TR201901826T4 - Il-4 ve/veya ıl-13'ün ilgili reseptörlerine bağlanmasını inhibe ederek belirli rahatsızlıkların önlenmesi ya da tedavi edilmesi için yöntemler. - Google Patents

Abstract

Mevcut tarifname, IL-4 ve/veya IL-13'ün ilgili reseptörlerine bağlanmasını önleyen bir protein içeren bir bileşimin terapötik olarak etkili miktarıın ihtiyacı olan bir sujeye tatbik edilmesini içeren bir rahatsızlığın tedavi edilmesi, iyileştirilmesi ya da önlenmesi için yöntemler ile ilgilidir. Bazı uygulamalarda, rahatsızlık tercihen Th2 immün yanıtının bir artışı ile ilişkilidir. Bazı uygulamalarda, alerjik astımı, riniti, konjunktiviti, akciğer fibrozunu, sistik fibrozu, kronik obstruktif pulmoner hastalığı, pulmoner alveolar proteinozu ya da yetişkin solunum zorluğu sendromunu tedavi etmek için tatbik tercihen lokal olarak akciğere yapılır.

Description

TARIFNAME IL-4 VE/VEYA IL-139UN ILGILI RESEPTORLERINE BAGLANMASINI INHIBE EDEREK BELIRLI RAHATSIZLIKLARIN ONLENMESI YA DA TEDAVI EDILMESI ICIN YONTEMLER BULUSUN SAHASI Mevcut bulus IL-4 ve/Veya IL-l3°ün ilgili reseptörlerine baglanmasini inhibe edebilen bir insan gözyasi lipokalin muteinini ya da bunun bir fragmanini ya da bir füzyon proteinini ya da konjugatini içeren, bir süjedeki bir rahatsizligi tedavi etme, iyilestirme ya da önleme yönteminde kullanilmak üzere bir bilesim ile ilgilidir, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani süjede bir in Vivo terapötik aktiviteyi sergileyebilir ve in VIVO insan IL-l3 indüklemeli transkripti Cclll (eotaksin) inhibe edebilir, burada adi geçen lipokalin inuteini ya da fragmani olgun insan gözyasi lipokalininin amino asit sekansi ile en az %75 sekans özdesligine sahiptir (SEK.KIM.NOII), burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani, olgun insan gözyasi lipokalininin (SEK.KIM.NO: l) dogrusal polipeptid sekansinin 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104- 106 ve 108 pozisyonuna karsilik gelen amino asit pozisyonlarinda SEK.KIM.NO: 6”da ifade edilenlerle ayni amino asitlere sahiptir ve burada lipokalin muteininin fragmani, adi geçen lipokalin muteinine kiyasla N-ucu ve/Veya C-ucu amino asitlerinden en az birini içermez.

Bazi uygulamalarda, rahatsizlik tercihen Th2 immün yanitiniii bir artisi ile iliskilendirilmistir. Bazi uygulamalarda, alerjik astimi, riniti, konjunktiviti, akciger fibrozunu, sistik fibrozu, kronik obstruktif pulmoner hastaligi, pulmoner alveolar proteinozu ya da yetiskin solunum zorlugu sendromunu tedavi etmek için tatbik tercihen lokal olarak akcigere yapilir.

ARKA PLAN Kovalent olmayan etkilesim yoluyla seçilmis hedeflere seçici olarak baglanan proteinler, biyoteknolojideki, tiptaki, biyoanalitikteki ve ayrica genel olarak biyoloji ve yasam bilimlerindeki reaktifler olarak önemli bir rol oynar. Antikorlar, yani immünoglobülinler, bu protein sinifinin baskin bir örnegidir. Ligandlarin/hedeflerin taninmasi, baglanmasi ve/Veya ayrilmasi ile baglantili olarak bu tip proteinlere manifold olarak duyulan ihtiyaçlara ragmen, günümüzde neredeyse inhisari olarak immünoglobülinler kullanilir.

Antikor benzeri fonksiyonlara sahip olan ilave protein baglama molekülleri lipokalin familyasinin üyeleridir ve dogal olarak ligandlari baglamak 'uzere evrimlesmistir. Lipokalinler, vertebratlar, böcekler, bitkiler ve bakteriler dahil olmak üzere birçok organizmada meydana gelir. Lipokalin protein familyasinin üyeleri (Pervaiz, S., & BreW, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) tipik olarak küçük, salimli proteinlerdir ve tek bir polipeptid zincirine sahiptir. Bunlar çok çesitli farkli moleküler tanima özellikleri: yani çesitli, esasen hidrofobik moleküllere (örnegin retinoitlere, yag asitlerine, kolesterollere, prostaglandinlere, biliverdinlere, feromonlara, tastantlara ve koku vericilere) baglanma kabiliyetleri, spesifik hücre yüzeyi reseptörlerine baglanmalari ve makromoleküler kompleksler meydana getirmeleri ile karakterize edilir. Bunlar geçmiste esasen nakil proteinleri olarak siniflandirilmis olmalarina ragmen, günümüzde lipokalinlerin çok çesitli fizyolojik fonksiyonlari yerine getirdigi asikardir. Bunlar arasinda retinol nakli, koklama duyusu, feromon sinyallesmesi ve prostaglandinlerin sentezi yer alir. Lipokalinler de ayni zamanda immün yanitin düzenlenmesinde ve hücre homeostazinin araciliginda endike olinustur (örnegin Flower, DK (1996) Biochem. J. 318, 1-14 ve Flower, D.R. ve digerleri (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9- 24”de incelenmistir). Löfblom ve digerleri Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22:843-848 antikorlar için potansiyel alternatifler olarak inimünoglobülin harici bazli protein iskelelerini açiklar.

Lipokalinler siklikla %20°den daha düsük sekans özdesliklerine sahip olan genel sekans korumasi için olagan disi düsük seviyeleri paylasir.

Tam aksine, bunlarin genel katlama sablonu yüksek oranda muhafaza edilir. Lipokalin yapisinin merkezi kismi, devamli olarak hidrojene bagli bir ß-Varilini meydana getirmek için kendi üzerine geri kapatilan tek bir sekiz çizgili antiparalel ß-yapragindan meydana gelir. Bu ß- Varili merkezi bir boslugu meydana getirir. Varilin bir ucu, tabani boyunca ilerleyen N-ucu peptit segmenti ve ayrica ß-dizilerini birlestiren üç peptit döngüsü tarafindan sterik olarak bloke edilir. B- varilinin diger ucu çözücüye açiktir ve dört esnek peptit döngüsü tarafindan meydana getirilen bir hedef baglayici alani kapsar.

Döngülerin bu çesitliligi baska türlü esnek olmayan lipokaliii iskelesinde her biri farkli boyut, sekil ve kimyasal karaktere sahip hedefleri içerebilen çok çesitli farkli baglama modlarini saglar (Örnegin Flower, D.R. (1996), yukarida; Flower, D.R. ve digerleri (2000), yukarida, ya da Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350 tarafindan incelenmistir). Çesitli PCT yayinlari (ömegin, WC 99/ 16873, WO 00/75308, WO 03/029463, WO 03/029471 ve WO 2005/ 19256) çesitli lipokalinlerin (örnegin gözyasi lipokalini ve hNGAL lipokalini) muteinleriniii, bir dogal tip lipokaliniii bir dogal ligandindan farkli bir hedefe karsi yüksek afinite ve spesifisite sergilemek üzere nasil yapilandirilabildigini açiklar. Bu örnegin, dört peptit döngüsünden en az birinin bir ya da daha fazla amino asit pozisyonuna inutasyon uygulayarak yapilabilir. Ilaveten, PCT yayini WO 2008/015239 IL-4 alfa reseptörüne baglanan lipokalin muteinlerini ögretir. Ilaveten, PCT yayini WO 2011/ 154420 IL-4 alfa reseptörü alt ünitesine baglanan lipokalin muteinlerini üretinek için bir ya da daha fazla yöntemi ögretir. Ilaveten, Holbaum ve digerleri, Inflamniation Research, 2011 cilt 60, no. ek 1, sayfalar 82-83 IL-4Ra”ya baglanan insan gözyasi lipokalininin bir inuteinini açiklar.

Th2 sitokinleri lL-4 (resmi olarak lnterlökin-4, Uniprot #P051 l2 olarak bilinir) ve IL-13 (resmi olarak Interlökin-13, Uniprot #P35225 olarak bilinir) büyük oranda üst üste binine fonksiyonlarina sahiptir ve eozinofili, goblet hücresi metaplazisi, hava yolu hiper cevapliligi, IgE immünoglobülin degisimi, alternatif makrofaj aktivasyonu, düz kas hücresi yeniden modellemesi ve subepitelyal fibroz dahil olmak üzere astimin birçok kilit özelligini dogrudan destekler. Dahasi, (resmi olarak lnterlökin-4 reseptörü alt birim alfa, Uniprot #P24394, SEKKIMNO: '12 olarak bilinen) lL-4, lL-13, lL-4RA genlerindeki ve Stat6”daki genetik polimorfizm Astim ile baglantilidir. IL-4, IL-13, IL-4RA ve Stat6°nin alelik varyantinin kombinasyonu sinerjik olarak göründügü ve IL-4, IL-13 ve IL-4RAsdaki açiklanan polimorfizm Th2 sitokinlerinin ya da IL-4/IL-13 reseptörünün ortak alt biriminin üretimini, fonksiyonunu ya da siiiyallesme aktivitesini arttirdigi için 'Özellikle ilgilidir (Finkelman ve digerleri II, 2010, 184:1663-74). Son zamanlarda, astim endotipleri ya da alt fenotipler moleküler mekanizma ya da tedavi yaniti tarafindan tanimlanmistir. Woodruff et al örnegin, astim fenotiplerini IL-13-indüklenebi1ir genlerinin POSTN (periostin), CLCA] (gob5) ve SERPINBZ akciger epiteliyal ekspresyonuna dayanarak Th2-yi'iksek ve Th2-düsük olarak tanimlamistir (Wooddruff PG ve digerleri, Genome-Wide profiling identifies epithelial cell genes associated With asthma and With treatment response to corticosteroids PNAS, 2007, 104: 15858-63; Prescott G. Woodruff) (T-helper Type 2-driven inflammation defines major subphenotypes of Asthma, Am.J. ReSpir.Citi.Care Med., 2009, 180z388-395). Moore ve digerleri, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002 , 282:L847-L835 IL-13 ve lL-4°ün insan hava yolu düz kas hücrelerinde eotaksin salinimina sebep oldugunu açiklar. Fiset ve digerleri, J allergy Clin lmmunol, 2003, 111 (3):580-586 lL-4 için aiitisens oligodeoksinükleotitleri tarafindan burun mukozasinda alerjik yanitin modülasyonunu açiklar. Walker ve digerleri, Immunology, 2009, 127z256-266, STAT6°nin RNA enterferansinin akciger epitelyal hücreleriiideki devam eden interlökin-13-arac111 vakalari hafiflettigini açiklar. Terada ve digerleri, PNAS, 2006, 103(23): 8816-8821 IL- 18'in farelerde Staphylococcus aureus ürünü tarafindan indüklenen atopik-dermatit-benzeri deri enflamasyonuna katkida bulundugunu açiklar. Cowden ve digerleri, Respiratory Research, 2010, 11:86 histainin H4 reseptör antagonizminin Th2 sitokinlerinin modülasyonu vasitasiyla mevcut havayolu enflamasyonunu ve fonksiyon bozuklugunu azalttigini açiklar.

Bu nedenle, yüksek baglanma afinitesi ile IL-4RA°ya baglanan ve bu nedenle IL-4”ün ve/veya IL-l3”ün ilgili reseptörlerine baglanmasini inhibe eden insan gözyasi lipokalininin muteinlerini içeren ve ihtiyaci olan bir süjede in vivo terapötik aktiviteler sergileyen bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarini içeren iyilestirilmis terapötik yöntemlere sahip oluninasi tercih edilecektir Mevcut basvuruda kullanildigi zaman, bilesime ihtiyaci olan bir süje bir rahatsizligin tedavi edilmesine ya da Önlenmesine ihtiyaci olan bir memeli olabilir yani birkaç açiklayici örnek vermek gerekirse bir insan, bir köpek, bir fare, bir siçan, bir domuz, bir maymun yani bir sinoniolgus olabilir.

AÇIKLAMANIN OZETI

[0009] Mevcut tarifiiame lL-4 ve/veya lL-13”üii ilgili reseptörlerine baglanmasini iiihibe edebilen bir insan gözyasi lipokalin muteinini ya da bunun bir fragmanini ya da bir füzyon proteinini ya da kon jugatini içeren, bir süjedeki bir rahatsizligi tedavi etme, iyilestirme ya da önleme yönteminde kullanilmak üzere bir bilesim ile ilgilidir, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani sü jede bir in vivo terapötik aktiviteyi sergileyebilir ve in vivo insan IL-l3 indüklemeli transkripti Cclll (eotaksin) inhibe edebilir, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani olgun insan gözyasi lipokalininin amino asit sekansi ile en az %75 sekans özdesligine sahiptir (SEK.KIM.NO:1), burada adi geçen lipokalin inuteiiii ya da fragmani, olgun insan gözyasi lipokalininin (SEK.KIM.NO: l) dogrusal polipeptid sekansinin 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104- 106 ve 108 pozisyonuna karsilik gelen amino asit pozisyonlarmda SEK.KIM.NO: 6°da ifade edilenlerle ayni amiiio asitlere sahiptir ve burada lipokalin muteininin fragmani, adi geçen lipokalin muteinine kiyasla N-ucu ve/veya C-ucu amino asitlerinden en az birini içermez.

Bazi baska uygulamalarda, lipokalin muteini, IL-4 ve/veya IL-13 tarafindan indüklenen asagi akisi sinyallesmesini ve/veya hücresel yanitlari bozabilir. Çesitli uygulamalarda, rahatsizlik, IL4/IL13 yolunun hastalik patojenezine katkida bulundugu bir rahatsizliktir. Çesitli baska uygulamalarda, bilesim akcigere lokal olarak tatbik edilebilir. Çesitli tercih edilen uygulamalarda, bilesim aerosol inhalasyonu vasitasiyla tatbik edilebilir. Yine bazi baska uygulamalarda, bilesiin günde dört kereye kadar, günde 'üç kereye kadar, günde iki kereye kadar, günde bir kereye kadar, iki günde bir kereye kadar, üç günde bir kereye kadar, haftada bir kereye kadar ve iki haftada bir kereye kadar meydana gelen gruptan seçilen bir siklikta ihtiyaci olan bir süjeye tatbik edilir.

