TR201908019T4 - Doğum öncesi teşhis için servikal mukusta fetal trofoblast hücrelerinin tanımlanması ve analizi. - Google Patents
Doğum öncesi teşhis için servikal mukusta fetal trofoblast hücrelerinin tanımlanması ve analizi. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201908019T4 TR201908019T4 TR2019/08019T TR201908019T TR201908019T4 TR 201908019 T4 TR201908019 T4 TR 201908019T4 TR 2019/08019 T TR2019/08019 T TR 2019/08019T TR 201908019 T TR201908019 T TR 201908019T TR 201908019 T4 TR201908019 T4 TR 201908019T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- cells
- fetal
- sample
- trophoblast
- analysis
- Prior art date
Links
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 title claims abstract description 95
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 title claims description 73
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 25
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 title claims description 7
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 title description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 81
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000036818 High risk pregnancy Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 178
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 8
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 8
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 claims description 7
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108030001694 Pappalysin-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000005819 Pregnancy-Associated Plasma Protein-A Human genes 0.000 claims description 7
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 claims description 6
- 101000620620 Homo sapiens Placental protein 13-like Proteins 0.000 claims description 6
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 claims description 6
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 6
- 102000044512 Galectin-14 Human genes 0.000 claims description 5
- 230000009602 intrauterine growth Effects 0.000 claims description 5
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims description 5
- 102000044513 Galectin-13 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000620927 Homo sapiens Galactoside-binding soluble lectin 13 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims 2
- 206010014970 Ephelides Diseases 0.000 claims 1
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 claims 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 13
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 22
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 22
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 12
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 208000030941 fetal growth restriction Diseases 0.000 description 7
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 6
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 5
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 5
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 4
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100033762 Proheparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 201000003511 ectopic pregnancy Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021809 Chorionic somatomammotropin hormone 1 Human genes 0.000 description 2
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 102000005711 Keratin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010070507 Keratin-7 Proteins 0.000 description 2
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 description 2
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000000370 laser capture micro-dissection Methods 0.000 description 2
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091061744 Cell-free fetal DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- 208000018478 Foetal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102100022336 Placental protein 13-like Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol Chemical compound OC.CC(O)=O ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001099 axilla Anatomy 0.000 description 1
- GAQNUGISBQJMKO-YFKPBYRVSA-N beta-citrylglutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C(O)(CC(O)=O)CC(O)=O GAQNUGISBQJMKO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 210000003785 decidua Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 231100000317 environmental toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000562 fetal loss Toxicity 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- -1 hCG Proteins 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002895 hyperchromatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 1
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 1
- 238000009598 prenatal testing Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000275 quality assurance Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000027272 reproductive process Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000007847 structural defect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000251 trophoblastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
- G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Endoservikal numuneden mukusun çıkartılması, bu sayede endoservikal numunede fetal hücrelerin ve anneye ait hücrelerin ayrıştırılması; ve süspansiyonda fetal hücrelerin immünomıknatıslı etiketleme kullanılarak endoservikal numunede anneye ait hücrelerden ayrıştırılan fetal hücrelerin izole edilmesine yönelik bir yöntem. Ayrıca, yukarıdaki yöntem ile hazırlanan ayrıştırılan hücrelerin bir karışımının elde edilmesiyle, bir fetala özgü antikor ile hücrelerin tedavi edilmesiyle, fetala özgü antikora bağlanmış hücrelerin tanımlanmasıyla ve tanımlanmış hücrelerin izole edilmesiyle bir endoservikal numuneden fetal hücrelerin geri kazanılmasına yönelik bir yöntem sağlanmaktadır. Yukarıdaki yöntem tarafından hazırlanan ayrıştırılan hücre, sadece bunlarla sınırlı olmayarak servikal hücreler arasında fetal hücrelerin tanımlanmasını, yüksek riskteki hamileliklerin tahmin edilmesi için fetal hücre yoğunluğunun, fetal hücrelerin genetik analizinin belirlenmesini ve preeklampsiyi kapsayan obstretikal bozuklukların tahmin edilmesi için büyüme faktörü veya diğer biyoişaretleyici ekspresyonun belirlenmesini kapsayan çeşitli amaçlara yönelik analiz edilebilmektedir ve kullanılabilmektedir.
Description
TARIFNAME
DOGUM ÖNCESI TESHIS IÇIN SERVIKAL MUKUSTA FETAL TROFOBLAST
HÜCRELERININ TANIMLANMASI VE ANALIZI
ÖNCEKI TEKNIK
1. Teknik Alan
Mevcut bulus hücre izolasyonu ile ilgilidir. Daha belirli bir sekilde, mevcut bulus, hücre geri
kazanIiEle izolasyonunun invazif olmayan yöntemleri ile ilgilidir.
Degisen demografi, çevresel toksinlere karslZlartan maruziyet ve reprodüktif proseste
müdahaleden dolaylîgelismeye yönelik anormalliklerin artabildigi düsünülmektedir. Herhangi
hamile bir çiftin, bir kromozal anormallikte veya yaplgl kusurlu canlElIogmus infanta sahip
olma riski daha önceden %3 ve %5 araleda olacak sekilde tahmin edilmekteydi. Bu önemli
riskten dolayÇl erken hamilelik yasIa kromozomal anormallikler ve genetik bozukluklar
riskine sahip hamileliklerin son on y[l]]]ZJ süreçte tanIiIIanmas dair çok fazla çaba
harcanmlgtlB Mevcut bakIi standardü riskli hamilelikleri tanIiIamak için anneye ait
analitlerin ve ultrason isaretleyicilerinin tek baslEla veya kombinasyon halinde izlenmesini ve
ardIan amniyosentez ve koryon villus numune allElnasIEkapsayan belirli teshisle ilgili
testlere yönlendirilmesini içermektedir. Önceki izleme modelleri kaydadeger yanllglpozitiflerin
ve yanlElnegatiflerin oranlar. sahip iken, sonraki teshisle ilgili testler invaziftir ve önemli
fetal kayip] riski tasliaktadlîllar. AsIlEtla, Mujezinovic ve ark., 45 çallgl'nanl bir sistematik
analizini yürütmüstür ve amniyosentez için %1.9'luk ve koryon villus numune alIiEIçin %2'lik
fetal kaylüloranElbiIdirmistir. Bu yüzden, fetüsten genetik malzemenin elde edilmesi için daha
güvenli yöntemler gelistirmeye yönelik arastülna devam etmektedir ve son derece gereklidir.
Dogum öncesi teshis için diger alternatif, implantasyon öncesi bir embriyoda kromozom
anormallikleri veya tekli gen için izlenme içeren implantasyon öncesi genetik bozukluklar.
teshisi (PGD). Ana avantaji: seçici hamileligin sonlandlîlßîasian kaçIlIBiasüiken aynEl
zamanda fetüsün belirli bir rahatslîllgh sahip olmayacaglEla dair yüksek bir olaslDKI
sunmasIlEI PGD; dogum öncesi teshis için cazip bir yöntem olmas. ragmen, kendi riskleri
ve yüksek maliyetlerine sahip olan, in vitro asllâma gerektiren, desteklenmis reprodüktif
teknolojinin bir yardIic-lE DolayElEa, PGD, genel popülasyonda genetik anormallikler için
bir evrensel teshis araclIölarak kullanlîslülegildir.
Anneye ait serumda fetal hücrelerin tanulanmas dair çaba gösterilmistir, ancak bu
yaklasIi, anneye ait kanda (106 ila 107 anneye ait hücreler baslEb 1 fetal hücre) fetal
hücrelerin göreceli nadirligi ve kendi izolasyon ve analizinde iliskilendirilen zorluklar
tarafldan gizlenmistir. Toplamda, tasarlanan klinik etkililik umut klElEEldi. Buna ek olarak,
anneye ait plazmadaki fetal nükleik asitlerin su anki kesfi, kromozomal anöploidlerin invazif
olmayan dogum öncesi görüntülenmesi Için birkaç yeni olasHJElsaglamIStlEI Insan genomunun
kodlama bölgesinde tekli nükleotit polimorfizmlerinin allelik oranII ölçülmesi, fetal ve
anneye ait DNA arasIa DNA metillenmesinin farkllîrlnodelleri ile DNA fragmentlerinin analizi,
fiziksel veya kimyasal yöntemler kullanllârak anneye ait plazmada fetal DNA'nI fraksiyonal
konsantrasyonunun zenginlestirilmesi ve fetal nükleik asit analizi için daha hassas dijital
polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)-bazll3/öntemlerin gelistirilmesi ile birinci on haftalllZJgebelik
süresinden sonra anormallikler ortaya çlElnaktadlB Spesifik kallt3al hastalllZlar, fetal DNA ile
teshis edilebilmektedir, ancak hücresiz fetal DNA'nI dolasan fragmentli dogasIan dolayü
anneye ait plazmanI görüntülenmesi, bir güvenilir yaklasIi olarak düsünülmemektedir.
13 ila 15 haftalllZl gebelik süresi öncesi, küçük alan aslümalarIIEl, trofoblast hücrelerin
desidua capsularisi geçmesine ve üterin kavitesine ulasmas- olanak saglamaktadlü Bu
proses, gebelik süresinin üç aylEtla meydana geldigi düsünülen amniyokoriyonik membran
üterin kavitesi ve iç servikal osa slîdlîilnazlllîlsaglamaslan sonra daha az olasEbir sekilde
gerçeklesmeye baslamaktadE 1971'de, Shettles, koriyonik hücresel elemanlarElandoservikal
kanalda mevcut dejenere viliden saglayarak, erken hamilelik sßsßda benzer bir bulasmanI
üterin kavitesi içinde meydana geldigini ileri sürmüstür. Reprodüktif yolun erisilebilir
bölgelerinden fetal hücrelerin yakalanma olasllglü erken dogum öncesi teshis için yeni
yaklasIilar ileri sürmektedir. Fetal hücrelerin serviksten ve endometriyal kaviteden
izolasyonu, çok erken (6 ila 14 hafta, muhtemelen 5 hafta kadar erken) teshis için bir cazip
invazif olmayan alternatif önermektedir. Birinci açllZlamasIan dolayÇl birkaç arastlElnacEI
servikal mukustan ve degisen basarlZlderecesi ile endometriyal kavitenin lavajian elde
edilen aklskandan fetal hücrelerin izole edilmesine dair uygunlugu bildirmistir. Mevcut
literatür, dogum öncesi teshiste transservikal hücre (TCC) numune aIiII mevcut
durumunun deneysel oldugunu, ancak laboratuar yöntemleri incelendiginden ve standart
hale getirildiginden dolayühem genetik teshis hem de hamilelik sonucu tahmini için
mükemmel potansiyel tasliaktadlEI
Fark edilir miktarda fetal hücreleri güvenilir bir sekilde verebilen Ideal yöntem, mevcut
hamilelik üzerinde negatif bir etkiye sahip olmamalIIEl ve enfeksiyonlu veya travmatik
komplikasyonlarlîl olmamalIB Gerçeklestirmesi basit ve minimum gözlemciler arasEl
degiskenlik ile uygun maliyetli olmalIlEl Birkaç teknik, endoservikal ve endometriyal
kaviteden, hepsinin degisen basarübranlarEile pamuk temizleme bezleri veya bir sito füa ile
elde edilen smirleri, bir kateter ile servikal mukusun aspirasyonunu, bir Pipelle ile
endometriyal biyopsiyi ve endoservikal kanal veya üterin kavitesinin IavajIEkapsayan TCC
numunelerinin geri kazanEIBnasEiÇin tasarlanmlStE
Su an, mevcut literatür çok farklUJKl göstermektedir ve fetal hücrelerin geri kazanllüias.
yönelik mevcut uygun yöntemlerin göreceli etkililiginin tasarlanmasIa genellikle tutarslZlJB
Önceden, su aralar bildirildigi gibi, rastgele kontrol denemelerinde çesitli yöntemlerin göreceli
etkililiginin dogrudan bir karsllâstlîilnasian ziyade fetal hücrelerin elde edilmesi ve bunlar.
teshisle ilgili faydasII olusturulmasi dair elverisliligine vurgu yapUBwlgtE TCC
numunelerinin toplanmasIan sonra islenmesinin, faydalEl bilginin verimini dogrudan
etkileyen bir çalismadan digerine çok büyük bir varyasyona sahip oldugu göz önünde
bulundurulmaktadlîl Fetal hücrelerin ve teshisle ilgili uç noktalar. (fetal cinsiyete karsI gen
bozukluklarm tanllanmasü için kullanilân teknikler, tekbiçimli olmayan sonuçlar ile
karsllâstlülnaya yönelik heterojen gruplar elde ederek farklllâsmlslardü Dolaylglýla, numune
toplanmasü/e analizi için iyi açllZlanan teknikler üzerinde bilgi eksikligi bulunmaktadlB bu da
teknik ve ayrlZl operatörlerin tecrübesine kaydadeger sekilde baglEl olunmasEl ile
sonuçlanmaktad lü
Örnegin, Shettles taraflEtlan isaret 1971 raporunda, Y kromozomunun tanllanmasÇlpamuk
temizleme bezleri ile elde edilen midservikal mukus numunelerinden fetal cinsiyetin
tanIilanmaslZIiçin kullanIüTCC numunelerinin geri kazanllBiasEIiçin pamuk temizleme
bezlerinin kullanilüwas. dair bir sIlEllandlEilna, verimi azaltabilen pamuk ile hücrelerin
tutulmasIE Servikal mukus geri kazanIiEleya normal tuzlu su ile endoservikal kanalI IavajEl
için bir sito fIEanI kullanHlZlTCC toplanmasEilçin canlülternatifler sunmaktadlEI Maksimum
2 cm derinligine harici os araclEgEa yerlestirilen ve çllZlartma slBisIa en az bir tam dönüs
ile döndürülen bir sito flîça, teshisle ilgili miktarlarda fetal hücreler saglamaktadß Bununla
birlikte, diger arastlElnacllâr bu basarlýlîltekrarlamada basarlîlîl idi. Bir tekli kanula ile
endoservikal mukusun aspirasyonu ayrlEla erkek fetüsler ile annelerden TCC numunelerinin
en fazla %70'inde fetal hücrelerin belirlenmesi ile sonuçlanmaktadß Buna ek olarak,
Kingdom ve ark., endoservikal kanaII IavajII sito flîogadan daha fazla trofoblast hücreleri
geri kazandlglIElre sito fEça örneklerinin, debris ve anneye ait endoservikal hücrelerinin daha
yüksek bir insidansi sahip olabildigini göstermistir. Fetal hücre verimi bak“an daha
etkili bir yöntem, normal tuzlu su ile doldurulan bir sEliîgaya baglanan bir esnek kateterin
endometriyal kaviteyi durulamak için kullan-@Dintraüterin IavajdlEI(IUL). TCC numune
allEinasEliçin IUL ve diger yöntemler Adinolfi ve Sherlock taraflEUan bir makalede
gösterilmektedir.
Insan Iökosit antijeni ((HLA)-G), insan ekstravillöz sitotrofoblast hücreleri tarafIan eksprese
edilen ve tüm diger üterin ve plasental hücre popülasyonlarIa olmayan bir sIlElIb ana
histouyumluluk kompleks proteinidir. 2003'te, Bulmer ve ark., IUL tarafIan geri kazanilân
TCC numunelerinde sitotrofoblast hücrelerinin tanilanmasüiçin HLA-G'ye karsElMAb'Ieri
kullanmlStIE Kendi büyük, düzensiz hiperkromatik çekirdekleri ile karakterize edilen
sitotrofoblast hücreleri, HLA-G pozitif idi ve 23 (%52) TCC numunesinin 12'sinde tanIilandü
Ilginç bir sekilde, dört hastadan lazer yakalama mikro-diseksiyonu ile toplanan HLA-G pozitif
elemanlarda QF-PCR taraflüdan DNA'nI moleküler incelemesi, fetal isaretleyicileri ortaya
koymustur, bu da dogum öncesi genetik teshis için bu yaklasIiI faydaslügöstermektedir.
Bu çalismada kullanilan birlesik immünohistokimyasal ve moleküler yaklasIi, numuneler
araslîiblaki kaydadeger varyasyonu ortaya koymustur. MAb etiketlemesinin duyarlliIglüHLA-G
reaktivitesi, fetal-türevli trofoblast hücrelerin tanIilanmasD için yüksek spesifikligi
saglamasEb ragmen göreceli olarak daha düsük idi. HLA-G, ekstravillöz sitotrofoblast
hücresel elemanlar taraflian, ancak sinsitiyal fragmentler tarafIan olmadan eksprese
edilmektedir, bu da tüm fetal hücrelerin tanllanabilmesini sIlEIlandlîilnaktadE Trofoblast
hücrelerinin yalnlîta spesifik altpopülasyonlarEiJzerinde eksprese edilen antijenlere karsEbir
takIi MAb'Ierin reaksiyona girme gerekliligi, fetal hücrelerin tannlanmasüçin kapsamlEbir
sekilde bir immünohistokimyasal yaklasIi için çok önemli 0Iacakt|Ei Son günlerde, ekstravillöz
sitotrofoblast hücrelerinin bir fiksatif temizleme içine sito flîça ile toplanan ve mukus ile
karlgmayan mikroskop preparatlar üzerinde hazlîllanan TCC örneklerinde bir antijenik
Isaretleyici olarak HLA-G kullanilârak tutarIEl bir sekilde (örneklerin >%95)
tanIilanabiImektedir. Bulmer ve ark. tarafIan kullanllân HLA-G'ye karsEbynEbntikor ile
boyanan ve hematoksilin ile ikinci kere boyanan preparatlar, servikal hücre çekirdeginin bir
yogun zemini üzerinde antikor ile etiketlenmis az saylîîa sitotrofoblast hücrelerini ortaya
koymaktadlEl Trofoblast frekansÇl gebelik süresinin aItEl/e on dördüncü haftalarEbraleUa
basarli]]]iiir sekilde numunesi alin tüm hamilelikler için ortalama olarak iki yüzde bir iken, bu
deger, ektopik hamilelik veya yanllîl ovuma sahip kadIardan geri kazanilân örneklerde dört
ila bes kat azaIdEIBu bulgular, genetik test etmeye ek olarak, bilginin riskli hamileliklerde
klinisyenleri uyaran TCC analizinden derlenebildigini ileri sürmektedir.
