agir zincir cDNA ve amino asit sekanslarini göstermektedir. Amino asit sekanslarinin alti çizili bölümleri, sekresyon için lider peptit sekansini göstermektedir. "",* durdurma kodonunu göstermektedir. Ayni zamanda lizin artiklarinin da alti çizilidir. Sekil 9, EMP-R4, lMP-R5 ve lMP-R8 artik hale getirme kisimlarinin yapisini gösterir. Sekil 10, MDA-MB-468 tümör modelinde radyo iyodinlenmis hRS7'ye bagli bir dozimetri grafigidir. Sekil 11, radyo immüno terapinin çiplak farelerde meme kanseri ksenogreftlerinin tümör büyümesi üzerindeki etkilerini gösteren bir dizi grafik sunmaktadir. Sekil 12, çiplak farelerde meme kanseri ksenogreftlerinin radyoimmünoterapi tedavisi sonrasi toksisiteyi degerlendiren bir dizi grafiktir. Sekil 13, nispi ortalama tümör hacimlerini (MTV) gösteren bir grafiktir. TERCIH EDILEN YAPILANMALARIN DETAYLI AÇIKLAMASI Aksi belirtilmedikçe, "bir" ya da "bir", "bir ya da daha fazla" anlamina gelir. Bir RS7 antikoru (daha önce belirtilen RS7-3G11), akcigerden bir insan primer yapiskan hücreli karsinomun ham membran hazirlanmasina karsi yükseltilmis bir murin IgG1'dir. Bakiniz, tamamen referans olarak dahil edilmis olan, Stein et al., karsinomuna karsi olusturulan murin MAb RS7-3G11 ile tanimlanan tümör ile iliskili bir antijeni tanir. Stein et al. RS7 antikorunun, yigilim 13 olarak karakterize edilen bir 46 ila 48 kDa arasi glikoproteini tanidigini açiklar. Stein et al., Int. J. Cancer Supp. antijeni, Akciger Tümörü ve Farkliiasma Antijenleri Üzerine 3. Uluslararasi IASLC Çalistayinin (3rd international IASLC Workshop on Lung Tumorand Differentiation Antigens) önerisini takiben EGP-1 (epiteiyai glikoprotein-1) olarak adlandiriimistir.Bakiniz, örnek olarak, DeLeij et al., int. J. Cancer Supp., 8260-63 (1994). Buna göre, burada tarif edildigi gibi, RS? ve EGP-1 antijenleri uyumludurEGP-1 antijeni literatürde ayni zamanda TROP2 olarak da bilinir, ancak hem EGP-1 hem de TROP2'nin birden fazla epitopu olabilir. Akis sitometrisi ve immüno histokimyasal boyama çalismalari, RS7 MAb'nin, normal insan dokusuna sinirli baglanma ile çesitli tümör tiplerinde antijen saptadigini göstermistir.(8tein et al., (1990), supra).RS7 antikoru, hizli bir sekilde içseliestirilebiien bir EGP-1 glikoprotein ile reaktiftir.EGP-1, öncelikle, akciger, mide, idrar kesesi, meme, yumurtalik, uterus ve prostat kanserleri gibi karsinomiar araciligi ile eksprese edilir. Hayvan modellerinde radyo etiketli murin RS? MAb kullanan iokalizasyon ve terapi çalismalari, tümör hedefleme ve terapötik etkinligi göstermistir (Stein et al. (1990) supra. Stein et al.(1991) supra). Daha yeni bir çalisma, akciger, meme, mesane, yumurtalik, uterus, mide ve prostat tümörlerinde güçlü RS7 boyamasi oldugunu göstermistir. Bakiniz, referans ile tamamen dahil edilmis olan, Stein et al., Int. J. Cancer 55: 938 (1993). Ayrica, bu çalismada akciger kanseri vakalari hem yapiskan hücreli karsinomiari hem de adenokarsinomiari içermektedir. Id. Her iki hücre tipi de güçlü bir sekilde boyanmistir; bu, RS? antikorunun, akcigerin küçük hücreli karsinomunun histolojik siniflari arasinda ayrim yapmadigini gösterir. Yukarida bahsediidigi gibi, RS? MAb hizli bir sekilde hedef hücrelere içseiiestiriiir (Stein et al.(1993)supra).R87 MAb için içsellestirme hizi sabiti, immüno toksin üretimi Için faydali oldugu gösterilen diger iki hizli sekilde içsellestiren MAb'in içseiiestirme hizi sabitleri arasinda orta seviyededir. Id. immüno toksin konjugatiarinin içseiiestiriimesinin, anti tümör aktivitesi için mutlak bir gereklilik oldugu detayli olarak belgelenmistir. (Pastan et al., Cell 47:641 (1986)). Ilaç immüno konjugatiarinin içseliestirilmesi, ayrica anti tümör etkiniiginde majör bir faktör olarak tarif antijeni, terapötik maddenin içsellestirilmesini gerektiren bu tip imm'uno terapi türleri için önemli bir hedef olabilir. Bu nedenle, RS7 MAb ile yapilan çalismalar, antikorun klinik teshis ve terapötik uygulamalar için aday olmasini saglayan birkaç önemli özellik gösterdigini göstermektedir.RS7 antijeni, teshis ve tedavi için faydali bir hedef sundugu için, RS7 antijeninin bir epitopunu taniyan bir MAb elde edilmesi arzu edilir. Ayrica, kimerik, Insanlastirilmis ve insan RS7 antikorlarinin mevcudiyeti, klinik numunelerde RS? antijeninin saptanmasi için arzu edilen ve in vivo uygulamalar için gerekli olan, çift determinant enzim bagli immünosorbent analizinin (ELISA) insanlarda gelistirilmesi için çok önemlidir. Bu amaçla, istemlerde tanimlandigi sekli ile mevcut bulus, bir yapilanmada, kimerik, insanlastirilmis ve insan antikorlarini ve bunlarin RS7 antijenini baglayan ve teshis ve tedavi metotlari için kullanilabilecek parçalari tarif eder.InsanlastiriImis antikorlar ve antikor parçalari, "Anti-CD20 Antibodies And Fusion Proteins Thereof And Methods Of Use" (Anti-CD20 Antikorlari ve Bunlarin Füzyon Proteinleri ve Kullanim Metotlari) karsinoembriyonik antijen antikor (anti-CEA antikor) olan, U.S. Basvuru No: tarif edilenler gibi Mu-9 antikorlari; U.S. Geçici Basvuru No. 60/399,707'de tarif edilenler gibi AFP antikorlari; 18733/1102 Vekalet Numarali "Monoclonal Antibody cPAM4" (Monoklonal Antikor cPAM4) baslikli Geçici U.S. Basvurusunda tarif edilenler gibi PAM4 antikorlari; U.S. Geçici Basvuru No. 60/360,229'da tarif edilenler açiklandigi sekli ile bir kimerik antikor, antikor molekülünün sabit etki alanlari bir insan antikorunkinden t'uretilirken, bir türden t'uretilen antikorlarin, tercihen bir kemirgen antikoru, bütünleyicilik belirleme bölgelerini (CDR'Ier) içeren degisken etki alanlarini içeren bir rekombinant proteindir. Veteriner uygulamalari için, kimerik antikorun sabit etki alanlari, diger türlerinkilerden elde edilebilir. Bir insanlastirismis antikor, bir tür antikorundan CDR'Ierin, örnek olarak bir kemirgen antikorunun CDR'lerinin, kemirgen antikorunun agir ve degisken zincirlerinden insan agir ve hafif degisken etki alanlarina aktarildigi bir rekombinant proteindir. Tercih edilen bir yapilanmada, RS? antikoru insanlastirilmistir. Insan olmayan monoklonal antikorlar, insan konakçi tarafindan yabanci bir protein olarak taninabilecegi ve tekrarlanan enjeksiyonlar, zararli asiri duyarlilik reaksiyonlarina yol açabilecegi için, bir murin RS? sekanslarinin insanlastirilmasi, hastalarin yasayabilecegi olumsuz bagisiklik tepkisini azaltabilir. Murin bazli monoklonal antikorlar için, bu genellikle bir Insan Anti Fare Antikoru (HAMA) tepkisi olarak adlandirilir. Mevcut bulusun bir baska yapilanmasi, bir insan alti primat anti EGP-1 antikoru, murin monoklonal anti EGP-1 antikoru (veteriner uygulamalari ile sinirli), kimerik anti EGP-1 antikoru, insan anti EGP-1 antikoru ve insanlastirilmis anti EGP-1 antikoru olan bir anti EGF-1 antikoru ya da bunun parçasidir. Tercihen, insanlastirilmis RS? antikorunun ya da bunlarin parçalari çerçeve bölgelerinde bulunan bazi insan artiklari, kendi murin karsitlari ile degistirilir. Ayni zamanda, VH için 2 farkli insan antikorundan bir çerçeve sekansi kombinasyonunun kullanilmasi da tercih edilir. Antikor molekülünün sabit etki alanlari bir insan antikorununkinden elde Mevcut bulusun tercih edilen baska bir yapilanmasi bir insan RS? antikorudur. Bir insan antikoru, antijenik zorluga yanit olarak spesifik insan antikorlari üretmek için ve hafif zincir lokusunun ögeleri, endojen agir zincir ve hafif zincir lokuslarinin hedeflenmis bozulmalarini içeren embriyonik kök hücre çizgilerinden türetilmis farelerin suslarina eklenir. Transjenik fareler, insan antijenlerine özgü insan antikorlarini sentezleyebilir ve fareler, insan antikor salgilayan hibridomlari üretmek için kullanilabilir. Transjenik farelerden insan antikorlari elde etme metotlari Green et al., Int. lmmun. 6:579 (1994)'da tarif edilmistir. Bir tam manasi ile insan antikoru, ayni zamanda, hepsi teknikte bilinen faj görüntüleme teknolojisi ile birlikte genetik ya da kromozomal transfeksiyon metotlari ile de olusturulabilir. Ornek olarak, asilanmamis donörlerden immünoglobulin degisken etki alanli gen repertuarlarindan in vitro insan antikorlari ve bunlarin parçalarinin üretimi için McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)'a bakiniz. Bu teknikte, antikor degisken etki alani genleri, filamentöz bir bakteriyofajin majör ya da minör bir tabaka protein genine çerçeve içinde klonlanir ve faj partikülünün yüzeyinde fonksiyonel antikor parçalari olarak gösterilir. Filamentöz partikül, faj genomunun tek sarmalli bir DNA kopyasini içerdiginden, antikorun fonksiyonel özelliklerine dayali seçimler ayni zamanda bu özellikleri sergileyen antikoru kodlayan genin seçilmesine de neden olur. Bu sekilde faj, B hücresinin bazi özelliklerini taklit eder. Faj gösterimi, incelenmek üzere çesitli formatlarda gerçeklestirilebilir, bakiniz örnek olarak, Johnson and Chiswell, Current Opiniion in Mevcut bulusun antikoru ve bunun parçalari tercihen, akcigerin bir insan primer yapiskan hücreli karsinomdan bir ham membran preparatina karsi yükseltilir. Ayni zamanda tercih edilen, RS7 antikoru ve bunun parçalari, bir insan yumurtalik karsinomu hücre hattindan canli hücrelerin zar hazirlanmasina karsi yükseltilmesidir. Yine tercih edilen, RS7 antijeninin canli Colo 316 hücreleri tarafindan saglanir. Ilgili bir damarda, RS7 antikoru, büyük ölçüde saf bir RS7 antijeni preparati kullanilarak elde edilebilir. Büyük ölçüde saf bir protein, dogada protein ile iliskili olan ve temel olarak kontamine edici hücresel bilesenleri içermeyen bir proteindir. Burada tarif edildigi sekli ile, "RS7 antikoru" terimi ayni zamanda kimerik, insan ve insanlastirilmis RS7 antikorlarini içerir. Kimerik, insanlastirilmis ve insan RS7 antikorlarinin hazirlanmasi Spesifik antijenlere karsi monoklonal antikorlar, teknikte uzman kisilerce bilinen metotlar ile elde edilebilir. Bakiniz, örnek olarak, Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), and Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN lMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2. (bundan sonra "Coligan" olarak anilacaktir). Kisaca, RS7 gibi RS7 antijen MAb'leri, farelerin RS7 antijeni içeren bir bilesim ile enjekte edilmesi, bir serum numunesinin kaldirilmasi sureti ile antikor üretiminin varliginin teyit edilmesi, B-Ienfositleri elde etmek için dalagin kaldirilmasi, hibridomlari elde etmek için B-lenfositlerinin miyelom hücreleri ile kaynatilmasi, hibridomlarin klonlanmasi, RS7 antijenlerine antikorlari üreten pozitif klonlarin seçilmesi, RS? antijenine antikorlari üreten klonlarin kültürlenmesi, ve RS7 antikorlarinin hibridom kültürlerinden izole edilmesi yolu ile elde edilebilir. Antikorlarin immünojene birinci yükseltilmesinden sonra, antikorlar sekanslanabilir ve daha sonra rekombinant teknikler ile hazirlanabilir. Murin antikorlarinin ve antikor parçalarinin insanlastirilmasi ve kimeriklestirilmesi, teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinmektedir. Örnek olarak, insanlastirilmis monoklonal antikorlar, fare bütünleyicilik belirleme bölgelerinin, fare immüno globulinin agir ve hafif degisken zincirlerinden bir insan degisken etki alanina aktarilmasi ve daha sonra, murin karsitlarinin çerçeve bölgelerinde insan artiklarinin kullanilmasi ile üretilir. Insanlastirilmis monoklonal antikorlardan t'uretilen antikor bilesenlerinin kullanilmasi, murin sabit bölgelerinin immünojenikligi ile iliskili potansiyel problemleri önler. Insanlastirilmis, kimerik ya da insan RS7 antikorlari ile kombinasyon terapisi için mevcut bulusun bir insan antikoru, yani anti EGP-2, MUC1 ila 4 arasindakiler, CEA, CC49, CSAp, PSMA, EGFR, A33 ve HER2/neu MAb'Ieri gibi insan EGP-1 MAb'leri ya da öteki insan antikorlari bir transjenik insan olmayan hayvandan elde edilebilir. Patent No. 5,633,425Mevcut bulusa ait bir kombinasyon terapisi için kullanilabilecek bir insan antikoru ayni zamanda Le(y), Tn, Tag-72, AFP, HCG, HCG-beta, ferritin, PAP, EGP-2, histon, sitokeratin, Tenascin, CanAg, böbrek kanseri G 250, VGFR1, VGFR2 ya da bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilen bir antijen ile reaktif olabilir. Ornek olarak, bir insan antikoru, insan immünoglobulin lokuslarina sahip transgenik bir fareden geri kazanilabilir. Fare hümoral immün sistemi, endojen immünoglobulin genlerini etkisiz hale getirerek ve insan imm'unoglobulin lokuslarini sokmak sureti ile insanlastirilir. Insan imm'unoglobulin lokuslari asiri derecede karmasiktir ve birlikte insan genomunun neredeyse % 0.2'sini kaplayan çok sayida ayrik bölüm içerir. Transjenik farelerin yeterli antikor repertuarlari üretebildiginden emin olmak için, fare genomuna büyük miktarda insan agir ve hafif zincir lokuslarinin sokulmasi gerekir. Bu, germ hatti konfigürasyonunda insan agir ya da hafif zincir immüno glob'ulin lokuslarini içeren maya yapay kromozomlarinin (YAC'Ier) olusumu ile baslayan asamali bir islemde gerçeklestirilir. Her bir ek parçanin boyutu yaklasik 1 Mb oldugundan YAC yapisi, imm'unoglobulin lokuslarinin üstüste binen parçalarinin homolog rekombinasyonunu gerektirir. Biri agir zincir lokuslarini içeren ve hafif zincir lokuslarini içeren iki YAC, farelere, embriyonik kök h'ücreli YAC içeren maya sferoblastlarinin füzyonu yolu ile ayri ayri sokulur. Embriyonik kök hücre klonlari daha sonra fare blastosistlerine mikro enjekte edilir. Elde edilen kimerik erkekler, YAC'yi germ hatlari boyunca aktarabilmeleri için taranir ve murin antikoru üretiminde yetersiz fareler ile yetistirilir. Biri insan agir zincir lokuslarini içeren ve digeri insan hafif zincir lokuslarini içeren iki transjenik susu yetistirmek, imm'unizasyona yanit olarak insan antikorlari üreten soy olusturur. Murin immüno glob'ulin degisken etki alanlarini klonlamak için genel teknikler, örnek tarif edilmistir. Insanlastirilmis MAb üretmek için teknikler, 'örnek olarak, Carteret al., Genel olarak, RS7 antikorlari için VK (degisken hafif zincir) ve % (degisken agir zincir) sekanslari, RT-PCR, 5'-RACE ve cDNA kütüphane taramasi gibi çesitli moleküler klonlama prosedürleri ile elde edilebilir. Spesifik olarak, MAb RSY'nin VH ve VK genleri, sirasi ile RT-PCR ve 5' RACE ile hibridom hücrelerinden PCR yükseltilmesi ile klonlanmistir ve bunlarin sekanslari, DNA sekanslamasi ile belirlenmistir. Gerçekligini teyit etmek için, klonlanmis VL ve VH genleri, hücre tarif edildigi gibi kimerik bir Ab olarak eksprese edilebilir. V gen sekanslarina dayanarak, insanlastirilmis bir RS? antikoru, Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995)) tarafindan tarif edildigi gibi tasarlanabilir ve olusturulabilir. cDNA, genel moleküler klonlama teknikleri ile bir murin ya da kimerik RS7 antikoru üreten herhangi bir hibridom hattindan ya da transfekte edilmis hücre hattindan hazirlanabilir (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Iaboratory manual, 2nd Ed(1989)). Tercih edilen bir yapilanmada, RS? hibridom hatti kullanilir. MAb için V sekansi VK1BACK ve VK1 FOR primerleri (Orlandi et al., 1989) ya da Leung et al. (BioTechniques, 15: 286 (1993)) tarafindan tarif edilen genisletilmis primer seti kullanilarak büyütülebilirken, VH sekanslari VH1BACK/ VH1FOR primer çifti tarafindan tarif edilen murin IgG'sinin sabit bölgelerine tavlanan primerler kullanilarak (Perkin Elmer Cetus, Non/valk, CT) 10 ml'sini, her bir dNTP'nin 250 uM'ini, primerlerin birimini içeren PCR reaksiyon karisimlari PCR'nin 30 döngüsüne maruz kalabilirler. Her bir PCR döngüsü tercihen 94 °C'de 1 dakika denatürasyon, 50 °C'de 1 .5 dakika tavlama ve 72 °C'de 1.5 dakika polimerizasyondan olusur. Yükseltilmis Vi< ve VH parçalari % 2 agaroz (BioRad, Richmond, CA) üzerinde saflastirilabilir. Benzer sekilde, insanlastirilmis V oligo nükleotit sablonu sentezleri ve PCR yükseltilmesinin bir kombinasyonu ile olusturulabilir. Vi< için PCR ürünleri, pBR327 bazli bir hazirlama vektörü, VKpBR gibi bir hazirlama vektörüne alt klonlanabilir, VK için PCR ürünleri, bir pBR327 tabanli evreleme vektörünün VK PCR ürünlerinin çerçeve içi Iigasyonunu kolaylastirmak için bir lg baslatici, bir sinyal peptidi sekansi ve uygun kisitlama bölgeleri içerecegi sekilde bir evreleme vektörüne alt klonlanabilir. VH için PCR ürünleri, pBluescript tabanli VHpBS gibi benzer bir evreleme vektörüne alt klonlanabilir. Ilgili PCR ürünlerini içeren tekli klonlar, örnek olarak Sanger et al. Burada tarif edilen DNA sekanslari, dogal olarak meydana gelen ya da indüklenen olsunlar, tüm aleller, mutantlar ve varyantlari içerecek sekilde alinmalidir. VK ve VH içeren ekspresyon kasetleri, baslatici ve sinyal peptit sekanslari ile birlikte, HindIIl-BamHl parçalari olarak çift kisitlama sindirimi ile sirasi ile VKpBR ve VHpBS'den çikarilabilir. Vi< ve VH ekspresyon kasetleri daha sonra sirasi ile pKh ve pG1g gibi uygun ekspresyon vektörlerine baglanabilir (Leung et al., Hybridoma, miyolom Sp gibi bir uygun hücrenin, higromisin direnci için seçilmis olan kolonilerin ve örnek olarak bir ELISA deneyi tarafindan bir kimerik ya da insanlastirilmis RS? MAb üretimi için izlenmekte olan süpernatant sivilarin için ortak transfekte edilebilir. Alternatif olarak, VK ve VH ekspresyon kasetleri, VKpBR2 ve VHpBSZ modifiye edilmis bölümleme vektörleri içinde Sp2/O-Ag14 hücreleri içindeki ekspresyon için sirasi ile Xbal/BamHl ve XhoI/BamHl parçalari olarak kesip alinmis vektörünün içine alt klonlanmis sekilde monte edilebilirler. Bu, bulusta yararli olan bir tercihen NSO hücre hatti ve CHO hücrelerinde eksprese edilen GS vektörüdür. Diger uygun memeli ekspresyon sistemleri, Werner et al., Arzneim-Forsch./Drug Res. ELISA tarafindan antikor salgilayan klonlar için oitak transfeksiyon ve tahlil, asagidaki sekilde gerçeklestirilebilir. VKpKh'in (hafif zincir ekspresyon vektörü) yaklasik olarak 10 mg'si ve VHpG1g'nin (agir zincir ekspresyon vektörü) 20 ug'si, C0 SP2/O miyelom hücrelerinin transfekte edilmesi için kullanilabilir. Transfeksiyondan sonra, hücreler, 37 °C, % 5 C0 2'de tam HSFM ortami (Life Technologies, Inc., Grand son 500 birim/ml higromisin konsantrasyonunda higromisin seçim ortami (Calbiochem, San Diego, CA) ilavesi ile iki gün sonra baslatilabilir. Koloniler tipik olarak elektroporasyondan 2 ila 3 hafta sonra ortaya çikar. Kültürler daha sonra analiz için genisletilebilir. Uygun konak hücreler arasinda mikrobiyal ya da memeli konakçi hücreleri bulunur. Tercih edilen bir konakçi, MAb'Ier ve diger füzyon proteinleri üretimi için gelistirilen insan hücre çizgisi PER.CG'dir. Buna göre, bu bulusun tercih edilen bir yapilanmasi, bir DNA sekansini kodlayan ve anti EGP-1 MAb, konjugat, füzyon proteini ya da bunlarin parçalarini içeren bir konakçi hücredir.PER.C6 hücreleri (WO 97/00326), insan fosfogliserat kinazi (PGK) baslaticisi kontrolü altinda Adserotip 5 (Ad5) E1A ve E1B kodlayan sekanslari (Ad5 nükleotitleri 459 ila 3510 arasindakiler) kontrol eden bir plazmid kullanilarak birincil insan embriyonik retina hücrelerinin transfeksiyonu ile üretilmistir. EIA ve EIB, sirasi ile adenovirüs erken gen aktivasyon proteini 1A ve 18'dir. Metotlar ve bilesimler, translasyon sonrasi olarak, 'örnek olarak glikosilasyon yolu ile modifiye edilen ilgilenilen insan rekombinant proteinlerinin stabil ekspresyonunu olusturmak için Özellikle faydalidir. Birçok özellik PER.CG'yi, PER.Cö gibi rekombinant protein üretimi için bir konakçi olarak özellikle faydali kilar, örnek olarak tamamen karakterize edilmis bir insan hücre hattidir ve iyi laboratuvar uygulamalarina uygun olarak gelistirilmistir. Ayrica PER.Cö, insan ya da hayvan kaynakli proteinlerden yoksun tanimlanmis serumsuz ortamda tanimlanmis bir kültür olarak yetistirilebilir ve büyümesi, silindir siseleri, çalkalayici siseler, toplayici siseler ve yaklasik olarak 35 saat iki katina çikarma süresine sahip olan biyolojik reaktörler ile uyumludur. Son olarak, E1A'nin varligi, CMV arttiricisinin/ baslaticisinin kontrolü altinda olan genlerin ekspresyonunun yukari dogru düzenlenmesine neden olur ve E13'ün varligi, rekombinant transjenin ekspresyonu üzerinde muhtemelen p53'e bagli apoptozun önlenmesini önler. Bir yapilanmada, hücre, geleneksel memeli hücre hatlarindan 2 ila 200 kat daha fazla rekombinant protein ve/ veya proteinli madde üretme yetenegine sahiptir. Kimerik ya da insanlastirilmis agir zincirin salgilanmasi için pozitif olan transfektom klonlari ELISA deneyi ile tanimlanabilir. Kisaca, transfektom kültürlerinden süpernatant numuneleri (~ -lgG, F (ab')2 parçasina özgü antikor ile (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) önceden kaplanmis ELlSA mikrotitre plakalarina ilave edilir. Plakalar 1 saat oda sicakliginda inkübe edilmistir. Baglanmamis proteinler, üç kez yikama tamponu (% ile yikanarak uzaklastirilir. Yaban turpu peroksidazi (HRP) konjuge edilmis GAHlgG, Fc parçasina özgü antikorlar (Jackson lmmunoResearch) kuyucuklara eklenir (konjuge edilmemis antikor ile 1.0 pg/ml'lik bir nihai konsantrasyona eklenmis 100 pl seyreltilmis antikor stoku x 104). 1 saatlik bir inkübasyonun ardindan, plakalar tipik olarak üç kez yikanir. Bir reaksiyon çözeltisi hidrojen peroksit içeren 100 pl] kuyucuklara ilave edilir.Rengin karanlikta 30 dakika süre ile gelismesine izin verilir. Reaksiyon, otomatik bir ELISA okuyucusunda (Bio- Tek Instruments, Winooski, VT) 490 nm'de absorbansi ölçmeden önce her bir kuyucuga 50 pl 4 N HC1 çözeltisi ilave edilerek durdurulur. Bagli kimerik antikorlar, alakasiz bir kimerik antikor standardina göre (Scotgen, Ltd., Edinburg, Iskoçya'dan temin edilebilir) göre belirlenir. Antikorlar, asagidaki gibi hücre kültürü ortamindan izole edilebilir. Transfektom kültürleri serumsuz ortama adapte edilmistir. Kimerik antikorun üretilmesi için hücreler, HSFM kullanilarak silindir siselerde 500 ml'lik bir kültür olarak büyütülür. Kültürler santrifüjlenir ve süpernatant 0.2 u'lik membrandan süzülür. Filtrelenen ortam, 1 mI/dak akis hizinda bir protein A kolonundan (1 x 3 cm) geçirilir. Reçine daha sonra yaklasik 10 sütun hacim PBS ile yikanir ve protein A'ya bagli antikor, 10 mM EDTA içeren 0.1 M glisin tamponu (pH 3.5) ile kolondan ayristirilir.1.0 ml'nin belirlenmis olan protein konsantrasyonlari içeren tüpler için toplanir. Pik fraksiyonlar toplanir, PBS'ye karsi diyaliz edilir ve, örnek olarak Centricon 30 (Amicon, Beverly, MA) ile antikor konsantre edilir. Antikor konsantrasyonu, daha önce oldugu gibi ELISA ile belirlenir ve konsantrasyonu, PBS kullanilarak yaklasik 1 mg/ml'ye ayarlanir. Sodyum azit, % 0.01 (agirlik/hacim), koruyucu olarak numuneye uygun bir sekilde ilave edilir. RS? antikorlarini hazirlamak için kullanilan primerlerin nükleotit sekanslari, asagidaki antikoru ya da antikor parçasi, bir murin RS7 MAb'in bütünleyicilik belirleme bölgelerini (CDR'Ier) ve bir insan antikorunun hafif ve agir zincir degisken bölgelerinin çerçeve (FR) bölgelerini ve bir insan antikorunun hafif ve agir zincir sabit bölgelerini içermekte olup, içerisinde insanlastirilmis RS7 Mab'in hafif zincir degisken bölgelerinin CDR'leri, KASQDVSIAVA'nin bir amino asit sekansini içeren CDR1; SASYRYT'nin bir amino asit sekansini içeren CDR2; QQHYITPLT'nin bir amino asit sekansini içeren CDR3 içerir; ve insanlastirilmis RS7 MAb'nin agir zincir degisken bölgesinin CDR'leri, NYGMN'nin bir amino asit sekansini içeren CDR1; WlNTYTGEPTYTDDFKG'nin bir amino asit sekansini içeren CDR2 ve GGFGSSYWYFDV'nin bir amino asit sekansini içeren CDR3 içerir. Ayni zamanda tercih edilen, insanlastirilmis antikorun hafif ve agir zincir degisken bölgelerinin FR'lerinin, murin RS7 MAb'nin bahse konu karsilik gelen FR'lerinden ornatilmis olan en az bir amino asit içermesidir. RS7 MAb'Ier, çesitli iyi bilinen teknikler ile hibridom kültürlerinden izole edilebilir ve saflastirilabilir. Bu tür izolasyon teknikleri, Protein-A Sefaroz ile benzesim kromatografisini, boyut dislama kromatografisini ve iyon degisim kromatografisini ila 2.9.3 arasi. Ayni zamanda bakiniz, Baines et al., "Purification of lmmunoglobulin G (IgG)," in METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, lnc. 1992). RS7 MAb'Ier, teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinen çesitli teknikler ile karakterize edilebilir. Ornek olarak, bir RS7 MAb'nin RS7 antijenine baglanma yetenegi, dolayli bir immüno floresan deneyi, akis sitometri analizi ya da Western analizi kullanilarak dogrulanabilir. RS? Antikor Parçalarinin Uretimi Mevcut bulus, RS7 ve hRS7 antikorlarinin parçalarinin kullanimini tasarlar. Spesifik epitoplari taniyan antikor parçalari bilinen teknikler ile üretilebilir. Antikor parçalari, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, st ve benzeri gibi bir antikorun antijen baglama kisimlaridir. Diger antikor parçalari, bunlarla sinirli olmamakla birlikte sunlari içerir: antikor molekülünün pepsin sindirimi sureti ile üretilebilecek olan F(ab)'2 parçalari ve F(ab)'2 parçalarinin dis'ulf'L'ir köprülerinin indirgenmesi sureti ile üretilebilecek olan Fab' parçalari. Bu metotlar örnek olarak, Goldenberg, U.S. patent No'lari. 4,036,945 and 4,331,647 ve bunlarda içerilen referanslar tarafindan tarif edilmistir. Ayni zamanda, bakiniz, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 2.10.4.4 arasi. Mevcut bulus, antikorlari ve antikor parçalarini kapsar. Tek Zincirli bir Fv molekülü (scFv) bir VL etki alani ve bir VH etki alani içerir. VL ve VH etki alanlari bir hedef baglama bölgesi olusturmak için birlesir. Bu iki etki alan bir peptit baglayicisi (L) tarafindan ayrica kovalent olarak baglanir. Bir scFv molekülü, eger VL etki alani, scFv molekülünün N-terminal kismi ise VL-L-VH olarak ya da eger VH etki alani, scFv molekülünün N-terminal kismi ise VH-L-VL olarak belirtilir. scFv molekülleri yapmak ve uygun peptit baglayicilari dizayn etmek için metotlar US Chain Fvs." FASEB Vol 9:73-80 (1995) ve R.E. Bird and B.W. Walker, "Single Chain Bir antikor parçasi, tam uzunluktaki antikorun proteolitik hidrolizi ile ya da E. coli ya da parça için DNA kodlamasinin bir baska konakçisi içerisinde ekspresyon ile hazirlanabilir. Bir antikor parçasi, geleneksel metotlar ile pepsin ya da tam uzunluktaki antikorlarin papain sindirimi ile elde edilebilir. Ornek olarak, bir antikor fragmani, F(ab')2 ile belirtilen bir 58 fragmani saglamak için pepsin ile antikorlarin enzimatik bölünmesi ile üretilebilir. Bu fragman, 3.58 Fab` tek degerlikli parçalari üretmek için disülfür baglantilarinin bölünmesinden kaynaklanan sülfhidril gruplari için istege bagli olarak bir tiyol indirgeme maddesi ve istege bagli olarak bir bloke edici grup kullanilarak ayrilabilir. Alternatif olarak, papain kullanan bir enzimatik bölünme, dogrudan iki tek degerlikli Fab parçasi ve bir PC parçasi üretir. Bu metotlar içerilen referanslar tarafindan tarif edilmistir. Ayni zamanda, bakiniz, Nisonoff et al., et al., in METHODS IN ENZYMOLOGYVOL. 