TARIFNAME BAKTERI DNA"SI IZOLASYONUNDA ÖKARYOTIK DNAtNIN UZAKLASTIRILMASI IÇIN ANTI-HISTON ANTIKORLARI KULLANILMASI VE KROMATIN IMMÜNO-PRESIPITASYONU METODU TEKNIK ALAN Mevcut bulus, metagenom-mikrobiyom çalismalarinda tüm genom dizilemede kullanima uygun bir kite ve söz konusu kitin kullanildigi bir tüm genom dizileme yöntemine iliskindir. TEKNIGIN BILINEN DURUMU Ökaryotik DNA, ilk etapta histon proteinlerinin etrafina sarilmaktadir. Bu protein* DNA kompleksleri yan yana gelerek bir yapi meydana getirirler. Bu yapi yaklasik 11 nm çapinda olup nükleozorn olarak adlandirilmaktadir. Nükleozomlar kendi aralarinda linker (baglayici) DNA iplikleri ile birbirlerine baglidirlar. Linker DNA"nin uzunlugu organizmaya göre degisim göstermekte olup, insan linker DNA°si 38-53 bp (base pair) uzunlugundadir. Nükleozomlarin kendi çevresinde burgulu bir biçimde sarili yapisi sayesinde kromatinler, kromatinlerin hücre bölünmesi sirasinda kisalip kalinlasmasi sonucunda ise kromozomlar olusur. Nükleozomlar, bir histon oktameri çekirdegi etrafinda paketlenmis yaklasik 147 DNA baz çiüi içerirler. Histonlar, ökaryotik kromatiiide ilk düzeyde DNA paketlenmesinden sorumludurlar. Yüksek oranda arti yüklü amino asitler (lizin ve arjinin) içeren histon proteinleri eksi yüklü DNA,ya sikica baglanir. Histonun bes tipi (H2A, H2B, H3, H4 ve Hl) vardir ve bir ökaryottan digerine histonlarin moleküler yapisi çok benzerdir. Her histon oktameri, H2A, HZB, H3 ve H4 histonlarinin her birinden iki kopya içerir. Ökaryotik konak canlinin, kendi hücrelerinin sayisindan en az 10 kat daha fazla bakteri hücresi ile birlikte yasadigi düsünülmektedir. Mikrobiyota, kelimenin tam anlamiyla vücut alanimizi paylasan komünal, simbiyotik ve patojen mikroorganizmalarin ekolojik toplulugunu ifade etmektedir. Mikrobiyota, konagin metabolizma ve beslenme homeostazi, enerji harcamalari ve bagisiklik gibi çoklu fizyolojik süreçlerine katkida bulunmaktadir. Mikrobiyom ise mikrobiyotanin sahip oldugu genetik materyalin tümünü ifade etmektedir. Son yillarda yapilan birçok çalismada, mikrobiyomun konakçinin metabolik durumunda oldugu kadar, bagisiklik gelisiminde ve fonksiyonlarinda da önemli bir role sahip oldugu gösterilmistir. Bu fonksiyon, bagirsak lümeni ve mukozal yüzeyleri arasinda küçük moleküllerin degisimi yoluyla ve sistemik dolasimla elde edilmektedir. Konagin genomu esasen statik olmasina ragmen, sahip oldugu mikrobiyom dinamik bir seyir göstermektedir. Konak organizmanin barindirdigi mikrobik topluluklar, gelisim süreciyle birlikte, beslenmedeki degisiklikler, yolculuklar, hastaliklar, tibbi tedaviler gibi birçok faktör nedeniyle sürekli olarak degismektedir. Son teknolojik gelismeler sayesinde, hayvan modellerinin ve insan popülasyonlarinin mikrobiyom dinamikleri hakkinda oldukça ayrintili çalismalar yapilmasi artik mümkün olmaktadir. Metagenomik, mikrobiyal topluluklarin kültürden bagimsiz genomik analizine verilen isimdir. Bu isim, istatistiksel meta-analiz kavramindan (istatistiksel olarak ayri analizleri birlestiren süreç) ve genomikten (bir organizmanin genetik materyalinin kapsamli analizi) türetilmistir. Metagenomik, kültüre edilemeyen ve bazi ortamlarda bulunan mikroorganizmalarin % 99'undan fazlasini temsil etmesi dolayisiyla çok güçlü bir yöntemdir. Bu yaklasim temelde iki ayri prensibe dayanmaktadir: a) Mikrobiyal genomik DNA'da dizi benzerligini paylasan genlerin (Örn; polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) amplifikasyonu sonrasi analizi; b) Bütün genom dizi analizi yöntemi ile alinan örnek içindeki bütün canli materyaline ait genomik DNA'larin bir bütün olarak analiz edilmesi. Burada bahsedilen a) yöntemi analiz edilen örneklerde yalnizca bakteri türlerinin ne olduguna dair bilgi vermektedir. Bakteri türlerinin sahip oldugu genom DNA bilgisi ve genom DNA degisimlerini bu metotla analiz etmek mümkün degildir. Bir baska deyisle, bu yöntem ile bakterilerin türünü tanimlamak mümkünken, bakterilerin sahip oldugu gen havuzunu ve bu havuzdaki degisimleri incelemek mümkün degildir. Bu sebeple `bakterilerin sahip oldugu genomdaki fonksiyonel analizlerin yapilmasi mümkün olmamaktadir. Bu sebeplerden dolayi, 168 rRNA dizilemesi fonksiyonel mikrobiyom arastirmalarina olanak tanimamaktadir. Burada bahsi geçen b) yöntemi ise 163 rRNA dizilemesine göre çok yüksek bir maliyete sahip olmasi ve yalnizca bakteri genomlari degil, örnegin alindigi konak canlinin genomunun da sekanslanmasiyla üretilen verinin dizilemesi sonucu konagin (yani ökaryotik canlinin) genom verisinin prokaryotlarin genom verisinden biyoiiiformatik (in-siliko) metotlarla ayristirilmasiyla özellikle genomu bilinmeyen ökaryotik canlilarin da bulundugu örneklerden yapilan çalismalarda sorun teskil etmesi dezavantajlarma sahiptir. Teknigin bilinen durumunda var olan bu yöntemlerin sahip oldugu dezavantajlar metagenomik alaninda bakteri genomu dizilemede kullanima uygun yeni metotlarin gelistirilmesi ihtiyacini ortaya çikarmistir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulus, manyetik veya manyetik olmayan bead"lere (boncuklara) baglanmis yahut bir kolonda immobilize edilmis antihiston antikorlari içeren bir solüsyonu içeren bir kite ve söz konusu solüsyonun kullanildigi ökaryotik genomik DNAlnin prokaryotik genomik DNA"dan ayristirilmasi metoduna iliskindir. BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bulus, ökaryotik genomik DNA"nin prokaryotik genomik DNA"dan ayristirilmasinda kullanima uygun bir metoda iliskin olup özelligi; a. Orneklerin lize edilmesi ve hücre içeriginin toplanmasi b. Hücre içeriginin manyetik veya manyetik olmayan bead,lere (boncuklara) baglanmis veya kolonda immobilize edilmis anti histon antikorlari ile temas ettirilmesiyle ökaryotik gDNA°nin immobilize anti histon antikorlarina tutundurulmasi c. Manyetik veya manyetik olmayan bead"ler (boncuklar) üzerinde veya kolon üzerinde bulunan anti histon antikorlarina baglanarak immobilize edilen ökaryotik gDNA°nin hücre içeriginden uzaklastirilmasi adimlarini içermektedir. Bulusa konu olan yöntem; ökaryotik canlilarin kromatin iplikçiklerinin olusmasini saglayan histon proteinlerinin, ökaryotik ve prokaryotik DNA°lari deneysel asamada birbirinden ayirma yöntemi olarak kullanilmasina dayanmaktadir. Bulusa konu olan yöntemde Ömeklerden elde edilen hücrelerin (ökaryotik ve prokaryotik) patlatilmasindan (lize edilmesinden) sonra histon proteinlerine yüksek afinite ile baglanacak antikorlar (yani anti histon antikorlari) kullanilacak ve ökaryatik hücre gDNA°larinin bu immobilize edilmis antikorlara baglanmasi saglanacaktir. Immobilize edilmis anti histon antikorlarina baglanan çöktürülmesi ya da ayristirilmasi ile ökaryotik DNA prokaryotik DNA"dan uzaklastirilmis olacaktir. Böylece geride kalan prokaryotik DNA°nin dizileme analizlerinde kullanilmasi mümkün olacaktir. Bulus sahiplerinin önerdigi metot ve bu metoda dayanarak hazirlanacak kit içerigi, ökaryotik genomik DNA"nin deneysel basamaklarda elimine edilmesi prensibine dayanmaktadir. Bu sayede metagenom analizlerindeki mevcut uygulamalarin sebep oldugu %90 civarindaki ökaryotik genomik DNA kontaminasyonunun sifira ya da sifira yakin degerlere düsürülmesi öngörülmektedir. Burada c) adiminda gerçeklestirilen ökaryotik gDNA"nin immobilize anti-histon antikorlarina tutundurulmasi islemi inkübasyon ile gerçeklestirilmektedir. Burada bahsi geçen anti histon antikorlari; h2a, h2b, h3, h4 veya h1 antikorlari içerisinden seçilebilir. Bu basvuru kapsaminda kullanilan "örnek" her türlü bitki ve hayvan dokusundan, insan dokusuiidaii, insan-hayvan diskisindan, insan-hayvan agiz florasindan, insan- hayvan derisinden veya hava, su, toprak, deniz suyu, çamur, madenler, tuzlalar, volkanlar, jeotermal kaynaklar, her türlü cismin yüzeyinden elde edilebilir. Basvuru kapsamindan yukarida belirtilen kaynaklardan alinan örnekler tüm dokunun izolasyonu, doku parçasi izolasyonu, yüzey swabi, doku swabi, doku biyopsisi, diski toplama, fekal swabi, tuvalet kagidi, rektal swab, mukozal biyopsi, intestinal mukozal lava j örnekleri ile elde edilebilir. Bulusa uygun ökaryotik genomik DNA,nin prokaryotik genomik DNA"dan ayristirilmasi yönteminin d) adiminda yer alan "uzaklastirma" ifadesi Manyetik veya manyetik olmayan bead,ler (boncuklar) üzerinde veya kolon üzerinde bulunan anti histon antikorlarina baglanarak immobilize edilen ökaryotik gDNA"nin santritüj yoluyla çöktürülüp ayrilarak uzaklastirilmasi veya filtrasyon yoluyla uzaklastirilmasi vb. gibi yöntemleri ifade etmektedir. Bulusa kapsaminda bahsedilen "manyetik bead" ifadesi demir oksit nanopartikülleri veya çekirdeginde demir oksit nanopartikül bulunan ve üzeri silan, altin, gümüs vb bir iV. katmanla kaplanmis bead"leri veya superparamagnetik polistiren bead"leri (boncuklari); örnegin DynabeadTM, ifade etmektedir. Bulus kapsaminda bahsedilen "manyetik olmayan bead" ifadesi zirkonyum, agaroz, silikadan elde edilen bead"leri (boncuklari) ifade etmektedir. Bulus bir diger açidan bir canliya ait 'örnekten metagenomik kütüphanesi olusturulmasinda kullanilan bir yönteme iliskin olup özelligi; Orneklerin lize edilmesi ve hücre içeriginin toplanmasi Hücre içeriginin manyetik veya manyetik olmayan beadalere (boncuklara) baglanmis veya kolonda immobilize edilmis anti histon antikorlari ile temas ettirilmesiyle ökaryotik gDNA"nin immobilize anti histon antikorlarina tutundurulmasi Manyetik veya manyetik olmayan bead"ler (boncuklar) üzerinde veya kolon üzerinde bulunan anti histon antikorlarina baglanarak immobilize edilen ökaryotik gDNA"nin hücre içeriginden uzaklastirilmasi Ökaryotik gDNA'nin uzaklastirilmasi sonrasi elde edilen hücre içeriginden prokaryotik genomik DNA°nin izolasyonu Metagenomik kütüphanenin olusturulmasi için gerekli basamaklarin takip edilmesi adimlarini içermesidir. Burada iii) adiminda gerçeklestirilen ökaryotik gDNA'nin immobilize anti-histon antikorlarina tutundurulmasi islemi inkübasyon ile gerçeklestirilmektedir. Burada V. adiminda geçeklestirilen hücre içeriginden prokaryotik genomik DNA izolasyonu teknigin bilinen durumunda var olan geleneksel yöntemlerle, örnegin fenol-kloroformun kullanildigi organik ekstraksiyon yöntemi ya da chelex ekstraksiyonu veya ticari olarak var olan kitler araciligiyla gerçeklestirilebilir. Bulus bir diger açidan; ökaryotik genomik DNA'nin prokaryotik genomik DNA"dan ayristirilmasinda kullanima uygun bir kite iliskin olup özelligi; l. Ornek içerisindeki hücrelerin hücre zarinin parçalanmasini (hücre lizisi) kolonda immobilize edilmis anti histon antikorlari içeren solüsyon (3. solüsyon) solüsyonlarini içermesidir. 1. solüsyonun kullanilmasi ile hücre içerigi ortaya çikacak, 2. solüsyonun kullanilmasi ile hücre içerigindeki histon proteinlerinin ve prokaryotik genomik DNA°nin yapisi korunmus olacak, üçüncü solüsyonun kullanilmasi ile de ökaryotik genomik DNA prokaryotik genomik DNA"dan uzaklastirilmis olacaktir Bulusa uygun kit içerisinde yer alan 1. solüsyonda bulunan hücre zarinin parçalanmasini, yani hücre lizisini, saglayan solüsyon deterjan bazli hücre lizis ajani veya lizis tamponu olabilir. Deterjan bazli hücre lizis ajani iyonik, non-iyonik veya zvitteriyonik deterjan olabilir. Tercihen zvitteriyonik veya non-iyonik deterjan bazli ajanlar kullanilir. ZVitteriyonik deterjanlara 'Örnek olarak CHAP , non-iyoik deterjanlara örnek olarak Triton-XTM serisinde bulunan deterjanlar veya Tween-20TM örnek verilebilir. Bu ürün içinde metagenom analizi için 3. solüsyonun kullanilmasi bulusun ana yenilik noktasini olustururken, 2. solüsyondaki proteaz ve DNAz inhibitörlerinin bir kokteyl olarak metagenomik dizilemede kullanilacak olmasi da bulusa yenilik katan yönlerdendir. Bulusa uygun 3. soüsyon içerisinden bulunan manyetik bead"ler demir oksit nanopartiküller veya çekirdeginde demir oksit nanopartikül bulunan ve üzeri silan, altin, gümüs Vb bir katmanla kaplanmis bead"ler veya superparamagnetik polistiren bead"lerden (boncuklari); örnegin Dynabea , olusan bir grubun içerisinden seçilir. Bulusa uygun 3. solüsyon içerisinden bulunan manyetik olmayan bead°ler zirkonyum, agaroz veya silikadan elde edilen bead"lerden olusan bir grubun içerisinden seçilir. Bulusa uygun 3. solüsyon içerisinde anti histon antikorlari; h2a, h2b, h3, h4 veya 111 antikorlari içerisinden seçilebilir. Bulus bir diger açidan, bulusa uygun kitin ökaryotik genomik DNA"nin prokaryotik genomik DNA°dan ayristirilmasinda kullanilmasina iliskindir. Bulus ayrica, bulusa uygun yöntemin mikrobiyom çalismalarinda kullanilmasina iliskindir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda bulusa uygun yöntem metagenom çalismalarinda kullanilir. Bulusun özellikle tercih edilen bir uygulamasinda, bulusa uygun yöntem ökaryotik genomik DNA7nin prokaryotik genomik DNA7dan ayristirilmasinda kullanilir. Bu tarifname baglaminda içerir ifadesinin kapsar ifadesini belirtmesi amaçlanmistir. Teknik açidan uygun olan yerlerde, bulusun uygulamalari birlestirilebilir. Uygulamalar burada belirli özellikler/elemanlar içerecek sekilde açiklanmistir. Tarifname ayrica esas olarak bahsi geçen özellikleri/elemanlari içeren ya da bunlardan meydana gelen diger uygulamalari da kapsamaktadir. Patentler ve basvurular ve benzeri teknik referanslar referans yolu ile bu dokümana dahil edilmistir. Burada spesifik olarak ve açikça anlatilan uygulamalar tek basina ya da bir veya birkaç diger uygulama ile birlikte bir feragatnameye esas teskil edebilir. TR TR