Servikal kanal içine plasentadan geçmeyen fetal hücrelerin geri kazanüBwasÜ/e analizi, genel
hasta popülasyonuna dogum öncesi genetik teshisin daha genis ulasüâbilirligini
saglayabilmektedir. Sito flîça kullanllârak TCC numune aliü'le trofoblast toplamanI etkililigi
ve güvenilirliginde ve trofoblast isaretleyicilerini eksprese eden bu hücrelerin tanIilanmasEle
izolasyonundaki gelismeler ile, fetal DNA'n az miktarlarügenetik test etme için kolayca elde
edilebilmektedir. Anneye ait serumda fetal DNA'nI analizi için gelisim altiaki bunlar gibi
yeni duyarlEteknoIojiler, aza say-ki izole hücreden fetal genom hakk-a kapsamIEbiIgiyi
elde edebilmektedir. AltElhaftallKl gebelik süresi kadar az bir sürede TCC tarafIan
sitotrofoblast hücrelerinin tedarik edilmesine yönelik kapasite, anneye ait serumda fetal
DNA'nI analizini kapsayan mevcut teknolojilerden daha erken bu çok önemli mevcut bilgiyi
saglayabilmektedir. Bu yüzden bu, izole trofoblastlar için bir invazif olmayan yöntemin
gelistirilmesi için faydallIcMacaktIE
immünohistokimya, özellikle hücre mikromanipüIasyon/mikrodiseksiyon kullanilârak genetik
teshis için fetal hücrelerin izole edilmesine yönelik bir invazif olmayan yöntem ile ilgilidir.
hamile kadIan elde edilen bir mukus numunesinden fetal trofoblast hücrelerinin izole
edilmesi ve saflastlîllhas- yönelik bir yöntem ile ilgilidir.
sonra immünohistokimyadan trofoblast hücrelerinin geri kazanmasi yönelik bir yöntem ile
hamile kadIEUan elde edilen transservikal hücreler kullan [Iârak invazif olmayan dogum öncesi
genetik teshise yönelik bir yöntem ile ilgilidir.
analiz edildigi bir hamile kad-an elde edilen transservikal hücreler kullanilarak invazif
olmayan dogum öncesi genetik teshise yönelik bir yöntem ile ilgilidir.
kullanilârak analiz edilen bir hamile kadIdan transservikal hücrelerden fetal hücrelerin elde
edilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI
Mevcut bulusa göre, su adnlarüçeren bir endoservikal numuneden fetal hücrelerin geri
kazanllBIasEla dair bir yöntem saglanmaktadß endoservikal numuneden mukusun
çlElartllBiasü bu sayede endoservikal numunede fetal hücrelerin ve anneye ait hücrelerin
ayrlgtlîlllîhaslîl ve süspansiyonda fetal hücrelerin immünomlKhatElEletiketleme kullanllârak
endoservikal numunede anneye ait hücrelerden ayrlgtlîllân fetal hücrelerin izole edilmesi.
Yukarlilbki yöntem tarafIan hazlEllanan ayrlgtlEllân hücre, sadece bunlarla sIIIllEibImayarak
servikal hücreler arasia fetal hücrelerin tanIilanmasIü yüksek riskteki hamileliklerin
tahmin edilmesi için fetal hücre yogunlugunun, fetal hücrelerin genetik analizinin
belirlenmesini ve preeklampsiyi kapsayan obstretikal bozukluklar. tahmin edilmesi için
büyüme faktörü veya diger biyoisaretleyici ekspresyonun belirlenmesini kapsayan çesitli
amaçlara yönelik analiz edilebilmektedir ve kullan Uâbilmektedir.
Dolayßýla, bulus, bir hamile insan disisinde preeklampsi veya Intraüterin büyüme
sIIIlEllandlElnas tespit edilmesine yönelik bir yöntemi kapsamakta olup, su adnlarlîl
içermektedir: bulusa göre yöntem kullanllârak hazlEllanan izole fetal ekstravillöz trofoblast
hücrelerin elde edilmesi, burada fetal ekstravillöz trofoblast hücreler, 5 ila 20 haftalllZl gebelik
süresinde toplanan PAP örneklerindendir; ve sunlardan seçilen bir fetal proteine karslZbir
antikor ile izole fetal ekstravillöz trofoblast hücrelerinin tahlilinin yapUBiaslîl galektin 13,
galektin 14, plasental büyüme faktörü, hamilelikle iliskilendirilen plazma protein A, alfa fetal
protein, endoglin ve fms ile ilgili tirozin kinaz 1, burada azalmlglgalektin 13, galektin 14,
plasental büyüme faktörü, hamilelikle iliskilendirilen plazma protein A, artmlgl alfa fetal
protein, endoglin ve fms ile ilgili tirozin kinaz 1, preeklampsi veya intraüterin büyüme
sIlHland @nasil göstergeleridir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
Mevcut bulusun diger avantajlarÇIekli sekiller ile baglantiEEblarak düsünüldügünde, asaglki
ayrlEtÜJJIIçllZlamaya referans ile benzerinin daha iyi anlasllüîasian dolayEkolayca takdir
edilecektir.
Sekil 1, ß-hCG'yi eksprese eden TCS'den izole edilen hücreleri göstermektedir. Her alan,
DAPI nükleer boyanI (sol) veya ikincil antikorun (sag) floresanIElgöstermek için
görüntülendi. BaglEfraksiyondaki hücrelerin tümü, anti ß -hCG taraflEUan etiketlendi, bu,
eslesmis DAPI ve hCG görüntülerinde ok baslarEitarafIan gösterilmekte iken, bagllîl
olmayan hücrelerin hiçbiri etiketlenmedi. Immün olmayan IgG ile etiketlenen baglEI
hücreler floresan degildi, bu da bir düsük spesifik olmayan baglamayügöstermektedir.
Sekil 2, izole trofoblast hücreleri ile cinsiyet belirlenmesini göstermektedir. Sadece SRY,
sadece DMD veya bir multipleks tahlilde her iki gen için primerler kullanilârak gösterildigi
gibi, sünnet derisi fibroblast (Fb) hücrelerinden, ayrlîsabitlenmis Fb hücrelerinden veya on
ayrEiizole trofoblast hücresinden izole DNA kullan llârak X (DMD) ve Y (SRY) kromozomlar
üzerindeki genlerin PCR analizi. Üst jelde hastanI fetüsü erkek olarak görünürken, alt jel
bir disi fetüsü göstermektedir. Düsük numunedeki bazEreaksiyonlarIEl, büyük olasIIJKJa
PCR tüpünün içine transfer süslütla hücre kayblEUan dolayEI basarlgü oldugu
görülmüstür.
TERCIH EDILEN YAPILANDIRMALARIN AÇIKLAMASI
Mevcut bulus, dogum öncesi teshisin gerçeklestirilmesi için serviks veya üterin kavitesinden
hamileligin birinci üç ayEboyunca hep birlikte elde edilen fetal malzemenin elde edilmesi ve
kullanüîhaslîliçin bir yöntem saglamaktadlB Yöntem, bir numunenin mukusundan fetal
hücrelerin ve anneye ait hücrelerin ayrlgtlîllüiaslüve bir endoservikal numunede diger
hücreden ayrlgtlElilB'iEIfetal hücrelerin izole edilmesini kapsamaktadlB Ilaveten, mevcut bulusu
yöntemleri, EVT hücrelerinin invazif olmayan edinimine olanak saglamaktadü ve hamilelik
sonuçlarEile protein ekspresyonunun karsilâstlElIhalela izin vermektedir. Bu bulgular, PE
veya IUGR veya diger obstetrikal bozukluklar için hasta riski hakkIa birinci ve Ikinci üç ay
boyunca bilgi verebilen EVT biyoisaretleyicilerinin bir saglam panelini tannlamlgtlü Mevcut
bulusun yöntemleri, bir klinik laboratuar hizmeti olarak kullanilâbilmektedir. Yöntem,
hücrelerin toplanmasIIIJbir filGatif çözeltide toplanan hücrelerin yerlestirilmesini, asitlestirme
ile mukusun çilâartlEnasIlÇl santrifüjlenme ile kalan hücrelerin ylKhnmasIElve mikroskop
preparatlarlîilizerinde hücrelerin hazlEllanmalelÜIapsamaktadlB
Örnekler, teknikte uzman kisi tarafIdan standart invazif olmayan yöntemler kullanilârak elde
edilebilmektedir. Örnekler, sadece bunlarla sIlEIlEloImamak kaydMa, intraüterin IavajlElÇl
servikal mukusun aspirasyonunu veya servikal 05 veya endoservikal kanaldan yüzey
dokusunun çüZlartllÜiasIElkapsamaktadlEl Tercih edilen yöntem, minimum bir sekilde servikal
dokuyu asIEEken, harici osu yaklasllZl 2 cm geçerek yerlestirilen bir sitolojik fEça
kullanilarak ve mukus dolgusunun çllZlartllBiasü/e yakalanmasüçin döndürülerek endoservikal
kanaldan mukusun toplanmasIlEl Sitolojik fßa daha sonra düsük pH (4 ila 6) tamponu ve
bir alkolden olusan bir fiksatif çözelti içinde temizlenmektedir. Örnegin, bir standart %3
asetik asit, %7 sodyum asetat, %50 metanol karglînllîlkullanllâbilmektedir. Klinisyenlere,
hamile oldugu bulunan ve ayrIEla birinci ve ikinci üç aylllZl süresinde olan kadIardan
ThinPrep® kiti kullanilarak örneklerin toplanmasEiçin yol gösterilebilmektedir. Bu kit, bir
sitolojik flîcl;a bar Ünaktad lEIve 20 ml fiksatif çözeltiyi kapsamaktadlü
Toplanan hücreler asitlestirme ile mukustan izole edildi. Asitlestirmeye, teknikte uzman kisi
tarafIan bilinen yöntemler kullanilarak ulasllâbilmektedir. Örnegin, fiksatifte 10 ila 20 kat
asetik asit çözeltisinin bir sulandlElnas- karsEllZJ gelen 2 ila 4 hücreyi barliün fiksatifin
pH'Ißzaltmak için asetik asidin %3'Iük bir çözeltisinin eklenmesi.
Örnek bir kere elde edildiginde, fetal hücreleri veya immünolojik hücre alt türleri gibi klinik
öneme sahip diger hücre türleri izole edilebilmektedir ve toplanan numunelerde
tanIilanabilmektedir. Buna, sadece bunlarla sIlElllîilmayarak, erkek Y kromozomunun varl[g]l:l
için kanlEIkuIIanElârak, anneye ait allelik profili ile allelik profilin karsüâstlEllB'iasÜ/e trofoblast
isaretleyici moleküllerin (örnegin, sitokeratin7, hCG, HLA-G, plasental alkalin fosfataz,
monoklonal NDOG1 tarafIan hedeflenen hiyalüronik asit ve monoklonal antikor FT141.1,
namEldeger FI'1.41.1'in bilinmeyen hedefi) ekspresyonunu kapsayan teknikte uzman kisi
taraf-an bilinen yöntemler kullanilârak ulasllâbilmektedir. Çogu durumda, fetal hücrelerin
analizi, floresan i'n si'tu hibritlesme (FISH) veya polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi genetik
teshisi içerebilmektedir. Yöntemler, ThinPrep® kit kullanllârak toplanan hücreler üzerinde
gerçeklestirilen testlere baglü olarak hamilelik sonucunu tahmin etmek için
kullanllâbilmektedir.
Servikal mukus dolgusunda biriken fetal hücrelerin numunesinin allEinas- yönelik ana
dezavantajlar, fetal hücresinden daha fazla anneye ait hücrenin bulunmasüve hücrelerin
agregasyonu ve mukusun zemin floresansIan dolathiukusun çogu test ile karlglnas-
Birinci problem, trofoblast hücreleri için saglam fluoresan isaretleyicileri kullanilârak
belirlenecektir. Bir isaretleyici olarak HLA-G'nin bir sIlEllandlElnasü tüm trofoblast alt
popülasyonlarII tanllanmamasllEl(örnegin, sinsisyal trofoblast fragmentleri). Sitokeratin,
tüm trofoblast alt popülasyonlarlîile eksprese edilmektedir, ancak yanlEpozitiflere yol açarak
bazüinneye ait hücre türlerde bulunabilmektedir. Mukus problemi bunun çözündürülmesi için
asitlestirme ile çözüldü. Degiskenlik gösterebilen numunelerde bulunan trofoblast hücrelerinin
saylîlîlyöntemi sIlElandßbilmektedir. SayEçok az ise, akli sitometrisi, kullanlSlslîl olmaya
baslayacaktlB Bununla birlikte, immünofloresan mikroskopu, birkaç HLA-G-pozitif hücresi 1
ml numuneden hazlîllanan bir mikroskopik alanda konumlanabilecegi sürece bir canllJaklasIi
olacaktlü
Plasentadan servikal kanal içine geçmeyen fetal hücrelerin geri kazanllmasüie analizi, genel
hasta popülasyonuna dogum öncesi genetik teshisin daha genis bir erisimini saglamaktadEl
Sito füa kullanilârak TCC numune alnEile trofoblast toplamanI etkililigi ve güvenilirliginde
ve trofoblast isaretleyicilerini eksprese eden bu hücrelerin tanllanmasEl/e izolasyonundaki
gelismeler ile, fetal DNA'nI az miktarlarÇ] genetik test etme için kolayca elde
edilebilmektedir. Anneye ait serumda fetal DNA'nI analizi için gelisim aItIaki bunlar gibi
yeni duyarlEteknolojiler, aza say-ki izole hücreden fetal genom hakkIa kapsamlEbiIgiyi
elde edebilmektedir. AItIZlhaftaIiEl gebelik süresi kadar az bir sürede TCC taraflEdan
sitotrofoblast hücrelerinin tedarik edilmesine yönelik kapasite, anneye ait serumda fetal
DNA'nI analizini kapsayan mevcut teknolojilerden daha erken bu çok önemli mevcut bilgiyi
saglayabilmektedir. Sonraki birkaç ylljboyunca, kromozom anormalliklerinin dogum öncesi
teshisine yönelik TCC numune alma, birinci üç ayda anormal hamilelikler için Izleme ve
obstetrikal problemlerin önceden teshisi kullanuârak daha fazla çalisma beklenmektedir,
bunlarI hepsi, burada açlKlanan yöntemlerden izole edilen hücreler kullanilârak
gerçeklestirilebilmektedir.
Ilaveten, ektopik hamilelik tüm hamileliklerin yaklaslK]%1 ila 2'sini zorlastlîilnaktadlîlve üterin
kavitesinin göz dibi, en yaygI sekilde fallop tüpü yerine baska bir bölgede blastosit
implantlarEgelistirildiginde meydana gelmektedir. Bu anormalligin gecikmis klinik teshisi, bir
s-lüßnneye ait sonuç ile sonuçlanabilmektedir. Fetal trofoblast hücrelerinin birinci üç ayllKI
süre boyunca servikal kalanda bulunmasü transservikal numune allElnasElile anormal
hamileligin degerlendirilmesine yönelik bir invazif olmayan yaklasl saglamaktadlEI
Mevcut yapllândlîilnada, bir piyasada satilan kit (ThinPrep®, Hologic Corporation,
Marlborough, MA), serviksten hamileligin birinci üç ayEboyunca hücrelerin toplanmasElçin
kullanllüiaktadlü Bu, PAP smir testlerinin hamilelik süsia rutin olarak tavsiye
edilmelerinden dolayüninimal olarak invazifliktedir. ThinPrep® kit kullanilârak, bir saglanan
sito flE;a, imalatçEtlaraflEhan yönlendirildigi gibi, iç os ve dlgos arasIEUa serviksten mukus ve
hücresel malzemenin toplanmasEiçin kullanllîhaktadlEl Toplanan hücreler, bir cam sisede
imalatçEltarafIan tedarik edilen Preseeryt® tasma ortamüiçinde temizlenmektedir.
Preseeryt® tasIia ortamübir metanoI-asetik asit bazIElfiksatif barIlEnaktadB Numuneler
oda lelakI[g]Ia veya analiz olana kadar sogutma aItIda depolanmaktadIE
Bir preparat preparasyonu, immünohistokimyasal boyama için mukusun ve serbest tutulan
hücrelerin çözündürülmesi için örnegin ilk olarak asitlestirilmesiyle yapllâbilmektedir. Örnek
daha sonra bir mikroskop preparata eklenen bir Shandon EZ mega hunisi içine
yerlestirilmektedir ve bir Sitospin3 santrifüjünde santrifüjlenmektedir. Bu prosedür, preparat
üzeride betimlenen alan içinde düzgün bir sekilde yayllân ve mukus ile karlgfnayan hücreleri
vermektedir. Alternatif olarak, sitolojik preparatlarI preparasyonu Için bir otomatik islemci
kullan Ilâbilmektedir. Bir örnek ThinPrepZOOO (Hologic)'tir.
Hücreler daha sonra HLA-G'ye karsEbntikor ile boyanmaktadlü bir temel histouyumluluk
proteini sadece fetal trofoblast hücreleri ile eksprese edilmektedir. Diger trofoblast
isaretleyicileri örnegin koriyonik gonadotropin (ß-CG) veya plasental laktojenin (PL) [3 alt
birimi gibi kullanllâbilmektedir, bunlar aras-a bazllârEl(örnegin, sitokeratin 7) daha az
spesifiktir. Immünofloresan mikroskopu veya akIi sitometrisi, fluoresan olarak etiketlenen
trofoblast hücrelerinin tanIiIanmasEiçin kullanlßiaktadlü Ilgili bir protein, uygun bir antikor
ve farkIEbir floresan etiketine sahip bir ikincil antikor (çift etiketleme) kullanllârak HLA-G-
pozitif hücrelerinde sorgulanabilmektedir. Alternatif olarak, bir FISH prosedürü HLA-G pozitif
hücrelerinin genetik analizi için kullanllâbilmektedir, örnegin, bunlarI Y kromozomunun
varllg1Egibi fetal hücrelerinin tannlanmasüçin bir yol bulunursa kromozom saylîD/eya bir
özel gen sekansIthespit edilmesi için kullanilâbilmektedir. FarklEbir strateji ayrlîla bir disi
fetüs için gerekli olabilmektedir. Aç[lZl alan mikroskobu (örnegin, bir peroksidaz belirteci için
diaminobenzidin substratElile) tarafIdan görsellestirilebilen HLA-G tanIilamasEliçin bir
enzime baglüikincil antikoru kullanilmasi. mümkün oldugu ve ilgili hücrelerin PCR
tarafIan genetik analizi için lazer yakalama mikrodiseksiyon tarafIan izole edilebildigi
gösterilmistir (Imudia ve ark., 2009).
Hipertensif bozukluk preekplamsiye shaip kad-ardan plasentalarI birkaç proteinin
(epidermal büyüme faktörü [EGF], dönüstürücü büyüme faktörü-a [TGFA], heparin-baglama
EGF benzeri büyüme faktörü [HBEGF]) degismis ekspresyonuna sahiptir. Bu yüzden fluoresan
çift etiketleme yöntemi mevcut herhangi bir klinik semptomdan aylar önce, birinci üç ay
boyunca servikal toplamalardan izole edilen trofoblastlarda bu proteinlerin ekspresyonunun
izlenmesi için kullanilâbilmektedir. Bu yüzden, bu yöntem, daha sonra hamilelik sonrasIda
preeklampsi gelistirme riski olan kad-lar tanIilanmasEliçin bir teshisle ilgili araç
saglayabilmektedir.
Mevcut durumda, koryon villus numune aIIiE[CVS) veya amniyosentez, fetal kromozomal
anormalligin dogum öncesi teshisi için kullanilâbilmektedir. Her iki yöntem invaziftir ve
potansiyel hamilelik kaybEI ile iliskilendirilmektedir. CVS, 10 hafta sonra
gerçeklestirilebilmektedir ve amniyosentezin 14 hafta hamilelik süresinden sonra yapllüiasEl
gerekmektedir. Ikinci üç ay basladüîtan sonra hamileligin sona ermesinin gerçeklestirilmesi
daha az arzu edilmektedir. Mevcut bulusun yöntemleri, erken birinci üç ayda ve bir invazif
olmayan sekilde testin gerçeklestirilmesine olanak saglamaktadü
Diger yapüândlîrlnada, yöntemler, obstetrikal bozukluklar. göstergesi olan
biyoisaretleyicilerin ekspresyonunu test etmek için kullanllâbilmektedir. Biyoisaretleyiciler
büyüme hormonlarÇIproteinIer ve RNA'yEkapsayabilmektedir. Örnek aracHJgllýla, yöntemler,
eger EGF, TGFA veya HBEGF'nin trofoblast hücrelerinde azaltI[gllIrllurumunu belirlemesi için
floresan antikorlarEille çift etiketleme hücreleri ile proteinlerin ekspresyonunu test etmek için
kullanilâbilmektedir. Bu degisiklikler, preeklampsiye sahip kadlîilardan tas-n plasentalarI
trofoblast hücrelerinde gözlemlenmistir. Tüm hamile kad-lar %5'i sonuç olarak
preeklampsiyi gelistirdiginden dolayÇl bu, bir pozitif hamilelik testi zamanlda rutin olarak
gerçeklestirmek üzere faydaIElbir test olacaktIE Bu kadlEIarI bozukluk riskinde oldugu
bulunmustur, ilk olarak klinik semptomlar görülmeden önce hipertansiyon uzunlugunun
gelistirilmesine karsEönlemler almak için yönlendirilebilmektedir.