1, page , ve Bir antikor parçasinin bir baska formu, tek bir bütünleyicilik belirleme bölgesi (CDR) Için kodlama yapan bir peptittir. Bir CDR, antikorun baglandigi ve degisken bölgenin geri kalanindan daha degisken oldugu epitopa yapida bütünleyici olan bir antikorun degisken bölgesinin bir bölümüdür. Buna göre, bir CDR bazen hiperdegisken bölge olarak adlandirilir. Degisken bir bölge üç CDR içerir. CDR peptitleri, ilgilenilen bir antikorun CDR'sini kodlayan genlerin olusturulmasi sureti ile elde edilebilir. Bu tür genler, örnek olarak degisken bölgeyi antikor üreten hücrelerin RNA'sindan sentezlemek için polimeraz zincir reaksiyonu kullanilarak hazirlanir. Bakiniz, 'örnek olarak, Larrick et aIMethods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODlES: PRODUCTlON, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995); ve Ward et al., "Genetic Manipulationand Expression of Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATlONS, Birch et al., (eds.), pages . Tek degerlikli hafif-agir zincir parçalari olusturmak için agir zincirlerin ayrilmasi, parçalarin daha fazla bölünmesi ya da diger enzimatik, kimyasal ya da genetik teknikler gibi diger parça temizleme metotlari da, parçalar bozulmamis antikor tarafindan taninan antijene baglandigi sürece kullanilabilir. Kimerik, insanlastirilmis ve insan RS7 antikor füzyon proteinlerinin üretimi Antikor füzyon proteinleri ve bunlarin parçalari, glutaraldehit baglantidan fonksiyonel gruplar arasinda daha spesifik baglantilara kadar çesitli geleneksel prosedürler ile hazirlanabilir. Antikorlar ve/ veya antikor parçalari, dogrudan ya da bir baglayici kisim vasitasi ile, antikor ya da parça üzerindeki bir ya da daha fazla fonksiyonel grup, örnek olarak, amin, karboksil, fenil, tiyol ya da hidroksil gruplari araciligi ile birbirine kovalent olarak baglanir. Glutaraldehite ilaveten çesitli geleneksel baglayicilar, 'Örnek olarak, disiyosiyanatlar, diosotiyosiyanatlar, bis(hidroksisüksinimit) esterler, karbodiimitler, maleimidhidroksisüksinimit esterler ve benzeri kullanilabilir. Kimerik, insanlastirilmis ve insan RS? antikor füzyon proteinleri üretmek için basit bir metot, bir antikor füzyon proteini olusturmak için antikorlari ya da parçalari glutaraldehit varliginda karistirmaktir. Ilk Schiff baz baglantilari, 'örnek olarak sekonder aminlere borhidrür indirgemesi ile stabilize edilebilir. B'olgeye özgü olmayan bir baglayici olarak glutaraldehit yerine bir diosotiyosiyanat ya da karbodiimit kullanilabilir. Antikor füzyon proteinlerinin MAb'lerden daha büyük bir baglanma spesifitesine sahip olmasi beklenir, çünkü füzyon proteinleri RS?' antijeninin en az iki epitopuna baglanan kisimlari içerir. Dolayisiyla, antikor füzyon proteinleri, tedavi için tercih edilen RS7 antijen baglayici proteinidir. Mevcut baglamda, bir antikor füzyon proteini, en az iki kimerik, insanlastirilmis ya da insan RS7 MAb ya da bunlarin parçalarini içermekte olup, içerisinde MAb ya da parçalardan en az ikisi, RST antijenin iki farkli epitopuna ya da bir R87 epitopuna ve tamamen farkli antijeninkine karsi baglanir. Ornek olarak, bispesifik bir RS? antikor füzyon proteini, bir CEA antikoru ya da bunun bir parçasini ve RS7 MAb ya da bunun bir parçasini içerebilir. Böyle bir bispesifik RS? antikor füzyon proteini, örnek olarak yukarida tarif edildigi gibi CEA'dan bir F(ab')2 parçasi elde edilmek sureti ile hazirlanabilir. Antikor F(ab')2 parçasinin zincirler arasi disülfür köprüleri, Fab'-SH parçalari olusturmak Için hafif zincir baglantilarini önlemeye özen göstererek sistein ile yavasça azaltilir.SH grubu (gruplari) fazla miktarda bis-malemit baglayici (1,1'- (metilendi-4,1-fenilen) bis-malemit) ile aktive edilir. RS? MAb, Fab'-SH'ye dönüstürülür ve daha sonra bispesifik bir RS? antikor füzyon proteini elde etmek için aktif CEA Fab'-SH parçasi ile reaksiyona sokulur. Bir bispesifik kimerik, insanlastirilmis ya da insan RS? antikor füzyon proteinine RS? antijen baglama kisimlari eklenerek polispesifik bir RS? antikor füzyon proteini elde edilebilir. Ornek olarak, bir bispesifik antikor füzyon proteini, bispesifik füzyon proteininin yukarida tarif edilen bis-maleimit aktivasyon prosedürünü kullanarak üçüncü bir RS7 antijen MAb ya da parçasina birlestirilmesinde kullanilmak üzere bir ya da daha fazla sülfhidril grubunu vermek üzere 2-iminotiy0l ile reaksiyona sokulabilir. Antikor kompozitleri üretmek için bu teknikler teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinmektedir. Bakiniz, örnek olarak, U.S. Patent No. 4,925,648. Bispesifik antikorlar, çesitli geleneksel metotlar ile, örnek olarak disülfit parçalanmasi ve tam lgG, ya da tercihen F(ab')2 parçalarinin karisimlarinin yeniden düzenlenmesi, birden dazla spesifiklige sahip olan antikorlari üreten polyomlarin olusturulmasi için birden fazla hibridomlarin füzyonu yolu ile ve genetik mühendisligi vasitasi ile yapilabilir. Bispesifik antikor füzyon proteinleri, farkli antikorlarin indirgeyici bölünmesinden kaynaklanan Fab' parçalarinin oksidatif bölünmesi ile hazirlanmistir. Bu, avantajli bir sekilde, iki farkli antikorun pepsin sindirimi ile üretilmis olan iki farkli F(ab')2 parçalarin karistirilmasi, Fab' parçalarinin bir karisimini olusturmak için indirgeyici bölünme, ardindan orijinal epitoplarin her birine spesifik olan bir Fab' kismini içeren bispesifik antikor füzyon proteinlerini içeren F(ab') parçalarinin bir karisimini üretmek için disülfür baglantilarinin oksidatif yeniden olusturulmasi ile gerçeklestirilir. Antikor füzyon proteinlerinin hazirlanmasinin genel teknikleri, örnek olarak, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961), H'ammerling et al., J. bulusta tasarlanan, mevcut bulusun anti EGP-1 MAb'Ierinden ya da bunlarin parçalarindan farkli olan en az bir birinci anti EGP-1 MAb ya da bunun parçasini ve en az bir ikinci MAb ya da bunun parçasini içeren bir antikor füzyon proteini ya da bunun parçasidir. Maleimidehidroksi süksinimit ester gibi bir hetero bifonksiyonel baglayici kullanarak daha seçici baglanti elde edilebilir. Esterin bir antikor ya da parça ile reaksiyonu, antikor ya da parçadaki amin gruplarini türetir ve türev, daha sonra, örnek olarak serbest sülfhidril gruplarina sahip olan antikor Fab parçasi (ya da, örnek olarak Traut Ayiraci ile buraya sokulmus olan sülfhidril gruplarina sahip olan daha büyük bir parça ya da intakt antikor) ile reaksiyona girebilir. Böyle bir baglayici, ayni antikordaki gruplari çapraz baglamak için daha az olasidir ve baglantinin seçiciligini arttirir. Antikorlari ya da parçalari antijen baglama bölgelerinden uzak bölgelerde baglamak avantajlidir. Bu, örnek olarak yukarida belirtildigi gibi bölünmüs zincirler arasi sülfhidril gruplarina baglanma ile gerçeklestirilebilir. Bir baska metot, bir oksitlenmis karbonhidrat kismina sahip bir antikorun, en az bir serbest amin fonksiyonuna sahip olan bir baska antikor ile reaksiyonunu içerir. Bu, nihai bilesigi olusturmak üzere tercihen ikincil bir amine Indirgeme, örnek olarak borhidrür indirgeme ile stabilize edilen bir baslangiç Schiff bazi (mime) baglantisi ile sonuçlanir. Bu bölgeye özgü baglantilar, küçük moleküller için, U.S. Patent No. 4,671 ,958'de ve daha büyük ekler için U.S. Patent No. 4,699,784'te açiklanmaktadir. Uzunlugunda 12 amino asit artigindan daha büyük baglayicilara sahip olan ScFv'Ier (örnek olarak, 15- ya da 18-artik baglayicilari), ayni zincir üzerindeki VH ve VL etki alanlarinin arasinda etkilesime izin verir ve genellikle monomerlerin, dimerlerin (diyakorlar olarak terimlenir) ve daha yüksek agirlikli multimerlerin küçük 157). Bununla birlikte, 5 ya da daha az amino asit artigi olan baglayicilara sahip ScFv'Ier, ayni zincirdeki VH ve VL etki alanlarinin intramoleküler eslesmesini yasaklar ve farkli bir zincirde VH ve VL etki alanlari ile eslesmeyi zorlar. 3- ve 12-artik arasindaki baglayicilar agirlikli olarak dimerler olusturur (Atwell et al., Protein (trikorlar olarak terimlenir), tetramerik (tetrakorlar olarak terimlenir) ya da scFv'Ierin daha yüksek oligomerik yapilari olusturulur; bununla birlikte, oligomerizasyonun kesin modellerinin, baglayici uzunluguna ek olarak, bilesimin yani sira V-etki alanlarinin oryantasyonuna da bagli oldugu görülmektedir. Ornek olarak, anti neuraminidaz antikoru NC10'un scFv'leri, agirlikli olarak O-artik baglayicilari (Dolezal et al., tetramerleri (VL ila VH oryantasyonu) olusturmustur. 1- ve 2-artik baglayicilarina sahip NC10'den olusturulmus olan scFv'Ier için, VH ila VL oryantasyonu agirlikli olarak bunun aksine, VL ila VH oryantasyonlari tetramerlerin, dimerlerin, ve daha büyük agirliktaki multimerlerin bir karisimini olusturmustur (Dolezal et al., Protein HD37'den olusturulan scFv'Ier için, O-artik baglayici, sadece trimerler olusturmustur ve 1-artik baglayici, sadece tetramerler olusturmustur (Le Gall et al., FEBS Letters Mevcut bulusun RS7 antikorlari ve bunlarin parçalari ayni zamanda, çok degerlikli ancak monospesifik olan antijene spesifik diyakorlari, trikorlari ve tetrakorlari 'üretmek için de kullanilabilir. Iki ya da daha fazla scFv molekül'ün'ün kovalent olmayan birlesmesi, fonksiyonel diyakorlari, trikorlari ve tetrakorlari olusturabilir. Monospesifik diyakorlar, ayni scFv'nin homodimerleridir; burada, her scFv, ayni antikorun VL etki alanina kisa bir baglayici ile baglanan seçilen antikordan VH etki alanini içerir. Bir diyakor, iki scFv'nin kovalent olmayan birlesmesi tarafindan olusturulan, iki Fv baglanma bölgesi veren iki degerlikli bir dimerdir. Bir trikor üç scFv degerinde üç degerlikli bir trimerin olusturulmasindan kaynaklanir, üç baglama bölgesini verir ve bir tetrakor dört scFv degerinde bir tetravalent tetramerdir ve dört baglama bölgesine neden 0Iur.VH1-baglayici-VL1 içeren bir rekombinant gen yapisi içeren bir ekspresyon vektöriLi kullanilarak birkaç monospesifik diyakor yapilmistir. Bakiniz, edilen bir yapilanmasi, bir EGP-1 hedef antijene karsi benzesime sahip bir ya da daha fazla antijen baglama bölgesini ve hapten moleküllerine karsi benzesime sahip bir ya da daha fazla hapten baglama bölgesini içeren çok degerlikli, çoklu spesifik bir antikor ya da bunun parçasidir. Antikor baglama benzesiminin belirlenmesi Bu sekilde izole edilen mRS7, cRS7 ve hRS7 antikorlarinin karsilastirmali baglanma benzesimleri dogrudan radyo immüno deney vasitasi ile belirlenebilir. RS?, kloramin- T metodu kullanilarak 131l ya da 125I ile etiketlenebilir (bakiniz, örnek olarak spesifik aktivitesi tipik olarak yaklasik olarak 10 uCi/pg'ye ayarlanmistir. Etiketlenmemis ve etiketli antikorlar, reaksiyon ortami kullanilarak uygun konsantrasyonlarda seyreltilir (HSFM, % 1 at serumu ve 100 tig/ml gentamisin ile desteklenmistir). Hem etiketli hem de etiketsiz antikorlarin uygun konsantrasyonlari, toplam 100 ul hacimli reaksiyon tüplerine eklenir. ME180 hücrelerinin bir kültürü (bir insan servikal karsinom hücre hatti) örneklenir ve hücre konsantrasyonu belirlenir. Kültür santrifüj edilir ve toplanan hücreler bir kez reaksiyon ortaminda yikandiktan sonra reaksiyon ortaminda tekrar 107 hücre/ml nihai konsantrasyona kadar tekrar süspansiyon haline getirilmistir. Tüm islemler sogukta 4 °C'de gerçekle stirilir. Hücre süspansiyonu, 100 pl, reaksiyon tüplerine ilave edilir. Reaksiyon, hücreleri yeniden süspanse etmek için reaksiyon tüplerinin periyodik olarak hafifçe çalkalanmasiyla 4 cC'de 2 saat boyunca gerçekle stirilir. Reaksiyon süresinin ardindan, her tüpe 5 ml yikama tamponu (% 1 BSA içeren PBS) eklenir. Süspansiyon santrifüjlenir ve hücre topagi ikinci bir kez baska bir 5 ml yikama tamponu ile yikanir. Santrifüjlemenin ardindan, hücre topaginda kalan radyoaktivite miktari bir gama sayacinda belirlenir (Minaxi, Packard Instruments, Sterling, Va). Ekspresyon vektörleri Bir ekspresyon vektörü, bir konakçi hücrede eksprese edilen bir geni içeren bir DNA molekülüdür. Tipik olarak, gen ekspresyonu, kurucu ya da uyarilabilir baslaticilar, dokuya özgü düzenleyici ögeler ve arttiricilari içeren belirli düzenleyici ögelerin kontrolü altina yerlestirilir. Böyle bir genin düzenleyici ögelerine "islevsel olarak bagli" oldugu söylenir. Bir baslatici, yapisal bir genin transkripsiyonunu yönlendiren bir DNA sekansidir. Yapisal bir gen, daha sonra spesifik bir polipeptidin karakteristik bir amino asit sekansina çevrilen, haberci RNA'ya (mRNA) kopyalanan bir DNA sekansidir. Tipik olarak, bir baslatici, bir genin 5' bölgesinde, yapisal bir genin transkripsiyonel baslangiç bölgesine yakin bir yerde bulunur. Bir baslatici indüklenebilir bir baslatici ise, transkripsiyon hizi bir indükleyici maddeye yanit olarak artar. Buna karsilik, eger baslatici bir yapisal baslatici ise, transkripsiyon hizi bir uyarici madde tarafindan düzenlenmez. Bir gelistirici, gelistiricinin, transkripsiyonun baslangiç alanina göre mesafesi ya da oryantasyonuna bakilmaksizin, transkripsiyonun etkinligini artirabilen bir DNA düzenleyici ogedir. Bir izole edilmis DNA molekülü, bir organizmanin genomik DNA'sina entegre olmayan bir DNA parçasidir. Ornek olarak, klonlanmis bir RS7 antijen geni, bir memeli hücresinin genomik DNA'sindan ayrilmis bir DNA parçasidir. Bir izole edilmis DNA molekülünün bir baska Örnegi, bir organizmanin genomik DNA'sina entegre olmayan kimyasal olarak sentezlenmis bir DNA molekülüdür. Bütünleyici DNA (cDNA), enzim ters transkriptaz tarafindan bir mRNA sablonundan olusturulan tek sarmalli bir DNA molekülüdür. Tipik olarak, ters transkripsiyonun baslatilmasi için mRNA'nin bölümlerine bir bütünleyici primer kullanilir. Teknikte uzman kisiler ayni zamanda, böyle bir tek sarmalli DNA molekülünden ve onun tamamlayici DNA sarmalindan olusan bir çift sarmalli DNA molekülüne atifta bulunmak için "cDNA" terimini de kullanirlar. Bir klonlama vektörü, bir konakçi hücrede özerk olarak çogaltma yetenegine sahip olan bir plazmid, kozmid ya da bakteriyofaj gibi bir DNA molekülüdür. Klonlama vektörleri tipik olarak, vektörün temel bir biyolojik fonksiyonunun kaybi olmadan belirlenebilir bir sekilde yabanci DNA sekanslarinin belirlenebilir bir sekilde sokulabildigi bir ya da az sayida kisitlama endonükleaz tanima bölgesinin yani sira klonlama vektörü ile dönüstürülmüs hücrelerin tanimlanmasi ve seçimi için uygun olan bir isaretleyici geni içerir. Isaretleyici genler tipik olarak tetrasiklin direnci ya da ampisilin direnci saglayan genleri içerir. Bir rekombinant konakçi, bir klonlama vektörü ya da ekspresyon vektörü içeren herhangi bir prokaryotik ya da okaryotik hücre olabilir. Bu terim ayni zamanda konakçi hücrenin kromozomunda ya da genomunda klonlanmis gen (genler) i içerecek sekilde genetik olarak tasarlanmis prokaryotik ya da ökaryotik hücreleri de içerir. Ekspresyon terimi, bir gen ürününün biyosentezini