Bazi uygulamalarda, mevcut basvuruda kullanildigi zaman bu bilesime ihtiyaci olan bir suje, IL-4 ekspresyonunun ve/veya IL-l3 ekspresyonunun katkida bulundugu ya da hastalik patojenezi ya da agravasyonu ile ilgili oldugu bir rahatsizliktan müzdariptir. Bazi uygulamalarda bu bilesime ihtiyaci olan bir suje, IL-4 aktivitesinin ve/veya IL-13 aktivitesinin uzaklastirilmasi, inhibisyonu ya da azaltilmasi ile gelistirilebilen, iyilestirilebilen ya da inhibe edilebilen bir rahatsizliktan müzdariptir. Bazi baska uygulamalarda, bu bilesime ihtiyaci olan bir suje örnegin alerjik enflamasyonu, alerjik astiini, riniti, konjunktiviti, akciger fibrozunu, sistik fibrozu, kronik obstruktif pulmoner hastaligi, pulmoner alveolar proteinozu ya da yetiskin solunum zorlugu sendromunu içeren bir ya da daha fazla rahatsizliktan muzdarip olabilir. Ayni zamanda tarifnamenin lipokalin muteininin bazi uygulamalarda doku fibrozunun tedavisi, iyilestirilmesi ya da 'Önlenmesi için tatbik edilmesi de düsünülmüstür (bakiniz Chiarainonte ve digerleri (1999), I. Clin. Invest. 104(6), 777- 785). Fibroz tercihen bir yaranin örnegin bir cerrahi kesikten kaynaklanan bir yaranin iyilesmesinden kaynaklanabilir. Doku fibrozu, örnegin, karacigerden, deri epidermisinden, deri endodermisinden, kastan, tendondan, kikirdaktan, kardiyak dokudan, pankreatik dokudan, akciger dokusundan, rahim dokusundan, n'oral dokudan, testisten, yumurtaliktan, böbreküstü bezinden, atar damardan, damardan, kalin bagirsaktan, ince bagirsaktan, safra yolundan ve guttan meydana gelen gruptan seçilen bir dokuyu etkiler ancak burada doku 'ozellikle akcigerden ve karacigerden seçilir. Örnegin, tarifnamenin bir yöntemi ile tercihen tedavi edilebilen, iyilestirilebilen ya da önlenebilen bir rahatsizlik, Th2 immün yanitinin bir artisi ile iliskilendirilmistir.

Bazi uygulamalarda, rahatsizlik bir alerjik reaksiyon ya da bir alerjik enflamasyon ile iliskilendirilebilir, tercihen alerjik reaksiyon bir gida alerjisidir ve tercihen alerjik enflamasyon alerjik astim, rinit, konjunktivit ya da derinatit ile iliskilidir. Tercih edilen çesitli uygulamalarda, alerjik alerjik astim, 1L4/1L13 yolunun hastalik patojenezine katkida bulundugu bir hava yolu iltihaplanmasi olabilir.

Diger tercihen edilen uygulamalarda, tarifnamenin bilesimi ayrica bir anti-alerjik ilaci ve/Veya bir anti-alerjik enflamasyon ilacini içerir.

Tarifnamenin bir yöntemi ile tercihen tedavi edilebilen, iyilestirilebilen ya da önlenebilen baska bir örnek bir rahatsizlik, bir mukus üretimi ya da bir mukus salgilainasi ile iliskilendirilmistir, Çesitli tercih edilen uygulamalarda, rahatsizlik bir akciger rahatsizligi olabilir ve tercihen bir kronik obstruktif pulmoner hastaligi (COPD) ya da sistik fibroz (CF) olabilir.

Burada tarif edildigi gibi, adi geçen bilesim çesitli açiklanmis rahatsizliklar için bir gen terapisi ajani olarak kullanilabilir.

Tarifnamenin bir lipokalin muteini, yetiskin insan gözyasi lipokalininin linear polipeptit sekansinda pozisyon 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 ve 108”e karsilik gelen bir pozisyonda herhangi bir ya da daha fazla amino asite inutasyona ugramis bir ainino asite sahip olan bir insan gözyasi lipokalin muteini olabilir. Bununla birlikte, tarifnainenin lipokalin muteini ayni zamanda insan NGAL lipokalini ya da burada tarif edilen diger lipokalinler gibi insan gözyasi lipokalininden baska bir lipokalin muteini de olabilir. Çesitli örneklerde, burada açiklanan lipokalin muteini, yetiskin insan gözyasi lipokalininin linear polipeptit sekansinin 26, 32, 34, 55, 56, 58 ve 63.pozisy0nuna karsilik gelen bir pozisyonda iki ya da daha fazla amino asitten herhangi birine sahiptir.

Burada tarif edilen lipokalin inuteini, özellikle tercih edilen bir uygulamada, yetiskin insan gözyasi lipokalininin sekansi ile en az %75 özdeslige sahiptir (SEK. KIM. NO: 1).

Mevcut tarifnamenin yöntemlerinde uygulanan bir lipokalin muteini tercihen baska bir tür, örnegin inarinoset lL-4RA ile çapraz reaktif olup, bu durum insan organizmasina benzeyen inarinoset maymunlarindaki o zamanki aday lipokalin muteininin test edilmesine izin verir. Lipokalin niuteini, fare IL-4RA”s1 ve/Veya sinomolgus IL- 4RA°si gibi diger insan disi türlerden alinan IL-4RA ile çapraz reaktif olabilir ya da olmayabilir.

Genel olarak lipokalin muteininin bir ilgili protein ya da ilgisiz protein ile esasen çapraz reaktif olmamasi tercih edilir. Adi geçen ilgili protein örnegin bir lL-23 reseptörü alfa zinciridir ve/Veya fibronektin tip III domainine sahip tip I sitokin reseptör'ûdür ancak adi geçen ilgisiz protein örnegin bir IL-6 reseptörü ve/Veya IL-18 reseptör'u alfa zinciridir.

SEKILLERIN TARIFI Sekil 1 tarifnamenin bir lipokalin muteini tarafindan TF-l hücrelerindeki insan IL-4 ve IL-13 indüklü STAT 6 fosforilasyonunun (FACS-bazli miktar tayini) inhibisyonunu tarif eder.

Sekil 2 tarifnainenin bir lipokalin inuteini tarafindan insan lL-4RA / IL-l3RAl (resmi olarak Interl'okin-13 reseptör'u alt birimi alfa-1, Uniprot #P78552, SEK. KIM. NO: 13 olarak bilinir) Zincirli çift uygulamali farelerde nsan IL-4 indüklü STAT 6 fosforilasyonunun (FACS-bazli miktar tayini) inhibisyonunu tarif eder.

Sekil 3 tarifnamenin bir lipokalin muteini tarafindan insan lL-4 reseptör'û alfa/IL-l3 reseptörü alfa 1 Zincirli çift uygulainali farelerin akciger dokusunda insan IL-13 indükli'i eotaksinin inhibisyonunu betimler.

Sekil 4 insan lL-il3°ünün tatbikinden önce ve ayrica farkli doz seviyelerinde bir IL-4 mutantina kiyasla (Sekil 4G) farkli zaman araliklarinda (Sekil 4a) ya da farkli dozlarda (Sekil 4b) tatbik edildigi zaman tarifnamenin bir lipokalin muteini tarafindan insan IL-4 reseptörû alfa/IL-l3 reseptörü alfa l zincirli çift uygulamali farelerin akciger dokusunda insan IL-13 indüklü eotaksinin inhibisyonunu betimler.

Sekil 5 büyüklük dislaniinli kromatografi ve lazer difraksiyonu ile bir nebulize edilmis lipokalin muteininin analizini betimler.

Sekil 6 intratrakeal damlatina sonrasinda insan lL-4RA/insan lL-l3 çift uygulamali farelerde tarifnamenin bir lipokalin inuteininin farinakokinetik özelliklerini ve biyodagilimini betimler.

Sekil 7 tarifnameiiin bir lipokalin muteini tarafindan insan havayolu epitelyum hava-sivi-ara yüzü kültüründe IL-l3 indüklü goblet hücresi metaplazisinin inhibisyonunu betimler.

DETAYLI TARIFNAME Mevcut tarifname 1L-4 ve/veya lL-l3”ün ilgili reseptörlerine baglaninasini inhibe edebilen bir insan gözyasi lipokalin muteinini ya da bunun bir fragmanini ya da bir füzyon proteinini ya da kon jugatini içeren, bir süjedeki bir rahatsizligi tedavi etme, iyilestirme ya da önleme yönteminde kullanilmak 'üzere bir bilesim saglar, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani süjede bir in VIVO terapötik aktiviteyi sergileyebilir ve in vivo insan IL-l3 indüklemeli transkripti Cell 'l (eotaksin) inhibe edebilir, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani olgun insan gözyasi lipokalininin amino asit sekansi ile en az %75 sekans özdesligine sahiptir (SEK.KIM.NO:1), burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani, olgun insan gözyasi lipokalininin (SEK.KIM.NO: 1) dogrusal polipeptid sekansinin 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104- 106 ve 108 pozisyonuna karsilik gelen amino asit pozisyonlarinda SEK.KIM.NO: 6'da ifade edilenlerle ayni ainino asitlere sahiptir ve burada lipokalin muteininin fragmani, adi geçen lipokalin muteinine kiyasla N-ucu ve/veya C-ucu amino asitlerinden en az birini içermez.

Mevcut tarifnameye uygun olarak kullanilmak üzere bir lipokalin muteini spesifik olarak IL-4 reseptörü alfa zincirine baglanabilir.

Avantajli olarak, bu lipokalin muteinleri IL-4 reseptörü alfa zinciri için yüksek bir baglanma afinitesine sahiptir. Bu lipokalin muteinleri WO 2008/015239 patentinde saglanan lipokalin muteiiileri ile ilgili IL-4 reseptöri'i alfa için daha da iyilestirilmis baglanma özelliklerine sahiptir; özellikle, daha yüksek bir baglanma afinitesine sahiptir.

Mevcut mucitler, mevcut bulusun lipokalin muteinlerinin, IL-4 reseptör'û alfa zincirine baglanmalari nedeniyle in vivo olarak bir terapötik yaniti açiga çikaracak sekilde reseptörlerin es asilli ligandlarinin yani sitokin(ler) IL-4 ve/Veya IL-l3s'ûn etkilesimini engelledigini göstermistir. Örnegin tarifnamenin lipokalin muteinlerinin IL-4 ve/Veya IL-13 aracili sinyallesmesi üzerinde sahip olabilecekleri etkileri arastirmak için kullanilinis olan bir transgenik fare modelinden alinan veriler IL-4 ve IL-13 tarafindan aracilik edilen asagi akis sinyallesmesinde bir bozulma gösterir. Farelerin insan IL-4 reseptörü alfa zincirini ve 1L-l3 reseptörü alfa 1 zincirini kodlayan genleri tasimasi bakimindan bir insana benzeyen transgenik fare, insanlardaki terap'otik potansiyeli temsil eder. Bu bakimdan insan genleri, ilgili fare kroinozomunun karsilik gelen lokuslarinda yer alir Ve böylece farenin hem tip I hem de tip II reseptörlerini eksprese eden bir çift uygulamali fare olinasini saglar. Bu nedenle, burada kullanildigi zaman “terapötik olarak etkili bir miktar” tercihen bir insanda terapötik olarak etkili olan mevcut tarifnamenin bir lipokalin muteininin bir miktaridir.

Tarifnamenin Orneklerinin tam aksine, önceki teknik, teknikte uzman kisilere tarifnamenin bir lipokalin muteininin süjelerdeki lL-4 ve/Veya IL-l3 tarafiiidan indüklenen asagi akis sinyallesniesini ya da hücresel yanitlarini bozma kapasitesine ve/veya alerjik enflamasyon, alerjik astim, rinit, konjunktivit, akciger fibrozu, sistik fibroz, kronik obstruktif pulmoner hastalik, pulmoner alveolar proteinoz ya da yetiskin solunum zorlugu sendromu gibi bir ya da daha fazla rahatsizliktan inuzdarip olan süjelerde bir in vivo terapötik aktivite sergileme kapasitesine sahip olup olmadigini ögretmez. Bu rahatsizliklara karsi lipokalin muteinlerinin etkililigi hakkindaki hiçbir bilgi `Önceki teknikten türetileinez. Örnegin Th2 immün yanitinin bir artisi ve/veya bir alerjik reaksiyon ya da bir alerjik enflamasyon ile iliskili rahatsizliklara karsi bir lipokalin muteininin bir terap'otik etkisini gösteren herhangi bir veri olmadiginda, bu terap'otik etki ve karsilik gelen tedavi, önleme ya da iyilestirme yöntemleri makul olarak beklenmeyecektir.

Aslinda mevcut tarifname, 'Örnegin mevcut bulusun lipokalin muteinlerinin anti-enflamatuar etkisini gösteren burada tarif edilen lipokalin muteinlerinin bir terapötik etkisini gösteren in vivo verileri saglar. Bu bakimdan, mevcut tarifname, ilk kez, tarifnamenin bir lipokalin inuteiiiinin (SEK.KIM.NO:6) IL-l3 indükl'û transkripti Cclll (eotaksin) etkili olarak in vivo olarak inhibe edebildigini ve esasen Ornek 5°te tarif edilen bir test ile ölçüldûgü gibi bir IL-4 mutantindan (Sekil 4c”de IL-4 (R121D, Y124D)) daha güçlü oldugunu göstermektedir. o 30u1°lik IL-l3 (Peprotech, lug)'nin sadece bir kez intratrakeal damlatma yoluyla tatbik edilmesi haricinde, Ornek 4'te tarif edildigi gibi birçok insan IL-4 reseptör'u alfa/insan IL-13 reseptör'û alfa zinciri 1 çift uygulamali farenin hazirlanmasi, o opsiyonel olarak, test parametrelerinin Ornek 5”te tarif edildigi gibi ayarlanmasi ve farelerin uygun sekilde gruplandirilmasi, o IL-l3 dozu öncesinde farkli zamanlarda 98ug”lik sabit bir dozda ya da IL-l3 dozundan 30 dakika önce farkli iniktarlarda 30ul°lik bir hacim ile intratrakeal damlatma yoluyla lipokalin muteininin (SEK.KIM.NO:6) tatbik edilmesi, o yine IL-l3 dozundan 30 dakika önce farkli miktarlarda 30ul°lik bir hacim ile intratrakeal damlatma yoluyla IL-4 mutantinin (R121D, Y 124D) tatbik edilmesi, o farmakolojik yanitin süresinin, doz bagimliliginin ve kiyaslanabilir potensin degerlendirilmesi için kisaltilmis IL-l3 indüklü havayolu enflamasyon modelinin (tekli IL-l3 intratrakeal tatbikin) kullanilmasi.

Bu yüzden, insan ortologlarinin varligi ve maymun ortologlarinin yoklugu göz önüne alindiginda mevcut tarifnamede tatbik edilen maymun hayvan modeli üzerinde gözlemlenen terapötik etki, terap'otik bir tatbikin yeterli kanitini saglar. Bu ilkeye dayanarak, insan hastalar hakkindaki herhangi bir verinin yoklugunda, in vivo deneylerin insanlarda burada tarif edilen lipokalin muteinlerinin in vivo aktivitesini, örnegin in vivo anti-enflamatuar aktivitesini tahmin etmek için yeterli olmasi oldukça makuldur.

Ilaveten, mevcut tarifname, bulusun bir lipokalin muteininin (SEK.KIM.NO:6), esasen Ornek 8°de tarif edilen bir test ile Ölçüldügü gibi, Ornek 8°de açiklanan bir anti-IL-4RA monoklonal antikoru (Sekil 7”de anti-lL4R mAb; sirasiyla SEK.KIM.NO: 14 ve 15”te gösterilen hafif ve agir zincir degisken bölgesi) kadar iyi bir fonksiyonel aktiviteyi sergileyebildigini gösterir. o yaklasik 0.3 ila 30 ng/ml°lik insan IL-l3°ü ile iki günde bir MucilAirTWnin (birincil insan hücreleri kullanilarak in vitro olarak sulandirilan insan havayolu epitelyumuna sahip bir hava-sivi arayüzü kültür sisteminin) inuamele edilmesi, o opsiyonel olarak, Alcain mavi boyamanin (mavi ila maviinsi yesil renkte boya asit mukopolisakkaritleri ve glikosaminoglikanlari ile boyamanin) yerinde gerçeklestirilmesi ve/veya MucilAirTWnin yaklasik 14 günlük tedavi sonrasinda artmis bir goblet hücresi yogunlugu gösterdigini kanitlamak içiii histolojik analizin gerçeklestirilmesi, o MucilAirTM”11in pozitif kontrol olarak 14 gün boyunca yaklasik ng/ml'lik insan IL-13°üne, IL-13 arti bir lipokalin muteininin farkli konsantrasyonlarina, IL-l3 alti adi geçen anti-IL-4RA monoklonal antikorunun farkli konsantrasyonlarina (hafif ve agir zincir degisken bölgeleri SEK. KIM. NO: 14 ve 153te gösterilir) ve negatif kontrol olarak lL-l3 olmadan 14 gün boyunca kültürlenen MucilAirTWye devamli olarak maruz kalmasini kiyaslayarak goblet hücresi metaplazisi üzerinde bir lipokalin muteininin inhibitör etkisi test edilir, 0 bir Alcain mavi boyainasi gerçeklestirilir, 'Örnegin bir yerinde boyama için apikal yüzeye Alcain mavi boyasi eklenir ve görüntü analizi için bir faz kontrast mikroskopu altinda boyanmis hücrelerden resimler çekilir, 0 kamu domaini Java görüntü isleme programi Image] ile Alcain mavi pozitif hücrelerin yüzdesi için miktar tayini yapilir ve Alcain mavi alani/toplam görüntü alani orani olarak bunlarin sayisi eksprese edilir, 0 opsiyonel olarak, ömegin Meso Scale Discovery°den alinan piyasada mevcut olan ultra hassas eotaksin-3 Kiti kullanilarak 14.günde bazal vasat içindeki eotaksin-3 (bir IL-13 indüklü kemokin) ölçülür.

Adi geçen anti-lL-4RA antikoru, sirasiyla SEK. KIM. NO: 14 ve ”in degisken hafif ve agir zincir bölgelerine sahiptir ve Aingen (former Immunex) tarafindan gelistirilmistir ve AMG 317 adi verilmistir. Astimda bir rol oynayan interlökin-4 ve interlökin-13 aksiyonlarini bloke etme kabiliyeti bakimindan arastirma altinda olan tamainen bir insan monoklonal antikorudur (2008”de orta ila siddetli astim için bir faz 2 doz araligi çalismasi tamamlanmistir). Geçici bir analiz biyolojik aktivite kaniti göstermistir; ancak, genel klinik etkililik beklentileri karsilamamistir. Bu yüzden, yukarida tarif edildigi gibi adi geçen anti-lL-4RA antikoru ile lipokalin inuteininin kiyaslamasi yapildigi zaman SEK.KIM.NO: 6°nin lipokalin muteini, IL-l3 indüklü goblet hücresi metaplazisiiii burada tarif edilen anti-IL- 4RA monoklonal antikoru kadar iyi bir sekilde inhibe edebilmistir. Bu nedenle bazi uygulamalarda, tarifnamenin bir lipokalin muteininin yukarida tarif edilen testte, goblet hücresi metaplazisinin inhibisyonu bakimindan SEK.KIM.NO: 6snin lipokalin muteini ile ayni özelliklere sahip olmasi tercih edilir.

IL-4/ lL-4R0t kompleksi ortak gama zinciri (ye, CD132) ya da IL- 13Ra1fal (IL-13R0t1) alt birimi ile IL-4 üzerindeki domainler vasitasiyla dimerize olabilir böylece sirasiyla Tip I ve Tip II reseptörleri olarak atif edilen iki farkli sinyallesine kompleksini meydana getirir. Alternatif olarak, IL-l3 ile IL-13Ral birlesebilir ve bir Tip II reseptör kompleksini meydana getirmek için IL-4R0t alt birimini içeren bir IL-13/IL-13R0tl kompleksi meydana getirebilir. Bu yüzden, IL-4R0t hem IL-4 hem de IL-13”ün biyolojik aktivitelerine aracilik eder (inceleyen Gessner ve digerleri, Immunobiology, 201285, 2000). Mevcut tarifnamenin lipokalin muteinleri avantajli olarak, Tip I ve/veya Tip 1] reseptörleri vasitasiyla sinyallesmeyi engeller ve/veya bloke eder çünkü bu lipokalin inuteinleri IL-4 reseptörü alfa zincirine baglanabilir.

In vitro çalismalar IL-4 ve IL-l3'ün çok sayida hücre tipinde, örnegin T hücrelerinde, B hücrelerinde, eozinofillerde, mast hücrelerinde, bazofillerde, hava yolu düz kas hücrelerinde, solunuin epitelyal hücrelerinde, akciger fibroblastlarinda ve endoteliyal hücrelerde efektör fonksiyonlari aktive ettigini göstermistir (inceleyen Steinke ve digerleri, Resp Res, 2:66, 200] ve Willis-Karp, linmunol Rev, 202: 175, 2004). IL-4ROL, örnegin periferal kan T hücreleri, monositler, havayolu epitel hücreleri, B hücreleri ve akciger fibroblastlari gibi çok çesitli hücre türleri üzerinde düsük sayilarda eksprese edilir (100-5000 molekül/hücre) (Lowenthal ve digerleri, J Iinmunol, l40:456, 1988).

Tip I reseptörü hematopoietik hücrelerde baskindir ancak tip II reseptör, hein heinatopoietik hücrelerde hem de heinatopoietik olmayan hücrelerde ekSprese edilir.

Hücre yüzeyi reseptörleri ve reseptör kompleksleri IL-4 ve/veya IL- 13”ü farkli afinitelerle baglar. IL-4 ve/veya IL-13”ü baglayan reseptörlerin ve reseptör komplekslerinin ana bilesenleri IL-4Roi, IL- 13ROtl ve IL-13R(12”dir. Bu Zincirler hücrelerin yüzeyi üzerinde IL- 4ROL/IL-13R0tl ya da IL-4Ra/IL-13Ra2°nin monoinerleri ya da heterodimerleri olarak eksprese edilir. IL-4l`0. monomeri IL-4”ü baglar ancak IL-l3°ü baglamaz. IL-13R0tl ve IL-l3ROL2 monomerleri IL- 13°ü baglar ancak IL-4”ü baglamaz. IL-4R0i/IL-13R0LI ve IL-4R0L/IL- 13R(12 heterodimerleri hem IL-4,ü hem de IL-l3”ü baglar. IL-l3 reseptör alfa 2 (IL-13Ralfa2)'nin lL-l3°ü yüksek afinite ile baglainasi ancak IL-'l 3 için bir sahte reseptör olduguna inanilan bir sinyallesmeyen reseptör olmasi nedeniyle, inevcut tarifnamenin lipokalin muteinlerinin IL-13 reseptör alfa 27ye tercihen baglanmadigi düsünülür.

Açiklandigi gibi, IL-4R0i vasitasiyla IL-4 ve IL-13 tip I (IL-4R0L ve yc) ve tip II reseptörlerinin (IL-4R0t ve IL-13R0il) bir bileseni vasitasiyla sinyal verir. IL-4, tip I ve II reseptör yollarinin her ikisi vasitasiyla sinyal verir ancak IL-13 sadece tip II IL-4R vasitasiyla sinyal verir. lL-13 ayni zainanda bir trans-inembran-sinyallesme domainini içermeyen IL-13ROL2 zincirine baglanir ve bir sahte reseptör olarak hareket ettigi düsünülür. yc janus kiiiazini (J AK)3 aktive eder ancaks IL-13R0r1 tirozin kinaz 2 (TYK2) ve JAK2”yi aktive eder. Ardindan aktive edilen JAK°lar, STAT-6°y1 fosforiller. Fosforillenmis STAT-6 dimerize olur, çekirdege tasinir ve T-yardimci tip 2 (Th2) hücre farklilasmasi, havayolu enflamasyonu, havayolu hiper-duyarlilik (AHR) ve mukus üretimi ile iliskili olanlar gibi IL-4 ve IL-l3 duyarli genlerinin baslaticilarina baglanir.

Th2-tip immün yanitlari antikor üretimini ve hüinoral immüniteyi destekler ve ekstrasellüler patojenlerle savasmalari için incelikle islenmistir. Th2 hücreleri Ig üretiminin (hümoral immünitenin) aracilaridir ve IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 ve IL- 13”'1'1 üretir (Tanaka, et. al., Cytokine Regulation of Humoral Iminunity, 251- 272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)). Th2-tipi iminün yanitlar, belirli sitokinleriii (örnegin, IL-4, IL-13) ve spesifik antikor türlerinin (IgE, IgG4) üretilmesi ile karakterize edilir ve alerjik reaksiyon için tipiktir ve bu da gözlerde sulanma ve akcigerlerde hava yolu iltihaplanmasi ve hava yolu kas hücrelerinin kasilmasi gibi astim semptomlari ile sonuçlanabilir.

Ek olarak, burada tarif edildigi gibi lipokalinlerin tatbik edilmesiyle mevcut tarifnamenin yöntemleri ile tercihen tedavi edilen, iyilestirilen ya da önlenen rahatsizlik alerjik reaksiyon ya da alerjik enflamasyon ile iliskili olabilir.

Bazi tercih edilen uygulamalarda, rahatsizlik alerjik astim, rinit, kon junktivit ya da dermatit olabilir.

Astim, hava yolu iltihaplanmasi ile iliskili hava yolu hiper duyarliligi ile karakterize edilen karmasik, kalici ve enflamatuar bir hastaliktir.

Arastirmalar yüksek dozda solunan kortikosteroitlerin ve uzun süre etkili bronkodilatörlerin ya da omalizumabin (immünoglobülin E7ye baglanan ve siklikla gelecek adim terapisi olarak kullanilan bir insancillastirilmis monoklonal antikor) düzenli kullaniminin bütün hastalarda astim kontrolünü saglamak için yeterli olmayabilecegini göstermistir ve bu da önemli bir karsilaninainis ihtiyaca isaret etmektedir. Interlökin-4, interlökin-l3 ve transkripsiyon faktörü-@nin sinyal transdüseri ve aktivatörü hava yolu iltihaplanmasinin, mukus üretiminin ve astimda hava yolunun asiri duyarliliginin gelisinesindeki anahtar bilesenlerdir. Bu molekülleri hedefleyen biyolojik bilesikler kontrol edilmemis orta ila siddetli astimli hastalar için yeni bir terap'otik modalite saglayabilir. Mevcut tarifname, burada tarif edildigi gibi lipokalin muteinleri yoluyla bu biyolojik bilesikleri saglar.

Bazi tercih edilen uygulamalarda, alerjik astim, IL4/1Ll3 yolunun hastalik patojenezine katkida bulundugu bir hava yolu iltihaplanmasidir.

Dahasi burada tarif edildigi gibi lipokalinlerin tatbik edilmesi yoluyla mevcut tarifnamenin yöntemleri ile tercihen tedavi edilen, iyilestirilen ya da önlenen rahatsizlik ayni zamanda akciger rahatsizliklari örnegin içinde IL4/IL13 yolunun bu patojeneze katkida bulundugu pulmoner rahatsizliklar olabilir. Bu tip pulmoner rahatsizliklar arasinda kronik fibrotik akciger hastaligi dahil olmak 'uzere akciger fibrozu, akcigerlerde 1L-4-ind`ûklü fibroblast çogalmasi ya da kolajen birikmesi ile karakterize edilen diger kosullar, bir Th2 immün yanitinin bir rol oynadigi pulmoner kosullar, akcigerde azalan bariyer fonksiyonu ile karakterize edilen (örnegin epitelyuma IL-4-indüklü hasardan kaynaklanan) kosullar ya da IL-4”ün bir enflamatuar yanitta bir rol oynadigi kosullar yer alir.

Benzer sekilde, Sistik fibroz (CF) asiri inukus üretimi ve kronik enfeksiyonlari gelisimi ile karakterize edilir. IL-4RA ve Th2 yanitinm inhibe edilmesi, mukus üretimini azaltacaktir ve alerjik bronkopulmoner aspergilloz (ABPA) gibi enfeksiyonlarin kontrol edilmesine yardimci olacaktir. Alerjik bronkopulinoner mikoz esasen bir Th2 immün yanitinin baskin oldugu sistik fibrozlu ya da astimli hastalarda meydana gelir. IL-4RA'nin ve Th2 yanitinin inhibe edilmesi bu enfeksiyonlarin temizlenmesine ve kontrol edilmesine yardimci olacaktir.

Benzer sekilde, kronik Obstruktif pulmoner hastalik (COPD) asiri mukus salgilamasi ve fibroz ile iliskilidir. lL-4RA”nin ve Th2 yanitinin inhibe edilmesi, mukus üretimini ve fibroz gelisimi azaltacaktir böylece solunum fonksiyonunu iyilestirir ve hastaligin ilerlemesini geciktirir. Bleomisin indüklü pnömopati ve fibroz ve radyasyon indüklü pulmoner firoz akciger fibrozu ile karakterize edilen rahatsizliklar olup, IL-4 ve IL-l 3 ”ü üreten ve karsiliginda fibroz gelisimini hafifleten Th2, CD4.sup.+ hücrelerin ve makrofajlarin içeri akisi ile ortaya çikar. IL-4RA°nin ve Th2 yanitinin inhibe edilmesi, bu rahatsizliklarin gelisimini azaltacaktir ya da önleyecektir.

Dahasi, lL-4 ve lL-l 3 akciger epitel hücrelerinin mukus üreten goblet hücrelere dönüsmesini indükler. IL-4 ve IL-l3 bu nedenle, alt populasyonlarda ya da bazi durumlarda iyilestirilmis bir mukus üretimine katkida bulunabilir. Mukus üretiini ve salgilamasi kronik obstruktif pulmoner hastalikta (COPD) ve sistik fibrozda (CF) hastalik patojenezine katki yapar. Bu yüzden, bir mukus üretimi ya da bir mukus salgilamasi (Örnegin asiri üretimi ya da asiri salgilanmasi) ile iliskili olarak rahatsizlik burada tarif edildigi gibi bir lipokalin muteininin tatbik edilmesiyle mevcut tarifnamenin yöntemleri ile tercihen tedavi edilebilir, iyilestirilebilir ya da önlenebilir. Bazi tercih edilen uygulamalarda, bir mukus üretimi ya da bir mukus salgilamasi ile iliskili rahatsizlik tercihen bir kronik obstruktif pulmoner hastalik (COPD) ya da sistik fibroz (CF) olabilir. Diger tercih edilen uygulamalarda, tarifnamenin bilesimi ayrica bir inukus 'Önleyici ilaci içerir.

Pulmoner alveolar proteinoz sürfaktan ariliginin bozulmasi ile karakterize edilir. IL-4 sürfaktan üretimini arttirir. Bazi baska uygulamalarda, sürfaktan üretimini azaltmak ve tam akciger lavaji ihtiyacini azaltmak için tarifnamenin bir lipokalin inuteini gibi bir lL- 4RA antagonistinin kullaniini da burada önerilmistir.

Yetiskin solunum güçlügü sendromu (ARDS) çok sayida faktöre bagli olabilir ve bunlardan biri toksik kiinyasallara inaruz kalinmasidir. Bu nedenle, tercih edilen ancak sinirlayici olmayan bir `Örnek olarak, ARDS°ye duyarli olan bir hasta popülasyonu, suni solunuin cihazlari kullanan kritik seviyedeki hastalardir çünkü ARDS bu tip hastalarda sik görülen bir komplikasyondur. Bazi baska uygulamalarda, tarifnamenin bir lipokalin muteini gibi bir lL-4RA antagonisti bu yüzden enflamasyon ve adezyon moleküllerini azaltarak ARDS'yi hafifletmek, önlemek ya da tedavi etmek için kullanilabilir.

Sarkoidoz granuloinatoz lezyonlari ile karakterize edilir. Bazi baska uygulamalarda, sarkoidozu, özellikle de pulmoner sarkoidozu tedavi etinek için tarifnamenin bir lipokalin muteini gibi bir IL-4RA antagonistinin kullanimi da burada önerilmistir.

IL-4 indüklü bariyer bozulinasinin bir rol oynadigi durumlar (örnegin, akcigerde azalan epitelyal bariyeri fonksiyonu ile karakterize edilen kosullar) lL-4RA antagonist(leri) ile tedavi edilebilir. Akcigerlerdeki epitelyal bariyere verilen hasar dogrudan ya da dolayli olarak IL-4 Ve/Veya IL-l3 ile indüklenebilir. Akcigerdeki epitelyum akciger lümeninin içeriklerinin alt mukozaya gimiesini önleyen seçici bir bariyer olarak islev görür. Bir hasarli ya da “sizintili” bariyer, antijenlerin bariyerden geçmesine izin verir ve bu da karsiliginda akciger dokusuna ayrica zarar verebilen bir innnün yaniti açiga çikarir. Bu sekilde bir immün yanit Örnegin eozinofillerin ya da mast hücrelerinin faaliyet göstermesini içerebilir. Bir IL-4RA antagonisti, bir immün yanitin bu sekilde istenmeyen stimülasyonunu inhibe etmek için tatbik edilebilir.

Bu bakimdan bulusun bir lipokalin muteini gibi bir IL-4RA antagonisti örnegi astim hastalarinda akciger epitelyuinunun iyilesmesini desteklemek için kullanilabilir ve böylece bariyer fonksiyonunu yerine getirir ya da alternatif olarak akciger epitelyumuna IL-4 ve/veya IL-13-indükli`i hasari önleinek için profilaktik amaçli olarak tatbik edilir.

Mevcut tarifnameye uygun olarak bir hastaligi ya da rahatsizligi tedavi etme yöntemlerinin belirli bir etki mekanizmasi ile sinirli olinadigi not edilmelidir. Ornegin, bazi baska uygulamalarda, tarifnamenin lipokalin muteini, açiklanan yöntemlerde gen terapisi ajanlari olarak kullanilabilir.

Burada kullanildigi gibi “tedavi” (ve bunun “tedavi etmek” ya da “tedavi edici” gibi dilbilgisel varyasyonlari) tedavi edilen süjenin dogal gidisatini degistirmek ainaciyla klinik müdahaleye atif eder ve klinik patoloji öncesinde ya da esnasinda gerçeklestirilebilir.

Tedavinin arzu edilen etkileri arasinda hastaligin ya da bir durumunun ya da semptoinunun meydana gelmesinin veya tekrarlamasinin engellenmesi, hastaligin bir durumunun ya da semptomunun hafifletilmesi, hastaligin dogrudan veya dolayli patolojik sonuçlarinin azaltilmasi, hastaligin ilerleme hizinin azaltilmasi, hastalik durumunun iyilestirilmesi veya hafifletilmesi ve gerileme veya prognozun saglanmasi bulunur. Bazi uygulamalarda, tarifnamenin yöntemleri ve bilesiinleri bir hastaligin ya da rahatsizligin gelisiminin geciktirilmesi için yararlidir. Tedavi hem insan terapisi hem de veterinerlik uygulamalari için geçerlidir. "Önleme" burada tarif edilen rahatsizliklarin (ya da bunlarla iliskili semptomlarin) meydana gelmeden önce önlenebilmesini ve/veya rahatsizliklarin nüksetmemesini içerir.

"Iyilesme" burada tarif edilen rahatsizliklarin (ya da bunlarla iliskili semptomlarin) hafifletilmesini, azaltilmasini, dindirilinesini ve/veya teskin edilmesini içerir.

Bütün dilbilgisel forrnlarinda “tatbik edilen” ya da “tatbik etme” terimi, tek terap'otik ajan ya da burada tarif edildigi gibi baska bir terap'otik ajan ile kombinasyoiilu olarak lipokalin muteininin terapötik olarak etkili bir dozunun tatbik edilmesi anlainina gelir. Bu nedenle, mevcut tarifnamenin bir lipokalin muteininin tercihen birlikte terapi yaklasiinlarinda yani diger ilaçlarla ya da ecza 'urunleri örnegin burada tarif edildigi gibi bir rahatsizlikligi tedavi etmek için diger ilaçlar ve/veya mevcut bulusun yöntemleri baglaminda yararli olabilen herhangi baska terapötik ajan ile birlikte kullanilabilen tercihen bir bilesim, tercihen farmasötik bilesim formunda oldugu varsayilir. Bu yüzden, burada tarif edilen lipokalin muteinlerini içeren bir bilesimin ayrica bir anti-alerjik ilaci ve/veya anti-alerjik enflamasyon ilacini içermesi tercih edilir.

Burada kullanildigi gibi, "etkili bir miktar", arzu edilen terapötik veya profilaktik sonuca ulasmak için burada tarif edildigi gibi bir lipokalin muteini için gerekli zaman periyotlari boyunca ve dozajlarda etkili bir miktar anlainina gelir. Kesin doz, tedavinin amacina bagli olacaktir ve bilinen teknikler kullanilarak teknikte uzman bir kisi tarafindan teyit edilebilecektir.

“Terapötik olarak etkili miktar” ile anlatilmak istenen tatbik edilme sebebi olan etkileri üreten bir dozdur. Burada tarif edildigi gibi bir lipokalin muteininiii “terap'otik olarak etkili miktari” yas, Vücut agirligi, genel saglik, cinsiyet, diyet, tatbik zamani, ilaç etkilesimi ve rahatsizligin siddeti gibi faktörlere uygun olarak degisebilir ve teknikte uzman kisiler tarafindan yapilan rutin deneyler ile teyit edilebilecektir. Bazen, “terap'otik olarak etkili miktar” terimi ile “farmas'otik olarak etkili iniktar” terimi burada birbirlerinin yerine kullanilabilir.

Terapötik olarak etkili bir miktar, mevcut basvuruda kullanildigi zaman, ayrica antikorun veya antikor parçasinin tüm toksik veya zararli etkilerinin, terapötik açidan faydali etkilerle bertaraf edildigi bir miktardir. "Profilaktik olarak etkili bir miktar", arzu edilen profilaktik sonuca ulasmak için gerekli zaman periyotlari boyunca ve dozajlarda etkili bir miktar anlamina gelir. Sart olmamakla birlikte tipik olarak profilaktik bir doz, hastaligiii erken bir asamasinda veya hastaliktan önce kullanildigindan profilaktik açidan etkili bir miktar, terap'otik açidan etkili miktardan daha az olacaktir. Arzu edilen terap'otik aktiviteye sahip olan burada tarif edilen lipokalin muteini, burada tarif edildigi gibi bir hastaya verileii fizyolojik olarak kabul edilebilir tasiyici içinde tatbik edilebilir.

Bazi uygulamalarda, mevcut basvuruda kullanildigi zaman bir “süje” bir oinurgali hayvandir. Ozellikle belirli uygulamalarda, omurgali hayvan bir memelidir. Memeliler arasinda primatlar (iiisan ve insan disi primatlar) ve kemirgenler (örnegin fareler ve siçanlar) bunlarla sinirli olmaksizin yer alir. Ozellikle belirli uygulamalarda, bir memeli bir insandir. Bazi baska uygulamalarda, bir bireyle es anlamli olarak bir insan süje, özellikle tercih edilen bir süjedir. Yine bazi baska uygulamalarda, mevcut basvuruda kullanildigi zaman ihtiyaç duyan bir insan sü je bir hastadir.

Tarifnamenin bir proteini bir lipokalin muteini tercihen retinol- baglayici protein (RBP), bilin-baglayici protein (BBP), apolipoprotein D (APO D), nötrofil jelatinaz ile iliskili lipokalin (NGAL), gözyasi lipokalini (TLPC), org-mikroglobülin ile ilgili protein (A2m), 24p3/uter0ka1in (24p3), von Ebners glandi proteini 1 (VEGP 1), von Ebners glandi proteini 2 (VEGP 2) ve Majör alerjen Can fl prekursör'unden (ALL-l) meydana gelen gruptan seçilen bir lipokalin Olabilir burada insan NGAL”i bir tercih edilen lipokalindir ve insan gözyasi lipokalini daha çok tercih edilen bir lipokalindir. Burada kullanildigi gibi bir “lipokalin” yaklasik olarak 18-20 kDA agirliginda olan ve bir baglayici cebi tanimlamak için bir ucundan çok sayida (tercihen dört) ilmek ile çiftli olarak baglanan çok sayida (tercihen sekiz) ß-dizisini içeren bir silindirik ß-pliseli yaprak süper ikincil yapisal bölgeye sahip olan monomerik protein olarak tanimlanir.

Lipokalin ailesi üyeleri arasinda çok çesitli baglanma modlarina yol açan durum farkli sekilde ri jit olan lipokalin iskelesindeki döngülerin çesitliligi olup bunlarin her biri farkli ebat, sekil ve kimyasal karakterdeki hedefleri ihtiva edebilir (örnegin, Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350°de incelenmistir). Aslinda proteinlerin bir lipokalin familyasi, genis bir ligand spektrumunu baglamak için dogal olarak evrimlesmistir ve genel sekans koruinasinin (siklikla %20”den daha az sekans özdeslikleri ile) alisilmisin disinda düsük seviyelerini paylasir ancak yüksek oranda korunmus genel bir katlama desenini muhafaza eder. Çesitli lipokalinlerdeki pozisyonlar arasindaki iliski teknikte uzman kisilerce çok iyi bilinmektedir. Bakiniz, örnegin, ABD Patent No. 7,250,297.

Genel olarak burada tarifnameye atifta bulunuldugunda, tarifnamenin bir lipokalin muteini, dogal olarak meydana gelen einsal lipokalininden farklidir söyle ki dogal olarak meydana gelen emsal lipokalinden en az bir amino asit bakiinindan farklilasir. Fark bir amino asit ikamesi, delesyonu ve/Veya eklemesi olabilir ve bir ikame olmasi tercih edilir. Bir “lipokalinin muteini” ya da “lipokalin muteini” özellikle bir “insan gözyasi lipokalini muteini” ya da “Tlc muteini” olabilir.

Tarifnamenin bir proteini, insan gözyasi lipokalininin (Tlc) bir muteinidir. Burada kullanildigi gibi “insan gözyasi lipokalini” terimi SWISS-PROT Veri Bankasi Erisim Numarasi P31025 olan yetiskin insan gözyasi lipokalinine atif eder. Yetiskin insan gözyasi lipokalini (SWISS-PROT Erisim Numarasi P31025 asit sekansinin amino asitleri 19-176) (SEK. KIM. NO: 1), burada tarif edilen çesitli uygulamalarda “referans” ya da “referans sekansi” olarak kullanilan SWISS-PROT Erisim Numarasi P31025 olan asit sekansinin sekansina dahil olan N-terminal sinyal peptidini (amino asitler l-l8) içermez.

Simdi insan gözyasi lipokalini (TLPC ya da Tlc) adi verilen insan gözyasi pre-albümini ilk olarak insan gözyasi sivisinin bir ana proteini (toplam protein içeriginin yaklasik olarak üçte biri) olarak tarif edilmistir ancak son yillarda ayni zamanda prostati, nazal mukozayi ve trakeal mukozayi içeren diger birçok salgi dokusu içinde de tanimlanmistir. Siçanlarda, domuzlarda, köpeklerde ve atlarda benzer proteinler bulunmustur. Gözyasi lipokalini bagil çözünmeyen lipitler ile ilgili gelisigüzelligi ve bu protein familyasinin diger üyelerinden farklilasan bagil karakteristikleri içermesi nedeniyle alisilrnisin disinda bir lipokalin üyesidir (Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248°de incelenmistir). Fark edilebilir bir sayidaki yag asitleri, yag alkolleri, fosfolipitler, glikolipitler ve kolesterol gibi farkli kimyasal siniflarin lipofilik bilesikleri bu proteinin endojen ligandlaridir. Ilginç bir sekilde, diger lipokalinlerin tam aksine, ligand (hedef) baglamanin direnci hem alkil amitler hem de yag asitleri için hidrokarbon kuyrugunun uzunlugu ile korelasyon kurar. Bu yüzden, gözyasi lipokalini en güçlü sekilde en az çözünebilir lipitlere baglanir (Glasgow, BJ. ve digerleri (1995) Curr. Eye Res. 14, 363-372; Gasymov, O.K. ve digerleri (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320).

Bir terapötik kullanim için özellikle uygun olan ve burada tarif edildigi gibi lipokalin muteinleri, SEK. KIM. NO: 2-ll°de ifade edilen lipokalinleri içerir. Bu moleküller insan 1L4Ra°s1 için bir spesifisite ve yüksek afiiiite sergiler ancak mevcut tarifname öncesinde, terapötik olarak ilgili in vivo veriler ile karakterize edilmemistir. Burada tarif edildigi gibi bir terapötik kullanim için uygun olan diger lipokalin muteinleri arasinda WO 2008/015239°a ait SEK. KIM. NO: 2-8°de ifade edilen lipokalinler yer alir. Burada tarif edildigi gibi bir terapötik kullaiiim için uygun olan diger lipokalin muteinleri arasinda WO 2011/154420.”ye ait SEK. KIM. NO: 2-1 l”de ifade edilen lipokalinler yer alir.

Burada kullanildigi gibi, bir “mutein”, (protein ya da nükleik asit olmasi göz önüne aliiimaksizin) bir “mutasyona ugramis” öge ya da “mutant” dogal olarak meydana gelen (dogal tip) nükleik asit ya da protein “referans” iskelesine kiyasla bir ya da daha fazla nükleotitin ya da amino asitin degis tokusuna (ikamesine), delesyonuna ya da yerlestirmesine atif eder. Dogal olarak meydana gelen (dogal tip) nükleik asitin ya da proteinin bir ikamesi tercih edilir. Burada “referans”, “referaiis sekaiis” ve “dogal tip sekans” birbirlerinin yerine kullanilabilir.

Mevcut tarifname ayni zamanda burada spesifik olarak tarif edilen lipokalin muteinlerinin Optimize edilmis varyantlarini da önerir.

Verilen bir hedefe afiniteye sahip bir lipokalin muteini seçildigi zaman, çok daha yüksek afiniteye sahip varyantlari ya da daha yüksek termostabilite, iyilestirilmis serum stabilitesi, termodinamik stabilite, iyilestirilmis çözünürlük, iyilestirilmis monomerik davranis, termal denatürasyona, kimyasal denatürasyoiia, proteolize ya da deterjanlara karsi iyilestirilmis direnç gibi iyilestirilmis özelliklere sahip varyantlari müteakip olarak seçmek içiii muteiniii ayrica inutajeneze tabi tutulmasi mümkündür. Daha yüksek afinitede hedeflenmesi halinde bu diger mutajenez in vitro “afinite olgunlastirmasi” olarak düsünülebilir, rasyoiiel tasarima ya da bir rastgele mutasyona dayanarak alana özgü inutasyon ile basarilabilir. Daha yüksek afiniteyi ya da iyilestirilmis özellikleri elde etmek için baska bir olasi yaklasim hataya yatkin PCRsnin kullanimi olup bu da lipokalin muteininin sekans pozisyonlarinin seçilmis bir araligi üzerindeki nokta mutasyonlari ile sonuçlanir. Hataya yatkin PCR Zaccolo ve digerleri (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603 tarafindan tarif edilen gibi bilinen herhangi bir protokole uygun olarak gerçeklestirilebilir. Bu amaçlar için uygun olan rastgele mutajenezin diger yöntemleri arasinda Murakami, H ve digerleri (2002) Nat.Bi0technol. 20, 76-81 tarafindan tarif edildigi gibi rastgele yerlestirme/delesyon (RID) mutajenezi ya da Bittker, J. A ve digerleri (2002) Nat. Biotechnol. ,1024-1029 tarafindan tarif edildigi gibi homolog olmayan rastgele rekombinasyon (NRR) yer alir. Tercih edilirse afinite olgunlastirmasi da ayni zainanda WO 00/75308 or Schlehuber, S. ve digerleri, (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120”de tarif edilen prosedüre uygun olarak yürütülebilir, burada digoksigenine yüksek afiniteye sahip olan bilin- baglayici proteinin muteinleri elde edilmistir.

Bir göz yasi lipokalin muteini, IL 4 reseptör alfa ile kompleks olusturmak için kullanilabilir. Mutein ayni zamanda IL 4 reseptör alfanin bir immünojenik fragmanini da baglayabilir. 1L-4 reseptör alfanm bir immünojenik fragmani bir ya da daha fazla epitopa, niimotopa ya da diger antijenik belirleyicilere sahip olan bir fragmandir ve bu yüzden bir antikorun yükseltilebilecegi bir immün yaniti indükleyebilir. Immünojenik fragman tek bir epitopu içerebilir ya da çok sayida epitopa sahip olabilir. Bir antijen-sunan sistem, örnegin bir tasiyici protein, bir bagisiklik sistemi tarafindan taninma için gereken büyüklügü saglama amaçli kullanilabildiginden immünojenik fragman için hiçbir belirli büyüklük sinirlamasi geçerli degildir. Bu yüzden, immünojenik fragman ayni zamanda bir “hapten” yani basli basina antijenik olmasi gerekmeyen bir fragman da olabilir ya da özellikle küçük molekül agirligi ve dolayisiyla boyutu sebebiyle düsük immünojenisiteye sahip olabilir. Tipik olarak bir immünojenik fragman, tek basina ya da bir tasiyici üzeriiide sunuldugu zaman bir immünoglobülin ya da MHC molekülleri tarafiiidan sunulmussa bir T hücresi reseptörü (TCR) tarafindan baglanabilir. Bir immünojenik fragman tipik olarak, tek basina ya da anti jeii gösteren sisteni formunda sunuldugu zaman bir hümoral iiiiinün yaniti ve/veya `Örnegin B- ve/veya T-lenfositlerinin aktivasyonuna yol açan hücresel iminün yaniti indükleyebilir.

Mevcut tarifnamede kullanilaii lipokalin inuteininiii bir hedefi (resnii olarak interlökin-4 reseptörü alt birimi alfa, Uniprot #P24394, SEK.KIM.NO: 12 olarak bilinen) interl'okin-4 reseptörünün alfa zinciridir ve bu bir transmembran proteinidir ve 207 ainino asitli bir ekstrasellüler domaini içerir. Ekstrasellüler domainin bir salgilanmis formu, sIL-4R alfa mevcut olup, ayni zamanda CD124 olarak da bilinir ve lL-4 aktivitelerini bloke edebilir. Tarifnamenin lipokalin muteini sIL-4 reseptör alfayi ve ayrica IL-4 reseptör alfanin ekstrasellüler doinainin herhangi bir kisinini baglayabilir.

Mevcut tarifnaine ayni zanianda burada tarif edildigi gibi lipokalin muteinleri için nükleotit sekanslarini içeren nükleik asit molekülleri (DNA ve RNA) ile ilgilidir. Genetik kodun bozulmasi ayni amiiio asidi belirten diger kodonlar tarafiiidaii belirli kodonlarin ikameleriiie izin verdigi için tarifname, tarifnainenin bir lipokalin muteinini kodlayan spesifik bir nükleik asit inolekülü ile siiiirli degildir ancak bir fonksiyonel muteini kodlayan nükleotit sekanslarini içeren bütün nükleik asit inoleküllerini kapsar.

Açiklanan nükleik asit molekülleri de ayni zamanda bir vektörün ya da bir plazmid, bir fajemit, bir faj, bir bakülovirüs, bir kozmid ya da bir suni kromozom gibi herhangi baska bir türden klonlanan vehikülünün parçasi olabilir. Bir örnekte, nükleik asit molekülü bir fazmid içine dahildir.

Bazi açiklanan gözyasi lipokalin muteinlerinde, Cys 61 ve Cys 153 arasinda dogal olarak meydana gelen disülfit bagi yok edilir.

Dolayisiyla, bu tip muteinler (ya da bir intramoleküler disülfit bagini içermeyen herhangi baska bir gözyasi lipokalin muteini) bir indirgeyici redoks iniliyösüne sahip olan bir hücre koinpartimani içinde, örnegin Gram-negatif bakterilerin sitoplazmasi içinde üretilebilir. Tarifnamenin bir lipokalin muteininin intramoleküler disülfit baglarini içermesi halinde, yeni olusan polipeptidin uygun bir sinyal sekansi kullanilarak bir oksidize edici redoks miliyösüne sahip olan bir hücre koinpartiinanina yönlendirilmesi tercih edilebilir. Bu sekilde bir oksidize edici ortam, Gram-pozitif bakterilerin ekstrasellüler miliyösünde ya da ökaryötik hücrelerin endoplazmik retikulumunun lümeninde E. Coli gibi Gram-negatif bakterilerin periplazmasi tarafindan tedarik edilebilir ve genellikle yapisal disülfit baglarinin olusuinunu destekler. Bununla birlikte, E. Coli gibi bir konak hücrenin sitozolü içinde bulusun bir lipokalin muteininin üretilmesi de mümkündür. Bu durumda, polipeptit ya çözünebilir ya da katlanmis halde dogrudan elde edilebilir ya da in Vitro olarak yeniden naturasyonun takip ettigi inklüzyon cisimcikleri formunda geri kazanilabilir. Baska bir seçenek de bir oksidize edici intrasellüler miliyöye sahip olan spesifik konak suslarinin kullaniini olup, bu da bu yüzden sitozol içinde disülfit baglarinin olusumuna izin verebilir (Venturi M, ve digerleri (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8).

Tarifname ayni zamanda, bulusun en az bir lipokalin muteinini ya da bunun bir fragmanini ya da varyantini ya da bir füzyon proteinini ya da konjugatini ve farinas'otik olarak kabul edilebilir bir formülasyonu (örnegin tampon/tuz/yardimci madde kombinasyonunu) içeren bir bilesim ile ilgilidir, burada adi geçen bilesim ihtiyaci olan bir süjeye asagidakilerden meydana gelen bir gruptan seçilen bir dozaj seviyesinde tatbik edilebilir: 0.06-600mg, 0.06-100mg, 0.3-10mg, 1- 3mg.

Bazi uygulamalarda, mevcut tarifnainenin bir bilesimi proteinli ilaçlar için terap'otik olarak etkili herhangi bir parenteral olan ya da olmayan (enteral) yol vasitasiyla tatbik edilebilir. Parenteral tatbik yöntemleri arasinda örnegin intrakutanöz, subkütan, intramuskular, intratrakeal, intranazal, intravitreal ya da intravenöz enjeksiyon ve infuzyon teknikleri, örnegin enjeksiyon solüsyonlari, infuzyon solüsyonlari ya da tent'i'ir formunda ve ayrica aerosol instalasyonu ve inhalasyonu, örnegin aerosol karisimlari, Spreyler, buhar ya da toz forinunda olanlar yer alir.

Bazi uygulamalarda, bilesimin akciger lokal olarak tatbik edilmesi tercih edilir. Akcigere lokal olarak tatbikin tercih edilen bir yolu aerosol inhalasyonudur. Pulmoner ilaç tatbiki yani (ayni zamanda intranazal tatbikte de kullanilabilen) aerosollerin inhalasyonu ya da intratrakeal damlatma yoluyla tatbik hakkinda genel bir inceleme örnegin Patton, J .S., ve digerleri (2004) Proc. Amer. Thoracic Soc., 1, 338-344 tarafindan verilmistir. Parenteral olmayan tatbik modlari örnegi oraldir, 'Örnegin haplar, tabletler, kapsüller, çözeltiler ya da süspansiyonlar formundadir ya da rektaldir örnegin fitiller formundadir. Bazi uygulamalarda, tarifnamenin bir lipokalin muteini ayni zamanda konvansiyonel toksik olmayan farmasötik olarak kabul edilebilir yardimci maddeler ya da tercihe göre tasiyicilari, katki maddelerini ve vehikülleri içeren formülasyonlarda sistemik ya da topikal olarak tatbik edilebilir. Tarifnamenin bir lipokalin muteininin inhalasyon yoluyla tatbiki için, mutein bir ilave fazla birlikte bir toz formülasyonu halinde mevcut olabilir. Lipokalin muteinin inikronize tozu WO96/0223l sayili patent tairfnamesinde ya da P. Lucas, K.

Anderson, J. N. Staniforth, Protein deposition from dry powder inhalers, Pharmaceutical Research, Cilt 15, April 1988, sayfalar 562- 569 makalesinde tarif edildigi gibi `Örnegin laktoz, dekstroz, maltoz, trehaloz gibi bir tasiyici materyal ile karistirilabilir. Alternatif olarak, US patent basvurulari 2005/0014677 ve 2009/0142407°de tarif edildigi gibi kati farmasötik preparasyonlar inhalasyon ainaçi kullanilabilir.

Bu nedenle tarifnamenin bir bilesimi, tarifnamenin bir lipokalin muteinini ve ayrica tarif edilen formülasyonlardan biriiii içerebilir.

Tatbik edilen bilesimin dozaji tercih edilen önleyici etkiyi ya da terapötik yaniti saglamak için genis sinirlar dahilinde çesitlilik gösterebilir. Örnegin, seçilen bir ligand için lipokalin muteininin afinitesine ve ayrica lipokalin muteini ve in vivo ligand arasindaki koinpleksin yari ömrüne bagli olacaktir. Ayrica, optimal dozaj lipokalin muteininin ya da bir fragmaninin ya da varyantinin ya da füzyon proteininin ya da kon jugatinin biyodagiliinina, tatbik moduna, tedavi edilen hastaligin/rahatsizligin ciddiyetine ve ayrica hastanin tibbi durumuna dayanacaktir.

Mevcut tarifname ayni zamanda ihtiyaci olan bir sujeyi tedavi etme yöntemi saglamakta olup, bu yöntem adi geçen sujeye nebulizasyon vasitasiyla bir farmasötik bilesimin tatbik edilmesini içerir, burada farmasötik bilesim en az bir 1L-4RA antagonistini ya da bir fragmanini ya da varyantini ya da bir füzyon proteinini ya da kon jugatini ve uybun bir çözeltiyi içerir. Çesitli tercih edilen açiklamalarda, bulusun farmasötik olarak kabul edilebilir formülasyonu bir nebulizasyon formülasyonu, örnegin nebulizasyon üzerine ve soiirasinda (örnegin monomerik ve tamamen fonksiyonel olarak aktif kalan) antagonistin fonksiyonel ve yapisal bütünlügünü muhafaza edebilen bir çözelti ya da bunun bir fragmani ya da varyanti ya da bir füzyon proteini ya da konjugati olabilir ve/veya kullanilan nebülizör ile birlikte tercih edilen büyüklük araliginda dainlaciklar meydana getirebilir. Bu bakimdan, örnek bir açiklama olarak mevcut tarifname: antagonistin, 'Örnegin tarifnameiiin bir lipokalin muteininin asagidakileri içeren bir çözelti olarak formüle edilebilecegini ögretir: pH degeri 5.5 ve 8.0 arasinda ayarlanan, osmolalite degeri yaklasik 150 ve 550 mOsm/kg arasinda olan, bir kalici anyon olarak yaklasik 31 ve 300 niM arasinda klorür içeren bir iyon konsaiitrasyonuna sahip olan ve/veya viskozitesi 1.5 cpsden daha düsük olan 1 ml tuzlu su için 0.01 mg ila 100 mg antagonsit ya da bir fragmani ya da varyanti ya da bir füzyon proteini ya da konjugati.

Tercihen formüle edilmis çözelti asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilen bir seviyede bir füzyon proteinini ya da konjugatini içerir: 0.05 mg/ml ila 50 mg/ml, 0.1 mg/ml ila 50 mg/ml, 0.05 mg/ml ila 25 ing/ml, 0.1 mg/ml ila 25 mg/ml, 0.05 mg/ml ila 15 mg/ml, 0.1 mg/ml ila 15 mg/ml, 0.05 mg/ml ila 10 mg/ml ve 0.1 mg/ml ila 10 mg/ml. Baska bir tercih edilen tarifnamede, açiklanan tuzlu suyun ayarlanmis pH degeri 5.5 ve 8.0 arasinda, 6.0 ve 8.0 arasinda, 6.0 ve 7.5 arasinda, 55 ve 7.5 arasinda, 6.0 ve 7.0 arasinda ve 6.5 ve 7.5 arasindaki degerlerden meydana gelen gruptan seçilir; ve/Veya osmolalite degeri yaklasik 150 ve 550 mOsm/L, yaklasik 150 ve 500 mOsm/L arasinda, yaklasik 200 ve 550 mOsm/L arasinda, yaklasik 200 ve 500 mOsm/L arasinda, yaklasik 200 ve 450 mOsm/L arasinda Ve yaklasik 150 ve 450 mOsm/L arasindaki degerlerden meydana gelen gruptan seçilir, Ozmolalite, ömegin osmol/L ya da Osm/L gibi çözeltinin litresi (L) basina çözünen madde ozinollarinin (Osm) sayisi olarak tanimlanan çözünen madde konsantrasyonunu ölçümüdür; ve/Veya 31 ve 300 mM, 50 ve 200 mM arasinda, 50 ve 300 mM arasinda, 50 ve 150 mM arasinda, 100 ve 200 mM arasinda, 100 ve 300 mM arasinda, 100 ve 250 mM arasinda, 150 ve 250 mM arasinda, 150 ve 300 mM arasinda ve 200 ve 300 mM arasindaki degerlerden meydana gelen gruptan seçilen bir kalici anyon olarak klorürün bir iyon konsantrasyonudur.

Ayrica tercihen, açiklanan tuzlu su, 0 ve 1.5 cp arasinda, 0 ve 1.0 cp arasinda, 0 ve 0.5 cp arasinda, 0.5 ve 1.0 cp arasinda, 0.5 ve 1.5 cp arasinda ve 1.0 ve 1.5 cp arasindaki degerlerden meydana gelen gruptan seçilen bir Viskoziteye sahiptir.

Bazi baska açiklamalarda, antagonistin sulu çözeltisi, örnegin bulusun bir lipokalin muteini bir elektronik neb'ûlizör, jet, ultrasonik ya da titresimli delikli membran örnegin PARI eFlow ya da Aeroneb titresimli ag neb'ûlizör'û ile nebülize edilebilir. Tercih edilen bir açiklamada, çözelti, bir elektronik nebülizör, jet, ultrasonik ya da titresimli delikli membran için 1 um ve 10 um arasinda bir kütle ortalamali aerodinainik çapina (MMAD) sahip olan bir aerosol olarak günde 2 kez nebülize edilir ve adi geçen neb'ûlizör, sonuçta elde edilen çözeltiyi yaklasik 1 ila yaklasik 5 dakika arasiiida bir zainan dilimi boyunca gereken büyüklüklerdeki parçaciklar (aerosoller) halinde aerosol haline getirebilir. Yine bazi baska açiklamalarda, adi geçen aerosollerden herhangi biri, 1 mm ila 10 um arasi, 2 um ila 8 um arasi, 2 um ila 5 um arasi, 1.5 um ila 4 um arasi, 3 um ila 4.5 um arasi ve 2.5 um ila 3.5 um arasindan seçilen gruptan meydana gelen bir kütle ortalamali aerodinamik çapa (MMAD) sahip olabilir.

Bazi uygulamalarda, uygulama açiklanan bir neb'ulizasyon formülasyonunu içeren bulusun bir farmasötik bilesiminin etkili bir miktarinin ihtiyaci olan bir sujeye l-3 dakika, tercihen 1-2 dakika içinde inhalasyon yoluyla tatbik için bir yöntem saglar. Bazi baska uygulamalarda, adi geçen inhalasyon yoluyla tatbik lokal olarak akcigere yapilir.

Bu nedenle bazi baska uygulamalarda, tarifname ihtiyaci olan bir sujeye açiklanan bir farmasötik bilesiinin tatbik edilmesini içeren bulusun bir yönteminde kullanima uygun olan bir etkili, güvenli, tahris edici olmayan, fizyolojik olarak kabul edilebilir ve uyumlu bir çözeltiyi saglar.

Tarifname, bulusun bir farmasötik bilesiminin ihtiyaci olan bir süjeye örnegin inhalasyoii yoluyla aerosol olarak tatbik edilmesi için çözeltinin kullanimini saglar.

Burada kullanildigi zaman, saptanabilir baglayici afiniteye sahip olan IL-4RA”ya baglanan ve/veya lL-4 ve/veya IL-l3°ün ilgili reseptörlerine baglanmasi engelleyen "IL-4RA antagonisti" bir polipeptit ya da protein anlamina gelir. Burada kullanildigi gibi, “saptanabilir afinite” genel olarak en az yaklasik 10'5 M°lik bir afinite sabitine sahip seçilmis bir hedefe baglanma kabiliyeti anlamina gelir.

Genel olarak daha düsük afiniteler artik ELISA gibi yaygin yöntemlerle ölçülemez ve bu nedenle ikincil öneme sahiptir. Örnegin, tarifnameye göre muteinlerin baglanma afiniteleri, 800 nM°nin altinda bir KD olabilir, 30 nM°nin altinda bir KD olabilir ve yaklasik 50 pikomolar (pM) ya da altinda olabilir.

Bazi uygulamalarda, istemlerde tanimlandigi gibi bir lipokalin muteini, IL-4 ekspresyonunun ve/veya IL-l3 ekspresyonunun katkida bulundugu ya da hastalik patojenezi ya da agravasyonu ile ilgili oldugu herhangi bir hastaligi ya da rahatsizligi tedavi etmek için kullanilabilir. Bazi uygulamalarda, istemlerde tanimladigi gibi bir lipokalin muteini, IL-4 aktivitesinin ve/veya IL-l3 aktivitesinin uzaklastirilmasi, inhibisyonu ya da azaltilmasi yoluyla iyilestirilen, dindirilen ya da engellenen herhangi bir hastaligi ya da rahatsizligi tedavi etmek için kullanilabilir. Bir açiklayici örnek olarak, mutein ya da bunu içeren farmasötik bilesim Th2 immün yanitinin bir artisi ile iliskili bir hastaligi ya da rahatsizligi tedavi etmek için bir yöntemde kullanilabilir. Bu sekilde bir hastalik ya da rahatsizlik örnegin bir alerjik reaksiyon ya da bir alerjik enflamasyon ile iliskili olabilir. Bazi baska uygulamalarda, bu tip bir hastalik ya da rahatsizlik alerjik astim, rinit, konjunktivit ya da derinatit olabilir (cf. Hage ve digerleri (1999) Cell, 97, 271-281, or Mueller ve digerleri (2002) Biochemica et Biophysica Acta, 237-250).

Tarifnamenin gözyasi lipokalin muteiiileri ile baglantili olarak mevcut bulusta kullanilan “fragman” terimi, N-ucu ve/veya C-ucu olarak kisaltilan yani N-ucu ve/veya C-ucu amino asitleriiiden en az biri eksik olan tani uzunluklu yetiskin insan gözyasi lipokalininden türetilen proteinler ya da peptitler ile ilgilidir. Bu tip fragmanlar, yetiskin insan gözyasi lipokalininin birinci sekansinin tercihen en az , daha tercihen 20, en çok tercihen 30 ya da daha fazla ardisik amino asidini içerir ve genellikle yetiskin insan gözyasi lipokalininin bir immünoeseyinde saptaiiabilir.

Mevcut tarifnamede kullanildigi gibi “varyant” terimi, örnegin ikame, delesyon, yerlestirme ya da kimyasal modifikasyon yoluyla amino asit sekansinin modifikasyonlarini içeren bir proteinin ya da peptidin (örnegin tarifnamenin gözyasi lipokalin muteininin) türevleri ile ilgilidir. Tercihen bu tip modifikasyonlar, proteinin ya da peptidin islevselligini azaltmaz. Bu tip varyantlar arasinda proteinler yer alir, burada bir ya da daha fazla amino asit ilgili D-stereoizoinerleri tarafindan ya da dogal olarak meydana gelen 20 amino asit haricindeki amino asitler yani örnegin ornitin, hidroksiproliii, sitrîilin, homoserin, hidroksilisiii, norvalin tarafindaii degistirilmistir. Ancak, bu tip ikameler ayni zamanda koruyucu olabilir yani bir amiiio asit tortusu kimyasal olarak benzer bir amino asit tortusu ile degistirilir. Koruyucu ikame örnekleri, asagidaki gruplarin üyeleri arasindaki ikamelerdir: l) alanin, serin ve treonin; 2) aspartik asit ve glutamik asit; 3) asparagin ve glutamin; 4) arginin ve lisin; 5) izolösin, lösin, metiyonin ve valin; ve 6) fenilalanin, tirozin ve triptofan.

Tarifnameye uygun olarak kullanildigi zaman “pozisyon” terimi burada tarif edilen bir amino asit sekansi içindeki bir amino asidin pozisyonu ya da burada tarif edilen bir nükleik asit sekansi içindeki bir nükleotidin pozisyonu aiilamina gelir. Burada kullanildigi gibi “karsilik gelen” terimi ayni zamanda bir pozisyonun sadece önceki nükleotitlerin/aminoasitlerin sayisi ile belirlenmedigiiii ifade eder.

Buna göre tarifnameye uygun olarak ikame edilebilen verilen bir amino asidin pozisyonu bir (mutant ya da dogal tip) lipokalin içinde baska bir yerde amino asitlerin delesyonuna ya da eklenmesine bagli olarak degisebilir. Benzer sekilde, mevcut tarifnameye uygun olarak ikame edilebilen verilen bir nükleotidin pozisyonu, promotör ve/Veya herhangi baska düzenleyici sekansi ya da geni (eksonlar ve intronlar dahil) içeren bir mutein ya da dogal tip lipokalin 5'-çevrilmemis bölgesi (UTR) içindeki delesyonlara ya da ilave nükleotitlere uygun olarak degisebilir. Bu yüzden, tarifnameye uygun olarak “karsilik gelen bir pozisyon” altinda, tercihen nükleotitlerin/amino asitlerin belirtilen sayida farklilasabildigi ancak yine de benzer komsu nükleotitleri/amino asitleri içerebildigi anlasilacaktir. Degis tokus edilebilen, silinebilen ya da eklenebilen adi geçen nükleotitler/amino asitler de “karsilik gelen pozisyon” terimine dahildir. Spesifik olarak, bir dogal tip lipokalinden farkli olan bir lipokalinin (muteinin) amino asit sekaiisinin amino asit tortusunun bir dogal tip lipokalinin amino asit sekansindaki belirli bir pozisyona karsilik gelip gelmedigini tespit etmek için, teknikte uzman kisiler teknikte çok iyi bilinen yollari ve yöntemleri, Örnegin hizalanialari manuel olarak ya da Temel Lokal Hizalama Arama Araci ya da ClustalW anlamina gelen BLAST2.0 gibi bilgisayar programlarini ya da sekans hizalamalarini üretmek için uygun olan herhangi baska bir uygun programi kullanmak suretiyle kullanabilir. Dolayisiyla bir dogal tip lipokalin, “söz konusu sekans” ya da “referans sekans” olarak islev görebilir ancak burada tarif edilen dogal tip lipokalinden farkli olan bir lipokalinin amino asit sekansi “sorgu sekansi” olarak islev görür. “Referans sekans” ve “dogal tip sekans” terimleri burada birbirlerinin yerine kullanilir.

Burada kullanildigi gibi tekil formda “bir”, “biri” ve “bu” ifadeleri, aksi metinde açikça dikte edilmedikçe çogul referanslari içerir. Bu yüzden örnegin “bir lipokalin muteinine” yapilan atif bir ya da daha fazla lipokalin muteinini içerir.

Aksi belirtilmedikçe, bir unsur serisinden önce gelen “en az” terimi, ilgili serideki bütün unsurlara atif eder.

Bu tarifname ve takip eden istemler boyunca, kapsam aksi sekilde gerektirmedigi takdirde, “kapsamak” sözcügü ve bunun “kapsamaktadir” ve “kapsar” gibi varyasyonlarinin, belirtilen tamsayi veya asama ya da asamalar veya tamsayi grubunun dahil oldugunu ancak herhangi bir diger tamsayi veya asama ya da asamalar veya tamsayi grubunu hariç birakmadigini kastettigi anlasilacaktir. Burada kullanildigi zaman “içeren” terimi, “ihtiva eden” ya da “sahip olan” terimi yerine kullanilabilir.

Burada kullanildigi zaman “meydana gelir” terimi, istem unsurunda belirtilmeyen hiçbir elemani, adimi ya da içerigi kapsamaz. Burada kullanildigi zaman “esasen meydana gelir” terimi, istemin temel ve yeni karakteristiklerini maddi olarak etkilemeyen materyalleri ya da adimlari hariç tutmaz.

Burada kullanildigi gibi çoklu atifli unsurlar arasinda baglaç olarak kullanilan “ve/veya” teriminin hem bireysel hem de birlesik seçenekleri kapsadigi anlasilir. Örnegin, iki elemanin “ve/veya” ile birlestirildigi yerlerde, bir birinci seçenek ikinci olmaksizin birinci elemanin uygulanabilirligine atif eder. Bir ikinci seçenek, birinci olmadan ikinci elemanin uygulanabilirligine atif eder. Bir üçüncü seçenek, birinci ve ikinci elemanlarin birlikte uygulanabilirligine atif eder. Bu seçeneklerden herhangi birinin ilgili anlam kapsamina girdigi ve bu nedenle burada kullanildigi gibi “ve/veya” teriminin gereklerini yerine getirdigi anlasilir. Birden fazla seçenegin es zamanli olarak uygulanabilinesinin anlam kapsamina girdigi anlasilir ve bu nedenle burada kullanildigi gibi “ve/veya” teriminin gerektirdikleriiii yerine getirir.

Bu tarifnamenin metni boyunca birçok belgeye atifta bulunulmustur.

Buradaki hiçbir sey, bulusun, bu sunumu önceki bulus sayesinde erkeii bir tarihe alma yetkisi olmadiginin kabulü olarak yorumlanmayacaktir. ÖRNEKLER Ornek 1: Bir IL-4 reseptörü alfa antagonisti tarafindan TF-l hücrelerinde IL-4 ve IL-13 indüklü Stat6 fosforilasyonunun inhibisyonu TF-l hücreleri 37 OC”de 30 dakika boyunca insan IL-4 reseptörü alfa zincirine karsi yönlendirilen bir lipokalin muteini olan bir IL-4 reseptörü alfa antagonisti ile enkübe edilmistir (SEK. KIM. NO: 6) ardindan lOnM lL-l3 (Figure la) ya da 0.1nM 1L-4 (Sekil lb) eklenmistir. Hücreler %16 PFA ile 37 °C”de 15 dakika boyunca enkübasyon sonrasinda sabitlenmistir ve PE Mouse Anti-STAT6 (pY641) - BD 612701 ile intrasellüler STAT6 boyainasi öncesinde %100 metanol ile permeabilize edilmistir. AndreWS ve digerleri H 2006 176:7456-7461 tarafindan açiklandigi gibi IL-4RA spesifik antikoru MAB23O (R&D Systems) ve IL-4 çift mutant lL-4 (R121D, Y124D) pozitif kontrol olarak kullanilmistir. ilaveten, insan gözyasi lipokalini (SEK. KIM. NO: 1) ve bir fare IgGZa antikoru (mlgGZa, Ancell 281-010; Lot#171605) negatif kontroller olarak kullanilmistir.

TF-l Stat6 fosforilasyon miktar tayininden elde edilen sonuçlar, Sekil l°de tarif edilmistir ve lL-4RA asagi akis sinyallesinesi ile ilgili oldugu için lipokalin muteininin (SEK. KIM. NO:6) IL-4”ün ve ayrica IL-13°ün potent antangonistleri oldugunu gösterir. IL-4RA spesifik antikoru MAB230 (R&D Systems) esit oranda iyi performans gösterir.

Sasirtici bir sekilde IL-4 mutanti, fonksiyonel antagonizm önceden tarif edilmis olmasina karsin TF-l hücrelerinde hem IL-4 hem de IL- 13 indüklü Stat6 fosforilasyonunun inhibe edilmesinde önemli oranda daha az etkilidir. Lipokalin inuteinine kiyasla (Tablo 1) lL-4 mutantinin (R121D, Y124D) hizli ayrisina hiz sabiti (koff) bu fonksiyonel farkin sebebi olabilir.

Tablo 1 Test maddesi KD k011 ko” Lipokalin Muteini 23 pM 4,1 x 106 M`is" 9,2 x 10*5 s'1 (SEK. KIM. NO: 6) IL-4 inutanti (R121D, 154 pM 1,9 x 107 M"s" 2,9 x 10'3 s.1 Y124D) Ornek 2: Çift knock-in farelerin yapilandirilmasi Insan IL-4 reseptör alfa zinciri ve IL-l3 reseptör alfa zinciri 1 knock- in fareleri, fare IL-4 reseptör alfa zincir geninin ve IL-13 reseptör alfa zincir l geninin ilgili insan ortologu ile degistirilmesi ile üretilmistir.

Dolayisiyla, üretilen fareler sözde insan IL-4 reseptörü alfa/insan IL- 13 reseptörü alfa zinciri 1 çift knock-in fareleri olup, bunlar fare ortolog gen lokusunda fare lL-4 reseptör alfa ve lL-13 reseptör alfa zinciri 1 genleri yerine insan genlerini barindirir.

Fareler su sekilde olusturulmustur: X kroinozomu üzerindeki 70 kb fare lL-l3RAl geni silinmistir ve fare embriyonik kök hücrelerinde bos bir alel meydana getirilmistir. Insan lL-13RA1 genini tasiyan bir DNA segmenti, silinmis lokusa uygulanmistir. Insan geni, insan X kromozomunun 95.7 kbilik bir fraginanindan meydana gelir ve bu sadece bütün ILl3RA genini içerinez ancak ayni zamanda ~ll kb”lik ' inter-genik DNA°y1 ve 3°UTR,nin ~7 kb”lik DNA 3°ünü içerir.

Burada iina edilen bilgi, bu DNA fragmaninin insan reseptör'ûn'un ekspresyonunu yönlendirecek olmasidir. Bu degisikligi tasiyan fareler, modifiye edilmis ES hücrelerinden üretilinistir. Ayri bir deneyde, fare IL-4RA”sini tasiyan 39 kb”lik DNA segmenti, insan IL-4R°sini kodlayan 63 kb°1ik DNA°nin karsilik gelen segmenti ile degistirilmistir ki bu da IL-4R alfadan ve ortak gama zincirinden meydana gelir ve yine modifiye edilmis hücrelerden üretilen bir fare çizgisi kullanilmistir. Hem IL-4R lokusunda hem de IL-13RA lokusunda insancillastirilmis lokus için bir fare çizgisi hoinozigotunu olusturmak için iki Knock-in fare çizgisi birbirleri ile kroslanmistir.

Fareler, fare proteiiilerinin yoklugunda insan proteinlerini eksprese eder. Insan Tip I ve Tip II reseptörlerilerinin düzgün ekpsresyonu insan IL4”üne immün hücrelerin yanitinin ve IL-133e hava yolu epitel hücrelerinin yanitinin gösterilmesi ile dogrulanmistir.

Ornek 3: IL-4 tip I reseptörü üzerinde bir IL-4 reseptörü alfa antagonistinin fonksiyonunu dogrulamak için çift knock-in farelerinin ex vivo analizi Splenositler, teknikte yaygin olarak bilinen yollar ve yöntemlerle insan lL-4 reseptörü alfa/insan IL-13 reseptörü alfa zinciri 1 çift knock-in farelerinden izole edilmistir. Bu. splenositler, insan IL-4 reseptörü alfa zincirine karsi yönlendirilen bir lipokalin inuteini (SEK.

KIM. NO:6) olan bir IL-4 reseptörü alfa antagonistinin yoklugunda ya da varliginda insan IL-47ünün artan konsantrasyonlari ile stimüle edilmistir. IL-4, IL-4 reseptör kompleksi vasitasiyla STAT6°nin fosforilasyonunu etkiler. Bu yüzden STAT6”nin fosforilasyonu, reseptörüne baglanan IL-4 için bir okumadir. Insan gözyasi lipokalini (SEK. KIM. NO: 1), bir negatif kontrol olarak islev görür.

Sekil 2°de lipokalin muteiiiinin (SEK. KIM. NO: 6) azaldigi ve bu yüzden splenositlerin üzerinde eksprese edilen IL-4 tip I reseptör'i'in'i'in üzerinde IL-4'üii etkisini nötralize ettigi gösterilmistir, çünkü IL-4 stimülasyonlu splenositlerdeki STAT 6 fosforilasyonu, stimüle edilmeyen splenositlerin seviyesine esittir.

Ornek 4: Çift knock-in transgenik farelere bir IL-4 reseptör'i'i alfa antagonistinin tatbiki ve e0taksin seviyelerinin analizi Blanchard ve digerleri (Clin Exp Allergy 2005, 35(8):1096-1103) tarafindan saglanan IL-l3 indüklü hava yolu enflamasyon modeli, insan IL-4 reseptörü alfa zincirine karsi yönlendirileii bir lipokalin niuteiiii olan bir IL-4 reseptörü alfa antagonistinin etkisini arastirmak için kullanilmistir. Modelde, l ug”1ik IL-l3 intratrakeal daiiilatina yoluyla 48 saatte bir üç kez tatbik edilmistir.

Dolayisiyla Sekil 3'te gösterildigi gibi vehikül (fosfat tamponlu tuzlu, bundaii böyle "PBS', olarak anilacaktir) ya da IL-l3 (hIL-l3) çift knock-in transgenik farelere grup 1 (PBS) ve grup 2 (hlL-l3) olarak sirasiyla tatbik edilmistir ancak grup 3 (SEK. KIM. NO: 6/hIL-l3) ve grup 4 (TLPC/hlL-l3) sirasiyla lipokalin muteinini (SEK. KIM. NO: 6) 57 ugslik bir dozda almistir ya da insan gözyasi lipokalini (SEK.

KIM. NO: 1) negatif kontrol olarak 57 ug°lik bir dozda almistir ve ilaveten hIL- 1 3 'ü almistir.

Gruplar 2 ve 3°te 3 fare vardir ancak gruplar 1 ve 4”te 2 fare vardir.

Intratrakeal dozlama 30 ulsde yapilmistir. IL-l3, lipokalin muteini (SEK.KIM.NO: 6) ve negatif koiitrol intratrakeal olarak tatbik edilmistir ve akciger dokusu hoinojenati eotaksin seviyelerinin ölçülmesi amaciyla elde edilmistir. Lipokalin muteininin ve negatif kontrolün IL-l3 tatbikinden 30 dakika 'Öncesinde tatbik edildigini not ediniz.

Bu modelde IL-l3 tatbik edildigi zaman, eotaksin seviyeleri, grup l”e kiyasla grup 4°teki son IL-l3 dozundan 24 saat sonra artmistir.

Eotaksin bir potent eozinofili kemoatraktanidir ve bu yüzden bir enflamasyon, özellikle de alerjik enflamasyon markörüdür. Sekil 3,te, grup 47ün lipokalin muteininin (SEK.KIM.NO: 6), grup 3”te negatif kontrole kiyasla eotaksin indüksiyonu üzerinde IL-13'i'in etkisini etkili bir sekilde nötralize ettigi gösterilmistir (ayni zamanda PBS grup l”e Cf ve grup 2'de tek basina IL-l3).

Ornek 5: Çift knock-in transgenik farelere bir IL-4 reseptör'û alfa antagonistinin tatbiki ve Cclll (eotaksin) mRNA ekspresyonunun analizi Bir insan lL-4 reseptörü alfa zincirine karsi yönlendirilen bir lipokalin muteini (SEK. KIM. No:6) olan bir IL-4 reseptörü alfa antagonistinin insan lL-4 reseptörü alfa/insan lL-l3 reseptörü alfa zinciri l double knock-in farelerine tatbiki Ornek 49te tarif edildigi gibi gerçeklestirilmistir ancak 30u1,lik IL-13 (Peprotech, lpg) intratrakeal damlatma yoluyla sadece bir kez tatbik edilmistir.

Gruplarin her biri 3 insan IL-4 reseptör'u alfa/insan IL-13 reseptörü alfa zinciri 1 çift knock-in farelerini içerir. Toplam RNA, IL-l3 dozundan 24 saat sonra akciger homojenatlarindan izole edilinistir ve RT-PCR yoluyla fare eotaksin ekspresyonu için analiz edilmistir. 24 saat sonra akciger dokusundaki iiiRNA ekspresyonu 18S rRNA ile norinallestirilmistir ve 1 ug hlL 13 fare için deger 1 olarak ayarlanmistir. Ayni zamanda IL-l3 dozu öncesinde farkli zamanlarda 98ug°lik sabit bir dozda ya da IL-l3 dozundan 30 dakika 'once farkli miktarlarda 30ul°lik bir hacim ile intratrakeal damlatma yoluyla lipokalin muteininin (SEK.KIM.NO:6) tatbik edilmistir. Yine IL-13 dozundan 30 dakika 'Önce farkli miktarlarda 30ul”lik bir hacim ile intratrakeal damlatina yoluyla IL-4 inutaiitiniii (R121D, Y124D) tatbik edilmistir. Farmakolojik yanitin süresinin, doz bagimliliginin ve kiyaslanabilir potensin degerlendirilmesi için kisaltilmis lL-l3 indüklü havayolu enflamasyon modelinin (tekli IL-l3 intratrakeal tatbikin) kullanilmistir. Sekil 4a”da lipokalin muteini (SEK. KIM. NO: 6) insan IL-l3 ind'ûklü transkripti Ccl 11 (eotaksin) uzatilmis bir süre boyunca etkili bir sekilde inhibe etmistir (Sekil 4a) ancak farmakolojik yanitin doz bagimliligi da Sekil 4b”de gösterildigi gibi sergilenmistir. Ek olarak, Sekil 4c”de görülebildigi gibi, lipokalin muteininin (SEK.

KIM. NO: 6) tercih edilen bir potensi, IL-4 mutanti ile yanyana kiyaslandigi zaman gösterilmistir (Sekil 4c).

Ornek 6: Pari eFlow titresimli mesh nebi'ilizör'i'in'i'i kullanarak bir IL-4 reseptör alfa antagonistini neb'i'ilize etmek için uygun formîilasyonlarin tanimlamasi Bir IL-4 reseptör alfa antagonisti, bir IL-4RA-spesifik lipokalin inuteini (SEK. KIM. NO: 6), 0.01 ya da 0.05 polisorbat 20 içeren 0.1 mg/ml'lik PBS konsantrasyonu içine bir Pari eFlow cihazi ile nebulize edilmistir. Nebülizörün rezervuari, 6 ml”lik formülasyon ile doldurulniustur ve rezervuarin yarisi nebulize ediliiiceye kadar yaklasik olarak 15 dakika boyunca çalistirilmistir. Sekil 5°te gösterildigi gibi, nebülize edilen numune nebülizörün agizligina takilan bir cain Viyal ile toplanmistir ve gözle görülebilir parçaciklari izlemek için gözle inceleine yoluyla, görülemeyen parçaciklari izlemek için isik karartmasi yoluyla, çözünebilir agregatlari izlemek için yüksek basinçli büyüklük dislanimli kromatografi (HP-SEC) yoluyla, kimyasal modifikasyonlari izlemek için ters fazli SEC yoluyla, fonksiyonel aktiviteyi izlemek için bir IL-4RA baglayici ELISA yoluyla ve damlacik büyüklügünü ölçmek için lazer difraksiyonu yoluyla analiz edilmistir. Seçilen formülasyonda lipokalin muteininin (SEK. KIM. NO: 6) nebülizasyonu gözle görülür agregat ya da görülemeyen parçaciklarin olusumuna yol açinamistir.

Hem nebulize edilmis protein hem de rezervuarda kalan protein inonoinerik ve tam fonksiyonel aktif olarak kalmistir. 5.5um”luk bir ortalama büyüklüge sahip damlaciklar cihazin spesifikasyonlarina göre üretilmistir. Formülasyondaki polisorbat 20 konsantrasyonu, muteini nebulize etme kabiliyetini etkilememistir çünkü ölçülen parametrelerin hiçbiri 0.01 ya da 0.05 polisorbat 20 içeren formülasyonlarda özdes degildir.

Ornek 7: Intratrakeal damlatma sonrasinda insan IL-4RA/insan IL-l3 çift knock-in farelerde IL-4 reseptörü alfa antagonistinin farmakokinetik özellikleri ve biyodagilimi.

Bir IL-4 reseptör alfa antagonisti, lipokalin inuteini (SEK. KIM. NO: 6) 30ul (98ug)°lik intratrakeal tatbik ile insan IL-4 reseptör alfa/insan IL-l3 reseptörü alfa zinciri 1 çift knock-in farelere tatbik edilmistir.

Yirmi hayvan dozlaninistir ve 1, 4, 8, '16 ve 24 saat sonra 4 fareden olusan gruplar öldürülmüstür. Oldürme esnasinda, akcigerlere 2 x lml FACSflOW sivisi ile lavaj yapilmistir, Li-heparin plazma numuneleri çekilinistir ve akcigerler sivi nitrojen içinde dondurulmustur. Akciger dokusu, 55 saniye boyunca 4°C -°de bir IKA TlO temel Ultra-Turrax (SlON-SG) doku homojenlestiricisi kullanilarak 1,5 ml liziz tamponu (komple mini proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri (Roche) / 10 ml T- PER (Perbio) içinden bir tablet) içinde homojenlestirilmistir.

Homojenat buz üzerinde 30-60 dakika enkübe edilmistir ve 10 dakika boyunca 4°Cide 10.000g ile santrifûjleme yoluyla temizlenmistir.

Toplam protein konsantrasyonu üreticinin talimatlarina göre bir BCA kiti (Pierce) ile tespit edilmistir ve numuneler -80°C”de alikotlarin saklanmasindan önce lmg/ml”lik bir standart nihai protein konsantrasyonuna gelecek sekilde PBS ile seyreltilmistir. Lavaj sivisinda, akciger dokusunda ve plazmada farkli zaman noktalarinda lipokalin muteininin (SEK. KIM. NO: 6) baglayici aktif konsantrasyonlarini ölçmek için bir kantitatif Mezo Ölçek Kesfi (“MSD”) bazli ELISA kullanilmistir. Kisaca, MSD plakalari PBS içinde 5 ug/ml nötravidin ile gece boyunca 4°C°de kaplanmistir, PBS/%005 TweenZO ile yikanmistir ve %3 BSA ile bloke edilmistir.

PBS/%0.] TweenZO içindeki 2,5 ug/ml'lik bir konsantrasyonda biyotinilatli insan IL-4RA”si, farkli matrislerden lipokalin muteinini yakalamak için eklenmistir ve bir gözyasi lipokalinine 'Özgü tavsan poliklonal antikoru (preparasyon: TLPC-Mix4666 Ab, Pieris, PL#684) ve PBS/%O,5 Tween20/%O.SBSA içinde anti-tavsan IgG Sulfo-Tag antikoru (Meso Scale Discovery, 0.5ug/ml) ile bagli mutein saptanmistir. Deney, üç matrisin tümünde 75 pg/ml ila 6ng/ml arasinda bir dogrusal aralik sergilemistir ancak QC numuneleri %80- 120arasinda bir geri kazanim saglamistir. Konsantrasyonlarin ve toplam miktarlarin hesaplamalari için fare basina 900ul°lik bir toplam plazma hacmi oldugu varsayilmistir. BCA kiti tarafindan ölçülen l mg/ml”lik toplam protein konsantrasyonuna akciger homojenatini standardize etmek için kullanilan seyreltme faktörü, standartlastirilmistir toplam akciger homojenatindaki ölçülen konsantrasyona ve 1,5 ml°lik liziz tamponu hacmine ve akcigerlerin ölçülen agirligina dayanarak akciger basina lipokalin muteininin t0plam miktari hesaba katilinistir. Bronkoalveolar lavaj sivisindaki lipokalin muteininin toplam miktari (bundan böyle “BALF” olarak anilacaktir) 2 ml°lik lavaj sivisinda geri kazanilan miktara dayanmistir.

Intratrakeal tatbikten 1 saat sonra Sekil 6a”da tatbik edilen dozun %43°ünün BALF°ta, %6”sinin akciger dokusunda ve %0,2°sinin plazma içinde geri kazanilabildigi görülebilir. 3.7, 3.9 ve 2.7 saatlik bir terminal yari ömür sirasiyla BALF”ta, akciger dokusunda ve plazmada teSpit edilmistir. Ayirca, Sekil 6b”de insan IL-4RA/insan IL- 13 çift knock-in farelerindeki hesaplanan akciger dokusunun Sekil 4a°da gösterilen gözlemlerle ayni dogrultuda olan yaklasik olarak 20 saat boyunca lipokalin muteininin 98ug°sinin intratrakeal damlatinasinin ardindan 0,7ug/ml”nin üzerinde muhafaza edildigi görülebilir. 0,7ug/ml°lik konsantrasyon, in vitro potens deneylerinde farkli olarak gözlemlenen lipokalin muteininin en yüksek ICgo degerine karsilik gelir. Dahasi Sekil 6b ayni zamanda plazma konsantrasyonlarinin ve bu nedenle sistemik maruziyetin, akciger dokusuna kiyasla 100 kat daha düsük oldugunu gösterir.

Ornek 8: Bir IL-4 reseptör'i'i alfa antagonisti tarafindan insan havayolu epitelyum hava-sivi-ara yüzü kültürü sisteminde IL-13 indi'ikl'i'i goblet hücresi metaplazisinin inhibisyonu Goblet hücresi metaplazisi, Astim dahil olmak üzere birçok solunuin hastaliginin ortak bir özelligidir. Bu nedenle, bir lL-4 reseptörü alfa aiitagonistinin yani lipokaliii muteininin (SEK.KIM.NO:6) MucilAirTM (Epithelix)°e dayanarak bir in vitro model içinde goblet hücresi metaplazisini önleme kabiliyeti degerlendirilmistir. 0.3 ila 30 ng/ml°lik insan IL-l3”ü ile iki günde bir MucilAirlM”, birincil insan hücreleri kullanilarak in vitro olarak sulandirilan insan havayolu epitelyumuna sahip bir hava-sivi arayüzü kültür sistemi muamele edilmistir. In-situ Alcian mavi boyamasi ve ayrica histolojik analiz yoluyla bir doza bagimli sekilde 14 günlük muamele soiirasinda MucilAirTWnin artmis bir goblet hücresi yogunlugu gösterdigi kanitlanmistir. Bu nedenle, MucilAirTM”nin pozitif kontrol olarak 14 gün boyunca yaklasik 10 ng/ml'lik insan IL-13”üne ve IL-13 + lipokalin muteininin (SEK. KIM. NO: 6) farkli konsantrasyonlarina (Sekil 7a°da gösterildigi gibi), lL-4 mutantin (R121D, Y124D) ve adi geçen anti-IL-4RA monoklonal antikorunun farkli konsantrasyonlarina (hafif ve agir zincir degisken bölgeleri SEK.

KIM. NO: 14 ve 15,te gösterilir) maruz kalmasinin ve negatif kontrol olarak 14 gün boyunca kültürlenen MucilAirTM°ye devamli olarak maruz kalmasini kiyaslayarak goblet hücresi metaplazisi üzerinde bir lipokalin muteininiii inhibitör etkisi test edilmistir. Asit mukopolisakkaritlerini ve glikosaminoglikanlari mavi ila mavimsi yesile boyayan Alcain mavi boyasi, bir in-situ boya için apikal yüzeye eklenmistir ve boyanmis hücrelerden alinan resimler görüntü analizi için bir faz kontrasti inikroskopu altinda çekilmistir. Kamu domaini Java görüntü isleme programi ImageJ ile Alcain mavi pozitif hücrelerin yüzdesi için miktar tayini yapilmistir ve Alcain mavi alani/toplam görüntü alani orani olarak bunlarin sayisi eksprese edilir.

Histolojik analiz, standart protokole göre Cenevre Universitesindeki bir platform tarafindan gerçeklestirilmistir. Ek olarak, bir IL-13 indüklü kemokin olan eotaksin-3, üreticinin talimatlarina uygun olarak Meso Scale Discovery°den piyasada mevcut olan ultra hassas eotaksin-3 Kiti kullanilarak 14. günde bazal vasat içinde ölçülmüstür.

Sekil 7aida ve Sekil 7b”de, lipokalin muteininin (SEK.KIM.NO: 6) tamamen doza bagimli bir sekilde MucilAir kültür sistemindeki IL- l 3 indüklü goblet hücresi metaplazisini bloke edebildigi görülmüstür.

Alcain mavisi alaninin orani, lipokalin inuteini ve ayrica anti-IL-4RA monoklonal antikoru tarafindan arka plana (hiçbir IL-13'e sahip olmayan negatif kontrolün oranina) indirgenmistir ancak IL-4 mutanti (R121D, Y124D) tarafindan indirgenineinistir ancak insan gözyasi lipokalini (SEK.KIM.NO:1) pozitif kontrol olarak (sadece IL-l3°e sahiptir) benzer sekilde boyaina sergilemistir. Sekil 7d°de görüldügü gibi (bazal kültür vasatinin içine salgilanan) eotaksin-3 için benzer sekilde sonuçlar elde edilmistir. Sekil 7c”de gösterildigi gibi 1L-l3 içeren ve içermeyen l4.gün kültürlerinin örnek Alcain mavisi/Nötral kirinizi boyali parafin kesitleri hava-sivi-arayüzü kültür sisteminde insan hava yolu epitelyuinu üzerindeki IL-l3 etkisini göstermistir.

Bulus, IL4/IL13 yolunun hastalik patojenezine, örnegin Th2 immün yanitinin bir artisi ile iliskili hastaliklara ve/veya rahatsizliklara katkida bulundugu hastaliklarin ve/veya rahatsizliklarin tedavisi ile baglantili endüstriyel uygulamalara sahiptir. Burada sekillerle açiklanarak tarif edilen bulus, burada spesifik olarak açiklanmainis olan herhangi bir elemanin ya da elemanlarin, sinirlamanin ya da sinirlamalarin yoklugunda uygun sekilde gerçeklestirilebilir. Bu yüzden 'Örnegin “içeren”, “dahil olan”, “ihtiva eden” ve benzeri terimler kapsamli ve sinirlamasiz olarak okunmalidir. Ek olarak burada kullanilan terimler ve ifadeler tarifname terimleri olarak kullanilmistir ve sinirlayici degildir ve bu teriinlerin ve ifadelerin kullanilmasi gösterilen ve tarif edilen özellikleri hiçbir esdegerligini ya da kisimlarini hariç tutma amaci gütmez ancak koruma talep edilen bulus kapsaminda çesitli modifikasyonlarin mümkün oldugu kabul edilir. Jenerik tarifnamenin kapsamina giren daha dar türlerin ve alt jenerik gruplandirlamalarin her biri de bulusun bir parçasini meydana getirir. Buna, kesilen materyalin burada spesifik olarak atif edilip edilmedigine dikkat edilmeksizin ilgili türden herhangi bir konuyu çikaran bir sart ya da negatif sinirlama ile bulusun jenerik tarifi dahildir. Ek olarak bulusun 'Özelliklerinin ya da yönlerinin Markus gruplari bakimindan tarif edildigi yerlerde, teknikte uzman kisiler bulusun ayni zamanda bu sekilde Markus grubun herhangi bir bireysel üyesi ya da alt grubu bakiinindan tarif edilecegini kabul edecektir.

Bulusun diger uygulamalari asagidaki istemlerden asikar olacaktir.

Claims (18)

ISTEMLER

1. IL-4 ve/Veya IL-13°ün ilgili reseptörlerine baglanmasini inhibe edebilen bir insan gözyasi lipokalin muteinini ya da bunun bir fragmanini ya da bir füzyon proteinini ya da konjugatini içeren, bir süjedeki bir rahatsizligi tedavi etme, iyilestirme ya da önleme yönteminde kullanilmak üzere bir bilesim olup, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani süjede bir in Vivo terapötik aktiviteyi sergileyebilir ve in VIVO insan 1L-13 indüklemeli transkripti Cclll (eotaksin) inhibe edebilir, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani olgun insan gözyasi lipokalininin amino asit sekansi ile en az lipokalin muteini ya da fragmani, olgun insan gözyasi lipokalininin pozisyonuna karsilik gelen amino asit pozisyonlarinda SEK.KIM.NO: 6”da ifade edilenlerle ayni ainino asitlere sahiptir ve burada lipokalin muteininin fragmani, adi geçen lipokalin muteinine kiyasla N-ucu ve/Veya C-ucu amino asitlerinden en az birini içermez.

2. Istem l,e göre kullanim için bir bilesim olup, burada adi geçen lipokalin inuteini ya da fragmani, IL-4 ve/Veya IL-l3 tarafindan indüklenen asagi akis sinyallesinesiiii ve/Veya hücresel yanitlari bozabilir.

3. Istem 1”e göre kullanim için bir bilesim olup, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani, insan IL-l3 indükl'û transkript Cclll°i (eotaksin) in Vivo olarak inhibe ederken bir IL-4 mutant (R121D, Y124D)'den daha potenttir.

4. Istem 1”e göre kullanim için bir bilesim olup, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani, anti-IL-4RA monoklonal antikoru aktivite sergileyebilir.

5. Istem 4”e göre kullaniin için bir bilesiin olup, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani, anti-IL-4RA monoklonal antikoru AMG kadar etkili bir sekilde IL-13- indüklü goblet hücresi metaplazisini inhibe edebilir.

6. Onceki isteinlerden herhangi birine göre kullaniin için bir bilesiin olup, burada suje içinde lL-4 ekspresyonunun ve/veya IL-l3 ekspresyonunun hastalik patojenezine ya da agravasyonuna katkida bulundugu ya da ilgili oldugu bir rahatsizliktan muzdariptir.

7. Onceki istemlerden herhangi birine göre kullaniin için bir bilesim olup, burada adi geçen bilesim akcigere lokal olarak tatbik edilir.

8. Önceki istemlerden herhangi birine göre kullaniin için bir bilesim olup, burada adi geçen bilesim aerosol inhalasyonu vasitasiyla tatbik

9. Onceki istemlerden herhangi birine göre kullaniin için bir bilesim olup, burada, bilesim günde dört kereye kadar, günde üç kereye kadar, günde iki kereye kadar, günde bir kereye kadar, iki günde bir kereye kadar, üç günde bir kereye kadar, haftada bir kereye kadar ve iki haftada bir kereye kadar meydana gelen gruptan seçilen bir siklikta ihtiyaci olan bir sü jeye tatbik edilir.

10. Önceki istemlerden herhangi birine göre kullaniin için bir bilesim olup, burada adi geçen bilesim her seferinde 0.06-600mg, 0.06- dozaj seviyesinde ihtiyaci olan bir su jeye tatbik edilir.

11. Önceki isteinlerden herhangi birine göre kullaniin için bir bilesim olup, burada adi geçen rahatsizlik Th2 immün yanitinin bir artisi ile iliskilidir.

12. 1 ila 10 arasindaki istemlerden herhangi birine göre kullaniin için bir bilesim olup, burada adi geçen rahatsizlik bir alerjik reaksiyon ya da bir alerjik enflamasyon ile iliskilidir.

13. 1 ila 12 arasindaki istemlerden herhangi birine göre kullaniin için bir bilesim olup, burada adi geçen rahatsizlik alerjik enflamasyon, alerjik astim, rinit, konjunktivit, akciger fibrozu, sistik fibroz, kronik obstruktif pulmoner hastalik, pulmoner alveolar proteinoz ya da yetiskin solunum zorlugu sendromudur.

14. 1 ila 12 arasindaki istemlerden herhangi birine göre kullanim için bir bilesim olup, burada adi geçen rahatsizlik alerjik astim, rinit, kon junktivit ya da dermatittir.

15. Istem 12”ye göre kullanim için bir bilesim olup, burada adi geçen bilesim ayrica bir anti-alerjik ilaci ve/Veya bir anti-alerjik enflamasyon ilacini içerir.

16. Önceki istemlerden herhangi birine göre kullanim için bir bilesim olup, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani esasen IL-23 reseptör alfa zinciri, fibronektin tip III domainini içeren tip I sitokin reseptöri'i, IL-6 reseptörü ya da IL-18 reseptörü alfa zinciri ile çapraz reaktif degildir.

17. 1 ila 10 arasindaki istemlerden herhangi birine göre kullanim için bir bilesim olup, burada adi geçen rahatsizlik, bir akciger rahatsizligidir.

18. Onceki istemlerden herhangi birine göre kullanim için bir bilesim olup, burada adi geçen lipokalin muteini ya da fragmani, IL-4 reseptörü alfa zincirine baglanir.