Diger yapllândlElnada, yöntem, transservikal trofoblast hücrelerinin genetik analizinin
yürütülmesini kapsayabilmektedir. Trofoblast DNA, (1) anti-HLA-G etiketlenmis hücrelerin
lazer yakalama mikroskobu ile (veya serviksin mevcut anneye ait hücrelerinden trofoblast
hücreleri ayI eden diger antikorlar kullanllârak) veya (2) trofoblast hücrelerin izole edilmesi
için anti-HLA-G afinite mlEhatElElboncuklarlühanopartikülleri ile elde edilebilmektedir. Genetik,
Immünolojik veya diger biyokimyasal analizler daha sonra tam-hücre yaklasIiIIIar bir çesidi
ile gerçeklestirilebilmektedir. Örnegin, revers transkripsiyonlu veya bu transkripsiyon olmadan
PCR, immünohistokimya, tam genom çogalmasüWGA) ve ardIan karsllâstlEnalEgenomik
hibritlesme veya sekanslama, metabolit tahlilleri, küçük bilesik tahlilleri ve diger testler uygun
olacaktlü Alternatif olarak, fetal ve anneye ait DNA, bir dijital PCR yaklasHEkullanllârak
fraksiyonlarlEb ayrllîi'iam @transservikal numunelerde degerlendiriIebilmektedir.
Genetik analiz, örnegin, FISH, sekanslama veya PCR bazlEl/öntemleri kapsayabilmektedir.
Alternatif olarak, mEriatElüboncuklar, ilgili hücreler ve aklglhattßinalizi için genisletilecek bir
yol olarak immünofloresan öncesinde ayrlEia kullanHâbilmektedir. Dynal Magnetic boncuklarÇl
ekli ikincil antikorlar veya anti-HLA-G'ye eklenmesi için kullanllâbilen kimyasal birlestirme
gruplarEiIe Invitrogen'den (Carlsbad, CA) elde edilmektedir. Asitlestirme ve nötrlestirmeden
sonra bunlar hücreler ile karlgtlElEhaktadlElve hedef hücreleri (trofoblast) boyamaktadE Test
tüpüne karsljiir mlEhat- tutulmaslýla veya 5 dakika boyunca DynaMagTM-Spin mlEhatlgD
(Life Technologies) benzeri bir cihaz içine tüpün yerlestirilmesiyle, ask. tutulan hücreler,
boncuklar ile kaplanan mlEhatlgbaglEliiücrelerin ardlEUa kalarak, emilmektedir. Üç ylElamadan
sonra, trofoblast hücrelerin çogunun izole edilmesi Için yeterli olmasgereken yaklas[lZ| 1,000
ila 10,000 kat genisletilmesi mümkündür. Hücreler, boncuklarlEl varllglIEtlogruIamak için
mikroskopik olarak ve numuneyi kontamine eden boncuklar olmadan hiçbir hücreyi manuel
olarak çlKlartmamak için incelenebilmektedir. Ardian, ilave test, burada ayriEtlIJDOIarak
açlEIand[gl3_îiibi yürütülebilmektedir.
Diger yapllândlîrlnada, fetal trofoblast hücreleri, bunlarI toplanmasIan sonra mevcut
anneye ait hücrelerden izole edilebilmektedir, böylece bunlar genetik veya biyokimyasal
testlerde kullanüâbilmektedir. Anti-HLA-G antikorunun spesifikligi, trofoblast izolasyonu için
bunu milihatlâllîlnanopartiküllere baglayarak bu amaca yönelik kullanHB1aktadIEl Örnegin,
yöntem, anti-fare IgG veya Protein A'ya (Clemente Associates, Madison, CT) konjuge edilen
ve fare monoklonal anti-HLA-G antikorunun (Klon: 4H84, BD Biosciences, San Diego, CA;
veya klon G233; Exbio, Prag) 5 üg'üle 4°C'de bir döner karlgt- bir gece boyunca inkübe
edilen 250 nm nanopartiküllerin 10 ul'sini kullanabilmektedir. Partiküller, 5 dakika boyunca
bir DynaMagTM-Spin mEIZhat- (Life Technologies) tüplerin yerlestirilmesiyle ve sonra
mlEhatlglEl nanopartiküller tutulurken s-I çlKlartllüîasEla bagIEl olmayan antikordan
ayruüîaktadlü Bir transservikal örnekten toplanan hücreler daha sonra nanopartiküllere
eklenmektedir ve 4°C'de bir döner karlgt- bir ila 24 saat boyunca oda slîiakllglia inkübe
edilmektedir. Numune m[lZhatlîIanmaktadlEl ve baglEblmayan hücreler giderilmektedir. Üç
ylKbmadan sonra, tutulan hücreler geri kazanlEnaktadlEl Trofoblast hücrelerinin tanIiIanmasEl
için anti-ßhCG ile immünofloresan mikroskobu ile immünom[EhatlgIl:lolarak izole edilmis
hücrelerin analizi, izole edilmis hücrelerin %95 ila 100'ünün etiketlendigini ve mlEhatlgama
sßsia çilZlartllân tüketilmis hücrelerin boyanmadiglElEloitaya çllöaracaktlîl (Tablo 1). Bu
metodoloji kullanilârak gerçeklestirilen bir testte, ortalama olarak 500 ila 2000 hücre her
hasta örneginden geri kazanIDAnneye ait servikal hücrelerden bunlarlîiyl eden antikorlara
bunlarI baglanmasi bagllîlolarak trofoblast hücrelerinin izole edilmesine yönelik bu
yaklasIi, diger teknolojiler ile birlikte kullanllâbilmektedir. Örnegin bir mikroaklgkan cihaz,
antikora konjuge bir mllZhatlgEl veya floresan isaretleyiciye bagllZl olarak hücreleri
sIltJhndlÜnak için yapUândlElIâbilmektedir.
Immünomllîhatlgllîlzolasyondan sonra hücreleri eksprese eden yüksek saflltha ß-hCG'ye ek
olarak, bagllîlolmayan fraksiyondaki hücreler ne anti-ß-hCG tarafüdan etiketlendi ne de
immün olmayan kontrol IgG ile etiketlenmedi (Sekil 1).
YukarlEIla aç[lZlandlg]i:gibi yöntem, fetüs ve plasenta hakkIa bilgi edinmek için biyokimyasal
veya genetik test etme için izole hücreleri kullanmaktadlü Izole edilen hücreler, bir çoklu
kuyucuk plakasIa (bir Terasaki çok kuyucuklu plaka gibi) daglmîii ile test etmeye ve bir
Stripper mikropipet (Origio MidAtIantic Devices, Mt. Laurel, NJ) ile sIIIIhndlEnaya yönelik
hücrelerin ayrülreya küçük gruplariEla sIlühndIElBiaktadB Bir test grubunda, 50 hücrelik grup
200 ü.' PBS'de ask. tutulmaktadlîlve 5 dk boyunca 1500 RPM'de (dakikada devir sayEtDbir
Shandon Sitospin 3 sitosantrifüj kullanlßrak bir preparat üzerinde santrifüjlenmektedir. Bu
fetal hücreler, immünofloresan mikroskobu ile protein ekspresyonunun analizi için veya FISH
ile moleküler analiz için kullanllâbilmektedir. Örnegin, hücreler trofoblasta özgü proteinleri
veya çesitli trofoblast aIt-popülasyonlar ile eksprese edilen proteinleri tanlýlan antikorlar ile
etiketlendi. Sonuçlar, izole hücrelerin koriyonik villiden olmadlgilrîlüancak derin bir sekilde
invazif ekstravillöz trofoblast hücreleri oldugunu göstermistir (Tablo 2). Bu, plasentanI
tabanIEkapIayan trofoblast hücrelerin, bunlarI transservikal numune aIIiEiIe topland[glü
serviks kadar uzaglEb göç ettigini göstermektedir. Bu, test protokollerinin ayrlEla gelistirilmesi
için faydalüalabilmektedir ve hamilelik lehsIa elde edilebilen bilgi miktarIEahrttlEnaktadlEI
Benzer bir yaklasIl, fetal bozukluklar veya anneye ait onstetrikal bozukluklar. protein
biyoisaretleyicilerine yönelik izole edilen hücrelerin izlenmesi için klinik olarak
kullanilâbilmektedir.
Alternatif olarak, hücreler, in vitro asüânma (IVF) ile üretilen implantasyon öncesi
embriyolardan biyopsisi alümg hücrelerin genetik analizi için kullanllân tek hücre
yöntemlerinden allEhn yöntemler kullanllârak moleküler biyolojik analiz için
sIlîlhndlEIIâbilmektedir veya tanIiIanabiImektedir ve izole edilebilmektedir. Izole edilmis
trofoblast hücreleri (en fazla 100), 2 ila 6 pl RNaz'sEisu ile ince duvarlElPCR tüpleri içine ayrü
ayrEyerlestirilen tekli hücreler olarak bir Stripper mikropipet ile SIEllHbndlEllâbilmektedir ve -
80°C'de dondurulabilmektedir. Bu hücreler, PCR veya WGA gibi çogalma yöntemleri
kullanilârak kendi RNA veya DNA'sIlZinceleyen test etmeye yönelik kullanllâbilmektedir. RNA
test etme için, sabit hücreler fiksatif çözeltiden çlElartIlEtan sonra RNA'nlEl stabilize edilmesi
gereklidir. Bu yüzden, PBS'deki baslanglg hücre ylKbmalarü HLA-G ile birlestirilmis
nanopartiküller ile inkübasyonlar ve hücrelerin alikotlar içine yönlendirilmesi, RNA
degradasyonunun önlenmesi için 20 mM ribonükleozid-vanadil kompleksi (New England
BioLabs, Inc.) ile takviye edilen PBS kullanllârak yapHB1aktadlEl Hücreler, RNA saflastlElnasEl
için hemen parçalanmalIEve bir kayotropik liziz çözeltisinde -80°C'de depolanmalIEveya
depolama öncesinde cDNA'ye dönüstürülmelidir. ELISA veya kütle spektrometrisi gibi tek
veya az saylâla hücre için azaltllân protein analizinin gerçeklestirilmesi de mümkündür.
WGA'dan sonra, DNA (5 ila 50 mikrogram), genetik mutasyonlara yönelik tarama, kromozom
saylîElbozukluklarII tanIilanmasEI(anüploidler) veya kisisellestirilmis ilaca yönelik tam
genomik sekansI elde edilmesi için mikrotahlil veya derin sekanslama yaklasulara
kullanliâbilmektedir. Genetik polimorfizmler, bir kalite garanti kontrolü olarak çogaltlßîlgl
DNA'n fetal oldugu, parental kökende oldugunu dogrulamak için parental polimorfizmler ile
karsilâstlElBrasübin degerlendirilebilmektedir.
Diger yapUânlenada, fetal hücreler, kitte koruyucu kullanllârak bir baslanglglfiksajül)lmadan
transservikal örneklerden izole edilebilmektedir. Bu, hücrelerin daha iyi geri kazanllmas- ve
daha az stabil hücre yaplßslarII (örnegin, metabolitler, RNA) ve artan miktarlarda fetal
DNA'nI elde edilmesi veya karyotipleme için metafaz hücrelerinin üretilmesi için hücrelerin
çogaltlJBialela yönelik kapasitenin daha dogru bir sekilde analiz edilmesine olanak
saglamaktadlEl
Izolasyon, %10 fetal sigilElserumu ve 50 ug/ml gentamisin veya antibiyotiklere sahip kültür
ortamII diger karsllâstlîllâbilir kombinasyonlarIElbarlEUIBin buz gibi RPMI 1640 doku kültür
ortamIa sito flîaganl (burada ayrlEtliând-lgllîlgibi kullanIJBiaktadlE) temizlenmesiyle
yapllâbilmektedir. Örnek hlZElbir sekilde laboratuara getirilebilmektedir ve 4°C'de steril
PBS'de santrifüjlenme ve yeniden asküla allEhia ile üç kere ylElanabilmektedir, Fare anti-HLA-
G ile baglanan anti-fare IgG'ye konjuge edilmis mllZhatlâIlîtlianopartiküller daha sonra hücreler
ile kombine edildi ve 1 saat boyunca 4°C'de inkübe edildi. Fetal hücreler bir DynaMag-Spin
(Life Technologies) mlEhat-a 4°C'de inkübasyon ve baglljolmayan hücrelerin çlElartllB1asü
ile geri kazan-DBu adn, ikiden fazla defa tekrarlandEi/e bagllîhücreler 100 u' buz gibi
PBS'de geri kazanIEl
Izole edilmis fetal hücreler ya standart trofoblast kültür ortamlEtla (Kilburn ve ark. 2000)
kültürlendi ya da immünohistokimya için sabitlendi. Kültürlenen hücreler 2 ila 3 gün içinde
küçük koloniler olusturdu, bu da bunlar. çogaldlglIEgöstermektedir. Sabit hücreler, hCG
veya BCL-2'nin beta alt birimine karslZlantikor ve ardian floresan ikinci antikor ile
etiketlendi. Tüm izole edilen hücreler, her iki antikor ile pozitif bir sekilde etiketlendi, bu da
bunlar. aslIa trofoblast oldugunu apoptotik olmad [glIÜgiöstermektediL
Yukarlîzlh belirtilen faydalara ek olarak, tekli hücre yaklasIiII bir faydasi: bunun yani&
sonuçlarEblaslIlgllEllEl neredeyse sm indirilebilmesidir. HatalarlEl ana kaynagi: anneye ait
hücreler ile izole trofoblast. kontaminasyonundadlü Genel olarak, anneye ait hücreler ile
gelen fetüslerinin cinsiyetini belirlemek için X (DMD) veya Y (SRY) kromozomlarlîüzerinde
genlerden sekanslarI multipleks çogaltllBiaslZliçin kullan-El Her reaksiyon, bir hücrenin
mevcut oldugu ve PCR'I çallgtlglîlurumda bir X için bir ürün üretmelidir, ancak sadece erkek
hücreler bir Y amplikonunu üretecektir. Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünlerinin analizinin,
bu yüzden hücrenin disi oldugu durumda bir tekli bant veya erkek oldugu durumda iki bant
üretmesi gerekmektedir. Her numuneden on hücre analiz edildi ve tüm tekli bantlar (Disi
Fetüsü) veya tüm çift bantlar (Sekil 2) için üretildi. Bu sekilde analiz edilen 18 hastada bu
bulunmamasi ragmen, bir erkek numunede rastgele tekli bant, muhtemelen bir kontamine
edici anneye ait hücredir (Tablo 3). Disi numunelerde anneye ait hücreleri ayI edilemez.
Trofoblast hücrelerinin yüksek safl[gll,`_lbir tekli bandI üretildigi hiçbir hücrenin olmadlglßrkek
numunelerde ortaya konulmaktadlB Yanllglbir teshisin üretmek için, tüm hücreler anneye ait
olacaktlE Bir disi fetüs durumunda, teshis disi ve dogru olabilmektedir. Bir erkek fetüsü
durumunda, sadece bir fetal hücrenin varllglÇIfetüsün disi olmadig'lIEgöstermesi için bir çift
bant üretecektir. Test daha sonra tekrarlanabilmektedir veya numune ayrlEti
arastlElâbilmektedir. Tüm kopyalarI anneye ait hücreler olabilme olaleJEÇIkopya saylgîile
birlikte üssel olarak azalmaktadlEl ve izole edilmis hücrelerin %95 trofoblast hücrelerini
barIlElnasüvarsayllârak sadece üç kopya ile 8,000'de 1'e ulasmaktadß Bu garanti
seviyesine, eger izole hücreler sadece %90 trofoblast barIlEllßa, dört kere ile
ulasllÜiaktadE %90 saflilZliçin, bir yanllglsonucun (P) olasl]]ljlEli›ir kopya (N) için 0.1'dir ve P =
'N oldugu her Ilave tekli hücre kopyasEiIe on kat azalmaktadlE
Yukarlki açiKlama, burada aç[lZlanan yöntemler ve kullanIilar için bir eksiksiz temel
saglamaktadlîi Mevcut bulus ile ve mevcut bulus faydasüle kullanilan yöntemler, asagi
sIlEliand iElElîcblmayan örnekler ile gösterilebilmektedir.
ÖRNEKLER
Malzemeler ve Yöntemler:
Bir normal intraüterin hamilelik (IUP; n=37), ektopik hamilelik (EP; n=10) veya yanilZIovum
(BO; n25) ile erken dogum öncesi bakIi sunan 18 ila 40 yas aras-aki hastalar, bir sitolojik
fEa ve bir ThinPrep® kit (Hologic) kullanilârak transservikal örneklerinin toplanmasi
yönelik kaydedildi. Preseeryt® fiksatif çözeltide toplanan hücreler asitlestirme ile mukus
temizlendi, santrifüjlenme ile ylElandlZl/e bir alikot bir Sitospin3 santrifüjü kullanllârak bir
mikroskop preparat üzerinde hazlîliandEIPreparatlar, HLA-G'yi tanlýbn monoklonal antikor
G233 ile etiketlendi, bir MHC antijeni spesifik olarak trofoblast hücreleri tarafIian eksprese
edilmektedir. Tüm HLA-G pozitif hücreleri, her preparatta tanIiland üre sayIlZlHematoksilin
ile boyandlthan sonra, her preparat üzerindeki toplam hücre saylîlîlbelirlendi ve HLA-G pozitif
hücrelerin toplam hücrelere oranEhesaplandElVeriler tek yönlü ANOVA, Student-Newman-
Keuls posthoc testi ve allîßalgna karakteristik (ROC) analizi kullanllârak karsliâst-ü
Sonuçlar:
Normal IUP, EP ve BO'nun ortalama gebelik süresi yaslarElslüslîla 9, 8 ve 10 haftadB
Trofoblast hücreleri 35/37 normal IUP, 6/10 EP ve 4/5 BO örnekleri için gözlemlendi. IUP
servikal numunelerde HLA-G pozitif hücrelerinin frekansüirtalama olarak 2000'de 1 idi, bu da
EP veya BO'ya sahip hastalar. numunelerindeki ortalama frekanstan 5 ila 10 kat daha
yüksek idi (p<0.001). Son iki grup önemli oranda farklEdegiIdi. Önemli bir sekilde, ROC
analizi, EP ve BO hamileliklerinin, %93 hassasiyet ve %95 spesifiklige sahip normal
hamileliklerden aylîll edildigini göstermistir.
Trofoblast hücreleri, HLA-G için immünohistokimyasal boyama ile birinci üç ayda servikal
hücreler arasiEUa güvenilir bir sekilde tanIiIanabilmektedir. Anormal hamilelikler, trofoblast
yokluguna bagllîblarak tahmin edilebilirdir.
Preeklampsi (PE) ve intraüterin büyüme sIEHandlElnasHIUGR), erken tanIiIama için hiçbir
güvenilir araç olmadan yayglEl olumsuz sonuçlardlü Mevcut semptomlardan daha önce PE
veya IUGR'ya sahip hastalar. tan lanmasülçin serum protein panellerini kullanma girisimleri
uygun olmamlgtlEl Her iki bozukluk, ekstravillöz trofoblast (EVT) hücreleri ile üterin
vaskülatürün yetersiz yeniden modellenmesine baglanmaktadlEl Endoservikal kanalda
bulunan EVT, bir PAP testine benzer bir invazif olmayan prosedürde yakalanabilmektedir ve
anneye ait hücreler olmadan izole edilebilmektedir. IUGR ve PE'nin serum biyoisaretleyicileri,
degisen seviyeleri serumda tespit edilebildiginden daha fazla gebelik süresinin basIa
EVT'de bozulmaktadlEl
Yöntemler:
PAP örnekleri (N=23), bir sito fEa kullanilârak gebelik süresinin 5 ila 20 haftalarlEUa
toplandElTlöbi kayitlar PE veya IUGR teshisi için art arda arast-EIEVT hücreleri (500-
1500), mlEhatlâIElnanopartiküllere birlestirilen HLA-G antikoru kullanilârak izole edildi.
Hücreler (-50) bir Sitospin 3 sitosantrifüj kullanilarak preparata eklendi, anti-ß-hCG ile
saflastlElna için degerlendirildi ve galektin 13 (LGALSl3, namEldeger PP13), galektin 14
(LGALSl4), plasental büyüme faktörü (PGF), hamilelikle iliskilendirilen plazma protein A
(PAPPA), alfa fetal protein (AFP), endoglin (ENG), veya fms ile ilgili tirozin kinaz 1 (FLT-1)'e
karslZhntikorlar (R&D Systems) ile immünofloresan ile etiketlendi. Floresan yogunlugunun
(FI), görüntü analizi ile ayrEhücreler için miktarlîblçüldü. 20 hücrenin FI degerlerinin her
hasta için ortalamasElalIEl/e bir post-hoc Tukey testi kullanüârak normal ve z[El sonuç
gruplarürasia ANOVA ile karsllâst-ü
Sonuçlar:
Dokuz hasta sonuç olarak PE veya IUGR gelistirirken, 14'ü normal hamileliklere sahipti.
LGAL513, LGALSl4, PAPPA ve PGF'nin ekspresyonlarII her biri normal hamilelikler ile
karsüâst-[giia PE/IUGR'yEgelistiren hamileliklerden EVT'de azaltllÜilStEI(p<0.05). FLT-l,
ENG, ve AFP'nin her biri PE/IUGR ile artt-Eilp<0.05).
EVT hücrelerinin invazif olmayan edinimine yönelik yeni bir yaklasIi, hamilelik sonuçlarEile
protein ekspresyon seviyelerinin karsilâstlîllüias. izin vermektedir. Bu bulgular, PE veya
biyoisaretleyicilerinin bir saglam panelini tannlamlStE
haftalllZl gebelik süresinde, trofoblastik hücreler, bir sito fEa kullanüârak endoservikal
kanaldan invazif olmayarak geri kazanllâbilmektedir. Bu hücreler, fetal spesifik isaretleyici
HLA-G kullan [larak malzeme hücrelerinden izole edilebilmektedir.
Yöntemler:
Birinci ve ikinci üç ayda hamile hastalardan trofoblast hücrelerinin izolasyonunu takiben,
örnekler, HLA-G ekspresyonu için immünohistokimya ile analiz edildi. Trofoblast hücreleri, bir
kolonsuz mIKhatlêlühanopartikül ayrIilJJrosedürü kullanilarak anneye ait hücrelerden ayrIEI
Trofoblast örneklerinin safl[g]lJB-hCG için boyanmasEüe hesaplandElAnneye ait ve fetal hücre
DNA'sII tam genom çogalmasIEQWGA) takiben, tek nükleotit polimorfizmi (SNP) tahlili ve
cinsiyet tanIiIamasÇlpoIimeraz zincir reaksiyonu ile gerçeklestirildi.
Sonuçlar:
Anneye ait ve fetal hücreler 5 hasta örneginden izolasyondan sonra karsuast-EJOrtalama
toplam trofoblast geri kazani 700 hücre idi, ortalama safllK]%90 üzerinde idi. Bir minimum
ug DNA tekli hücreler ve 5 ila 100 hücre grubu kullanliârak WGA'dan elde edildi. SNP
tahlilleri tüm örneklerde anneye ait ve trofoblast hücreleri arasIa aIIeIik farki-ar
göstermistir. Cinsiyet belirlendi ve hasta kayElhrIan dogrulandü
Trofoblast hücrelerin ß-hCG ekspresyonunun yüksek derecesine baglEbIarak kabul edilebilir
safllEta endoservikal kanaldan geri kazanllâbilmektedir ve izole edilebilmektedir. Buna ek
olarak, fetal DNA, sert fetal genomunun invazif olmayan dogum öncesi test edilmesi için bir
platform olarak kendi faydaslmösteren anneye ait DNA'dan ayrEitli.
Bu basvuru boyunca, Amerika Birlesik Devletleri patentini kapsayan çesitli yayIara yazar ve
y[lîl ve patent saylîEltarafIan atlflia bulunulmaktadlü Yaylar için tam atlfilar dahil
edilmektedir.
Bulus, bir görsel sekilde açiEIandEie kullan ilân terminolojinin sIBland lEilna yerine açlEamanI
kelimeleri dogasIa olmasII hedeflendigi anlasilâcaktE
AçilZl bir sekilde, mevcut bulusun çogu modifikasyonu ve varyasyonu, yukar- ögretiler
Egil-a mümkündür. Bu yüzden, ekli istemlerin kapsamEliçinde bulusun, spesifik olarak
açmandigüksi durumda uygulanabildigi anlasilüiaktadlEI
Claims (11)
- Bir endoservikal numuneden fetal hücrelerin geri kazanllBialeh yönelik bir yöntem olup, asag-ki adllarEiçermektedir: endoservikal numuneden mukusun çiEhrtllEnasD böylelikle endoservikal numunede fetal hücrelerin ve anneye ait hücrelerin ayrigtlüllßwasüve süspansiyonda fetal hücrelerin immünomiiîhatlglßtiketlemesi kullanilârak endoservikal numunede anneye ait hücrelerden ayrlStEIlân fetal hücrelerin izole edilmesi.
- Söz konusu izole etme adIiII fetal hücrelerin hep birlikte izole edilmesini kapsadlgiÇl istem 1'e göre yöntem.
- . Numunenin intraüterin Iavaj, servikal mukusun aspirasyonu veya endoservikal kanaldan yüzey dokusunun çEEhrtIIIhasEile elde edildigi, istem 1'e göre yöntem.
- AyrlEla bir trofoblast kültür ortamIa numunenin kültürlenmesini içeren, istem 1'e göre yöntem.
- Bir fiksatif çözeltide numunenin yerlestirilmesini içeren, istem 1'e göre yöntem.
- . Söz konusu çilZlartma adIiIIEJ, asitlestirme ile endoservikal numuneden mukusun çiEhitilB1alelERapsadigiüistem 1'e göre yöntem.
- . AyrEia teshis amaçlar. yönelik numunede izole edilen hücrelerin tanIiIIanmasEilçeren, istem 1'e göre yöntem.
- Söz konusu tanIiIama adIIlEl, esasen floresan in situ hibritlesmesi, revers transkripsiyon ile polimeraz zincir reaksiyonunun, revers transkripsiyon olmadan polimeraz zincir reaksiyonunun sekanslanmasEl/e immünohistokimyadan olusan gruptan seçilen bir yöntem kullanilarak hücrelerin analiz edilmesini kapsadlglÇl istem 7'ye göre yöntem.
- . AyrlBa esasen tam genom çogalmasü ardIan genomik hibritlesme veya metabolit tahlillerin ve küçük bilesik tahlillerinin sekanslanmasIan olusan gruptan seçilen bir yöntem kullanilarak tanIilanan hücrelerin analiz edilmesini kapsadlglÇlistem 7'ye göre yöntem.
- 10.Bir hamile insan disisinde preeklampsi veya intraüterin büyüme sIlEllandlîiinasII tespit edilmesine yönelik bir yöntem olup, asagidaki adnlarlîçermektedir: istem 1'e göre yöntem kullanllârak halehnan izole fetal ekstravillöz trofoblast hücrelerinin elde edilmesi, burada fetal ekstravillöz trofoblast hücreleri 5 ila 20 haftalllîi gebelik süresinde toplanan PAP örneklerinden elde edilmektedir; ve sunlardan seçilen bir fetal proteine karsEbir antikor ile izole edilmis fetal ekstravillöz trofoblast hücrelerinin tahlilinin yapilfhaslîlgalektin 13, galektin 14, plasental büyüme faktörü, hamilelikle iliskilendirilen plazma protein A, alfa fetal protein, endoglin ve fms ile ilgili tirozin kinaz 1, burada azalmlgl galektin 13, galektin 14, plasental büyüme faktörü, hamilelikle iliskilendirilen plazma protein A, artmlglalfa fetal protein, endoglin ve fms ile ilgili tirozin kinaz 1, preeklampsi veya intraüterin büyüme sIlEiand lElnasII göstergeleridir.
- 11.Yöntemin servikal hücreler arasIaki fetal hücrelerin tanHIanmas, yüksek riskli hamileligin, fetal hücrelerin genetik analizinin tahmin edilmesi için fetal hücre yogunlugunun belirlenmesine veya büyüme faktörleri, proteinler ve RNA'dan olusan gruptan seçilen obstetrikal bozukluklar. biyoisaretleyicilerinin belirlenmesine yönelik kullanIigÇlistem 1'e göre yöntem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261715854P | 2012-10-19 | 2012-10-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201908019T4 true TR201908019T4 (tr) | 2019-06-21 |
Family
ID=50488767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2019/08019T TR201908019T4 (tr) | 2012-10-19 | 2013-10-18 | Doğum öncesi teşhis için servikal mukusta fetal trofoblast hücrelerinin tanımlanması ve analizi. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10344315B2 (tr) |
| EP (1) | EP2909315B1 (tr) |
| JP (1) | JP6421123B2 (tr) |
| AU (1) | AU2013331171B2 (tr) |
| CA (1) | CA2888746C (tr) |
| DK (1) | DK2909315T3 (tr) |
| ES (1) | ES2729182T3 (tr) |
| IN (1) | IN2015DN03186A (tr) |
| TR (1) | TR201908019T4 (tr) |
| WO (1) | WO2014062995A1 (tr) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2888746C (en) | 2012-10-19 | 2022-07-26 | Wayne State University | Identification and analysis of fetal trophoblast cells in cervical mucus for prenatal diagnosis |
| WO2016057993A1 (en) | 2014-10-10 | 2016-04-14 | Wayne State University | Methods and compositions relating to assays of fetal extravillous trophoblast cells |
| US10808239B2 (en) | 2016-04-06 | 2020-10-20 | Wayne State University | Isolation and analysis of fetal DNA from extravillous trophoblast cells retrieved from the endocervical canal |
| WO2017180909A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Nextgen Jane, Inc. | Sample collection and preservation devices, systems and methods |
| WO2019021065A2 (en) * | 2017-02-13 | 2019-01-31 | Trophodiagnostics, Llc | NEW SYSTEM AND METHOD FOR COLLECTING, ENRICHING AND ISOLATING TROPHOBLASTIC CELLS FROM A ENDOCERVICAL CHANNEL |
| US11230729B2 (en) | 2018-04-20 | 2022-01-25 | Inanna Diagnostics, Inc | Methods and devices for obtaining cellular and DNA material from human female reproductive system |
| TWI668423B (zh) * | 2018-10-02 | 2019-08-11 | 吳宏偉 | 細胞分選方法及系統 |
| CN111122857A (zh) * | 2018-10-31 | 2020-05-08 | 苏州浚惠生物科技有限公司 | 胎儿滋养层细胞的标志物、鉴定方法、检测试剂盒和应用 |
| CN111304153A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-06-19 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | 一种分离滋养层细胞的方法 |
| JP7824649B2 (ja) * | 2020-02-21 | 2026-03-05 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 胎児発育不全に対する定量的評価指標 |
| CN112980779B (zh) * | 2021-05-20 | 2021-08-24 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法 |
| AU2023406050A1 (en) * | 2022-11-29 | 2025-06-12 | Akna Health Inc. | Identification of cervical biomarkers |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5629147A (en) | 1992-07-17 | 1997-05-13 | Aprogenex, Inc. | Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization |
| DE69223617T2 (de) | 1992-09-18 | 1998-04-09 | Amersham Int Plc | Verfahren zum Auffangen von Zellkernen und dafür verwendete Vorrichtung |
| BR9907852A (pt) * | 1998-02-12 | 2000-10-24 | Immunivest Corp | Processos para detectar e enumerar células raras e cancerosas em uma população celular mista, para diagnosticar câncer de estágio precoce em um paciente de teste, para determinar a probabilidade de recorrência de câncer em um paciente humano anteriormente tratado de câncer, para distinguir um carcinoma confinado ao órgão de um carcinoma com propriedades metastáticas, para acompanhar a situação de remissão em um paciente humano com câncer que passa pelo tratamento de terapia contra o câncer e para aumentar quantidades de células epiteliais circulantes em uma amostra de sangue, partìcula magnética revestida, composição, conjuntos de teste para avaliar uma amostra de paciente quanto a presença de células raras circulantes, quanto a presença de células de tumor circulantes, quanto a presença de células de câncer de mama circulantes, quanto a presença de células de câncer de próstata circulantes, quanto a presença de células de câncer de cólon circulantes, quanto a presença de células de câncer de bexiga circulantes e para monitorar um paciente quanto a recorrência de câncer, e, fração de sangue periférico enriquecido quanto a células neoplásticas circulantes |
| AUPR749901A0 (en) * | 2001-09-06 | 2001-09-27 | Monash University | Method of identifying chromosomal abnormalities and prenatal diagnosis |
| US20040197832A1 (en) * | 2003-04-03 | 2004-10-07 | Mor Research Applications Ltd. | Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells |
| US20050181429A1 (en) | 2003-04-03 | 2005-08-18 | Monaliza Medical Ltd. | Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells |
| JP2008514900A (ja) | 2004-07-30 | 2008-05-08 | アデザ・バイオメデイカル・コーポレイシヨン | 疾病および他の状態のマーカーとしての癌胎児性フィブロネクチンならびに癌胎児性フィブロネクチンの検出のための方法 |
| US20070224597A1 (en) | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Biocept, Inc. | Isolating fetal trophoblasts |
| US20090286271A1 (en) | 2006-05-31 | 2009-11-19 | Karumanchi Ananth S | Methods of Diagnosing and Treating Complications of Pregnancy |
| US20110183338A1 (en) | 2008-01-30 | 2011-07-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Two stage enrichment of cell-free fetal dna in maternal plasma |
| CA2752838A1 (en) * | 2008-02-18 | 2009-08-27 | Genetic Technologies Limited | Cell processing and/or enrichment methods |
| WO2010121294A1 (en) * | 2009-04-21 | 2010-10-28 | Genetic Technologies Limited | Methods for obtaining fetal genetic material |
| CA2888746C (en) | 2012-10-19 | 2022-07-26 | Wayne State University | Identification and analysis of fetal trophoblast cells in cervical mucus for prenatal diagnosis |
-
2013
- 2013-10-18 CA CA2888746A patent/CA2888746C/en active Active
- 2013-10-18 DK DK13847056.2T patent/DK2909315T3/da active
- 2013-10-18 WO PCT/US2013/065570 patent/WO2014062995A1/en not_active Ceased
- 2013-10-18 TR TR2019/08019T patent/TR201908019T4/tr unknown
- 2013-10-18 JP JP2015538043A patent/JP6421123B2/ja active Active
- 2013-10-18 EP EP13847056.2A patent/EP2909315B1/en active Active
- 2013-10-18 ES ES13847056T patent/ES2729182T3/es active Active
- 2013-10-18 US US14/436,270 patent/US10344315B2/en active Active
- 2013-10-18 IN IN3186DEN2015 patent/IN2015DN03186A/en unknown
- 2013-10-18 AU AU2013331171A patent/AU2013331171B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK2909315T3 (da) | 2019-06-03 |
| EP2909315B1 (en) | 2019-05-01 |
| ES2729182T3 (es) | 2019-10-30 |
| HK1214294A1 (en) | 2016-07-22 |
| US10344315B2 (en) | 2019-07-09 |
| CA2888746C (en) | 2022-07-26 |
| EP2909315A4 (en) | 2016-04-20 |
| IN2015DN03186A (tr) | 2015-10-02 |
| US20150267240A1 (en) | 2015-09-24 |
| WO2014062995A1 (en) | 2014-04-24 |
| AU2013331171A1 (en) | 2015-05-28 |
| JP6421123B2 (ja) | 2018-11-07 |
| JP2015533504A (ja) | 2015-11-26 |
| AU2013331171B2 (en) | 2019-05-30 |
| EP2909315A1 (en) | 2015-08-26 |
| CA2888746A1 (en) | 2014-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TR201908019T4 (tr) | Doğum öncesi teşhis için servikal mukusta fetal trofoblast hücrelerinin tanımlanması ve analizi. | |
| US20250347681A1 (en) | Process for multi-analyses of rare cells extracted or isolated from biological samples through filtration | |
| Moser et al. | Trophoblast retrieval and isolation from the cervix: origins of cervical trophoblasts and their potential value for risk assessment of ongoing pregnancies | |
| Imudia et al. | Retrieval of trophoblast cells from the cervical canal for prediction of abnormal pregnancy: a pilot study | |
| GRIFFITH‐JONES et al. | Detection of fetal DNA in trans‐cervical swabs from first trimester pregnancies by gene amplification: A new route to prenatal diagnosis? | |
| KR20050123139A (ko) | 경자궁경부 세포를 이용한 비침습성 산전 유전자 진단 | |
| Suttipasit et al. | Detection of prostate specific antigen and semenogelin in specimens from female rape victims | |
| AU2024200656A1 (en) | Identifying status of male fertility by determining sperm capacitation | |
| Fritz et al. | Trophoblast retrieval and isolation from the cervix (TRIC) is unaffected by early gestational age or maternal obesity | |
| Katz‐Jaffe et al. | DNA identification of fetal cells isolated from cervical mucus: potential for early non‐invasive prenatal diagnosis | |
| Imudia et al. | Transcervical retrieval of fetal cells in the practice of modern medicine: a review of the current literature and future direction | |
| CN111781360A (zh) | 游离细胞捕获探针及其相关产品和用途 | |
| Chang et al. | Minimally‐invasive early prenatal diagnosis using fluorescence in situ hybridization on samples from uterine lavage | |
| RU2474823C1 (ru) | Способ прогнозирования качества эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения | |
| Bourlard et al. | Rarity of fetal cells in exocervical samples for noninvasive prenatal diagnosis | |
| Miller et al. | Transcervical recovery of fetal cells from the lower uterine pole: reliability of recovery and histological/immunocytochemical analysis of recovered cell populations | |
| Mantzaris et al. | Potential of syncytiotrophoblasts isolated from the cervical mucus for early non-invasive prenatal diagnosis: evidence of a vanishing twin | |
| Bischoff et al. | Endocervical fetal trophoblast for prenatal genetic diagnosis | |
| Sibiak et al. | Methods of detection and isolation of trophoblast cells from trans-cervical specimens–a historical overview | |
| EP1395670B1 (en) | Determining endometrial status by testing menstruation tissue | |
| HK1214294B (en) | Identification and analysis of fetal trophoblast cells in cervical mucus for prenatal diagnosis | |
| WO1999066331A1 (en) | Method and kit for the detection of male infertility | |
| Coleman | Culturing trophoblast samples | |
| HK40056745A (en) | Identifying status of male fertility by determining sperm capacitation | |
| Jalal et al. | Chromosome analysis in prenatal diagnosis |