belirtir. Ornek olarak, yapisal bir gen söz konusu oldugunda, ekspresyon yapisal genin mRNA'ya transkripsiyonunu ve mRNA'nin bir ya da daha fazla polipeptide translasyonunu içerir. Insanlastirilmis, insan ve kimerik RS? antikorlari tedavi ve teshis amaçli kullanilir Istemlerde tarif edildigi sekli ile mevcut bulusta tasarlanan, denege bir EGP-1 MAb ya da bunun parçasini içeren terapötik konjugatin ya da bir antikor füzyon proteininin ya da bunun parçasinin terapötik olarak etkili bir miktarinin verilmesini içeren, bir denekteki bir malinitenin teshis edilmesinin ya da tedavi edilmesinin bir metodu olup, içerisinde EGP-1 MAb ya da bunun parçasi ya da antikor füzyon proteini ya da bunun parçasi en az bir terapötik maddeye baglanmis ve daha sonra bir farmasötik olarak uygun eksipiyan içinde formüle edilmistir. Ayni zamanda, konjuge olmayan (çiplak) bir EGP-1 MAb ya da diger antijen baglayici kisimlar ile füzyon yapisinin, EGP-1'i eksprese eden kanser hücreleri için bir terapötik olarak kullanilabilecegi de tasarlanmistir. Bu konjuge olmayan antikorlar, kemoterapi, radyoterapi ve/ veya immüno terapi gibi diger terapötik yöntemler ile kombinasyon halinde, birlikte ya da çesitli sekanslarda ve programlarda avantajli olarak verilebilir. Ayni zamanda tercih edilen, bir çoklu degerlikli, bir EGP-1 antijeni ya da bir yada daha fazla hapten baglama bölgesine karsi bir yada daha fazla antijen baglama bölgesine sahip olan çoklu spesifik antikor ya da bunun parçasinin buna ihtiyaci olan bir denege verilmesini, baglayici olmayan proteinin denegin kari akisini temizlemesi için yeterli bir miktarda s'üre beklemeyi; ve daha sonra denege çoklu degerlikli, çoklu spesifik antikor ya da bunun parçasinin baglama bölgesini baglayan bir tanilayici madde, bir terapötik madde, ya da bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir tasiyici molekülün verilmesini içerebilen, kanserin teshisi ya da tedavi edilmesi için bir metottur. Tercih edilen bir yapilanmada, kanser bir akciger, meme, bas ve boyun, yumurtalik, prostat, Monoklonal antikorlarin (MAb) üretimi için hibridom teknolojisi, kanser hücrelerinin yerini alabilen ya da bunlari öldürebilen moleküler problarin üretimi için bir metot saglamistir. Radyo etiketli MAb'Ieri kullanan tümör görüntüleme teknikleri, bir takim malinitelerde kanserli istilayi tasvir etmek için kullanilmistir. Deney hayvanlarinda ve insanlarda, karsinoembriyonik antijeni eksprese eden çesitli tümörlerde karsinoembriyonik antijenin radyo immüno deteksiyonu için antikorlar ve ayni zamanda diger hedef antikorlara sahip olan melanom, kolon karsinomu ve meme karsinomu gibi tümörler de kullanilmistir. Goldenberg et al., Cancer Res. 40: 2984 al., Lancet 2: 999 (1982). MAb'Ierin in vitro teshis için kullanimi iyi bilinmektedir. Bakiniz, örnek olarak Carlsson et al., Bio/Technology 7 (6):567 (1989).Ornek olarak MAb'ler, biyopsi örneklerinden dokuda tümör ile iliskili bir antijenin varligini tespit etmek için kullanilabilir. MAb'ler ayrica, radyo immüno assay, enzime bagli immünosorbent deneyi ve flüoresans immüno assay gibi teknikleri kullanarak klinik sivi numunelerinde tümör ile iliskili antijen miktarini ölçmek için kullanilabilir. Tümör hedefli MAb ve toksinlerin konjugatlari, in vivo olarak kanser hücrelerini seçici olarak öldürmek için kullanilabilir ((Spalding, Bio/Technology 9(8): 701 (1991); Goldenberg, Scientific American Science & Medicine 1(1): 64 (1994)). Ornek olarak, deneysel hayvan modellerinde yapilan terapötik çalismalar, sitotoksik radyo nüklitleri tasiyan antikorlarin anti tümör aktivitesini göstermistir.(Goldenberg et al., Cancer Senekowitsch et al., J. Nucl. Med. 30: 531 (1989)). Ayni zamanda, bakiniz, Stein et al., Antibody Immunoconj.Radiopharm.4:703 (1991). Ayrica, bu MAb'lerin bazilari ile Faz-l terapötik denemeleri, lenfoma, melanom ve diger malinitelerin tedavisi için baslatilmistir. Bakiniz, örnek olarak, DeNardo et al., lnt.J. Cancer Suppl. 3: 96 Insanlastirilmis, kimerik ve tamamen insan antikorlari ve bunlarin parçalari, terapötik metotlarda ve tanilayici metotlarda kullanim için uygundur. Buna göre, mevcut bulusta tasarlanan, (i) bir anti EGP-1 antikorunu içeren bir bilesimin saglanmasini ve (ii) buna ihtiyaci olan bir denege tanilayici ya da terapötik antikor konjugatinin verilmesini içeren, bir denege bir tanilayici ya da terapötik madde verilmesinin bir metodunda kullanimlaridir. Tercihen, istemlerde tanimlandigi gibi kimerik, insanlastirilmis ve tamamen insan RS7 antikorlari ve bunlarin parçalari, malinitelerin tedavisi için metotlarda kullanilir. Ayni zamanda burada tarif edilen, istemlerde açiklandigi sekilde kanser hücresine baglanan bir anti EGP-1 mAb ya da bunun parçasini ya da antikor füzyon proteini ya da bunun parçasini içeren bir antikor bileseni içeren, istemlerde açiklandigi sekilde tanilayici ya da terapötik konjugati hedefleyen bir kanser hücresi olup, içerisinde antikor bileseni en az bir tanilayici ya da en az bir terapötik maddeye baglidir. Tercihen, tanilayici konjugat en az bir foto aktif tanilayici madde ya da bir MRl kontrast maddesi içerir. Yine tercih edilen, tanilayici madde, 60 ila 4.000 keV arasinda bir enerjiye sahip radyoaktif bir etikettir. Tedavi için bilesimler, en az bir çiplak ya da konjuge edilmis insanlastirilmis, kimerik ya da insan RS? antikorunu tek basina, ya da baska çiplak ya da konjuge edilmis insanlastirilmis, kimerik, insan ya da istemlerde açiklandigi sekilde mevcut bulusun diger antikorlari, ya da burada açiklanmamis olan öteki çiplak ya da konjuge edilmis insanlastirilmis, kimerik ya da insan antikorlari ile kombinasyon halinde içerir. Istemlerde tanimlandigi sekilde mevcut bulus ayni zamanda bir konjuge edilmis ya da çiplak bir antikorun bir imm'uno modülatör gibi terapötik bir madde ile ya da anti EGP-1 antikoruna konjuge edilmeyen tanilayici bir madde ile uygulanmasini da kapsar. Ayni ya da farkli epitop ya da antijene yönelik çiplak ya da konjuge edilmis antikorlar, istemlerde tanimlandigi gibi mevcut bulusun antikorlarindan bir ya da daha Buna göre, istemlerde tanimlandigi sekilde mevcut bulus, tek basina anti EOP-1 antikorlarini ve bunlarin parçalarini, çiplak bir antikor ya da antikor parçasi olarak ya da multimodal bir terapi olarak tatbik etmeyi tasarlar. Tercihen, antikor insanlastirilmis, kimerik ya da tamamen insan RS? antikoru ya da bunun bir parçasidir. Istemlerde tanimlandigi sekilde mevcut bulusun multimodal terapileri ayrica çiplak antikorlar, füzyon proteinleri ya da immüno konjugatlar formunda baska antikorlarin uygulanmasi ile takviye edilmis bir çiplak anti EGP-1 antikoru ile immüno terapi içerir. Ornek olarak, bir insanlastirilmis, kimerik ya da tamamen insan RS? antikoru, bir baska çiplak insanlastirilmis, kimerik RS? ya da `öteki antikor ile, ya da bir insanlastirilmis, kimerik RS? ya da bir izotopa, bir ya da daha fazla kemoterapötik maddelere, sitokinlere, toksinlere ya da bunlarin bir kombinasyonuna konjuge edilmis olan bir baska antikor ile birlestirilebilir. Ornek olarak, istemlerde tanimlandigi sekilde mevcut bulus, bir çiplak ya da konjuge edilmis EGP-1 ya da RS? antikorunun ya da bunun parçasinin, anti EGP-2, CEA, CSAp, MUC1 ila 4 arasindakiler, EGRF, HER2/neu, PSA, CC49 (anti Tag 72 antikoru) ya da PSMA antikorlari gibi 'öteki kati tümör/ karsinom ile iliskili antikorlarin öncesinde, bununla kombinasyon halinde, ya da sonrasinda tedaviyi tasarlar. Bu kati tümör antikorlari, digerlerinin yani sira ilaçlar, enzimler, hormonlar, toksinler, izotoplar ya da imm'uno modülatörlere çiplak ya da konjuge edilmis olabilir. Ayni zamanda, Insanlastirilmis, kimerik ya da tamamen insan RS? antikorunun füzyon proteini ve bir toksin istemlerde tanimlandigi sekilde mevcut bulusta da kullanilabilir. Çiplak antikorlar ya da kismen çiplak ve kismen terapötik bir madde ya da immüno modülatör ile konjuge edilmis birçok farkli antikor kombinasyonu olusturulabilir. Alternatif olarak, farkli çiplak antikor kombinasyonlari sitotoksik ilaç gibi diger terapötik maddeler ile ya da radyasyon ile kombinasyon halinde uygulama için kullanilabilir. Bu tür antikorlarin kombinasyonlari, avantajli bir sekilde, teknikte bilindigi gibi antisens oligo nükleotitler ile yapilabilir. Bu haliyle, terapötik konjugatlar bir oligo nükleotit, özellikle de tercihen B hücresi malinitelerinin onkojenlerine ve onkojen ürünlerine karsi yönlendirilen bir antisens oligo nükleotitini içerebilir. Ornek olarak, U.S. 5,734,033'te (Reed) tarif edilen bol-2 ekspresyonunu inhibe eden antisens molekülleri ayni zamanda bir antikor füzyon proteininin terapötik madde kismini birlestirebilir ya da bunu olusturur ya da mevcut bulusun insanlastirilmis bir RS7 antikoru ile uygulanabilir. Burada tarif edilen, tanilayici ya da terapötik maddelere baglanmis olan monospesifik baglama proteinleri dogrudan RS7 pozitif tümörleri hedefler. Monospesifik moleküller, hedeflenmis olan antijenlere seçici olarak baglanir ve molekül üzerindeki baglama bölgelerinin sayisi arttikça, hedef hücre için benzesim artar ve istenen yerde daha uzun bir kalma süresi gözlenir. Ayrica, antijen bagli olmayan moleküller vücuttan hizli bir sekilde temizlenir ve normal dokulara maruz kalma en aza indirilir. Çoklu spesifik baglayici proteinlerin kullanimi, daha sonra spesifik tanilayici ya da terapötik maddelerin spesifik teslimi için RS7 pozitif tümörlerini daha önceden hedefler. Maddeler, histamin süksinil glisil (HSG) içeren peptitler ile tasinir.679 (bir lgGI, K) olarak adlandirilan murin monoklonal antikoru, tri-peptit kismi HSG'yi içeren moleküllere yüksek benzesim ile baglanir (Morel et al, Molecular immunology, 27, baglayici protein olusturabilir. Ayni zamanda, alternatif haptenler de kullanilabilir. Bu baglanma proteinleri seçici bir sekilde hedeflenen antijenlere baglanir ve artmis benzesim ve istenen yerde daha uzun bir kalma süresi saglar. Ayrica, antijen bagli olmayan diyakorlar vücuttan hizli bir sekilde temizlenir ve normal dokulara maruz kalma en aza indirilir. RS? antikorlari ve bunlarin parçalari, kanser gibi memeli hastaliklarini tedavi etmek için kullanilabilir. Kanser, bunlarla sinirli olmamak üzere, akciger, meme, mesane, yumurtalik prostat ve kolon kanserlerini içerir. Istemlerde tanimlandigi sekilde bulusa uygun teshis ya da tedavi amaçli bir hedefe tanilayici ya da terapötik bir madde verilmesi, anti EGP-1 antikoru ya da bunun parçalarini bir tanilayici ya da terapötik madde ile saglanmasini ve ihtiyaç duyan bir hastaya baglayici protein ile verilmesini içerir. Teshis ayrica, bagli proteinlerin bilinen teknikler ile tespit edilmesi adimini gerektirir. Mevcut bulusun antikorlarinin ve bunlarin parçalarinin tanilayici ya da terapötik maddeler ile uygulanmasi, bir memelide intravenöz, intraarteriyel, intraperitoneal, intramüsküler, subkütanöz, intraplevral, intratekal, bölgesel bir kateter yolu ile perfüzyon ya da dogrunda intralesiyonel enjeksiyon yolu ile gerçeklestirilebilir. Baglayici proteini enjeksiyon ile uygularken, uygulama sürekli infüzyon ile ya da tekli ya da çoklu boluslar ile olabilir. 20 ila 800 mg/m2 araligindaki dozlar, tercihen tedavi görüntüleme için önerilen orantili olarak daha düsük dozlar ile uygulanabilir. Bu gibi dozlar, klinik duruma ve hasta toleransina bagli olarak farkli frekanslarda tekrar edilebilir. Tanilayici ya da terapötik maddeye sahip olan antikor, farmasötik olarak kabul edilebilir bir enjeksiyon araci, fizyolojik pH ve konsantrasyonda tercihen fosfat tamponlu salin (PBS) içerisinde insan ya da memeli terapötik ve teshis amaçli kullanim için bir kit olarak saglanabilir. Preparat tercihen, özellikle eger insanlarda kullanilmasi amaçlanmis ise steril olacaktir. Bu tür kitlerin istege bagli bilesenleri arasinda stabilizatörler, tamponlar, etiketleme reaktifleri, radyoizotoplar, paramanyetik bilesikler, gelismis temizleme için ikinci antikor ve geleneksel siringalar, sütunlar, siseler ve benzerleri bulunur. ggiplak antikor tedavisi Istemde tanimlandigi sekilde çiplak kimerik, insanlastirilmis ve tamamen insan RS7 antikorlarinin ya da bunlarin parçalarinin terapötik olarak etkili bir miktari, farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyan içinde formüle edilebilir. Ayni zamanda, çiplak kimerik, insanlastirilmis ve tamamen insan RS? antikorlarinin etkinligi, bu çiplak antikorlarin, bir ya da daha fazla öteki çiplak antikor ile, bir ilaç, toksin, immüno modülatör, hormon, büyüme faktörü, enzim ya da terapötik radyo nüklitler gibi bir terapötik maddeye konjuge edilmis olan kimerik, insanlastirilmis ve tamamen insan RS7 antikorlarinin bir ya da daha fazla immüno konjugatlari ile, ya da bir ilaç, toksin, immüno modülatör, hormon, büyüme faktörü, enzim, oligo nükleotit, ya da terapötik nükleotiti içeren, RS7 antikorlari ya da bunlarin parçalari ile es zamanli olarak ya da sirali olarak ya da daha önceden belirlenmis olan bir doz ayarlama rejimine göre uygulanmis olan bir ya da daha fazla terapötik madde ile takviye edilmesi sureti ile gelistirilebilir. Tercih edilen bir yapilanmada, mevcut bulusun çiplak ya da konjuge edilmis olan RS? antikorlari, en az bir kanser ilaci ile birlestirilir. Bu tür bir kombinasyon terapisi, ilacin etkisini arttirabilir ya da ihtiyaç duyulan ilaç dozunu düsürebilir. Ornek olarak, iki gögüs kanseri hücre hatti için sirasi ile MDA468 ve T47D için belirlenmistir. Calu3 ve T47D hücreleri, bir EGP-1 antijeni için pozitif ve bir CEA antijeni için negatiftir ve MDA468, hem EGP-1 hem de CEA antijenleri için pozitiftir. Sonuçlar Dox-RS? için Bu nedenle, mevcut bulusun çiplak, insan, insanlastirilmis ya da kimerik bir anti EGP-1 antikoru ya da bunun bir parçasini, 2P-Dox gibi belirli bir ilaca birlestirmek, çoklu ilaç direnci üstesinden gelmeye yardimci olabilir. Bu ayni zamanda, antikor tarif edildigi gibi belirli bir