TR201904207T4 - Olgun dendritik hücrelerin hazırlanması için bileşimler. - Google Patents

Olgun dendritik hücrelerin hazırlanması için bileşimler. Download PDF

Info

Publication number
TR201904207T4
TR201904207T4 TR2019/04207T TR201904207T TR201904207T4 TR 201904207 T4 TR201904207 T4 TR 201904207T4 TR 2019/04207 T TR2019/04207 T TR 2019/04207T TR 201904207 T TR201904207 T TR 201904207T TR 201904207 T4 TR201904207 T4 TR 201904207T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
cells
dcs
cell
dendritic cells
cocktail
Prior art date
Application number
TR2019/04207T
Other languages
English (en)
Inventor
J Schendel Dolores
Bigalke Iris
Zobywalski Anke
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh
Publication of TR201904207T4 publication Critical patent/TR201904207T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/19—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/20—Cellular immunotherapy characterised by the effect or the function of the cells
    • A61K40/24—Antigen-presenting cells [APC]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/46—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/02—Compounds of the arachidonic acid pathway, e.g. prostaglandins, leukotrienes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

Buluş en az bir olgun olmayan dendritik hücrenin in vitro mastürasyonu için bir yöntem ile ilişkilidir, b yöntem söz konusu olgun olmayan dendritik hücrenin TNF?, IL-1ß, IFNß, a TLR7/8 agonist ve prostaglandin E2 (PG) ile stimüle edilmesini içermektedir. Buna ilaveten, buluş söz konusu faktörleri içeren bir bileşim ile aynı zamanda da buluşun yöntemi ile üretilen olgun dendritik hücreler ile ilişkilidir.

Description

TARIFNAME OLGUN DENDRITIK HÜCRELERIN HAZIRLANMASI IÇIN BILESIMLER Bulus TNFa, IL-lß, IFNy, a TLR7/8 agonisti ve prostaglandin (PG) E2,ye sahip bir olgun olmayan dendritik hücrenin stimüle edilmesini içeren in vitro olgunlastlrma ile elde edilebilen olgun dendritik hücrelerin bir popülasyonu veya olgun dendritik hücreyle ilgilidir, burada olgun dendritik hücre veya olgun dendritik hücrenin popülasyonu en az oranmda IL-12p70 ve IL-107u eksprese etmektedir, ve olgun dendritik hücrelerin popülasyonu veya olgun dendritik hücreyi içeren bir farmasötik bilesimle ve tümör ya da enfeksiyonlu hastalllarm tedavisinde kullanüia yönelik olarak olgun dendritik hücrelerin bir popülasyonu veya olgun dendritik hücreyle ilgilidir. Dendritik hücreler (DC"s - DHiler) tümöre özgü öldürücünün ve hastadaki yard Enc :hücrelerin harekete geçirilmesinde yardlînc Jhr gibi yüksek bir potansiyele sahiptir (Schuler G, Schuler- Thurner B, Steinman RM. The use of dendritic cells i'n cancer immunotherapy. Curr Opin Salcedo M, Bercovici N, Taylor R, Vereecken P, Massicard S, Duriau D, Vernel-Pauillac F, Boyer A, Baron-Bodo V, Mallard E, Bartholeyns J, Goxe B, Latour N, Leroy S, Prigent D, Martiat P, Sales F, Laporte M, Bruyns C, Romet-Lemonne JL, Abastado JP, Lehinann F, Velu T. Vaccination of melanoma patients using dendriti'c cells loaded with an allogeneic tumor cell lysate. Cancer Immunol Immunother. 2005 Sep 27: . Bu amaçla, hastadan elde edilen olgun olmayan dendritik hücrelerden in vitro mature edilmis olan olgun dendritik hücreleri, tümöre-özgü antijenler ile yüklenmektedir ve Vücuda yeniden enjekte edilmektedir, tercihen lenf dügümlerine veya yaklnlna enjekte edilmektedir. Lenf dügümleri içerisinde dendritik hücreler naif T hücreleri ile etkilesime ginnektedir bu da sözde immünolojik sinaps ve takip eden efektör T hücrelerinin çabuk çogalmasl Slraslnda aktif sinyal transdüksiyonu ile sonuçlanmaktadi, dolaylêllýla bu sitotoksite (sitotoksik T lenfositler= CTL"ler), makrofajlarEi aktivasyonu ve ertelenen türde hipersensitivite reaksiyonlarEgibi tümör karSEÜJ cevaplara arac Ilk etmektedir. DHsler regulate CD4 pozitif T helper (h) hücre polarizasyonlarßIdüzenlemektedir. Thl hücreleri, örnegin belirli sitokin patemleri vasiasj ile CTLileri desteklemektedir (örnegin Interferon gamma ve IL-2, TNF-beta). Öte yandan, Th2 hücreleri antikorlarEbaslatmaktadi aynüzamanda eozinofilleri baslatmaktadE ve IL-4, Messi M, Lanzavecchia A,Sallust0 F. Kinetics ofdena'ritic cell activation.' impact on priming of induce the development offunctionally heterogeneous T helper cell subsets. Immunity 1998, 8: 275-283, Rengarajan J, Szabo SJ, Glimcher LH. T ranscriptional regulation of T hI/Th2 Dendritik hücreler ile terapi için, majör DH"lerin yeterli sayßEiEi bulunabilmesi önemlidir. Çünkü, hastada, yalnüca beyaz kan hücrelerinin % 0.2'si dendritik hücrelerdir, olgun dendritik hücrelerin in vitro üretimi için etkili bir yönteme sahip olunmas Egerekmektedir. Teknikte, periferik kan mononükleer hücrelerden, monositlerden ve diger miyeloid progenitör hücrelerden baslayarak olgun dendritik hücrelerin haz Illanmasü için çesitli yöntemler önerilmistir (Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, Steinbrink K, Paragnik L, Schmitt E, Knop J, Enk AH.: Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce olgunlasma of potent immunostimulatory dendritik hücreler under fetal calfserum-free conditions. Eur J Immunol. MA, Lyerly HK.A subset of human monocyte-deri'ved dendritic cells expresses high levels of interleukin-12 in response to combined CD40 ligand and interferon-gamma treatment. Blood. Hilkens CM, Kapsenberg ML, Kirkwood JM, Storkus WJ, Kalinski P.: alpha-type-J polarized dendritic cells.' a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cancer Res. A.:Selected T all-like receptor agonist combinations synergi'sti'cally trigger a T helper type 1- EE, Trinchieri G, Caux C, Garrone P.:A type I i'nterferon autocrine-paracrine loop is involved in Toll-like receptor-induced interleukin-l2p70 secretion by dendritic cells. J Exp Med. 2005 Periferik kan mononükleer hücrelerin, monositlerin ve diger miyeloid progenitör hücrelerin GM-CSF ile veya ya IL-4 ile ya da IL-13 ile kültivasyonunun in vitro olgun olmayan dendritik hücrelerin üretimi ile sonuçlandEgükabul edilmektedir (Ahn JS, Agrawal B. IL-4 is more eßective than IL-13 for in vitro differentiati'on of dendritik hücreler from peri'pheral blood kadar, olgun olmayan dendritik hücrelerin olgunlasmayEiçin kullanElabilir tatmin edici bir yöntem bulunmamaktadm. Jonuleit (H. Ve digerleri (1997, supra) TNF-(i, IL-l, IL-6 ve prostaglandin EZ (PG) (sözde Jonuleit kokteyli) içeren bir bilesim kullanan bu tür bir olgunlasma yönteminden bahsetmektedir, Bu bilesim ile olgun olmayan dendritik hücrelerin inkübasyonu ile üretilen dendritik hücreler olgun dendritik hücreler için yüzey belirteçlerini göstermektedir ve iyi hasat edilebilir. Ancak, bu hücreler biyolojik aktif IL-12p70 üretmekte basarßâd Mar, bu lenf dügümlerinde Thl hücrelerinin baslat JInas üçin en önemli etmendir. Mailliard, R. ve digerleri TNF-Ot, IL-l, interferon or, interferon V ve poliI:C içeren bir bilesenden bahsetmektedir (Mailliard, R. ve digerleri, 2004, supra). YukarElaki Jonuleit kokteylinin aksine, bu sözde Kalinski kokteyli ile olgun olmayan dendritik hücrelerin inkübasyonu olgun dendritik hücreler (ilgili yüzey belirteçleri tarafidan gösterildigi gibi) ile sonuçlanmaktadm, bu da IL- 12p70 üretmektedir. Ancak, bu hücreler kültür siselerinin en alt klîsm Ba son derece yap Skandî ve böylece toplanmas [neredeyse imkâns Ekim Bundan dolay Eda bu yöntem ile asüama tedavisi için yeterli olgun dendritik hücrelerin elde edilmesi imkânslzl degilse dahi çok zordur. bahsetmektedir. Bu uygulamada anlatllan deneylerde, olgun olmayan dendritik hücreler yalnâca R848 ile uyarEImaktadE. Ancak, R848 tek bir olgunlasma maddesi olarak klinik dendritik hücreler için uygun tüm özellikleri saglayamamaktad 3. Tüm deneyler FCS (fetal buzag Eeruinu) ile gerçeklestirilmistir ve bundan dolayüda, GMP kosullarElaltha (iyi üretim yöntemi) uygulanabilir degildir çünkü fetal buzagEserumsuz kosullar GMP islemi için çok önemlidir. Bundan dolayl, olgun olmayan dendritik hücrelerden olgun dendritik hücrelerin hazlrlanmas l için halen gelistirilmis yöntemlere ihtiyaç duyulmaktad Il. Bulus en az bir olgun olmayan dendritik hücrenin in vitro olgunlastülfmasîiçin bir yöntemle elde edilebilen olgun dendritik hücrelerin bir popülasyonu veya olgun dendritik hücreyi saglamakta olup, burada bulus söz konusu olgunlasmamß dendritik hücrenin TNF-or, lL-lß, olgun dendritik hücre veya olgun dendritik hücre popülasyonu en az oran &da IL-l2p70 ve IL-10,ü eksprese etmektedir. Mevcut bulus su saslrtld lbulguya dayalldln; TNF-(x, IL-lß, IFNy, bir TLR7/8 agonisti ve prostaglandin E2 (PG) kombinasyonu özellikle dendritik hücrelerin in vitro olgunlasmaslnl' tesvik etmek için uygundur. Özellikle, ve Ömekte gösterildigi gibi, söz konusu kombinasyon kullan Ihrak elde edilen olgun dendritik hücreleri sasEtBJoir sekilde kayda deger miktarlarda IL- 12p70 dIsJa vurmaktadî ve bunlar sasEtEJbir sekilde toplanmas Dkolaydî, bu da kayda deger miktarlarda olgun dendritik hücrelerin elde edilmesini saglamaktadî. Bu tür olgun dendritik hücre popülasyonlarEteknikte bilinen kokteyller ile üretilemez, ve özellikle yukarEla anlatJUgE gibi J onuleit kokteyli veya kokteylleri ile üretilemez. Örnegin insan periferik kan mononükleer hücreleri, monositler veya diger miyeloid projenitor hücrelerden baslayarak ve dogrudan kandan izole edilmis olan immatur DHtlerin kendilerinden baslayarak olgun dendritik hücrelerin hazlrlanmasl için bireysel teknikler teknikte bilinmektedir (Berger TG, Strasser E, Smith R, Carste C, Schuler-Thumer B, Kaempgen E, Schuler G. Efficient elutriation ofmonocytes within a Closed system (Elutra) for Clinical-scale generation Ringwald J, Schuler-Thumer B, Zingsem J, Eckstein R.C0rnparison of two apheresis systems for the collection of CD 14+ cells intended to be used in dendritic cell culture. Transfusion. Piechaczek C, Winkels G, Schwambom E, Micheli D, Hennemann S, Schmitz J .Isolati'on and generation of clinical-grade dendritic cells using the CliniMACS system. Methods Mol Med. Bundan dolayHda, olgun olmayan dendritik hücrelerden olgun dendritik hücrelerin üretilmesi için inkübasyon süresi, kullanman ortam vs için temel yöntemler teknikte bilinmektedir. Olgun dendritik hücre veya olgun dendritik hücre popülasyonunun elde edilebildigi yöntemde, bu önceki tekniklerin kapsamlidaki faktörlerin yeni bir kombinasyonu kullanüînaktadî Mevcut bulus bu önceki teknik yöntemlerinin kapsamEida kullanmamak olan faktörlerin yenilikçi bir kombinasyonu ile iliskilidir. Mevcut bulusun kapsamßdaki yöntemi böylece teknikte kalifiye bir kimse taraf Bdan kolaylEkla önceki teknik yöntemleri gerçeklestirilerek uygulanabilir ancak olgun dendritik hücreler elde etmek için olgun olmayan dendritik hücrelerin inkübasyonu s Eas Eda yukarma tan Enlanan etmenlerin bilesimini kullanarak bu uygulamay :yapabilin Buna ilaveten, bireysel bilesenlerin her birisi teknikte bireysel olarak kullanllhiß oldugundan ötürü, teknikte kalifiye olan bir kimse hangi konsantrasyonda hangi etmenin kullanLlInasLl gerektigini kolayllkla belirleyebilir. Buna ilaveten, teknikte kalifiye kimse özellikle büyüme faktörleri ve serum bilesenleri olan hücre kültürü ortamlnn bilesimlerine dayall olarak bireysel konsantrasyonunu adapte edebilecektir. Genel bir kühvuz olarak, TNF -a ve lL-lp; 1 ng/ml ila 50 ng/ml konsantrasyonlarida kullanüabilir, daha fazla tercihen 5 ng/ml ila 40 ng/ml konsantrasyonlarda kullan Iabilir, ve hatta daha fazla tercihen 10 ng/ml konsantrasyonda kullan Iabilir. PG; 50 ng/ml ila 5000 ng/ml aras Ekonsantrasyonlarda, tercihen 50 ng/ml ila 1000 ng/ml arasEkonsantrasyonlarda, hatta daha arasE konsantrasyonlarda kullanüabilir. IFNy; 500 U/ml ve 10000 U/ml arasü konsantrasyonlarda, tercihen 1000 ve 5000 U/ml arasElkonsantrasyonlarda, ve daha fazla tercihen ya 1000 U/ml konsantrasyonunda veya 5000 U/ml konsantrasyonunda kullanlabilir. Son olarak, TLR7/8 agonist, tercihen R848, 0.2 ve 5 ug/ml arasl konsantrasyonlarda, tercihen 0,5 tig/ml ve 2 tig/ml arasi konsantrasyonlarda, daha fazla tercihen 1 tig/ml konsantrasyonunda kullan Tabilir. Bulusa göre, olgun olmayan dendritik hücreleri yukarElaki etmenlerin bir kombinasyonu ile kültürlenebilir. Bu kültür ortamia etmenler eklenerek gerçeklestirilebilir. Alternatif bir sekilde, olgun olmayan dendritik hücrelerinin büyüdügü kültür ortamühalihazmda etmenleri içeren bir ortam ile degistirilmektedir. Sonraki tercih edilen bir uygulamada, yukarüa belirtilen maddeler söz konusu olgun olmayan dendritik hücrenin kültür ortamEia eklenen bilesimin parçasld rlar. Söz konusu kültür ortam lherhangi bir uygun türde olabilir, yani insan serumu olabilir veya olmayabilir, örnegin proteinler, amino asitler veya antibiyotikler gibi diger hayvan takviyeleri ile birlikte veya olmaksEEi tamamlanabilir. Tercih edilen bir uygulamada, ortam üretilmektedir ve GMP kosullarEaltEida kullan ülnaktadm Olgunlasma süreci tamamland Rtan sonra, DH"ler yukarEve asagEpipetleme ile, çalkalama ile (elle veya mekanik olarak) ve tuz solüsyonu, ortam bilesenleri (örnegin RPMI) veya sitokinsiz tam medyum ile yEkama toplanabilir. Hücreler toplanabilir, santrifüjlenebilir ve sitokinler peletlenmis DHllerin en az bir resüspansiyonu ile temizlenerek çülar Jlabilir. YukarLdakilere iliskin bir yap Lland Lninada IL-12p705in oran _lve IL-lO'un en az 3.0,Lbir Sinyal 3- Imolgun dendritik hücreler ilaveten bir TLR3 ligand, tercihen polil:C ile Örnegin, 10 ve 50 ng/ml aras 3konsantrasyon1arda, tercihen 20 ng/ml konsantrasyonunda islem görebilir. TLR3 ligand :hücrelere ayr :bir sekilde eklenebilir veya ayrEa diger etmenleri de içeren bilesenin bir bölümü olabilir. Bulusun tercih edilen bir uygulamas mda, söz konusu TLR7/8 agonist imidazokinilon türünde bir immün cevap modifiye edici bilesendir, daha fazla tercihen 4-amin0-2-etoksimetil-u,a- dimetil-lH-imidazol[4,5-c]kinolin-l-etanoldür (R848). Bu tür bilesenlerin üretimi WO analog loksoribin gibi diger TLR7/8 agonistler, TLR7/8,e baglanan tek dizili RNA°lar olarak TLR8 agonistler örnegin ss polyU ve ss RNA40 veya TLR7/8 agonistlerin bir kombinasyonu kullanllabilir Tercih edilen baska bir uygulamada, bulusun yönteminin baslangE malzemesi olarak kullanEan olgun olmayan dendritik hücresi olgun olmayan dendritik hücreden elde edilen bir monosittir. Tercihen, periferik kandan veya lökaferezden elde edilen ve yogunluk asamalü santrifüjleme, yEkayarak ayEma veya basit bir sekilde plastik tutma teknikleri ile zenginlestirilen monositik progenitörler kullan [[maktad E. Altematif olarak, CD14,e in vitro ayrlsma ile CD34 pozitif progenitör hücrelerinden monositik progenitör hücreler elde etmek de ayr da olas dlr, örnegin FLT3L, SCF, TPO, IL-3 ve/veya [L- Tercihen, söz konusu olgun olmayan dendritik hücre insan periferik kan mononükleer hücrelerin, monositlerin veya GM-CSF ile birlikte diger miyeloid progenitör hücreler ve lL-4 veya IL-13 inkübe edilerek elde edilmektedir. YukarEla halihazida anlatldEgEgibi, teknikte ilgili yöntemler bilinmektedir. Buna ilaveten, bu tür yöntemler Örnekte anlat Jinaktad i. Örnegin standart amino asitler, büyüme faktörleri, karbon kaynagütampon sistemi veya belirli tuzlar içeren memelilerin hücrelerinin fizyolojik kosullandiElmasEiçin herhangi bir uygun medyum kullan Jlabilir. Hücre kültürü belirli C02 konsantrasyonlarîida ortam bilesimine göre 37°C sLdaklLlita gerçeklestirilebilir. Buna ilaveten, immatur DH periferik kandan dogrudan elde edilebilir örnegin lökaferez vas Tas-ile. Özellikle tercih edilen bir uygulamada, her ne kadar örnegin bilimsel arastmma veya veteriner hekimligi uygulamalarßa iliskin kosullar memeli menseili olgun olmayan dendritik hücrelerin kullanJhbildigi durumlar için elverisli oldugu halde, olgun olmayan dendritik hücre insan menseilidir. Sonuç olarak, tercih edilen baska bir yapühndlîmada, bulusun yöntemi asagîdaki adüilarü içermektedir: a)periferik kandan mononükleer hücrelerin hazîlanmasü b)ad`rn a)°n|n mononükleer hücrelerinin GM-CSF ve lL-4 veya IL-l3 ile inkübe edilmesi, C)ad31 b),den elde edilen hücrelerin TNFu, IL-lß, IFNy, bir TLR7/8 agonist, pros- taglandin E2 (PG), ve istege baglDolarak bir TLR3 agonist, tercihen poliI:C içeren bir kokteyl ile inkübe edilmesi, ve d)olgun dendritik hücrenin veya hücrelerin toplanmasE Adii a)°da, mononükleer hücreler periferik kandan lökaferez vas Iasüile elde edilebilir. Buna ilaveten, mononükleer hücreler; manyetik veya FACS sîlîllandmma, yERayarak ayßma veya plastik tutunma veya yogunluk asamalEsantriiîjjleme (örnegin metrikamid) ile izole edilebilir. Tercihen, adlm b)°deki inkübasyon 1 ila 9 gün, tercihen 2 ila 9 gün, daha fazla tercihen 2 ila 6 gün almaktadE. Ancak, eger periferik kan/lökaferezden taze bir sekilde izole edilmis immatur DH71er kullanlllyor ise adlmlar a) veya b)°nin ayr lrnasl luygundur. Buna ilaveten, adlm b)"nin yaln ztca saatler sürmesi olas d 11 ve adlm c) ile birlikte gerçeklestirilebilir. Adßi c),deki inkübasyon 12 saat ila 72 saat, tercihen 24 saat ila 20 saat alabilir. YukarEla hâlihazîlda anlatJHIg] gibi, teknikte kalifiye bir kimse eger gerekir ise bu inkübasyon sürelerini uyarlanabilir. Imol gun dendritik hücrelerin inkübasyonu ve toplanmasl yukarida zaten anlatilmlStlr. Bulusun tercih edilen baska bir uygulamas Eida, olgun dendritik hücre veya hücreler in vitro olarak bir veya daha fazla antijen ile ilaveten yüklenmektedirler. Söz konusu antijenlere sahip matur hücrelerin yüklenmesi asag Ela daha detaylEbir sekilde anlat Ernaktad E. Tercihen, söz konusu antijenin veya antijenlerin lenf dügümleri içerisinde efektör T hücresi olgunlasmay jetikledigi düsünülmektedir. Daha fazla tercihen, ve yine asagîla anlatJHgDgibi, söz konusu yükleme söz konusu antijenin en az bir peptitine sahip olgun dendritik hücre veya hücrelerin inkübe edilmesi ile veya antijen kodlayan RNA veya DNA ile birlikte dendritik hücrenin veya hücrelere nükleik asit verilmesi ile gerçeklestirilmektedir. YukarEla belirtildigi üzere, bulus, bulusun kapsam Eda yer alan yöntemle elde edilebilen olgun dendritik hücreler veya olgun dendritik hücre popülasyonu ile ilgilidir. Yukarüa da deginildigi üzere bulus kapsam mdaki yöntemle elde edilebilen olgun dendritik hücreler oldukça fazla miktarda IL-12p70 üretmektedir ve kolay toplanabilmektedirler. Bu birlestirilmis etkiler burada sunulan deneylerdeki J onuleit veya Kalinski kokteyli ile gözlenmemistir (bakîl 3 Örnek). Ömeklerde gösterildigi gibi ve özellikle Sekiller 7 ve 83de gösterildigi gibi, bulusun olgun dendritik hücrelerinin popülasyonu interferon-gamma üretimini stimüle edebilir, her ikisi de dogal öldürücü hücreler (Sekil 8) aynl zamanda peptit-spesifik T hücreleri (Sekil 7). Sonuç olarak, bulusun yöntemi ile elde edilebilen dendritik hücreler, t hücrelerinin aktivasyonunun gerekli oldugu hastalklar Etedavi etmek amac Stla özellikle m vi'vo T hücrelerin aktive edilmesi baglamida uygundur. Sonuç olarak, sonraki bir unsurda, mevcut bulus ayrßa olgun dendritik hücrelerin popülasyonunu içeren bir farmasötik bilesim ile iliskilidir. Buna ilaveten, bulus ayrßa tümörlü hastalklar ve bulaslgjhastallllar (örnegin virüsler, bakteriler, intraselüler bakteriler veya mantar ile kßkEtEan) içeren gruptan seçilen bir hastalEgB tedavi edilmesinde kullanmak için olgun dendritik hücrelerin popülasyonu ile iliskilidir. Tercih edilen bir uygulamada, olgun dendritik hücrelerin söz konusu popülasyonu bulusun bir yöntemi ile elde edilebilmektedirler, burada hücreler yine poli I:C ile inkübe edilmektedir. Yukarlda belirtildigi gibi, bu tür dendritik hücreler özellikle NK hücrelerini stimüle edebilmektedirler ve peptit-spesifik T hücrelerin stimüle edilmesinde poli I:C olmakslîüi bulusun içerisindeki yönteme göre inkübe edilen hücreler kadar etkilidir. Tercihen, yukarEiaki hastalüllarm tedavisi için dendritik hücreler; lenf dügümleri dâhilinde efektör T hücre olgunlasmasmß tetikledigi varsay Ühn antijenlerle in vitro yüklenmektedir. Bu tür teknikler teknolojide bilinmektedir. (Dieckmann D, Schultz ES, Ring B, Chames P, Held G, Hoogenboom HR, Schuler G.Optimizing the exogenous antigen loading af monocyte- Akasaki Y, Abe T, Fukuda T, Saotome H, Ryan JL, Kufe DW, Ohno T. Vaccination Qfgli'oma patients with fusions of dendritic and glioma cells and recombinant human interleukin 12. J A, Galinsky l, DeAngelo D, Avigan D, Kufe D, Stone RJnduction of anti-leakemic cytotoxic '7` lymphocytes by fusion ofpatient-derived dendriti'c cells with autologous myeloblasts. Leuk Res. P.Cotransfecti0n afdendritic cells with RNA codingfbr HER-Z/neu and 4-1BBL increases the induction of tumor antigen specißc cytotoxi'c T lymphocytes. Cancer Gene Ther. 2005 Sep; 12(9):749-56, Kyte JA, Kvalheim G, Aamdal S, Saeboe-Larssen S, Gaudemack G. Preclinlcal full-scale evaluation of dendri'ti'c cells transfected with autologous tumor-mRNA for melanorna Clayton A, Zitvogel L, Jasani B, Balley-Wood R, Wilson K, Tabi Z, Mason MD, Adams M. Preparation of human ovarian cancer ascites-derived exosomes for a clinical trial. Blood Cells Novault S, Flament C, Leboulaire C, Borg C, Amigorena S, Boccaccio C, Bonnerot C, Dhellin O, Movassagh M, Piperno S, Robert C, Serra V, Valente N, Le Pecq JB, Spatz A, Lantz O, Tursz T, Angevin E, Zitvogel L. Vaccination ofmetastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DH) derived-exosomes: results thheflrst phase I clinical trial. J Transl Med. 2005 Mar 2; 3(1): 10, Kawamura K, Kadowaki N, Suzuki R, Udagawa S, Kasaoka S, Utoguchi N, Kitawaki T, Sugimoto N, Okada N, Maruyama K, Uchiyama T.Dendrlti`c cells that endocytosed antigen-containing IgG-lt'posomes elicit efective antitumor immum'ty. J Schadendorf DAnal-ysi's of T -cell responses in metastatic melanoma patients vacci'nated with 22. Epub 2004 Mar 3, Su Z, Dannull J, Yang BK, Dahm P, Coleman D, Yancey D, Sichi S, Niedzwiecki D, Boczkowski D, Gilboa E, Vieweg J.Telomerase mRNA-transfected dendriti'c cells sti'mulate antigen-spect'fic CD8+ and CD4+ T cell responses in patients with metastatic Ilgili antijenler ile dendritik hücrelerin yüklenmesi MHC baglanma kanalidan solüsyonlar dahilinde peptitlerin rekabetçi yer degistirmesi ile yap Ülabilir, veya daha kompleks antijenler için, proteinler ve orijinal tümör lizatlarüveya tümör hücre hatlarijlizatlarEgibi, immatur DH"lerin fagositozu ve uygun isleme ile yapmnaktadî Transfeksiyon yöntemleri de ayrIla (lipofeksiyon, elektroporasyon veya çîilak nükleik asitlerin basit inkübasyonu) uygulanabilir ve nükleik asitler girilmektedir örnegin antij en kodlayan plazmidler, bunlar& RNA°sZlveya DNA ve özellikle orijinal tümörlerden RNA veya DL,len'n içine tümör hücre dizileri. Herhangi bir türde antijen kaynaklarl blarak kullanmak için örnegin membran fragmanlarl !veya eksozomlar olarak düsünülebilir orijinal MHC molekülleri ile birlikte diger antijenik kombinasyonlar da olabilir. YukarEla belirtildigi gibi, dendritik hücreler örnegin kanserli hücre tipi gibi seçilen bir hücreye kars Eaktif T hücreleri üretmek için dogrudan organizmaya verilebilir. Bu hücrelerin 5111'da farmasötik olarak kabul edilebilir tasS/EEIar ile birlikte verilmesi, bir memeli kan] veya doku hücreleri ile nihai kontaga bir hücrenin girilmesi için normal olarak kullanJhn yöntemlerin herhangi birisi ile gerçeklesmektedir. Parenteral uygulama için uygun formülasyonlar, örnegin, intraartiküler (eklemlerde), intra- venöz, intramüsküler, intradermal, intraperitoneal, ve subkütanöz yöntemlerle verilen (tercihen intradermal veya subkütanöz), ve tasyldllar sulu izotonik steril enjeksiyon solüsyonlar içermektedir, bunlar sunlarÜçerebilir: antioksidanlar, tampon maddeler, bakteri önleyiciler, ve planlanmß alßîiß kanüile birlikte izotonik formülasyonunu eriten çözünen maddeler, ve askEla tutan maddeler, çözündürücüler, kalEllastBEJajanlar, stabilizatörler ve prezervatitler içerebilen sulu ve susuz steril süspansiyonlar. Intravenöz veya intraperitoneal uygulama bulusun dendritik hücreleri için tercih edilen uygulama yöntemidir. Mevcut bulus bakEnßdan bir hastaya verilen dendritik hücrelerin dozu zaman içinde hastada faydalübir terapötik yanEEetkilemek için veya kanser hücrelerinin büyümesini engellemek için veya enfeksiyonu engellemek için yeterli olacaktm Bundan dolayÇ hücreler bir hastaya virüs veya tümör antijenine cevaben etkili bir CTL yanmiortaya çLkarmak için veya hastalLk veya enfeksiyondan kaynaklanan semptomlar | ve/Veya komplikasyonlar l hafifletmek, azaltmak, iyilestirmek veya en azlridan k dmen durdurmak için yeterli bir miktarda verilmektedir. Bunu gerçeklestirmek için gerekli miktar "terapötik olarak etkili doz" olarak tanînlanmaktadi. Doz; üretilen dendritik hücrenin aktivitesi ve hastanEi dummu aynj zamanda vücut agilgjveya tedavi edilecek olan hastanîl yüzey alanjile belirlenecektir. Dozun miktarEda ayrßa belirli bir hastada belirli bir hücrenin varlgü dogasüve yayglîiltgüile degerlendirilecektir. Örnegin kanser (örnegin, metastatik melanom, prostat kanseri vs.) gibi hastalRlarEi tedavisinde veya korunmas Eda verilecek olan hücrenin etkin miktarßß belirlenmesinde, doktorun dolasan plazma seviyelerini, CTL toksisitesini, hastallgîi ilerlemesini ve girilen herhangi hücre türlerine karsîl immün yarim indüksiyonunu degerlendirmesi gerekmektedir. lnfüzyondan önce, kan numuneleri elde edilmektedir ve analiz için saklanmaktad ri. Genellikle intraperional olarak 70 kg agîllgîida bir hastaya kabaca 60-120 dakika üzerinden zerk edilmektedir. Tercihen, en az 107/ as [[ama noktalîhücre say JhrEkullan [llnaktad B. Enjeksiyonlar örnegin 2 haftalEk aralEklarla 4 kez tekrarlanabilir ve intradermal veya subkütanöz enjeksiyonlar ile lenf dügümlerinin yakima verilecektir. Rapel enjeksiyonlar 4 haftalül bir aradan sonra gerçeklestirilebilir. Vital bulgular ve puls oksimetre ile oksijen satürasyonu yakEidan izlenmektedir. Kan numuneleri infüzyonu takiben 5 dakika ve 1 saatte elde edilmektedir ve analiz için saklanmaktad E. Hücre reiniîizyonu bir yü] [E sürede toplam 10-12 tedavi için kabaca her ay tekrarlanmaktadlit Birinci tedaviden sonra, iniüzyonlar klinisyenin takdirine dayall l olarak ayakta tedavi edilen hasta bazlnda gerçeklestirilebilir. Eger yeniden infüzyon bir ayakta tedavi edilen hasta olarak verilir ise, katllllmc !tedaviyi takiben en az 4 saat boyunca gözlenmektedir. Uygulama için, mevcut bulusun hücreleri hastanüi genel sagltgia ve kitleye uygulandEgIgibi; hücre tipinin LD-50'si (veya toksisitenin diger ölçüsü) ve çesitli konsantrasyonlarda hücre tipinin yan etkileri ile belirlenmektedir. Uygulama tek veya bölünmüs dozlar vasîasjile gerçeklestirilebilir. Bulusun hücreleri sitotoksik ajanlar, nükleotid analoglar ve biyolojik cevap degistiriciler içeren bilinen bir geleneksel tedavi ile bir kosul için diger tedavileri de ilave edebilir. Benzer bir sekilde, biyolojik cevap degistiricileri istege bagljolarak dendritik hücreler ile tedavi için eklenmektedir. Örnegin, hücreler istege baglüolarak bir adjuvan, GM- CSF, IL-l2, veya IL-2 bir sitokin veya KLH. Yukarda belirtildigi gibi, bulus kapsamlndaki yöntem en az bir olgun dendritik hücre hazlîllamak için TNF-u, lL-lß, lFNy, bir TLR7/8 agonist, prostaglandin E2 (PG) ve istege baglEblarak bir TLR3 agonist, tercihen polil: C"nin birlestirilmis kullanEriîile iliskilidir. Buna ilaveten, burada ilaveten TNF-oi, lL-lß, lFNy, a TLR7/8 agonist, prostaglandin E2 (PG) ve istege baglEolarak bir TLR3 agonist, tercihen poliI:C içeren bir bilesim açlklanmaktadi. YukarEia belirtildigi gibi, her iki durumda, tercihen söz konusu TLR7/8 agonist is an imidazokinilon türünde bir immün yarim modifiye edici bir bilesendir, tercihen 4-amino-2- etoksim-til-a,a-dimetil-1H-imidazol[4,5-c]kinilon-l-etanol (R84 8). Bulus istemlerde tan @land [g E sekilde koruma kapsam& D 5 E Eland Emay 3 amaçlamayan asag daki sekiller ve örneklerle ilave olarak açlklanacaktlr. Sekillerin kEa aç Rlamas :I FarkLmature edilmis dendritik hücreler ienerasvonu (DHiler) A. Neubauer haznesinde ve FACS analizinde (CD14) manüel sayîh ile belirlenen ekilen toplam hücreler (mononükleer hücreler) veya CD14 pozitif monositler üzerine hesaplanan primer hücre kültüründen sonra (6 gün farklllastlrma +24s olgunlasma) toplanan DH31erin geri kazanlm .l FACS kaliburun FL-3,ü içerisinde ölçülen 7AAD kaynasma miktarîria dayall `olarak algllanan yasama kabiliyeti. Altri standardlridaki Jonuleit kokteyli ile mature edilen DH"lerin kesik çizgi gösterilen seviyeleri. B. Primer DH kültüründen sonra DH'ler için DH spesifik moleküllerin yüzey ekspresyonu. DH-spesifik molekül CD83"ün yüksek ekspresyonu ile kars Ühstîülitgüda düsük CD14 dßavurumu DHslerin matur statüsünü göstermektedir, FACS analiz ile gösterildigi gibi (geçitleme olmaksîß tüm hücrelerin yüzdesi, toplamda 1000 hücrenin elde edilmesi). FACS analizi ile algJhnan primer DH kültüründen sonra yardßicE uyaran moleküllerin, CD8O ve CD867nîl yüzey ekspresyonu. DHslerin lenI` dügümünün içine potansiyel göçünün göstergesi olarak kemokin reseptörü 7°nin (CCR7=CD 197) ekspresyonu. Izotip kontrol antikoru ile kaplamaya göre pozitif yüzde alg lanmaktadlii. DC] = Jonuleit = TNF-alpha (IOng/ml) + IL-lbeta (10ng/ml)+ IL-6 (15ng/ml) + Prostaglandin E2 (= PGEZ, JOOOng/ml) DC2 = Kal'mskj = TNIF-alpha (lÜng/ml) + IL-lbcta (iOng/mi) + IFN alpha (3000rU/mi) + LFNgamma (IOOOIU/ml) -l- polyIIC (20 ng/ml) DC3 = TNF-alpha (10ng/mi) + IL-lbeta (iOng/mi) + PGE2 (IOOng/mi) + IFNganima DC4 "-'I'N'F-alpha (iong/mi) + IL-lbcta (lOng/ml) + PGE2 (ZSOng/ml) + IFNgamma (SOOOIU/ml) + R848 (1 tig/ml) - DCS = TNF-alpha (IOng/ml) + IL-lbeta (lÜng/ml) + PGE2 (250ng/ml) + IFNgamma (SOÜOIU/ml) + R848 (l ;Lg/1111) + poly I:`C (ZOiiyml) Farki-olgunlasmî DH9lerin olgunlasma stabilitesi (V kama denevi) DH`ler sitokinlerden ylkanarak çlkarllmstlr ve yaln ztca serum ve gentamisin ile DH kültür medyumunda olgunlasmadan sonra ilave olarak kültürlenmistir. A.7AAD kat 111 Ela dayaljolarak tespit edilen ykayarak ç Earlldktan sonra farklj olgunlasmß DH,lerin yasama kabiliyeti. B.YEBayarak çEIgarma isleminden sonra yüksek CD83 ekspresyon seviyeleri ile kßlaslandgida düsük uyarlînß CD14°ün yüzey ekspresyonu. C.Y kayarak çEkarma isleminden sonra yardîhc Duyaran moleküller CD80 ve CD86 ve CCR7"nin ekspresyonu . DCI = Jonuleit = lNF-alpha (IOng/ml) + [IJ-!beta (10ng/ml)+ IL-6 (15ng/ml) + Prostaglandin E2 (= PGE2, lOOOng/ml) DC3 = TNF alpha (IOng/ml) + IL lbeta (lûng/ml) + PGE2 (lOOng/ml) + lFNgamma (1000IU/ml)+ R848 (i pg/ml) DC4 = TNF-alpha (IOng/ml) + lL-lbcta (IOng/ml) + PGE2 (250ng/ml) + IFNgamma DCS = TNF-alpha (IOng/ml) + IL-lbeta (lOng/ml) + PGE2 (250ng/ml) + IFNgamma (SOOOIU/ml) 4- R848 (l ;lig/ml) + poly I:C (ZOng/ml) Farklîblgunlasmî DH"lerin dondurarak saklanmas :(krivoprezervasvon). DHaler dondurulmustur ve sE/Dnitrojenin gaz evresi altida depolanmßti ve çözüldükten sonra analiz edilmistir. ng. A.7AAD katlîhßa dayalîlolarak tespit edilen ykayarak çEarItlEtan sonra farkl] olgunlasmlsl DH,lerin yasama kabiliyeti. B.D0ndurma isleminden sonra yüksek CD83 ekspresyon seviyeleri ile klýaslandlglnda düsük uyar lmls CD14,ün yüzey ekspresyonu. C.D0ndurma isleminden sonra yard Bicü uyaran moleküller CD80 ve CD86 ve CCR7"nin ekspresyonu DCI = Joiiulcit = TNF-alpha (10ng/ml) + IL-lbeta (lOng/ml) + IL-6 (lSng/ml) + Prostaglandin 52 (= PGEZ, 1000ngimi) DC2 - Kalinskj .-. TNF~alpha (lOng/ml) + [L-lbcta(10ng/ml) + [FN alpha (30001U/m1) + DC3 = TNRalpha (long/ml) + IL-lbeta (IÜng/ml) + PGE2 (100ng/ml) + IFNgamma DC4 = TNF~alpha (lOng/ml) + IL-lbeta (IOng/ml) + PGEZ (250ng/ml) + IFNgamma (50001U/mi) + R848 (1 !ag/ml) DCS = TNF-alpha (IOng/ml) + IL-lbera (IOng/ml) + PGEZ (250ng/ml) + IFNgamma (SOOOIU/ml) + R848 (1 pg/ml) + poly I:C (20ng/ml) KarEtîiIan bir lenfosit reaksivonunda farklE olgunlasmß DH,lerin alla-uyaran kapasitesinin analizleri A. Otolog T hücrelerinin proliferatif kabiliyetinin islevsel kontrolü: yalnElca medyumun içindeki T hücreleri, üçüncü parti ile uyar Ian T hücreleri (=bes kar IsJtEJInS MNC donörleri) (4000 rad @33 almg 10e5/çukurcuk, oran lzl uyaran hücreler: responder hücreler), T-hücreler + IL-2 (5IU/ml) ve PHA lûmg/ml son 685, SOIU/ml IL- 2 ile uyarlan T-hücreleri. T hücre sayLlarLlOeS/çukurcuk. 7 gün üzerinden yardimi kültür, son 24 saatin 3H-timidin katlllm ile çogalma ölçülmüstür. Tüm degerler bes tekrar edilen ç-ukurcuktan hesaplanm l slthi B.Bir örnek allojenik T hücre cevap vericinin çogalma kabiliyetinin islevsel kontrolü. oranßß hücre sayßßa göre, DH,ler: responder hücreler) negatif kontrolü D.Farkljolgunlasm@ DH°ler ile uyarEÜan otolog T hücrelerinin çogalmas 3(DH sayßü E.Fark1301gunlasm3 DH'ler ile uyarEan bir örnek, allojenik T hücre responderin çogalmasü (DH sayßü 10e4/çukurcuk, T hücre sayED 10e5, oran 1:10, DHsler: responder hücreler). F.Fark1| lolgunlasm s DH°ler ile uyar lan otolog T hücreleri ile k ;taslandi g lida üç baglrhslzt T hücre responderlerin çogalma verilerinin özeti. DCI = Jonuleit = TNF-alpha (IOng/ml) + IL-lbeta (10ng/rnl)+ IL-6 (ISDg/ml) + Prostaglandin 52 (= PGE2, lOOOng/ml) DC2 = Kalinski = TNF-alpha(10ng/ml)+ IL- lbeta (IOng/ml) + IFN alpha (3000rU/mi) + DC3 =›TNF-alpha (lOngfml) + IL-lbeta (lOng/ml) + PGE2' (wong/m1) + IFNgamma (10001'U/ml)+ R848(1ug/ml) DC4 = 'INF-alpha (IOng/ml) + LL-lbeta›(10ng/ml) + PGE2 (250ng/ml) + IFNgamma (SOOOIU/ml) + R848 [l pg/ml) DCS = TNF-alpha (IOng/rnl) + IL-lbeta (lOng/ml) + PGE2 (250ng/rnl) + IFNgamma (SOOOIU/ml) + R848 (1 pg/ml) + poly 12C (20ng/ml) FarklIkoktevller kullan [[arak Olgunlastîillan IL-12p70 ve IL-103un üretimi Immatur DHller farklüolgunlasma kokteylleri ile kültürlenmistir ve IL-12p70 ve IL-lO miktarlarî standart ELISA ile belirlenmistir. Sßasgila dolu çubuklar IL-l2p703i göstermektedir ve bos çubuklar IL-10"u göstermektedir. A: 7 günden sonra primer olgunlasma hücrelerin üst faz medyumu; B: Malzeme ve Yöntemlerde anlat 1d g lgibi sinyal3-deneyi temsil eden, 24 saatlik bir kokültür süresini takiben ylkanmsl, olgunlasm sl DHSIerin ve CD40L-nükleik asit verilmis fibroblastlarlîi kültürlerinin üst faz medyumu. C. sinyal-3 deneyinin pg/ml degerlerine dayalE olarak, farklj kokteyllerde olgunlastBIbn DH popülasyonlar :için IL-12p70/IL-10°un oranlarEbelirlenmistir. Hesaplama yapmak için, IL-12p70 ve IL-lOsun teorik olarak esit biyolojik potansiyelde oldugu varsayBnStE. Dolu daireler 0 ve 3,5 arasEida pozitif oranEgöstermektedir, sivri çizgiler IL- 12p70 salgEIama için Jonuleit veya Kalinski kokteyli ile olgunlastiülan DH"lerin keskin farkl l||l DCI = Jonuleit = TNF-alpha (IOng/ml) + IL-lbeta (IOng/ml) + 1L-6 (ISng/ml) + Prostagland'm E2 (= PGE2, lOOOng/ml) DC2 = Kalinski = TNF~alpha (IOng/ml) + IL-lbeta (IOng/ml) + IFN alpha (3000IU/ml) + lFNgamma (IOOOl'U/ml) + polylzc (20 ng/ml] DC3 = TNP-aipha`(10ng/mi) + lL-lbeta (lOng'ml) + PGEZ (lOOng/ml) + IFNgamma (lOOOIU/ml) + R848 (lpg/ml) DC4 = TNF-alpha (lOng/ml) + IL~1beLa (lOng/ml) + PGEZ (250ng/m1) + IFNgamma (SOOOIU/ml) + R848 (lpg/ml) DCS = TNF-alpha (lOng/ml) 47 IL-lbeta (IOng/ml) + PGEZ (250ng/ml) + [FNgamma (SOOOIU/ml) + R848 (lpg/ml) + poly I:C (20ng/ml)_ Sekil 6: in vitro kopyalanan RNA kodlayan EGFP ile transfekte edilen DH*lerde EGFP,nin ekspresyonu Akß sitometrisi histogram bindirmeleri; 24 saat elektroporasyondan sonra matur DHalerin içine (dolgun egriler) transfekte edilen EGFP RNA°y3göstermektedir ve negatif kontroller olarak ilgili transfekte edilmeyen DH"leri (bos egriler) göstermektedir. DHiler gösterilen dört kokteylde olgunlastEEmEtE, RNA elektroporasyon ile girilmistir, DH'ler olgunlasma kokteylleri içeren ilgili ortamlarEia döndürülmüstür ve 24 saat sonra akß sitometrisi için toplanmlslardlii. Sayllar EGFP-pozitif DH°leri ve bunlarln ortalama Horasan yogunluklar n i göstermektedir. Bu veriler 24 saatte ve 48 saatte ölçümler ile birlikte iki deneyi temsil etmektedir. DCI = Jonulcit = 'INF-alpha (IOngfml) + lL-lbcm (IOng/ml) + lL-ö (lSng/ml) + Prosuiglanditi E2 (`- PGEZ, IOOOng/ml) DC2 = Kalinski = TNF-alpha (lûng/ml) + IL-lbeta (lOng/ml) + [FN alpha (3000IU/ml) + DC4 = TNF-alpha (lOng/ml) + IL-lbeta (10ng/ml) + PGEZ (250ng/ml) + IFNgamma (SOOOlU/ml) + R848 (1 tig/ml) DCS = TNF-alpha (lûng/ml) + IL-lbeta (lûng/ml) + PGEZ (250ng/ml) + IFNgamma Sekil 7: Virüs-peptit pulsed DH,lere yanii veren bir HLA-A*0201-pozitif donöründen otolog lenfositlerin yan m3 T hücre yanmar; matur peptit pulsed DH"ler ile birlikte 7 g ilk olarak aktive edilmis olan lenfositler (T hücre zenginlestirilmis Elutra fraksiyonu 3= % kullanan bir lFNy-ELISPOT deneyinde degerlendirilmistir ve daha sonra monositler art IEF peptitleri ile 24 s boyunca yeniden uyarhnßlardm ELISPOT analizleri için, 4x103 otolog in vitro aktive edilen lenfositler, bes peptit CEF havuzu ile birlikte 2x103 monositle uyarllrnlslardln. Üç tekrar çukurcuk için ortalama ± S.D. hesaplanmlstlit Açlklama: yetersiz geri kazanlmlara dayal lolarak, DC2 hücreleri ile aktive edilen lenfositler deneye dâhil edilmemistir. DCI = Jonuleit = TNF-alpha (lOng/ml) + lL-lbeta (lÜng/ml) + [L-6 (ISng/ml) + Prostaglandjn E2 (= PGE2, lOOOng/ml) DC2 = Kalinski = TNF-alpha (IOIig/mJ) -1- IL-lbeta (lOrig/ml) + IFN alpha (3000IUIml) 4- DC3 = 'INF-alphaüûng/ml) + IL-lbeta (lOng/ml) + PGE2 (100ng/ml) + IFNgamma DC4 = 'INF-alpha (10ng/ml) + IL-lbeta (lÜng/ml) + PGE2 (ZSOng/ml) + lFNgamma (soooruzmi) + R848 (i pg/ml) DCS = TNF-alpha (lOng/ml) + IL-lbeta (lÜng/ml) + PGE2 (2500g/ml) + IFNgamma (SOOOIU/ml) + R84B (i ;lg/ml) + poly I:C (20ng/ml) Sekil 8: matur DH7ler ile uyarfßin 0t010g lenfositlerin interferon-gamma yanftîl Bir HLA-A*0201 donöründen lenfositler burada anlatüan Jonuleit kokteyli, Kalinski Kokteyli ve üç yeni kokteyl kullan Ührak olgunlastmman otolog DH"lerle uyarîmßtî Periferik kan lenfositleri (PBL"ler) yülayarak ayEma ile ayrflhißtß ve fraksiyon 3`e dahil edilmistir, burada hücrelerin %54.8"i CD-3 pozitif T lenfositleri ve %17,7,si de CD56 pozitif hücreleri idi, bu da dogal öldürücü (NK) hücreler için karakteristiktir. (A) Ylkayarak ayirma fraksiyonu 3lte PBL"ler farkll 'kokteyller kullanan olgunlasmls farkll lDl-l popülasyonlar lile dogrudan inkübe edilmistir ve bunlarüi interferon-gamma salgühmasDÜFN-gamma) standart bir ELISPOT deneyden 24 saat sonra ölçülmüstür. DC! = Jonuleit = TNFOL (lOng/inl) + IL-lß (IIOng/ml) + IL-6 (lSng/ml) +.Prostaglandin E2 (= PGEZ; lÜOOng/ml); DCZ = Kalinski = TNFa (10ng/ml) + IL-lß (lûng/ml) + IFNa (30001'U/ml) + IFN'Y (IOOOIU/ml) + poIyI:C (20ng/ml); DC3 = TNFoc (lOng/ml) + IL›lß (IOng/ml) +PGE2 ( lOOnngl) + IFNy(1000rU/ml) + R848(1pg/ml); DC4 = TNT-`0: (lûng/ml) + IL-lß (IOng/ml) + PGE2 ( + R848 (1 tig/mb; DCS = mm (lOng/rnl) + IL-lß (lOng/ml) + PGEZ ( + R848 (lpg/ml)_+ poly 1: C (ZOng/ml). ' Asagmaki örnek farkl :donör hücreleri kullan Earak gerçeklestirilen en az üç bag &132 deneyin temsili örnegi olarak bir örnegin aç HâlamasEiEyapmaktad E. 1. Malzeme ve Yöntemler Lökaferez ve ylavarak av @ma Insan dendritik hücrelerinin üretilmesi için progenitör hücre popülasyonu olarak monositlerin elde edilmesi için, ELUTRA ile yügayarak ayîma kapalEsistemi kullandR(Gambr0 BCT, Lakewood, ABD). Bildirilen onaydan sonra, mobilize olmayan donörler modifiye edilmis bir MNC programj (V6zl) kullanüarak bir COBE Spectra hücre ayEEEKGambro BCT, Inc. Lakewood, ABD.) ile 180 dakika lökafereze maruz kalmßtlî: aymma faktörü 0.8 ml/dak toplama oran :lve yalnâca sistemi için kosullarln ayarlanmasl liçin otomatik kan sayacl lACT Dif (Beckman Coulter, Krefeld, Almanya) ile analiz edilmistir. Lökaferez ürünler; sabit bir rotor hBJ(2400rpm) ve rotor-kapalütoplama ile takip edilen bir medya akin oranEiEi bilgisayar kontrollü asamalEayarlamas Dkullan [Barak ters-akß santrifüj lü yügayarak ayrstßma yöntemi ile üretici talimatlarEia uygun bir sekilde ELUTRA (Gambro BCT, Lakewood, ABD) ile islenmistir. Böylece %1 insan serumu albümini içeren (Octalbine®, Octapharma, Langen, Almanya) HANKs tamponlu tuz solüsyonu (Biochrom, Berlin, Almanya) içeren 5000ml"lik akan tampon hazlîllanmßtm ELUTRA islemi rotor-kapalü fraksiyonda zenginlestirilmis monositler ile birlikte, bes fraksiyon ile sonuçlanmlstLr. Fraksiyonlarln hücresel bilesimi otomatik kan sayacl lACT Diff ile (Beckman Coulter, Krefeld, Almanya) ve FACS analizi ile karakterize edilmistir. EL U T RA fiaksivonlarß E: FA CS-anali'zi Orijinal lökofarez ürünün hücreleri ve tüm bes ELUTRA fraksiyonu asagElakilerle 30 dakika inkübe edilmistir; fluoresein izotiyosiyanat (FITC)-ve fikoeritrin (PE) konjüge monoklonal fare antikorlarî IgG izo-tip kontroller (klon X-40), anti-CD14-FITC (klon: MP9), anti- CD19-FITC (klon: (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya) ve anti-CD3-PE (klon UCHTI), anti-CD56-PE (C5.9), anti-CDlö-PE (klon: DJ 1300), ve ilave bir kontrol olarak CD14-PE (TÜK4) (Dako Diagnostics, Hamburg, Almanya) ve anti-CD67-FITC (klon: 80H3) (Immunotech, Marseille, Fransa). Hücreler ylkanmlstlii ve PES +%2 fetal buzagl .serumunda resüspanse edilmistir (Biochrom, Berlin, Almanya). Aksl sitometrisi analizi Cellquest Prosoftware kullanilarak bir FACS Kalibur cihazlnda gerçeklestirilmistir (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya). Y Ravamk avrümü monositlerden immatur monositten-türetilmis dendritik hücrelerin olusturulmus J Rotor-kapal Efraksiyondan hücreler veya sonradan isimlendirilen fraksiyon 5 DH üretimi için dogrudan kullanlhißti eger CD14 pozitif hücreler FACS analizi ile alg Ianan tüm hücreler üzerinden %60"| .temsil ediyor ise. Fraksiyon 5 hücreleri ELUTRA toplama torbaslndan kültürü deney tüpünde (NUNC, Wiesbaden, A1manya); çok düsük endotoksin içeren (Biochrom, Berlin, Almanya) RPMI 1640, %l,5 insan serumu (A-B pozitif yetiskin erkekler havuzu) (Kan BankasDUniversity of Tuebingen, Almanya) ve 10 ug/ml Gentamisin (Biochrom, Berlin, Almanya) içeren 35ml DH inedyuma ekilmistir ve 37°C sBaklItta, % 5 C0; ile nemli bir ortamda altügün boyunca kültürlenmistir. l, 3 ve 6. Günde hücre kültürleri deney tüpü bas îia 7ml taze DH medyumunda; ve 20 ng/ml rekombinant insan IL-4 (R&D Systems, Wiesbaden, Almanya) ile tamamlanm Eti. Dendri'ti'k hücreleri olgunlasmas l Olgunlasma islemleri; deney tüpü basLna burada anlatlan ilave 7 ml taze DH medyumu ile birlikte 6. günde immatur DH,lere, belirtildigi gibi, sitokinlerin ve diger belirteçlerin fark] | kombinasyonlar n'n eklenmesi ile baslatllmlstln: Jonulei't kokteyli: lOng/ml TNF-Ot, 10ng/ml lL-l-p, lSng/ml IL-6 (R&D Systems, Wiesbaden, Almanya) ve l^g/inl prostaglandin E2 (Minprostin®, Pharmacia/Pfizer, Erlangen, Almanya), Kali'nski' kokteyli.' 10ng/ml TNF-or, lOng/ml IL-l-ß (R&D Systems, Wiesbaden, Almanya), , çift dizgili RNA (poli IzC, InVivogen, Toulouse, Fransa). Yem' kokteyl 1: 10ng/ml TNF-a, 10ng/ml IL-l-ß (R&D Systems, Wiesbaden, Almanya), SOOOIU/ml IFNy (Imukin®, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Almanya), tig/ml R848 (anivogen, Toulouse, Fransa) ve 250ng/ml prostaglandin Ez. Kokteyl l"in bir varyasyonu olarak, ayni bilesenleri kullandlk, yaln'Zca IFNy konsantrasyonu lOOOIU/mFye azalt'lîll_ ve prostaglandin E2 ila lOOng/mVye azaltTdî Yeni kokteyl 2: kokteyl lie benzer artDZOng/ml çift dizgili RNA (poli IzC, anivogen, Toulouse, Fransa). Kontrol olarak, bir deney tüpü yalnßca 7 ml taze medyum almßtm ve immatur DH'ler olarak hizmet vermistir (veriler gösterilmemektedir). Dendri'ti'k hücrelerin toplanmas l 24 saat boyunca olgunlasma kokteylleri ile DHslerin inkübasyonundan sonra, hücreler yavas çalkalama ile PBS+ %0.5 insan serumu ile iki kez ylkanarak toplanmlsltlri, hücreler Neubauer haznesi ile sayllmlstlii ve analizler için hazlrlanmlStlrI. Akü sitometri'k (FA CS)-analizi DH tenotigi: DHsler asagElaki Horasan-konjuge monoklonal fare antikorlarüile etiketlenmislerdir; izotip (FITC, klon: C ve HLA-DR (PE, Fransa) için belirlilik ile birlikte etiketlenmislerdir. CCR7 boyama; kültür üst faz nda 60 dakika boyunca DHilerin inkübasyonu ile ve yl'kamadan sonra da siyanin (5) (Jackson lmmuno, West Grove, USA) ile konjüge sEan lgG`ye karsß ikincil fare antikorunun alglhnmasE ile hibridoma EBNA-A2,nin (klon R3) lg2A"sj için izotip kontrolü ile kars Iastildfgida bir sßan hibridoma BLR-2 (klon SES) ile geçeklestirilmistir (E.Kremmer, Canlllgjtest etmek için, DH"ler peletlenmislerdir ve long/ml in PBS + 2% fetal buzagü serumunun nihai konsantrasyonlarüida 20 dakika boyunca 7-Amin0aktinomisin D"de resüspanse edilmistir (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Almanya). YEkamadan sonra, hücreler FACS Kalibur makinesinin üçüncü kanalnda analiz edilmislerdir. ngunlasma sabitli'k kontrolü (Y @avarak cümrma- Testi) Olgunlastîülnß, toplanm& ve yEkanmlIs DH, ler 250m2 hücre kültürü deney tüplerinde hiçbir sitokin olmaksßm 2,5-3 X 106/9ml taze DH medyumuna yeniden ekilmislerdir (NUNC, Wiesbaden, Almanya). Yaklas J& 44 s sonra, DH° ler toplanm Et& ve FACS analizleri ile fenotipler belirlenmistir. Sinyal &Deneyi DHSler önceden anlatîld g gibi T-hücresini taklit eden hücreler ile birlikte kültürlenmislerdir (Kalinski, 2004). Klsiaca, olgunlast ii llnls' ve ylkanmls DHsler 2 x 104/çukurcuk konsantrasyonlarlîida 96 çukurcuklu plakalara yeniden ekilinislerdir ve 5x 104/çukurcuk konsantrasyonlarßda insan CD40L,si ile stabil olarak transfekte edilmis fare fibroblastlarjile inkübe edilmistir (Garrone P, Neidhardt EM, Garcia E, Galibert L, van Kooten C, Banchereau J. Fas ligazion induces apoptosis of CD40-activated human B lymphocytes. J Exp Med. 1995 herhangi bir ekleme olmaksâm ve standart medyumda CD40L olmaksâm DH`ler test edilmistir.24 saat sonra, plakalar santrifüjlenmistir ve 8 tekrarlama çukurcugunun üst fazlarü ELISA ile IL- 10 ve IL- 1 2p70 'in analizleri için toplanm Slard li ELISA (IL-Igp 70/IL-10) DHiler tarafindan olgunlasma islemi (primer Dl-Fler) slrtaslnda lL-12p70 ve lL-lO salgTanmasFIve Sinyal-3 deneyi içindeki DH"ler standart kantitatif ELISA ile belirlenmistir. ELISA, üreticinin talimatlarlîia göre lL-12p70 ve lL-10,un (R&D Systems, Wiesbaden, Almanya) belirlenmesi için önceden-test edilmis antikor ikili setleri kullanJhrak gerçeklestirilmistir. Tetrametilbenzidin ve H202 ile kolorimetrik substrat reaksiyonu 450 nmade H3PO4 ile durduktan sonra ve 620nm ile dalga uzunlugu düzeltmeden sonra ölçülmüstür ve yazmüi easy fit ile analiz edilmistir (SLT, Crailsheim, Almanya). Dendriti'k hücrelerin dondurularak saklanmasl l toplanmlstlii (Octal-bine®, Octapharma, Langen, Almanya) ve %20 insan serum albümininde Dessau-Thornau, Almanya) içeren 0,5 ml (esit miktarlarda) taze hazlîllanm`sl dondurucu solüsyon ile nazik bir sekilde karßtîümßtß Dondurma tüpleri (NUNC, Wiesbaden, Almanya) gece boyunca -80°C sßaklügtta saklanmßt& ve sßl'ünitrojen konteynerin gaz evresine transfer edilmistir. Karlslt il Im sl-lenfosit reaksivonu DHsler belirtildigi gibi in vitro olgunlastliilllnlStlr, PBS + %0,5 insan serumunda 2 kez (Nunc, Wiesbaden, Almanya) mikro plakalarn 96 çukurcuklu yuvarlak alt kisim na kaplanm Tstîl. FarklÜdonörlerden ELUTRA prosedüründen sonra fraksiyon 3,ün dondurularak saklanmß hücreleri responder hücrelerin bir kaynagü olarak kullanJInßtE ve allojenik donörlerin DH,lerine lxlOS/çukurcukta ekilmistir. MHC farleRlarJvasîasjile T hücre aktivasyonu için bir kontrol olarak, üçüncü parti hücreler asagElaki gibi kullanElmßlardE: 40 Gy ile ßßlandlktan sonra beyaz kan hücrelerinden elde edilen 5 bagEnsEl donörün MCNilerinin bir karßßijstimülan hücreler olarak kullanmnßlardm Çogalmak için T hücrelerinin belirsiz potansiyeli IL-2 ile (Proleukin® by Chiron, Emeryville, USA) 501U/ml`de ve Iitohemaglutinin ile 10mg/mlide (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Almanya) inkübasyonu ile kontrol edilmistir. 6 gün sonra, hücreler 0,5uCi/çukurcuk 3H-timidin ile dopdolu olmaktadlii (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Almanya) ve 3l-l-timidin allml lbir ß-sayaç cihazl lkullan larak 24 saat sonra belirlenmistir (Wallac, Freiburg, Almanya). DH "lerin içine E GFP-RNA transjeksiyonu EGFP-RNA in vitro olarak üretilmistir ve daha önceden de anlatEDdEgDgibi 24 saatte olgun DHslerin içinde elektroporasyon yap Dnßti (Nair, S. K., Boczkowski, D., Morse, M., Cumming, R. 1., Lyerly, H. K. and Gilboa, E. (1998). Induction of primary carclnoem-bryonic anti'gen (CEA)-specific cytotoxic T lymphoeytes in vitro using human dendri'ti'c cells transfected with RNA. Nat Biotechnol. 16:364-369, Javorovic, M., Pohla, H., Frankenberger, B., Wolfel, T. and Schendel, D.J. (2005). RNA transfer by electroporation into olgun dendri'tik hücreleri leading to reactivation of effector-memory cytotoxic T lymphocytes.' a quantitati've toplam hacme sahiptir, 8 ug EGFP-RNA ve 3x106 DH°1er içermektedir. Elektroporasyondan sonra, DHaler orijinal olgunlasma medyalarEia döndürülmüslerdir ve 37°C sßakllkta ve %5 COfde 24-çukurcuklu plakada akg sitometrisi analizinden önce 24 veya 48 saat boyunca inkübe edilmistir. Virüs-spesifik T hücre aktivasyonunun ELISPOT deneyi Aktivasyon için, %10 insan serumuna sahip RPMI 1640 medyumunda, 24-çukurcuklu plakalarda 1x105 peptit-yüklü DH,1er ile lxlO6 hücreler/çukurcukta ELUTRA fraksiyonundan (3) lenfositler kaplanm sltlri; d3,te 30 lU/ml lL-2 eklenmistir ve d7"de lenfositler toplanmlst'rt HLA-A*, EBV- BMLF veya iki ilave peptit içeren CEF havuzu (PANATecs GmbH, Tuebingen, Almanya), EBV-LMP-. In vitro aktive edilmis T hücreleri ve otolog monositler artDCEF peptitleri 37°C sßaklülta %5 C0; ile 24 saat boyunca 2 mM L-glutamin, l mM sodyum piruvat, penisiilin/streptomisin (100 U/ml), %10 insan AB serum (BioWhittaker, Verviers, Belçika) ve 20 IU/ml IL-2 içeren RPMI 1640 medyumda inkübe edilmistir. Anlatilllg: gibi IFNy-ELISPOT analizi gerçeklestirilmistir (Becker, C.,ve digerleri (2001). T lenfositler ile birlikte adoptif tümör tedavisi bir IFNy yakalama deneyi ile zenginlestirilmistir (Nat Med. 7: 1159-1162, Pohla, H., ve digerleri (2000). Allogenei'c vacci'nation for renal cell carcinoma: Development and monitoring. Bone Marrow Transplant. 25: 83-87), ancak burada antikor ile önceden kaplanmis PVDF plakalarl l (Mabtech AB, Nacka, Isveç) ve streptavidin-alkalin fosfataz ve kullanlîha bazi BClP/NBT- artEsubstrat solüsyonu (Mabtech) algüama için kullanülnßtü. 3.2.3 yaz :ÜIIEIIG AID okuyucu sistemi ELR03 kullantlarak noktalar sayhnßtm (AID Autoiininun Diagnostika GmbH, Strassberg, Almanya). 2. Sonuçlar ve tart Sma Primer DH kültürü Anlat Ian örnegin (DC034) ELUTRA fraksiyonu 5 sunu içermistir %80,6 CD14 pozitif CD67-pozitif hücreler ve dendritik hücreler üretmek için uygundu. Toplam etkiler hücrelere aynü zamanda da monositlere (CD14 pozitif hücreler) dayalÇ dendritik hücrelerin en yüksek geri kazanBiEJonuleit kokteyli kullanEIarak bulunmustur; öte yandan en düsügü de Kalinski kokteyli kullantlarak bulunmustur (Sekil 1 A). Düsük hücre sayIarJhücre kazßlßüarEveya enzimatik sindirme kullanmaksüß DHllerin toplanmasîa iliskin yetersiz kabiliyeti göstermektedir. Bu bulgu bu kokteyl ile olgunlastEÜInS DHllerin dendritik maskelerinin güzel uzamasEve daha yüksek derecede yapgmaya dayaljolabilen sistemimizdeki Kalinski kokteylinin büyük bir dezavantajlnl temsil etmektedir. 7AAD boyama ile belirlenen toplanmls dendritik hücrelerin yasama kabiliyeti Jonuleit kokteyli kullanllarak %971nin üzerinde canl lhücreler göstermistir Öte yandan Kalinski kokteyli ile olgunlastîllan hücreler yaln îca %79,5,e ulasin Qtîl, bizim yeni kokteyllerimiz bu iki deger aras Eda degismistir (Sekil 1A). YardBicE uyaran moleküllerin, örnegin CDSO ve CD86 gibi ekspresyonu, antijen sunan hücreleri yansEmaktadî, özellikle dendritik hücreleri yansîmaktadm Sekil 1B farkli kokteyller ile olgunlastmürnß tüm DH,lerde bu moleküllerin yüksek ekspresyonunu göstermektedir. CD14 monolitik bir moleküldür, ancak GM-CSF/IL-4 ve olgunlasma kokteyllerinin etkisi altîlda, dendritik hücrelerin yüzeyinden hâlßa kaybolmaktadî Burada sunu göstermis olduk ki; Tüm kokteyller ile olusturulan DH"ler CD14 ekspresyonunu kaybetmektedirler, bu da makrofajlar bakLmndan olasi bir farkllastLmia yerine, DH,ler baklmndan fark] llastlrrna için açlk bir kanltlniteligindedir. CD83 öte yandan DH,lerin olgunlasma durumunu göstermek için en önemli markör olarak görev yapmaktadE. CD14"ün neredeyse algüanamaz ekspresyonu ile birlikte CD837ün ekspresyonu sunu göstermistir ki; tüm bes olgunlastmllnß DH popülasyonlarîida, DH kimligine sahip hücrelerdi ve son derece maturdüler (Sekil lB). Kemokin reseptörü (7) (CD197) yüksek entotelyal venüller içinde CCL19 ve CCL2l"in kemokin gradyanlarE boyunca lenf dügümlerine dogru DH"lerin göçmen potansiyelini göstermektedir. Tüm farklîblgunlastßtîmg DH popülasyonlarEbIüksek seviyelerde CCR7 dga vurmustur (Sekil lC). Olgunlasma sitokinlerinin ylanß çücarümasmdan sonraki DH 'ler (Y Ümyarak çlarma Olgunlasma durumunun stabilitesi klinik olarak kullanüabilir DH"lerin önemli bir özelligidir çünkü ölümcül hastallklara sahip hastalar süglügla önleyici sitokinlerin yüksek serum titrelerini göstermektedir (örnegin IL-lO, TGF-beta, IL-6). Bu sitokinler; immatur bir duruma enjekte edilen DH`leri çevirerek enjekte edilen DH*leri etkileyebilir ve as [[anmß tümör antijenlerine dogru bir hastanîl immün sistemini tölere edebilir. Yeni kokteyllerimizin stabil olgunlasmay ltesvik edip etmedigini test etmek için, tüm sitokinleri ylkayarak çlkardlktan sonra ve yalnlzca medyumda yeniden ekimi takiben en az 405 DH`1rin inkübe edilmesinden sonra önemli DH markör moleküllerini test ettik. Kalinski kokteyli ile olgunlastlî'llmls DHilerde dikkat çekecek derecede düsük yasama kabiliyeti bulunmustur (Sekil 2A). Sekil 2A sunu göstermistir, bekledigimiz gibi, yasama kabiliyeti zaman içinde kaybedilmektedir çünkü DHiler tükenmistir ve bu tür bir durumdaki hücreler olgunlasma kokteyli ile inkübasyonu takiben 60 saatten daha fazla bir süre sonra tedavi için artEk uygun degildirler. Test sebebiyle yalnßca belirli moleküllerin yüzey ekspresyonunu denetledik, örnegin CD14sün reindüksiyonu gibi, burada bunlar immatur DH,lere bir revers gösterecektir. Sekil 2B,nin gösterdigi gibi, bes farklEblgunlastmEmß DHller son derece düsük seviyelerde CDl4 dßa vurmaktadß (%l'in altßda) öte yandan DH markörü CD83'ün olgunlasmasüîi yüksek seviyelerini elinde tutmaktadm Yine Kalinski kokteyli ile olgunlastlrlhnls DH"ler, diger kokteyller ile olgunlastLnLljnLs DHslerden çok az düsük CD83 degerleri göstermistir. Sekil 2C yardlîhc l'luyaran moleküllerin, CD80 ve CD86°nlîi yüksek ekspresyon seviyelerinin stabilitesini ve CCR7 ekpresyonu ile göçmen potansiyelinin tesis edilmesini göstermistir. Dondurma ve çözdürmeden sonra DH ,ler Bu adüida, daha sonra dondurularak saklanmakta olan yüksek sayEla DHalerin üretimi için bir yöntem arastßdm. Monositlerin dondurulmas Biçin veya alternatif olarak tüm matur DHllerin dondurulmas [için, hatta antijen yüklemeden sonra dahi, Sekil 3 dondurma, slv lnitrojenin gaz evresi dahilinde depolama ve çözdürme prosedüründen sonra farkli blgunlastlrllmls' DHilerin yasama kabiliyeti ve olgunlasma markörlerini göstermektedir. %80,in üzerinde bir yasama kabiliyeti kabul edilebilirdir, bu Jonuleit ile ve bizim yeni kokteyllerimiz ile olgunlastETan DH"ler ile elde edilmistir (Sekil 3A),ancak Kalinski e kokteyl 5 ile olgunlastlîllmß DHller ile elde edilmeinektedir (her ikisi de poli I:C içeriyor). DH inarkörleri CD83 ve CCR7 yüksek seviyelerde dEa vurulmustur, ve yalnîca CD14 hücrelerin çok düsük sayßjtüm çözdürülen DH popülasyonlarmda alg [lhnm @ti (Sekil 3B ve C). DH ,lerin allostimülatör kapasitesi DH,1erin islevsel kapasitelerini test etmek için, allojenik T hücrelerine karsl stimülatör hücreler olarak DHsler ile birlikte karlslt almis lenfosit belirteci kullandlk. T hücrelerinin yasama kabiliyetlerini test etmek için, maksimal saylîla farkl`lMHC moleküllerine (üçüncü parti=5 kargtiülnß MNC donörleri), bir mitojenik stimuli (PHA) ve T hücresi stimülatör sitokin lL- 2,ye karsîi çogalmanEi baslat [llnashîîtest ettik. Sekil 4 bu üç kontrolü otolog T hücreleri (4A9 ve örnek allojenik T hücreleri responderi (4B) için göstermektedir. Sekil 4C herhangi bir responder hücresi olmaksüüi Islilanmß DH`leri göstermektedir. Sekil 4D bir allojenik responderle kglaslandlglaman düsük otolog T hücresini göstermektedir (Sekil 4E). Sekil 4F°de, DH donörünün otolog T hücreleri ile kSl'aslandEgEzaman farklüolgunlastilnß DH"lerin ko-inkübasyonundan sonra 3 bagEnsîl allojenik responder T hücrelerinin çogalmasLnU özetledik. 3 ilgili responder T hücreleri ve DH,ler arasndaki MHC fark] lllklar ndan beklendigi üzere, yüksek bir stimülatör kapasitesi gözlemledik. Yine, diger olgunlastlrllrnls DH,ler ile klyasland gl zaman Kalinski kokteyli ile olgunlastnllrns Dl-Pler aynHstimülasyon seviyelerini göstermemislerdir, bu da düsük yasama kabiliyeti ve deney prosedürü sias Eida ölen hücrelerin yüksek oran [Ea dayalîblabilir. DH *lerin IL-12p 70 ve IL-I 0 sal Et 3 F arkl Jlast ima ve olgunlasma islemleri sßas Eda, DHiler kültür üst fazlarEiEi içine sitokinler salgIamaktadmlar. Sekil 5A primer DH kültürlerinin içine biyolojik olarak aktif olan IL- 12p70 (dolgun çubuklar) ve L-lO (bos çubuklarYlerin salgElanmaslîlEgöstermektedir. Jonuleit kokteyli ile olgunlastßiünß DHller IL-12p707in belirlenebilir miktarlarßE salgilamamaktadlrlar, öte yandan Kalinski kokteyli ayn Zamanda bizim yeni kokteyllerimiz ml baslna lL-12p70, in ng-oranlarînl lindüklemislerdir. Bu sonuçlar DI-Plerde sitokin üretimini indüklemeye iliskin bir bilesimin kapasitesini göstermektedir. Sekil 5B"de, görülmektedir ki; lenf dügümlerinde potansiyel T hücreleri ile DH7lerin karsflasmasr ve CD40 ligandrvas Tas`| ile taklit etmesinden sonra, Kalinski kokteylinde olgunlastîlmß DHilerden lL-l2p70,in re- indüklenmesi halen olasi] ve bizim yeni kokteyllerimizi kullanarak daha düsük bir seviyeye re-indüklenmesi de olas El 3. göz önünde bulundurmak için, bu her iki önemli düzenleyici sitokinlerin degerlerini teorik olarak esit biyolojik potansiyele sahip olarak ve IL-12p70/IL-10"un bir katsay SJ n n belirlenmesi ile hesaplad k. Sekil SC su sonuçlar göstermektedir; Kalinski kokteyli Jonuleitten daha üstündür, literatürde anlatlldlgl gibi, ancak bizim yeni kokteyllerimiz CD40 ligasyonundan 24 saat sonra lL-12 re-indüksiyonu için pozitif katsayllar ortaya koymaktadîl ve böylece Jonuleit kokteyli ile olgunlastEEDnS DH"lerden daha fazla lL-l2p70 salg [[anmaktad E. Burada anlattîg'înî sonuçlarüözetlemek için, TLR7/8 ligand ve diger sitokinleri ve katkührü içeren maddelerin yeni bir kombinasyonundan bahsediyoruz, bu kombinasyon DHslerin tamamen olgunlasmasIhEbaslatabilmektedir ve bu hücrelerde Thl düzenleyici kapasitelerini baslatabilmektedir. Jonuleit kokteyli ile DH olgunlasmayjile karSJhstEJHEgîlda, bizim kokteyller ayrlia toplama ve dondurmadan sonra da yüksek hücre yasam kabiliyeti, CD83 ekspresyonu ile yüksek olgunlasma seviyeleri göstennistir, CCR7 ekspresyonu ile ko- stimülatör molekülleri ve göçmen potansiyeli aynLl zamanda da olgunlasma stabilitesi göstermistir. Jonuleit kokteylinin aksine, bizim kokteylimiz primer kültür dahilinde ayni. zamanda CD4O Iigasyonu ile T hücresi etkilesimini taklit ettikten sonra lL-12p70 salglIJanmasîlTindükleyebilmektedir. Bizim yeni kokteylimiz ile olusturulmus olan matur DHller lL-12p70 ile Thl-indükleme kapasitelerine ilaveten Jonuleit kokteylinin en iyi özelliklerini bir araya getirmektedir. Kalinski kokteyli ile olgunlasmadan sonra elde edilen DH"lerin aksine, yeni kokteylimiz hücre sayüarßiîl kaybîla iliskin negatif etki olmaksâß ve uzayan hücre ölümü süreçlerinin neden oldugu verimsizlige iliskin negatif etki olmaksüEl, IL- 12p70 salg Iamaya sahip DH"ler ile sonuçlanmaktad E. Insan dendritik hücrelerinin olusturulmasE için bizim prosedürlerimiz iyi üretim uygulamasüiß (GMP) düzenlemeleri ile uyumludur ve bundan dolayEda asElarEi üretilmesi için klinik uygulamalarda kullan lmaktad'ri, bunlar tümör antijenik yapilarina kars. lefektör T hücrelerinin Thl polarizasyonunu tesvik edebilir. Elektr0p0rasy0n ile DH,lerin içine RNA-transferini takiben protein ekspresyonu DH-esaslItümör as lar Eda kullanmak için birkaç antijen kaynag llüsünülmüstür. RNA isleme ve sunma için DH"lere bütün proteinler saglamak için cazip bir adaydm, bundan dolay] spesifik MHC-baglayEEpeptitlerin bilinmesine olan ihtiyacüatlgloruz. In vitro transkribe edilmis RNA ile yüklendikten sonra proteini dga vurmak için DH"lerin kapasitesini test etmek için, ilgili RNA7nîl transfer edilmesinden sonra akâ sitometrisi ile EGFP ekpresyonunu analiz ettik. DC3 hücreleri dahil edilmemistir çünkü kokteyl 3 kokteyl 4,e esdegerdir, lFNy ve PGE25nin düsük miktarlarl liçin hariç (bak nlzl örnegin Sekil 1). EGFP ekspresyonu DCl hücrelerinin içine RNA transfeksiyonunu takiben 12-14 saatte önceden zirvede bulunmustur ve ekspresyon 48 saat stabildi (Javorovic, M., Pohla, H., Frankenberger, B., Wolfel, T. and Schendel, DJ. (2005). RNA transfer by electroporati'on into mature dendritic cells leading to reactivati'on of'efector-mentow cytotoxi'c T b/mphocytes: a quanti'tati've analysis. Mol Ther. 12: 734-743), bundan dolayüEGFP-pozitif hücrelerin yüzdeleri ve ortalama florasan yogunluklarHMFI) elektroporasyondan 24 ve 48 saat sonra ölçülmüstür. DCl ve DC4 hücreleri EGFP dßa vurrnustur öte yandan DC2 hücreleri EGFP dßa vurmamßti ve DC5 hücreleri hiç EGFP dßa vurmamßlardî (Sekil 6) veya yalnâca çok düsük seviyelerde EGFP dßa vurmuslardm (veriler gösterilmemektedir). Bu aynjörnek 48 saatte de görülmüstür (veriler gösterilmemektedir). TLR3 ligandüpoli (LC), Kalinski de ve kokteyl 5,te mevcuttu (s [Ias [Sila DC2 ve DC5 hücreleri) ancak Jonuleit (DCI hücreleri) ve kokteyl 4'te (DC4 hücreleri) bulunmamaktaydH Kalinski kokteyli ayrlda IFNd içermekteydi, bu da diger hiçbir kokteylde mevcut degildi. Ilginç bir sekilde, baska bir yerde sunu bulduk; yalnIZca lFNa ile olgunlastlîllinls DH°ler de RNA transferini takiben EGFP proteinini dlêa vuramam`sllardlî (Frankenberger. B., ve digerleri (2005). Cell-based vacci'nes for metastatic renal cell carcinoma.' genetically-engi'neered tumor cells and monocyte-derived dendriti'c cells. World J Peptit-pulsed DH,ler ile birlikte T hücrelerinin IFNy salg Llamas n n baslatlhias J DC5 hücreleri RNA ile yüklenemediginde ötürü, peptitleri sunmak için kapasiteleri bir alternatif olarak test edilmistir (Sekil 7). Bir HLA-A* otolog lenfositleri Jonuleit kokteyli ile klyaslandlglnda kokteyller 3-4 içinde olgunlastii im sl peptit-pulsed Dl-Pler ile 7 gün boyunca stimüle edilmislerdir. Hücreler daha sonra otolog monositler arti lCEF peptitleri ile 24 saat boyunca restimüle edilmistir ve IFNy-ELISPOT deneyinde analiz edilmistir. Peptit-spesifik yan Fflar tüm DH popülasyonlar`lile bulunmustur, DC5 hücrelerinin T hücre aktivasyonu için peptitler gösterebilecegini göstermektedir. Bundan dolay Eda, mastürasyon kokteyllerinde polinin (IzC) varlEgEDHslerin ekzoj en RNA ile yüklendikten sonra muhtemelen yabancDRNASdan hücreleri korumak için mekanizmalari TLR3 aktivasyonu ile protein dgavurumunu engellemistir (Kato, H. ve digerleri (2006). Digerential roles QfMDA5 and RlG-I helicases in the recogm'tion ofRNA viruses. Nature 441: 101-105). Böylece, burada kokteyl 5 için gösterildigi gibi ve önceden Kalinski kokteyli için baslld gl gibi, Kalinski medyumunda veya kokteyl 57te olgunlastliilrnls DH"ler RNA esasl | asllarda kullanilamazlar, her ne kadar her ikisi de peptitler ile kullanlma uygun olsa dahi (Mailliard, R. B. ve digerleri (2004). alpha-type-l polarized dendri'ti'c cells.' a iiovel kokteyller 3 ve 4 kanser asßîgelistirmek için tümörle iliskili antijenlerin kaynaklarEblarak ya peptitlerin veya RNA°nß kullanJInasjile DH"ler üreten IL-12p701in olusturulmasEiçin çok uygun olacakt i Matur DH,ler ile stimüle edilen otolog lenfositlerin interferon-gamma yanltl.l Bir HLA-A*0201 donöründen lenfositler; Jonuleit kokteyli, Kalinski kokteyli ve hastada anlat lan yeni kokteyller kullan Llarak olgunlastLrLlan otolog DH" lerle stimüle edilmistir. Periferik kan lenfositleri (PBL" ler) ylkayarak aylrma ile ayrllinlstln ve burada hücrelerin öldürücü (NK) hücreler için karakteristiktir. (A) YRayarak ayîma fraksiyonu 3,te PBL, ler farklîkokteyller kullanan olgunlasmß farklEDH popülasyonlarEile dogrudan inkübe edilmistir ve bunlar& interferon-gamma salgüamasEGFN-gamma) standart bir ELISPOT deneyde 24 saat sonra ölçülmüstür. ELISPOT analizi için, belirsiz baglanmayEönlemek için 2 mM L-glutamin, lmM sodyum piruvat, penisilin/streptomisin (IOOU/rnl) ve %10 insan AB serumu (BioWhittaker, Verviers, Belçika) ile tamamlanmîsl RPMI 1640 kültür medyumunda 37°C sEiaklÜgta 2 s boyunca plakalarln inkübasyonunu takiben, ELUTRA fraksiyonun (3) PBLsleri çukurcuk basina 50 ml üç tekrar olarak antikor ile önceden kaplanms PVDF plakalar üzerinde kaplanmlstlri. Kaptür antikor lFNy-spesifik klon l-DlK idi (Mabtech).DH popülasyonlarl çukurcuklara dikkatli bir sekilde eklenmistir. Geçmisin degerlendirilmesi için, DHller ve lenfositler tek baslîia kaplanmßtm. Toplam kültür hacmi 150 ul idi ve plakalar 24 saat boyunca %5 COz ile birlikte 37°C sßakltkta nemlendirilmis bir inkübatör ile inkübe edilmistir. Hücrelerin çÜgtarÜInas Iîidan ve PBS/%0.5 Tween20 ile fazlas Sla yüganmasmdan sonra, biyotinlenmis deteksiyon antikoru, klon 7-B6-1 ile inkübasyon (Mabtech) ve spotlarß gelisimi önceden anlatIdg] gibi gerçeklestirilmistir (1, 2), ancak streptavidin-alkalin fosfataz ve kullanßia haz& BCIP/NBT- artüsubstrat solüsyonu kullannnßtm Spotlar 3.2.3 yazEEn sürümü ile birlikte ELR03 AID okuyucu sistemi kullanllarak sayllmlStvn (AID Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Almanya). Aktivasyon için, ELUTRA fraksiyon 3°ten lenfositler; %10 insan serumu ile birlikte RPM] hücreler/çukurcukta kaplanmßtß; d37te 30 lU/ml lL-2 eklenmistir ve d7ide lenfositler (GILGFVFTL) veya iki ilave peptit içeren CEF havuzu (PANATecs GmbH, Tuebingen, Almanya), EBV-LMP- ve enflüanza RNA polimeraz PA. In vitro aktive edilmis T hücreleri ve otolog monositler artDCEF peptitleri 37°C slZlaklllgtta %5 COZ ile 24 saat boyunca 2 mM L-glutamin, l mM sodyum piruvat, penisiilin/streptomisin (100 U/ml), %10 insan AB serum (Bio-Whittaker, Verviers, Belçika) ve IU/ml IL-2 içeren RPMI 1640 medyumda inkübe edilmistir. Anlat ldlgl l gibi IFNy- ELISPOT analizi gerçeklestirilmistir (Becker, C., ve digerleri (2001). T lenfositler ile birlikte adoptif tümör tedavisi bir lFNy yakalama deneyi ile zenginlestirilmistir (Nat Med. 7: 1159- 1162, Pohla, H., ve digerleri (2000). Allogenei'c vacci'nati'on for renal cell carcinoma.' Development and monitoring. Bone Marrow Transplant. 25: 83-87), ancak burada antikor ile önceden kaplanmg PVDF plakalarD(Mabtech AB, Nacka, Isveç) ve streptavidin-alkalin fosfataz ve kullanßqa hazi BCIP/NBT-artE substrat solüsyonu (Mabtech) algEama için kullan Jingt E. 3.2.3 yaz Jlînüile AID okuyucu sistemi ELR03 kullan Tarak noktalar saylnßt] (AID Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Almanya). Bu erken zaman diliminde (bakîlü Sekil 8) alglhnan dominant interferon-gamma üreten hücreler NK hücrelerini yukaridaki deneylerin aksine aktif hale getirmektedirler, burada peptit-spesiiik T hücrelerinin yanltlarl 17 g aktivasyon sürecinde DH"ler taraflndan stimüle edilmistir (bak niz` Sekil 7). Bu analiz sunu göstermistir; NK hücrelerinin aktivasyonu; DCl, DC3 ve DC4 kokteylleri ile karsllastrrlldgrzaman, DC5 kokteylinde olgunlastlîülnl's DH31er kullanItiEgBzaman yaklask üç kat daha arttiülng idi. Birlestirdigimiz zaman, bu çal Emalar sunu göstermektedir; DH"ler, ve özellikle kokteyl 5"in içinde olanlar dogal öldürücü hücreleri (Sekil 8) aktif hale getirebilmektedir aynjzamanda etkili bir sekilde sitomegalovirüs, Epstein-Barr virüsü ve enflüanza virüsünden türeyen epitoplarüalg Ühyan peptit-spesifik efektör T hücrelerini yeniden uyarmaktad E. 3. Örnegin özeti Dendritik hücreler (DH)-esas1l"asTbr sl'kllkla lL-lß, TNFU., IL-6 ve prostaglandin E2 (PG)"nin sitokin kokteyli (Jonuleit) ile olgunlastmülnß monositten türemis DH"lerden faydalanmaktadîi T hücrelerini Thl-yanülarma yönlendiren DH,ler elde etmek için, biyolojik olarak aktif lL-l2p70 üreten, DH'ler veren kokteyller arad Ek. ELUTRA ile aferez ürünlerin yikayarak ayrJInas &dan sonra, insan serumu ile birlikte GMP-uyumlu medyumda 6 gün boyunca GM-CSF ve IL-4 ile birlikte zenginlestirilmis monositleri kültürledik. Olgunlasmamß DH"ler; poli I:C ve interferon y, PG, IL-lß ve TNFor ile birlikte veya degil TLR7/8 ligandlarEiçeren çesitli kokteyller ile 24 gösterilmemektedir), %<2 CD14, ve % 60 kemokin reseptörü CCR7 yuvalayan lenf dügümü dlSa vurmustur. DHiler tam maturite muhafaza etmistir ve dondurularak saklanmadan sonra ve sitokinler yikanip temizlendikten sonra ve 44 saat boyunca yeniden kültürlendikten sonra tipik TLR7/8 içeren kokteyller ile olgunlastEJIngsi DH,lerin üst fazlarßda lL-12p70 ve lL-lO mevcuttu. IFNy, IL-lß, TNFOL, PG ve TLR7/8 ligand R848 kokteyli toplandltan sonra ve CD40L-transfekte edilmis Iibroblastlar ile 24 saat boyunca kokültürden sonra IL-12p70 salg Jhyan, lenf dügümlerinde T hücreleri ile kars [lhstEgDzaman taklit eden DH"ler vermistir. (IL-lß, TNFa, IFNor, IFNß, poli IzC) ile bildirildigi biçimde Il-lTnin IL-107a olan oranîia iliskin olarak DHsler yaln Eica çok az bir azalma göstermislerdir. Bizim yeni kokteyllerimiz ile olgunlastlrtilln S DHllerin islevselligi karistirilmis lenfosit kültürü ve ELlSpot deneyleri ile test edilmistir. Bizim DHaler allo-yanltlar indüklemistir ve Jonuleit kokteyli tarafindan üretilen DHiler ile kýaslandigi_ zaman viral antijenler için spesifik olan T hücrelerini uyarin Et& (veriler gösterilmeinektedir). Kßaca, DH olgunlasmayjiçin bu yeni kokteyl iyi toplama, makul geri kazaniilar, olgunlasma markerlerinin stabilitesi ve yüksek kalitedeki DH asilhrüiçin gerekli GMP- prosedürlerine sahip Th-l indükleme kapasitesi özelliklerini birlestirmektedir. Mevcut bulusun tercih edilen yapilandirmalari asag daki maddelerin içerik konusunu olusturmaktadln: 1. En az bir olgunlasmamlsi dendritik hücrenin in vitro olgunlastlîilinasi'için bir yöntem olup, olgunlasmamß dendritik hücrenin TNFOL, lL-lß, lFNy, TLR7/8 agonisti ve prostaglandin E2 (PG) ile stimüle edilmesini içermektedir. 2. Madde 1"in yöntemi olup ilave olarak olgunlasmamß dendritik hücrenin bir TLR3 agonisti, tercihen polyI:C ile stimüle edilmesini içermektedir. . Madde 1 veya 2'nin yöntemi olup burada söz konusu maddeler söz konusu olgunlasmamls dendritik hücrenin kültür ortamlna eklenen bir bilesimin parçalarldlii. . Madde 1 ila 33ten herhangi birine göre yöntem olup burada söz konusu TLR agonisti imidazokuinilon tipinde, immün cevabünodifiye eden bilesiktir. Madde 4"e göre yöntem olup, söz konusu imidazokuinilon tipi immün cevab _lnodif'iye etanol"dür (R848). . Maddeler 1 ila 5°ten herhangi birine göre yöntem olup, burada söz konusu olgun olmayan dendritik hücre bir monositle türetilmis olgunlasmamg dendritik hücredir, tercihen insan periferal kan mononükleer hücreleri, monositler, diger miyeloid progenitör hücrelerinden veya CD14 pozitif hücrelerin in vitro farkllllastlnlllnas lile CD34 pozitif` progenitör hücrelerden türetilmistir veya burada söz konusu olgunlasmamFs dendritik hücreler dogrudan periferal kandan elde edilmistir. . Maddeler 1 ila 63dan herhangi birine göre yöntem olup, burada olgunlasmamß dendritik hücre, insan periferal kan mononükleer hücreleri, monositler veya diger miyeloid progenitör hücrelerin GM-CSF ve IL-4 veya IL-1331e inkübe edilmesiyle elde edilmektedir. . Maddeler 1 ila 7iden herhangi birine göre yöntem olup, burada olgunlasmamß dendritik hücre insan kökenlidir. . Maddeler 1 ila 8"den herhangi birine göre yöntem olup asagldaki ad mlarl içermektedir: a) periferal kandan mononükleer hücrelerin hazßlanmas: b) adEh a)'nEi mononükleer hücrelerinin GM-CSF ve IL-4 veya IL-l3'le inkübe edilmesi c) adlm b)"de elde edilen hücrelerin TNFoi, IL-lß, lFNy, TLR7/8 agonisti, prostaglandin E2 (PG) ve opsiyonel olarak bir TLR3 agonisti, tercihen poli I:C ile inkübe edilmesi, ve d) olgun dendritik hücre veya hücrelerin toplanmasE Madde 9"a göre yöntem olup, burada adii a),da mononükleer hücreler periferal kandan lökaferez ile elde edilmektedirler. Madde 9 veya 10,un yönteini olup, burada adlm b),deki inkübasyon adlml ll ila 9, tercihen 2 ila 9, daha tercihen 2 ila 6 gün sürecektir. Maddeler 9 ila 11,den herhangi birine göre yöntem olup, burada adlîn c)°deki inkübasyon 12 saat ila 72 saat, tercihen 20 saat veya 24 saat sürmektedir. Maddeler 1 ila 12"den herhangi birine göre yöntem olup, burada olgun dendritik hücre veya hücre/hücreler ilave olarak bir veya daha fazla antijenle in vitro olarak yüklenmektedir. Madde 137ün yöntemi olup burada söz konusu antijen veya antijenlerin lenf nodlar] içerisindeki efektör T hücre olgunlasmasElEtetiklemedigi farz edilmektedir. Madde 13 veya l4sün yöntemi olup, burada söz konusu yükleme, olgun dendritik hücre veya hücrelerin söz konusu antijenin en az bir peptidi ile inkübe edilmesi veya dendritik hücre veya hücrelerin antijeni kodlayan RNA veya DNA ile transfekte edilmesiyle gerçeklestirilmektedir. Maddeler 1 ila 153teki yöntemden elde edilebilen bir olgun dendiritk hücre veya olgun dendritik hücre popülasyonu. Madde 16"nin olgun dendiritk hücre veya olgun dendritik hücre popülasyonunu içeren bir farmasötik bilesim. Madde lölnm olgun dendiritk hücre veya olgun dendritik hücre popülasyonunun tümörlü hastalEklar veya enfeksiyonlu hastalEklardan meydana gelen grup içerisinden seçilen bir hasta] Eglîl tedavi edilmesi için bir ilaclîi haz [Ilanmas lida kullanlînü En az bir olgun dendritik hücrenin haz illanmaslnda TNFa, IL-lß, IFNy, TLRagonisti ve prostaglandin E2 (PGYnin ve opsiyonel olarak TLR3 agonisti, tercihen poli l:C"nin birlikte kullan îhlî . Madde 19,a göre kullanin olup, söz konusu TLR7/8 agonisti, bir imidazokuinilon tipi immün cevab. lmodifiye eden bilesiktir, tercihen 4-amin0-2-etoksimetil-a-a-dimetil- 1H-imidazol[4,5-c]kuinolin-1-etanol"dür (R848). 21.TNF0L, IL-lß, IFNy, TLR7/8 agonisti ve prostaglandin E2 (PG),nin ve opsiyonel olarak TLR3 agonisti, tercihen poli I:C"yi içeren bir bilesim. 22. Madde 21°in bilesimi olup, burada söz konusu TLR7/8 agonisti, bir imidazokuinilon tipi immün cevabi: modifiye eden bilesiktir, tercihen 4-amin0-2-etoksimetil-u-a- dimetil-lH-imidazol[4,5-C]kuinolin-l-etanoFdür (R848). TR TR TR TR TR
TR2019/04207T 2006-03-28 2007-03-28 Olgun dendritik hücrelerin hazırlanması için bileşimler. TR201904207T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06006373A EP1840206A1 (en) 2006-03-28 2006-03-28 Compositions for the preparation of mature dendritic cells
US82582206P 2006-09-15 2006-09-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201904207T4 true TR201904207T4 (tr) 2019-05-21

Family

ID=36441990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/04207T TR201904207T4 (tr) 2006-03-28 2007-03-28 Olgun dendritik hücrelerin hazırlanması için bileşimler.

Country Status (13)

Country Link
US (3) US8679840B2 (tr)
EP (4) EP1840206A1 (tr)
AU (1) AU2007229640B2 (tr)
CA (1) CA2647622C (tr)
CY (1) CY1121448T1 (tr)
DK (2) DK2004807T3 (tr)
ES (2) ES2535835T3 (tr)
HU (1) HUE042138T2 (tr)
PL (2) PL2004807T3 (tr)
PT (2) PT2004807E (tr)
SI (1) SI2918673T1 (tr)
TR (1) TR201904207T4 (tr)
WO (1) WO2007110240A1 (tr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1780220A1 (en) * 2005-11-01 2007-05-02 Charité - Universitätsmedizin Berlin Use of CEACAM8-specific substances for treating autoimmune diseases and a method for screening substances which induce apoptosis
WO2010049152A1 (en) * 2008-10-29 2010-05-06 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Novel composition for the preparation of mature dendritic cells
SI2534242T1 (sl) * 2010-02-10 2016-08-31 Immunicum Ab Izboljšan sestavek za inhibicijo tumorske celične proliferacije
CN102933228A (zh) * 2010-03-15 2013-02-13 宾夕法尼亚大学董事会 制备和储存活化的、成熟树突细胞的体系和方法
EP2617434A1 (en) * 2012-01-20 2013-07-24 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. HIV-1 integrase deficient immunogens and methods for loading dendritic cells with said immunogens
WO2013127976A1 (en) * 2012-03-02 2013-09-06 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Method for the preparation of dendritic cell vaccines
EP2913394B1 (en) * 2012-12-18 2016-06-22 Immunicum AB Co-differentiation and activation of monocytes from allogeneic donors to provide pro-inflammatory dendritic cells
EP3145516A4 (en) * 2014-05-20 2018-06-13 Kiromic, LLC Methods and compositions for treating malignancies with dendritic cells
EP3317402B1 (en) 2015-06-30 2024-02-14 Universidade Nova de Lisboa A viable cell population, method for production and uses thereof
HUE053674T2 (hu) * 2015-12-23 2021-07-28 Medigene Immunotherapies Gmbh Antigén-specifikus TCR receptorok új generációja
KR101946572B1 (ko) * 2017-01-31 2019-02-11 주식회사 큐라티스 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 그 제조방법
GB201711379D0 (en) 2017-07-14 2017-08-30 Univ Cape Town Maturation of dendritic cells
AU2017431122B2 (en) * 2017-09-05 2021-09-02 Medigene Immunotherapies Gmbh Dendritic cell potency assay
DK3460052T3 (da) * 2017-09-20 2020-02-03 Immunicum Ab Forbedrede allogene dendrittiske celler til anvendelse i behandling af cancer
CN109182384A (zh) * 2018-09-30 2019-01-11 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种rff1细胞的构建方法
CN114601923B (zh) * 2022-04-25 2023-08-22 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) 一种新生抗原组合物及在制备治疗肿瘤的药物中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6558951B1 (en) * 1999-02-11 2003-05-06 3M Innovative Properties Company Maturation of dendritic cells with immune response modifying compounds
CN1636229B (zh) * 2001-09-06 2012-12-19 西北生物治疗药物公司 引发单核树突细胞和t细胞th-1应答的组合物和方法
US20050003533A1 (en) * 2003-05-08 2005-01-06 Pawel Kalinski Mature type-1 polarized dendritic cells with enhanced IL-12 production and methods of serum-free production and use

Also Published As

Publication number Publication date
ES2535835T3 (es) 2015-05-18
WO2007110240A1 (en) 2007-10-04
US20100284976A1 (en) 2010-11-11
DK2004807T3 (en) 2015-05-11
US9512402B2 (en) 2016-12-06
PT2004807E (pt) 2015-05-20
EP2918673B1 (en) 2019-01-16
US20170037372A1 (en) 2017-02-09
EP2004807B1 (en) 2015-03-04
CA2647622A1 (en) 2007-10-04
EP2004807A1 (en) 2008-12-24
CY1121448T1 (el) 2020-05-29
SI2918673T1 (sl) 2019-05-31
ES2718525T3 (es) 2019-07-02
PT2918673T (pt) 2019-04-23
PL2004807T3 (pl) 2015-07-31
CA2647622C (en) 2017-04-18
EP2918673A1 (en) 2015-09-16
HUE042138T2 (hu) 2019-06-28
EP1840206A1 (en) 2007-10-03
US8679840B2 (en) 2014-03-25
AU2007229640B2 (en) 2013-05-02
PL2918673T3 (pl) 2019-08-30
AU2007229640A1 (en) 2007-10-04
DK2918673T3 (en) 2019-04-01
EP3517603A1 (en) 2019-07-31
US20140302096A1 (en) 2014-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201904207T4 (tr) Olgun dendritik hücrelerin hazırlanması için bileşimler.
Santini et al. Type I interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity in vitro and in Hu-PBL-SCID mice
Zobywalski et al. Generation of clinical grade dendritic cells with capacity to produce biologically active IL-12p70
AU2002307243B2 (en) Antigen-presenting cell populations and their use as reagents for enhancing or reducing immune tolerance
US20080254537A1 (en) Compositions and Methods for Inducing the Activation of Immature Monocytic Dendritic Cells
MX2007012221A (es) Composicion de celulas dendriticas y metodos.
CN112830974A (zh) 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用
Tsai et al. In vitro immunization and expansion of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive immunotherapy using peptide-pulsed dendritic cells
CA2445382A1 (en) Method for generating highly active human dendritic cells from monocytes
WO2009149539A1 (en) Enhancing antigen-specific cd8+ t cell response using irf-7 mrna
CN112313328A (zh) 用于治疗用途的树突细胞的体外分化和成熟方法
IL292009A (en) In vitro methods and compositions for enhancing the activation of dendritic cells and t cells, and for inducing a th-1 immune response
KR101232128B1 (ko) 면역 기능이 우수한 성숙 수지상 세포의 제조방법
CA2640836C (en) Method for generating dendritic cells employing decreased temperature
Katsuda et al. Comparison of different classes of CpG-ODN in augmenting the generation of human epitope peptide-specific CTLs
AU2013206016B2 (en) Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells
HK40051623A (en) Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells