TR201901998A2 - Direk Karbapenemaz Üçlü (Kpc-2, Oxa-48, Ndm-1) PCR Tanı Kiti - Google Patents

Direk Karbapenemaz Üçlü (Kpc-2, Oxa-48, Ndm-1) PCR Tanı Kiti Download PDF

Info

Publication number
TR201901998A2
TR201901998A2 TR2019/01998A TR201901998A TR201901998A2 TR 201901998 A2 TR201901998 A2 TR 201901998A2 TR 2019/01998 A TR2019/01998 A TR 2019/01998A TR 201901998 A TR201901998 A TR 201901998A TR 201901998 A2 TR201901998 A2 TR 201901998A2
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
carbapenemase
pcr
ndm
oxa
kpc
Prior art date
Application number
TR2019/01998A
Other languages
English (en)
Inventor
Bukavaz Şebnem
Original Assignee
Trakya Ueniversitesi Rektoerluegue
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Trakya Ueniversitesi Rektoerluegue filed Critical Trakya Ueniversitesi Rektoerluegue
Priority to TR2019/01998A priority Critical patent/TR201901998A2/tr
Priority to PCT/TR2020/050066 priority patent/WO2020167272A2/en
Priority to US17/429,357 priority patent/US20220145358A1/en
Publication of TR201901998A2 publication Critical patent/TR201901998A2/tr

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686Polymerase chain reaction [PCR]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Buluş, bir karbapenemazların tespitinde kullanılan PCR temelli hızlı tanı kiti ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME Direk Karbapenemaz Üçlü (Kpc-Z, Oxa-48, Ndm-i) PCR TanEl(iti Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, antibiyotik (karbapenem) direncine sebep olan karbapenemazlarlBl tespitinde kullanilân, PCR temelli, hlîllîiianlîlkiti ile ilgilidir.
Bulusla Ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Karbapenemazlar penisilinleri, çogu olguda sefalosporinleri, belirli dereceye kadar karbapenemleri ve monobaktamlarEliiidroIize eden [3- IaktamazlardIE Gram negatif bakterilerde son ylmar içerisinde genislemis spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) ve karbapenemaz üreten etkenlerle gelisen enfeksiyonlar, özellikle hastanede yatmakta olan hastalarda ve altta yatan immünsüpresif durumu olanlarda ciddi tedavi sorunlarlEla neden olmaktadlîl Dünyada Enterobacteriaceae ailesinde en yayglEl olarak saptanan karbapenemazlar; Klebsiella pneumoniae karbapenemaz (KPC), , New Delhi metallo-ß-laktamaz (NDM) ve oxacillinase-48 OXA-48 enzimleridir.
Karbapenemler beta-Iaktam lellfJlîiçerisinde en genis spektruma sahip, hlîlEbakterisidaI etki gösteren antibiyotiklerdir ve genis antibakteriyel spektrumlarlsîla aerob ve anaerob birçok mikroorganizma taraflîitlan olusturulan enfeksiyonlarda yaygI kullanllîhaktadlîllar.
Teknigin bilinen durumunda; Karbapenemazlar rutin mikrobiyoloji IaboratuvarlarIa klasik kültür ve antibiyogram tayini seklinde identifiye edilmektedir.
Rutin mikrobiyoloji Iaboratuvarlarlda kullan [lân bakteri tanIiIama ve antibiyogram seklindeki klasik tanIilama metoduyla, öncelikle hastadan gelen materyalin kültüre edilerek 24 saatlik inkübasyonundan sonra otomatize sistemler kullanüârak, bakteri ismi konmaktadEI Sistemlerin çalisma prensibi, bakterinin üreme esnasliîtia kullandEgJEl metabolitler ve sonucunda olusturdugu enzim ve pH degisiklikleri temel aI-rak, özetle biyokimyasal özelliklerine göre isimlendirilmektedir. Bu yöntemlerin kullanllîzhasIa söz konusu Enterobacteriaceae üyesi bakteriler için teknik bir sorun olmamakla birlikte, tespiti için en az 48 saate ihtiyaç duyulmasElie bu süre zarfIa direnç enzimlerinin hlîla hastadan hastaya yayüüiasßöz konusu olmaktadlE Ikincil islem olarak da Antibiyogram ile söz konusu bakterinin hangi antibiyotige karsülluyarllîl oldugu yine otomatize sistemler tarafIdan belirlenmektedir. Söz konusu islem sEisHa, direnç enziminin varl[g]- isaret edilirken, direnç detayElie tipi hakkIa kesin bir yargüa varllâmamaktadEI Böylelikle tehlike arz eden, hastalar arasIa hlîla yayEIân, plazmid aracHJKlEEnzim tipinin belirlenmesi ve hastanI diger hastalardan izole edilerek bulaslElDglEl dolaylîlîzla da salg ar olusmasßngelIenememektedir.
Karbapenemazlarl identi'rikasyonunda ayrEla teknigin bilinen durumunda, fenotipik Carba NP ve Modifiye Hodge Test (MHT) de kullanllBiaktadE MHT Mebsie//a pneumoniae'de oldukça duyarlElolmas- ragmen diger Enterobacteriaceae üyelerinde iyi sonuç vermemektedir.
AyrEla teknigin bilinen durumundaki bu testler genel bir karbapenemaz varliglllîl dogrulamakta fakat dirence neden olan enzimin tam ismini belirtememektedir. Carba NP test, güvenilir bir test olmasEla ragmen maliyeti yüksek oldugundan dolayEllercih edilmemektedir. Ülkemizde enzimlerin belirlenmesinde genellikle konvansiyonel PCR ya da uluslararasEiliretimli kitler kullanlßiaktadlü Bu kitler ülkemizde sllZllIZIa görülen ve probleme sebebiyet veren üç önemli (Kpc-Z, Oxa-48, Ndm-l) enzimin dlglîida çok say. enzimi içerdigi ve yurt dlgl] üretimli oldugu için maliyeti oldukça yüksektir. Ayrlîla, direnç tayini daha uzun zaman almaktadlE den fazla karbapenemaz enzim çesidi tayin eden bir kit ile ilgilidir. Bu nedenle direnç tayini islemi oldukça uzun sürmektedir.
Bulusun Klâla AÇEEIamasüie AmaçlarEl Bulusta, antibiyotik direncine sahip karbapenemazlarl tespitini saglayan PCR temelli, hlîIEl Bulustaki PCR temelli hElEllanEkiti sayesinde antibiyotige karsütlirenç olusturan enzimler hlîlEl bir sekilde (1-2 saat) tanIiIanmakta ve hangi enzimin dirence neden oldugu tespit edilmektedir. Plazmid araclIJKIEllJir enzim ise hastanI izolasyonu hlîla saglanmakta ve direnç yayEIJEJl Ebnlenmektedir.
Yogun bakIi ünitelerinde yatan komorbîditesi yüksek hastalar için önem arz eden direnç enzimlerinin hlîla hastadan hastaya yayllBiasII önlenmesi ve hastanI diger hastalardan izole edilerek bulaslEllIglül gerçeklesmesi önlenmektedir.
Bulus kit içerigi basit bir sekilde kullanIi amac. uygun olarak dizayn edilebilmektedir. Örnegin, mikrobiyoloji rutin Iaboratuvarlarda, tanlîlamaçllîlkullanllâcak olan kitler prob hibridizasyon teknigine dayalÇIepidemiyoIojik arastüina çalânalaria kullanllâcak olanlar ise istege uygun olarak, Konvansiyonel Tekli veya Multipleks ve Sybr-Green teknikleriyle üretilebilmektedir.
Bulus kiti, ülkemizde s[th;a karsllâsllân ve tehlike arz eden üç önemli (Koc-2, Oxa-48, Ndm-l) karbapenemaz enzimini içerdiginden direnç tayini hlîlüa (1-2 saat) yapllâbilmektedir ve maliyeti oldukça düsüktür.
Bulusu AçEIilayan Sekillerin TanlEilarEl Sekil 1: Is aklgsemaslîl Bulusu olusturan unsurlarIII/klilünar[parçalar tanliilarü Karbapenemaz pozitif Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae vb. bakteri Klinik örnek Klinik örnekten bakteri kültürü Klinik örnekten direk DNA izolasyonu Bakteri kültüründen DNA izolasyonu DNA izolasyonu standardizasyonu, özgüllük ve hassasiyet belirleme Konvansiyonel PCR (blaKPC-2, blaOXA-48, bIaNDM-l) Multiplex PCR Sybr-Green PCR . DNA sekans ve varyant analizi PPHQWF-WNH Bulusun AyrItEIJIJçIIamasEI Bulus Sekil 1 de belirtilen islem adi leas- göre; öncelikle Karbapenemaz pozitif °C'de biriktirilerek üretilmektedir. SonrasIa klinik örnekler (2) rutin tanIZllaboratuvarlarIa, laboratuvara Escherichia ::o/i; K/ebsie//a pneumani'ae vb. bakterileri (1) -80 gönderilen kan, endotrakeal aspirat ve balgam gibi örnekler seçilen DNA izolasyon kitinde önerilen sekilde hazlEllanmakta ve klinik örneklerden bakteri kültürü (3) üretilmektedir. Klinik örneklerden direk DNA izolasyonu (4) ve bakteri kültüründen DNA izolasyonu (5), es zamanlEl olarak DNA izolasyon kiti ya da kaynatma metodu ile gerçeklesmektedir. PCR basamagi hemen geçilmeyecekse, örnekler kia süre (birkaç hafta) için +4 °C' de ve 6 aylilg bir süre - 80°C' de bekletilmektedir. DNA izolasyonu standardizasyonu, özgüllük ve hassasiyet belirlenmesi yapI[than sonra (6), çalisma amac. uygun say. enzim tespitini saglayan kitler Konvansiyonel Tekli (7) veya Multipleks (8) ve Sybr-Green (9) teknikleriyle üretilerek ölçüm yapilâbilmektedir. Tekli konvansiyonel PCR b/aKPC-Z, b/aOXA-48, b/aNDM-l' den herhangi birisi ile olusurken, Multipleks PCR; blaKPC-Z, b/aOXA-48, b/aNDM-l' den istenilen ikisi veya üçü tek reaksiyondan, Prob hibridizasyon ise tekli ve/veya çoklu enzimden olusabilecektir. Bu teknikte, sorun teskil eden direnç enzimlerini kodlayan DNA bölgelerini hedef alan primerler kullanilarak, çallgi'nanl amac. uygun farklEtipte dizayn edilecek olan hazlElseçilen DNA bölgelerinin çogalmaslßaglayan PCR kitleri üretilmektedir. Kitte bulunan ve farkIEkarbapenemaz genlerin tespiti için spesifik olan DNA primer çiftleri Tablo 1'de gösterilmektedir.
Ileri primer Geri primer Bu kitlerin içeriginde Master mix olarak adlandEllân ana karlglülida Taq DNA polimeraz enzimini de içeren ve çogaltiiâcak bölgeye özgü primerleri içeren ayrlîia kontrol olarak hazlEllanan tüplerden olusan solüsyon ve malzemeler yer almaktadE Süpheli direnç enzimine uygun olarak seçilen PCR kiti ile kisa sürede (yaklasliZl 1-2 saat) Elglal döngü cihazlEtla reaksiyon tamamlanmaktadlB Son adli olan DNA sekans ve varyant analizi (10) Için; Klasik PCR kiti seçilmis ise PCR örnekleri % 1'lik agaroz jelde, 100V' da, 30 dakika yürütülür. Real- Time PCR kiti seçilmis ise MeIt-Curve analizi ve dogru erime noktalarlîlle ayrEla internal amplifikasyon kontrolleri (IAK) degerlendirilerek sonuçlar kaydedilmektedir. Seçilen örneklerin DNA Sekans Analizi sonucuna göre nükleotid farkIHJKIarElincelenerek, enzim varyasyonu istatiksel olarak da degerlendirilecektir.

Claims (2)

ISTEMLER
1. Antibiyotik direncine sahip karbapenemaz tespitini saglayan PCR temelli tanleiti olup özelligi; karbapenemaz grubundan olan Mebsi'e//a pneumoni'ae karbapenemaz (KPC), New Delhi metallo-B-laktamaz (NDM), oxacillinase-48 (Oxa-48) enzim çesitlerinin tespitini saglayacak sekilde No:1, No:2 ve No:3, No:4, No:5, No:6 DNA primer çiftlerini içermesidir.
2. Istem 1'e göre PCR temelli tanEllitinin çallgina yöntemi olup özelligi, . Karbapenemaz pozitif Escherichia evli ve K/ebsie//a pneumon/'ae bakterilerinin (1) -80 °C'de biriktirilerek üretilmesi, . Kan, endotrakeal aspirat veya balgam gibi klinik örneklerden (2), bakteri kültürü (3) eldesi, - Klinik örneklerden direk DNA izolasyonu (4) ve bakteri kültüründen DNA izolasyonu (5), o DNA izolasyonu standardizasyonu, özgüllük ve hassasiyet belirlenmesi (6), o Enzim tespitini saglayan kitler Konvansiyonel Tekli (7) veya Multipleks (8) ve Sybr-Green (9) teknikleriyle üretimesi, o DNA sekans ve varyant analizi (10) islem ad larEiÇermesidir.
TR2019/01998A 2019-02-11 2019-02-11 Direk Karbapenemaz Üçlü (Kpc-2, Oxa-48, Ndm-1) PCR Tanı Kiti TR201901998A2 (tr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TR2019/01998A TR201901998A2 (tr) 2019-02-11 2019-02-11 Direk Karbapenemaz Üçlü (Kpc-2, Oxa-48, Ndm-1) PCR Tanı Kiti
PCT/TR2020/050066 WO2020167272A2 (en) 2019-02-11 2020-02-03 Direct carbapenemases triple (kpc-2, oxa-48, ndm-1) pcr diagnostic kit
US17/429,357 US20220145358A1 (en) 2019-02-11 2020-02-03 Direct carbapenemase triple (kpc-2, oxa-48, ndm-1) pcr diagnostic kit

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TR2019/01998A TR201901998A2 (tr) 2019-02-11 2019-02-11 Direk Karbapenemaz Üçlü (Kpc-2, Oxa-48, Ndm-1) PCR Tanı Kiti

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201901998A2 true TR201901998A2 (tr) 2020-08-21

Family

ID=72044401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/01998A TR201901998A2 (tr) 2019-02-11 2019-02-11 Direk Karbapenemaz Üçlü (Kpc-2, Oxa-48, Ndm-1) PCR Tanı Kiti

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220145358A1 (tr)
TR (1) TR201901998A2 (tr)
WO (1) WO2020167272A2 (tr)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050058985A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Dodgson Kirsty Jane Method and kit for identifying vancomycin-resistant enterococcus

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020167272A2 (en) 2020-08-20
US20220145358A1 (en) 2022-05-12
WO2020167272A3 (en) 2020-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Banerjee et al. Rapid antimicrobial susceptibility testing methods for blood cultures and their clinical impact
Price et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rRNA gene-based pyrosequencing: impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota
JP6258360B2 (ja) 抗生物質耐性細菌を検出するための方法およびキット
Buchan et al. Multiplex identification of gram-positive bacteria and resistance determinants directly from positive blood culture broths: evaluation of an automated microarray-based nucleic acid test
US20180135108A1 (en) Method for detecting bacterial and fungal pathogens
Chen et al. Identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) using simultaneous detection of mecA, nuc, and femB by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
Turutoglu et al. Methicillin and aminoglycoside resistance in Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis and sequence analysis of their mecA genes
Nieman et al. A prospective multicenter evaluation of direct molecular detection of blood stream infection from a clinical perspective
Smiljanic et al. Comparison of in-house and commercial real time-PCR based carbapenemase gene detection methods in Enterobacteriaceae and non-fermenting gram-negative bacterial isolates
CN101965407A (zh) 使用经标记的抗生素鉴定抗生素耐受性
Franco et al. Genotyping and rifampicin and isoniazid resistance in Mycobacterium bovis strains isolated from the lymph nodes of slaughtered cattle
US20250188550A1 (en) Methods and compositions for drug resistance screening
Fang et al. Screening for vancomycin-resistant enterococci: an efficient and economical laboratory-developed test
CN110656188A (zh) 检测引发血流感染的杆菌的引物和/或探针组合物及其应用
Genc et al. The identification of carbapenemase types in Enterobacteriaceae by using molecular assay and phenotyping confirmation tests
Tomaso et al. Comparison of commercial DNA preparation kits for the detection of Brucellae in tissue using quantitative real-time PCR
Rocchetti et al. Detection of Mycobacterium chelonae, Mycobacterium abscessus group, and Mycobacterium fortuitum complex by a multiplex real-time PCR directly from clinical samples using the BD MAX system
Pu et al. Investigation of Streptococcus agalactiae using pcs B‐based LAMP in milk, tilapia and vaginal swabs in Haikou, China
Xiao et al. Evaluation of real-time PCR coupled with multiplex probe melting curve analysis for pathogen detection in patients with suspected bloodstream infections
van Almsick et al. Rapid detection of carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae using a bioluminescence-based phenotypic method
Alzahrani et al. Antibiotic resistance profile and random amplification typing of β-lactamase-producing Enterobacteriaceae from the local area of Al-Taif and nearby cities in Saudi Arabia
Metan et al. Rapid detection of antibacterial resistance in emerging Gram-positive cocci
Mencacci et al. Comparison of conventional culture with SeptiFast real-time PCR for microbial pathogen detection in clinical specimens other than blood
Zhu et al. A locked nucleic acid (LNA)-based real-time PCR assay for the rapid detection of multiple bacterial antibiotic resistance genes directly from positive blood culture
Eisner et al. Identification of glycopeptide-resistant enterococci by VITEK 2 system and conventional and real-time polymerase chain reaction