ilaç ile kombinasyon halinde verildigi zaman da mümkündür. RS? immüno koniuqatlari Istemlerde tanimlandigi sekilde mevcut bulus ayni zamanda insanlastirilmis, kimerik ve insan RS? antikorlarinin ve bunlarin parçalarinin terapi için kullanimini da kapsar. Immüno terapinin amaci, hedef olmayan dokulara maruz kalmayi en aza indirirken hedef hücrelere sitotoksik dozlarda radyoaktivite, toksin, sitokin, enzim ya da hormon ya da ilaç sunmaktir. Mevcut bulusun RS? antijen baglayici proteinleri, akciger, meme, mesane, yumurtalik, uterus, mide ve prostat gibi çesitli tümörleri tedavi etmek için kullanilabilir. Mevcut bulusun antikorlarinin ya da antikor füzyon proteinlerinin ve bunlarin parçalarinin herhangi biri, bir ya da daha fazla terapötik ya da tanilayici madde ile konjuge edilebilir. Genel olarak, her bir antikor ya da antikor parçasina bir terapötik ya da tanilayici madde eklenir, ancak ayni antikor ya da antikor parçasina birden fazla terapötik madde ya da tanilayici madde de eklenebilir. Eger Fc bölgesi mevcut degil ise (örnek olarak, immüno konjugatin antikor bileseni olarak kullanilan antikor bir antikor parçasi oldugu zaman), tam uzunluktaki bir antikorun ya da antikor parçasinin hafif zincir degisken bölgesine bir karbonhidrat kismi sokmak mümkündür. karbonhidrat kismi, terapotik ya da tanilayici madde eklemek için kullanilir. Peptitlerin bir antikor karbonhidrat kismi vasitasi ile antikor bilesenlerine konjuge edilmesi için metotlar, teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinmektedir. Bakiniz, karbonhidrat bölümüne sahip olan bir antikor bileseninin, en az bir serbest amin fonksiyonuna sahip olan ve çok sayida peptit ile yüklenen bir tasiyici polimer ile reaksiyona sokulmasini içerir. Bu reaksiyon, nihai konjugati olusturmak için ikincil bir amine indirgeme ile stabilize edilebilen bir baslangiç Schiff bazi (imin) baglantisina yol açar. Ayrica, DTPA (Mx-DTPA gibi), DOTA, TETA ya da NOTA gibi bir selator antikora eklenebilir. Istemlerde tanimlandigi sekilde mevcut bulusun antikor füzyon proteinleri, iki ya da daha fazla antikor ya da bunlarin parçalarini içerir ve bu füzyon proteinini olusturan antikorlarin ya da parçalarin her biri, bir terap'otik madde ya da tanilayici madde içerebilir. Ek olarak, antikor füzyon proteininin bir ya da daha fazla antikoru ya da parçayi, ekli tanilayici maddenin birden fazla terapötigine sahip olabilir. Ayrica, terapotik maddelerin ayni olmasi gerekmez, ancak farkli terapotik maddeler olabilir; tanilayici maddeler ayni zamanda azaltilmis SH gruplarina ve karbonhidrat yan zincirlerine de baglanabilir. Çok çesitli tanilayici ve tedavi edici reaktifler, avantaj saglayan sekilde istemlerde tanimlandigi sekilde bulusun antikorlarina konjuge edilebilir. Burada belirtilen terapotik maddeler, yukarida tarif edildigi gibi çiplak antikor ile ayri olarak tatbik için de faydali olan maddelerdir. Terap'otik maddeler, örnek olarak, vinka alkoloidleri gibi kematerapötik ilaçlari, antrasiklinleri, epidofilotoksinleri, taksanlari, anti metabolitleri, alkilleyici maddeleri, antibiyotikleri, ornatilmis üreyi, enzimleri, Cox-2 inhibitörlerini, anti mitotikleri, anti anjiyojenik ve apoptotoik maddeleri, özellikle doksorubisini, doksorubisin analoglarini, metotreksati, taksolü, CPT-11'i, kamptotesanlari ve bunlardan ve diger anti kanser madde siniflarindan digerlerini, metil hidrazin türevini, adrenokortikal baskilayiciyi, antagonisti, endostatini, taksolü ve benzerlerini içerir. Immüno konjugatlarin ve antikor füzyon proteinlerinin hazirlanmasina yönelik diger faydali kanser kemoterapötik ilaçlari arasinda azot hardallari, etilenimin türevleri, alkil sülfonatlar, nitrozüreler, triazenler, folik asit analoglari, COX-2 inhibitörleri, pirimidin analoglari, pürin analoglari, platin koordine kompleksleri, pirozin hormonlari EGF reseptör tirozin kinazi, bir BCR ABL tirozin kinazi YA DA bir VEGF reseptör tirozin kinazi ve benzerlerini inhibe edenler gibi kinaz inhibitörleri yer alir. Uygun kemoterapötik maddeler, REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), ve in GOODMAN AND GILMANis THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMilIan Publishing Co. 1985) ve bu yayinlarin revize edilmis olan versiyonlarinda tarif edilmistir. Deneysel ilaçlar gibi diger uygun kemoterapötik maddeler, teknikte uzman kisiler tarafindan bilinmektedir. Psödomonas eksotoksin gibi bir toksin ayni zamanda, bu bulusun RS? ve hRS7 antikorlarinin bir immüno konjugatinin terapötik madde kismini olusturmak için komplekslenebilir. Bu gibi konjugatlarin ya da diger füzyon proteinlerinin hazirlanmasinda uygun sekilde kullanilan diger toksinler, risin, abrin, ribonükleaz (RNaz), DNaz I, Stafilokok enterotoksin-A, sekerci boyasi antiviral protein, jelonin, difterin toksin, Psödomonas eksotoksin ve Psödomonas endotoksini içerir. Bakiniz, Journal for Clinicians 44:43 (1994).Mevcut bulusta kullanim için uygun olan ilave toksinler, teknikte uzman kisiler tarafindan bilinmektedir ve U.S. Patent 6,077,499'da açiklanmaktadir. Bir sitokin gibi bir immüno modülatör, EGP-1, RS? ve hRS7 immüno konjugatinin terapötik madde kismini da birlestirebilir ya da olusturabilir ya da bu istemlerde tanimlandigi sekli ile bulusun kimerik insanlastirilmis ya da insan RS? antikorlarina ya da bunlarin parçalarina konjuge edilmemis olarak uygulanabilir. Burada kullanilan faktörü (TNF) gibi Ienfoksinleri ve interlökinler (örnek olarak interlökin-1 (IL-1), IL-2, faktörleri (örnek olarak, granülosit koloni uyarici faktör (G-CSF) ve granülosit makrofaj koloni uyarici faktör (GM-CSF)), interferonlar (örnek olarak, interferon-oi, -B ve -y), "81 faktörü" olarak belirtilen kök hücre büyüme faktörü, eritropoietin ve trombopoietin ya da bunlarin bir kombinasyonunu içerir. Uygun immüno modülatör 0, ve benzerleri bulunur. Alternatif olarak, denekler çiplak EGP-1 ya da RS? antikorlarini ve ayrica ayri olarak uygulanan sitokin alabilir, bunlar çiplak RS7 antikorlarinin uygulanmasindan önce, eszamanli olarak ya da daha sonra uygulanabilir.RS7 antikoru ayni zamanda immüno modülatöre konjuge edilebilir. Immüno modülatör ayni zamanda, farkli antijenlere baglanan bir ya da daha fazla antikordan olusan bir hibrit antikora birlestirilebilir. Bir terapötik ya da tanilayici madde, indirgenmis bir antikor bileseninin mentese bölgesine disülfür bag olusumu yolu ile eklenebilir. Alternatif olarak, bu tür peptitler, N-süksinil 3- (2-piridilditio) proprionat (SPDP) gibi bir hetero bifonksiyonel çapraz baglayici kullanarak antikor bilesenine eklenebilir. Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994).Bu gibi konjugasyon için genel teknikler teknikte iyi bilinmektedir. Bakiniz, örnek olarak, Wong, CHEMlSTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS- LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRlNCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages ; Price, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTlON, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995).Alternatif olarak, terapötik ya da tanilayici madde, antikorun Fc bölgesinde bir karbonhidrat kismi araciligi ile konjuge edilebilir. Karbonhidrat grubu, bir tiyol grubuna bagli olan ayni peptidin yüklenmesini arttirmak için kullanilabilir ya da karbonhidrat kismi farkli bir peptidi baglamak için kullanilabilir. Ayrica, radyo etiketli bir antikor, immünokonjugat ya da bunun parçalari, bir y yayici radyoizotop ya da tanilayici görüntüleme için faydali bir pozitron yayici içerebilir. bulunur. Bakiniz, örnek olarak, 18F, 68Ga, 94mTc ve benzerleri gibi pozitron yayicilari görüntüleme amaçli olarak açiklayan "Labeling Targeting Agents withGallium-68" baslikli Mucitler G.L.Griffiths ve W.J. McBride, (U.S. Geçici Basvuru No. 223Ra'yi içerir. Ornek olarak, 61.5 saat yari ömrü ve bol miktarda beta partikül ve gama isini arzi nedeni ile radyoimmünoterapi için daha ümit verici radyoizotoplardan biri olarak kabul edilen 67Cu, selat'or maddesi p-bromoasetamido-benziI-tetraetilaminetetraasetik asit (TETA) kullanarak bir RS? antijen baglayici proteine konjuge edilebilir. Chase, supra. Alternatif olarak, enerjik bir beta partikülü yayan 90Y, dietilenetriaminepentaasetik asit (DTPA) kullanilarak bir RS7 antijen baglayici proteine baglanabilir. Ayrica, RSI MAb'nin 131l ile dogrudan radyo etiketlenmesi için bir metot Stein et al.(1991)supra, ve Govindan ve digerlerine ait olan "Stable Radioiodine Conjugates and Methods for Their Synthesis," baslikli WO 991 1294A1'de tarif edilmistir. Termal nötron aktivasyon terapisi için bor ilaveli yüklü bir tasiyiciya sahip olan istemlerde tanimlandigi sekildeki RS? antikorlari ya da bunlarin parçalari normal olarak benzer sekillerde etkilenecektir; Bununla birlikte, hedeflenmemis RS? immüno konjugatinin nötron isimasi gerçeklestirilmeden önce temizlenmesini beklemek avantajli olacaktir.R87 antikoruna baglanan bir antikor kullanilarak temizleme hizlandirilabilir. Bu genel ilkenin açiklamasi için U.S. Patent No. 4,624,846'ya bakiniz. Ornek olarak, karboranlar gibi bor ekleri, RS? antikorlarina eklenebilir. Karboranlar, teknikte iyi bilindigi gibi kolye yan zincirlerinde karboksil fonksiyonlari ile hazirlanabilir. Karboranlarin aminodekstran gibi bir tasiyiciya tutturulmasi, karboranlarin karboksil gruplarinin aktiflestirilmesi ve tasiyici üzerinde aminler ile yogunlastirilmasi ile basarilabilir. Ara konjugat daha sonra RS? antikoruna konjuge edilir. RS? antikor konjugatinin uygulanmasindan sonra, bir bor eki, termal nötron isimasi ile aktive edilir ve yüksek toksik, kisa menzilli etkiler üretmek üzere d emisyonu ile bozulan radyoaktif atomlara dönüstürülür. Ayrica, mevcut açiklama bir denekte kanser teshisi metotlarini içerir. Teshis, farmas'otik olarak uygun bir eksipiyan içinde formüle edilmis, tanilayici açidan etkili bir miktarda konjugat uygulanarak ve bahse konu konusu tespit ederek gerçeklestirilebilir. Ornek olarak, radyoaktif ve radyoaktif olmayan maddeler tanilayici maddeler olarak kullanilabilir. Uygun bir radyoaktif olmayan tanilayici madde, manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarli tomografi ya da ultrason için uygun bir kontrast maddesidir. Manyetik görüntüleme maddeleri, örnek olarak, bulusa ait antikorlar ile birlikte kullanildiginda, 2-benziI-DTPA ve bunun monometil ve sikloheksil analoglarini içeren metal selat kombinasyonlari ile kompleks haline getirilmis manganez, demir ve gadolinyum gibi radyoaktif olmayan metalleri içerir. Buna göre, bir denekte bir malinitenin teshisi için, (i) denekten bir numunenin, bir çiplak anti EGP-1 MAb ya da bunun parçasini ya da çiplak antikor füzyon proteinini ya da bunun parçasini içeren bir bilesim ile in vitro teshis analizinin yapilmasini içeren bir metot tarif edilmistir. Ornek olarak, RT-PCR ve immüno assay in vitro teshis metotlari, dokularda, kanda ve diger vücut sivilarinda çok az miktarda EGP-1 varligini yararli bir tani/ tespit metodu olarak saptamak için kullanilabilir. Immüno histokimya, bir hücrede ya da dokuda EGP-1'in varligini tespit etmek için kullanilabilir. Tercihen, teshis edilen malinite bir kanserdir. En çok tercihen, kanser, akciger, prostat, yumurtalik, meme, kolon ve mesane grubundan seçilir. Ek olarak, DTPA, DOTA, TETA ya da NOTA bir selat'or, ya da uygun bir peptit, floresan molekülü gibi bir tespit edilebilir etiket ya da bir agir metal ya da radyonüklid gibi sitotoksik madde ile konjuge edilebilir. Ornek olarak, terapötik olarak faydali bir immünokonjugat, bir foto aktif madde ya da boyayi bir antikor füzyon proteinine birlestirerek elde edilebilir. Florokrom ve diger kromojenler gibi floresan bilesimler ya da görünür isiga duyarli porfirinler gibi boyalar, uygun isigi Iezyona yönlendirerek radyasyon, foto terapi ya da foto dinamik terapi olarak adlandirilmistir (Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMlC THERAPY OF TUMORS ANDOTHER DISEASES (Libreria antikorlar, foto terapi saglamak için foto aktive edilmis boyalar ile birlestirilmistirMew daha önceki çalismalarda, özellikle antikor parçalarin ya da alt parçalarin kullanimi ile endoskopik terapi uygulamalarinin kullanimi dahil edilmemistir. Bu nedenle, mevcut bulus, foto aktif maddeler ya da boyalar içeren immüno konjugatlarin terap'otik kullanimini tasarlar. Bir MRI kontrast maddesi, bir paramanyetik iyon ve bir ultrason arttirici madde gibi kontrast maddeleri de ayni zamanda mevcut bulusta tasarlanmaktadir. Ornek olarak, gadolinyum iyonlari, lantan iyonlari, manganez iyonlari ya da diger benzer etiket, CT kontrast maddeleri ve ultrason kontrast maddeleri mevcut bulusta kullanilmak için uygundur. Tercih edilen bir yapilanmada, ultrason arttirici madde, insanlastirilmis bir RS? IgG ya da bunun parçasini içeren bir lipozomdur. Ayni zamanda tercih edilen, lipozomun gaz ile doldurulmus olmasidir. Terapi amaci ile, mevcut bulusun RS? antikorlari ve bunlarin parçalari hastaya terapötik olarak etkili bir miktarda uygulanir. Bir antikorun, eger uygulanan miktar fizyolojik olarak Önemli ise "terapötik olarak etkili bir miktarda" verildigi söylenir. Eger varligi, alici hastanin fizyolojisinde saptanabilir bir degisiklikle sonuçlanir ise, bir madde fizyolojik olarak önemlidir. Mevcut bulus, RS7 antijeninin varligi için biyolojik numunelerin in vitro taranmasi için RS7 ve hRS7 antikorlari ve bunlarin parçalarini içeren RS7 antikorlarinin kullanilmasini tasarlar. Bu gibi imm'uno assaylarda, RS? antikoru sivi fazda kullanilabilir ya da asagida açiklandigi gibi bir kati faz tasiyiciya baglanabilir. Ayni zamanda, bakiniz Stein et al. (1993), supra, and Stein et al., Cancer Res. 49: 32 (1989). Bir biyolojik numunenin RS7 antijenini içerip içermedigini belirlemek için bir tarama metodunun bir örnegi radyo immüno assaydir (RIA). Ornek olarak, bir RIA formunda, test edilen madde, radyo etiketli RS?' antijeninin varliginda RS? antijen MAb ile karistirilir. Bu metotta, test maddesinin konsantrasyonu, MAb'ye bagli olan etiketlenmis RS7 antijeninin miktari ile ters orantili ve serbest etiketlenmis RS? antijeninin miktari ile dogrudan iliskili olacaktir. Diger uygun tarama metotlari, teknikte uzman kisiler tarafindan kolayca anlasilacaktir. Alternatif olarak, bir RS? antijen baglayici proteinin bir kati faz tasiyiciya baglandigi in vitro analizler yapilabilir. Ornek olarak MAb'Ier, MAb'yi polimer kapli bir boncuk, bir plaka ya da bir tüp gibi çözünmeyen bir destege baglamak için aminodekstran gibi bir polimere baglanabilir. Diger uygun in vitro deneyler, teknikte uzman kisiler tarafindan kolayca anlasilacaktir. Tespit edilebilir sekilde etiketlenmis RS? antijen baglayici protein ve RS7 antijeninin spesifik konsantrasyonlarinin yani sira diger deney kosullari, numune içindeki RS7 antijeninin konsantrasyonu, numunenin dogasi ve benzerlerini içeren çok sayida faktörlere bagli olarak degisebilir. Bir RS? antijen baglayici protein numunesinin baglanma etkinligi, iyi bilinen metotlara göre belirlenebilir. Teknikte uzman kisiler, rutin deneyler kullanarak her belirleme için operasyonel ve optimal analiz kosullarini belirleyebilecektir. Yikama, karistirma, çalkalama, filtreleme ve benzerleri gibi diger adimlar, bilinen ya da özel durum için gerekli olan deneylere ilave edilebilir. Biyolojik bir numunedeki RS? antijeninin varligi, enzim bagli bir immünosorbent analizi (ELlSA) kullanilarak belirlenebilir. Dogrudan rekabet eden ELISA'da, bir saf ya da yari saf antijeni preparasyonu, test edilen sivi ya da hücresel özde çözünmeyen kati bir destege baglanir ve kati faz antijen ve etiketli antikor arasinda olusturulmus olan ikili kompleksin tespit edilmesine ve/ veya miktarlanmasina izin vermek için bir miktar saptanabilir etiketli çözünür antikor ilave edilir. Buna karsilik, ayni zamanda "iki bölgeli ELISA" ya da "sandviç analizi" olarak da bilinen bir "çift determinant" ELISA, az miktarda antijen gerektirir ve analiz, antijenin kapsamli bir sekilde saflastirilmasini gerektirmez. Bu nedenle, çift determinant ELISA, klinik bir numunede bir antijenin tespit edilmesi için dogrudan rekabetçi ELISA'ya tercih edilir. Ornek olarak, biyopsi örneklerinde c-myc onkoproteinin miktar nicellestirilmesi için çift determinant ELISA'nin kullanilmasi için, bakiniz, Field et al., Çift determinant bir ELISA'da, etiketlenmemis MAb ya da antikor parçasinin ("kapt'ur antikor") bir kati destege baglidir, test numunesi kapt'ur antikor ile kontak haline getirilir, ve tespit edilebilir sekilde etiketlenmis olan çözülebilir antikorun (ya da antikor parçasinin) bir miktari kaptür antikoru, antijen, ve etiketlenmis antikor arasindaki `uçlu kompleksin tespit edilmesine ve/ veya nicellestirilmesine izin vermek için eklenir. Bir antikor parçasi, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab ve benzeri gibi bir antikorun bir kismidir. Mevcut baglamda, bir antikor parçasi, bir R87 Mab'in, RS? antijeninin bir epitopuna baglanan bir kismidir. "Antikor parçasi" terimi ayni zamanda bir kompleks olusturmak için spesifik bir antijene baglanarak bir antikor gibi davranan herhangi bir sentetik ya da genetik olarak islenmis proteini de içerir. Ornek olarak, antikor parçalari, hafif zincir degisken bölgesinin içeren izole edilmis parçalari, agir ve hafif zincirlerinin degisken bölgelerini, ve bir peptit baglayici tarafindan hafif ve agir degisken bölgelere baglanmis olan rekombinant tekli zincir polipeptit moleküllerini içeren "Fv" parçalarini içerir. Bir antikor füzyon proteini, en az iki esas olarak monospesifik antikor ya da antikor parçasi içeren bir polispesifik antikor kompozisyonu olup, içerisinde antikorlarin ya da antikor parçalarinin en az ikisi, RS? antijeninin farkli epitoplarina baglanir. Bir RS? füzyon proteini ayrica bir antikor füzyon proteininin bir tanilayici ya da terap'otik madde ile konjugatini içerir.RS7 antikoru terimi, insanlastirilmis, kimerik, insan ve murin antikorlarini, bunlarin antikor parçalarini, immüno konjugatlari ve bunlarin parçalarini ve antikor füzyon proteinlerini ve bunlarin parçalarini içerir. Çift determinant bir ELISA gerçeklestirme metotlari iyi bilinmektedir. Bakiniz, örnek olarak, Field et al., supra, Spandidos et al., supra, and Moore et al., "Twin-Site ELISAs for fos and myc Oncoproteins Using the AMPAK System," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages . Ornek olarak, çift determinant ELlSA kullanilarak RS? antijeninin tespit edilmesi için bir metotta, bir biyopsi numunesinden ince kiyilmis doku liyofilize edilir ve beher 500 pl solüsyon için 10 ila 20 mg arasinda dokunun (islak agirlik) bir konsantrasyonunda ug/pl löpeptin ve 1 mM EDTA içeren liziz tamponunda (100 mM NaCI, 50 mM Tris- HCl, pH 7.4) içinde yeniden askiya alinir. Süspansiyon, 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir ve daha sonra yaklasik olarak alti 10 saniye araliklar ile soniklestirilir. Çözünmeyen malzeme santrifüjleme ile uzaklastirilir. Çözünür öz, kaptür antikoru olarak adsorbe edilmis olan bir RS? antijen MAb içeren mikrotitre plaka kuyucuklarina ilave edilir. Yakalanan RS? antijeni daha sonra alkalin fosfataz ile birlestirilmis ikinci bir RS? antijeni MAb tarafindan taninir. Ozdeki RS? antijen miktarina orantili bagli alkalin fosfataz miktari, p-nitrofenilfosfat gibi bir kromojenik substrat kullanilarak kolorimetrik olarak tespit edilir. Alternatif olarak, RS? antijeni için bir çift determinant ELISA, at turpu peroksidazi kullanilarak gerçeklestirilebilir. Numune hazirlama ve çift determinant ELlSA'nin diger varyasyonlari, teknikte uzman kisiler tarafindan rutin deneyler ile tasarlanabilir. Çift determinant ELISA'da, çözünür antikor ya da antikor parçasi, kaptür antikoru tarafindan taninan epitoptan farkli bir RS? epitopuna baglanmalidir. Ornek olarak, çözünür antikor RS?' MAb olabilirken, kaptür antikoru MR23 olabilir. Alternatif olarak, çözünür antikor MR23 olabilir, kaptür antikoru ise RS? MAb olabilir. Çift determinant ELISA, RS? antijeninin bir biyopsi numunesinde mevcut olup olmadigini belirlemek için gerçeklestirilebilir. Alternatif olarak, analiz, vücut sivisinin klinik bir numunesinde bulunan RS7 antijeninin miktarini ölçmek için gerçeklestirilebilir. Nicel analiz, saflastirilmis RS? antijeninin dilüsyonlari dahil edilerek gerçeklestirilebilir.RS7 antijeninin saflastirilmasi için bir metot asagida gösterilmistir. Mevcut bulusun RS? MAb'Iari ve bunlarin parçalari ayni zamanda bir analiz kitinin hazirlanmasi için de uygundur. Bu tür bir kit, siseler, tüpler ve benzerleri gibi bir ya da daha fazla kapali hapsedilmis konteynir araçlari içerisine almak için bölümlere ayrilmis olan bir tasima araci içerebilir olup, bahse konu konteynir araçlari immüno assayin ayri ögelerini içerebilir. Ornek olarak, bir kati faz destegi üzerinde hareketsiz tutulan kaptür antikorunu içeren bir konteynir araci ve çözeltide tespit edilebilir sekilde etiketlenmis antikorlar içeren bir baska konteynir araci olabilir. Diger konteyner araçlari, RS? antijeninin seri seyreltimlerini içeren standart çözeltiler içerebilir. RS7 antijeninin standart çözeltileri, apsiste çizilen RS? antijen konsantrasyonu ve 0rdinattaki tespit sinyali ile standart bir egri hazirlamak için kullanilabilir. R8? antijeni içeren bir numuneden elde edilen sonuçlar, biyolojik numunedeki RS? antijeninin konsantrasyonunu vermek için böyle bir çizimden enterpolasyonlu olabilir. Mevcut bulusun RS? antikorlari ve bunlarin parçalari, ayni zamanda, histolojik bir örnekten hazirlanan doku kesitlerinde RS? antijeninin varligini tespit etmek için de kullanilabilir. Bu tür in situ tespit, RS7 antijeninin varligini belirlemek ve incelenen dokudaki RS? antijeninin dagilimini belirlemek için kullanilabilir. In situ tespit, tespit edilebilir bir sekilde etiketlenmis bir RS? antijen baglayici proteinin donmus doku bölümlerine uygulanmasi ile gerçeklestirilebilir. Çalismalar, RS7 antijeninin parafine gömülmüs bölümlerde korunmadigini göstermektedir. (Stein et al., (1993), supra). Genel in situ tespit teknikleri, teknikte siradan uzmanliga sahip kisiler tarafindan iyi bilinmektedir. Bakiniz, örnek olarak, Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application," in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH 113-38 zamanda, bakiniz, Stein et al. (1989), supra, ve Stein et al. (1993), supra. RS7 antikorlari ve bunlarin parçalari, herhangi bir uygun tespit maddesi ile, örnek olarak bir radyoizotop, bir enzim, bir floresan etiket, bir kemilüminesan etiket, bir biyolüminesan etiket ya da bir paramanyetik etiket ile tespit edilebilir bir sekilde etiketlenebilir. Bu tür tespit edilebilir sekilde etiketlenmis RS? antijen baglanma proteinlerinin üretilmesi ve tespit edilmesi metotlari, teknikte siradan uzmanliga sahip kisiler tarafindan iyi bilinmektedir ve asagida daha ayrintili olarak tarif edilmistir. Isaretçi kismi, bir gama sayaci ya da bir sintilasyon sayaci kullanimi ya da otoradyografi ile algilanan bir radyoizotop olabilir. Tercih edilen bir yapilanmada, tanilayici konjugat bir gama, beta ya da bir pozitron yayan izotoptur. Mevcut tarifnamedeki bir isaretleyici kismi, daha önceden belirlenmis kosullar altinda bir sinyal üretecek molekülü ifade eder. Isaretleyici kisimlarin örnekleri arasinda radyoizotoplar, enzimler, floresan etiketler, kemilüminesan etiketler, biyolüminesan etiketler ve paramanyetik etiketler bulunur. Burada kullanildigi sekli ile, bir tanilayici ya da terapötik madde, teshis ve tedavi için faydali bir konjugat üretmek üzere bir antikor parçasina konjuge edilmis bir molekül ya da atomdur. Tanilayici ya da terapötik maddelerin örnekleri arasinda ilaçlar, toksinler, selatörler, boyalar, kromajenler, bor bilesikleri ve isaretleyici kisimlari bulunur. Mevcut bulusun amaci 213Bi ve 211At'dir. Ek radyonüklidler ayni zamanda tanilayici ve terapötik maddeler olarak da mevcuttur. Uygun tanilayici görüntüleme izotoplari, genellikle 25 ila 4.000 keV araliginda bulunurken, uygun terapötik radyonüklidler genellikle 60 ila 700 keV araligindadir. Istemlerde tanimlandigi sekli ile mevcut bulusun RS? antikorlari ve parçalari ayni zamanda bir floresan bilesigi ile etiketlenebilir. Floresan etiketli bir MAb'nin varligi, RS? antijen baglayici proteinin uygun dalga boyunun isigina maruz birakilmasi ve elde edilen floresanin tespit edilmesi sureti ile belirlenir. Floresan etiketleme bilesikleri, floreserin izotiyosiyanat, rodamin, fikoeriterin, fikosiyanin, allofosiyanin, o- ftaldehit ve floresamini içerir. Floresan etiketli RS7 antijen baglayici proteinler, akis sitometrisi analizi için ozellikle yararlidir. Alternatif olarak, RS? antikorlari ve bunlarin parçalari, RS? antijen baglayici proteini bir kemilüminesan bilesige birlestirerek tespit edilebilir bir sekilde etiketlenebilir. Kemilüminesan etiketli MAb'nin varligi, bir kimyasal reaksiyon sirasinda ortaya çikan lüminesansin varligi tespit edilerek belirlenir. Kemilüminesan etiketleme bilesiklerinin örnekleri arasinda Iuminol, izol'uminol, bir aromatik akridinyum ester, bir imidazol, bir akridinyum tuzu ve bir oksalat ester bulunur. Benzer sekilde, mevcut bulusun RS? antikorlarini ve bunlarin parçalarini etiketlemek için bir biyol'uminesan bilesik kullanilabilir. Biyol'uminesans, biyolojik sistemlerde bulunan ve katalitik bir proteinin kemilüminesan reaksiyonun etkinligini arttirdigi bir tur kemilüminesanstir. Bir biyolojik isildayan proteinin varligi, isildama varliginin tespit edilmesi sureti ile belirlenir. Etiketleme için yararli olan biyolojik Iüminesan bilesikler arasinda lusiferin, lusiferaz ve akuorin bulunur. Alternatif olarak, RS7 antikorlari ve bunlarin parçalari, RS? antikorunun bir enzime baglanmasi ile tespit edilebilir bir sekilde etiketlenebilirRS? antikoru enzim konjugati, uygun substrat varliginda inkübe edildiginde, enzim kismi, örnek olarak spektrofotometrik, florometrik ya da görsel yollar ile saptanabilen bir kimyasal kisim üretmek 'üzere substrat ile reaksiyona girer.RS7 antikorunu tespit edilebilir bir sekilde etiketlemek için kullanilabilecek enzim 'Örnekleri arasinda malat dehidrojenaz, stafilokok nükleaz, delta-V-steroid izomeraz, maya alkol dehidrojenaz, oi-gliserfosfat dehidrojenaz, trioz fosfat izomeraz, atradish peroksidaz, alkalin fosfataz, asidaz ß- galaktosidaz, ribonükleaz, üreaz, katalaz, glukoz-ö-fosfat dehidrojenaz, glukoamilaz ve asetilkolinesteraz yer alir. Istemlerde tanimlandigi sekli ile RS7 antikorlari, füzyon proteinleri ve bunlarin parçalari ayrica in vivo teshis amaci ile paramanyetik iyonlar ile etiketlenebilir. Manyetik rezonans görüntüleme için özellikle yararli olan kontrast maddeleri Gd, Mn, Dy ya da Fe iyonlarini içerir. RS? antikorlari ve bunlarin parçalari ayni zamanda ultrason kontrast] arttirici maddelere de baglanabilir. Ornek olarak, ultrason kontrast maddesi, insanlastirilmis bir RS? IgG ya da bunun parçasini içeren bir lipozomdur. Ayni zamanda tercih edilen, ultrason kontrast maddesinin, gazla doldurulmus bir lipozom olmasidir. Ilgili bir damarda, bispesifik bir antikor bir kontrast maddeye baglanabilir. Ornek olarak bispesifik antikor, ultrason görüntülemede kullanim için birden fazla görüntü arttirici madde içerebilir. Tercih edilen bir yapilanmada, kontrast maddesi bir lipozomdur. Tercihen, lipozom, Iipozomun dis yüzeyine kovalent olarak baglanmis iki degerlikli bir DTPA peptidi içerir. Yine tercih edilen, Iipozomun gaz ile doldurulmus olmasidir. Teknikte uzman kisiler, mevcut bulusa uygun olarak kullanilabilecek diger uygun etiketleri bileceklerdir. Isaretleyici kisimlarinin RS? antikorlarina baglanmasi, teknikte bilinen standart teknikler kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bu baglamdaki tipik metodoloji Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schurs et al., Clin. Chim. supra, and Stein et al. (1993), supra. tarafindan tarif edilmistir. Ayni zamanda, Yukarida tarif edilen in vitro ve in situ tespit metotlari, bir patolojik durumun teshisinde ya da evrelemesinde yardimci olmak için kullanilabilir. Ornek olarak, bu tür metotlar, akciger, meme, mesane, yumurtalik, uterus, mide ve prostat tümörlerini içeren RS? antijenini eksprese eden tümörleri saptamak için kullanilabilir. Istemlerde tanimlandigi sekli ile mevcut bulus ayni zamanda in vivo tani için RS7 antikorlarinin kullanimini da tasarlar. Radyo etiketli MAb'Ier ile tanilayici görüntüleme metodu iyi bilinmektedir. Immüno sintigrafi tekniginde, örnek olarak antikorlar, bir gama yayan radyo izotop ile etiketlenir ve bir hastaya verilir. Gama yayan radyo izotoplarin yerini ve dagilimini tespit etmek için bir gama kamera kullanilir. Bakiniz, örnek olarak, Srivastava (ed.), RADlOLABELED MONOCLONAL ANTlBODIES FOR Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTlCAL SCIENCES, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.), pp. , ve Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall 1993). Tanilayici görüntüleme için, radyoizotoplar dogrudan ya da dolayli olarak bir araci fonksiyonel grup kullanilarak RS? antikoruna baglanabilir. Faydali araci fonksiyonel gruplar arasinda, etilendiamintetraasetik asit ve dietiletriaminepentaasetik asit gibi selatörler bulunur. Ornek olarak, bakiniz Shih et al., supra, ve U.S. Patent No. ,057,313. Hastaya verilen radyasyon dozu, minimum yari ömrün en iyi kombinasyonu, vücutta minimum tutulma ve minimum izotop miktarinin tespiti ve dogru ölçüm yapilmasina izin verecek en iyi kombinasyon için izotop seçimi ile mümkün oldugunca düsük bir seviyede tutulur. RS? antikoruna baglanabilen ve tanilayici görüntüleme için uygun olan radyoizotop örnekleri 99mTc ve 111In'dir. Farmasötik olarak uygun eksipiyan Bir RS? antikorunun etki süresini terapötik bir uygulamada kontrol etmek için ilave farmas'otik metotlar kullanilabilir. Kontrol salim preparatlari, RS? antikorunu kompleks hale getirmek ya da adsorbe etmek için polimerlerin kullanilmasi sureti ile hazirlanabilir. Ornek olarak, biyolojik uyumlu polimerler, polimatilenleri (etilen ko-vinil asetat) ve bir stearik asit dimer ve sebasik asidin bir polianhidrit kopolimerinin antikorunun böyle bir matristen salinma hizi, RS?' antikorunun moleküler agirligina, matris içindeki RS7 antikorunun miktarina ve dagilmis parçaciklarin boyutuna baglidir. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., supra. Diger kati dozaj formlari REMlNGTONSPHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th ed. (1990)'da tarif edilmektedir. Bir denege verilecek olan, istemlerde tanimlandigi sekli ile bulusun insanlastirilmis, kimerik ve insan RS? antikorlari, tek basina antikordan, immüno konjugattan, füzyon proteinden olusabilir, ya da bir ya da daha fazla farmasotik olarak uygun eksipiyan, bir ya da daha fazla ilave içerik, ya da bunlarin bazi kombinasyonlarini içerebilir. istemlerde tanimlandigi sekli ile mevcut bulusun immüno konjugati, çiplak antikoru, füzyon proteini ve bunlarin parçalari, farmasötik olarak faydali kompozisyonlar hazirlamak için bilinen metotlara göre formüle edilebilir olup, burada immünokonjugat ya da çiplak antikor bir farmasötik olarak uygun eksipiyan ile bir karisim içinde birlestirilir. Steril fosfat tamponlu salin, farmasötik olarak uygun bir eksipiyanin bir Örnegidir. Diger uygun eksipiyanlar, teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinmektedir. Ornek olarak, bakiniz, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELlVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), ve Gennaro (ed), REMINGTONis PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), ve bunlarin revize edilmis olan versiyonlari. istemlerde tanimlandigi sekli ile mevcut bulusa ait immünokonjugat ya da çiplak antikor, örnek olarak bolus enjeksiyonu ya da sürekli infüzyon yolu ile intravenöz uygulama için formüle edilebilir. Enjeksiyon için formülasyonlar, birim koruyucu formda, örnek olarak ampullerde ya da çok dozlu kaplarda, ilave bir koruyucu madde ile sunulabilir. Kompozisyonlar, yagli ya da sulu tasitlarda süspansiyonlar, çözeltiler ya da emülsiyonlar gibi formlar alabilir ve süspansiyon, stabilize edici ve/ veya dagitici maddeler gibi formüle edici maddeler içerebilir. Alternatif olarak, aktif bilesen kullanimdan önce uygun bir tasiyici, 'Örnek olarak steril pirojen içermeyen su ile yapi için toz formunda olabilir. Terapötik ya da tanilayici konjugat ya da çiplak antikorun etki süresini kontrol etmek Için ek farmasötik metotlar kullanilabilir. Kontrol salim preparatlari, immüno konjugati ya da çiplak antikoru kompleks hale getirmek ya da adsorbe etmek için polimerlerin kullanilmasi sureti ile hazirlanabilir. Ornek olarak, biyolojik uyumlu polimerler, polimatilenleri (etilen ko-vinil asetat) ve bir stearik asit dimer ve sebasik asidin bir polianhidrit kopolimerinin matrislerini içerir. Shenivood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). Bir immüno konjugatin ya da antikorunun böyle bir matristen salinma hizi, immüno konjugatin ya da antikorunun moleküler agirligina, matris içindeki immüno konjugatin, antikorun miktarina ve dagilmis parçaciklarin boyutuna baglidir. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., supra. Oteki kati doz ayarlama formlari Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), ve Gennaro (ed.), REMINGTONiS PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), ve bunlarin revize edilmis olan versiyonlarinda tarif edilmistir. Immünokonjugat, antikor füzyon proteini, çiplak antikor ve bunlarin parçalari ayni zamanda bir memeliye subkütanöz olarak ya da hatta diger parenteral yollardan uygulanabilir. Tercih edilen bir yapilanmada, anti EGP-1 antikoru ya da bunun parçasi, doz basina 10 ila 2000 miligram arasinda protein dozajinda uygulanir. Ayrica, uygulama sürekli infüzyon ile ya da tekli ya da çoklu boluslar ile yapilabilir. Genel olarak, insanlar için uygulanan bir immüno konjugat, füzyon proteini ya da çiplak antikorun dozu, hastanin yasi, kilosu, boyu, cinsiyeti, genel tibbi durumu ve önceki tibbi 'Öyküsü gibi faktörlere bagli olarak degisecektir. Ayni zamanda kosullarin geregi olarak daha düsük ya da daha yüksek bir doz da verilebilecek olmasina ragmen, tipik olarak, aliciya, tek bir intravenöz infüzyon yolu ile yaklasik 1 mg/kg ila mg/kg araliginda bir immüno konjugat, antikor füzyon proteini ya da çiplak antikor dozu verilmesi arzu edilir. Bu dozaj ihtiyaç duyuldugu sekilde, örnek olarak 4 ila 10 hafta boyunca haftada bir kez, tercihen 8 hafta boyunca haftada bir kez ve daha fazla tercihen 4 hafta boyunca haftada bir kez tekrar edilebilir. Ayni zamanda, birkaç ay boyunca her hafta gibi daha az siklikta da verilebilir. Doz, doz ve programin uygun sekilde ayarlanmasi ile çesitli parenteral yollardan verilebilir. Istemlerde tanimlandigi sekli ile mevcut bulusa ait RS7 antikorlari, farmas'otik olarak faydali bilesimleri hazirlamak için bilinen metotlara göre formüle edilebilir olup, burada RS? antikorlari, farmasotik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile karisim halinde birlestirilir. Uygulamasinin bir alici hasta tarafindan tolere edilebilmesi durumunda, bir bilesimin "farmasotik olarak kabul edilebilir bir tasiyici" oldugu kabul edilir. Steril fosfat tamponlu salin, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyicinin bir örnegidir. Diger uygun tasiyicilar, teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinmektedir. Bakiniz, örnek olarak, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SClENCES, 18th Ed. (1990) Terapi amaci için, immüno konjugat, füzyon proteini ya da çiplak antikor, bir memeliye terap'otik olarak etkili bir miktarda uygulanir. Mevcut bulus için uygun bir denek, ayni zamanda, insan olmayan bir hayvan denek de öngörülmüs olmasina ragmen, genellikle bir insandir. Bir antikor preparatinin, eger uygulanan miktar fizyolojik olarak önemli ise "terapotik olarak etkili bir miktarda" verildigi s'oylenir. Eger varligi, alici memelinin fizyolojisinde saptanabilir bir degisiklikle sonuçlanir ise, bir madde fizyolojik olarak Önemlidir. Ornek 1:Kimerik bir RS? antikorunun yapisi RS7VK ve VH genlerinin moleküler klonlanmasi Toplam sitoplazmik RNA ve mRNA, RS? üreten hibridom hücrelerinden hazirlanmistir. VK ve VH dizilerini kodlayan genler, RT-PCR ve 5'RACE ile klonlanmistir ve sekanslar, DNA sekanslamasi ile belirlenmistir. PCR reaksiyonundan kaynaklanan olasi hatalari ortadan kaldirmak için çoklu bagimsiz klonlar sekanslanmistir. Sekans analizleri iki VK (#1 ve #23) ve bir VH (RS7VH) transkriptinin varligini ortaya çikarmistir. Varsayilan murin VK'sinin her biri VH ile birlestirilmesi ile, insan sabit bölge etki alanlari içeren iki kimerik Abs (cAb) üretilmistir ve transfeksiyon ile Sp2/O hücrelerinde eksprese edilmistir. cAb üreten klonlar, transfekte edilmis hücre klonlarinin hücre kültürü süpernatantlarinin ELlSA ile taranmasi ile tanimlanmistir. Pozitif klonlar genisletilmis ve hücre kültür süpernatantlarindan cAb'ler saflastirilmistir. Ag baglama analizi, sadece VK #23 ve VH, cAb-VK #23'ten olusan cAb'nin ME 180'inin, bir insan servikal karsinom hücresi (ATCC, Rockville, MD), ham membran fraksiyonu ile kaplanmis mikro kuyucuklara baglandigini göstermistir (Sekil 1). Vi< #1 ve VH, cAb-VK #1 kombinasyonu olan cAb, Ag kaplanmis kuyucuklara baglanma göstermemistir. Bu nedenle, immüno reaktif cAb (VK #23 ile) CRS7 olarak tanimlanmistir. Klonlanmis murin VH ve PCR (nihai ürün) olarak fonksiyonel VK(#23) sekanslari, sirasi ile RS7Vk (Sekil 2A) ve R87VH (Sekil 28) olarak tanimlanmistir. RS? Abs için baglama aktivite analizi Tasarlanmis CRS7'nin baglanma benzesimini degerlendirmek için rekabetçi bir ELISA baglanma analizi kullanilmistir. Kisaca, biotinile edilmis murin RST'in sabit miktari, degisen konsantrasyonlarda (0.01 ila 100 ug/ml arasinda) test Abs (R87 veya cRS?) ile karistirilir ve Ag kapli mikro hücrelere eklenir ve oda sicakliginda 1 saat ink'ube edilir. Yikandiktan sonra, HRP konjuge streptavidin eklenir ve 1 saat oda sicakliginda inkübe edilir. Ag bagli biotinlenmis RS7'ye baglanan HRP konjuge streptavidin miktari, 4 mM orto-fenilendiamin dihidroklor'ür ve % 0.04 H202 içeren bir substrat çözeltisinin eklenmesinden sonra OD490 okunmasi ile ortaya çikarilmistir. Bu tip rekabetçi Ag baglama deneyi ile, cRS7 ve murin RST'nin, biotinlenmis murin RS7'nin antijen kapli kuyucuklara baglanmasi Için esit derecede rekabet ettigi, böylece elde edilen VK ve VH sekanslarinin dogrulugunu onayladigi ortaya çikmistir (Sekil 1). Ornek 2:HRS7 antikor yapim metodu HRS7 V genlerinin sekans dizayni Kabat veri tabanindaki insan VK ve VH sekanslari aranirken, RS? VK ve VH'nin FR'lerinin sirasi ile insan SA-1A'cl VK ve RF-TSB VH'ye en yüksek seviyede sekans homolojisi gösterdigi bulunmustur. Bunun bir istisnasi, NEWM VH'ninki ile en yüksek sekans homolojisini gösteren RS7VH'nin FR4'üdür.Bu nedenle, insan SA-1A'CL çerçeve sekanslari, RS7VK (Sekil 3A) CDR'Ierinin asilanmasi için iskele olarak kullanilmistir ve RS7VH (Sekil 4) için bir RF-TSS ve NEWM çerçeve sekanslarini bir kombinasyonu kullanilmistir. Baslangiçtaki insan antikor çerçevelerine kiyasla, CDR bölgelerinin disindaki her zincirde bir dizi amino asit degisikligi vardir.VarsayiIan CDR'leri yandan kusatan murin FR'leri içindeki çok sayidaki amino asit artiklari, daha önce Qu,Z., Losman,M.J., Eliassen,K.C., Hansen,H.J., Goldenberg,D.M., and Leung,S.O. (1999). Humanization of lmmu31, an alpha-fetoprotein-specificantibody. yeniden sekillendirilmis olan hRS7 Fv içinde tutulmustur. Bu artiklar RSYVK'nin ve hR87 V sekanslarinin yapimi Leung et al. Leung, 8.0., Shevitz, J., Pellegrini, MC., Dion, A.S., Shih, L.B., Goldenberg, D.M., and Hansen, H.J. (1994) Chimerization of LL2, a rapidly internalizing antibody specific for B celllymphoma. Hybridoma, 13: 469-476) tarafindan tarif edilen modifiye edilmis bir strateji, Sekil 4'te gösterildigi sekilde hRS7' için dizayn edilmis olan VL ve VH genlerinin uzun oligo nükleotit sentezlerinin ve PCR'nin bir kombinasyonunun kullanilmasi ile yapimi için kullanilmistir.HRS7 VH etki alaninin yapimi için, iki uzun oligo n'ukleotit, hRSYVHA (176-mer) ve hRSYVHB (168- mer), otomatik bir DNA sentezleyicide (Applied Biosystem) sentezlenmistir. hRS7VHA, hRS7VH etki alaninin nt 23 ila 198 arasindakilerini temsil eder. hRS7VHB, nt 174 ila 340 arasindakilerini tamamlayan hRSYVH etki alaninin eksi sarmalini temsil eder. HRS7VHA ve B'nin 3'-terminal sekanslari (23 nt artiklari) birbirini bütünleyici niteliktedir. Tanimlanan PCR kosulu altinda, uzun oligo nükleotitlerin geri kalani ile çevrili kisa bir çift sarmalli DNA olusturmak için hRS7VHA ve B'nin 3'-uçlari tavlanir. Her bir tavlanmis uç, tek sarmalli DNA'nin transkripsiyonu için bir primer görevi görür, sonuçta hRS7VH'nin nt 23 ila 340 arasindakilerini olusan bir çift sarmalli DNA ortaya çikar. Bu DNA, tam uzunluktaki hRS7VH'yi olusturmak üzere iki kisa oligo nükleotit, hRSYVHBACK ve hRS7VHFOR varliginda daha da büyütülmüstür. hRS7VHBACK 5,-GTGGTGCTGC AGCAATCTGG GTCTGAGTTG AAGAAGCC-S' hRSYVHFOR 5,-TGAGGAGACG GTGACCAGGG ACCCTTGGCC CCAGACAT-S! Minimum hRS7VHA ve B miktari (ampirik olarak belirlenmistir), 10 ul 10x PCR Tamponu (, 2 umol hRS7VHBACK ve hRS7VHFOR varliginda ve 2.5 birim Taq DNA polimeraz (Perkin Elmer Cetus, NonNalk, Ct) yükseltilmistir. Bu reaksiyon karisimi, 94 °C'de 1 dakika denatürasyon, 45 cC'de 1 dakika tavlama ve 72 °C'de 1.5 dakika polimerizasyonu içeren 3 döngü PCR reaksiyonuna ve ardindan 1 dakika boyunca 94 ° C'de denatürasyon, 1 dakika boyunca 55 °C'de tavlama ve 1 dakika boyunca 72 "C'de polimerizasyondan olusan 27 döngü PCR reaksiyonuna maruz birakilmistir. hRS7VH için çift sarmalli PCR ile büyütülmüs ürün, jel ile saflastirilmistir, Pstl ve BstEII ile sinirlama ile sindirilmistir ve agir zincir adimlandirma vektörü VHpBSZ'nin bütünleyici PstI/BstEII bölgelerine klonlanmistir. Insanlastirilmis V sekansinin tam uzunlukta DNA'sini olusturmak için hRS7VKA ( yukarida açiklandigi gibi sentezlenmistir. hRS7VKA ve B, yukarida açiklandigi gibi iki kisa oligo nükleotit hRS7VKBACK ve hRS7VKA, hRS7VK etki alaninin nt 20 ila 175 arasindakilerini temsil eder. hRS7VKB, nt 155 ila 320 arasindakilerini tamamlayan hRS7VK etki alaninin eksi sarmalini temsil eder. hRSYVKBACK 5,-GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTG-3 ' hRS7VKFOR 5'-ACGTTAGATC TCCACCTTGG TCCCAGCACC (3-31 HRS7VK için jel ile saflastirilmis PCR ürünleri, Pvull ve Bgllll ile sinirlama ile sindirilmistir ve VKpBR2 hafif zincir hazirlama vektörünün bütünleyici Pvul/Bcll bölgelerine klonlanmistir. Nihai ekspresyon vektörü hRS7pdHL2, sirasi ile hRS7VK ve VH'nin XbaI-BamHl ve XhoI/BamHl parçalarinin sirasi ile yukarida açiklandigi gibi pdHL2'ye alt klonlanmasi ile olusturulmustur. HR87 Antikorlarinin Transfeksivonu ve Ekspresvonu HRS7 için ekspresyon vektörünün yaklasik olarak 30 ug'si, Sall ile sindirilerek dogrusallastirilmis ve elektroporasyon (450V ve 25 üF) ile Sp2/0-Agl4 hücrelerine transfekte edilmistir. Transfekte edilmis hücreler, 2 gün boyunca 96 kuyucuklu plakalara plakalanmistir ve daha sonra, 0.025 uM'Iik bir nihai konsantrasyonda ortama MTX ilave edilerek ilaca direnç için seçilmistir. MTX'e dirençli koloniler oyuklarda 2 ila 3 hafta arasinda ortaya çikmistir. Seçimi devam ettiren kolonilerden gelen süpernatantlar, ELISA analizi ile insan Ab sekresyonu için taranmistir. Kisaca, GAH-IgG, F(ab')2 parçasina özgü Ab ile daha önceden kaplanmis ve oda sicakliginda 1 saat inkübe edilen bir mikrotitre plakasinin kuyucuklarina 100 ul süpernatant eklenmistir. Baglanmamis proteinler, üç kez yikama tamponu (% 0.05 polisorbat 20 içeren PBS) ile yikanarak uzaklasmistir. HRP konjuge GAHIgG, Fc parçasina özgü Ab kuyucuklara eklenmistir.1 saatlik bir inkübasyonun ardindan, plaka yikanmistir. Bagli HRP konjuge Ab, 4 mM OPD ve % 0.04 H202 içeren bir substrat çözeltisinin eklenmesinden sonra A490nm okunmasi ile ortaya çikarilmistir. Pozitif hücre klonlari genisletilmistir ve hRS7 IgG, bir Protein A kolonu üzerinde benzesim kromatografisi ile hücre kültürü süpernatantindan saflastirilmistir. Insanlastirilmis RS7 antikorunun Baglanma Aktivitesi ME180 hücre membrani 'özü kapli plakasini kullanan bir ELISA rekabetçi baglama testi, tarif edildigi gibi hRSY'nin immüno-reaktivitesini degerlendirmek için fraksiyonu, sonikasyon ve santritüjleme ile hazirlanmistir. Ham membran Özü, santrifüjleme yolu ile 96 kuyucuklu düz dipli PVC plaka içine kaplanmistir ve % 0.1 glutaraldehit ile sabitlenmistir. Membran kapli kuyucuklara degisen konsantrasyonlarda mRST, cRS7 ya da hRSY ile karistirilan biotinile edilmis murin RST'nin sabit miktari membran kapli kuyucuklara eklenmistir ve oda sicakliginda 1 ila 2 saat arasinda inkübe edilmistir. Yikandiktan sonra, HRP konjuge streptavidin eklenmistir ve 1 saat oda sicakliginda inkübe edilmistir. Membran bagli biotinlenmis mRS7'ye baglanan HRP konjuge streptavidin miktari, 4 mM orto-fenilendiamin dihidroklorür ve % 0.04 H202 içeren bir substrat çözeltisinin eklenmesinden sonra A490nm okunmasi ile ortaya çikarilmistir. Sekil 6'daki rekabet analizlerinde gösterildigi gibi, hRS7 IgG, RS7'nin baglanma benzesmesinin insanlastirmada korundugunu onaylayan mRS7 ve cRS7 ile karsilastirilabilir baglanma aktiviteleri sergilemistir. Ornek 3: Artik veren etiketler kullanarak insanlastirilmis RS7'nin radyo iyodinasyonlari Artik veren kisim (IMP-R4, lMP-R5 ya da lMP-R8), baska bir yerde tarif edilen prosedür boyunca disülfür indirgenmis hRS7'ye baglanmistir ve birlestirilmistir kullanarak radyo iyodin artiklarinin artiklastirilmasinda, 125l-lMP-Rx-hRS7 (burada x = 4, 5 ya da 8) hazirlamak için, sirasi ile IMP-R4, IMP-R5 ve IMP-R8 kullanilarak % 87.1 ('nin toplam verim ve faaliyetleri (parantez içinde) elde edilmistir. 131l-lMP-R4 varligi kullanan nmol IMP-R4 ve 3.22 mg DTT-indirgenmis hRS7 kullanilarak, % 60 toplam verim ( elde edilmistir. 30.3 mCi 131l, lMP-R4 ve indirgenmis hRST kullanilarak kullanilarak yapilan üçüncü bir çalisma % 71.8 birlesme ( vermistir. 13.6 mCi 131I ve spesifik olmayan insanlastirilmis bir antikor olan hLL2 kullanilarak etiketlenen bir ile sonuçlanmistir. Ornek 4:Meme kanseri hayvan modelinde klinik öncesi deneyler Tümör hedefleme çalismalari için, 5 ila 8 haftalik disi çiplak farelerde, ~ 2.3 x 107 kültürlenmis MDA-MB-468 hücrelerinin subkütanöz enjeksiyonunda yayilmistir, ve bir ay sonra tümör boyutu ~ 0.1 ila 0.2 cm3 arasina ulastigi zaman kullanilmistir. Fareler, 125l-[IMP-Rxj-hRS7'nin 10 iJCi'Iik bir karisimi ile, burada x = 4, 5 ya da 8, ve l-MAb'ün ila 25 pCi arasinda bir miktari ile i.v. olarak enjekte edilmistir (CT metodu). Bu sayede, her bir deney 125l/131l ile bir çift etiketli deney olmustur. Belirtilen zamanlarda, çesitli organlarda ve kanda biyolojik dagilimlar belirlenmistir ve gram basina enjekte edilen doz yüzdesi olarak ifade edilmistir.125l biyolojik dagilimlarinin tespitinde 131I`nin 125I penceresine geri saçilmasi için düzeltmeler yapilmistir. Terapi çalismalari için, tümörün sürekli büyümesi için en uygun metodu belirlemek üzere çesitli biçimlerde tümör büyüme modelleri incelenmistir. Hedefleme deneyleri için kullanilan metodun, yaklasik 8 haftalik tümör büyümesinden sonra optimal oldugu ve tümör büyüme profillerine dayanarak hayvanlarin % 30 ila 50'sinin kullanilabilecegi sonucuna varilmistir. Terapi çalismalari için, tüm'or tasiyan hayvanlara, 131l-IMPR4-hRS7 ile i.v. olarak enjekte edilmistir, madde incelenmistir ve dogrudan radyo iyodinlestirilmis malzeme 131-l-hRS7 ile karsilastirilmistir. Alt çizgi vücut agirliklari haftalik vücut agirliklari ve tümör hacimlerinin ölçülmesi ile karsilastirilmistir. Tümörler 3 cm3'e ulastiginda hayvanlar feda edilmistir. Tüm hayvan deneyleri, IACUC onayli protokollere uygun olarak yapilmistir. Bu deneyler, çift etiketli hRS7 preparatlari (125I-IMP-Rx-hRS7, burada x = 4, 5 veya 8, her madde, dogrudan etiket 131I-hRS7 ile karistirilarak), NIH Isviçre çiplak farelerinde büyütülen tümörlerde gerçeklestirilmistir. Tablolar 1A, 18 ve 1C, artiklama etiketlerini kullanarak üstün performansi gösteren ayrintili biyolojik dagilimlari açiklarDrnek olarak, 7. günde tümör grami basina % enjekte edilen doz 125I-IMP-R4-hRS7, 125l- olmustur. Ayni zamana ait tümör en alt seviye oranlari, 131-l-hRS7 ile oranlara daha yüksek olmustur (veriler gösterilmemistir). Tablo 1: MDA-MB-468 tümör ksenoqraftlarini tasiyan NlH Isvicre Çiplak farelerinde, ile cift etiketlenmis, insanlastirilmis RS7'nin bivoloiik dagilimlari Tablo 1A: Doku Etiket °/o ID/g ± SD1, n = 5 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ Tablo-1 B: Doku Etiket % lD/g ± 8D1, n = 5 125 _ _ 131i (CT) 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125 _ _ 125i-iiviP- Tablo-1G: 125i-iMR-R8-hRS7 've 131i-hRS? (CT Metodu) Doku Etiket % lD/g ± SD1, n = 5 488 131i(CT) (o17± wn2± (otoîobM mns± 1%HMR 4ß±OJ 38±0A L8±o2 Q7±Q2 Kwmüm' R8 a1±oe &3±Q4 L8±Qz os±o2 1Mucn 125i-iMP- 125i-iMP- 1%"MP' 4 2 1 4 1"HCU 92±1ß 95±Oß &4±L4 ae±oe 1%HMP- 1"HCU 1A+02 OB±03 Q4±Q1 os±o1 125i-iiviP- 125 _ _ AcI RÂ""P 1p±on 9±0A 85±0A 03±OA 125i-iMP- 131l yerine 125I kullanan biyolojik dagilimlara dayanan dozimetri hesaplamalari, Siegel, kullanilarak gerçeklestirilmistir. Tablo 2, artik hale getirme ve geleneksel radyo iyodin etiket setlerini karsilastirmaktadir ve Sekil 10, verileri grafiksel olarak tarif etmektedir. Tümöre ve tümörden tümör olmayanlara verilen doz açisindan optimal bir sekilde gerçeklestirmek için artik verme maddelerinin hepsine bakilmistir; avantajli radyo kimyasal verim ve ayni madde için elde edilebilir aktiviteler bakis açisindan terapi deneyleri için l-IMP-R4-hR87 seçilmistir. Tablo-2: MDA-MB-468 tümör modelindeki çesitli sekillerde radyoiyodinlestirilmis hRS? 'den 'öt'ür'L'i hesaplanmis radyasyon dozlari Kana 1500 cGv 've normalize edilmis cGv Organ Model Grup I Grup II Grup III R4 R5 R8 Çiplak farelerde MDA-MB-468 insan meme karsinomu ksenograftlarinin tedavisi Maksimum tolere edilen doz (MTD): Dozimetri verilerinden (Tablo-2, grup-1), kana bir radyasyon dozu 'üreten, 131I-lMP-R4-hRS7 ve MTD'nin deneysel tespiti, Isviçre çiplak farelerinde her bir maddenin artan dozlari dördüncü haftada `ölürken, 300 uCi doz grubundaki 4 hayvandan 30 2. hafta ila 4. hafta arasinda 'ölmüst'ür, Besinci haftadaki 275 ve 325 pCi doz gruplarindaki hayvanlarin hayatta kalmasinin beklenmedik olmasina ragmen, MTD'nin 231 uCi (dozimetri verilerinden hesaplanan) ve verilen 250 mCi arasinda oldugu sonucuna doz grubundaki alti hayvanin altisi, 370 pCi doz grubundaki alti hayvanin üçü, ve 400 uCi doz grubundaki dört hayvanin dördü ölmüstür. Bunlara dayanarak, MTD'nin 280 ila 310 pCi araliginda oldugu tahmin edilmistir. Terapi Çalismasi-1 Bu birinci terapi deneyi için, 131I-lMPR-4-hRS7'nin etkinliginin, 131l-hRS7'nin (CT metodu) etkinligi ile karsilastirilarak, her bir madde, maksimum tolere edilen dozunun ~ % 70'inde kullanilmistir. Artik verme maddesinin tek bir 175 uCi dozunun, 200 uCi geleneksel radyo iyodin maddesinden önemli ölçüde daha etkili oldugu görülmektedir. Ayni zamanda, tedavi edilmemis kontrolleri de içeren bu deneyde, grup basina 10 ya da 11 hayvan kullanilmistir ve üç grup da baslangiç tümör boyutlari çok benzer olacak sekilde randomize edilmistir. Terapiden önceki üç grup olmustur. Bu deneyde, 49. güne ait ara veriler asagidaki Sekil 11'de gösterilmektedir. Sekil 11'deki 'üst panel, her bir gruptaki tek tek hayvanlar için tümör hacimlerini (cm3) gösterir ve alt panel iki biçimde ortalama tümör hacmini gösterir. Tedavi edilmeyen grupta üç ölüm görülmüstür. Tümör büyüme kontrolü, artik veren etiketleme grubu için, geleneksel etikete ve tedavi edilmemis gruplara kiyasla, ortalama tümör hacimleri (MTV) için egrilerin altindaki alandaki student-t testi ile belirlenen gün 49'a göre anlamli sekilde daha iyidir. 49. günde, 131I-lMP-R4-hRS7 ile yapilan tedaviye bagli olarak MTV'Ierin AUC'larindaki farkliliklar için önem (p degerleri), parantez içinde verilen terapiden (gün -2) önce tümör hacmi farkliliklari için ilgili p degerleri veren radyo iyodin gruplari arasindaki ortalama tümör hacimlerinde 49. günde devam eden farkliliklar vardir, ikincisi ise azalmaya devam eder. Terapi sonrasi 8 haftada, 131I-IMP-R4-hRS7 ile tedavi edilen 11 farenin 5'inde tam gerileme gözlenmistir ve MTV, baslangiç degerinin % 20'si olmustur. Tedavi edilmemis ve 131I-hRS7 ile tedavi edilmis farelerde 8 haftada MTV, sirasi ile 131I-hRS7 grubunda 11 farenin 1'inde tam gerilemesi ile, ilgili baslangiç degerlerinin % 280'i ve % 163'ü olmustur. Tedaviler iyi tolere edilmistir. lMP-R4 grubunun -2. günde ortalama vücut agirligi Kan hücre sayisi ile belirlenen tedavi edilen gruplarin miyelotoksisiteleri Sekil 12'de gösterilmektedir. Kisaca: 131I-lMP-R4-hRS7 ile, WBC, lenfosit ve nötrofil sayimlarinin sirasi ile kontrol seviyelerinin % 34, % 7 ve % 61'i olan en düsük noktalara, maddenin uygulanmasindan bir hafta sonra ulasilmistir. Besinci haftada, bunlar kontrol seviyelerinin sirasi ile % 74, % 58 ve % 92'sine ulasmistir ve 49. günde lenfosit ve nötrofil sayimlarinin kontrol düzeylerinin sirasi ile % 41'i, % 13'ü ve % 67'ü olan en düsük noktalarina maddenin uygulanmasindan bir hafta sonra ulasilmistir. Besinci haftada, bunlar kontrol seviyelerinin sirasi ile % 85, % 67 ve % 103'üne geri dönmüstür ve 49. günde kontrol seviyelerinin % 42, % 32 ve % 49'unda kalmistir. Terapi Çalismasi-2 MDA-MB-468 tümör modelinde 131l-lMP-R4-hRS7 kullanarak RAlT'in Spesifikligi 131I-IMP-R4-hRS7'nin etkinligi, 131l-IMP-R4 ile etiketli spesifik olmayan kontrol insanlastirilmis antikor hLL2 (anti CD-22 MAb) ile karsilastirilmistir. Bu deneyde, her maddeden 175 pCi uygulanmistir. Bu, 131l-IMP-R4-hRS7 maksimum tolere edilen dozunun ~ % 70'ini temsil eder. Tedavi edilmeyen kontrolleri içeren bu deneyde, grup basina 7 ila 8 arasinda hayvan kullanilmistir ve gruplar, terapi deneyi-1'de oldugu gibi baslangiç tümör hacmi dagilimlarina göre randomize edilmistir. Uç grup için (tedavi oncesi MTV: gosteren Sekil 13, büyüme kontrolünün spesifikligini gösterir. Örnek 5: Meme kanseri hastasinin Y-9O insanlastirilmis RS? mAb ve çiplak insanlastirilmis RS? mAb ile tedavisi: Memede tekrar eden adenokarsinom öyküsü olan 56 yasinda bir kadin servikal lenf dügümü ve sol akciger metastazi ile basvurmustur. Kemoterapi ve hormonal terapilerden sonra iki kez tekrarlamistir. Daha sonra, iki hafta ara ile, Y-90 konjuge insanlastirilmis RS7 mAb i.v. olarak, her biri 100 mg'lik bir antikor dozu içinde 20 uCi Y-90 dozunda iki terap'otik enjeksiyon yapilmistir. Terapiden dort hafta sonra beyaz kan hücresi ve trombosit sayilari yaklasik % 50 oraninda azalmis, ancak tedavi sonrasi 9 haftada toparlanmistir. Terapiden 12 hafta sonra yeniden düzenlemede, bilgisayarli tomografi ile pulmoner ve nodal metastazlarda bir ca. % 30 azalma ölçülmüstür. Bundan sonra, her biri 3 saat boyunca olan, bazi geçici zorluk ve titreme disinda ve kan sayimi ya da kan kimyasallari üzerinde olumsuz bir etkisi olmadan, iyi tolere edilen, çiplak insanlastirilmis RS7'den, haftada 4 intüzyon almistir. Her inf'uzyon için çiplak antikor dozu 400 mg/m2 idi. Yaklasik 8 hafta sonra, bilgisayarli tomografi ile yeniden düzenleme, ölçülebilir Iezyonlarda yaklasik yüzde 20 oraninda ek bir azalma oldugunu göstermistir. Uç ay sonra yapilan takip muayenesinde hastaligi stabil görünmüstür (yani ek ya da ilerleyici bir büyüme kaniti yoktur). TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR