TR201910626T4

TR201910626T4 - Nicotina tabacumdan izopropilmalat sentaz ve bunun yöntemleri ve kullanımları.

Info

Publication number: TR201910626T4
Application number: TR2019/10626T
Authority: TR
Inventors: Bakaher Nicolas; Nicolas Bindler Gregor; Philippe Blanc Michel; Goepfert Simon; Martin Florian
Original assignee: Philip Morris Products Sa
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2019-08-21
Also published as: IN2014CN01706A; JP7000265B2; SG11201400209UA; EP2565265A1; BR112014004827A2; US10287599B2; AU2012301349B2; AU2012301349A1; RU2644238C2; RU2014112234A; KR20140067082A; CN103958673A; EP2751262A1; BR112014004827A8; ES2742271T3; JP2014531200A; JP2018186820A; UA116437C2; IL231101B; IL231101A0

Abstract

Mevcut buluş Nicotiana tabacumdan izopropil sentaz genini ve bunun varyantlarını, homologlarını ve fragmanlarını ifşa etmektedir. Özellikle, bir tütün bitkisi gibi bir bitkinin sükroz ester bileşimini değiştirmek amacı ile bu genin ekspresyonunun ya da bu şekilde kodlanan proteinin aktivitesinin modifikasyonu tarif edilmektedir.

Description

TARIFNAME NICOTINA TABACUMDAN IZOPROPILMALAT SENTAZ VE BUNUN YÖNTEMLERI VE KULLANIMLARI BULUSUN ALANI Mevcut bulus Nicoti'ana tabacumdan izopropil sentaz genini ve bunun varyantlarini, homologlarini ve fragmanlarini ifsa etmektedir. Özellikle, bir tütün bitkisi gibi bir bitkinin sükroz ester bilesimini degistirmek amaci ile bu genin ekspresyonunun ya da bu sekilde kodlanan proteinin aktivitesinin modifikasyonu tarif edilmektedir. BULUSUN ARKA PLANI Sükroz esterlerinin yaygin olarak bitkilerde böcek öldürücü özelliklere sahip oldugu bilinmektedir ve yaprak bitleri, akarlar, armut pisillidi ve beyaz sinekler dahil olmak üzere yumusak vücutlu böceklere karsi toksisite göstermektedir. Sükroz esterleri ayrica aroma öncülleri olarak degerlendirilmektedir ve bitkinin ömrü boyunca yaprak yüzeyi üzerinde birikmektedir. Bunlar kürlenmis ve sigara malzemesinde tanimlanabilen bilesiklerdir. lsinmasi üzerine sükroz esterlerden esterlesmis küçük karboksilik asitler salinmaktadir. Bu küçük karboksilik asitler, çok güçlü aroma molekülleridir ve bunlarin tütünün oryantal aromasindan kismen sorumlu oldugu düsünülmektedir. Sükroz esterleri bitkilerin glandular trikom hücrelerinde üretilmektedir. Glandular trikom hücreleri ayrica proteinler (phylloplanin) ve diterpenoidler (cembrenoid ve labdenoid) gibi diger yaprak eksüdalarinin sentezinde yer almaktadir. Sükroz ve sükroz esterler meydana getirmek için sükroza esterlesen küçük karboksilik asitler iki farkli metabolik blok araciligiyla üretilmektedir. Tütün çesitleri yapragin yüzeyinde bulunan sükroz esterlerinin miktari ve kalitesi açisindan farklilik göstermektedir. Genel bir kural olarak flue cured, burley ve Maryland çesitleri, en fazla bes karbon zinciri uzunlugunda asil gruplari olan düsük miktarlarda sükroz esterleri biriktirirken birçok oryantal çesit ve birçok puro tütünü türü en fazla alti karbon zinciri uzunlugunda asil gruplarina sahip olan yüksek miktarlarda sükroz esterleri biriktirmektedir ve daha az oranda da yedi karbon zinciri uzunlugu olan asil gruplarina sahip olan esterler gözlemlenebilmektedir. Tütün çesitleri arasinda üretilen sükroz esterlerinde gözlemlenen diktomoni kendi fonksiyonel alelinden dolayi BMVSE (beta-metilvaleril içeren sükroz esterleri) ve kendi fonksiyonel olmayan alelinden dolayi olarak bmvse olarak adlandirilan tek bir baskin Iokusa baglidir. BMVSE genomik Iokusunun tütünün A kromozomuna yerlestirilmistir. Kroumova and Wagner (2009) General and Applied Plant Physio/ogy 35, 3-4, p95-110, çift sarmalli engelleyici RNA kullanarak izopropilmalat sentaz ekspresyonunu durdurmak için bir ters genetik yaklasimi kullanarak çesitli bitkilerde sükroz esteri asil grubu içerigini degistirme denemelerini açiklamaktadir. Bu çalismada Solanum pennellii"den izopropilmalat sentaz geni, cDNA'dan gen parçalarini amplifiye etmek için kullanilmistir. Bunlar daha sonra bir çift sarmalli engelleyici RNA yapisina sens ve antisens oryantasyonda dahi edilmis ve Agrobacterium araciligiyla Nicotiana tabacum T.I. 1068, Nicotiana glutinosa cv. 24a ve S. pennellii'ye transforme edilmistir.. N. tabacum bitkileri kullanilarak elde edilen sonuçlar, transforme edilmemis kontroller ile karsilastirildiginda azalan beta-metilvaleril ve artan 2-metilbütiril- asilasyonu araciligiyla seker esterlerinin asil grubu bollugunda bazi degisimler göstermistir. Bununla birlikte elde edilmis N. tabacum bitkileri fenotipik olarak bozulmustu çünkü bunlar klorotikti ve bazilari kivircik yapraklara sahipti. Benzer sekilde, transforme edilen N. g/utinosa and 8. pennellii bitkileri fenotipik olarak bozulmustu. Yazarlar izopropilmalat sentazin kritik bir enzim oldugu ve bunun bozulmasinin muhtemelen sagliksiz bir bitkiye neden oldugu sonucuna varmistir. Teknikte sükroz esteri bilesiminin modüle edildigi ve bununla birlikte bitki üzerindeki istenmeyen etkilerin minimize edildigi bitkilere yönelik bir ihtiyaç vardir. Bu ihtiyacin karsilanmasi mevcut bulusun bir amacidir. BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus, en azindan kismen, Nicotiana tabacum'da izopropilmalat sentaz geninin aktivitesinin ya da ekspresyonunun modüle etmenin, bitkinin tüm metabolizmasi üzerinde daha az istenmeyen etki ile sükroz esteri bilesiminde bir degisim ile sonuçlandigina iliskin sasirtici bulguya dayanmaktadir. Etkilerin birçogu bitkinin trikromlarinda ve ikincil metabolizmaya konsantre olmaktadir. Dolayisiyla Nicotiana tabacum"dan izopropilmalat sentazin aktivitesini ya da ekspresyonunu modüle etmek, esasen bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda bitkini görsel görünüsüne degisimlerle sonuçlanmamaktadir. Bu faydalidir çünkü bitkiler, tütün de dahil olmak üzere, görsel görünüsteki degisikliklerin ya sanayide kabul edilemeyecegi ya da kabul edilemez bir sekilde azaltilmis üretim verimlerine yol açabilecegi çesitli ürünlerin ticari üretimi için kullanilmaktadir. Avantajli olarak tütünden kaynaklanan aerosolün aroma profili yeni aroma profillerinin olusturulabilecegi sekilde modifiye edilebilmektedir. Bunun ötesinde sükroz esteri profilinin modifiye edilmis oldugu bitkilerin böcek direnci degistirilebilmektedir. Sükroz esterlerinin bilesimi, ilaçlarda, gida katki maddelerinde, sigara aroma vericilerindeki gibi ve organik pestisitler ve benzerlerinin bilesimleri olarak çesitli kullanimlar için bitkiden esktrakte edilebilmektedir. BULUSUN YAKLASIMLARI VE YAPILANMALARI Mevcut bulus bagimsiz istem 1 'de tanimlanmistir ve bunlarin bazi istege bagli özellikleri bagimli istemlerde tanimlanmistir. Burada "bulus", "örnek", ve "yapilanma" terimleri kullanildiginda bu, bulus için aranan yegane korumanin talep edildigi sekilde oldugu seklinde yorumlanacaktir. Bir birinci yaklasimda bir izopropilmalat sentazi kodlayan bir sekansi içeren, bundan meydana gelen ya da esasen bundan meydana gelen ve SEK ID No:1, SEK ID NO: 10 ya da SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO:14 ile en az %60 sekans özdesligine sahip olan bir izole edilmis polinükleotit saglanmaktadir. Bir baska yaklasimda, polinükleotit tarafindan kodlanan izole edilmis bir polipeptit saglanmaktadir. Bir baska yaklasimda, SEK ID NO: 2 ya da SEK ID NO: 11 ya da SEK ID NO: 13 ya da SEK lD NO:15 ile en az %60 sekans özdesligine sahip olan bir izole edilmis polipeptit saglanmaktadir. Izole edilmis polinükleotit sekansini içeren bir yapi, vektör ya da ekspresyon vektörü saglanmakta olup, opsiyonel olarak burada söz konusu yapi, vektör ya da ekspresyon vektörü ilaveten SEK ID NO:8'de belirtilen sekansi ya da bunun burayla en az yaklasik %60 özdeslige sahip olan bir varyantini ya da bir trikom promotörünü ya da izopropilmalat sentaz promotörünü içeren, bunlardan olusan ya da esasen bunlardan olusan bir promotör içermektedir. Baska bir yaklasimda SEK ID NO:8'i ya da bunun burayla en az yaklasik %60 özdesligi olan bir varyantini içeren, bunlardan olusan ya da esasen bunlardan olusan bir izole edilmis polinükleotit saglanmaktadir. Baska bir yaklasimda mevcut bulusun polinükleotitlerinin en azindan birini, polipeptitlerinin en azindan birini ya da yapisini, vektörünü ya da ekspresyon vektörünü içeren bir mutant, dogal olmayarak meydana gelen ya da transjenik hücresi saglanmaktadir. Uygun sekilde izopropilmalat sentazin ekspresyonu ya da vasitasiyla kodlanan proteinin aktivitesi modüle edilmektedir ve bitkinin en azindan bir kismi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmemis oldugu bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz esterlerinin bilesiminde bir degisime sahiptir. Uygun sekilde bitkinin görsel görünüsü kontrol bitkisi ile büyük oranda aynidir. Bir baska yaklasimda, mevcut bulusa göre bitki hücresini içeren bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transgenik bir bitki saglanmaktadir. Bir baska yaklasimda bir bitkinin bir parçasindaki sükroz esterlerinin miktarini modüle etmeye yönelik bir yöntem saglanmakta olup, asagidaki adimlari içermektedir: (i) bitkideki izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmesi, burada izopropilmalat sentaz burada açiklanan polipeptit sekansini ya da polinükleotit sekansini içermektedir; (ii) adimda (i) elde edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkisinin en azindan bir kismindaki sükroz esterlerinin miktarinin ölçülmesi ve (iii) buradaki sükroz esterlerinin miktarinin izopropilmalat sentazin ekpresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmemis oldugu bir kontrol ile karsilastirildiginda degismemis olan bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin tanimlanmasi ve tercihen burada söz konusu mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin görsel görünüsü kontrol bitkisi ile büyük oranda aynidir. Baska bir yaklasimda bu yöntem vasitasiyla elde edilen ya da elde edilebilen bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitki saglanmaktadir. Baska bir yaklasimda mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bir bitki saglanmakta olup, burada izopropilmalat sentazin ek3presy0nu ya da vasitasiyla kodlanan proteinin aktivitesi modüle edilmektedir ve bitkinin en azindan bir kismi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmemis oldugu bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz esterlerinin bilesiminde bir degisime sahiptir ve burada söz konusu bitkinin görsel görünüsü kontrol bitkisi ile büyük oranda aynidir. Bir baska yaklasimda, bitkiden hücreleri ya da dokuyu içeren biyokütle, tohum ya da yapraklari içeren bitki malzemesi saglanmaktadir. Bir baska yaklasimda mevcut bulusa göre bitkinin bir parçasini ya da bitki malzemesini içeren bir tütün ürünü saglanmistir. Bir baska yaklasimda sükroz esterlerinin bir bilesimini üretmeye yönelik bir yöntem saglanmis olup, asagidaki adimlari içermektedir: (i) mevcut bulusa göre mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bir bitkinin en azindan bir parçasinin, bitki malzemesinin ya da tütün ürününün saglanmasi; (ii) (örnegin bir ya da daha fazla) sükroz esterinin buradan ekstrakte edilmesi ve (iii) opsiyonel olarak ekstrakte edilmis sükroz esterlerin saflastirilmasi. Söz konusu yöntem vasitasiyla elde edilen ya da elde edilebilen sükroz esterlerinin bir bilesimi ayrica saglamaktadir. Uygun sekilde bir ya da daha fazla sükroz ester, Sekil 5'te gösterilen yapiya sahiptir ve burada R3 asetil ya da hidrojen, tercihen asetildir; R1, R2 ve R4'ün biri ya da daha fazlasi 6 karbonu olan bir asil, tercihen betametilvaleril içermektedir ve R5 bir asetil ya da hidrojen. tercihen hidrojendir. Uygun sekilde bir ya da daha fazla sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esterinden olusan gruptan seçilmekte olup, burada R3=asetil, R1 =propionil ya da bunun bir izomeri, R2= propionil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5 hidrojen ya da asetildir ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri ve R5 hidrojen ya da asetildir ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4: hekzanoil ya da bunun bir izomerive R5 hidrojen ya da asetil (C2Ci4:0)dir ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5 hidrojen ya da asetildir ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5 hidrojen ya da asetildir ya da Sekil "te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2= hekzanoil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5 hidrojen ya da asetil (CZC15:0)'dir; Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3 asetil, R1 valeril ya da bunun bir izomeri, R2 valeril ya da bunun bir izomeri, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5 hidrojen ya da asetil (CZC16:O)'dir ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3 asetildir, R1 propinoil ya da bunun bir izomeridir R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R5 ya bir hidrojen atomudur ya da bir asetil kismidir (C2Ciö:0); Sekil Site gösterilen genel yapiya sahip olan ve R3'ün asetil oldugu, R1'in valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (C2C1720) oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahip olan ve burada R3iün asetil oldugu, R1"in hekzanoil oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in gerek bir hidrojen atomu gerekse bir asetil kismi (C2C1810) oldugu bir sükroz esteri ya da bunlarin bir kombinasyonu. Uygun sekilde bir ya da daha fazla sükroz esteri Sekil 5,te gösterilen ve burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri ve R55ün hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri ve R5 hidrojen ya da asetildir ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2: hekzanoil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ve R5 hidrojen ya da asetil (CZC15:O)dir ya da Sekil Site gösterilen veburada R3'ün asetil oldugu, R1'in valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R4'ün hekzanoil ya da bunun bir izomeri oldugu ve R5 hidrojen ya da asetil kismi (C2C1620) oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir. burada R3iün asetil oldugu , R1 ,in proponoil ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin hekzanoil ya da bunun bir izomeri oldugu, R4iün hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5iin ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (C2C16:0) oldugu bir sükroz ester; Sekil 5'te gösterilen ve burada R3'ün asetil oldugu, R1'in valeril ya da bunun bir izomeri, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in ya hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (CZC18:O) oldugu bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahip olan ve burada R3'ün asetil oldugu, R1'in hekzanoil oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5"in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (0201720) oldugu bir sükroz esterinden olusan gruptan seçilmektedir. Bir baska yaklasimda tütünün ya da bir tütün ürününün aromasini modüle etmeye yönelik bir yöntem saglanmakta olup, asagidakileri içermektedir: (i) tütün ya da bir tütün ürününe burada açiklandigi sekilde bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bir bitkiden bir parçanin, tercihen yapraklarinin eklenmesi, tercihen burada söz konusu mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitki ya da bitki malzemesi Nicotinia cinsine aittir ya da (ii) burada açiklanan yöntem vasitasiyla elde edilen ya da elde edilebilen sükroz esterlerini içeren beta-metilvalerili içeren bir bilesimin tütün ya da bir tütün ürününe eklenmesi. Bir baska yaklasimda, beta-metilvalerik asit üretmeye yönelik bir yöntem saglanmakta olup, asagidaki adimlari içermektedir: (i) mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin en azindan bir kISminin, bitki malzemesinin ya da tütün ürününün saglanmasi; (ii) adimda (i) saglanan malzemenin ya da bunun bir ekstraktinin hidrolize edilmesi ve (iii) meta- metilvalerik asidin opsiyonel olarak izole edilmesi ya da saflastirilmasi. Uygun sekilde bitki bir tütün bitkisidir - Nicotiana cinsinden ya da Nicotiana tabacum türlerinden bir bitki gibi. Uygun sekilde bitkinin görsel görünüsü kontrol bitkisi ile büyük oranda aynidir. Uygun sekilde, söz konusu bitkinin görsel görünümü tarla naklinden üç ay sonra ya da tepe almadan 36 gün sonra kontrol bitkisi ile ayni olup, tercihen, içerisinde mutantin, dogal olarak olusmayan ya da transjenik bitkilerin sap yüksekligi tarla naklinden üç ay sonra ya da tepe almadan 36 gün sonra kontrol bitkisinin sap yüksekligi ile aynidir ve/veya mutantin, dogal olarak olusmayan ya da transjenik bitkilerin klorofil içerigi tarla naklinden üç ay sonra ya da tepe almadan 36 gün sonra kontrol bitkisinin klorofil içerigi ile aynidir. Diger yapilanmalarda, mutant olan, dogal olarak bulunmayan ya da transgenik bitkilerin olgunluk derecesi, bitki basina yaprak sayisi, sap yüksekligi, yaprak baglanma açisi, yaprak boyutu (genislik ve uzunluk), noktalar arasi mesafesi, yaprak ayasi-yaprak orta kismi oran ve yapraklarin renklenimi tarla transplantindan üç ay sonra ya da tepe almadan 36 gün sonra kontrol bitkileriyle büyük ölçüde aynidir. Baska bir yaklasim biyokütle, tohum ya da yapraklar ile ilgili olup, bitkinin bir parçasini ya da biyokütleyi, tohumu ya da yapraklari içeren bir tütün bitkisindeki gibi burada açiklanan bitkiden (bitkilerden) hücreleri ya da dokuyu içermektedir. Bu yöntem araciligi ile tanimlanan ya da tanimlanabilen tütün malzemesi ayrica bu tarifnamenin bir baska yaklasiminda da saglanmistir. Bitkinin böcek direnci modüle edilebilmektedir. Mevcut bulusun diger yaklasimlari asagida ortaya konmustur. Bir ya da daha fazla düzenleyici sekans ile uygulanabilir bir sekilde baglantili izole edilmis polinükleotit içeren bir kimerik gendir. En az 15-30 nükleotit, 30-50 nükleotit, 50-100 nükleotit, 100-150 nükleotid, 150-200 nükleotit, 200-300 nükleotit, 300-400 nükleotit, 400-500 nükleotit, 500-600 nükleotit ya da 600-700 nükleotit, 700-800 nükleotit, 1000-1300 nükleotit, 1300-1500 nükleotit ya da 1500-1900 nükleotit içeren, bunlardan meydana gelen ya da temel olarak bunlardan meydana gelen bir NtTS polinükleotit yapisi. Mevcut bulusa göre bitki malzeme, biyokütle, tohum ya da yapraklar içeren ya da kullanan bir tüketilebilir ürün. Mevcut bulusa göre izole edilmis polinükleotit, kimerik gen, polinükleotit yapisi, çift sarmalli RNA, konjugat ya da ekspresyon vektörünü ve benzerini içeren bir hücre hattidir. Bir hücrede izopropilmalat sentazin ekspresyonunu ya da bu vasitayla kodlanan proteinin aktivitesini modüle etmeye yönelik bir yöntem olup, söz konusu yöntem kimerik genin, polinükleotit yapinin, çift sarmalli RNA 'nin, konjugat ya da mevcut bulusa göre ekspresyon vektörünün uygulanmasini içermektedir. Bir izopropilmalat sentaz polinükleotitin saptanmasi, izole edilmesi, büyütülmesi ya da analiz edilmesi için bir yöntem olup, bu yöntem bir polinükleotit içeren bir numunenin temin edilmesi ve bahsi geçen polinükleotitin mevcut bulusa göre olan izole edilmis nükleotit sekansindan en az komsu nükleotitin bir nükleotit sekansini içeren bir polinükleotit moleküle melezlestirilmesi adimini içermektedir. Izopropilmalat sentazin ekspresyonunu ya da bu vasitasiyla kodlanan proteinin aktivitesini modüle eden bir ajanin bir bitkinin en azindan bir parçasindaki - yapraklar gibi - sükroz esteri içerigini modüle etmek için kullanimidir. Bir yapilanmada ajan izopropilmalat sentaz polinükleotidi ya da izopropilmalat sentaz polinükleotidinden türetilmis, bir kimerik izopropilmalat sentaz geni, izopropilmalat sentaz polinükleotidi içeren bir polinükleotit yapisi, bir antisens RNA, bir çift sarmalli RNA, bir cDNA, izopropilmalat sentaz polinükleotiti ve buna kovalent olarak baglanmis olan en az bir nükleotit olmayan ya da polinükleotit olmayan kisim içeren bir konjugat, bir ribozim, bir mutajen, bir civa parmak, bir küçük molekül ya da bir meganükleazdir. Bir baska yapilanmada, polinükleotid parça(lar) bir antisens nükleik asidi, bir ribozimi, bir etkilesen RNA (RNAI), bir kilavuz RNA, ya da baska ötelenmemis RNA ve benzerinin spliceosome aracili trans-uçbirlestirmesini gerçeklestiren bir RNA 'yi kodlar. Bir baska yapilanmada, polinükleotit parça(lar)i bir RNAi 'yi kodlar. Bir baska yaklasim bir tütün ürününü üretmeye yönelik bir yöntem ile ilgili olup, asagidaki adimlari içermektedir: (a) mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik tütün bitkisinden tohum elde edilmesi; (b) tohumun ekilmesi ve bir bitki olarak yetistirilmesi; (c) bitkinin hasat edilmesi; ve (d) hasat edilen bitkiden bir tütün ürününün hazirlanmasi. Yukarida bahsedilmis olan yapilanmalar yukarida tarif edilmis olan yaklasimlarin her birinin yapilanmalari olarak açiklanmislardir. SEKILLERIN KISA TARIFNAMESI Sekil 1 yaprak eksüdalarinda ölçülen tahmin edilen sükroz esteri miktarini göstermektedir. Ölçüm bir bmvse tütün çesidi Hicks Broadleaf (HBL) ve bir BMVSE tütün çesidi Red Russian'dan (RR) yesil yaprak disklerini akton/metanol yikamalarinda gerçeklestirilmektedir. Miktar bir harici standart olarak sükroz oktaasetatin eklenmesinden tahmin edilmektedir. n=4 her tür için. C2Cl2:0, Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2=propi0nil ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5 hidrojen ya da asetil oldugu bir (doymus) sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=asetil, R2=valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri içermektedir. CZC13:O, Sekil 5"te gösterilen, burada R3=asetil, R1 =bütiril, R2=bütiril, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir (doymus) sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2=propionil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2: propionil ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri içermektedir. CZC1420, Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=pr0pionil ya da bunun bir izomeri, R2=pr0piponil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir (doymus) sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2=valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri içermektedir. C2C15:0, Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2=valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5"in hidrojen ya da asetil oldugu bir (doymus) sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2=valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2= hekzanoil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri içermektedir; C2C16:0 Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahip olan ve burada R3`ün asetil oldugu, R1'in valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R4'ün hekzanoil ya da bunun bir izomeri oldugu ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi oldugu bir sükroz esteri içermektedir ya da burada sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir, R1 propionil ya da bunun bir izomeridir, R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir. C2C17:O Sekil 5'te gösterilen bir (doymus sükroz esteri içermektedir, burada R3 asetildir, R1 valeril ya da bunun bir izomeridir, R2 hekzanoildir, R4 hekzanoildir ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir. CZC18:0 Sekil 5'te gösterilen bir (doymus) sükroz esteri içermektedir, burada R3 asetildir, R1 hekzanoildir, R2 hekzanoildir, R4 hekzanoildir ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir. Sekil 2 esas sükroz esteri izomerlerini, moleküler kütle ve bunlarin beta-metilvaleril esterler içeren sükroz esterlerini üreten ya da üretmeyen tütün türlerindeki görünüsüne göre ayrilmis sekilde göstermektedir. Sirasiyla C5 ve C6 olarak listelenen 2 ve 3-metilbütiril ya da 3 ve 4 metilvaleril esterler arasinda fark yoktur. Asagidaki adlandirma asil bilesimini tanimlamak için kullanilmaktadir. Örnegin C2C4C405'e atifta bulunursak bu sirasiyla R3, R1, R2 ve R4'teki asil grubundaki karbonlarin sayisina isaret etmektedir. 02 asetil olabilmektedir; C3 bütiril olabilmektedir; C4 propionil ya da bunun bir izomeri ya da izobütiril olabilmektedir; CS valeril (pentanoil) ya da bunun bir izomeri ya da 2-metil bütiril ya da izovaleril ya da izopentenoil ya da pentenoil olabilmektedir; CB hekzanoil ya da bunun bir izomeri ya da 2-metilvaleril ya da beta- metilvaleril ya da 4-metilvaleril olabilmektedir. Bir asetil ya da hidrojen R5'te (gösterilmemektedir), uygun sekilde hidrojende bulunabilmektedir. Sekil 3 z üzerinde esterlesen asil zincirlerinin olusumunu ve dallanmis zincirli amino asit sentezi yolunu göstermektedir. Kutu Içindeki adimlar, çekirdek dallanmis zincirli amino asit sentezi yolunu göstermekte olup, burada karbon zincirleri kondansasyon izomerizasyonu ve dekarboksilasyon döngüsü basina bir karbon uzatilmaktadir. 1: Asetolaktat sentaz [2.2.1.6]; 2: Asetohidroksiasit izomeroredüktaz [1.1.1.86]; 3: 3,4-Dihidroksiasit dehidrataz [4.2.1.9]; 4: Dallanmis zincirli aminoasit aminotransferaz [2.6.1.42]; 5: Dallanmis zincirli keto asit dehidrojenaz kompleksi (BCKD) ([1.2.4.4] [2.3.1.1681 [1.8.1.4]); 6: Izopropilmalat sentaz [2.3.3.13]; 7: Izopropilmalat izomeraz [4.2.1.33]; 8: Izopropilmalat dehidrojenaz [1.1.1.85]; 9: Treonin deaminaz [4.3.1.19]. C4: izobütanoil ester; iCS: 3-metiI-bütiril ester (izovaleril ester); aiC5: 2-metiI-bütiril ester (anteizo-valeril ester); iCB: 4-metiI-bütiril ester (izo-kaproil ester); aiCö: 3-metiI-valeril ester (anteizo-kaproil ester), ß-metilvaleril ester, BMV). Karboksilik asitler, her ne kadar isimleri çözülebilir formlari yansitsa da nötr formda bulunmaktadir. Önerilen IPMS2 katalize edilmis adimlar döngüseldir. Sekil 4 transformant bitkilerin yüzey yaprak eksüdasindaki sükroz tetraester bolluguna iliskin tahmini göstermektedir. Yapraklar bagimsiz transformasyon olaylarindan ortaya çikan bir aylik rejenere edici bitkilerden toplanmaktadir. Dahili standart (sükroz oktaasetat) 2,5 ng/mg taze agirlikta eklenmektedir. Her bir sükroz esterine özgü iyon için kaydedilen sinyal alani ölçülmekte ve dahili standart alanin orani olarak grafige aktarilmaktadir. Dahili standart alanin orani, taze yaprak agirliginda sinyallerin normalizasyonuna olanak saglamaktadir. Burada sunulan sükroz esteri adlandirmasi, Sekil 2'de açiklanmaktadir. A: parenteral çesit K326 (Flue cured, n=3) yaprak eksüdalarinin ve bir trikoma özgü promotör altinda SEK ID NO:1'i eksprese eden transformantlarin bilesimi; B: parenteral çesit K326 yaprak eksüdalarinin ve bir trikoma özgü promotör altinda SEK ID NO:1'i eksprese eden transformantlarin bilesimi; C: parenteral çesit Basma'nin (Oryantal, n=4) yaprak eksüdalarinin ve bir trikoma özgü promotör altinda SEK ID NO: 9iun RNAI yapisini eksprese eden transformantlarin bir bilesimi ve D: parenteral çesit Basma'nin yaprak eksüdalarinin ve bir trikoma özgü promotör altinda SEK ID NO: 9'un RNAI yapisini eksprese eden transformantlarin bilesimi. C2C14:0, Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=propi0nil ya da bunun bir izomeri, R2=pr0pip0nil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R51in hidrojen ya da asetil oldugu bir (doymus) sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2=valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5lin hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri içermektedir. CZC15:O, Sekil 5"te gösterilen, burada R3=asetil, R1=propi0nil ya da bunun bir izomeri, R2=valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir (doymus) sükroz esteri ya da Sekil 'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2=valeril ya da bunun bir izomeri. R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R57in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 51te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2: hekzanoil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri içermektedir. CZC18:O Sekil Site gösterilen genel yapiya sahip olan ve burada R3'ün asetil oldugu, R1'in valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R4'ün hekzanoil ya da bunun bir izomeri oldugu ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi oldugu bir sükroz esteri içermektedir ya da burada sükroz esteri Sekil Site gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir, R1 propionil ya da bunun bir izomeridir, R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir. CZC17:0 Sekil 5'te gösterilen bir (doymus sükroz esteri içermektedir, burada R3 asetildir, R1 valeril ya da bunun bir izomeridir, R2 hekzanoildir, R4 hekzanoildir ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir. CZC18:0 Sekil 5'te gösterilen bir (doymus sükroz esteri içermektedir, burada R3 asetildir, R1 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R2 hekzanoildir, R4 hekzanoildir ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir. Sekil 5 Sükroz esteri iskelesinin yapisini göstermektedir. R1 ila R5 ya hidrojen atomlaridir ya da bir ester bagi ile baglanan asil kisimlaridir. Sekil 6 sükroz esterlerinde esterlesen asil Zincirlerini göstermektedir. R' sükroz molekülünü göstermektedir. 1. asetil, 2. bütiril, 3propionil, 4. izobütiril, 5.valeril (pentanoil), 6. 2-metiI-bütiril, 7. izovaleril, 8. izopentenoil, 9. pentenoil, 10. hekzanoil ya da bunun bir izomeri 11. 2- metilvaleril, 12,beta-metilvaleril, 13. 4-metilvaleril. Bunlarin izomerleri ve türevleri ayrica kapsanmaktadir. Dolayisiyla örnek yoluyla izomer propionilin -izobütiril gibi bir izomeri olabilmektedir. Baska bir örnek olarak izomer valeril (pentanoil)in - 2-metiI-bütiril ya da izovaleril gibi bir izomeri ya da bir çift bagli valeril (pentanoil)in -izopentenoil ya da pentenoil gibi bir izomeri olabilmektedir. Baska bir örnek olarak izomer hekzanoilin - 2-metilvaleril, beta- metilvaleril ya da 4-metilvaleril gibi bir izomeri olabilmektedir. Izomer bir ya da daha fazla çift bag içerebilmektedir ya da içermeyebilmektedir. TANIMLAR Bu basvuru kapsaminda kullanilan teknik terim ve ifadelere, genel olarak bitki ve moleküler biyolojinin ilgili tekniginde kendilerine uygulanan anlamlar verilmelidir. Asagidaki terim tanimlarinin tümü, bu uygulamanin tam içerigi için geçerlidir. "Içeren" kelimesi, diger elemanlari ya da adimlari hariç tutmaz ve belirsiz "bir" tanimi bir çoklugu hariç tutmaz. Tek bir adim, istemlerde belirtilen birkaç özelligin islevini yerine getirebilir. Belirli bir sayisal deger veya aralik baglaminda "yaklasik", "esasen" ve "yaklasik olarak" terimleri, verilen deger ya da araligin %20, %10 'u içerisinde ya da %5, %4, %3 %2 ya da %1 'i içerisinde olan bir deger ya da araligi isaret etmektedir. "izole edilmis" ifadesi, kendi dogal ortamindan alinan herhangi bir varliga karsilik gelir, ancak bu ifade herhangi bir saflik derecesini isaret etmemektedir. Bir "vektör", bir nükleik asit aracini tarif etmekte olup, bu nükleik asidin tasinmasini mümkün kilmak için nükleik asit bilesenlerinin, nükleik asit yapilarinin ve nükleik asit konjugatlarinin ve benzerlerinin bir kombinasyonunu içerir. Uygun vektörler dairesel, çift sarmalli DNA plazmidleri gibi ekstra kromozomal replikasyon yapabilen episomlari; linearize çift sarmalli DNA plazmidleri; ve her tür kökene sahip baska tasiyicilari içerir. Bir "ekspresyon vektörü", nükleik asidin ekspresyonunu mümkün kilmak için olan nükleik asit bilesenlerinin, nükleik asit yapilarinin ve nükleik asit konjugatlarinin ve benzerlerinin bir kombinasyonunu içeren bir nükleik asit aracidir. Uygun ekspresyon vektörleri dairesel, çift sarmalli DNA plazmidleri; lineer hale getirilmis nükleik asit plazmidleri ve herhangi bir orijinden diger islevsel olarak esdeger ekspresyon vektörleri gibi ekstra-kromozomal replikasyon yapabilen epizomlari içerir. Bir ekspresyon vektörü, asagida tarif edilmis oldugu üzere bir nükleik asit, nükleik asit yapilari ya da nükleik asit konjugati ile yukari akis yününde yerlestirilmis ve çalisir sekilde baglanmis en az bir transkripsiyon promotör içerir. "Yapi" terimi, bir ya da daha fazla polinükleotit içeren bir çift sarmalli, rekombinant nükleik asit fragmanini isaret etmektedir. Yapi, tamamlayici bir "yolcu ya da kodlama dizisi" ile eslestirilmis bir "sablon dizi" içerir. Verilen bir yapi bir vektör içine, bir vektör içerisine yerlestirilmis olan bir ekspresyon tasiyici gibi bir transkripsiyon promotörün yönelimine göre ya ayni (ya da sens) yönelimde ya da ters (ya da antisens) yönelimde olmak üzere iki muhtemel yönelim ile yerlestirilebilir. Örnek niteliginde bir yapi SEK ID NO: 9*da gösterilmektedir. Bir "promotör" alisilagelen sekli ile yukari akis yönünde konumlandirilmis olan ve bir çift sarmalli nükleik asit parçasina uygulanabilir bir sekilde baglantili olan bir nükleik asit eleman/sekansini isaret etmektedir. Promotörler tamamen ilgili bir dogal gene yakin bölgelerden türetilebilir ya da farkli dogal promotörlerden ya da sentetik nükleik asit bölümlerinden türetilen farki elemanlardan olusabilir. Örnek niteliginde bir promotör SEK ID NO: 8'de gösterilmektedir. "Homoloji, özdeslik ya da benzerlik" terimleri sekans hizalamasi ile mukayese edildiginde iki polipeptit arasindaki ya da iki nükleik asit molekülü arasindaki sekans benzerligi derecesini isaret etmektedir. Karsilastirilmakta olan iki farkli nükleik asit sekansi arasindaki homoloji derecesi karsilastirilabilir pozisyonlardaki özdes veya eslesen nükleotitlerin sayisinin bir fonksiyonudur. Yüzde özdeslik görsel inceleme ve matematiksel hesaplama vasitasiyla belirlenebilir. Alternatif olarak, iki nükleik asit sekansinin özdeslik yüzdesi, - ClustalW, CIustalX, BLAST, FASTA ya da Smith-Waterman gibi bir bilgisayar programi kullanmak sureti ile sekans bilgilerinin mukayese edilmesiyle belirlenebilir. "Bitki" terimi, yasam döngüsünün ya da gelisiminin herhangi bir asamasinda olan herhangi bir bitkiyi ve bunun silsilesini isaret etmektedir. Bir yapilanmada, bitki bir tütün bitkisi olup, Nikotina familyasina ait olan bir bitkiye karsilik gelmektedir. Tütün bitkisinin tercih edilen türleri, bitki çesitleri, melezleri ve varyeteleri burada tarif edilmektedir. Bir "bitki hücresi", bir bitkinin yapisal ve fizyolojik bir birimine karsilik gelir. Bitki hücresi, bir hücre duvari olmayan bir protoplast, izole edilmis tek bir hücre ya da laboratuvar ortaminda yetistirilmis bir hücre ya da bitki dokusu, bir bitki organi ya da tam bir bitki gibi olup bu örneklerle sinirli olmayan daha yüksek tertipli bir birimin bir kismi formunda olabilir. "Bitki malzemesi" terimi, biyokütle, yapraklar, yaprak tabakasi, yapragin orta damari, damarlar, kökler, çiçekler ya da çiçek kisimlari, meyveler, polen, yumurta hücreleri, zigotlar, tohumlar, çelikler, salgilar, özütler, hücre ya da doku kültürleri ya da bir bitkinin herhangi baska kisimlari ya da ürünleri dahil olmak üzere bir bitkiden elde edilebilen her türlü kati, sivi ya da gaz bilesime ya da bunlarin bir kombinasyonuna karsilik gelmektedir. Bir yapilanmada, bitki malzemesi biyokütle, tohum ya da yapraklari içerir ya da bunlardan meydana gelir. Bir baska yapilanmada, bitki malzemesi yapraklari içerir ya da bunlardan meydana gelir. "Çesit" terimi, sabit özellikleri paylasan bitkilerin bir popülasyonuna karsilik gelmekte olup, bu özellikler bunlari ayni türün baska bitkilerinden ayirmaktadir. Bir ya da daha fazla ayirt edici özellige sahip olmakla birlikte, bir çesit, bu varyete içindeki bireyler arasinda çok küçük bir genel varyasyon ile karakterize edilir. Bir çesit siklikla ticari olarak satilir. Burada kullanildigi sekliyle "hat" ya da "soy hatti" terimi, bitki yetistirme sirasinda kullanilan bir bitki grubunu ifade eder. Bir hat bir varyeteden bir ya da daha fazla ele alinan özellik için bireyler arasinda küçük varyasyon göstermesi ile ayirt edilebilmekte olup, bunun yaninda baska özellikler için bireyler arasinda bir miktar varyasyon olabilmektedir. "Modüle etmek" terimi bir polipeptitin aktivitesini azaltmak, inhibe etmek, arttirmak ya da diger türlü etkilemek anlamina gelmektedir. Terim ayrica terimi bir polipeptiti kodlayan bir genin aktivitesini azaltmak, inhibe etmek, arttirmak ya da diger türlü etkilemek anlamina gelmekte olup, transkripsiyonel aktiviteyi modüle etmeyi içerebilmektedir fakat bunlarla sinirli degildir. "Azaltmak" ya da "azalan" terimi, bir çoklugun ya da polipeptit aktivite, transkripsiyonel aktivite ve/veya protein ekspresyonu gibi ancak bunlarla sinirli olmamak kaydiyla bir aktivitesinin yaklasik %10 ile yaklasik %99 arasinda ya da en az %10, en az %20, en az %25, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %75, en az %80, en az %90, en az %95, en az %98, en az %99 ya da en az %100 ya da daha fazla bir azalmasina karsilik gelmektedir. Burada kullanilmis oldugu üzere "inhibe etme" ya da "inhibe" terimi, bir çoklugun ya da bunlarla sinirli olmamak kaydiyla polipeptit aktivitesi, transkripsiyonel aktivite ve/veya protein ekspresyonu gibi bir aktivitenin yaklasik %98 ile yaklasik %100 arasinda bir azalmasina ya da en az %98, en az %99, özellikle de %100 oraninda bir azalmasina karsilik gelmektedir. Burada kullanilmis oldugu üzere "artma" ya da "artan" terimi, yaklasik %10 ile yaklasik %99 arasinda bir yükselmeye ya da bir çoklugun ya da bunlarla sinirli olmamak kaydiyla polipeptit aktivitesi, transkripsiyonel aktivite ve/veya protein ekspresyonu gibi bir aktivitenin en az %10, en az %20, en az %25, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %75, en az %80, en az% 90, en az %95, en az %98, en az %99, en az %100, en az %150 ya da en az %200 oraninda ya da daha fazla yükselisine karsilik gelmektedir. Bir kontrol bitkisi ya da kontrol bitki hücreleri baglaminda "kontrol" terimi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modifiye edilmedigi (örnek olarak, artirma ya da azaltma) bir bitki ya da bitki hücresi anlamina gelir ve böylece de bu içerisinde izopropilmalat sentazin ekspresyon ya da aktivitesinin modifiye edilmis oldugu bir bitki ile bir karsilastirma saglayabilir. Kontrol bitkisi bir bos tasiyici içerebilir. Kontrol bitkisi bir yabani tür bitkiye karsilik gelebilir. DETAYLI TARIFNAME Bir yaklasimda izole edilmis bir polinükleotit saglanmis olup, bu bir polinükleotit sekansi içermekte, bundan olusmakta ya da esasen bundan olusmaktadir ve sekans listesinde gösterilmis olan polinükleotitlerin herhangi biri de dahil olmak üzere burada tarif edilmis olan sekanslarin herhangi biri ile en az %60 sekans özdesligine sahiptir. Uygun olarak, izole edilmis polinükleotidler, bunlarla en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir sekans içerir, bundan meydana gelir ya da esasen bundan meydana gelir. Birinci yaklasimda izole edilmis bir polinükleotit saglanmakta olup, bir izopropilmalat sentazi kodlayan bir polinükleotit sekansini içermekte, bundan olusmakta ya da esasen bundan olusmaktadir ve SEK ID NO:1 ile en az %60 sekans özdesligine sahiptir. Uygun olarak, izole edilmis polinükleotidler, SEK ID No:1 ile en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir sekans içermektedir, bundan olusmaktadir ya da esasen bundan olusmaktadir. Bir baska yaklasimda, bir izole edilmis polinükleotit saglanmis olup, bu bir izopropilmalat sentaz kodlayan ve SEK ID NO: 10 ile en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir polinükleotit sekansi içermekte, bundan meydana gelmekte ya da esas olarak bundan meydana gelmektedir. Bir baska yaklasimda, bir izole edilmis polinükleotit saglanmis olup, bu bir izopropilmalat sentaz kodlayan ve SEK ID NO: 12 ile en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir polinükleotit sekansi içermekte, bundan meydana gelmekte ya da esas olarak bundan meydana gelmektedir. Bir baska yaklasimda, bir izole edilmis polinükleotit saglanmis olup, bu bir izopropilmalat sentaz kodlayan ve SEK ID NO: 14 ile en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir polinükleotit sekansi içermekte, bundan meydana gelmekte ya da esas olarak bundan meydana gelmektedir. Bir baska yaklasimda, bir izole edilmis polinükleotit saglanmis olup, SEK ID NO: 8 ile en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir polinükleotit sekansi içermekte, bundan meydana gelmekte ya da esas olarak bundan meydana gelmektedir. 8. SEK ID NO: 8, tercih edilen bir promotörü kodlamaktadir. "Polinükleotid" terimi, modifiye edilmemis ya da modifiye edilmis deoksiribonükleik asit (DNA) ya da ribonükleik asit (RNA) olabilen bir nükleotit polimerini ifade eder. Buna bagli olarak, bir polinükleotit, sinirlama olmaksizin, bir genomik DNA, tamamlayici DNA (cDNA), mRNA ya da antisens RNA ya da bunun bir parça(lar)i olabilir. Bunun ötesinde, bir polinükleotid tek sarmalli ve çift sarmalli bölgelerin bir karisimi olan tek sarmalli ya da çift sarmalli nükleik asit, DNA ve RNA içeren bir melez molekül ya da tek sarmalli ve çift sarmalli bölgelerin ya da bunlarin bir parça(lar)inin bir karisimina sahip bir melez molekül olabilir. Ek olarak, polinükleotit DNA, RNA ya da her ikisini ya da bunlarin bir fragmanini (fragmanlarini) içeren üç sarmalli bölgelerden olusabilir. Bir polinükleotit, fosfotioatlar gibi bir ya da daha fazla modifiye edilmis baz Içerebilir ve bir peptit nükleotit asit (PNA) olabilir. Genel olarak, polinükleotitler, izole edilmis ya da klonlanmis cDNA, genomik DNA, oligonükleotidler ya da tek tek nükleotitlerden ya da yukaridakilerin bir kombinasyonundan birlestirilebilir. Burada tarif edilmis olan polinükleotit dizileri DNA dizileri olarak gösterilmesine ragmen, bu diziler karsilik gelen RNA dizilerini ve bunlarin tamamlayici (örnegin tamamen tamamlayici) DNA ya da RNA dizilerini, bunlarin ters komplemanlari da dahil olmak üzere içerir. "Izopropilmalat sentaz polinükleotiti" terimi, Nicotiana fabacumdan izopropilmalat sentazi (IMPS) kodlayan polinükleotitleri içermektedir ve SEK ID No:1, SEK ID NO: 10, SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO: 14 ile büyük oranda homolojiye sahip ya da bunlara büyük oranda özdes polinükleotitler; SEK ID No:1, SEK ID NO: 10, SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO: 14'ün sekansi ile %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 ya da %99 sekans özdesligine sahip olan polinükleotit varyantlarini; SEK ID No:1, SEK ID NO: 10, SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO: 14'ün fragmanlarini içeren polinükleotitlerin fragmanlarini ve SEK ID NO:1, SEK ID NO: 10, SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO: 14'ün SEK ID No:1, SEK ID NO: 10, SEK ID NO:12 ya da SEK ID NO: 14iün karsilik gelen fragmanlari ile %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 ya da %99 sekans özdesligine sahip olan burayla büyük oranda homolojiye (yani sekans benzerligine) ya da büyük oranda özdeslige sahip fragmanlari içermektedir, bunlardan olusmaktadir ya da esasen bunlardan olusmaktadir. izopropilmalat sentaz polinükleotiti, SEK ID No:1, SEK ID NO: 10, SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO: 14 ile bir izopropilmalat sentaz olarak islev gören bir polipeptiti kodlamak için yeterli ya da büyük bir özdeslik ya da benzerlik derecesi içeren sekanslari içermektedir. Bir yapilanmada "izopropilmalat sentaz polinükleotidi" terimi, SEK ID No:1, SEK ID NO: 10, SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO: 14 olarak burada belirtilen bir polinükleotiti içeren, bunlardan olusan ya da esasen bunlardan olusan bir polimere isaret etmektedir. Burada tarif edilmis oldugu üzere bir polinükleotit, genellikle fosfodiester baglari içerecektir, ancak bazi durumlarda, örnek olarak fosforamidat, fosforotioat, fosforoditiyoat ya da O- metilfosforamidat baglari içeren alternatif omurgalara ve peptit polinükleotit omurgalara ve baglara sahip olabilen polinükleotid analoglari dahil olabilir. Diger analog polinükleotitler, pozitif omurgalara; iyonik olmayan omurgalara ve riboz olmayan omurgalara sahip olanlari içermektedir. Riboz-fosfat omurgasinin modifikasyonlari çesitli nedenlerle, örnek olarak, bu gibi moleküllerin fizyolojik ortamlarda ya da bir biyoçip üzerindeki problar olarak stabilitesini ve yari Ömrünü arttirmak için yapilabilir. Dogal olarak meydana gelen polinükleotitlerin ve analoglarin karisimlari yapilabilir, alternatif olarak farkli polinükleotit analoglarinin karisimlari ve dogal olarak meydana gelen polinükleotitler ile analoglarin karisimlari yapilabilir. Örnek olarak, fosforamidat, fosforotioat, fosforoditiyoat, O-metilfosforamidit baglari ve peptit polinükleotit omurgalari ve baglantilari dahil olmak üzere çesitli polinükleotit analoglari bilinmektedir. Diger analog polinükleotitler, pozitif omurgalara, iyonik olmayan omurgalara ve riboz olmayan omurgalara sahip olanlari içermektedir. Bir ya da daha fazla karbosiklik sekeri içeren polinükleotitler de ayrica dahildir. Diger analoglar, peptit polinükleotit analoglari olan peptit nükleik asitlerini içerir. Bu omurgalar dogal olarak meydana gelen polinükleotitlerin çok yüklü fosfodiester omurgasinin aksine dogal sartlar altinda büyük ölçüde iyonik degildir. Bu avantajlara neden olabilir. Ilk olarak, peptit polinükleotit omurgasi gelismis melezleme kinetikleri sergileyebilir. Peptit nükleik asitler mükemmel eslesmis çiftlere karsilik eslesmemis çiftler için erime sicakliginda büyük degisimlere sahiptir. DNA ve RNA tipik olarak bir dahili eslesmeme için erime sicakliginda bir 2-4°C düsüs sergiler. Iyonik olmayan peptit polinükleotit omurgasi ile düsüs 7-9 °C ,ye yakindir. Benzer sekilde bunlarin iyonik olmayan dogasindan dolayi bu omurgalara takilan bazlarin hibridizasyonu nispeten tuz konsantrasyonuna karsi duyarsizdir. Ek olarak, peptit nükleik asitleri, hücresel enzimler tarafindan bozunmayabilir ya da daha az ölçüde bozunabilir ve bu nedenle de daha kararli olabilir. Açiklanan polinükleotidlerin kullanimlari ve bunlarin fragmanlarinin kombinasyonlari arasinda fragmanlarin nükleik asit melezleme analizleri içerisinde problar olarak ya da nükleik asit amplifikasyon analizleri içerisinde öncüller olarak kullanimi bulunmaktadir. Bu tür parçalar bir DNA sekansinin en az yaklasik 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ya da 20 ya da daha fazla bitisik nükleotitini içerir. Diger yapilanmalarda bir DNA parçasi bir DNA sekansinin en az yaklasik 10, 15, 20, 30, 40, 50 ya da 60 ya da daha fazla bitisik nükleotitini içerir. Bu teknikler ayrica bir fonksiyonel izopropilmalat sentaz geni burada sükroz esterlerin olusumu için gerekli olarak gösterildiginden dolayi BMVSE ve bmvse bitkilerini tanimlamak için kullanilabilmektedir. izopropilmalat sentazin genetik markörleri ve alelleri, bir bitkini sükroz ester üretimini tahmin edici olarak kullanilabilmektedir. Bu tür bir test, sigara kalitesini ya da yigin tipi homojenligi tahmin etmek ya da bitki çesitlerini izlemek için kullanilabilmektedir. Dolayisiyla bir yaklasimda burada açiklandigi sekilde bir izopropilmalat sentaz polinükleoitidi tespit etmeye yönelik bir yöntem saglanmakta olup, söz konusu polinükleotiti spesifik olarak tespit edebilen ya da spesifik olarak amplifiye edebilen ya da söz konusu polinükleoitidi spesifik olarak amolifiye edebilen problarin ya da primerlerin kullanimini içermektedir. Bir baska yaklasimda sükroz esterlerini üretebilen bir bitkiyi tanimlamaya yönelik bir yöntem saglanmis olup, asagidaki adimlari içermektedir: (a) ilgili bir bitkiden nükleik asit içeren bir örnegin saglanmasi ve (b) burada açiklandigi sekilde bir izopropilmalat sentaz polinükleoitidin mevcudiyetinin belirlenmesi, burada söz konusu polinükleoitidin söz konusu bitkideki mevcudiyeti söz konusu bitkinin sükroz esterleri üretme kabiliyeti oldugunun göstergesidir. izopropilmalat sentaz polinükleotidinin en azindan bir kismini saptamak için olan kitler de saglanmis olup, bunlar izopropilmalat sentaz polinükleotidinin en azindan bir kismini spesifik olarak saptamak için daha fazla primer ya da probdan birini içerir. Kit polinükleotid amplifikasyonu için reaktifler - örnek olarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) - ya da nükleik asit probu melezleme tespit teknolojisi için - örnek olarak Southern Blots, Northern Blots, in-situ melezleme ya da mikro sekans gibi - reaktifler içerebilir. Kit, Western Blots, ELISA, SELDI kütle spektrometrisi ya da test seritleri gibi antikor baglama tespit teknolojisi için reaktifler içerebilir. Kit, DNA sekanslama için reaktifler içerebilir. Kit, sükroz esteri içeriginin belirlenmesi için reaktifler ve/veya talimatlar içerebilir. Bazi yapilanmalarda, bir kit tarif edilen yöntemlerden biri ya da daha fazlasi için talimatlar içerebilir. Tarif edilen kitler, özellikle ortak dominant puanlama ile genetik kimlik belirleme, filogenetik çalismalar, genotipleme, haplotipleme, pedigri analizi ya da bitki islahi için yararli olabilir. Yöntemler ve kitler bir BMVSE ve bir bmvse çesidi arasindaki bir çakismaya dayali bir üreme yaklasimindan ve soylarda bitkilerin sekansa dayali seçiminden faydalanabilmektedir. Tipik olarak BMVSE üreten çesitte bulunan fonksiyonel izopropilmalat sentaz genetik bölgesini gösteren bitkiler ya da bmvse üretmeyen çesitte bulunan disfonksiyonel izopropilmalat sentaz genetik bölgesini gösteren bitkiler seçilecektir. Hibridizasyon kosullarinin seçimini etkileyen temel parametreler ve uygun kosullari belirlemek için rehberlik Sambrook, J., EF Fritsch ve T. Maniatis tarafindan tarif edilmistir (1989, Molecular Cloning: A Laboratuar Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Burada tarif edilmis olan amino asit sekansiyla kombinasyon halindeki genetik kodun bilgisi kullanilmak sureti ile dejenere oligonükleotitler hazirlanabilir. Bu tür oligonükleotitler örnek olarak, PCR'da öncüller olarak faydaliyken DNA parçalari izole edilir ve yükseltilir. Belirli yapilanmalarda dejenere öncüller genetik kütüphaneler için problar olarak kullanilabilir. Bu tür kütüphaneler cDNA kütüphanelerini, genomik kütüphaneleri ve hatta elektronik ekspres sekans etiketi veya DNA kütüphanelerini içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Bu yöntem araciligiyla tanimlanan homolog sekanslar dolayisiyla burada tanimlanmis olan sekanslarin homologlarini tanimlamak için problar olarak kullanilacaktir. Ayrica potansiyel kullanimlar, indirgenmis sikilik kosullarinda, alisilageldik sekli ile orta derecede sikilik kosullari altinda ve genellikle yüksek düzeyde sikilik kosullari altinda burada tarif edilen polinükleotide (polinükleotitlere) hibridlesen polinükleotitler ve oligonükleotidlerdir (örnek olarak öncüller ya da problar). Melezleme kosullarinin seçimini etkileyen temel parametreler ve uygun kosullari belirlemek için rehber Sambrook, J., EF Fritsch ve T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) tarafindan açiklanmaktadir ve teknikte uzman kisilerce, örnek olarak polinükleotidin uzunluguna ya da baz bilesimine dayali olarak kolaylikla belirlenebilir. Orta dereceli sikilik kosullarina erismenin bir yolu 5x Standart Sodyum Sitrat, O.5% Sodyum Dodesil Sülfat, 1.0 mM Etilendiamintetraasetik asit (pH 8.0), yaklasik %50 formamid melezleme tampon maddesi, 6x Standart Sodyum Sitrat ve yaklasik 55 °C 'lik bir hibridizasyon sicakligi (ya da örnek olarak yaklasik %50 formamid ile yaklasik 42 °C `lik hibridizasyon sicakligi içeren biri gibi benzer hibridizasyon solüsyonlari) ve 0,5x Standart Sodyum Sitrat, %O,1 Sodyum Dodesil Sülfatta yaklasik 60 °C 'lik yikama kosullari içeren bir ön yikama solüsyonunun kullanimini içerir. Genel olarak yüksek derecede sikilik kosullari yukaridaki oldugu gibi melezleme kosullari olarak tanimlanir ancak yaklasik olarak 68 °C 'de 0.2x Standart Sodyum Sitrat, %0,1 Sodyum Dodesil Sülfat yikamaya sahiptir. Hibridizasyonda SSPE (1x SSPE, 0.15M sodyum klorür, 10 mM sodyum fosfat ve 1.25 mM Etilendiamintetraasetik asittir, pH 7.4) Standart Sodyum Sitrat (1x Standart Sodyum Sitrat 0.15M sodyum klorür ve 15 mM sodyum sitrattir) ve yikama tamponlari ile ikame edilebilir; yikamalar, melezleme tamamlandiktan sonra 15 dakika boyunca gerçeklestirilir. Yikama sicakligi ve yikama tuz konsantrasyonunun hibridizasyon reaksiyonlarini ve dupleks stabilitesini yöneten teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen ve asagida ayrica açiklanan temel prensiplerin uygulanmasi vasitasiyla istenen bir zorluk derecesine erismek için gerektigi sekilde ayarlanabildigi anlasilmalidir (bkz, örnek olarak, Sambrook J., E. F. Fritsch ve T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)). Bir polinükleotit bilinmeyen sekansli bir hedef polnükleotite melezlendigi zaman hibrit uzunlugunun melezleyen polinükleotitinki olacagi varsayilir. Bilinen sekansa sahip polinükleotitler melezlendigi zaman hibrit uzunlugu polinükleotitlerin sekanslarinin hizalanmasi ve optimal sekans tamamlayicilik bölgesi veya bölgelerinin tanimlanmasi sureti ile belirlenebilir. Uzunlukça 50 baz çiftinden az olacagi tahmin edilen hibritler için hibridizasyon sicakligi hibritin erime sicakligindan 5 ila 10 °C az olmalidir, burada erime sicakligi asagidaki denklemlere göre belirlenir. Uzunluk olarak 18 baz çiftinden az melezler için erime sicakligi (°C) = 2(A+T bazlarinin sayisi) + 4(G bazlarinin sayisi + C bazlarinin sayisi). Uzunluk olarak 18 baz çiftinin üstünde melezler için erime sicakligi (°C) = 81.5 + 16.6(Iog10 [Na+]) + 0.41(% G + C) - (600/N) olup, burada N melezdeki bazlarin sayisidir ve [Na+] melezleme tamponundaki sodyum iyonlarin konsantrasyonudur ([Na+], 1x Standart Sodyum Sitrat = 0.165M için). Tipik olarak her bir bu tür melezleme polinükleotidi, melezlendigi bir polinükleotidin uzunlugunun en az %25'i (yaygin olarak en az %50, %60 ya da %70 "i ve en yaygin haliyle de en az %80'i) kadar olan bir uzunluga sahiptir ve melezlendigi bir polinükleotit ile en az %60 sekans özdesligine (örnek olarak, en az %65, %70, %75, %80, %85, %90, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100) sahiptir. Teknikte uzman bir kisi tarafindan anlasilacagi gibi, bir dogrusal DNA iki olasi yönelime sahiptir: '-3' dogrultusu ve 3'- 5' dogrultusu. Örnek olarak eger bir referans sekans 5' - 3, dogrultusunda yerlestirilirse ve eger bir ikinci sekans ayni polinükleotit moleküIü/sarmali içinde 5` - 3' dogrultusunda yerlestirilirse o zaman referans sekans ve ikinci sekans ayni yönde yönlendirilir ve ayni yönelime sahiptir. Tipik olarak bir promotör sekans ve ilgili bir gen verilen promotörün regülasyonu altinda ayni oryantasyonda yerlestirilir. Ancak 5' ila 3' dogrultusunda yerlestirilen referans sekansa göre eger bir ikinci sekans ayni polinükleotit moleküIü/sarmali içinde 3' ila 5' dogrultusunda yerlestirilirse o zaman referans sekans ve ikinci sekans anti-sens dogrultusunda yönlendirilir veya anti-sens dogrultusuna sahiptir. Birbirine göre anti-sens oryantasyonuna sahip olan iki sekans alternatif olarak eger referans sekans (5, - 3, dogrultusu) ve referans sekansin ters tamamlayici sekansi (5' - 3' yerlestirilen referans sekans) ayni polinükleotit moleküIü/sarmali içine yerlestirilirse ayni oryantasyona sahip olarak tanimlanabilir. Burada belirtilen sekanslar, 5' - 3' dogrultusunda gösterilmektedir. Burada saglanmis olan rekombinant yapilar, izopropilmalat sentaz protein ekspresyon seviyelerini modüle etmek amaci ile bitkileri ya da bitki hücrelerini dönüstürmek için kullanilabilirler. Bir rekombinant polinükleotid yapisi, burada tarif edilmis oldugu üzere bir izopropilmalat sentaz polinükleotitini kodlayan bir polinükleotidi içerebilmekte olup, bu bitki ya da hücre içinde izopropilmalat sentaz polipeptidini ifade etmeye uygun bir düzenleyici bölgeye çalisir sekilde baglanir. Dolayisiyla, bir polinükleotid burada tarif edilmis oldugu üzere izopropilmalat sentaz polipeptidini kodlayan bir kodlama sekansini içerebilir. Bir rekombinant polinükleotid tarafindan kodlanan izopropilmalat sentaz polipeptidi dogal bir izopropilmalat sentaz polipeptidi olabilir ya da hücreye heterolog olabilir. Bazi durumlarda, rekombinant yapi bir düzenleyici bölgeye islevsel olarak bagli bir izopropilmalat sentaz-modüle edici polipeptidin ekspresyonunu azaltan ya da inhibe eden bir polinükleotit içerir. Uygun düzenleyici bölgelerin örnekleri burada tarif edilmistir. Burada tarif edilmis olanlar gibi rekombinant polinükleotid yapilari içeren vektörler de ayrica saglanir. Uygun vektör omurgalari, örnek olarak plazmidler, virüsler, yapay kromozomlar, BAC 'ler, YAC 'ler ya da PAC 'ler gibi teknikte rutin olarak kullanilanlari içerir. Uygun ekspresyon vektörleri, sinirlama olmaksizin, örnek olarak bakteriyofaj, bakulovirüsler ve retrovirüslerden türetilen plazmidleri ve viral vektörleri içerir. Sayisiz vektörler ve ekspresyon sistemleri ticari olarak temin edilebilir. Vektörler ayrica, örnek olarak replikasyon, iskelet baglanti bölgeleri ya da isaretleyicilerin kökenlerini de içerebilir. Bir isaretleyici gen bir bitki hücresinde seçilebilir bir fenotip verebilir. Örnek olarak bir isaretleyici, bir antibiyotige (örnek olarak, kanamisin, G418, bleomisin ya da higromisin) ya da bir herbisite (örnek olarak, glifosat, klorsülfüron ya da fosfinotrisin) direnç gibi biyosit direnci saglayabilir. Ek olarak, bir ekspresyon vektörü ifade edilen polipeptidin manipülasyonunu ya da tespitini (örnek olarak saflastirma ya da Iokalizasyonu) kolaylastirmak için tasarlanmis bir etiket sekansini içerebilir. Lusiferaz, beta-glukuronidaz (GUS), yesil flüorisimali protein (GFP), glutatiyon S-transferaz (GST), polihistidin, c-myc ya da hemaglutinin sekanslari gibi etiket sekanslari, tipik olarak kodlanmis polipeptit ile bir füzyon olarak ifade edilir. Bu tür etiketler karboksil ya da amino terminali de dahil olmak üzere polipeptit içinde herhangi bir yere yerlestirilebilir. Bir bitki ya da bitki hücresi, stabil olarak dönüstürülmek üzere rekombinant polinükleotidin genomuna entegre edilmesi sureti ile dönüstürülebilir. Stabil olarak dönüstürülmüs hücreler tipik olarak her bir hücre bölünmesi ile dahil edilen polinükleotidi muhafaza etmektedir. Bir bitki ya da bitki hücresi rekombinant polinükleotidin genomuna entegre edilmeyecegi sekilde geçici olarak transforme edilebilir. Geçici olarak transforme edilen hücreler tipik olarak her bir hücre bölünmesi ile birlikte verilen rekombinant polinükleotitin tamamini ya da bir kismini kaybetmekte olup, böylelikle bir araya getirilen rekombinant polinükleotit yeterli sayida hücre bölünmesinden sonra yavru hücrelerde tespit edilemez. Bir bitki hücresini transforme etmek için teknikte birçok yöntem mevcut olup, bunlarin tamami burada kapsanmis olup, bunlara biyolistikler, gen tabancasi teknikleri, Agrobakteri aracili dönüsüm, viral vektör aracili dönüsüm ve elektroporasyon dahildir. Yabanci nükleik asidin bitki kromozomlarina entegrasyonu için Agrobacterium sistemi, bitki genetik mühendisligi için kapsamli bir sekilde arastirilmis, modifiye edilmis ve kullanilmistir. Sens ya da antisens yönelimde düzenleyici sekanslara çalisir sekilde bagli olan söz konusu saflastirilmis tütün proteinine karsilik gelen nükleik asit sekanslarini içeren çiplak rekombinant nükleik asit molekülleri geleneksel yöntemler araciligi ile uygun T-DNA sekanslarina baglanir. Bunlar, polietilen glikol teknikleri ya da elektroporasyon teknikleri ile tütün asal hücrelerine dahil edilmekte olup, bunlarin her ikisi de standarttir. Alternatif olarak, söz konusu saflastirilmis proteini kodlayan rekombinant nükleik asit molekülleri içeren bu vektörler canli Agrobakteri hücrelerine dahil edilmekte olup, bu daha sonra nükleik asidi bitki hücrelerine aktarir. T-DNA vektör sekanslarina eslik etmeden çiplak DNA ile dönüsüm, tütün asal hücrelerinin nükleik asit içeren Iipozomlarla kaynamasi araciligi ile ya da elektroporasyon araciligi ile saglanabilir. T- DNA vektör dizileri ile refakat edilmeyen çiplak DNA ayrica asal, yüksek hizli mikro mermiler araciligi ile tütün hücrelerini dönüstürmek için de kullanilabilir. Bir hücre ya da kültürlenmis doku dönüsüm için alici doku olarak kullanilirsa, bitkiler, teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen tekniklerle, istenirse, dönüstürülmüs kültürlerden yeniden üretilebilir. Bir rekombinant yapiya dahil edilecek düzenleyici bölgelerin seçimi, bunlarla sinirli olmamak üzere, verimlilik, seçilebilirlik, indüklenebilirlik, arzu edilen ekspresyon seviyesi ve hücre ya da doku tercihli ekspresyonu içeren çesitli faktörlere baglidir. Düzenleyici bölgeleri kodlama sekansina göre uygun bir biçimde seçmek ya da konumlandirmak sureti ile bir kodlama sekansinin ekspresyonunu modüle etmek teknikte uzman bir kisi için siradan bir konudur. Bir polinükleotidin transkripsiyonu benzer bir sekilde modüle edilebilir. Bazi uygun düzenleyici bölgeler sadece ya da agirlikli olarak belirli hücre tiplerinde transkripsiyonu baslatir. Bitki genomik DNA 'sindaki düzenleyici bölgelerin tanimlanmasi ve karakterize edilmesi için yöntemler teknikte bilinmektedir. Uygun transkripsiyon promotörler farkli dokularda ya da hücre tiplerinde bulunan ya da farki gelisim asamalari sirasinda bulunan ya da farkli çevresel kosullara cevaben bulunan dokuya özgü faktörler tarafindan ayirt edilebilen dokuya özgü spesifik transkripsiyon promotörleri (örnek olarak, köke özgü promotörler, filize özgü promotörler, odun dokusuna özgü promotörler) içerir. Uygun promotörler spesifik indükleyiciler gerektirmeksizin birçok hücre tipinde aktive edilebilen konstitütif promotörleri içerir. Izopropilmalat sentaz RNAI polipeptit üretimini kontrol etmek için uygun promotörlara iliskin örnekler karnibahar mozaik virüsü 358 (CaMV/358), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33. nos veya ubikuitin- veya fazeolin-promotörleri içerir. Teknikte uzman kisiler çok sayida rekombinant transkripsiyon promotör varyasyonu olusturabilirler. Dokuya özgü promotörlar bitki gelisimi sirasinda spesifik zamanlarda vejetatif dokular ya da üreme dokulari gibi belirli hücrelerde ya da dokularda aktif olan transkripsiyonel kontrol elemanlaridir. Dokuya özgü ekspresyon örnegin belirli dokulardaki polinükleotitlerin ekspresyonu tercih edildigi zaman avantajli olabilir. Gelisimsel kontrol altinda dokuya özgü transkripsiyon promotörlara iliskin örnekler sadece (ya da birincil olarak sadece) vejetatif dokular, örnek olarak yapraklar ya da kökler gibi belirli dokularda ya da meyve, ovüller, tohumlar, polen, pistoller, çiçekler ya da herhangi bir embriyonik doku gibi üreme dokularinda trankripsiyonu baslatabilen transkripsiyon promotörlerini içermektedir. Üreme dokusuna özgü transkripsiyon promotörlar örnek olarak antere özgü, ovüle özgü, embriyoya özgü, endosperme özgü, zara özgü, tohuma ve tohum kabuguna özgü, polene özgü, petale özgü, sepale özgü ya da bunlarin kombinasyonlari olabilir. Uygun yapraga özgü promotörlar piruvat, C4 bitkisinden (dari) ortofosfat dikinaz (PPDK) transkripsiyon promotör, daridan cab-m1Ca+2 transkripsiyon promotör, Arabidopsis thaliana myb ile iliskili gen promotör (Atmyb5), ribuloz bifosfat karboksilaz (RBCS) promotörlar (örnek olarak, yapraklarda ve isikta büyüyen fidelerde eksprese edilen domates RBCS 1, RBCSZ ve RBCS3A genleri, gelisen domates meyvesinde eksprese edilen RBCS1 ve RBCS2 ya da neredeyse tamamen yaprak ayasinda ve yaprak sap kökündeki mezofil hücrelerde yüksek seviyelerde eksprese edilen ribuloz bifosfat) içerir. Uygun senesansa özgü promotörlar meyve olgunlasmasi, senesans ve yapraklarin kesilmesi sirasinda aktif bir domates promotörü, bir sistein proteaz kodlayan genin bir dari promotörünü içerir. Uygun antere özgü promotörlar kullanilabilir. Teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen uygun kök tercihli promotörlar seçilebilir. Uygun tohum tercihli promotörlar hem tohuma özgü promotörleri (bu promotörlar tohum depolama proteinlerinin promotörleri gibi tohum gelisimi sirasinda aktiftir) hem de tohum filizleme promotörleri (bu promotörlar tohum filizlenmesi sirasinda aktiftir) içermektedir. Bu tür tohum tercihli promotörlar Cim1 (sitokinin indüklü mesaj); 021981 (dari 19 kDa zein); milps (myo-inositoI-1-fosfat sentaz); mZE40-2, ayrica Zm-4O olarak da bilinir; nuclc ve celA (selüloz sentaz) içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Gama-zein bir endospreme özgü promotördir. Glob-1 bir embriyoya özgü transkripsiyon promotördir. Iki çenekliler için tohuma özgü promotörlar fasulye beta-faseolin, napin, ß-konglisinin, soya fasulyesi Iektin, krusiferin ve benzerlerini içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Monokotlar için, tohuma özgü promoterler, bunlarla sinirli olmamak üzere, bir dari 15 kDa zein promotör, bir 22 kDa zein promotör, bir 27 kDa zein promotör, bir gamma-zein promotör, bir 27 kDa y-zein promotör (gzw64A promotör gibi, bkz. Genbank Eklenme numarasi 878780), bir balmumu promotör, bir çekilmis 1 promotör, bir çekilmis 2 promotör, bir globulin 1 promotör (bkz. Genbank Erisim numarasi L22344), bir Itp2 promotör, cim1 promotör, dari end1 ve end2 promotörleri, nuc1 promotör, Zm40 promotör, eep1 ve eep2; Iec1, tioredoksin H promotör; mlip15 promotör, PCNA2 promotör; ve çekilmis-2 promoteri içerir. Indüklenebilir promotörlere iliskin örnekler patojen atagina, anaerobik kosullara, yüksek sicakliga, isiga, kurakliga, soguga ya da yüksek tuz konsantrasyonuna cevap veren promotörleri içerir. Patojen indüklenebilir promotörlar bir patojen (örnek olarak, PR proteinleri, SAR proteinleri, beta-1,3-glukanaz, kitinaz) tarafindan enfeksiyonu takiben indüklenen patogenezle iliskili proteinlerden (PR proteinler) olanlari içerir. Bitki promotörlerine ek olarak diger uygun promotörlar bakteriyel orijinden örnek olarak,otör, nopalin sentaz promotör ve Ti plazmidlerden türetilen diger promotörlardan türetilebilir ya da viral promotörlardan (örnek olarak, karnabahar mozaik virüsünün (CaMV) 358 ve 198 RNA promotörleri, tütün mozaik virüsünün konstitütif promotörleri, karnabahar mozaik virüsünün (CaMV) 198 ve 358 promotörleri ya da siraca otu mozaik virüs 358 promotörleri) türetilebilir. "Izopropilmalat sentaz polipeptidi" terimi Nicotiana tabacumt sentaz (IPMS) kodlayan bir polipeptit anlamina gelmektedir ve SEK ID No:2, SEK ID NO:11, SEK ID NO:13 ya da SEK ID NO: 15 ile en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 ya da %99 sekans özdesligi olan bir polinükleotit varyanti tarafindan kodlanan bir amino asit sekansi ve SEK ID No:2, SEK ID NO:11, SEK ID NO:13 ve SEK ID NO: 15'in karsilik gelen fragmanlari ile en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 ya da %99 sekans özdeslige sahip olan SEK ID No:2, SEK ID NO:11, SEK lD NO:13 ya da SEK ID NO:15 fragmanlarini içermektedir, bunlardan olusmaktadir ya da esasen bunlardan olusmaktadir. izopropilmalat sentaz polinükleotidi ayrica SEK ID No:2, SEK ID NO:11, SEK lD NO:13 ve SEK ID NO: 15 ile bir izopropilmalat sentaz olarak islev görmek için yeterli ya da büyük oranda bir özdeslik ya da benzerlik derecesi içeren sekanslari içermektedir. Izopropilmalat sentaz peptidinin fragmanlari tipik olarak izopropilmalat sentaz aktivitesini korumaktadir. Izopropilmalat sentaz polipeptitler ayni zamanda herhangi bir tür degisimin (örnek olarak, amino asitler eklemeleri, delesyonlari ya da amino asitlerin ikame edilmeleri; glikosilasyon durumlarindaki degisimler; yeniden katlamayi ya da izomerizasyonu, üç boyutlu yapilari ya da kendiliginden iliskilenme durumlarini etkileyen degisimler) dahil edilmesi vasitasiyla üretilen varyantlari içermekte olup, bunlar halen bir izopropilmalat sentaz olarak islev görmek kaydi ile kasti olarak üretilebilir ya da dogal olarak izole edilebilir. Izopropilmalat sentaz polipeptitleri, lineer formda olabilir ya da bilinen yöntemler kullanilarak siklize edilebilir. "Izopropilmalat sentaz polipeptidi" ayrica burayla en az %60, %65, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, % 99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan SEK ID No:1, SEK ID NO:10, SEK ID NO:12 ya da SEK ID NO:14 tarafindan kodlanan bir polipeptit ya da burayla %100 sekans özdesligi olan SEK ID No:2, SEK ID NO:11, SEK ID NO:13 ya da SEK ID NO:15`te belirtilen sekansi içeren, bundan olusan ya da esasen bundan olusan bir polipeptit anlamina gelebilir. Bir baska yaklasimda sekans listesi içerisinde gösterilmis olan polipeptitlerin herhangi biri dahil olmak üzere burada tarif edilmis olan sekanslarin herhangi biri ile en az %60 sekans özdesligine sahip olan bir polipeptit sekansi içeren, bundan meydana gelen ya da temel olarak bundan meydana gelen bir izole edilmis polipeptit saglanmistir. Uygun olarak, izole edilmis polipeptitler, bunlarla en az %60, %61, %62, %63, %64, %65, %66, %67, %68, %69, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir sekans içerir, bundan meydana gelir ya da temel olarak bundan meydana gelir. Polipeptitler herhangi bir tür degisimin (örnek olarak amino asitler eklemeleri, delesyonlari veya ornatimlari; glikosilasyon durumlarindaki degisimler; yeniden katlamayi veya izomerizasyonu, üç boyutlu yapilari veya kendiliginden birlesme durumlarini etkileyen degisimler) dahil edilmesi vasitasiyla üretilen, kasti olarak üretilen veya dogal olarak izole edilen varyantlari içerir. Varyant, sessiz bir degisim yaratan ve fonksiyonel olarak esdeger bir protein ile sonuçlanan degisimlere sahip olabilir. Kasten amino asit sübstitüsyonlari, maddenin sekonder baglanma aktivitesi korunmus oldugu sürece kalintilarin polarite, yük, çözünürlük, hidrofobiklik, hidrofiliklik ve/veya amfipatik dogasinda benzerlik temelinde yapilabilir. Örnek olarak, negatif yüklü amino asitler aspartik asit ve glutamik asit içerir; pozitif yüklü amino asitler, Iisin ve arginin içerir; ve benzer hidrofiliklik degerlerine sahip yüksüz polar bas gruplari olan amino asitler arasinda Iösin, izolösin, valin, glisin, alanin, asparagin, glutamin, serin, treonin, fenilalanin ve tirozin bulunur. Korunumlu sübstitüsyonlar, örnek olarak asagidaki Tabloya göre yapilabilir. Ikinci kolon içerisinde ayni bloktaki ve tercihen de üçüncü kolon içerisinde ayni siradaki amino asitler birbirleri yerine ikame edilebilir: ALIFATIK Polar olmayan Gly Ala Pro Ile Leu Deg Polar - yüksüz Cys Ser Thr Met Asn Gly Polar - yüklü Asp Glu Lys Arg AROMATIK His Phe TrpTyr Polipeptit olgun bir protein ya da olgunlasmamis bir protein ya da olgunlasmamis bir proteinden türetilmis bir protein olabilir. Polipeptitler, lineer formda olabilir ya da bilinen yöntemler kullanilarak siklize edilebilir. Polipeptitler en az 10, en az 20, en az 30 ya da en az 40 bitisik amino asit içerir. Bir baska yaklasimda, bir izole edilmis izopropilmalat sentaz polipeptidi saglanmis olup, bu bir izopropilmalat sentaz kodlayan ve SEK ID NO: 2 ile en az %60, %65, %70, 0/o75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %98, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir polinükleotit içermekte, bundan olusmakta ya da esasen bundan olusmaktadir. Bir baska yapilanmada bir izole edilmis izopropilmalat sentaz polipeptidi saglanmis olup, bu bir izopropilmalat sentaz kodlayan ve SEK ID NO: 11 ile en az %60, %65, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir polinükleotit içermekte, bundan olusmakta ya da esasen bundan olusmaktadir. Bir baska yapilanmada bir izole edilmis izopropilmalat sentaz polipeptidi saglanmis olup, bu bir izopropilmalat sentaz kodlayan ve SEK ID NO: 13 ile en az %60, %65, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir polinükleotit içermekte, bundan olusmakta ya da esasen bundan olusmaktadir. Bir baska yapilanmada bir izole edilmis izopropilmalat sentaz polipeptidi saglanmis olup, bu bir izopropilmalat sentaz kodlayan ve SEK ID NO: 15 ile en az %60, %65, %70, %75, %80, %85, %87, %88, %89, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 sekans özdesligine sahip olan bir polinükleotit içermekte, bundan olusmakta ya da esasen bundan olusmaktadir. Burada ayrica polipeptid sekanslarinin fragmanlari ifsa edilmekte olup, uygun olarak, bu tür fragmanlar tam uzunluklu sekansin aktivitesini muhafaza etmektedir. Mutant polipeptitler mutant bitkiler, dogal olarak bulunmayan bitkiler ya da mutant polipeptidi içeren transgenik bitkiler olusturmak için kullanilabilir. Uygun olarak mutant polipeptidi mutant hale getirilmemis polipeptidin aktivitesini korumaktadir. Mutant polipeptidin aktivitesi mutant hale getirilmemis polipeptitten daha yüksek, daha düsük ya da yaklasik ayni olabilmektedir. Bir polipeptit, bir polipeptidi eksprese etmeye uygun kültür kosullari altinda dönüstürülmüs ya da rekombinant konakçi hücreleri kültürlemek sureti ile hazirlanabilir. Meydana gelen eksprese edilmis polipeptit daha sonra bilinen saflastira teknikleri kullanilarak saflastirilabilir. Polipeptitin saflastirilmasi ayrica polpeptite baglanacak ajanlari içeren bir afinite kolonu; bu tür afinite reçineleri üzerinde bir ya da daha fazla kolon adimi; hidrofobik etkilesim kromatografisini içeren bir ya da daha fazla adim ya da immünoafinite kromatografisi içerir. Alternatif olarak polipeptit ayrica saflastirmayi kolaylastiracak bir formda eksprese edilebilir. Örnek olarak bir füzyon polipeptiti, örnek olarak maltoz baglayici polipeptit, glutatyon-S-transferaz ya da tiyoredoksin olarak eksprese edilebilir. Füzyon polipeptitlerinin ekspresyonu ve saflastirilmasi için kitler ticari olarak temin edilebilir. Polipeptit bir epitopla isaretlenebilir ve sonrasinda bu epitopa yönelik spesifik bir antikor kullanilarak saflastirilabilir. Polipeptidi daha da saflastirmak için bir ya da daha fazla sivi kromatografi asamasi - ters fazli yüksek performansli sivi kromatografisi gibi - kullanilabilir. Yukaridaki saflastirma adimlarinin bazilari ya da hepsi çesitli kombinasyonlar halinde büyük ölçüde homojen bir rekombinant polipeptit saglamak için kullanilabilir. Bu sekilde saflastirilan polipeptit büyük ölçüde diger polipeptitlerden arinmis olabilir ve burada tanimlanmis oldugu üzere "büyük ölçüde saflastirilmis bir polipeptit" olarak tanimlanir; bu tür saflastirilmis polipeptitler polipeptitleri, fragmanlarini. varyantlarini ve benzerlerini içerir. Polipeptitlerin ve fragmanlarinin ekspresyonu, izolasyonu ve saflastirilmasi herhangi bir uygun teknik araciligiyla gerçeklestirilebilmekte olup, bu teknikler burada açiklanan yöntemleri içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Ayrica polipeptitlere karsi üretilen bir monoklonal antikor gibi bir afinite kolonunu eksprese edilmis polipeptitleri afinite açisindan saflastirmak için kullanmak da mümkündür. Bu polipeptitler geleneksel teknikler, örnek olarak bir yüksek tuz elüsyon tamponunda bir afinite kolonundan uzaklastirilabilir ve daha sonra kullanim için bir düsük tuzlu tampon içinde diyaliz edilebilir ya da kullanilan afinite matrisine dayanarak pH 'in ya da diger bilesenlerin degistirilmesi vasitasiyla uzaklastirilabilir ya da afinite kismin dogal olarak meydana gelen substrati kullanilarak tamamen uzaklastirilabilir. Bir polipeptit ayrica bilinen geleneksel kimyasal sentez araciligiyla üretilebilir. Polipeptitlerin ya da bunun parçalarinin sentetik araçlarla yapilmasina yönelik yöntemler teknikte uzman kisiler tarafindan bilinmektedir. Sentetik olarak yapilan polipeptit sekanslar, bir dogal polipeptitle primer, sekonder ya da tertier yapisal ya da konformasyonel karakteristikleri paylasmak sureti ile biyolojik aktivite de dahil olmak üzere ortak biyolojik özellikler tasiyabilir. Burada kullanilmis oldugu üzere "dogal olarak meydana gelmeyen" terimi, dogal olarak olusmayan ya da dogada bulunmayan bir varligi (örnek olarak, bir polinükleotit, bir genetik mutasyon, bir polipeptit, bir bitki, bir bitki hücresi ve bitki materyali) tarif eder. Bu tür dogal olarak meydana gelmeyen varliklar ya da yapay varliklar, burada tarif edilmis olan ya da teknikte bilinen yöntemler ile yapilabilir, sentezlenebilir, baslatilabilir, modifiye edilebilir, müdahale edilebilir ya da manipüle edilebilir. Bu nedenle, örnek olarak, dogal olarak meydana gelmeyen bir bitki, dogal olarak meydana gelmeyen bir bitki hücresi ya da dogal olarak meydana gelmeyen bitki materyali, geleneksel bitki yetistirme teknikleri kullanilarak - geriye dogru çaprazlama gibi - ya da antisens RNA, araya giren RNA, meganükleaz ve benzeri gibi genetik manipülasyon teknolojileri kullanilarak yapilabilir. Baska bir örnek olarak, dogal olarak meydana gelmeyen bir bitki, dogal olarak meydana gelmeyen bir bitki hücresi ya da dogal olarak meydana gelmeyen bitki materyali, bir ya da daha fazla genetik mutasyonun (örnek olarak bir ya da daha fazla polimorfizm) bir birinci bitki ya da bitki hücresinden ikinci bitki ya da bitki hücresine (bunun kendisi dogal olarak meydana gelebilir) geri melezlemesi yoluyla ya da aktarimi yoluyla yapilabilmekte olup, böylelikle sonuçta elde edilen bitki, bitki hücresi ya da bitki malzemesi ya da bunun silsilesi doga tarafindan olusturulmayan ya da dogada mevcut olmayan bir genetik yapi (örnek olarak, bir genom, bir kromozom ya da bunlarin bir bölümü) içerir. Sonuçta elde edilen bitki, bitki hücresi ya da bitki materyali böylece yapay olur ya da dogal olarak meydana gelmez. Buna göre, yapay ya da dogal olarak meydana gelmeyen bir bitki ya da bitki hücresi, ikinci bitki ya da bitki hücresi birinci bitki ya da bitki hücresinden farkli bir genetik geçmis içermesi kosuluyla (i) yapay olan ya da (ii) bir Ikinci bitkide ya da bitki hücresinde dogal olarak meydana gelen bir modifiye edilmis genetik sekans ile sonuçlanan, bir birinci yapay ya da dogal olarak meydana gelen bitkideki ya da bitki hücresindeki bir genetik sekansin modifiye edilmesi vasitasiyla yapilabilmektedir. Genetik arka plandaki farkliliklar, fenotipik farkliliklar ya da teknikte bilinen moleküler biyoloji teknikleriyle - nükleik asit sekanslamasi, genetik isaretleyicilerin varligi ya da yoklugu (örnek olarak, mikrosatellit RNA isaretleyicileri) - ile tespit edilebilir. Bir dizi polinükleotide dayali yöntem, bitkilerde gen ekspresyonunu arttirmak için kullanilabilmektedir. Bir örnek olarak transforme edilecek bitki ile uyumlu olan bir yapi, vektör ya da ekspresyon vektörü, bitkideki geni fazla eksprese edebilen bir yukari akis promotörü ile birlikte ilgili geni içerecek sekilde hazirlanabilmektedir. Örnek niteligindeki promotörler burada açiklanmaktadir. Transformasyonu takiben ve uygun kosullar altinda büyüdügü zaman promotör, bitkideki ya da bunun spesifik bir dokusundaki bu enzimin seviyelerini modüle etmek (örnegin arttirmak) için ekspresyonu tahrik edebilmektedir. Örnek niteliginde bir yapilanmada bir bitkide geni fazla eksprese etmek için izopropilmalat sentazi tasiyan bir vektör olusturulmaktadir. Vektör, izopropilmalat sentaz geninin yukari yönünde bitkinin bütün dokularinda kendi ekspresyonunu tahrik eden uygun bir promotör tasimaktadir. Vektör ayrica transforme edilmis kali ve hücre hatlarinin seçimini saglamak için antibiyotige dirençli bir gen tasiyabilmektedir. Bir yapilanmada promotör bir bitkinin trikomlarindaki transkripsiyonel aktiviteyi desteklemektedir. Bir yapilanmada promotör bir bitkinin trikomlarinda transkripsiyonel aktiviteye sahiptir. Baska bir yapilanmada promotör bir bitkinin herhangi baska bir parçasinda aktivite olmayan ya da büyük oranda olmaya bir bitkinin trikomlarinda spesifik olarak transkripsiyonel aktiviteye sahiptir. Uygun olarak promotör SEK ID NO: Side belirtilen sekans ya da dogal bir izopropilmalat sentaz promotör içermektedir, bunlardan olusmaktadir ya da esasen bunlardan olusmaktadir. Dogal izopropilmalat sentaz promotör, izopropilmalat sentaz geninin 5' ucuna yerlestirilecektir. Örnegin SEK ID NO:6'da endojen izopropilmalat sentaz promotör, nükleotit 2826'dan önce konumlandirilacaktir. Dolayisiyla izopropilmalat sentaz geni bir bitkinin trikomunda fazla eksprese edilebilmektedir. Sasirtici sekilde bulus sahipleri takip eden ekspresyonun trikoma özgü ekspresyon kullanarak erisilen seviyelerle karsilastirildiginda bu kadar yüksek bir birikme ile sonuçlanmadigini kesfetmistir (bkz. Sekil 4 ve açiklamasi). Bir yapilanmaya göre izopropilmalat sentazin ekspresyonu ya da aktivitesi, sükroz esterlerini içeren beta-metilvarili halihazirda üretebilen bir bitkide artmaktadir, böylelikle burada artan izopropilmalat sentaz birikimi ve artan sükroz ester üretimi içeren beta-metilvaril meydana gelmektedir. Baska bir yapilanmaya göre izopropilmalat sentazin ekspresyonu ya da aktivitesi, sükroz esterlerini içeren beta-metilvarili halihazirda üretemeyen bir bitkide artmaktadir, böylelikle burada azalan izopropilmalat sentaz birikimi ve azalan sükroz ester üretimi içeren beta-metilvaril meydana gelmektedir. Antisens RNA, ribozim ile yönlendirilmis RNA bölünmesi, transkripsiyon sonrasi gen susturulmasi, örnek olarak RNA enterferansi ve transkripsiyonel gen susturma dahil olmak üzere bir dizi polinükleotid bazli metodun bitkilerde gen ekspresyonunu inhibe ettigi bilinmektedir. Bu yaklasimlar gen ekspresyonunu azalmak ya da inhibe etmek için klasik olarak kullanilirken ayrica eksprese edilen proteinlerin hücresel verimliligini ve kalitesini arttirarak gen ekspresyonunu arttirmak için kullanilabilmektedir. Bu yaklasimlar apoptoz ile iliskili gen ekspresyonunun, protein glikosilasyon ile iliskili gen ekspresyonunun sustutulmasini, hücresel metabolizmaya dahil olan Iaktat dehidrojenazi ve gen amplifikasyonu için dihidrofolar refüktazi içermektedir. Diger yaklasimlar, bitki hücrelerinde gen regülasyonunu degistirmeye yönelik farkli hücresel yollara dahil olan birden çok hedefi azaltmayi ya da inhibe etmeyi kapsayabilmektedir. Bazi yapilanmalarda, tam uzunluktaki polinükleotidin ya da bunun bir fragmaninin bir tamamlayicisi kullanilabilir. Tipik olarak, bir fragman en az 10 bitisik nükleotit, örnek olarak en az10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 ya da daha fazla bitisik nükleotittir. Bir baska yapilanmada, polinükleotid fragman (fragmanlar), ekspresyonu ya da aktiviteyi azaltabilmekte ve bir antisens nükleik asidi, bir ribozimi, spliseozom aracili trans-bölünmeyi etkileyen bir RNA, bir enterferansçi RNA, bir kilavuz RNA, ya da baska translasyona tabi tutulmamis RNA ve benzeri kodlayabilmektedir. Bir baska yapilanmada, polinükleotit fragmani (fragmanlari) bir enterferansçi RNA'yi kodlamaktadir. izopropilmalat sentazin ekspresyonunu ya da aktivitesini azaltabilen bilesimler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, bir ya da daha fazla endojen izopropilmalat sentaz gen(ler)inin transkripsiyonuna müdahale edebilen sekansa özgü polinükleotidleri; izopropilmalat sentaz RNA transkriptlerinin (örnek olarak, çift zincirli RNA'Iar, mikroRNA, siRNA'lar, ribozimler) translasyonuna müdahale edebilen sekansa özgü polinükleotidler; izopropilmalat sentaz proteinlerinin stabilitesine müdahale edebilen sekansa özgü polipeptitler; izopropilmalat sentaz proteininin enzimatik aktivitesine ya da substratlara ya da düzenleyici proteinlere göre izopropilmalat sentaz proteininin baglanma aktivitesine müdahale edebilen sekansa özgü polinükleotidler; izopropilmalat sentaz proteini için spesifite sergileyen antikorlar; izopropilmalat sentaz proteininin stabilitesine ya da izopropilmalat sentaz proteininin enzimatik aktivitesine ya da izopropilmalat sentaz proteininin baglanma aktivitesine müdahale edebilen küçük molekül bilesikleri; izopropilmalat sentaz polinükleotitine baglanan çinko parmak proteinleri; ve izopropilmalat sentaz polinükleotide dogru aktiviteye sahip meganükleazlar içerir. Antisens teknolojisi, bir polipeptidin ekspresyonunu modüle etmek (örnek olarak azaltmak ya da inhibe etmek) için kullanilabilen iyi bilinen bir yöntemdir. Baskilanacak bir polinükleotit klonlanir ve RNA 'nin antisens ipligi kopyalanacak sekilde bir düzenleyici bölge ve bir transkripsiyon sonlandirma sekansina islevsel olarak baglanir. Rekombinant yapi daha sonra bitkilere dönüstürülür ve RNA 'nin antisens ipligi üretilir. Polinükleotit, baskilanacak olan genin tüm sekansi olmak zorunda degildir, fakat tipik olarak, baskilanacak olan genin sens dizgisinin en azindan bir kismina esas olarak tamamlayici olacaktir. Bir polinükleotit, bir mRNA 'nin ekspresyonunu etkileyen bir ribozim ya da katalitik RNA 'ya kopyalanabilir. Ribozimler, herhangi bir hedef RNA ile spesifik olarak eslesmek ve fosfodiester omurgasini belirli bir yerde parçalamak, böylece de hedef RNA 'yi islevsel olarak etkisiz hale getirmek üzere tasarlanabilir. Heterolog polinükleotidler, belirli mRNA transkriptlerini parçalamak ve böylece de bir polipeptidin ekspresyonunu önlemek için tasarlanmis ribozimleri kodlayabilir. Çekiç basi ribozimler, belirli mRNA 'lari yok etmek için yararlidir, ancak bölgeye özgü tanima sekanslarinda mRNA 'yi parçalayan çesitli ribozimler kullanilabilir. Çekiç basi ribozimler, mRNA 'lari, hedef mRNA ile tamamlayici taban çiftlerini olusturan yan bölgeler tarafindan dikte edilen yerlerde kistirir. Tek gereksinim, hedef RNA 'nin bir 5'-UG-3 'nükleotit sekansi içermesidir. Çekiç basi ribozimlerin yapimi ve üretimi teknikte bilinmektedir. Çekiç basi ribozim sekanslari, in vivo klevaj verimliligini arttirmak için bir tasiyici RNA (tRNA) gibi stabil bir RNA içine gömülebilir. Bir yapilanmada RNA transkript(ler)inin translasyonuna müdahale edebilen sekansa özgü polinükleotitler enterferansçi RNA'dir. RNA enterferansi ya da RNA susturma spesifik mRNA 'larin enzimatik degradasyon için hedefleyebildigi evrimsel olarak korunmus bir islemdir. Çift sarmalli bir RNA (çift sarmalli RNA) enterferansçi RNA yolunu baslatmak için bir hücre (örnek olarak, çift sarmalli RNA virüsü ya da enterferansçi RNA polinükleotidler) tarafindan dahil edilmeli ya da üretilmelidir. Çift sarmalli RNA, çift sarmalli RNA'ya özgü endonükleazlar ("Dicer") olan RNaz III tarafindan 21-23 bp uzunlukta birden çok siRNA dupleksine dönüstürülebilir. Küçük enterferansçi RNA'Iar sonrasinda bir ATP bagimi islem araciligiyla küçük enterferansçi RNAtnin açilmasini baslatan RNA indüklü susturma kompleksleri tarafindan ayirt edilebilir. Küçük enterferansçi RNA'nin sarilmamis antisens sarmali, aktive edilmis RNA indüklü susturma komplekslerini küçük enterferansçi RNA anti-sens sarmalina tamamlayici bir sekans içeren hedeflenmis mRNA'ya yönlendirmektedir. Hedeflenen mRNA ve anti-sens sarmali bir A-formlu helezon olusturabilir ve A-formlu helezonun esas oyugu aktive edilmis RNA indüklü susturma kompleksleri tarafindan ayirt edilebilir. Hedef mRNA, küçük enterferansçi RNA sarmalinin 5' ucunun baglanma alani tarafindan tanimlanan tek bir bölgede aktive edilmis RNA indüklü susturma kompleksleri tarafindan yarilabilir. Aktive edilmis RNA indüklü susturma kompleksleri baska bir klevaj durumunu katalize etmek için geri dönüstürülebilir. Enterferansçi RNA ekspresyon vektörleri, mRNA'Iarin, pre-mRNA'larin ya da ilgili RNA varyantlarinin ekspresyon seviyesini azaltarak enterferansçi RNA polinükleoititlerini kodlayan enterferansçi RNA yapilarini içerebilmektedir. Ekspresyon vektörleri ayrica burada tarif edilmis oldugu üzere bir enterferansçi RNA yapisinin yukari kismina yerlestirilen ve faal olarak buraya baglanan bir promotör içerebilir. Enterferansçi RNA ekspresyon vektörleri uygun bir minimal çekirdekli promotör, bir ilgili enterferansçiRNA yapisi, transkripsiyon sonlandirma ve poliadenilasyon sinyallerini içeren bir yukari yönde (5') regülatör bölge, bir asagi yönde (3`) regülatör bölge ve çesitli seçim markerleri gibi teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen diger sekanslari içerir. NtTS polinükleotitleri, çift sarmalli yapilar (yani, bir antisens iplik ve bir tamamlayici sens ipligi içeren çift sarmalli bir RNA molekülü), çift sarmalli saç tokasi benzeri yapilar ya da tek sarmalli yapilar (yani, sadece bir antisens iplik içeren bir tek sarmalli RNA molekülü) dahil olmak üzere çesitli formlarda üretilebilir. Yapilar, kendi kendini tamamlayici ve antisens ipliklere sahip bir dubleks, asimetrik dubleks, saç tokasi ya da asimetrik saç tokasi ikincil yapi içerebilir. Çift sarmalli enterferansçi RNA, çift sarmalli küçük enterferansçi RNA'lara enzimatik olarak çevrilebilmektedir. Küçük enterferansçi RNA dupleksinin sarmallarinin biri hedef mRNA içindeki bir tamamlayici sekansa ve iliskili RNA varyantlarina birlesebilir. Enterferansçi RNA/mRNA dupleksleri sekansa bagli bir sekilde birçok alanda RNAylari yarabilen RNA indüklü susturma kompleksleri tarafindan ayirt edilmektedir, bu da hedef mRNA'nin ve iliskili RNA varyantlarinin degradasyonuyla sonuçlanir. Çift sarmalli RNA molekülleri, bir kök-döngü yapisinda bir tek oligonükleotitten birlestirilmis küçük enterferansçi RNA molekülleri içerebilmekte olup, burada küçük enterferansçi RNA molekülünün kendiliginden tamamlayici sens ve antisens bölgeleri bir polinükleotit bazli ya da polinükleotid bazli olmayan baglayici(lar)in yani sira, iki ya da daha fazla ilmek yapisina ve kendi kendini tamamlayici sens ve antisens ipliklerini içeren bir sapa sahip dairesel tek sarmalli RNA tarafindan baglanmakta olup, içerisinde dairesel RNA RNAI 'yi yöneltebilen bir aktif küçük enterferansçi RNA molekülü üretmek amaci ile in vivo ya da invitro islenebilir. Küçük saç tokasi RNA moleküllerinin kullanimi da ayrica burada düsünülmüstür ve tipik olarak bir aralayici ya da döngü sekansi ile ayrilan ters tamamlayici (sens) sekansina ek olarak spesifik bir antisens sekansi içerir. Ara parçanin ya da ilmigin yarilmasi tek sarmalli bir RNA molekülü ve bunun ters tamamlayicisini saglamakta olup, böylece bunlar çift sarmalli bir RNA molekülü olusturacak sekilde (istege bagli olarak her iki ipligin ya da bunlardan birinin 3' ucuna ya da 5' ucuna bir, iki, üç ya da daha fazla nükleotidin ilave edilmesi ya da buralardan çikarilmasi ile sonuçlanabilen ilave isleme adimlari ile birlikte) birlesirler. Aralayici, antisens ve sens sekanslarinin, ara parçanin ayrilmasindan (her iki ipligin ya da bunlardan birinin 3' ucuna ya da 5' ucuna bir, iki, üç ya da daha fazla nükleotidin ilave edilmesi ya da buralardan çikarilmasi ile sonuçlanabilen sonradan gelen islem adimlarindan) önce birlesmesine ve çift- sarmalli bir yapi (ya da sap) olusmasina izin vermek için yeterli bir uzunluga sahip olabilir. Aralayici sekans tipik olarak iki tamamlayici nükleotit sekans bölgesi arasinda yer alan iliskisiz bir nükleotit sekansi olup, bu bir çift Zincirli polinükleotit içine birlestigi zaman bir küçük saç tokasi RNA içerir. Aralayici sekansi genellikle yaklasik 3 ile yaklasik 100 arasinda nükleotit içerir. Herhangi bir ilgili RNA polinükleotit, NtTS saç tokasi dupleksini üretmek için uygun bir sekans bilesiminin, döngü büyüklügünün ve gövde uzunlugunun seçilmesi vasitasiyla üretilebilir. Bir saç tokasi dupleksinin gövde uzunluklarini dizayn etmek için uygun bir aralik en az yaklasik 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ya da 20 nükleotitlik - örnek olarak yaklasik 14-30 nükleotit, yaklasik 30-50 nükleotit, yaklasik 50-100 nükleotit, yaklasik 100-150 nükleotit, yaklasik 150-200 nükleotit, yaklasik 200-300 nükleotit, yaklasik 300-400 nükleotit, yaklasik 400-500 nükleotit, yaklasik 500-600 nükleotit ve yaklasik 600-700 nükleotit gövde uzunluklarini içerir. Bir saç tokasi dupleksinin döngü uzunluklarinin dizayn edilmesi için uygun bir aralik, eger saç tokasinin gövde uzunlugu temel ise yaklasik 4-25 nükleotitlik, yaklasik 25-50 nükleotitlik ya da daha uzun döngü uzunluklari içerir. Belirli yapilanmalarda çift sarmalli bir RNA ya da tek sarmalli RNA molekülü, uzunluk olarak yaklasik 15 ile yaklasik 40 nükleotid arasindadir. Belirli yapilanmalarda küçük enterferansçi RNA molekülü, uzunluk olarak yaklasik 15 ile yaklasik 35 nükleotid arasinda olan bir çift sarmalli RNA ya da tek sarmalli RNA olabilmektedir. Küçük enterferansçi RNA molekülü, uzunluk olarak yaklasik 17 ile yaklasik 30 nükleotid arasinda olan bir çift sarmalli RNA ya da tek sarmalli RNA olabilmektedir. Küçük enterferansçi RNA molekülü, uzunluk olarak yaklasik 19 ile yaklasik 25 nükleotid arasinda olan bir çift sarmalli RNA ya da tek sarmalli RNA olabilmektedir. Küçük enterferansçi RNA molekülü, uzunluk olarak yaklasik 21 ile yaklasik 23 nükleotid arasinda olan bir çift sarmalli RNA ya da tek sarmalli RNA olabilmektedir. 21 nükleotitten daha uzun dupleks haline getirilmis bölgelere sahip saç tokasi yapilari, döngü sekansi ve uzunluguna bakilmaksizin etkili küçük enterferansçi RNA'ya yönelik susturmayi baslatabilir. Hedef mRNA sekansi uzunluk açisindan yaklasik 14 ile yaklasik 50 nükleotid arasindadir. Bu nedenle, hedef mRNA tercihen bir hedef sekansi için asagidaki kriterlerin bir ya da daha fazlasini karsilayan uzunluk olarak yaklasik 14 ile yaklasik 50 nükleotit arasinda olan bölgeler için taranabilir: yaklasik 2:1 ile 122 arasinda bir A+T/G+C orani; hedef sekansin 5' ucunda bir AA dinükleotit ya da bir CA dinükleotit; hedef mRNA 'ya özgü olan en az 10 ardisik nükleotitlik bir sekans (yani sekans ayni bitkiden baska mRNA sekanslari içerisinde bulunmaz); ve üçten fazla ardisik guanin (G) nükleotiti ya da üçten fazla ardisik sitozin (C) nükleotiti içeren bir "dizi" içermemek. Bu kriterler, teknikte bilinen çesitli teknikler kullanilarak degerlendirilebilir, örnek olarak, BLAST gibi bilgisayar programlari, seçilen hedef dizinin hedef mRNA 'ya özgü olup olmadigini belirlemek için kamuya açik veritabanlarini aramak amaci ile kullanilabilir. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen bilgisayar yazilimi (örnek olarak, ticari olarak temin edilebilen OIigoEngine, Target Finder ve siRNA Tasarim Araci) kullanilarak bir hedef dizi (ve bir küçük enterferansçi RNA sekansi) seçilebilmektedir. Yukaridaki kriterlerin birini ya da daha fazlasini karsilayan, uzunluk olarak yaklasik 14 ve yaklasik 30 arasinda olan hedef mRNA sekanslari seçilebilmektedir ya da hedef sekanslar yukaridaki kriterlerin birini ya da daha fazlasini karsilayan, uzunluk olarak yaklasik 16 ve yaklasik 30 nükleotit arasinda olanlardan seçilmektedir. Yukaridaki kriterlerin bir ya da daha fazlasini karsilayan uzunluk olarak yaklasik 19 ile yaklasik 30 nükleotit arasinda olan hedef sekanslar seçilir. Yukaridaki kriterlerin bir ya da daha fazlasini karsilayan uzunluk olarak yaklasik 19 ile yaklasik 25 nükleotit arasinda olan hedef sekanslar seçilir. Küçük enterferansçi RNA molekülleri, burada açiklanan polinükleotit sekanslarinin herhangi birinin en az 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ya da daha fazla ardisik nükleotitine tamamlayici olan spesifik bir antisens sekansi içerebilmektedir. Küçük enterferansçi RNA molekülü tarafindan olusturulan spesifik antisens sekansi, hedef sekansin tamamlayicisi ile özdes ya da büyük ölçüde ayni olabilir. Bir yapilanmada, küçük enterferansçi RNA molekülü tarafindan olusturulan spesifik antisens sekansi, hedef mRNA sekansinin tamamlayicisiyla en az yaklasik %75, %80, %85, %90, %95, %96, %97, %98, %99 ya da %100 özdestir. Sekans özdesligini tespit etme yöntemleri teknikte bilinmektedir ve örnek olarak Wisconsin Computer Group Üniversitesi (GCG) yaziliminin BLASTN programi kullanilarak tespit edilebilir ya da NCBI web sitesinde saglanabilir. Küçük enterferansçi RNA moleküllerinin spesifik antisens sekansi, hedef mRNA sekansindan bir, iki, üç, dört ya da daha fazla nükleotitte farklilasarak (örnek olarak, geçis ya da transformasyon dahil olmak üzere nükleotit ikamesiyle) degiskenlik gösterebilir. Çift sarmalli bir RNA molekülünün antisens zincirinde bu tür nükleotit ikameleri mevcut oldugunda, ikame edilmis nükleotidin tipik olarak hidrojen bagi baz eslesmesini olusturacagi sens iplikçikteki tamamlayici nükleotit uygun sekilde ikame edilebilir veya olmayabilir. Sens sekansinda bir ya da daha fazla nükleotit ikamesinin meydana geldigi fakat antisens sarmalda bulunmayan çift zincirli RNA molekülleri de düsünülmüstür. Bir küçük enterferansçi RNA molekülünün antisens sekansi yukarida tarif edilmis oldugu üzere küçük enterferansçi RNA'nin nükleotit sekansi ve hedef nükleotid sekansi arasinda bir ya da daha fazla uyumsuzluk içerdigi zaman, uyumsuzluklar antisens sekansinin 3' uç, 5' üç ya da merkezi kisimda bulunabilir. Bir baska düzenlemede küçük enterferansçi RNA molekülleri kati kosullar altinda seçici olarak dogal olarak bulunan bir hedef genin ya da hedef mRNA 'nin bir kismina selektif olarak melezlenebilen spesifik bir antisens sekansini içerir. Teknikte uzman kisilerce bilindigi gibi melezleme kosullarinin sikiligindaki degisiklikler, melezleme ve yikama asamalari için kullanilan çözeltilerin zamanini, sicakligini ya da konsantrasyonunu degistirerek elde edilebilir. Uygun kosullar ayrica kismen kullanilan belirli nükleotit sekanslarina, örnek olarak hedef mRNA ya da gen sekansina da bagli olabilir. Bitkilerde çift sarmalli RNA-susturmanin indüklenmesi için bir yöntem, saç tokasi RNA üreten bir gen yapisi ile dönüsümdür (bkz. Smith ve dig. (2000) Nature, 407, 319-320). Bu tür yapilar uygun bir aralayici ile ayrilan hedef gen sekansinin ters bölgelerini içerir. Bir fonksiyonel bitki intron bölgesinin bir aralayici fragman olarak ilave edilmesi, intron ilave edilmis bir saç tokasi RNA 'nin üretilmesine bagli olarak gen susturma indüksiyonunun etkinligini arttirir (Wesley ve dig. (2001) Plant J., 27, 581-590). Uygun olarak, gövde uzunlugu yaklasik 50 nükleotit ile yaklasik 1 kilobaz uzunlugundadir. Intron ilave edilmis saç tokasi RNA 'yi üretmek için yöntemler, teknikte iyi bir sekilde tarif edilmistir (bkz. örnek olarak Bioscience, Biotechnology and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617). Dubleks ya da çift sarmalli bir yapiya, örnegin çift sarmalli RNA`ya ya da küçük saç tokasi RNA'ya sahip enterferansçi RNA molekülleri, kunt uçlara sahip olabilir ya da 3 'ya da 5' çikintilarina sahip olabilir. Burada kullanilmis oldugu üzere "çikinti", bir RNA iplikçiginin 3'- terminali diger iplikçigin 5'-terminalinden daha fazla uzandiginda dubleks bir yapidan çikinti yapan eslenmemis nükleotit ya da nükleotitlere karsilik gelir (3 'çikintisi) ya da tam tersi de geçerlidir. (5 'çikintisi). Çikintiyi içeren nükleotitler ribonükleotitler, deoksiribonükleotitler ya da bunlarin modifiye edilmis versiyonlari olabilir. Bir yapilanmada enterferansçi RNA molekülünün en az bir seridi, yaklasik 1 ile yaklasik 6 nükleotit uzunlugunda bir 3' çikintisina sahiptir. Diger yapilanmalarda 3 'çikintisi, yaklasik 1 ile yaklasik 5 nükleotit, yaklasik 1 ile yaklasik 3 nükleotit ve yaklasik 2 ile yaklasik 4 nükleotid uzunlugundadir. Enterferansçi RNA molekülü, molekülün bir ucunda bir 3' çikintisi içerdiginde, diger uç, kunt uçlu olabilir ya da ayrica bir çikintiya (5' ya da 3 ') sahip olabilir. Enterferansçi RNA molekülü, molekülün her iki ucunda bir çikinti içerdiginde, çikintilarin uzunlugu ayni ya da farkli olabilir. Bir yapilanmada enterferansçi RNA molekülü, molekülün her iki ucunda yaklasik 1 ile yaklasik 3 nükleotitten 3' çikinti içerir. Baska bir yapilanmada enterferansçi RNA molekülü, molekülün her iki ucunda 2 nükleotidin 3' çikintisina sahip olan çift sarmalli bir RNA'dir. Yine baska bir yapilanmada, enterferansçi RNA'nin çikintisini içeren nükleotitler TT dinükleotitleri ya da UU dinükleotitleridir. Hedef mRNA sekansina bir ya da daha fazla çikinti içeren enterferansçi RNA molekülünün özdeslik yüzdesini belirlerken, çikinti(lar) dikkate alinabilir ya da dikkate alinmayabilir. Örnek olarak çift zincirin bir 3' çikintisindan nükleotitler ve 5' ya da 3'-ucundan 2 'ye kadar nükleotit küçük enterferansçi RNA molekülünün önemli ölçüde etkinlik kaybi olmaksizin modifiye edilebilir. Enterferansçi RNA molekülleri, bir ya da daha fazla 5' ya da 3'-kep yapisi içerebilir. Enterferansçi RNA molekülü, sense iplikçigin 3'-ucunda, antisens iplikte ya da hem sens hem de antisens ipliklerinde; ya da sens iplikçigin 5'-ucunda, antisens iplikçikte ya da RNAi molekülünün hem sens hem antisens Iplikçiklerinde bir kep yapisi içerebilir. Alternatif olarak, enterferansçi RNA molekülü, RNAi molekülünün hem 3' ucu hem de 5' ucunda bir kep yapisi içerebilir. "Kep yapisi" terimi, bir oligonükleotitin ucunda yer alan, molekülü eksonükleaz bozunmasindan koruyan ve ayrica bir hücre içinde dagitim ya da lokalizasyonu kolaylastirabilen bir kimyasal modifikasyonu ifade eder. Enterferansçi RNA moleküllerine uygulanabilen bir baska modifikasyon, enterferansçi RNA molekülünün aktivitesini, hücresel dagilimini, hücresel alimini, biyoyararlanimini ya da stabilitesini arttiran bir ya da daha fazla parçanin ya da konjugenin enterferansçi RNA molekülünün kimyasal baglantisidir. Polinükleotidler, teknikte iyi bilinen yöntemlerle sentezlenebilir ya da modifiye edilebilir. Kimyasal modifikasyonlar 2' modifikasyonlariyla, dogal olmayan bazlarin dahil edilmesiyle, bir Iiganda kovalent eklenmeyle ve tiyofosfat baglari ile fosfat baglarinin yer degistirmesiyle sinirli olmaksizin bunlari içerebilir. Bu yapilanmada dupleks yapinin bütünlügü en azindan bir ve tipik olarak iki kimyasal bag ile güçlendirilir. Kimyasal baglanma teknikte iyi bilinen çesitli tekniklerle, örnegin kovalent, iyonik veya hidrojen baglarinin dahil edilmesi; hidrofobik etkilesimler, van der Waals veya biriktirme etkilesimleri vasitasiyla; metal-iyon koordinasyonu veya purin analoglarinin kullanimi araciligiyla gerçeklestirilebilir. Yine baska bir yapilanmada iki sarmalin birinde veya ikisindeki nükleotitler hücresel enzimlerin örnegin kisitlama olmadan belirli nükleazlarin aktivasyonunu engellemek veya inhibe etmek için modifiye edilebilir. Hücresel enzimlerin aktivasyonunu düsürmek ya da inhibe etmek için teknikler teknikte bilinmekte olup, 2,-amino modifikasyonlari, 2'-floro modifikasyonlar, 2'-alkil modifikasyonlari, yüklenmemis omurga modifikasyonlarini, morfolino modifikasyonlarini, 2'-O- metil modifikasyonlarini ve fosforamidat içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Dolayisiyla bir çift iplikçikli RNA üzerindeki nükleotitlerin en az bir 2'-hidr0ksi grubu bir kimyasal grupla ikame edilir. Ayrica en az bir nükleotit kilitlenmis bir nükleotit olusturmak için modifiye edilebilir. Bu kilitlenmis nükleotit ribozun 2'-oksijeni ile ribozun 4'-karbonunu baglayan bir metilen ya da etilen köprüsü içerir. Kilitli nükleotitin bir oligonükleotit içine dahil edilmesi, tamamlayici sekanslara yönelik afiniteyi gelistirir ve erime sicakligini birkaç derece arttirir. Ligandlar, örnek olarak hücresel emilimini arttirmak için bir enterferansçi RNA molekülüne konjuge edilebilir. Belirli yapilanmalarda bir hidrofobik Iigand hücresel membrana dogrudan nüfuzu kolaylastirmak için moleküle konjuge edilir. Bu yaklasimlar antisens oligonükleotitlerin hücre nüfuzunu kolaylastirmak için kullanilmistir. Belirli durumlarda bir katyonik Iigandin oligonükleotitlere konjugasyonu siklikla nükleaza karsi gelismis dirençle sonuçlanir. Katyonik Iigandlara iliskin temsili örnekler propilamonyum ve dimetilpropilamonyumu içerir. Anti-sens oligonükleotitler, katyonik Iigand oligünükleotit boyunca dagildigi zaman mRNA 'ya karsi yüksek baglanma afinitelerini muhafaza edebilir. Bir yapilanmaya göre izopropilmalat sentazin ekspresyonu ya da aktivitesi, sükroz esterlerini içeren beta-metilvarili halihazirda üretebilen bir bitkide artmaktadir, böylelikle burada artan izopropilmalat sentaz birikimi ve artan sükroz ester üretimi içeren beta-metilvaril meydana gelmektedir. Burada tarif edilen moleküller ve nükleotitler, iyi bilinen kati faz sentezi teknikleri kullanilmak sureti ile hazirlanabilir. Teknikte bilinen böyle bir sentez için baska herhangi bir araç da ek olarak ya da alternatif olarak kullanilabilir. Çesitli yapilanmalar, bir ya da daha fazla polinükleotitin ya da bir ya da daha fazla polinükleotiti içeren enterferansçi RNA yapilari içeren NtTS ekspresyon vektörlerine yöneliktir. Çesitli yapilanmalar, bir ya da daha fazla polinükleotit ya da bir ya da daha fazla enterferansçi RNA yapisi içeren ekspresyon vektörlerine yöneliktir. Çesitli yapilanmalar, bir ya da daha fazla polinükleotidi ya da bir ya da daha fazla enterferansçi RNA polinükleotitini kodlayan bir ya da daha fazla enterferansçi RNA yapisi içeren ekspresyon vektörlerine yönelik olup, bunlar bir saç tokasi yapisini olusturmak için kendi kendine tavlama kabiliyetine sahip olup, içerisinde bu yapi, (a) bir ya da daha fazla NtTS içerir polinükleotit; (b) saç tokasi yapisinin bir halkasini olusturan bir aralayici elemani kodlayan ikinci bir sekans; ve (c) birinci sekans ile ayni yönde konumlandirilan birinci sekansin bir ters tamamlayici sekansini içeren bir üçüncü sekans içermekte olup, burada ikinci sekans, birinci sekans ve üçüncü sekans arasinda konumlandirilir ve ikinci sekans, islevsel olarak birinci sekansa ve üçüncü sekansa baglantilidir. Tarif edilmis olan sekanslar saç tokasi yapilari olusturmayan çesitli polinükleotitlerin yapilmasinda kullanilabilir. Örnek olarak bir çift sarmalli RNA (1) DNA'nin bir birinci iplikçiginin bir birinci promotöre faal olarak baglanmasi vasitasiyla transkribe edilmesi ve (2) DNA`nin birinci sarmalinin ters tamamlayici sekansinin bir ikinci promotöre faal olarak baglanmasi vasitasiyla transkribe edilmesi araciligiyla olusturulabilir. Polinükleotitin her bir sarmali ayni ekspresyon vektöründen ya da farkli ekspresyon vektörlerinden transkribe edilebilir. RNA enterferans aktivitesine sahip olan RNA dupleksi, RNA seviyelerini azaltmak için küçük enterferansçi RNAilara enzimatik olarak çevrilebilir. Bu nedenle çesitli yapilanmalar, polinükleotit ya da enterferansçi RNA polinükleotitlerini kodlayan enterferansçi RNA yapisi içermekte olup, bunlar kendi kendine yeniden birlesebilmekte olup, içerisinde bu yapi (a) burada tarif edilmis olan polinükleotidlerden birini ya da daha fazlasini; ve (b) birinci sekans ile ayni yönde konumlandirilan birinci sekansin tamamlayici (örnek olarak, ters tamamlayici) bir sekansini içeren ikinci bir sekans içerir. en ekspresyonunun birlikte baskilanmasinin desteklenmesi vasitasiyla izopropilmalat sentazin ekspresyon seviyelerini azaltmak için çesitli bilesimler ve yöntemler saglanir. Ko-supresyon fenomeni bir transgenin birden çok kopyasinin bir bitki hücresi konagina dahil edilmesinin bir sonucu olarak ortaya çikar. Bir transgenin birden çok kopyasinin entegrasyonu transgenin ve hedeflenen endojen genin azalan ekspresyonu ile sonuçlanabilir. Ko-supresyon derecesi, transgen ve hedeflenen endojen gen arasindaki sekans özdesliginin derecesine baglidir. Hem endojen genin hem de transgenin susturulmasi, transkripsiyonu engelleyen susturulmus lokuslarin (baska bir deyisle, endojen promotör ve ilgili endojen gen) kapsamli metilasyonu vasitasiyla meydana gelebilir. Alternatif olarak bazi durumlarda endojen genin ve transgenin ko-supresyonu post transkripsiyonel gen susturma vasitasiyla meydana gelebilmekte olup, burada transkriptler üretilebilir ancak artan degradasyon oranlari transkriptlerin birikmesini engeller. Post-transkripsiyonel gen susturma vasitasiyla birlikte baskilamaya yönelik mekanizmanin RNA bu islemlerde hem önemli bir promotör hem de bir hedef olarak görüldügünden dolayi RNA enterferansini andirdigi düsünülmektedir ve buna en azindan kismen ayni moleküler makine düzeni, muhtemelen mRNA'Iarin RNA yönlü degradasyonu aracilik eder. Nükleik asitlerin birlikte baskilanmasina nükleik asidin ya da bunun fragmanlarinin birden çok kopyasinin ilgili bir bitkinin genomu içine transgenler olarak entegre edilmesi vasitasiyla erisilebilir. Konak bitki, nükleik aside ya da bunun fragmanlarina faal olarak baglanan bir promotör içeren bir ekspresyon vektörü ile çevrilebilir. Çesitli yapilanmalar, bir polinükleotite islevsel olarak bagli bir promotör içeren NtTS 'nin endojen genlerinin yon vektörlerine yöneliktir. Mutant polinükleotitleri ve polipeptitleri elde etmek için yöntemler da ayrica saglanmistir. Bir bitki hücresi ya da bitki materyali dahil olmak üzere ilgili herhangi bir bitki, mutagenezi indükledigi bilinen, çesitli yöntemlerle genetik olarak modifiye edilebilmekte olup, bunlar arasinda bölgeye yönelik mutagenez, oligonükleotid-yönelimli mutagenez, kimyasal olarak indüklenen mutagenez, isimayla uyarilan mutagenez, modifiye bazlari kullanan mutagenez, bosluklu dupleks DNA kullanan mutagenez, çift sarmalli kopma mutagenezi, onarim-hatali konak türleri kullanan mutagenez, total gen sentezi ile mutagenez, DNA karilmasi ve diger esdeger yöntemler kullanilarak mutajenez bulunmaktadir. Alternatif olarak genler, transpozonlarin (örnek olarak IS elemanlarinin) ilgili bitkilerin genomlarina dahil edilmesi vasitasiyla inaktivasyon için hedeflenebilir. Bu mobil genetik elemanlar cinsel çapraz tozlama araciligiyla dahil edilebilir ve insersiyon mutantlari aktivitesindeki kayip, örnek olarak azalan kadmiyum tasimasi için taranabilir. Bir ana bitkideki bozulan gen, ana bitkinin transpozon indüklü mutageneze tabi olmayan bitkiyle örnek olarak cinsel çapraz tozlama vasitasiyla çaprazlanmasi ile diger bitkilere dahil edilebilir. Teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen herhangi bir standart üreme teknigi kullanilabilir. Bir uygulamada bir veya daha fazla gen, bir veya daha fazla tasiyicinin eklenmesi vasitasiyla inaktive edilebilir. Mutasyonlar bir veya daha fazla geninin homozigot parçalanmasiyla, bir veya daha fazla NtMRP geninin heterozigot parçalanmasiyla veya eger birden fazla gen parçalanmissa hem homozigot hem de heterozigot parçalanmalarin bir kombinasyonuyla sonuçlanabilir. Uygun transpoze edilebilir elemanlar retrotranspozonlari, retropozonlari ve SINE benzeri elemanlari içermektedir. Bu yöntemler, teknikte uzman kisilerce bilinmektedir. Alternatif olarak genler kendi kendini yarabilen ve bitkilerde replikasyon yapabilen küçük dairesel RNAilardan türetilen ribozomlarin dahil edilmesi vasitasiyla inaktivasyon için hedeflenebilir. Bu RNA'lar gerek tek basina (viroid RNA'Iar) gerekse bir yardimci virüsle (uydu RNA'Iar) çogaltilabilir. Uygun RNA'lara iliskin örnekler avocado sunblotch viroidden türetilenleri ve tütün ringspot virüsü, Iucerne transient streak virüsü, velvet tütün mottle virüsü, solanum nodiflorum mottle virüsü ve subterranean clover mottle virüsünden türetilen uygun RNA'Iari içerir. Çesitli hedef RNA 'ya özgü ribozomlar teknikte uzman kisiler tarafindan bilinmektedir. Bazi yapilanmalarda bir izopropilmalat sentaz polipeptidin ekspresyonu, bir gende bir mutasyon olusturmak gibi transjenik olmayan araçlar vasitasiyla modüle edilebilmektedir. Bir gen sekansinda rastgele bir mutasyonu ortaya koyan yöntemler, kimyasal mutagenez, EMS mutagenezi ve radyasyon mutagenezini içerebilir. Bir hücrenin içine bir ya da daha fazla hedeflenmis mutasyonu getiren yöntemler, genom düzenleme teknolojisi, özellikle çinko parmak nükleaz aracili mutagenez, yuvarlanma (genomlarda lokal endüklenmis lokal lezyonlari hedefleme), homolog rekombinasyon, oligonükleotid-yönelimli mutagenez ve meganükleaz aracili mutagenez içerir. Bazi sinirlayici olmayan mutasyon örnekleri en az bir nükleotidin, tek nükleotit polimorfizmlerinin ve basit bir sekansin tekrarinin silinmesi, eklenmesi ve missens mutasyonlaridir. Mutasyondan sonra, erken durdurma kodonlari ya da fonksiyonel olmayan genler olusturan silmeleri tanimlamak için tarama yapilabilir. Mutasyondan sonra yüksek seviyelerde eksprese edilebilen fonksiyonel genler olustuan mutasyonlari tanimlamak için tarama yapilabilmektedir. Mutantlarin taranmasi, sekanslama ile ya da gene ya da proteine özgü bir ya da daha fazla prob ya da primerin kullanilmasiyla gerçeklestirilebilir. Polinükleotitlerdeki spesifik mutasyonlar da ayrica olusturulabilmekte olup, bunlar gen ekspresyonunun azalmasi, mRNA 'nin stabilitesinin azaltilmasi ya da proteininin stabilitesinin azalmasiyla sonuçlanabilir. Bu tür bitkiler burada mutant bitkiler olarak adlandirilir. Mutant bitkiler, azaltilmis polipeptit seviyeleri ile sonuçlanan bir ya da daha fazla mutasyonun herhangi bir kombinasyonuna sahip olabilir. Örnegin mutant bitkiler, tek bir gende tek bir mutasyona; tek bir gende birden çok mutasyona; iki ya da daha fazla ya da üç ya da daha fazla gende tek bir mutasyona ya da iki ya da daha fazla ya da üç ya da daha fazla gende birden çok mutasyona sahip olabilmektedir. Buna göre, mutant polipeptit varyantlarini içeren mutant bitkiler açiklanmaktadir. Bir yapilanmada, bitkilerden tohumlar mutajenize edilir ve daha sonra birinci nesil mutant bitkilere büyütülebilir. Ilk nesil bitkilerin daha sonra kendi kendine tozlasmalarina izin verilir ve birinci nesil bitkiden elde edilen tohumlar, daha sonra kendi Iokuslarinda mutasyonlar için taranan ikinci nesil bitkilere büyütülebilir. Mutasyona ugratilmis bitki materyali mutasyonlar için taranabilmesine ragmen, ikinci nesil bitkilerin taranmasinin bir avantaji, tüm somatik mutasyonlarin, germ hatti mutasyonlarina karsilik gelmesidir. Teknikte uzman bir kisi, tohumlar, polen, bitki dokusu ya da bitki hücreleri dahil ancak bunlarla sinirli olmamak kaydi ile çesitli bitki materyallerinin, mutant bitkilerini olusturmak için mutajenize edilebilecegini anlayacaktir. Bununla birlikte, mutajenize edilmis bitki materyalinin türü, bitki nükleik asidinin mutasyonlar için elendiginde etkileyebilir. Örnek olarak, polen, mutasyona ugramamis bir bitkinin polinasyonu öncesinde mutajeneze tabi tutuldugunda, bu tozdan kaynaklanan tohumlar, birinci nesil bitkilere büyütülür. Birinci nesil bitkilerin her hücresi, polende meydana gelen mutasyonlari içerecektir; böylelikle, bu birinci nesil bitkiler daha sonra ikinci jenerasyona kadar beklemek yerine mutasyonlari için elenebilir. Mutasyonlari olusturmak için nokta mutasyonlari, kisa delesyonlar, eklemeler, transversiyonlar ya da kimyasal mutajenler ya da radyasyon dahil olmak üzere geçisler olusturan mutajenler kullanilabilir. Mutajenler, etil metansülfonat, metilmetan sülfonat, N-etil-N-nitrozüre, trietilmelamin, N-metiI-N-nitrozorea, prokarbazin, klorambusil, siklofosfamid, dietil sülfat, akrilamid monomer, melfalan, nitrojen hardal, vinkristin, dimetilnitrozamin, N-metiI-N'-nitro- Nitrosoguanidin, nitrosoguanidin, 2-aminopurin, 7,12 dimetiI-benz(a)antrasen, etilen oksit, heksametilfosforamid, bisülfan, diepoksialkan (diepoksikutan), diepoksibütan ve benzerleri), 2- metoksi-ö-kloro-Q [3-(etiI-2-kloro-etil) aminopropilamino] akridin dihidroklorür ve formaldehit içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Mutajenin dogrudan neden olmayabildigi Iokusaki spontane mutasyonlar ayrica bunlarin istenen fenotip ile sonuçlanmasi kosulu ile tasarlanmistir. Uygun mutajenik maddeler, örnek olarak, iyonize edici radyasyonu içerir - örnek olarak, X-isinlari, gama isinlari, hizli nötron isinlamasi ve UV radyasyonu gibi. Teknikte uzman kisilerce bilinen herhangi bir bitki nükleik asit preparati metodu, mutasyon taramasi için bitki nükleik asidi hazirlamak amaci ile kullanilabilir. Tek tek bitkilerden, bitki hücrelerinden ya da bitki malzemelerinden hazirlanan nükleik asit, mutajenize edilmis bitki dokusu, hücreleri ya da materyalinden kaynaklanan bitki popülasyonunun gendeki mutasyonlarin taranmasini hizlandirmak için istege bagli olarak toplanabilir. Bir ya da daha fazla art arda bitki, bitki hücresi ya da bitki malzemesi jenerasyonu taranabilir. Istege bagli olarak birlestirilmis grubun büyüklügü kullanilan tarama yönteminin duyarliligina baglidir. Nükleik asit örnekleri istege bagli olarak bir araya getirildikten sonra, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) gibi polinükleotite özgü amplifikasyon tekniklerine tabi tutulabilirler. Izopropilmalat sentaz genine ya da buraya hemen bitisik sekanslara özgü herhangi bir ya da daha fazla primer ya da prob, istege bagli olarak havuzlanmis nükleik asit numunesi içindeki NtTS dizilerini yükseltmek için kullanilabilir. Tercihen, bir ya da daha fazla primer, yararli mutasyonlarin ortaya çikmasi muhtemel olan izopropilmalat sentaz Iokusunun bölgelerini çogaltmak için tasarlanmistir. En çok da tercihen primer, izopropilmalat sentaz polinükleotid bölgeleri içindeki mutasyonlari tespit etmek için tasarlanmistir. Ek olarak, nokta mutasyonlarinin taranmasini kolaylastirmak amaci ile primer(ler)in bilinen polimorfik bölgelerden uzak durmasi tercih edilir. Amplifikasyon ürünlerinin tespit edilmesini kolaylastirmak için, bir ya da daha fazla primer ya da prob, herhangi bir geleneksel etiketleme yöntemi kullanilarak etiketlenebilir. Primer(ler) ya da problar, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilmak sureti ile burada tarif edilmis olan sekanslara dayanarak tasarlanabilir. Polimorfizm, teknikte bilinen araçlarla tanimlanabilmektedir. Baska bir yaklasimda bir mutant bitki hazirlamaya iliskin bir yöntem saglanmaktadir. Yöntem, fonksiyonel bir izopropilmalat sentaz polipeptidini kodlayan bir geni içeren bir bitkinin en az bir hücresinin temin edilmesini içerir. Daha sonra, bitkinin bu en az bir hücresi, izopropilmalat sentaz geninin aktivitesini modüle etmek için etkili kosullar altinda islenir. En az bir mutant bitki hücresi daha sonra bir mutant bitkiye aktarilmakta olupi burada mutant bitki bir kontrol bitkisine kiyasla bir modüle izopropilmalat sentaz polipeptit seviyesine sahiptir. Bir mutant bitkinin yapilmasi için olan bu metodun bir yapilanmasinda, isleme basamagi en az bir hücrenin yukarida belirtilmis olan sekilde ve en az bir mutant bitki hücresi üretmek amaci ile etkili kosullar altinda kimyasal bir mutagenize edici maddeye tabi tutulmasini içerir. Bu yöntemin bir baska yapilanmasinda isleme basamagi en az bir mutant bitki hücresi üretmek için etkili kosullar altinda en az bir hücrenin bir radyasyon kaynagina tabi tutulmasini içerir. "Mutant bitki" terimi, genotipin, bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda, genetik mühendisligi ya da genetik modifikasyondan baska bir yolla uygun olarak modifiye edildigi mutant bitkileri içerir. Belirli yapilanmalarda mutant bitki, mutant bitki hücresi ya da mutant bitki malzemesi, baska bir bitki, bitki hücresi ya da bitki malzemesi içinde dogal olarak meydana gelen ve istenen bir özelligi veren bir ya da daha fazla mutasyon içerebilir. Bu mutasyon, bir baska bitki, bitki hücresi ya da bitki malzemesi (örnek olarak, mutasyonun türetildigi bitkiden farkli bir genetik arka plana sahip bir bitki, bitki hücresi ya da bitki malzemesi) içine dahil edilebilir (örnek olarak, geri melezlenebilir). Bu nedenle örnek olarak, bir birinci bitkide dogal olarak meydana gelen bir mutasyon, birinci bitkiden farkli bir genetik arka plana sahip olan bir ikinci bitki gibi ikinci bir bitkinin içine sokulabilir. Bu nedenle uzman kisi, kendi genomunda izopropilmalat sentaz geninin bir ya da daha fazla mutant alelinde dogal olarak tasinan bir bitkinin arzu edilen bir özelligi kazandigi bir bitkiyi arastirip tanimlayabilmektedir. Dogal olarak meydana gelen mutant alel(ler) izopropilmalat sentaz geninde bir ya da daha fazla mutasyona sahip bir soy, çesit ya da melez üretmek için üreme, geri çaprazlama ve geri melezleme dahil olmak üzere çesitli yöntemler ile ikinci bitkiye aktarilabilir. Istenen özelligi gösteren bitkiler, mutant bitkilerden olusan bir havuzdan taranabilir. Uygun olarak, seçim burada tarif edilmis oldugu üzere izopropilmalat sentaz nükleotit sekanslarinin bilgisini kullanarak gerçeklestirilir. Sonuç olarak, bir kontrol ile karsilastirildiginda sükroz esteri bilesimindeki degisimler için bir gösterge niteliginde olan bir genetik özellik taramak mümkündür. Böyle bir tarama yaklasimi, burada bahsedilmis oldugu üzere geleneksel nükleik asit amplifikasyonu ve/veya melezleme tekniklerinin uygulanmasini içerebilir. Dolayisiyla mevcut bulusun baska bir yaklasimi, bir mutant bitkinin tanimlanmasi için bir yöntem ile ilgili olup, asagidaki adimlari içermektedir: (a) bir bitkinin bir izopropilmalat sentaz polinükleotitini içeren bir numunenin temin edilmesi; ve (b) izopropilmalat sentaz polinükleotidinin nükleik asit sekansinin belirlenmesi adimlarini içermekte olup, içerisinde bir kontrol bitkisinin izopropilmalat sentaz polinükleotidi ile mukayese edildiginde izopropilmalat sentaz polinükleotid dizisindeki bir fark, söz konusu bitkinin bir izopropilmalat sentaz mutant bitkisi oldugunun göstergesidir. Bir baska yaklasimda, bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz esterlerinin biesiminde bir degisime sahip olan bir mutant bitkiyi tanimlamak için bir yöntem saglanmakta olup, asagidaki adimlari içermektedir: (a) taranacak bir bitkiden bir numune temin etme; (b) söz konusu numunenin izopropilmalat sentaz polinükleotidinde bir ya da daha fazla mutasyon içerdigini belirleme; ve (c) bahsedilen bitkinin metionin içerigini belirleme adimlarini içermekte olup; içerisinde sayet bahsi geçen numune izopropilmalat sentaz polinükleotidi içerisinde ekspresyonu modüle eden bir ya da daha fazla mutasyon içeriyorsa ya da kodlanan proteinin aktivitesi bir kontrol bitkisi ve bu bitkinin bir kismi ile mukayese edildiginde sükroz esteri bilesiminde bir degisime izopropilmalat sentazinin ekspresyonunun ya da aktivitesinin düsmemesi artan serbest metionin seviyelerini biriktiren bir dogal olarak meydana gelen mutant bitkinin göstergesidir. Bir baska yaklasimda, bir kontrol bitkisi ile karsilastiridiginda bir mutant bitkiyi hazirlamak için bir yöntem saglanmakta olup, asagidaki adimlari içermektedir: (a) bir birinci bitkiden bir numune temin etme; (b) söz konusu numunenin, izopropilmalat sentaz polinükleotidinde sükroz esterlerin bilesiminde bir degisim ile sonuçlanan bir ya da daha fazla mutasyon içerdigini belirleme; ve (o) bir ya da daha fazla mutasyonu ikinci bir bitkiye transfer etme. Mutasyon(lar), genetik mühendisligi, genetik manipülasyon, geri melezleme, bitki islahi, geri çaprazlama ve benzerleri gibi teknikte bilinen çesitli yöntemler kullanilarak ikinci bitkiye aktarilabilir. Bir yapilanmada, birinci bitki dogal olarak meydana gelen bir bitkidir. Bir yapilanmada, ikinci bitki birinci bitki ile farkli bir genetik arka plana sahiptir. Bir baska yaklasimda, bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz eserterlerin bilesiminde bir degisime sahip olan bir mutant bitkiyi hazirlamak için bir yöntem saglanmakta olup, asagidakileri içermektedir: (a) bir birinci bitkiden bir numune temin etme; (b) söz konusu numunenin, izopropilmalat sentaz polinükleotidinde sükroz esterlerin bilesiminde bir degisim ile sonuçlanan bir ya da daha fazla mutasyon içerdigini belirleme; ve (o) bir ya da daha fazla mutasyonu ikinci bir bitkiye transfer etme. Bir yapilanmada, geri melezleme asamasi istege bagli olarak geri çaprazlama ve benzerleri dahil olmak üzere bitki islahindan olusur. Bir yapilanmada, birinci bitki dogal olarak meydana gelen bir bitkidir. Bir yapilanmada, ikinci bitki birinci bitki ile farkli bir genetik arka plana sahiptir. Bir yapilanmada, birinci bitki bir kültür bitkisi ya da elit bir kültür bitkisi degildir. Bir yapilanmada, ikinci bitki bir kültür bitkisi ya da elit bir kültür bitkisidir. Bir baska yaklasim, burada tarif edilmis olan yöntemler ile elde edilen ya da elde edilebilen bir mutant bitki (bir kültür bitkisi ya da elit mutant kültür bitkisi de dahil) ile ilgilidir. Belirli yapilanmalarda mutant bitkiler, izopropilmalat sentaz polinükleotidinin sekansi dahil olmak üzere, bitkinin belirli bir bölgesine sadece lokalize edilmis bir ya da daha fazla mutasyona sahip olabilir. Bu yapilanmaya göre, mutant bitkinin kalan genomik sekansi, mutagenezden önceki bitki ile ayni ya da büyük ölçüde ayni olacaktir. Belirli yapilanmalarda mutant bitkiler, bitkinin birden fazla bölgesi içerisinde - örnek olarak izopropilmalat sentaz polinükleotidin sekansi içerisinde ve genomun bir ya da daha fazla baska bölgesi içerisinde lokalize olmus bir ya da daha fazla mutasyona sahip olabilir. Bu yapilanmaya göre, mutant bitkinin kalan genomik sekansi, mutagenezden önceki bitki ile ayni ya da büyük ölçüde ayni olmayacaktir. Belirli yapilanmalarda mutant bitki izopropilmalat sentaz polinükleotidin bir ya da daha fazla, iki ya da daha fazla, üç ya da daha fazla, dört ya da daha fazla ya da bes ya da daha fazla eksonunda ya da izopropilmalat sentaz polinükleotidin bir ya da daha fazla, iki ya, üç ya da daha fazla, dört ya da daha fazla ya da bes ya da daha fazla intronunda; izopropilmalat sentaz polinükleotidin bir promotöründe; izopropilmalat sentaz polinükleotiddin 3' çevrilmemis bölgesinde; izopropilmalat sentaz polinükleotidin 5' çevrilmemis bölgesinde; izopropilmalat sentaz polinükleotidin kodlama bölgesinde ya da izopropilmalat sentaz polinükleotidin kodlanmamis bölgesinde ya da bunlarin iki ya da daha fazlasinin, üç ya da daha fazlanin, dört ya da daha fazlasinin, bes ya da daha fazlasinin ya da alti ya da daha fazlasinin herahngi bir kombinasyonunda bir ya da daha fazla mutasyona sahip degildir. Baska bir yaklasimda izopropilmalat sentaz kodlayan bir gende bir mutasyon içeren bir bitkiyi, bir bitki hücresini ya da bitki malzemesini tanimlamaya iliskin bir yöntem saglanmakta olup, asagidakileri içermektedir: (a) bir bitkinin, bir bitki hücresinin ya da bitki materyalinin mutageneze tabi tutulmasini; (b) bahsi geçen bitki, bitki hücresi ya da bitki malzemesi ya da bunlarin soylari arasindan bir nükleik asit örnegi elde etmeyi; ve (c) izopropilmalat sentazi kodlayan genin nükleik asit sekansini ya da bunun bir varyantini ya da bir fragmanini belirlemeyi içermekte olup, içerisinde söz konusu sekanstaki bir farklilik, burada bir ya da daha fazla mutasyonun göstergesidir. Çinko parmak proteinleri, ekspresyon ya da izopropilmalat sentaz aktivitesini modüle etmek için kullanilabilir. Çesitli yapilanmalarda, bir polinükleotidin kodlama sekansinin bir parçasini ya da tamamini içeren bir genomik DNA sekansi, çinko parmak nükleaz aracili mutajenez ile modifiye edilir. Genomik DNA dizisi çinko parmak proteini baglanmasi için essiz bir bölge için taranmistir. Alternatif olarak, genomik DNA sekansi çinko parmak proteini baglanmasi için iki essiz bölge için taranmakta olup, içerisinde her iki bölge birbirine zit ipliklerde bulunur ve birbirleriyle, örnek olarak 1, 2, 3, 4, 5, 6 ya da daha fazla baz çifti ile yakinlasirlar. Buna göre burada açiklanan polinükleoititlere baglanan çinko parmak proteinleri saglanir. Bir çinko parmak proteini, izopropilmalat sentaz genindeki seçilmis bir hedef yeri tanimak üzere dizayn edilebilir. Bir çinko parmak proteini, dogal çinko parmak DNA baglama bölgelerinden ve dogal olmayan çinko parmak DNA baglama bölgelerinden kesme ya da genlesme ya da bir seçim yöntemine baglanan bir bölgeye yönelik mutagenez islemi ile türetilen herhangi bir motif kombinasyonunu içerebilmekte olup, seçim metodu örnek olarak faj gösterimi seçimi, bakteriyel iki melez seçimi ya da bakteriyel bir melez seçimini içerir ancak bunlarla sinirli degildir. "Dogal olmayan çinko parmak DNA-baglama alani" terimi, hedef DNA içinde üç-baz çifti sekansini baglayan ve degistirilecek olan DNA 'yi içeren hücre ya da organizmada meydana gelmeyen bir çinko parmak DNA-baglama alanini ifade eder. Bir hedef gene özgü olan spesifik nükleotit sekanslarini baglayan çinko parmak proteininin tasarimi için yöntemler, teknikte bilinmektedir. Bir çinko parmak nükleazi, bir polinükleotie baglanan bir çinko parmak proteini için kodlayan bir birinci polinükleotidin ve bir spesifik olmayan endonükleazi kodlayan bir ikinci polinükleotidin bir füzyonu yapilarak olusturulabilmekte olup, bu endonükleaz Tip IIS endonükleaz gibidir ancak bununla sinirli degildir. Bir çinko parmak proteini ve nükleaz arasindaki bir füzyon proteini, iki temelden olusan bir aralayici içerebilir ya da alternatif olarak, aralayici, üç, dört, bes, alti, yedi ya da daha fazla baz çiftinden olusabilir. Çesitli yapilanmalarda, bir çinko parmak nükleazi bir polinükleotidin bir genomik DNA sekansinin bir kodlayici bölgesi ya da kodlayici bir bölgesi olan bir düzenleyici bölgede çift sarmalli bir kopma meydana getirir ve bir polinükleotidin ekspresyon seviyesinin azaltilmasina ya da bu sekilde kodlanan proteinin aktivitesinde bir azalmaya yol açar. Çinko parmak nükleazi ile yarilma, homolog olmayan uç birlesmesiyle DNA onarimini takiben bölünme bölgesinde DNA 'nin delesyonuna neden olur. Baska yapilanmalarda bir izopropilmalat sentaz polinükleotidin düzenleyici sekansina baglanmak için bir çinko parmak proteini seçilebilir. Daha belirgin olarak, düzenleyici sekans bir transkripsiyon baslatma bölgesini, bir baslangiç kodonunu, bir ekzonun bir bölgesini, bir ekson- intronun bir sinirini, bir sonlandiriciyi ya da bir durdurma kodonunu içerebilir. Buna göre, tarifname izopropilmalat sentaz geninin yakininda ya da içinde çinko parmak nükleaz aracili mutagenez ile üretilen bir mutant, dogal olmayan ya da transgenik bitki ya da bitki hücrelerini ve bu tür bir bitki ya da bitki hücresini çinko parmak nükleaz aracili mutagenez ile yapma yöntemlerini saglar. Çinko parmak proteininin ve çinko parmak nükleazinin bir bitkiye verilmesi için yöntemler, meganükleazin verilmesi için asagida tarif edilenlere benzerdir. Bir baska yaklasimda, tarifname ayrica mutant, dogal olmayan ya da transjenik ya da baska sekilde genetik olarak modifiye edilmis bitkilerin meganükleazlar - I-Crel gibi - kullanilarak üretilmesine yönelik yöntemler saglar. Dogal olarak meydana gelen meganükleazlarin yani sira rekombinant meganükleazlar da tek bir bölgede ya da izopropilmalat sentaz polinükleotidin bozulmasina izin vermek için bir bitkinin genomik DNA 'sindaki nispeten az sayida alanda çift Zincirli bir kopmaya neden olmak için kullanilabilir. Meganükleaz, degistirilmis DNA tanima özelliklerine sahip tasarlanmis bir meganükleaz olabilir. Meganükleaz proteinleri, teknikte bilinen çesitli farkli mekanizmalarla bitki hücrelerine verilebilir. Tarifname bir bitki hücresinde ya da bitkide polinükleotidlerinin birini ya da daha fazlasini etkisiz hale getirmek için meganükleazlarin kullanimini kapsamaktadir. Yaklasimlar ayrica bir bitkide bir polinükleotidin bir meganükleaz kullanilarak inaktive edilmesi için bir yöntem saglamakta olup, (a) burada açiklanan bir ya da daha fazla polinükleoitidi içeren bir bitki hücresi saglanmasini; (b) söz konusu bitki hücresine bir meganükleaz ya da bir meganükleaz kodlayan bir yapi vermeyi; ve (c) meganükleazin -polinükleotidin büyük ölçüde etkisiz hale getirmesine olanak tanimayi içermektedir. Meganükleazlar, bir polinükleotidin kodlama bölgeleri Içindeki meganükleaz tanima bölgelerini ayirmak için kullanilabilir. Bu tür yarilma, homolog olmayan uç birlesmesiyle mutajenik DNA onarimini takiben meganükleaz algilama bölgesinde DNA'nin delesyonuna neden olur. Gen kodlama dizisindeki bu tür mutasyonlar tipik olarak geni inaktive etmek için yeterlidir. Bir bitki hücresinin modifiye edilmesi için olan bu yöntem, bir meganukleaz ekspresyon kasetinin uygun bir transformasyon yöntemi kullanilarak bir bitki hücresine verilmesini içerir. En yüksek verim için, meganükleaz ekspresyon kasetinin seçilebilir bir isaretleyiciye baglanmasi ve bir seçim ajani varliginda basarili bir sekilde dönüstürülmüs hücrelerin seçilmesi arzu edilir. Bu yaklasim, meganükleaz ekspresyon kasetinin genoma entegrasyonu ile sonuçlanacaktir, bununla birlikte bitkinin düzenleyici onayi gerektirecekse bu arzu edilemez. Bu gibi durumlarda, meganükleaz ekspresyon kaseti (ve baglantili seçilebilir isaretleyici geni), geleneksel yetistirme teknikleri kullanilarak sonraki bitki nesillerinde ayrilabilir. Alternatif olarak, bitki hücreleri baslangiçta seçilebilir bir isaretleyici bulunmayan bir meganükleaz ekspresyon kaseti ile dönüstürülebilir ve bir seçim ajani içermeyen ortamlarda yetistirilebilir. Bu kosullar altinda, islenen hücrelerin bir kismi meganükleaz ekspresyon kasetini elde edecek ve meganükleaz ekspresyon kasetini genoma entegre etmeden geçici olarak tasarlanmis meganükleazi eksprese edecektir. Transformasyon verimliligini hesaba katmadigi için, bu son transformasyon prosedürü istenen genom modifikasyonunu elde etmek için daha fazla sayida islenen hücrenin taranmasini gerektirir. Yukaridaki yaklasim, bir çinko parmak proteini ya da çinko parmak nükleazi kullanildiginda bir bitki hücresini modifiye etmek için de uygulanabilir. Meganükleaz ekspresyon kasetinin verilmesini takiben bitki hücreleri, baslangiçta kullanilan belirli dönüstürme prosedürü için tipik olan kosullar altinda yetistirilir. Bu, 26 derece C 'nin altinda, siklikla karanlikta ortam üzerinde yetisen dönüstürülmüs hücreler anlamina gelebilir. Bu tür standart kosullar bitki hücresinin dönüsüm isleminden kurtulmasi için bir süre boyunca, tercihen 1-4 gün boyunca kullanilabilir. Bu ilk geri kazanim periyodunu takiben herhangi bir noktada meganükleaz tanima bölgesini ayirmak ve mutasyona ugratmak için islenmis meganükleazin aktivitesini uyarmak amaci ile yetistirme sicakligi yükseltilebilir. Bazi uygulamalar için, polinükleotidin bitkinin genomundan kesin olarak çikartilmasi arzu edilebilir. Bu tür uygulamalar, her biri amaçlanan silme isleminin her iki tarafinda bir meganükleaz tanima bölgesini bölen bir çift tasarlanmis meganükleaz kullanilarak mümkündür. Meganükleazlar ve diger DNA onarma stratejileri ayrica bir bitki hücresinde bulunan bir DNA ve hedef DNA arasinda bir heterolog rekombinasyonu tetiklemek için kullanilabilmektedir. Hedef DNA tipik olarak bitki hücresinde bulunan DNA'ya homolog olan en az bir, tercihen iki bölge içermektedir. Hücre tarafindan DNA onarimini takiben homolog uçlar hedef DNA'nin hücreye dahil edilmesiyle sonuçlanacak sekilde birlestirilmektedir. Baska bir yapilanmada bir bitkideki izopropilmalat sentazin ekspresyon seviyeleri, genin dogrudan kloroplast genomuna eklenmesi vasitasiyla arttirilabilmektedir çünkü izopropilmalat sentaz bitki hücresi çekirdeginde kodlanan bir kloroplastik proteindir. Benzer sekilde izopropilmalat sentazin kloroplastlara tasinmasi ya da yerlestirilmesini arttirmak ayrica aktivite seklini modüle edebilmektedir. Bir amaç bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda büyük oranda ayni görsel görünüsü korurken modüle edilmis sükroz esterleri seviyesi sergileyen mutant, transjenik ya da dogal olarak meydana gelmeyen bitkiler saglamaktir. Dolayisiyla burada kontrol hücreleri ya da kontrol bitkileri ile karsilastirildiginda modüle edilmis sükroz ester seviyelerine sahip olan mutant, transjenik ya da dogal olarak meydana gelmeyen bitkiler ya da hücreler açiklanmaktadir. Mutant, transjenik ya da dogal olarak meydana gelmeyen bitkiler ya da hücreler, burada açiklanan polinükleoitit sekanslarini kodlayan bir ya da daha fazla polipeptidin ekspresyonunun modüle edilmesi vasitasiyla burada açiklanan izopropilmalat sentazin sentezini ya da aktivitesini modüle etmek için modifiye edilmistir. Baska bir yaklasim mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bir bitki ya da hücre ile ilgili olup, burada izopropilmalat sentazin ekspresyonu ya da aktivitesi sükroz ester seviyelerinde söz konusu enzimin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmemis oldugu bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda en az %5'Iik bir artisa ya da azalmaya sahiptir. Yine baska bir yaklasim mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bir bitki ya da hücre ile ilgili olup, burada bu sekilde kodlanan proteinin aktivitesi ya da izopropilmalat sentazin ekspresyonu modüle edilmektedir ve burada aerosoldeki sükroz ester seviyeleri söz konusu enzimin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmemis oldugu bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda en az %5 artmakta ya da azalmaktadir. Kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz esteri içerigindeki degisim en az yaklasik %5, en az yaklasik %10, en az yaklasik %20, en az yaklasik %25, en az yaklasik %30, en az yaklasik %40, en az yaklasik %50, en az yaklasik %60, en az yaklasik %70, en az yaklasik %75, en az yaklasik %80, en az yaklasik %90, en az yaklasik %95, en az yaklasik %96, en az yaklasik %97, en az yaklasik %98, en az yaklasik %99 ya da yaklasik % 100 ya da daha fazla olabilmektedir. Bitki, aerosolün serbest kalmasi için en az 125 °C, en az 150 °C, en az 175 °C ya da en az 200 °C gibi - 100 °C 'ye ya da daha yüksek bir sicakliga kadar isitilabilir. Tarifnameye göre genetik modifikasyonda kullanim için uygun bitkiler, monokotiledon ve dikotiledon bitkileri ve asagidaki familyalarin birinden türler içeren bitki hücre sistemlerini içermektedir: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae, ya da Vitaceae. Uygun türler Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffee, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Diosoorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, ve Zea cinslerinin üyelerini içerebilir. Uygun türler Dari spp., Sorgum spp., Miscanthus spp., Seker kamisi spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (büyük mavi gövde), Pennisetum purpureum (fil çimeni), Phalaris arundinacea (kamis kanarya otu), Cynodon dactylon (bermuda çimeni), Festuca arundinacea (uzun çayir otu), Spartina pectinata (prairie cord-grass), Medicago sativa (adi yonca), Arundo donax (dev kamis), Secale cereale (çavdar), Salix spp. (sögüt), Eucalyptus spp. (okaliptüs), Triticosecale (triticum - bugday x çavdar), bambu, Helianthus annuus (ayçiçegi), Carthamus tinctorius (aspir), Jatropha curoas (jatropha), Ricinus communis (hint yagi otu), Elaeis guineensis (palmiye), Linum usitatissimum (keten ), Brassicajuncea, Beta vulgaris (seker pancari), Manihot esculenta (cassaya), Lycopersicon esculentum (domates), Lactuca sativa (marul), Musa paradisiaca (muz), Solanum tuberosum (patates), Brassica oleracea (brokoli, karnabahar, Brüksel Iahanasi), Camellia sinensis (çay), Fragaria ananassa (çilek), Theobroma kakao (kakao), Coffea arabica (kahve), Vitis vinifera (üzüm), Ananas comosus (ananas), Capsicum annum (aci ve tatli biber), AIIium cepa (sogan), Cucumis melo (kavun), Cucumis sativus (salatalik), Cucurbita maxima (kabak), Cucurbita moschata (kabak), Spinacea oleracea (ispanak), Citrullus Ianatus (karpuz), Abelmoschus esculentus (bamya), Solanum melongena (patlican), Rosa spp. (gül), Dianthus caryophyllus (karanfil), Petunya spp. (petunya), Poinsettia pulcherrima (poinsettia), Lupinus albus (lupin), Uniola paniculata (yulaf), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (aspen), Pinus spp. (çam), Abies spp. (köknar), Acer spp. (akçaagaç), Hordeum vulgare (arpa), Poa pratensis (çayir salkim otu), Lolium spp. (çavdar) ve Phleum pratense (çayir otu), Panicum virgatum (anahtar otu), Sorghum bicolor (sorgum, sudangrass), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (energycane), Populus balsamifera (kavak), Zea mays (misir), Glisin max (soya fasulyesi), Brassica napus (kanola), Triticum aestivum (bugday), Gossypium hirsutum (pamuk), Oryza sativa (pirinç), Helianthus annuus (ayçiçegi), Medicago sativa (adi yonca), Beta vulgaris (seker pancari) ya da Pennisetum glaucum (inci dari) içerebilir. Çesitli yapilanmalar, mutant bitkilere, dogal olarak meydana gelmeyen bitkilere ya da izopropilmalat sentaz gen ekspresyon seviyelerini düsürmek ve dolayisiyla bitkiler - tütün bitkileri gibi - üretmek için modifiye edilen transgenik bitkilere yönelik olup, içerisinde izopropilmalat sentazin ekspresyon seviyesi, ilgilenilen bitki dokulari içinde bir kontrol bitkisine göre azalir. Tarif edilmis olan bilesim ve yöntemler Nicotiana familyasinin herhangi bir türüne uygulanabilmekte olup, bunlar N. rustica ve N. tabacum (örnek olarak, LA 821, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, K326, Hicks Broadleaf ve Petico) içermektedir. Diger türler N. acauiis, N. acuminata, N. acuminata var. multif/ora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavico/a, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forget/ana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii', N. knightiana, N. Iangsdorffii, N. /inearis, N. long/flora, N. maritima, N. mega/osiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifo/ia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperi's, N. otophora, N. pani'cu/ata, N. pauci'flora, N. petunioides, N. p/umbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosu/ata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifo/i'a, N. setche/Iii', N. simulans, N. solanifo/ia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sy/vestris, N. thyrsi'f/ora, N. tomentosa, N. Iomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides ve N. x sanderae içerir. Daha çok tercih edilen bir yapilanmada bitki bir tütün bitkisidir - Nicotiana cinsinden ya da Nicotiana tabacum türlerinden bir bitki gibi. Tütün çesitlerinin ve elit tütün çesitlerinin kullanimi da burada düsünülmektedir. Transgenik, dogal olarak bulunmayan ya da mutant bitki bu nedenle bir ya da daha fazla transgen ya da bir ya da daha fazla genetik mutasyon ya da bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir tütün çesidi ya da elit tütün çesidi olabilir. Genetik mutasyon(lar) (örnek olarak, bir ya da daha fazla polimorfizm), bireysel tütün çesidi ya da tütün çesidinde dogal olarak bulunmayan mutasyonlar (örnek olarak, elit tütün kültür bitkisi) olabilir ya da mutasyon münferit tütün varyetesinde ya da tütün kültür bitkisinde (örnek olarak elit tütün kültür bitkisi) dogal olarak meydana gelmemek kaydiyla dogal olarak meydana gelebilen genetik mutasyon(lar) olabilir. Özellikle yararli Nicotiana tabacum çesitleri, Burley tipi, koyu tip, firinda kurutulmus tip ve Oryantal tip tütünleri içerir. Varyetelerin ya da kültür bitkilerinin sinirlandirici olmayan örnekleri: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB O4P, HB 04P LC, H83307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, 'Perique' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NFS, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, PO1, PO2, P03, RG 11, RG 8, VA 509, A844, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma l Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpâo Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, Tl-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Yukarida özellikle belirtilmemis olsalar bile, yukaridakilerin düsük dönüstürücü ait türleri de burada düsünülmüstür. Bitki çesitleri ve elit bitki çesitleri belirli yapilanmalarda tercih edilmektedir. Ni'cotiana tabacum belirli baska yapilanmalarda kullanilabilmektedir. Nicoti'ana tabacum Burley tipi kullanilabilmektedir. Yapilanmalar ayrica izopropilmalat sentaz ekspresyonu ya da aktivitesini modüle etmek için modifiye edilmis olan, bunun da bir kontrol ile karsilastirildiginda modüle edilmis sükroz esteri seviyelerine sahip bitkiler ya da bitki bilesenleri ile sonuçlandigi, mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkiler üretmeye yönelik bilesimlere ve yöntemlere yöneliktir. Bitkilerde sükroz esterlerinin seviyesini modüle etmek, buradan üretilen aerosolün aroma profilinin degistirildigi bitkiler üretmek için kullanilabilmektedir. Mevcut bulus dolayisiyla istenen tütün aromalarini üretmek için yeni karistirma seçenekleri saglayabilmektedir. Dolayisiyla örnek yoluyla bitkinin sükroz esteri içerigi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin arttirilmasi vasitasiyla arttirilabilmekte olup, bu da oryantal tütüne daha fazla benzer olan aroma moleküllerini artan seviyelerde salabilen bir bitki ile sonuçlanabilmektedir. Dolayisiyla baska örnek yoluyla bitkinin sükroz esteri içerigi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin arttirilmasi vasitasiyla arttirilabilmekte olup, bu da flue cured tütüne daha fazla benzer olan aroma moleküllerini artan seviyelerde salabilen bir bitki ile sonuçlanabilmektedir. Baska bir yaklasimda, tütün harmanlamaya yönelik bir yöntem saglanmakta olup, bir ya da daha fazla tütün tipinin bir tütün harmanina, bitkinin sükroz esteri içeriginin burada açiklandigi gibi izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesiinn modüle edilmis (arttirilmis ya da azaltilmis) oldugu bir transjenik, mutant ya dogal olarak meydana gelmeyen bir bitkiden türetilen tütüne (örnegin tütün yapraklarina ya da tütün yapraklarindan türetilebilen ya da türetilen bir bilesime) eklenmesi ya da bunlarin degistirilmesini içermektedir. Baska bir yaklasimda, tütün harmanlamaya yönelik bir yöntem saglanmakta olup, bir tütün harmanindaki Oriental tip tütünün degistirilmesi, azaltilmasi ya da eklenmemesi ve bir ya da daha fazla tütün tipinin bir tütün harmanina, bitkinin sükroz esteri içeriginin burada açiklandigi gibi izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesiinn modüle edilmis (arttirilmis ya da azaltilmis) oldugu bir transjenik, mutant ya dogal olarak meydana gelmeyen bir bitkiden türetilen tütüne (örnegin tütün yapraklarina ya da tütün yapraklarindan türetilebilen ya da türetilen bir bilesime) eklenmesi ya da bunlarin degistirilmesini içermektedir. Tütünün -Oriental tütün gibi- yer degistirmesi, azaltilmasi ya da eklenmesi yer degistirilen, azaltilan ya da eklenen tütünün yaklasik %10'una, %20'sine, %30'una, %40iina, %50'sine, %60iina, %70'ine, %80'ine, %90'ina ya da %100'üne karsilik gelebilmektedir. Baska bir yaklasim tütün ya da bir tütün ürününn aromasini modüle etmeye yönelik bir yöntem ile ilgili olup, bir ya da daha fazla tütün tipinin bir tütün harmanina, bitkinin sükroz esteri içeriginin burada açiklandigi gibi izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesiinn modüle edilmis (arttirilmis ya da azaltilmis) oldugu bir transjenik, mutant ya dogal olarak meydana gelmeyen bir bitkiden türetilen tütüne eklenmesi ya da bunlarin degistirilmesini Içermektedir. Baska bir yaklasim tütün ya da bir tütün ürününü aromasini modüle etmek için izopropilmalat sentazin ekspresyonunu ya da aktivitesini modüle eden ajanin kullanimi ile ilgilidir. Bitkilerdeki sükroz esteri seviyesini modüle etmek ayrica bitkinin böcek direncinin degistirildigi bitkiler üretmek için kullanilabilmektedir. Bitkinin böcek direnci, burada açiklanan sükroz esteri üretimi seviyesinin arttirilmasi vasitasiyla arttirilabilmektedir. Bitkinin böcek direnci, burada açiklanan sükroz esteri üretimi seviyesinin azaltilmasi vasitasiyla azaltilabilmektedir. Burada açiklanan bitkilerde üretilen sükroz esterlerinin bilesimi, ilaçlarda, gida katki maddelerinde, sigara aroma vericilerindeki gibi ve organik pestisitler ve benzerlerinin bilesimleri olarak çesitli kullanimlar için bitkiden esktrakte edilebilmekte ve opsiyonel olarak buradan saflastirilmaktadir. Bir yapilanmada sükroz esterleri, yapraklardan ya da yapraklarin yüzeyinden ekstrakte edilmektedir. Dolayisiyla sükroz esterlerini içeren ilaçlar, gida katki maddeleri, sigara aroma vericileri ve organik pestisitler gibi ürünler bu patent hakki bildiriminin baska bir yaklasimidir. Mevcut patent hakki bildirimine göre sükroz esterleri, Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahip olup, burada R1, R2, R3, R4 ve R5 ya hidrojen atomudur ya da asil zinciridir. Sükroz esterlerine esterlesebilen asil zincirleri, Sekil 6`da gösterilmektedir. Spesifik sükroz esterlerinin bazi örnekleri Tablo 1 ve Sekil 2ide gösterilmektedir. Bir ya da daha fazla sükroz esterinin her birinde R1, R2 ve R4iteki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisi örnegin 12, 13, 14, 15, 16, 17 ya da 18 olabilmekte; uygun olarak, 14, , 16, 17 ya da 18 olabilmekte; uygun sekilde 16, 17 ya da 18 ya da uygun olarak 14 ya da 15 olabilmektedir. Bu karbon sayisinin sükroz esterlerinin her birinde bulunmasi kosuluyla bilesen asil zincirleri Sekil 6'de gösterilenlerin herhangi birinden seçilebilmektedir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Uygun olarak asil zincirlerinin biri ya da daha fazlasi, ikisi ya da daha fazlasi ya da üçü ya da daha fazlasi, özellikle bir 6 karbonlu asil zinciri mevcut oldugu zaman beta-metilvaleril olacaktir. Bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5'te bir asetile ya da bir hidrojene ve R1, R2 ve R4 pozisyonlarinin herhangi birinde 3, 4, 5 ya da 6 karbonu olan bir asil zincirine sahip olan bir sükroz esteridir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3ite bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5'te bir asetile ya da bir hidrojene ve R1, R2 ve R4 pozisyonlarinin herhangi birinde 4, 5 ya da 6 karbonu olan bir asil zincirine sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5'te bir asetile ya da bir hidrojene ve R1, R2 ve R4 pozisyonlarinin herhangi birinde 5 ya da 6 karbonu olan bir asil zincirine sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3"te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5ite bir hidrojene sahiptir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5'te bir asetile ya da bir hidrojene ve R1, R2 ve R4 pozisyonlarinin herhangi birinde 6 karbonu olan bir asil zincirine sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5'te bir asetile ya da bir hidrojene ve R1 pozisyonunda 3, 4, 5 ya da 6 karbona sahip bir asil zincirine, R2 pozisyonunda 3, 4, 5 ya da 6 karbon atomuna sahip bir asil zincirine ve R4 pozisyonunda 3, 4, 5 ya da 6 karbona sahip olan bir asil zincirine sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5lte bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3ite bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5'te bir asetile ya da bir hidrojene ve R1 pozisyonunda 4, 5 ya da 6 karbona sahip bir asil zincirine, R2 pozisyonunda 4, 5 ya da 6 karbon atomuna sahip bir asil zincirine ve R4 pozisyonunda 4, 5 ya da 6 karbona sahip olan bir asil zincirine sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3ite bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5'te bir asetile ya da bir hidrojene ve R1 pozisyonunda 5 ya da 6 karbona sahip bir asil zincirine, R2 pozisyonunda 5 ya da 6 karbon atomuna sahip bir asil zincirine ve R4 pozisyonunda 5 ya da 6 karbona sahip olan bir asil zincirine sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5ite bir asetile ya da bir hidrojene ve R1, R2 ve R4 pozisyonlarinin en azidan birinde 6 karbonu olan bir asil zincirine sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Bir yapilanmada sükroz esteri R3 ve R5'te bir asetile ya da bir hidrojene ve R1 pozisyonunda 6 karbona sahip bir asil zincirine, R2 pozisyonunda 6 karbon atomuna sahip bir asil zincirine ve R4 pozisyonunda 6 karbona sahip olan bir asil zincirine sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Bir yapilanmada sükroz eseri bir (dallanmis zincirli) beta-metilvaleril olup, sükroz esteri içermektedir. Bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R1 ila R5`in her biri asetil, bütiril, propionil ya da bunun bir izomeri, izobütiril, valeril (pentanoil), 2-metil- bütiril, izovaleril, izopentenoil, pentenoil, hekzanoil ya da bunun bir izomeri, 2-metilvaleril, beta- metilvaleril ve 4-metilvalerilden olusan gruptan seçilen asil zincirilerinin herhangi biridir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir ve R1, R2, R4 ve R5'in her biri asetil, bütiril, propionil ya da bunun bir izomeri, izobütiril, valeril (pentanoil), 2-metiI-bütiril, izovaleril, izopentenoil, pentenoil, hekzanoil ya da bunun bir izomeri, 2-metilvaleril, beta-metilvaleril ve 4-metilvalerilden olusan gruptan seçilen asil zincirilerinin herhangi biridir. Bir yapilanmada 6 karbonu olan asil zincirinin bir dallanmis zincir olmasi tercih edilmektedir. Bir yapilanmada 6 karbonu olan asil zincirinin beta-metilvaleril olmasi tercih edilmektedir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5ite gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 hidrojen ya da asetildir ve R5 hidrojen ya da asetildir ve R1, R2 ve R4`ün her biri asetil, bütiril, propionil ya da bunun bir izomeri, izobütiril, valeril (pentanoil), 2-metil-bütiril, izovaleril, izopentenoil, pentenoil, hekzanoil ya da bunun bir izomeri, 2-metilvaleril, beta-metilvaleril ve 4- metilvalerilden olusan gruptan seçilen asil zincirilerinin herhangi biridir. Münferit sükroz esterleri Tablo 1 ve Sekil 2'de açiklanmaktadir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5,te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir ve R5 hidrojen ya da asetildir ve R1, R2 ve R4'ün her biri asetil, bütiril, propionil ya da bunun bir izomeri, izobütiril, valeril (pentanoil), 2-metiI-bütiril, izovaleril, izopentenoil, pentenoil, hekzanoil ya da bunun bir izomeri, 2-metilvaleril, beta-metilvaleril ve 4-metilvalerilden olusan gruptan seçilen asil zincirilerinin herhangi biridir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5*te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir, R5 hidrojen ya da asetildir; R1 bütiril, propionil ya da bunun bir izomeri, valeril (pentanoil) ya da bunun bir izomeri ya da hekzanoil ya da bunun bir izomeridir; R2 propionil ya da bunun bir izomeri, valeril (pentanoil) ya da bunun bir izomeri ya da hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R4 valeril (pentanoil) ya da bunun bir izomeri ya da hekzanoil ya da bunun bir izomeridir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5"te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir, R5 hidrojen ya da asetildir; R1 propionil, valeril (pentanoil) ya da bunun bir izomeri ya da hekzanoil ya da bunun bir izomeridir; R2 propionil ya da bunun bir izomeri, valeril (pentanoil) ya da bunun bir izomeri ya da hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R4 valeril (pentanoil) ya da hekzanoil ya da bunun bir izomeridir. Bir yapilanmada modüle edilen sükroz esteri Sekil Site gösterilen genel yapiya sahiptir, burada R3=asetil, R1=pr0pionil ya da bunun bir izomeri, R2=propiponil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir (doymus) sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=pr0pionil ya da bunun bir izomeri, R2=va|eril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri (C2C1420) içermektedir. Bir yapilanmada modüle edilen sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahiptir, burada R3=asetil, R1 :propionil ya da bunun bir izomeri, R2=valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir (doymus) sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2=valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5"in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütil, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5"in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri içermektedir (01201520). Bir yapilanmada sükroz esteri Sekil Site gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir, R1 valeril ya da bunun bir izomeridir, R2 valeril ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir (CZC16:0). Bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir, R1 propionil ya da bunun bir izomeridir, R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir (02C16:0). Bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5`te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir, R1 valeril ya da bunun bir izomeridir, R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir (CZC17:0). Bir yapilanmada sükroz esteri Sekil 5`te gösterilen genel yapiya sahiptir ve burada R3 asetildir, R1 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5 ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismidir (C2C1820). Baska bir yapilanmada sükroz esteri 594 Dalton ila 692 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 608 Dalton ila 692 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 622 Dalton ila 692 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 636 Dalton ila 692 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 650 Dalton ila 692 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 650 Dalton ila 678 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri 594 Dalton ila 678 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 608 Dalton ila 678 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 622 Dalton ila 678 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 636 Dalton ila 678 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 650 Dalton ila 678 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Bir bir yapilanmada sükroz esteri 664 Dalton ila 678 Dalton'luk bir moleküler agirliga sahiptir. Baska bir yaklasim, tütünün ya da bir tütün ürününün aromasini modüle etmeye yönelik bir yöntem ile ilgili olup, burada açiklanan sükroz esterlerin bilesimlerinin buraya eklenmesini içermektedir. Baska bir yapilanmada bir bitkideki sükroz esterlerin konsantrasyonu, seviyeleri ya da üretimi arttirilmaktadir. Baska bir yapilanmada bir bitkideki sükroz esterlerin konsantrasyonu, seviyeleri ya da üretimi azaltilmaktadir. Spesifik bir yapilanmada izopropilmalat sentaz ekspresyonu ya da aktivitesini arttirmak modifiye edilmis olan mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkiler üretmeye yönelik bilesimler ve yöntemler saglanmakta olup, bunlar sükroz esterlerin konsantrasyonunun, seviyesinin ya da üretiminin arttirildigi bitkiler ya da bitki malzemesi ile sonuçlanabilmektedir. Spesifik olarak burada açiklanan sükroz esterlerinin üretimi ya da seviyesi arttirilmakta ya da indüklenmektedir. Spesifik bir yapilanmada izopropilmalat sentaz ekspresyonu ya da aktivitesini azaltmak modifiye edilmis olan mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkiler üretmeye yönelik bilesimler ve yöntemler saglanmakta olup, bunlar sükroz esterlerin konsantrasyonunun, seviyesinin ya da üretiminin azaltildigi bitkiler ya da bitki malzemesi ile sonuçlanabilmektedir. Spesifik olarak burada açiklanan sükroz esterlerinin seviyesi azaltilmakta ya da ortadan kaldirilmaktadir. Avantajli olarak burada açiklana yöntemlere göre elde edilen mutant bitkiler, dogal olarak bulunmayan bitkiler, melez bitkiler ya da elde edilen transjenik bitkiler, kontrol bitkilerine genel olarak benzer ya da bunlarla büyük ölçüde aynidir. Bir yapilanmada mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transgenik bitkilerin sap yüksekligi, tarla transplantindan bir, iki ya da üç ay sonra ya da tepe almadan 10, 20, 30 ya da 36 gün sonra sonra kontrol bitkileriyle aynidir. Örnek olarak mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transjenik bitkilerin sap yüksekligi, kontrol bitkilerinin sap yüksekliginden az degildir. Bir baska yapilanmada mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transgenik bitkilerin klorofil içerigi, kontrol bitkileri ile büyük oranda aynidir. Bir baska yapilanmada, mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transjenik bitkilerin sap yüksekligi, kontrol bitkileri ile büyük oranda aynidir ve mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkilerin klorofil içerigi kontrol bitkileri ile büyük oranda aynidir. Baska yapilanmalarda mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transgenik bitkilerin büyüklügü ya da formu ya da sayisi ya da rengi kontrol bitkileri ile büyük oranda aynidir. Uygun olarak bitki bir tütün bitkisidir. Baska bir yaklasimda bir bitkinin en azindan bir parçasindaki sükroz esteri içerigini - beta- metilvaleril sükroz esteri içerigi gibi - modüle etmeye yönelik bir yöntem saglanmakta olup, asagidaki adimlari içermektedir: (i) bitkideki izopropilmalat sentaz ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmesi, burada izopropilmalat sentaz burada açiklanan polinükleotit sekansini ya da burada açiklanan polipeptit sekansini içermektedir; (ii: opsiyonel olarak adimda (i) elde edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin en azindan bir kismindaki sükroz esteri içeriginin ölçülmesi ve (iii) buradaki sükroz esteri içeriginin bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda modüle edilmis olan bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin tanimlanmasi. Uygun bir sekilde söz konusu mutantin, dogal olarak bulunmayan ya da transjenik bitkilerin genel görünümü kontrol bitkisi ile büyük ölçüde aynidir. Uygun olarak bitki bir tütün bitkisidir. Bir baska yaklasimda, bir bitkinin en azindan bir kisminda (örnek olarak, yapraklar) bulunan sükroz ester içeriginin - beta-metilvaleril sükroz esteri içerigi gibi - için bir yöntem saglanmistir olup, asagidaki adimlari içermektedir: (i) bitkideki izopropilmalat sentaz ekspresyonunun ya da aktivitesinin arttirilmasi, burada izopropilmalat sentaz burada açiklanan polinükleotit sekansini ya da burada açiklanan polipeptit sekansini içermektedir; (ii) opsiyonel olarak adimda (i) elde edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin en azindan bir kismindaki sükroz esteri içeriginin ölçülmesi ve (iii) buradaki sükroz esteri içeriginin bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda arttirilmis olan bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin tanimlanmasi. Baska bir yaklasimda bir bitkinin en azindan bir parçasindaki sükroz esteri içerigini - beta- metilvaleril sükroz esteri içerigi gibi - azaltmaya yönelik bir yöntem saglanmakta olup, asagidaki adimlari içermektedir: (i) bitkideki izopropilmalat sentaz ekspresyonunun ya da aktivitesinin azaltilmasini, burada izopropilmalat sentaz burada açiklanan polinükleotit sekansini ya da burada açiklanan polipeptit sekansini içermektedir; (ii) opsiyonel olarak adimda (i) elde edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin en azindan bir kismindaki sükroz esteri içeriginin ölçülmesi ve (iii) buradaki sükroz esteri içeriginin bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda azaltilmis olan bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin tanimlanmasi. Avantajli olarak burada açiklana yöntemler ayrica izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin arttirilmasi vasitasiyla oryantal özelliklere sahip olan bitkiler üretmek için kullanilabilmektedir. Dolayisiyla bu yapilanmaya göre oriental olmayan bir bitki çesidi - flue cured ya da bir burley çesidi bitki gibi - izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin burada arttirilacagi sekilde üretilebilmektedir. Bu oriental özellikleri bitkilere uygulayabilmekte olup, bu da oriental aromasini degistirebildiginden böylelikle yeni aromatik bitki hatlari, çesitleri ya da melezleri üretebildiginden dolayi avantajli olabilmektedir. Burada açiklana yöntemler ayrica izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin azaltilmasi vasitasiyla oriental özelliklerin azaltildigi, inhibe edildigi ya da ortadan kaldirildigi bitkileri üretmek için kullanilabilmektedir. Dolayisiyla bu yapilanmaya göre oriental olmayan bir bitki çesidi izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin burada azaltilacagi sekilde üretilebilmektedir. Bitkilerde oriental özelliklerin azaltilmasi ya da ortadan kalirilmasi oriental aromasini degistirebildiginden böylelikle yeni aromatik bitki hatlari, çesitleri ya da melezleri üretebildiginden dolayi avantajli olabilmektedir. Kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda izopropilmalat sentazin ekspresyonundaki artis yaklasik %5 ila yaklasik %100 ya da daha fazla ya da en az %10, en az %20, en az %25, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %75, en az %80, en az %90, en az %95, en az %98, en az %100, %150 ya da %200 ya da daha fazla bir artis olabilmekte olup, transkripsiyonel aktivitede ya da protein ekspresyonunda ya da her ikisinde bir artisi içermektedir. Kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda izopropilmalat sentazin aktivitesindeki artis yaklasik %5 ila yaklasik %100 ya da daha fazla ya da en az %10, en az %20, en az %25, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %75, en az %80, en az %90, en az %95, en az %98, en az %100, %150 ya da %200 ya da daha fazla bir artis olabilmektedir. Kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda izopropilmalat sentazin ekspresyonundaki azalma, yaklasik %5 ile yaklasik %100 arasinda ya da en az %10, en az %20, en az %25, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %75, en az %80, en az %90, en az %95, en az %98 ya da %100 olabilmekte olup, bu transkripsiyonel aktivitede ya da protein ekspresyonunda bir azalma içermektedir. Kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda izopropilmalat sentazin aktivitesindeki azalma yaklasik %5 ila yaklasik %100 ya da daha fazla ya da en az %10, en az %20, en az %25, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %75, en az %80, en az %90, en az %95, en az %98 ya da %100 ya da daha fazla olabilmektedir. Bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz esteri içerigindeki artis, yaklasik %5 ile yaklasik %100 arasinda ya da en az %10, en az %20, en az %25, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %75, en az %80, en az %90, en az %95, en az %98 ya da en fazla %100 oraninda bir artis olabilmektedir. Bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz esteri içerigindeki azalma, yaklasik %5 ile yaklasik %100 arasinda ya da en az %10, en az %20, en az %25, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %75, en az %80, en az %90, en az %95, en az %98 ya da en fazla %100 oraninda bir azalma olabilmektedir. Burada açiklanan polinükleotitler ve rekombinant yapilar, ilgili bir bitki türünde, spesifik olarak tütünde burada açiklanan izopropilmalat sentazin ekspresyonunu modüle etmek için kullanilabilmektedir. Bir yaklasim, mutant bir bitkinin, dogal olarak meydana gelmeyen bir bitkinin, melez bir bitkinin, tarifnamenin bir transjenik bitkisinin bir tohumudur. Tercihen tohum, bir tütün tohumudur. Baska bir yaklasim, polen ya da mutant bir bitkinin bir ovülü, dogal olarak meydana gelen bir bitki, bir melez bitki, tarifnamenin bir transjenik bitkisidir. Ek olarak, mevcut bulus mutasyona ugramis bir bitki, dogal olarak meydana gelmeyen bir bitki, bir melez bitki, tarif edildigi gibi ayrica erkek kisirligi veren bir nükleik asit içeren transjenik bir bitki saglamaktadir. Tarifname ayrica, mutant bitkinin, dogal olarak bulunmayan bitkinin, hibrit bitkinin ya da transjenik bitkinin ya da bunun bir kisminin, ebeveyinin bütün morfolojik ve fizyolojik özelliklerini eksprese edebilen bitkileri rejenere eden bir kisminin yenilenebilir hücrelerinin bir doku kültürünü saglamaktadir. Yenilenebilir hücreleri arasinda, yapraklar, polen, embriyolar, kotiledonlar, hipokotiller, kökler, kök uçlari, anterler, çiçekler ve bunlarin bir kismi, ovüller, sürgünler, saplar, saplar, özü ve kapsüller ya da kalluslar ya da bunlardan türetilen protoplastlar bulunur ancak bunlarla sinirli degildir. Tarifnameye göre modifiye bir mutant izopropilmalat sentaz aIeIi tasiyan bir bitki, yararli soylar, çesitler ve melezler olusturmak için bir bitki yetistirme programinda kullanilabilir. Özellikle, mutant izopropilmalat sentaz aIeIi, yukarida tarif edilmis oldugu üzere ticari açidan önemli çesitlere girmektedir. Dolayisiyla bitkileri yetistirmeye yönelik yöntemler saglanmakta olup, burada açiklandigi sekilde bir mutant bitkiyi, bir dogal olarak meydana gelmeyen bitkiyi ya da bir transjenik bitkiyi farkli bir genetik özdesligi, farkli bir genetik geçmisi, farkli bir çesidi, farkli bir hatti ya da farkli bir melezi olan bir bitki gibi baska bir bitki ile çaprazlamayi, islah etmeyi ya da introgresyona tabi tutumayi içermektedir. Bir yöntem bir mutant bitkinin, bir dogal olarak meydana gelmeyen bitkinin ya da bir transjenik bitkinin Nicotiana familyasinin - Nicotiana tabacum (for example, Burley type) gibi bit bitkisi ya da bir bitki çesidi ya da elit bitki çesidi ile çaprazlanmasini, islah edilmesini ya da introgresyona tabi tutulmasini içermektedir. Yöntem ayrica, soy bitkinin baska bir bitki ile çaprazlanmasini ve istege bagli olarak, arzu edilen genetik özellikler ya da genetik arka plan ile bir soy elde edilene kadar geçisin tekrarlanmasini içerebilmektedir. Yöntem ayrica izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edildigi bir bitkiyi tanimlamaya iliskin adim içerebilmektedir. Yöntem ayrica izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edildigi bir bitkiyi seçmeye iliskin adim içerebilmektedir. Bu tür islah yöntemlerinin hizmet ettigi bir amaç, baska çesitlere, yetistirme soylarina, melezlere ya da çesitlere, özellikle ticari menfaat sahiplerine arzu edilen bir genetik özellik kazandirmaktir. Bir baska amaç ise, tek bir bitki çesidi, soy, melezleri ya da kültür bitkilerinde farkli genlerin genetik modifikasyonlarinin istiflenmesini kolaylastirmaktir. Tür içinin yani sira türler arasi eslesmede düsünülmüstür. Bu kesismelerden dogan ve ayni zamanda yetistirme soylari diye anilan döl bitkileri, tarifnamenin dogal olarak meydana gelmeyen bitkilerinin örnekleridir. Bir yapilanmada dogal olarak meydana gelmeyen bir bitkinin üretilmesi için bir yöntem saglanmakta 0Iup,bu yöntem: (a) döl tütün tohumunu vermek üzere bir ikinci bitki ile bir mutant ya da transgenik bitkinin çaprazlanmasini; (b) dogal olarak meydana gelen bitkinin elde edilmesi Için bitki büyüme kosullari altinda döl tütün tohumunun yetistirilmesini Içermektedir. Yöntem ayrica izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edildigi bir bitkiyi tanimlamaya iliskin opsiyonel adimi içerebilmektedir. Yöntem ayrica izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin bir kontrol bitkisine göre modüle edildigi bir bitkiyi seçmeye iliskin adim içerebilmektedir. Yöntem ayrica asagidakileri içerebilmektedir: (o) dogal olarak meydana gelen bitkinin kendi nesliyle ya da baska bir bitki ile döl tütün tohumu elde etmek amaci ile çaprazlanmasi; (d) adimin (o) döl tütün tohumunu ilave dogal olarak meydana gelmeyen bitkiler elde etmek amaci ile bitki yetistirme kosullari altinda islah edilmesi; ve (e) çaprazlama ve yetistirme adimlarini (c) ve (d) dogal olarak meydana gelmeyen bitkilerin baska nesillerini üretmek amaci ile birden fazla kez tekrarlanmasi. Yöntem istege bagli olarak adimdan (a) önce, karakterize olan ve mutant ya da transjenik bitkiye özdes olmayan bir genetik kimlik içeren bir ebeveyn bitki saglama adimini içerebilmektedir. Bazi yapilanmalarda, yetistirme programina bagli olarak, çaprazlama ve yetistirme asamalari dogal olarak meydana gelmeyen bitkilerin nesillerinin üretilmesi için 0 ile 2 kez, 0 ile 3 kez, 0 ile 4 kere, 0 ile 5 kez, 0 ile 6 kez, 0 ile 7 kez, 0 ile 8 kez, 0 ile 9 kez ya da 0 ile 10 kez arasinda tekrarlanir. Geriye dogru çaprazlama, içerisinde bir dölün ebeveynlerinin birinin genetik kimligine yakin olan bir genetik kimlige sahip olan sonraki nesil içerisinde bir döl bitki elde etmek amaci ile ebeveynlerinden birisi ile ya da ebeveynine genetik olarak benzer olan bir baska bitki ile çaprazlandigi bir metodun bir örnegidir. Bitki islah etme teknikleri, özellikle tütün bitkisi islahi iyi bilinmektedir ve tarifnamenin yöntemlerinda kullanilabilir. Tarifname ayrica, bu yöntemler ile üretilen, elde edilen ya da elde edilebilen dogal olarak meydana gelmeyen bitkiler saglar. Burada tarif edilmis olan yöntemlerin bazi yapilanmalarinda, varyant izopropilmalat sentaz genleri için üreme ve taramadan elde edilen soylar standart tarla prosedürleri kullanilarak tarlada degerlendirilir. Orijinal mutagenize olmayan ebeveyn de dahil olmak üzere kontrol genotipleri dahil edilir ve girisler rastgele tam blok tasarimi ya da diger uygun alan tasariminda düzenlenmektedir. Tütün için, standart tarimsal uygulamalar kullanilir, örnek olarak, tütün hasat edilmeden önce, tartilir ve kimyasal ve diger yaygin testler için kürleme yapilir. Verilerin istatistiksel analizi, seçilen soylarin ana soya benzerligini dogrulamak için gerçeklestirilir. Seçilen bitkilerin sitogenetik analizleri, kromozom komplement ve kromozom çiftlesme iliskilerini dogrulamak için istege bagli olarak gerçeklestirilir. Bir yapilanmada yukarida açiklanan islah etme, çaprazlama ya da introgresyona tabi tutma yöntemleri vasitasiyla elde edilen ya da elde edilebilen bitkiler, cis-abienol üretmeyecektir, büyük oranda cis-abienol üretmeyecektir ya da tespit edilebilir seviyelerde cis-abienol üretmeyecektir. Baska bir yapilanmada sükroz esteri bilesimleri ve burada tarif edilen yöntemler vasitasiyla elde edilen ya da elde edilebilen sükroz esteri bilesimleri cis-abienol içermeyecek ya da ihtiva etmeyecektir, yüksek cis-abienol seviyeleri içermeyecek ya da ihtiva etmeyecektir ya da tespit edilebilir seviyelerde cis-abienol içermeyeoek ya da ihtiva etmeyecektir. cis-abienol özelligi bulunabilmektedir ya da bulunmayabilmektedir. DNA parmak izi, tek nükleotit polimorfizmi, mikrosatellit isaretleyicileri ya da benzer teknikler, burada tarif edilmis oldugu üzere NtMRP gen(ler)ini ya da mutant alellerini baska tütünlere transfer etmek ya da üretmek için bir isaretleyici destekli seçim (MAS) islah etme programinda kullanilabilir. Örnek olarak, bir yetistirici agronomik olarak arzu edilen bir genotipe sahip bir mutant aleli içeren bir genotipin melezlemesinden ayrilan popülasyonlar olusturabilir. F2 ya da geri çapraz nesillerdeki bitkiler, burada listelenen tekniklerden biri kullanilarak bir izopropilmalat sentaz genomik sekansindan ya da bunun bir fragmanindan gelistirilmis bir isaretleyici kullanilarak taranabilir. Mutant alele sahip oldugu belirlenen bitkiler, taranacak ikinci bir popülasyon yaratmak için geri çaprazlanabilir ya da kendi kendine tozlasabilir. Beklenen kalitim modeline ya da kullanilan MAS teknolojisine bagli olarak, seçilen bitkilerin tanimlanmasina yardimci olmak için her bir geri çaprazlama döngüsünden önce seçilen bitkilerin kendi kendine tozlasmasi gerekli olabilir. Tekrarlayan ebeveynin istenen fenotipi geri kazanilincaya kadar geriye dogru çaprazlama ya da baska bir islah prosedürü tekrar edilebilir. Tarifnameye göre, bir yetistirme programinda basarili çaprazlar, verimli olan F1 bitkilerini vermektedir. Seçilen F1 bitkileri, ebeveynlerden biri ile çaprazlanabilir ve ilk geri çapraz nesil bitkileri, varyant izopropilmalat sentaz gen ekspresyonu (örnek olarak, izopropilmalat sentaz geninin sifir versiyonu) için tekrar taranan bir popülasyon üretmek için kendi kendine tozlasir. Geriye dogru çaprazlama, kendi kendine tozlasma ve tarama islemi, örnek olarak son tarama, tekrarlayan ebeveyn ile verimli ve makul ölçüde benzer bir bitki üretene kadar en az 4 kez tekrarlanir. Bu bitki, eger istenirse, kendi kendine tozlastinlir ve sonra bitki, varyant izopropilmalat sentaz gen ekspresyonu sergiledigini teyit etmek üzere sonradan taranir. Bazi yapilanmalarda, F2 neslindeki bir bitki popülasyonu varyant izopropilmalat sentaz gen ekspresyonu için taranir, standart yöntemlere göre örnek olarak, burada tarif edilmis olan izopropilmalat sentaz ekspresyonu için izopropilmalat sentaz bilgisine dayanan primerler ile bir PCR yöntemi kullanilarak bir izopropilmalat sentaz geninin yokluguna bagli olarak izopropilmalat sentaz eksprese etmeyen bir bitki belirlenir. Melez çesitler, bir birinci çesitteki disi ebeveyn bitkilerinin (diger bir deyisle tohum ebeveynleri) kendi kendine tozlasmasini önleyerek, disi ebeveyn bitkilerini döllemek için ikinci bir çesit erkek ebeveyn bitkilerinden polene izin vererek ve disi bitkiler üzerinde F1 melez tohumlarinin olusmasini saglayarak üretilebilmektedir. Çiçeklerin erken evrelerinde çiçeklerin yumusatilmasiyla disi bitkilerin kendi kendine tozlasmasi önlenebilir. Alternatif olarak, disi ebeveyn bitkilerinde bir erkek sterilite formu kullanilarak polen olusumu önlenebilir. Örnek olarak, erkek sterilitesi sitoplazmik erkek sterilite (CMS) ya da bir transgenik erkek sterilite ile üretilebilmekte olup içerisinde bir transgen mikrosporogenez ve/veya polen olusumunu ya da kendiliginden uyumsuzlugu Inhibe eder. CMS içeren disi ebeveyn bitkiler özellikle yararlidir. Disi ebeveyn bitkilerinin CMS oldugu yapilanmalarda, erkek fertil bitkilerden polen toplanir ve CMS disi ebeveyn bitkilerinin stigmalarina elle uygulanir ve sonuçta elde edilen F1 tohumu hasat edilir. Burada tarif edilen çesitler ve soylar tek çapraz F1 melezleri olusturmak için kullanilabilir. Bu tip yapilanmalarda, ebeveyn varyetelerinin bitkileri erkek ebeveyn bitkilerden disi ebeveyn bitkilere dogal çapraz tozlasmayi kolaylastirmak amaci ile esas olarak homojen birlesen popülasyonlar olarak yetistirilebilir. Disi ebeveyn bitkileri üzerinde olusturulan F1 tohumu, geleneksel yollarla seçici olarak hasat edilir. Ayrica iki ana bitki türü toplu olarak yetistirilebilir ve kendi kendine tozlasma sonucu erkek ebeveyn üzerine olusturulan disi ebeveyn ve tohum üzerinde olusan F1 melez tohumunun bir karisimi hasat edilebilir. Alternatif olarak, tek çaprazli bir F1 melezinin disi bir ebeveyn olarak kullanildigi ve farkli bir erkek ebeveyn ile çaprazlandigi üç yönlü çaprazlar gerçeklestirilebilir. Baska bir alternatif olarak, iki çapraz bagin F1 dölünün kendileri çapraz oldugu çift çapraz melezler olusturulabilir. Istenilen bir özelligi ya da fenotipi olan popülasyonun üyeleri için mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkilerin bir popülasyonu taranabilir ya da seçilebilir. Örnek olarak, tek bir transformasyon olayinin progenisi popülasyonu istenen bir polipeptit ya da polinükleotit ekspresyon seviyesine sahip olan bitkiler için taranabilir. Ekspresyon seviyelerini tanimlamak için fiziksel ve biyokimyasal yöntemler kullanilabilir. Bunlar bir polinükleotidin saptanmasi için Southern analizi ya da PCR amplifikasyonu; Northern lekeleri, S1 RNaz korumasi, primer uzanti ya da RNA transkriptlerinin tespit edilmesi için RT-PCR amplifikasyonu; polipeptitlerin ve polinükleotitlerin enzimini ya da ribozim aktivitesini tespit etmek için enzimatik analizler; ve polipeptitleri saptamak için protein jel elektroforezi, Western lekeleri, immünopresipitasyon ve enzime bagli immün testleri içerir. Yerinde melezleme, enzim boyama ve immün boyama gibi baska teknikler de polipeptitlerin ya da polinükleotitlerin varligini ya da ekspresyonunu teSpit etmek için kullanilabilir. Mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transgenik bitki hücreleri ve bitkileri burada tarif edilmekte olup, bunlar bir ya da daha fazla rekombinant polinükleotit - burada açiklanan bir ya da daha fazla izole edilmis polinükleotit gibi - bir ya da daha fazla polinükleotit yapi, bir ya da daha fazla çift sarmalli RNA, bir ya da daha fazla konjugat ya da bir ya da daha fazla vektör/ekspresyon vektörü içermektedir. Ekspresyon, örnek olarak, RT-PCR, Northern blots, RNaz korumasi, primer uzantilari, Western blots, protein jel elektroforezi, immüno-çökeltme, enzime bagli immünotestler, çip deneyleri ve kütle spektrometresi gibi yöntemler kullanilarak degerlendirilebilmektedir. Bir polipeptidin doku tercihli ya da genis ölçüde eksprese eden bir promotörün kontrolü altinda eksprese edilmesi durumunda, ekspresyonun tüm bitkide ya da seçilmis bir dokuda degerlendirilebilecegi belirtilmelidir. Benzer sekilde, bir polipeptit örnek olarak, belirli bir zamanda, gelisimde ya da indüksiyon üzerine eksprese edilirse ekspresyon arzu edilen bir zaman periyodunda seçici olarak degerlendirilebilmektedir. Sinirlama olmaksizin, burada tarif edilmis olan ekspresyon ya da aktivite modüle edilmesinden önce ya da sonra baska amaçlar için modifiye edilebilmektedir. Asagidaki ilave genetik modifikasyonlarin biri ya da daha fazlasi, tarifnamenin mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkilerinde mevcut olabilmektedir. Bir yapilanmada agir metal alimi ya da agir metal tasimasina dahil olan bir ya da daha fazla gen modifiye edilmis olup bu da m0difikasy0n(lar) olmaksizin kontrol bitkilerinden ya da parçalarindan daha düsük bir agir metal içerigine sahip olan bitkilerle ya da bitki kisimlariyla (yapraklar gibi) sonuçlanmaktadir. Sinirlayici olmayan örnekler, katyon difüzyon kolaylastiricilari (CDF) ailesine, Zrt-, Irt-benzeri proteinlerin ailesine (ZIP), katyon degistiricilerin (CAX) ailesine, bakir tasiyicilarin ailesine (COPT), agir metal P-tipi ATPazlar ailesine (W02009074325 sayili belgede tarif edilmis oldugu üzere HMAllar), dogal dirençle iliskili makrofaj proteinlerinin (NRAMP) homologlari ailesi ve kadmiyum gibi agir metallerin tasinmasinda yer alan ATP-baglayici kaset (ABC) tasiyicilari ailesinin bir baska elemanina ait olan genleri içermektedir. Burada kullanildigi haliyle agir metal terimi, geçis metallerini içermektedir. Bir baska yapilanmada, azotlu metabolik ara maddelerin dönüstürülmesine katilan bir ya da daha fazla gen bitkilerle ya da bitkilerin kisimlariyla (yapraklar gibi) sonuçlanacak sekilde modifiye edilmis olup, bunlar isitildiginda, kontrol bitkilerinden ya da bunlarin kisimlarindan daha düsük seviyelerde en az bir tütün spesifik nitrozamin (örnek olarak; Kontrol bitkilerine veya bunlarin parçalarina kiyasla 4- (metilnitrozamino)-1-(3-piridiI)-1 bütanon, N-nitrosonornikotin, N-nitrozoanatabin ve N- nitrozoanabasin) üretmektedir. Degistirilebilen genlerin sinirlayici olmayan örnekleri, nikotinin nornikotine dönüstürülmesine katilan ve WO2006091194, W02008070274, W02009064771 ve PCT/U82011/021088 sayili belgelerde tarif edilen CYP82E4, CYP82E5 ve CYP82E10 gibi bir nikotin demetilazi kodlayan genleri içermektedir. Diger modifikasyonlarin örnekleri herbisid toleransi, örnek olarak glifosati içermekte olup, bu birçok genis spektrumlu herbisidin aktif bir içerigidir. Glifosat dirençli transgenik bitkiler, aroA geninin (Salmonella typhimurium ve E.coli`den bir glifosat EPSP sintetaz) aktarilmasiyla gelistirilmistir. Sülfonilüre dirençli bitkiler, Arabidopsis 'ten mutant ALS (asetolaktat sentetaz) geninin dönüstürülmesiyle üretilmistir. Mutant Amaranthus hibridusundan fotosistem II 'nin 08 proteini atrazine dirençli transgenik bitkiler üretmek amaci ile bitkilere aktarilmistir; ve bromoksinile dirençli transgenik bitkiler, bxn geninin bakteri KlebsieI/a pneumoniae 'den ilave edilmesi ile Üretilmistir. Bir baska örnek modifikasyon, böceklere dirençli bitkilerde ortaya çikmaktadir. BaciI/us thuringiensis (Bt) toksinleri, B-dirençli haserelerin ortaya çikisinin geciktirilmesinin etkili bir yolunu saglayabilir, burada yakin zamanda brokoli içinde gösterildigi gibi, piramitli cry1Ac ve crylc BI genleri, her iki tek proteine dirençli elmas sirt/i güve/eri kontrol eder ve dirençli böcek/erin evrim/'ni önemli ölçüde geciktirmektedir. Bir baska örnek modifikasyon, patojenlerin (örnek olarak virüsler, bakteriler, mantarlar) neden oldugu hastaliklara dirençli olan bitkilerde ortaya çikmaktadir. Hem bir Bt füzyon genini hem de bir kitinaz genini (sari sap deligine direnç ve kilif toleransi) eksprese eden bitkilerle Xa21 genini (bakteri yanikligina karsi direnç) eksprese eden bitkiler yapilandirilmistir. Bir baska örnek modifikasyon, erkek sterilite gibi degistirilmis reprodüktif kabiliyet ile sonuçlanmaktadir. Diger bir örnek modifikasyon, abiyotik strese (örnek olarak, kuraklik, sicaklik, tuzluluk) toleransli olan bitkilerde ortaya çikar ve toleransli transjenik bitkiler, Arabidopsis'ten asil gliserol fosfat enziminin aktarilmasiyla üretilmistir; Mannitol ve sorbitol sentezinde rol oynayan mannitol dehidrojenaz ve sorbitol dehidrogenaz kodlayan genler, kuraklik direncini arttirmaktadir. Bir baska örnek modifikasyon, insanlarda kullanim için uygun immünojenik özelliklere sahip proteinler üreten bitkilerde ortaya çikmaktadir. Örnek olarak, N-glikaninda esas olarak alfa-1,3- baglantili fukoz tortulari, beta-1,2-bagli ksiloz tortulari ya da her ikisinden de yoksun proteinler üretebilen bitkiler kullanilabilmektedir. Diger örnek modifikasyonlar, gelistirilmis depolama proteinleri ve yaglari, gelismis fotosentetik etkinlige sahip bitkiler, uzatilmis raf ömrü olan bitkiler, gelistirilmis karbonhidrat içerigi olan bitkiler ve mantarlara dirençli bitkiler; alkaloidlerin biyosentezinde yer alan bir enzimi kodlayan bitkiler ile sonuçlanabilmektedir. Içerisinde S- adenosiI-L-metionin (SAM) ve/veya sistatiyonin gama-sentaz (CGS) ekspresyonunun modüle edildigi transgenik bitkiler de düsünülmektedir. Bir ya da daha fazla bu tür özellik, baska bir tütün çesidinden elde edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da tütün bitki çesidine intragresyona tabi tutulabilmekte ya da dogrudan buna dönüstürülebilmektedir. Özellik(ler)in, mutasyona ugramis, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkilere introgresyOnu örnegin soya islah etme, geri çaprazlama, iki kat haploid islahi ve benzerleri vasitasiyla gerçeklestirilebilmektedir (bkz. Wernsman, E. A, ve Rufty, RC 1987. Bölüm On Yedi. Tobacco. 669-698 arasi sayfalar Içinde: Cultivar Development. Crop Species. W.H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co., New York, NY 761 pp.). Yukarida tarif edilen moleküler biyoloji-bazli teknikler, özellikle RFLP ve mikrosatelit isaretleyicileri, yinelenen ebeveyn ile en yüksek genetik özdeslige sahip olan progenleri tanimlamak için bu gibi geri çaprazlamalarda kullanilabilmektedir. Bu, yinelenen ebeveyn ile en azindan %90, tercihen en az %95, daha tercihen en az %99 genetik özdeslige sahip, ancak daha tercihen genetik olarak yinelenen ebeveyn ile özdes olan ve ayrica donör ebeveynden introgresyona tabi tutulan özellik(ler)i içeren tütün çesitlerinin üretimini hizlandirmasina izin vermektedir. Genetik kimligin bu sekilde belirlenmesi, teknolojide bilinen moleküler isaretleyiciler temelinde olabilir. Son geri çaprazlama nesli, transfer edilen nükleik asit(ler) için saf üreme soyunu vermek Için kendiliginden olabilir. Elde edilen bitkiler genel olarak, aktarilan özellikler (örnek olarak bir ya da daha fazla tek genli özellik) yani sira, tarifnamenin mutasyona ugramis, dogal olarak bulunmayan ya da transjenik bitkilerin morfolojik ve fizyolojik özelliklerine de sahiptir. Tam geri çaprazlama protokolü, uygun bir test protokolünü belirlemek için degistirilen özellige bagli olacaktir. Her ne kadar transfer edilen özellik dominant bir alel oldugunda geri çaprazlama yöntemleri basitlestirilmis olsa da, resesif bir alel de transfer edilebilmektedir. Bu örnekte, arzu edilen özelligin basarili bir sekilde transfer edilip edilmedigini belirlemek için dölün bir testinin yapilmasi gerekli olabilir. Bir bitki ya da bitki hücresi, stabil olarak dönüstürülmek üzere rekombinant polinükleotidin genomuna entegre edilmesi sureti ile dönüstürülebilir. Stabil olarak dönüstürülmüs hücreler tipik olarak her bir hücre bölünmesi ile dahil edilen polinükleotidi muhafaza etmektedir. Bir bitki ya da bitki hücresi rekombinant polinükleotidin genomuna entegre edilmeyecegi sekilde geçici olarak transforme edilebilir. Geçici olarak transforme edilen hücreler tipik olarak her bir hücre bölünmesi ile birlikte verilen rekombinant polinükleotitin tamamini ya da bir kismini kaybetmekte olup, böylelikle bir araya getirilen rekombinant polinükleotit yeterli sayida hücre bölünmesinden sonra yavru hücrelerde tespit edilemez. Proteinler (örnek olarak, antikorlar), yag asidi zincirleri, seker kökleri, glikoproteinler, polimerler (örnek olarak, polietilen glikol) ya da bunlarin kombinasyonlari gibi makromoleküler bilesikleri içeren konjuge edilmis kisimlar açiklanmaktadir. Bir oligonükleotid, oligonükleotitin hücresel alimini arttiran bir parçaya konjuge edilebilir. Kisimlarin sinirlayici olmayan Örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, antikorlar, polipeptitler, bir kolesterol parçasi gibi Iipit parçalari, kolik asit, bir tiyoeter, örnek olarak, keksiI-s-tritiltiol, bir tiokolesterol, bir alifatik zincir, örnek olarak; dodesandiol ya da undesil kalintilari, bir fosfolipid, bir poliamid ya da bir polietilen glikol zinciri, bir adamante asetik asit, bir palmitil kismi, bir oktadesilamin ya da hekzilamino-karbonil- oksikolesterol kismi içermektedir. Kisim pozitif yüklü bir polimer olabilir - örnek olarak, yaklasik 1 ile 50 amino asit kökü ya da polietilen glikol (PEG) ya da polipropilen glikol gibi polialkilen oksit gibi pozitif yüklü bir peptit olabilir. Uygun olarak, bir polialkilen oksit gibi pozitif yüklü polimer, serbest birakabilir bir baglayici gibi bir baglayici vasitasiyla oligomere baglanabilir. Polipeptit ekspresyonu ölçüldügü zaman hücredeki polipeptidi kodlayan mRNA miktarinin tespit edilmesi örnegin PCR ya da Northern blot vasitasiyla yapilabilir. Örnekteki polipeptitin miktarindaki bir degisimin ölçüldügü zaman anti-NtHMA antikorlarinin kullanimi vasitasiyla NtHMA'nin tespit edilmesi bilinen teknikler kullanilarak polipeptidin miktarinin belirlenmesi için kullanilabilir. Alternatif olarak enzimin biyolojik aktivitesi, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak ölçülebilmektedir. Bir baska yapilanmada polipeptitler ile immünoreaktif olan antikorlar burada saglanmaktadir. Burada açiklandigi sekilde polipeptitler, fragmanlar, varyantlar, füzyon polipeptitleri ve benzerleri bunlarla immünoreaktif olan antikkorlarin üretiminde "immünojenler" olarak kullanilabilmektedir. Bu tür antikorlar spesifik olarak polipeptide antikorun antijen baglanma alanlarinda baglanmaktadir. Spesifik olarak baglanma antikorlari bir polipepti, homologlari ve varyantlari spesifik olarak ayirt eden ve bunlarla baglanan ancak diger moleküllerle baglanmayanlardir. Bir yapilanmada antikorlar burada belirtilmis olan bir amino asit sekansina sahip olan polipeptitlere özgüdür ve diger polipeptitlerle çapraz etkilesime girmemektedir. Daha spesifik olarak polipeptitler, parça, varyantlar, füzyon polipeptitler ve benzerleri antikorlarin olusumunu meydana getiren antijenik belirleyiciler ya da epitoplar içermektedir. Bu antijenik belirleyiciler veya epitoplar gerek lineer gerekse konformasyonel (kesintili) olabilir. Lineer epitoplar polipeptitin amino asitlerinin tek bir seçiminden olusurken konformasyonel veya kesintili epitoplar polipeptit katlanmasi üzerine yakin hale gelen polipeptitin farkli bölgelerinden amino asit kisimlarindan olusmaktadir. Epitoplar teknikte bilinen yöntemlerin herhangi biri araciligiyla tanimlanabilir. Ek olarak polipeptitlerden epitoplar analizlerde ve poliklonal sera ya da kültürlenen hibridomalardan süpernatantlar gibi maddelerden spesifik baglanma antikorlarini saflastirmak için arastirma ayiraçlari olarak kullanilabilir. Bu tür epitoplar ya da bunlarin varyantlari teknikte bilinen kati faz sentezi, kimyasal ya da enzimatik polipeptit klevaji gibi teknikler kullanilarak ya da rekombinant teknoloji kullanilarak üretilebilir. Polipeptitlere yönelik hem poliklonal hem de monoklonal antikorlar geleneksel teknikler araciligiyla hazirlanabilir. Polipeptitlere özgü monoklonal antikorlar üreten hibridoma hücre hatlari ayrica burada tasarlanmistir. Bu tür hibridomalar geleneksel teknikler araciligiyla üretilebilir ve tanimlanabilir. Antikorlarin üretimi için çesitli konak hayvanlar bir polipeptit, fragman, varyant ya da bunlarin mutantlari ile enjeksiyon vasitasiyla immün hale getirilebilmektedir. Bu tür konak hayvanlar tavsanlari, fareleri ve siçanlari içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Çesitli adjuanlar immünolojik tepkiyi arttirmak için kullanilabilir. Konak türlere dayanarak bu tür yardimcilar Freund '8 (tam ve tam olmayan), alüminyum hidroksit gibi mineral jeller, yüzey aktif maddeler örnegin lisolesitin, pluronik polioller, polianyonlar, peptitler, yag emülsiyonlari, anahtar deligi Iimpet hemosiyanin, dinitrofenol ve potansiyel olarak faydali insan adjuvanlari örnegin BCG (bacille Calmette-Guerin) ve Corynebacterium parvum içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Monokonal antikorlar geleneksel teknikler araciligiyla geri kazanilabilir. Bu tür monoklonal antikorlar IgG, IgM, IgE, IgA, IgD ve bunlarin herhangi bir alt sinifi dahil herhangi bir immünoglobulin sinifindan olabilir. Antikorlar ayrica polipeptitlerin ya da fragmanlarinin gerek in vitro gerekse in vi'vo mevcudiyetini tespit etmek için kullanilabilir. Antikorlar ayrica immünoafinite kromatografi vasitasiyla polipeptitleri ya da fragmanlarini saflastirmakta kullanilabilir. Çesitli düzenlemeler, mutant bitkiler, dogal olarak meydana gelmeyen bitkiler ya da transgenik bitkilerin yani sira izopropilmalat sentaz polinükleotidinin ekspresyon seviyesinin indirgenmis oldugu biyokütle saglar, böylece bunlarda daha düsük miktarlarda kadmiyum birikir. Bu tür bitkilerin, özellikle de tütün bitkilerinin ve daha özel olarak yaprak lamina ve tütün bitkilerinin ortasinin parçalari, aerosol Olusturucu malzemeler, aerosol olusturan cihazlar, tütün ürünleri, sigara olarak içilebilen nesneler, dumansiz ürünler ve tütün ürünleri dahil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmamak kaydiyla çesitli tüketim ürünlerinin içerisine dahil edilebilir ya da bunlarin yapiminda kullanilabilir. Aerosol Olusturucu malzemelerin örnekleri tütün bilesimleri, tütünler, tütün ekstresi, kesilmis tütün, kesilmis dolgu, kürlenmis tütün, genisletilmis tütün, pestil tütün, yapisi yeniden kazandirilmis tütün ve pipo tütünlerini içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Sigara ürünleri ve sigara olarak içilebilir ürünler aerosol olusturma cihazlarinin tipleridir. Sigara ürünleri ya da sigara olarak içilebilir ürünler sigaralari, sigarillolari ve purolari içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Dumansiz ürünlerin örnekleri çigneme tütünleri ve enfiye içerir. Belirli aerosol Olusturucu cihazlarda, yanma yerine, bir tütün bilesimi ya da baska bir aerosol Olusturucu malzeme, bir aerosol üretmek üzere bir ya da daha fazla elektrikli isitma elemani tarafindan isitilmaktadir. Isitmali sigara içim ürününün bir baska tipinde bir aerosol, isinin bir tutusturulabilir ya da kimyasal isi kaynagindan fiziksel olarak ayri bir aerosol olusturan malzemeye aktarimi ile üretilmekte olup, bu malzeme isi kaynaginin içerisinde, etrafinda ya da asagi akim yönünde bulunabilir. Dumansiz tütün ürünleri ve çesitli tütün içeren aerosol olusturan malzemeler herhangi bir formda tütün içerebilmekte olup, bunlar pullar, filmler, köpükler veya boncuk gibi herhangi bir formatta diger içerige ilave edilen, içerisine karistirilan, bununla çevrelenen ya da baska türlü bir araya getirilen kuru parçaciklar, granüller, seritler, tozlar ya da bir bulamaci içermektedir. Burada kullanilmis oldugu üzere, "duman" terimi, sigaralar gibi tütün ürünleri ile üretilen ya da bir aerosol Olusturucu malzemenin yakilmasiyla üretilen bir aerosol türünü tarif etmek için kullanilir. Bir yapilanmada, ayrica burada tarif edilmis olan mutant, transjenik ve dogal olarak meydana gelmeyen bitkilerden kürlenmis malzeme saglanmaktadir. Yesil tütün yapraklarinin kürlenmesi islemleri, teknikte uzman kisilerce bilinir ve bunlarla sinirli olmamak üzere, hava ile kürleme, atesleme, firinda kürleme ve günesle sertlestirme içermektedir. Yesil tütün yapraklarini kürleme islemi, hasat edilen tütün türüne baglidir. Örnek olarak, Virginia flue (parlak) tütün, tipik olarak firinda kürlenirken, Burley ve bazi koyu türler genellikle hava ile kurutulur ve pipo tütünü, çigneme tütünü ve enfiye genellikle ateste kurutulmaktadir. Bir baska yapilanmada, mutant tütün bitkilerinden, transgenik tütün bitkilerinden ya da burada tarif edilmis olan dogal olarak meydana gelmeyen tütün bitkilerinden yapilan yapraklar, tercihen de kürlenmis yapraklar içeren tütün içeren aerosol olusturan malzemeler tarif edilmistir. Burada tarif edilmis olan tütün mamulleri ayrica modifiye edilmemis tütün de içerebilen bir harmanlanmis tütün mamulü olabilir. Aerosol olusturan malzemeleri ya da tütün bilesimleri içerisindeki sükroz esterlerin yüzdesi, mutant olmayan, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik olmayan karsi bitkilerden türetilen aerosol olusturan malzemeler ya da tütün ile karsilastirildigi zaman %5, %10, %15, %20, %25, %30, %35, %40, %45, %50, %55, %60, %65, %70, %75, %80, %85, %90, %95, %96, %97, %98, %99 ve %100, %150 ya da %200 ya da daha yüksek bir degerdedir. Aerosol olusturan malzemeleri ya da tütün bilesimleri içerisindeki sükroz esterlerin yüzdesi, mutant olmayan, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik olmayan karsi bitkilerden türetilen aerosol olusturan malzemeler ya da tütün ile karsilastirildigi zaman %5, %10, %15, %20, %25, %30, %35, %40, %45, %50, %55, %60, %65, %70, %75, %80, %85, %90, %95, %96, %97, %98, %99 ve %100'den daha düsük bir degerdedir. Mutant, dogal olarak olusmayan ya da transjenik bitkiler, örnek olarak tarimda baska kullanimlara sahip olabilir. Örnek olarak burada tarif edilen mutant, dogal olmayan ya da transgenik bitkiler, hayvan yemi ve insan gida ürünlerini yapmak için kullanilabilir. Tarifname ayrica mutant bitkinin, dogal olarak meydana gelmeyen bitkinin ya da burada tarif edilen transgenik bitkinin yetistirilmesini ve ekili bitkilerden tohumlarin toplanmasini içeren tohumlarin üretilmesine yönelik yöntemler da saglamaktadir. Burada tarif edilmis olan bitkilerden elde edilen tohumlar, bir imalat ürününün olusturulmasi için teknikte bilinen araçlarla ambalajlama malzemesinde ambalajlanabilir ve paketlenebilir. Kagit ve bez gibi ambalaj malzemeleri teknikte iyi bilinmektedir. Bir tohum paketi, örnek olarak, ambalaj malzemesine tutturulmus bir etiket ya da çikartma, ambalaj malzemesi üzerine basilmis bir etiket ya da paketin içerisine yerlestirilen bir etiketin içindeki etiketin niteligini anlatan bir etikete sahip olabilir. Baska bir yaklasim sükroz esterleri içeren bir bilesim üretmeye yönelik bir yöntem ile ilgili olup, asagidaki adimlari içermektedir: (a) bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitki parçasinin; biyokütle, tohum ya da yapraklarin ya da burada açiklandigi gibi tütün ürününün saglanmasi ve (b) buradan sükroz esterlerinin ekstrakte edilmesi ve (c) opsiyonel olarak sükroz esterlerinin saflastirilmasi. Bir baska yaklasim, beta-metilvaerik üretmeye yönelik bir yöntem ile ilgili olup, asagidaki adimlari içermektedir: (a) bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitki parçasinin; biyokütle, tohum ya da yapraklarin ya da burada açiklana aerosol olusturan malzemenin saglanmasi; (b) adimda (a) elde edilen malzemenin ya da bunun bir ekstraktinin hirolize edilmesi ve (o) opsiyonel olarak beta-metilvalerik asidin toplanmasi. Beta-metilvalerik asit, polihidroksialkanoatlarin ve plastikler dahil malzemelere faydali özellikler verebilen benzerlerinin üretiminde kullanilabilmektedir. Üretilebilen plastikler biyolojik olarak parçalanabilmektedir ve dolayisiyla biyoplastiklerin üretiminde kullanilabilmektedir. Bir bakteri - örnegin E. coli or Pseudomonas - burada tarif edilen izopropilmalat sentazi eksprese etmek için üretilebilmektedir. Uygun olarak kullanilan bakteri ayrica polihidroksialkanoatlar üretmek Için üretilebilmektedir. Mikrobiyal sistemler kullanarak polihidroksialkanoatlarin üretimine yönelik yöntemler, örnegin US5,750,848 ve U88,492,134 sayili patent belgelerinde açiklanmaktadir. Dolayisiyla bir yaklasim izopropilmalat sentaz ve opsiyonel olarak bir polihidroksialkanoat üretmeye yönelik bir ya da daha fazla gen içeren bir bakteri ile ilgilidir. Baska bir yaklasim, polihidroksialkanoat üretmeye yönelik bir yöntem ile ilgili olup, bakterinin kullanimini içermektedir. Bir yapilanmada, ayrica burada tarif edilen mutant, transjenik ve dogal olarak meydana gelmeyen bitkilerden kürlenmis malzeme saglanmaktadir. Yesil tütün yapraklarinin kürlenmesi islemleri, teknikte uzman kisilerce bilinmektedir ve bunlarla sinirli olmamak üzere, hava ile kürleme, atesleme, firinda kürleme ve günesle kürlemeyi içermektedir. Yesil tütün yapraklarini kürleme islemi, hasat edilen tütün türüne baglidir. Örnek olarak, Virginia flue (parlak) tütün, tipik olarak firinda kürlenirken, Burley ve bazi koyu türler genellikle hava ile kurutulur ve pipo tütünü, çigneme tütünü ve enfiye genellikle ateste kurutulmaktadir. Baska bir yapilanmada burada tarif edilen mutant, transjenik ve dogal olarak meydna gelmeyen bitkilerden yapraklari, örnegin kürlenmis yapraklari içeren ya da burada tarif edilen yöntemler vasitasiyla üretilen tütün ürünleri dahil olmak üzere tütün ürünleri açiklanmaktadir. Burada tarif edilen tütün ürünleri ayrica modifiye edilmemis tütün de içerebilmektedir. Bir baska yapilanmada, bitki malzemesi, tercihen burada tarif edilen mutant, transjenik ya da dogal olarak meydana gelmeyen tütün bitkilerinden yapraklari - kürlenmis yapraklar gibi - içeren tütün ürünleri tarif edilmektedir. Örnegin bitki malzemesi tütün ürününün içine ya da disina eklenebilmektedir ve böylece yanmasi üzerine istenen bir aroma salinmaktadir. Bu yapilanmaya göre tütün ürünü modifiye edilmemis bir tütün ya da modifiye edilmis bir tütün bile olabilmektedir. Bu yapilanmaya göre tütün ürünü burada açiklanan genlerden baska bir ya da daha fazla gende modifikasyonlara sahip olan bir mutant, transjenik ya da dogal olarak meydana gelmeyen bir bitkiden türetilebilmektedir. Baska bir yaklasim (izole edilmis) bir sükroz esteri bilesimi ile ilgili olup, burada tarif edilen sükroz esterlerinin bir ya da daha fazlasini içermektedir, bunlardan olusmaktadir ya da esasen bunlardan olusmaktadir. Sükroz esteri R1, R2 ve R4'teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 14 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4tteki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 15 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4tteki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 16 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4"teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 17 oldugu bir sükroz esteri ve R1, R2 ve R4"teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 18 oldugu bir sükroz esteri olabilmektedir. Bu karbon sayisinin bulunmasi kosuluyla bilesen asil zincirleri Sekil 6'da gösterilenlerin herhangi birinden seçilebilmektedir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3"te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Uygun olarak asil zincirlerinin biri ya da daha fazlasi, ikisi ya da daha fazlasi ya da üçü ya da daha fazlasi, beta-metilvaleril olacaktir. Dolayisiyla örnek yolula sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen, R3=asetil, R1 =pr0pi0nil ya da bunun bir izomeri, R2: propionil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4= valeril ya da bunun bir izomeri ve R52in hidrojen ya da aseti oldugu ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5"in hidrojen ya da asetil (0201420) oldugu sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterile, burada R3=asetil, R1=pr0pi0nil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2: hekzanoil ya da bunun bir izomerii R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5,in hidrojen ya da asetil (CZC15:0) oldugu bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil (C2C16:0) oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5,te gösterilen, burada R3 asetildir, R1 propinoil ya da bunun bir izomeridir R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (CZC16:0) oldugu bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen ve R3'ün asetil oldugu, R1'in valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (02C17:0) oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen burada R3'ün asetil oldugu, R1'in hekzanoil oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in gerek bir hidrojen atomu gerekse bir asetil kismi (C2C1810) oldugu bir sükroz esteri olabilmektedir. Alternatif olarak sükroz esteri R1, R2 ve R4`teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 14 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4'teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 15 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4`teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 16 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4"teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 17 oldugu bir sükroz esteri ve R1, R2 ve R4'teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 18 oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde olmadigi bir sükroz esteri (C2C18:0) olabilmektedir. Bu karbon sayisinin bulunmasi kosuluyla bilesen asil zincirleri Sekil 6'de gösterilenlerin herhangi birinden seçilebilmektedir. Uygun olarak sükroz esteri R31te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Uygun olarak asil zincirlerinin biri ya da daha fazlasi, ikisi ya da daha fazlasi ya da üçü ya da daha fazlasi, beta-metilvaleril olacaktir. Dolayisiyla örnek yolula sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen, R3=asetil, R1 :propionil ya da bunun bir izomeri, R2: propionil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=propi0nil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5',in hidrojen ya da aseti oldugu ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri. R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R51in hidrojen ya da asetil (CZC14:0) oldugu sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterile, burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5*te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2: hekzanoil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil (C2C1520) oldugu bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil (C2C16:0) oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil Site gösterilen, burada R3 asetildir, R1 propinoil ya da bunun bir izomeridir R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (CZC16:O) oldugu bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen ve R3`ün asetil oldugu, R1`in valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (CZC17:O) oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen burada R3'ün asetil oldugu, R1'in hekzanoil oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in gerek bir hidrojen atomu gerekse bir asetil kismi (C2C18:0) oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde bulunmadigi bir sükroz esteri olabilmektedir. Alternatif olarak sükroz esteri R1, R2 ve R4`teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 14 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4'teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 15 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4`teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 16 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4"teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 17 oldugu bir sükroz esteri ve R1, R2 ve R4'teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 18 oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde olmadigi bir sükroz esteri olabilmektedir. Bu karbon sayisinin bulunmasi kosuluyla bilesen asil zincirleri Sekil @da gösterilenlerin herhangi birinden seçilebilmektedir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Uygun olarak asil zincirlerinin biri ya da daha fazlasi, ikisi ya da daha fazlasi ya da üçü ya da daha fazlasi, beta-metilvaleril olacaktir. Dolayisiyla örnek yolula sükroz esteri Sekil 5'te gösterilen, R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2: propionil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5`in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da aseti oldugu ya da Sekil 5'te gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil (C2C14:O) oldugu sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterile, burada R3=asetil, R1 :propionil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2: hekzanoil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil (C2C1520) oldugu bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil (C2C16:0) oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil Site gösterilen, burada R3 asetildir, R1 propinoil ya da bunun bir izomeridir R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (CZC16:O) oldugu bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen ve R3`ün asetil oldugu, R1`in valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde bulunmadigi bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen burada R3'ün asetil oldugu, R1'in hekzanoil oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in gerek bir hidrojen atomu gerekse bir asetil klSmI (CZC18:0) oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde bulunmadigi bir sükroz esteri olabilmektedir. Alternatif olarak sükroz esteri R1. R2 ve R4'teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 14 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4`teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 15 oldugu bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4"teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 16 oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde bulunmadigi bir sükroz esteri; R1, R2 ve R4'teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 17 oldugu bir sükroz esteri ve R1, R2 ve R4'teki asil zincirlerindeki karbonlarin toplam sayisinin 18 oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde olmadigi bir sükroz esteri olabilmektedir. Bu karbon sayisinin bulunmasi kosuluyla bilesen asil zincirleri Sekil 6"da gösterilenlerin herhangi birinden seçilebilmektedir. Uygun olarak sükroz esteri R3ite bir asetile ve R5'te bir asetile ya da hidrojene sahiptir. Uygun olarak sükroz esteri R3'te bir asetile ve R5'te bir hidrojene sahiptir. Uygun olarak asil zincirlerinin biri ya da daha fazlasi, ikisi ya da daha fazlasi ya da üçü ya da daha fazlasi, beta-metilvaleril olacaktir. Dolayisiyla örnek yolula sükroz esteri Sekil 5Ste gösterilen, R3=asetil, R1=propionil ya da bunun bir izomeri, R2: propionil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=pr0pionil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da aseti oldugu ya da Sekil Site gösterilen bir sükroz esteridir, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzan0il ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil (C2C1410) oldugu sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterile, burada R3=asetil, R1 =propionil ya da bunun bir izomeri, R2= valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=valeril ya da bunun bir izomeri ve R5`in hidrojen ya da asetil oldugu bir sükroz esteri ya da Sekil 5"te gösterilen, burada R3=asetil, R1=bütiril ya da bunun bir izomeri, R2= hekzanoil ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5'in hidrojen ya da asetil (C2C15:0) oldugu bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen, burada R3=asetil, R1=valeril ya da bunun bir izomeri, R2: valeril ya da bunun bir izomeri, R4=hekzanoil ya da bunun bir izomeri ve R5,in hidrojen ya da asetil (C2C16:0) oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde bulunmadigi bir sükroz esteri ya da Sekil 5ite gösterilen, burada R3 asetildir, R1 propinoil ya da bunun bir izomeridir R2 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir, R4 hekzanoil ya da bunun bir izomeridir ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi (CZC16:O) oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde bulunmadigi bir sükroz esteri; Sekil 5'te gösterilen ve R3`ün asetil oldugu, R1'in valeril ya da bunun bir izomeri oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in ya bir hidrojen atomu ya da bir asetil kismi oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde bulunmadigi bir sükroz esteri ya da Sekil 5'te gösterilen burada R3'ün asetil oldugu, R1'in hekzanoil oldugu, R2'nin hekzanoil oldugu, R4'ün hekzanoil oldugu ve R5'in gerek bir hidrojen atomu gerekse bir asetil kismi (CZC18:0) oldugu, bulunmadigi, büyük oranda bulunmadigi ya da tespit edilebilir seviyelerde bulunmadigi bir sükroz esteri olabilmektedir. Baska bir yön bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitki (uygun olarak bir tütün bitkisi) ile ilgili olup, burada tarif edilen izopropilmalat sentazin ekspresyou ya da bununla kodlanan proteinin aktivitesi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da bununla kodlanan proteinin aktivitesinin arttirilmis oldugu bir kontrol ile karsilastirildiginda artmaktadir ve burada söz konusu bitki söz konusu kontrol bitkisinden daha yüksek seviyelerde sükroz esterleri içeren beta-metilvaleri üretmektedir. Baska bir yön bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitki (uygun olarak bir tütün bitkisi) ile ilgili olup, burada tarif edilen izopropilmalat sentazin ekspresyou ya da bununla kodlanan proteinin aktivitesi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da bununla kodlanan proteinin aktivitesinin azaltilmis oldugu bir kontrol ile karsilastirildiginda azalmaktadir ve burada söz konusu bitki söz konusu kontrol bitkisinden daha düsük seviyelerde sükroz esterleri içeren beta-metilvaleri üretmektedir. Baska bir yön bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik flue oured tütün bitkisi) ile ilgili olup, burada tarif edilen izopropilmalat sentazin ekspresyou ya da bununla kodlanan proteinin aktivitesi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da bununla kodlanan proteinin aktivitesinin arttirilmis oldugu bir kontrol ile karsilastirildiginda artmaktadir ve burada sükroz esterlerini içeren beta-metilvalerilin üretimi söz konusu bitkiden daha yüksektir. Baska bir yön bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik oriental tütün bitkisi) ile ilgili olup, burada tarif edilen izopropilmalat sentazin ekspresyou ya da bununla kodlanan proteinin aktivitesi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da bununla kodlanan proteinin aktivitesinin azaltilmis oldugu bir kontrol ile karsilastirildiginda azalmaktadir ve burada söz konusu bitki söz konusu kontrol bitkisinden daha düsük seviyelerde sükroz esterleri içeren beta- metilvaleri üretmektedir. Burada tarif edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik tütün bitkileri toplanabilmekte ve buradan türetilen tütün seçilen tütün tipi için bilinen uygulamalar kullanilarak islenebilmekte ya da kürlenebilmektedir. Yaprak yüzeyi örnegin su ya da organik solvent yikamalari kullanilarak toplanabilmektedir ve sonrasinda kurutulabilmektedir. Meydana gelen toz daha sonra sigara malzemesinin aroma özelliklerini arttirmak için kullanilabilmektedir. Yikamalardan sonra kalan tütün malzemesi daha sonra örnegin genisletilmis tütün için malzeme olarak kullanilabilmektedir. Bir baska yaklasimda bir bitkinin en azindan bir kisminda böcek direncini modüle etmeye yönelik bir yöntem saglanmakta olup, asagidaki adimlari içermektedir: (i) bitkideki izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmesi, burada izopropilmalat sentaz burada açiklanan polipeptit sekansini ya da polinükleoitit sekansini içermektedir; (ii) adimda (i) elde edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkisinin en azindan bir kismindaki sükroz esterlerinin miktarinin ölçülmesi; (iii) burada sükrz estetrleri içeren beta- metilvaleril miktarinin izopropilmalat sentazin ekpresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmemis oldugu bir kontrol ile karsilastirildiginda degismemis olan bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin tanimlanmasi ve (iv) böcek direncinin modüle edilmis oldugu bir bitkinin elde edilmesi ve tercihen burada söz konusu mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin görsel görünüsü kontrol bitkisi ile büyük oranda aynidir. Uygun olarak bir bitkinin en azindan bir kisminda böcek direncini arttirmaya yönelik bir yöntem saglanmakta olup, asagidaki adimlari içermektedir: (i) bitkideki izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin arttirilmasi, burada izopropilmalat sentaz burada açiklanan polipeptit sekansini ya da polinükleoitit sekansini içermektedir; (ii) adimda (i) elde edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkisinin en azindan bir kismindaki sükroz esterlerinin miktarinin ölçülmesi; (iii) burada sükroz esterleri içeren beta-metilvaleril miktarinin izopropilmalat sentazin ekpresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmemis oldugu bir kontrol ile karsilastirildiginda artmis olan bir mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin tanimlanmasi ve (iv) böcek direncinin arttirilmis oldugu bir bitkinin elde edilmesi ve tercihen burada söz konusu mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkinin görsel görünüsü kontrol bitkisi ile büyük oranda aynidir. Söz konusu yöntem vasitasiyla elde edilen ya da elde edilebilen bir bitki ya da bitki malzemesi saglanmaktadir. Baska bir yaklasim mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bir bitki ile ilgili olup, burada izopropilmalat sentazin ekspresyonu ya da vasitasiya kodlanan proteinin aktivitesi modüle edilmektedir ve bitkinin en azindan bir kismi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmemis oldugu bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz esterlerinin bilesiminde bir degisime sahiptir ve burada söz konusu bitkinin görsel görünüsü kontrol bitkisi ile büyük oranda aynidir ve burada böcek direnci ayrica modüle edilmektedir. Uygun sekilde mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bir bitki saglanmakta olup, burada izopropilmalat sentazin ekspresyonu ya da vasitasiya kodlanan proteinin aktivitesi arttirilmaktadir ve bitkinin en azindan bir kismi, izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin arttirilmamis oldugu bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda sükroz esterlerinin bilesiminde bir degisime sahiptir ve burada söz konusu bitkinin görsel görünüsü kontrol bitkisi ile büyük oranda aynidir ve burada böcek direnci ayrica arttirilmaktadir. Tanimlama, seçme ya da islah etme için bitkileri genotiplerine ayirmaya yönelik bilesimler, yöntemler ve kitler, tarifname ile kapsanmaktadir ve bir polinükleotid numunesinde bir izopropilmalat sentazin polinükleotidinin varligini saptamak için bir araç içerebilmektedir. Buna göre, izopropilmalat sentazin polinükleotidinin en azindan bir bölümünü ve istege bagli olarak bir ya da daha fazla prob ve istege bagli olarak amplifikasyon ya da saptamanin gerçeklestirilmesi için bir ya da daha fazla reaktifin yükseltilmesi için daha fazla primerin birini içeren bir kompozisyon tarif edilmektedir. Buna göre, izopropilmalat sentazin polinükleotidine karsilik gelen yaklasik 10 ya da daha fazla bitisik polinükleotid içeren gen spesifik oligonükleotit primerleri ya da problari tarif edilmektedir. Bahsi geçen primerler ya da problar, izopropilmalat sentazin polinükleotitine melezlenen (örnek olarak spesifik olarak melezleme) yaklasik 15, 20, , 30, 40, 45 ya da 50 daha fazla bitisik polinükleotit içerebilir ya da bunlardan meydana gelebimektedlir. Bazi yapilanmalarda, primerler ya da problar yaklasik 10 ile 50 bitisik nükleotit, yaklasik 10 ile 40 bitisik nükleotit, yaklasik 10 ile 30 bitisik nükleotit ya da yaklasik 15 ile 30 bitisik nükleotit içerebilmekte ya da bunlardan meydana gelebilmekte olup, bunlar gen tanimlamasinin sekansa bagli yöntemlerinda (örnek olarak, Southern melezlemesi) ya da izolasyonda (örnek olarak, bakteriyel kolonilerin ya da bakteriyofaj plaklarinin yerinde melezlemesi) ya da gen tespitinde (örnek olarak, nükleik asit yükseltmesi ya da saptamasinda bir ya da daha fazla amplifikasyon primeri olarak) kullanilabilir. Bu bir ya da daha fazla spesifik primer ya da prob, izopropilmalat sentazin polinükleotidinin bir parçasini ya da tamamini büyütmek ya da tespit etmek üzere dizayn edilebilir ve kullanilabilir. Spesifik örnekleme yoluyla, iki primer izopropilmalat sentazin nükleik asidini kodlayan bir nükleik asit fragmanini - örnek olarak DNA ya da RNA gibi - çogaltmak için bir polimeraz zincir reaksiyon protokolünde kullanilabilir. Polimeraz zincir reaksiyonu, izopropilmalat sentaz nükleik asit sekansindan türetilmis bir primer ve izopropilmalat sentaz nükleik asit sekansinin yukarisindaki ya da asagisindaki bir sekansa melezlenen bir ikinci primer kullanilarak da gerçeklestirilebilir - örnegin bir izopropilmalat sentaz promotör sekansi, mRNA öncüsünün 3' ucu ya da bir vektörden türetilen bir sekans. Polinükleotidlerin in vitro amplifikasyonu için kullanisli termal ve izotermal tekniklerin örnekleri, teknikte iyi bilinmektedir. Numune, bir bitki, bir bitki hücresi ya da bitki malzemesi ya da bitkiden, bitki hücresinden ya da burada tarif edilen bitkisel malzemeden yapilmis ya da türetilmis bir tütün ürününden elde edilebilir ya da türetilebilir. Böylece, baska bir yaklasimda, bir numunede bir izopropilmalat sentaz polinükleotidinin saptanmasi için bir yöntem saglanmis olup, asagidaki adimlari içermektedir: (a) bir polinükleotit içeren ya da içermesinden süphelenilen bir numunenin saglanmasi; (b) izopropilmalat sentaz polinükleotidinin en azindan bir kismini spesifik olarak tespit etmek için söz konusu numuneyi daha fazla primer ya da bir ya da daha fazla prob ile temas ettirme; ve (0) bir amplifikasyon ürününün varligini belirleme adimlarini içermekte olup, içerisinde bir amplifikasyon ürününün varligi, numunedeki polinükleotidinin varliginin göstergesidir. Bir baska yaklasimda, polinükleotidinin en azindan bir bölümünü spesifik olarak saptamak için daha fazla primerin ya da probun kullanilmasi da saglanmaktadir. Izopropil sentaz polinükleotidinin en azindan bir kismini saptamak için olan kitler de saglanmis olup, bunlar izopropilmalat sentaz polinükleotidinin en azindan bir kismini spesifik olarak saptamak için daha fazla primer ya da probdan birini içermektedir. Kit polinükleotid amplifikasyonu için reaktifler - örnek olarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) - ya da nükleik asit probu melezleme tespit teknolojisi için - örnek olarak Southern Blots, Northern Blots, in-situ melezleme ya da mikro sekans gibi - reaktifler içerebilir. Kit, Western Blots, ELISA, SELDI kütle spektrometrisi ya da test seritleri gibi antikor baglama tespit teknolojisi için reaktifler içerebilir. Kit, nükleik asit sekanslama için reaktifler içerebilir. Kit, sükroz esteri içeriginin belirlenmesi için ayraçlar ve/veya talimatlar içerebilir. Bazi yapilanmalarda, bir kit tarif edilen yöntemlerdan biri ya da daha fazlasi için talimatlar içerebilir. Tarif edilen kitler, özellikle ortak dominant puanlama ile genetik kimlik belirleme, filogenetik çalismalar, genotipleme, haplotipleme, pedigri analizi ya da bitki islahi için yararli olabilir. Mevcut tarifname ayrica bir bitkinin, bir izopropilmalat sentaz polinükleotitini içeren bir bitki hücresinin ya da bitki malzemesinin genotipinin belirlenmesine yönelik bir yöntem da saglar. Genotipleme, bir kromozom çiftinin homologlarini ayirt etmenin bir yolunu saglar ve bitki popülasyonundaki segregantlari ayirmak için kullanilabilir. Moleküler isaretleme yöntemleri, filogenetik çalismalar için, bitki çesitleri arasindaki genetik iliskileri karakterize etmek için, çaprazlamalari ya da somatik melezleri tanimlama için, monogenik özellikleri etkileyen kromozomal bölümleri lokalize etmek için ve niceliksel kalitim arastirmasi için kullanilabilir. Spesifik genotipleme yöntemi, amplifikasyon parçasi uzunluk polimorfizmlerini (AFLP'Ier) içeren herhangi bir sayida moleküler isaretleyici analitik teknigi kullanabilir. AFLP 'ler, nükleotid sekansi degiskenliginin neden oldugu amplifikasyon parçalari arasindaki alelik farklarin ürünüdür. Dolayisiyla, mevcut tarifname ayrica, bir izopropilmalat sentaz geninin ya da nükleik asidin ve ayrica bu genlere ya da AFLP analizi gibi teknikler kullanilarak nükleik asitlere genetik olarak baglanmis kromozomal sekanslarin ayrilmasini takip etmek için de bir araç saglar. Tarifname, asagidaki örneklerde daha detayli olarak tarif edilmis olup, bunlar bulusu daha detayli olarak tarif etmek amaci ile saglanmislardir. Tarifnamenin gerçeklestirilmesi için halihazirda tasarlanan tercih edilen bir modu ortaya koyan bu örnekler, tarifnameyi örneklendirmeyi amaçlamaktadir ve sinirlandirmayi amaçlamamaktadir. ÖRNEKLER Örnek 1: Flue cured Hicks Broadleaf (HBL) ve primitif Red Russian (RR) Nicotini'a tabacum çesitlerinde sükroz esteri analizi Tütünde sükroz esteri sentezini çalismak için iki model çesit seçilmektedir: flue cured Hicks Broadleaf (HBL) ve primitif Red Russian (RR). Ulusal Genetik Kaynaklari Programi (Germplasm Resources Information Network - (GRIN), National Germplasm Resources Laboratory, Beltsville, Maryland) kataloglarindan bulunabilen baslangiç verisi, sükroz esteri içeren beta- metilvalerilde bu iki hat arasinda farkli bir içerik önermektedir. HBL ve RR yaprak eksüdalarinin sükroz esterlerdeki bilesimi analiz edilmektedir ve sonuçlar Sekil 1'de gösterilmektedir. RR sükroz esteri bilesimi, HBL sükroz esteri bilesiminden farklilik göstermektedir. HBL'de sükroz esterleri esasen C2C15:O'dan olusurken, RR'de daha yüksek moleküler agirlikli türlerin - CZC16:O, 02017:O ve C2C18:O gibi - mevcudiyetinde gözlemlenmektedir. Sekil 2'de gösterildigi gibi RR ve HBL arasidaki farklar, moleküllerde metilvaleril mevcudiyetinden ya da yoklugudan sorumludur. Dolayisiyla RR'nin bir BMVSE çesidi ve HBL'nin bir bmvse çesidi oldugu sonucuna varilmaktadir. Örnek 2: Kantitatif özellik Iokus analizi Yaprak eksüdalarindaki sükroz esterlerinin bilesimi, HBL ve RR ebeveynlerinin çaprazlanmasindan meydana gelmis 136 özlenmis F2 genotipi bitkilerden sirasiyla üreyen 8 F3 bitkisinin 136 popülasyonunda analiz edilmektedir. Bir kantitatif özellik lokus çalismasi, mikro uygu markörler ve sükroz esteri fenotipini içeren beta-metilvalerili iliskilendirmektedir. Veri, Kantitatif özellik Iokus kartografi kullanilarak analiz edilmektedir. Sükroz esteri özelligi ihtiva eden beta-metilvaril, tütün genomunda tek bir lokusa baglanmaktadir. Bu Iokus tütünün baglanti grubu 15 (A kromozomu) üzerine yerlestirilmektedir. Örnek 3: Sükroz ester ile iliskili geni ihtiva eden beta-metilvarilin tanimlanmasi Trikomlardaki tütün eksonlarinin transkripsiyon seviyesi, Sekil 3`te açiklanan fonksiyonlari kodlayan potansiyel genlerin tamami arasindan preferik gen hedefini seçmek için çalisilmaktadir. Ekspresyon çalismasi, mikro diziler kullanarak sükroz esteri üretim profili içern kendi beta-metilvalerilleri için seçilen çesitli çesitlerde çalisilmistir. Sonuçlar, bunlarin ekspresyonlari her çesidin ekstraktlarinin her birinde ölçülen sükroz esterleri içeren beta-metilvalerilin tahmin edilen miktarlari ile iliskili (R0,95) oldugundan dolayi izopropilmalat sentaz ile iliskili eksonlari tanimlamaktadir. Domates izopropilmalat sentazlarinin IPMSA ve IPMSB homologlarini kodlamaya yönelik dört tütün sekansi tanimlanmaktadir. Bunlar NtIPMS1A (SEK ID NO: 10), NtIPMS1Bv1 (SEK ID NO: 12), NtIPMS1Bv2 (SEK ID NO:14) ve Nt/PMSZ (SEK ID No:1) olarak adlandirilmaktadir. EST veritabanina göre SEK ID No:1, bunun ekspresyonunun çogu trikomlarda gözlemlenebildiginden dolayi seçilen aday olmustur. N. tabacum çesidinden yapilan bir BAC kütüphanesi. HBL, PISOGE adli bir BAC'i tanimlayan PCR yemi olarak NtIPIl/ISZ CDNA kullanarak taranmaktadir. Bu BAC rastgele sekanslanmaktadir. Düzenek, pisogei ve pisoge2'nin NtIPMSZ ile iliskili sekanslari içerdigi çesitli ardillar üretmektedir. Intron-ekson yapisi, tütün ve domatesten izopropilmalat sentazlar arasinda korunmaktadir. NthMS1Bv1,NtIPMS1Bv2, SIIPMSB and SllPMSA için genlerin on iki eksona ayrildigi gözlemlenmektedir. NthMSZhin ayrica on iki eksondan olusmasi beklenmektedir fakat SIIPMSA birinci eksonu pisoge1'dek iki eksona karsilik geldiginden dolayi NthMSZ'nin on üç ekson ihtiva ettigi varsayilmaktadir. Genomik sekans tahmininin güvenilirligi PCR vasitasiyla test edilmektedir. Global olarak pisoge düzeneginden tahmin edilen sekans, gerek Hicks Broadleaf gerekse Red Russian bitkilerinden izole edilen genomik DNA ya da saflastirilmis PISOGE BAC kullanarak onaylanmaktadir. NtIPMSZ'ye karsilik gelen bir tam uzunluklu genomik yapi tanimlanmaktadir. Ek olarak iki baska gen benzeri yapi gözlemlenmektedir ve muhtemelen psödogen kopyalarini temsil etmektedir. PISOGE BAC tarafindan önerilen yapi kismen onaylanmaktadir fakat BAC yapisi ve HBL genomik DNA arasinda farkliliklar gözlemlenmektedir. PCR NIIPM82"nin RR ve HBL alelleri arasinda ayrim yapmaya yönelik bir genetik markör olarak kullanilmaktadir. IPMSZ markörü, kantitatif özellik Iokus eslemede kullanilan bütün F2 bitkilerin genomik DNA'si üzerinde PCR amplifikasyonunda kullanilmaktadir. sükroz esterleri kantitatif özellik Iokusu, bu ilave markör ile yeniden hesaplanmaktadir. Kantitatif özellik lokusu piki, özellik ve markör arasindaki iliski olasiliginin maksimum oldugu konumu tanimlamaktadir. Basit sekans tekrar markörü PT30172 ile birlikte lPMSZ markörü, sükroz esteri özelligi içeren beta- metilvaleril üzerindeki etki olasiliginin en yüksek oldugu markörlerdir. Örnek 4: NthMS2'nin aktivitesinin sükroz esterleri içeren beta-metilvalerilin sentezinde anahtar faktör olarak gösterimi NtIPMSZ'ye karsilik gelen ekspres sekansi etiketleri, asagidaki formda trikom EST kütüphanelerinden izole edilmektedir: GT09L09 (orijin: Galpao [TI1068] trikomlar) ve OTOSCZO (orijin Orinocco [TI81] tricomlar). Her iki molekül nükleotit sekansi açisindan özdestir ve dolayisiyla sadece OTOSCZO CDNA ekspresyon deneyleri için kullanilmistir. Bir RNAi yapisi, konsensus sekansina dayanarak NtIPMSZnin birinci eksonu ve birinci intronu kullanilarak olusturulmaktadir. Her iki yapi ya trikomlara özgü CPSZp promotörünü (CPSZ sadece trikomlarda meydana gelen cis-abeinol sentezine dahil olan kopalil sentazi 2'yi isaret etmektedir) ya da MMVp viral promotörünü (MMV mirabilis mozaik virüsünü isaret etmektedir) içeren bir ikili vektöre transfer edilmektedir. Ilgili Ikili vektörleri tasiyan Agrobacterium tumefaciens AGL1 kullanan stabil transformasyonlar, oriental tütün çesidi Basma xanthi ve flue cured çesidi K326'da gerçeklestirilmektedir. Yapraklar bagimsiz transformasyon olaylarindan ortaya çikan bir aylik rejenere edici bitkilerden toplanmaktadir. Dahili standart (sükroz oktaasetat) 2,5 ng/mg taze agirlikta eklenmektedir. Her bir sükroz esterine özgü iyon için kaydedilen sinyal alani ölçülmekte ve dahili standart alanin orani olarak grafige aktarilmaktadir. Sinyal tepkisi molekülden moleküle degisiklik göstermektedir böylece karsilastirma sadece her bir molekül arasinda geçerli olmaktadir. Dahili standart alanin orani, taze yaprak agirliginda sinyallerin normalizasyonuna olanak saglamaktadir. Sekil 2 burada sunulan sükroz esteri adlandirmasini açiklamaktadir. Sekil 4'e atifta bulunursak: (A) parental çesit K326'nin (Flue cured, n=3) yaprak eksüdalarinin ve NtIPM82 eksprese eden transformantlarin trikoma özgü bir promotör altindaki bilesimi; (B) parental çesit K326'nin yaprak eksüdalarinin ve NthMSZ eksprese eden transformantlarin biral bir promotör altindaki bilesimi; (C) parental çesit Basma'nin (Oriental, n=4) yaprak eksüdalarinin ve NtIPMSZ-RNAI eksprese eden transformantlarin trikoma özgü bir promotör altinda bilesimi; (D) parental çesit Basma'nin yaprak eksüdalarinin ve NthMSZ-RNAI eksprese eden transformantlarin viral bir promotör altinda bilesimi. Sunulan veriler NthMS2'nin sükroz esteri içeren beta metilvalerik asit üretiminde anahtar gen oldugunu göstermek için yeterlidir. IPMSZinin sükroz esteri çesidini (oriental) içeren bir beta metilvalerik asitte baskilanmasi, sükroz esteri içeren beta metavalerik asidin üretimini azaltmakta ya da ortadan kaldirmaktadir (bkz. C ve D), dolayisiyla IPMSZinin biyosentetik yolun anahtar bir bileseni olmasini saglamaktadir. Bir RNA enterferans yapisinin tamamlayici ve trikoma özgü ekspresyonu, beta metilvalerik asit içerebilen esterler olan sükroz esterlerinin 02016:O, 02017:0 ve 0201820 birikim kaybi ile sonuçlanmaktadir. NthMSZ'nin bir bmvse çesidine (flue cured) dahil edilmesi, sükroz esterlerinin üretimini indükleyebilmektedir (bkz A ve B). Bu, NtIPMS2 cDNA ekspresyonunun tek basina sükroz esterinin üretimini geri kazandirmak için yeterli oldugunu kanitlamaktadir. Burada NtIPMSZ cDNA'nin tamamlayici ve trikoma özgü ekspresyonu, beta metilvalerik asit içerebilen esterler olan sükroz esterlerinin C2016:O, 02017:0 ve 0201820 birikim kaybi ile sonuçlanmaktadir. Ilginç sekilde cDNA'nin temel ekspresyonu (B) yüksek bir sükroz esteri birikimi ile sonuçlanmamisken trikoma özgü ekspresyon örnegin sükroz esteri çesidini içeren beta metilvalerik asitte gözlemlenebilen ile karsilastirilan seviyelerde sükroz esteri birikimi ile sonuçlanmistir. Örnek 5: Çinko parmak nükleaz hedef bölgelerinin seçimi için arama protokolü Bu örnek, genin ekspresyonunu modifiye etmek için araçlar gelistirmek üzere belirli bir genom veri tabanina kiyasla verilen gen dizisi içindeki benzersiz hedef bölgelerin meydana gelmesi için izopropilmalat sentaz genini göstermektedir. Asagida açiklananlar da dahil olmak üzere tarifnamenin yöntemleri tarafindan tanimlanan hedef bölgeler sekans motifleri ve bölgelerin ya da motiflerin herhangi birinin tütün gibi bir bitkide karsilik gelen gen sekansini modifiye etmek için kullanimi tarifname içerisine alinmistir. Arama algoritmasi. Örnek olarak bir DNA veriitabani içerisinde bir son ek dizisi kullanan herhangi bir mesafe tutucu boyutu tarafindan ayrilan iki adet sabit uzunlukta alt dizgi DNA motifinin ortaya çikisi için bir girdi sorgusu (hedef) nükleotit sekansinin taranmasina olanak taniyan bir bilgisayar programi gelistirilmistir. Sonek dizisi olusturma ve arama, herhangi bir girdi dizesini dogrudan Burrows-Wheeler dönüstürülmüs dizeye dönüstüren açik kaynak Iibdivsufsort library-2.0.0 (httpzllcodegoogle.com/p/Iibdivsufsortl) kullanir. Program, tam girdi (hedef) nükleotid dizisini tarar ve seçilen DNA veritabaninda seçilen sayida süreden daha az olan tüm alt dizgi kombinasyonlarini döndürür. Bir sorgu dizisinin çinko parmak nükleaz araci/i mutagenezi için hedef alanin seçimi. Bir çinko parmak DNA baglanma alani, bir üç baz çifti uzunlukta nükleotit sekansini tanir. Bir çinko parmak nükleazi, bir, iki, üç, dört, bes, alti ya da daha fazla çinko parmak DNA baglama alanini ve bir Tip IIS kisitlama enziminin spesifik olmayan nükleazini içeren bir çinko parmak proteini içerir. Çinko parmak nükleazlari, bir hedef sekansa iki iplikçikli bir kirilmanin sokulmasi için kullanilabilir. Çift iplikçikli bir kirilmayi yerlestirmek için, biri hedef sekansin arti (üst) dizgisine baglanan ve digeri ayni hedef sekansin bir eksi (alt) dizgisine baglanan bir çift çinko parmak nükleazin 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ya da daha fazla nükleotitle ayrilmasi gereklidir. Iki sabit uzunlukta aIIt dizgi DNA motifinin her biri için 3 'lük çogul kullanilarak, program belirli bir aralayici uzunlugu ile ayrilan iki çinko parmak proteini hedef bölgesini tanimlamak için kullanilabilir. Program girdileri: 1. Hedef sorgu DNA sekansi Aranacak DNA veritabani Ilk alt dizgi DNA motifinin sabit boyutu Ara parçanin sabit boyutu Ikinci alt dizgi DNA motifinin sabit boyutu @SNPS'JN Program girisi 2 'nin seçilen DNA veri tabanindaki program girisi 4 ile ayrilan program girisleri 3 ve 5 kombinasyonunun esik sayisi Program çiktisi.' Her bir sekans için, DNA veri tabaninda sekansin maksimum sayisi, maksimum program girisi 6 esigi ile kaç kez gerçeklestigine dair nükleotit sekanslarinin bir listesi. Burada belirtilen veya açiklanan herhangi bir yayin mevcut basvurunun dosyalanma tarihinde önce açiklanan iliskili bilgiyi saglar. Buradaki ifadeler bulus sahiplerinin bu açiklamalari önceki bir tarihe alma haklarinin bulunmadigi anlamina gelmemektedir. Tarifnamenin çesitli 78 modifikasyonlari ve varyasyonlari teknikte uzman kisilerce bulusun kapsamindan ve özünden uzaklasmadan anlasilacaktir. Tarifname, tercih edilen belirli yapilanmalarla baglantili olarak tarif edilmis olmasina ragmen, hak iddia edilen bulusun, bu gibi belirli yapilanmalar ile gereksiz sekilde sinirlandirilmamasi gerektigi anlasilmalidir. Aslinda, hücresel, moleküler ve bitki biyolojisinde ya da ilgili alanlarda uzman kisiler için açik olan bulusun gerçeklestirilmesi için açiklanan modlarin çesitli modifikasyOnlarinin asagidaki istemlerin kapsami içinde olmasi amaçlanmistir. 79 SEKANSLAR SEK ID No:1 (NtIPMSZ nükleotit sekansi) ATGGCTTCTCTCTCTGTAAATTCTATAATTTCCCTGAG CACTTCCCTTTCATTACATTCTAAA AACCCACTTATTCACAGTGTCTTCAGTTTCACGCCTTCAACCACAAGGCATTCAG CTATATG CTGCTCAAATATTCGTCGGCGGCCGGAGTATAAACATGGAAAATTCTCTGACCCTGATTAT GTTGGTATTTTTGACACCAGTCTTCGCGATGGCGAACAGGCCGCTGGTGCTACCATGACTA GTAAAGAAAAACTGGACATTG CACGTCAGTTGGCTAAGCTTGGTGTTGATGTTATTGAGGC CGGTTTTCCTTTTGCCTCTGAAG CTGAGTTCGAG CTTGTAAAGTTGATAG CACAGGAAATT GGTAATAACGTAGACAAAGAAGGATACGTGCCGATGATATGTGCCTTAG CTAG GTCTAGTA AGAAGGATATTGAAAGAGCTTGGGATGCTTTAAAGTATGCAAAGAAACCAATGCTTCATATG TTTATTGCGACGAGTGATATACATATGAAGTACAAGTTAAAGATGAGTAGAGAAGAAATTGT GGAGACAGCTAGGAGTACGGTGGCTTATGCAAAAACCCTATTTGAGGATGTTCGGTTTAGC GCTGAAGATG CTGCAAGATCTGATAGGGAGTTCCTTTATCATATTATTG GAGAAGTTATCAA AGCTGGTGCAACAGTGATTGGCCTCCCTGATACAGTTGGATGCAATTTGCCCAGTGAATAT GCACAACTGATTTCTGATATAAAAGCCAATACCCCAGGAATACAAGATG CAAACATTTCAAC ACACTGTCACAACGATCTTGGGCTTGCTACTGCCAACTCCTTAG CTGGAATTTG CG CAGGC GCAAGACTAGTAGATGTTACCATCAATGGAATTGGTGAAAGAG CTGGAAATGCTTCTCTGG AG GAGATTGTAATGGCCTTAAAATATCGTGGAGAGCAAGTACTAG GTGGTATCTATACTGG GATTAATACAAAG CATATATTCATGACGAGCAAAATGGTAGAAGAGTACAGTGGGCTTAAG CTGCAGCCACATAAGGCCATTGTTGGAG CTAATGCATTTTCTCATGAGAGTGGCATCCATC AGGATG GAGTGTTAAAGAACAGAGATACATATGAGTTTGTATCTCATGAAGATGTTGGGTAT CGTCGTGCTAATGAAAACGGTATTAGTCTGGGAAAGCTCAGTGGCCGCCATGCATTGAAA GCCAAAATGGCTGAGCTTGGATATGACTTTGATGGAAAAGAACTTGATGACCTCTTTCGTC GATTCAAGTCACTAGCTGAGAGGAAAAAGAAAATTACAGATGATGACTTGAGAG CACTTGT ATCAGATGACGTTTTCCAGCCTCAAGTTTCCTGGCAACTTGGAGATGTACAGATTACTTGTG GAAATGTTGGCCGCTCTACAGCAAATGTTAAGCTTATTGACAGCGATGGTCAAGAGCACAC TG CCTTTTCTGTTG GAACAGGACCTGTTGATG CAG CTTACAAGGCAGTTGACCTCATTGTA AAGGTACCTGTAACACTCGTTGAATATTCGGTTAATGCAATCACAAAACGTATAAATTCCAC AGCTTCAACCAGAGTGTTAGTTCGTGGGAATGATGACTATGCATCGTTTAATACTTCAAACG GGCAAACTGTTAATCGTACAGTTAGTGGAACAGGAGCGCATATGGACATTGTCGTTTCAAG TGTCCAAGCCTATGTTGAGGCGTTGAACAAAATATTCAGTTACAAAAAAACAGGTCTCGTGA ACAAATTTGAAGGCAGTGCGCAATCGTAA SEK ID No:2 (NtIPMSZ amino acid sequence) MASLSVNSI ISLSTSLSLHSKNPLIHSVFSFTPSTTRHSAICCSNIRRRPEYKHGKFSDPDYVGI F DTSLRDGEQAAGATMTSKEKLDIARQLAKLGVDVI EAGFPFASEAEFELVKLIAQEIGNNVDKEG YVPMICALARSSKKDI ERAWDALKYAKKPMLH MF lATSD| HMKYKLKMSREEIVETARSTVAYAK TLFEDVRFSAEDAARSDREFLYHIIGEVIKAGATVIGLPDTVGCNLPSEYAQLISDIKANTPGIQDA N ISTHCHNDLG LATANSLAGICAGARLVDVTI NG IGERAGNASLEEIVMALKYRGEQVLGGIYTGI NTKH I FMTSKMVEEYSGLKLQPHKAIVGANAFSHESGI HQDGVLKNRDTYEFVSHEDVGYRRA NENGISLGKLSGRHALKAKMAELGYDFDGKELDDLFRRFKSLAERKKKITDDDLRALVSDDVFQ PQVSWQLGDVQITCGNVGRSTANVKLIDSDGQEHTAFSVGTGPVDAAYKAVDLIVKVPVTLVE YSVNAITKRI NSTASTRVLVRG N DDYASFNTSNGQTVNRTVSGTGAH MDIVVSSVQAYVEALN K IFSYKKTG LVNKFEGSAQS SEK ID No:3 (tamamlama için kullanilan NtIPM82 CDNA sekansi) ctcttttcttagggaaaagaataatggcttctctctctgtaaattctataatttccctgagcacttccctttcattacattctaaaaacccacttat tcacagtgtcttcagtttcacgccttcaaccacaaggcattcagctatatg ctg ctcaaatattcgtcggcggccggagtataaacatgg aaaattctctgaccctg attatgttggtatttttgacaccagtcttcgcgatggcgaacaggccgctggtgctaccatgactagtaaagaa 80 aaactggacattgcacgtcagttggctaagcttggtgttgatgttattgaggccggttttccttttgcctctgaagctgagttcgag cttgtaa agttgatagcacaggaaattggtaataacgtag acaaagaaggatacgtg ccgatgatatgtg ccttagctaggtctagtaagaagg atattgaaagag cttgggatg ctttaaagtatgcaaagaaaccaatgcttcatatgtttattg cgacgagtgatatacatatgaagtacaa gttaaagatgagtag agaagaaattgtggagacagctaggagtacggtggcttatgcaaaaaccctatttgaggatgttcggtttagc gctgaagatgctgcaagatctgatagggagttcctttatcatattattggagaagttatcaaagctggtgcaacagtgattggcctccctg atacagttggatgcaatttgcccagtgaatatgcacaactgatttctg atataaaagccaataccccaggaatacaagatgcaaacatt tcaacacactgtcacaacgatcttgggcttgctactgccaactccttagctggaatttgcgcaggcgcaagactagtagatgttaccatc aatggaattggtgaaagagotggaaatgcttctctggaggagattgtaatggccttaaaatatcgtggagagcaagtaotaggtggtat ctatactgggattaatacaaagcatatattcatgacg agcaaaatggtagaagagtacagtgggcttaag ctgcagccacataaggc cattgttggagctaatgcattttctcatgagagtggcatccatcaggatggagtgttaaagaacagagatacatatgagtttgtatctcatg aagatgttgggtatcgtcgtgctaatgaaaacggtattagtctgggaaagctcagtggccgccatgcattg aaagccaaaatggctga gcttggatatgactttgatggaaaagaacttgatgacctctttcgtcgattcaagtcactagctgagaggaaaaagaaaattacagatg atgacttgagagcacttgtatcagatgacgttttccagcctcaagtttcctggcaacttggagatgtacagattacttgtggaaatgttggc cgctctacagcaaatgttaagcttattgacagcg atggtcaagagcacactgccttttctgttggaacaggacctgttg atgcagcttaca aggcagttgacctcattgtaaaggtacctgtaacactcgttgaatattcggttaatgcaatcacaaaacgtataaattccacagcttcaa ccagagtgttagttcgtgggaatgatgactatgcatcgtttaatacttcaaacgggcaaactgttaatcgtacagttagtggaacaggag cgcatatggacattgtcgtttcaagtgtccaagcctatgttgaggcgttgaacaaaatattcagttacaaaaaaacaggtctcgtgaaca aatttgaaggcagtgcgcaatcgtaaaagtgatggtgtgtgctccagaaacaaaagcttaaatgctgcttagtg ctcgatgatcataaa tttatgctctattcatgcatgcattactgaagttaattaagaagtaatcttaattgtataagatgtaaacatgtttctattcatgcattactatgaa attaattacaatttctgagccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa SEK ID NO:4 (Red Russian'da gözlemlenen XI, Xll ve XIII eksonlarini kapsayan NtIPMSZ bölgesinin genomik DNA sekansi. cDNA eslesen bölgelerin alti çizilidir. Koyu renk Red Russian ve Hicks Broadleaf DNA sekansini göstermektedir) AGCAAGATGTCAAGAAGCACACTTGCCTTTTCCTGTTGGAACAGGACCTGTTGATGCAGC TTACAAGGCAGTTGACCTCATTGTAAAGGTTTATAATGAAACTGAAAACTCTCATAATGTT TGTATCTTGTC AC AC TAG TAGGATAG GTAATTTAG GTTTTATATAC G CTGAAG GTATAAAA ATATTTACTCAATCAGAGCGCTTACAAGACAATTGCAGGTAACTCTATGAGTAGCTTAGA CTAAAAGATAAACGTAGTAATTTCAATGTAAATAGTTTAG GAGACATGCGAATCTTTCCTTG ACAAAGAAACTAAAAAACTTGCGAAGCACGCACCTCAATCACCCCGTCTGTGTGAATTGAA CGAACTTAAAAGTACAACCAG CTTAAACTGATTTTTTACCTATTTTTTAGTGTTCAGACGGAT CTGCAG CAACCATGATTTGATTCACCGGTCGACAAATATCCTCACCGTG CATTCGAACTCC CTTTCTCCACATCCTAAAAATCCTCTTCTAAGATGTCTTTGTTTGCAAACTCTAGCCGTCATA TCTTG GTGGAAAACATGTCTCTTCTAATATGTGTATTTATATGTTATAAATAGTATTTAG GAG AATG GCAAG TTAACAGACTAATTAACACCTATTATG AATG GATCCAACCGAATAGAAATATT CCAACATTTAG CTAAGTAAG CTGCCAAGTCAAATAAGACTGATAGAGTAAAAACTCTTTCAT ATAGCAATGAATATAACCTAAATCCTTTAGTTACTGCTAG CAATTTTGTAGGTATAATTGCTT TGTTTGGTAAAAACATCTATGTAACTTTTGTTTTATAAGTAATGTTCTTTGTCATTATGCAGQ TACCTGTAACACTCGTTGAATATTCGGTTAATG CAATCACAAAACGTATAAATTCCACAGCT TCAACCAGAGTGTTAGTTCGTGGGAATGATGACTATGCATCCGTTTAATACTTCAAACGGG CAAACTGTTAATCGTACAGTTAGGTATGAAATATACATGAAGTACTGTTTCCCTTTAATTTAT CCTTATTTCCCTTAATAATATTCTTTCATG CATAATGTGGGAACATGAAGATGACAGAGAAG AATTAAAACGATTTTTTCCTAAAGGAGAAAATAATATGTGATAGGAATGAAATGTTGTCAGTT TTATATAGTTCTCAAATTTTATGGTACTACGGGTATCTAGAGCCAACCTGAGAATAGAAAGT ATCATATAAGAAATATACACAGCAGTTAGATAGAGTACATTTTTAATTATTTAATTATATTTA TGCATGCCTCAACACGTTTACTCACCTCTTAGCCTAATTTTTGTTACATGGGATCGTTCTA CATTTTGAGTAGCTGAGAGATTTGAACTTAGGACCTTTATTTTCTCTAACACTATGTTATAT TGCCAGTGGAACAGGAGCGCATATGGACATTGTCGTTTCAAGTGTCCAAGCCTATGTTGA GGCGTTGAACAAA_ATATTCAGTTACAAAA_AAACAGNTCTCGTGAACAAATTTGAAGGCA GTGCGCAATCGTAAAAGTGATGGTGTGTGCTNCNNCTANAAG 81 SEK ID No:5 Hicks Broadleaflida gözlemlenen XI, X!! ve Xlll eksonlarini kapsayan NIIPMSZ bölgesinin genomik DNA sekansi. cDNA eslesen bölgelerin alti çizilidir. Koyu renk Red Russian ve Hicks Broadleaf DNA sekansini göstermektedir.) GTCAAGAGCACACTGCCTTTTCTGTTGGAACAGGACCTGTTGATGCAGCTTACAAGGCA GTTGACCTCATTGTAA_AGGTTTATAATGAAACTG AAAACTCTCATAATGTTTGTATCTTGT CACACTAGTAGGATAGGTAATTTAAGTTTTATATACGCTG AAGGTATAAAAATATTTACTC AATCAGAGCGCTTACAAGACAATTGCAGGTAACTCTATGAGTAGCTTAGACTAAAAGTTT TAATTATTTAATTATATTTATGCATGCCTCAACACGTTTACTCACCTCTTAGCCTAATTTTT GTTACATGGGATCGTTCTACATTTTGAGTAGCTGAGAGATTTGAACTTAGGACCTTTATTT TCTCTAACACTATGTTATATTGCCAGTG GAACAGGAGCGCATATGGACATTGTCGTTTCA AGTGTCCAAGCCTATGTTGAGGCGTTGAACAAAATATTCAGTTACAAAAAAACAGGTCTC GTGAACAAATTTGAAGGCAGTGCGCAATCGTAAAAGTGATGGTGTGTGCTATCTGCNAA AAACTCGA SEK ID No:6 (BAC bitisik sekansina karsilik gelen NtIPMSZ (toplam BAC uzunlugu 76832bp'ir. Sadece 14232bp gösterilmektedir)) TGATGATTTCTCATTATAATTGTAACTAGTGGTGGCAAAATGGTAAAAAGAAAACAGTTATC CATCCATATTATTCATTAAAAAATGGGTTGTATAATGAACTTTTTAAAAAAGGATCAATTATG GATAAGAACCATATTATCCGCTTAGAAAATGGATAACCAATAAGTTAACTTCTACACTTGTAA AGCTTCAAATTGGGGGTTCCTCAAGTTTGTGAGAAGAAGAATTCTCCCAAAGTGATCATATT CAAGAAGTCTTGGATAAATGAATATCCATATTATCCGCCGATTATCTCGTTTTAATCCGTATT AAATATGAGTCGGTTCGAATAATTTATCTGTTTTTGTATTATCTACTTTGGACATGTCCATAC CCGACCCGACCCCGCTCGTTTGTCACCCCTAGTTGTAACATATACTGTTTGCTTACCTAAC GGGTTGAGTTAAGTACCATCACGACTTGGTGGGATTTTGGCTCTTACAAAACTACAATTGA GCCTGATTATAATATTTTATTATAAAATTGAGGTTCGGTATAATTTATTTTGCTGATCAAATCT TGGTGATTCAAAGTTCAACTGAAATATGCAATACTAAATTATTTTCTTATTTAATAAATTTTAT GATGAGCTAATATTTATAATTTGAATAAAAAAAAATTCATAATACTAGTATTTTTGAGTTGAAT AGAAATTGTCAGTACAGTTGAATATAACAACTGTAATTATTCATAAAATATTTTAGTTTGATAT AATAATAATCTTTCAAAAAACATTCTTACAGAACTTGACTGAAACCATAATAAAGTATCTCAC TACTTTTGTGCGACAAGGTTTCTTCCTAAATGAGATCAACAATCATTCTTTTAAGGATTTTTA TTTTTATTTTTATCACAAATATATTACTCAATATCTAAGTAATCTTTAAAAATCTGTATACTCAT TACTATAAAGCATACATGCAAAACGCGTACAATAAAAACTAATTTTTAAAAAATAGGGGGAA GGAGAAGGGATGAACAGAACCCTCATTAATAAAGCAAAAATTTAAATATCCAACAAATTGAA CTGTTAAGATTATAAAAAAAAAGAAAAAAGAACTTCATTGTCGAAGTAAGTCAAAGTATCACT AGCCGTAAAAATTTCGGCACCTTTTAAAAGAATGATAAATATACTAGGGAAAGCCTAAAACC TCTTGGTATTAATAACTATAGTTTAGAAATTAGGCAAAGCCGCTACTAGGGTAGTTAATTATT GGTTCTGTTTATATTTATATCATTCGTTTTGTTGATAATGATGAGCAACGTTCCATTACATGA AGAAACCACGTCAATGTTTATTCCCTCATTCGTTTTCTAAATTTATTCGAGATGTGAGTAAAC CTCCCCCCACCCCCACACACCCCCTTTTTTTTTTGCTGTTAAAGTTTCGACAATAAGAACGT TCAGAGTTTCTTGAACTTCTGTTTTATCTGCAGAAATTATAAATTGGAGTCAACCACTGCATC CCAAATTGATGCAGACTTTATCTGAATAATTAATCAGTATATAATTATAATATCTATTTTCTAT GTTTCTAATTTATGTGACACATTTCTTATCCGTTAGTTTAAAAAAAATGATAAATTTATATATT TCAGAATAAI I IAACI I IAAAI I I I I I [A] I I IATCCATTTTACCTTTAATGAGAAACTTTTGTA ACCATACAAATGTTATAGAATATATTTAGAACAACAAGTTTCAAATATTTTATAGTCACATAAA TTTAACACACAAATATTAGAGCAAATTTCAAACTACTTCACATAAATTGAAACAGAGGGAAAA ATAATACTCCCTCCGTTCCCTTTTACTTGGCACGTTTTGACTTTTTACGCCCCTTAAGAAATA ATAAATGAAGTGCATAATTTACCATGATACCCATATTAATTGATGTATATTTTATTGGATTTG AAAAATGATTTGAAATGAGTAATAAATATCGTGGGTATAACAAAAAAAAAATTATCTTCTCTT GATATGCGTAAAGTGACAAGCAAAAATGAAAATCTATTTTTAGTATACATGCCAAATAAAAG TGAACGGTAAAAATGAACGGAGGGAGTATATATTATTACTACTAAAACGGGAAACTGGGCA 82 TGCTAAGTTTTTCATTGCTATTTCAAGTTCCGATTAATAGCCATAATATAATGTTTTCTAGAA ACAAAGAACAACGCCAAGATAAATTTTCCCAAAAAGTAGCACAAATGTAACAAATTCTTACC TCAAATTTTAATCTAAACACATAAATTTTCTTTATAATTGTTTCTTAAAAACTTAAACTAAATTC AAATGCCAACAAGTTTAAATGAGCAAGGAAGTATTTTCAGTTTCTATTTCTTGAATTTAATAA GAATGGAAATATTTTCCGTTTGTTTACTGGGTTCTGTCTAGTCTAGCTTAAGACGAAAATTG TCTTGTTTTAAGTTTTACAAACCGTAAGGGGTGGTAATTCAATTTTCAATTGTAGTATGAGCA ATTAATTCCAACACAAAATCTCACGTGAAATAATATACTCTAGTGTTTGTTTGGCGTACGAAA AAGAAAGTCTACATAATTAATGCAGCGTTCCATAGTTGATATTAAAATAATACCCGTAATAAA TTATATAAAACTTTATGTGTTATTCTTTTGATAAAACAGCAACCAGACACACCAGGGGCTAC TTTGGTCATTTTCTCTCCAATAAAAACCCTTGTTTCACCAGCTTTGTAGGTGTTCGAATTCAC CAAAGCGAACATTCCATTAACTCCGATCCACTCTCTTTTCTTAGGGAAAAGAATAATGGCTT CTCTCTCTGTAAATTCTATAATTTCCCTGAGCACTTCCCTTTCATTACATTCTAAAAACCCAC TTATTCACAGTGTCTTCAGTTTCACGCCTTCAACCACAAGGCATTCAGCTATATGCTGCTCA AATATTCGTCGGCGGCCGGAGTATAAACATGGAAAATTCTCTGACCCTGATTATGTTGGTA TTTTTGACACCAGTCTTCGCGATGGCGAACAGGCCGCTGGTGCTACCATGACTAGTAAAGA AAAACTGGACATTGCACGTCAGTTGGCTAAGCTTGGTGTTGATGTTATTGAGGCCGGTTTT CCTTTTGCCTCTGAAGCTGAGTTCGAGCTTGTAAAGTTGATAGCACAGGAAATTGGTAACC TTTAATGTTTAACCGTTCACATTTCTAATATTTACTTATTTGTAACATGTCGTCACGTGTTAGT TTCATTCTTTTTATGAACCAAACATGCATGCAAAGATATTTTTAGATATTTGGACGGCGAGT GAGATTTGAAACTAGGACCGTTTGCCTGATACAATATTAAAATATGTAACCATTTTATGTACA AGTTTAAACTGTTGATAGTAGCATATTTTTTACTTTTATTTAAGTATACTATATTCCAACAGGT AATAACGTAGACAAAGAAGGATACGTGCCGATGATATGTGCCTTAGCTAGGTCTAGTAAGA AGGATATTGAAAGAGCTTGGGATGCTTTAAAGTATGCAAAGAAACCAATGCTTCATAGTAAG AAAATATTTCAAGATCGAATTAGGTCAAAAGTGTAATCGTAAAAAGTAAAAGAGAGAATCTA AAGGTACTTATTTGTTCTGGTCTTTTCTTTTTTTAATATAAGCGGCCTTGAGATTATAGGAGG TTTGATATAGACCTCTACCATGTAAATTCTTAI I IAI I IGCI I I I IGI I IAGCI I I IAACCI I I TCCCTGTACTGAAATAGATTGTAATGGCCTTAAAATATCGTGGAGAGCAAGTACTAGGTGG TATCTATACTGGGATTAATACAAAGCATATATTCATGACGAGCAAAATGGTACTCTCATCTTA ATCTTCTAGTTAGAGATATATTTTACCAGTTTTAAAGCTGCTTAATTTTTTGTGCCTTTCTGTT GACACAATTGTTGCTATGTAGGTAGAAGAGTACAGTGGGCTTAAGCTGCAGCCACATAAGG CCATTGTCGGAGCTAATGCATTTTCTCATGAGAGTGGCATCCATCAGGTTTTGCGTTATTTT TCTCTAAAAGTTTTACTTCTACATACACTAGATTTGTTGAAAGATTACTGAATTGGCGACCTT CTACACTAGGTTAAATTGCAATAAACATTTCATACCACTACCGGTTGATATAAAATAAATCCT TTCTCGTTAAGATAAGATGGGTAAAATGAAGAATTCAAAGTTGAATTATTTTCAATTATAGAA ATGTATCATTCTTTTTGTAACAGACTAATAAGGAAATTGTGTCATCTAAATAACACATGAAGT ATTTGGATTCAGCCCATTGCCCCTTCCTCTTTCATTATCGCCTTAATCAGGATTCTCTACTTC CATAGTATCATTCAGTTTTCATTCTTCCTTTTTAAATTTTTTTTAATGTGGTTTAGGATGGAGT GTTAAAGAACAGAGATACATATGAATTTGTATCTCTTGAAGATGTTGGGTATCGTCGTGCTA ATGAAAACGGTATTAGTCTGGGAAAGCTCAGGTATGATTTGATTTTCAGAGTGATCGATTTG TTATGTTGATGGTTTGATAGAGATTATTGTTTCAAATTCTTTGGTCTTTCCCCCATATTTTTG GATGAGTCAAAATAATTCGACTAATATATAGTCCTACCAATTTGGTGTCAACATATGTACGA ATTGAATATAGTCATCAATCAACTATGTCCAACTATCCATACTGTAAGGTATACTCCCTTTAC ATTAAAAAATACAAGTGAACTGAAAAAAAAAAGACATTTTTTAATTAAAGTGTGCTATCTCTA ACCGTTTAAATTTTTAGATTAGATTATCATACAGTTCAAACACTTTAAAACTCGTACTATCCC CTAGAATTTCAGTACCTCCGTTGTATTGAATCAACCCCAACCCTTCATTTTTCTCATTTACAT TAGGCACATTGATGTACCTCTTTCCTTTAAGGAATACATTTTGTAACATGGTAGAATATTTTG TGCAGTGGCCGCCATGCATTGAAAGCCAAAATGGCTGAGGTAAGATACATAATCTATAGTA CGATATACTACAAATATTATAGTATATGGAAATGGATCAAATCATTTTATTTTTGTTACAGCTT GGATATGACTTTGATGGAAAAGAACTTGATGACCTCTTTCGTCGATTCAAGTCACTGGCTG AGAGGAAAAAGGTGATTACGTTGCTGATATTTCATAGTGCAACAGTCAAATTTGTGATCGCA CCTTTTCGTTCCTAGTGTTTGTCCATATTTTTTGAGTTAATTTCAAATATGATCACTAATTTCT ACTATAACAATAAAATTTAAATTTTTTTATTCGCATTAAAGTGACTGAACTAACAATTAAAAAT ATTTGAAAAATATATGAAAAATTACGGCCAAAGAAAAACTCTTTTGACTCTCGACATCCGAG 83 CATCACCACATAGTAATAAATGAGAAAATTATTTTTTATCAAATTAAAGTAACTGAATTTTACT TATTATTCATAATAAAAGAAAATCACTAAACTATACGCACTATAGTGGCAAAACCTATCCATA TTCAAGGTGACTTTAAGTACCGGTCTAGTAGGTAGATTTTTGTGATTTTACTGTTATAGTGG ATAAAATTAAAGTCACTTTTTTTGATAAATTGGAAGAATAGCCTGACAGACATCTCACTTATT CGGCTTTGACATCCCGGTCCCCCTACTCCATATAATTTCAACCAAACACTTAAACTTGTATA AAACATTAGTCTTAAACACCTCTGATACTGTGTGTGTTGTTCACTCGTGCTGATATAAAGGA CACATCAGATCCACCTCAGATATATTAATGCCACATCATTATCTATTTTTACAAAAAATATTTT TTAATAAAAATATCAAACTCATCCCTTTCTTCTCCAAAAAAAAAAACAAACCTTATTCCTCTCT CCACCATTCCATCTCTGCCTCTTCCACCCGTCACCGCCACTACCAAACACTGCACCCTTCC TCTTCCATGAGAAAACACTCAATCAAACCTACTTCATCTTTTATTTTTGTCCTAAACTTCTCC ATTACTACAATCTATTCAACCACCCATGGTAGTCTTGTTGCCACCATCGCCAGCAACCACTC CAAAACCACCACTATATCTCCTCTTCTCTTCATATTCATGTCACTCTTTCAAAACCTAGACAT TGAACGAGTTTAATAAAATCTATCCTTAAATTTTCTTTCTAGCCAAATACCCAAAGCAAAACC AAAAAAATTGAAAAAGAAAGAGAAGAAATTTTTACTCAAAATTCTTATTGACCCCTCCAGCAA CGATAAAATTTATAAAACTAACAAAATCAAGCTTCGGCGTTTTCAACAACCGATGACGATCC AATTTCTGGCTTAAACACTATTTTCAAGCTTCAATGTCTCTTAATTCTCCGGCGTCTTCATTG TCTTCTTCAGTTATTTTGAGAAAAACAAAAATTAAATAACTTTGTTCCTTGACTAGCTGCTCT GCTAAACTCTATTAGTTTGGTCTTGTTATACTGCTTCTTTTTTTATTTTTATCATAGTCCAGTT GATTGCTAAAATTGTAAGAGAAATAATGTAATGCTGTTTGAGAAAACTCTACTTGAGAAACA AAAATTTAATATAGAGGGTGTGGAGCGTGTCAATTTCAATGGCGTTTTTAAGAGATTTGGGG GTAAGAAGAAGCGGCTGGGATAGAGAGGGGCGAGATAATGGCTAGCATTGTTTTTAATTTT I I I I ICI I I ICATI I I ICTCI I I IATTAI I I ICTAATCAAATTTTGTATAGTTACTCGCTTTTAG GAGCGTGCAATCACTTATTTTGTTTGACTCACAAAACAAAGGCTACATAAGTTTGGTCAATG GTTAGATGAGTTTAAAACTAATGTCTTATACAAGTTCAAGTGCCTGATTGAAACTATGTGGA GTAGGGTGATCGGAATGTCAAAGCCGAATAAGTCGAGGCAGTGGCGAAGCCAAGAAATTC AACAAGGGTATTCAAACCTTTGCCAGTGGGCTATGTAAGGGTGTTCAAAGCCTATTTTTAAT CAATAACAAGTAATATTTTACCTTATACGGAGTATAATTTTCTGGCGAAGGGTAGTCAGTTG ACCACCCTTGATTGCACGTAGCTTCGCCCCTGAGTCGAGGTGTCTCTTAGGCTAAAATAGC GTGATAAATTTTATAATAAAATTTATTTTATATGAGTAAAGTTAATAAAATTTATTTTATATGAG TAAAGTTAAGTAAATTATAATACTTAAAGAAAATTGAAAGCTTACATATGCAGAGGTCCGGT CCTCGACCCACTTATCTTGATCCCCCTCTTTCTTCTTCTTCACAATATGCGTCTCCTTGAATA GCTCATCATGACTCATTGGACGCCCATACTTCTTTTCCTGAAAATAAATTAATTTAGTTAATA AATAAAATAGATATACTTAGAAAAGTAAAATAATTTAAGCAATTACGTACCAATCTTCTTTTTA TTGTCCCTAGGCTGATCGCACCTCTAGTGTGCAAGGAGCCTCCCTTCTCGGATGCGCGAG CTTTCTTTCCTTTTTCGCTCCTCTCTAAGAACTTTGCGGTAAGCCATTGCCTTTGCAAATCAT TCCACAAATTCTCAAGTAACCAGCCAGGCCTCTTGTTCTTCTTTCTAGCATCCGAGAAAGCA TCCGCCAATCTCTTACTAGCTTTGTGATGAAAATTTGCAGCCACTTCCGCGCTATAGCGGT CTTTCCATACACACTTGCTCTGTATTTTAAAATTTAATTATTAGATGGAAACATCATAAATATA AATTATTAAACTGTTTAAAAAAATATTTATACCTTAAATTGATTGAAAATTTGCTCTTTCAGTG AGAATGGACAATCAGTCCAAGTCGTATAAGGGCCATCATAAAGCTTTCTGATGGCATTAGT GATTATCTTCGTAGTCTTATTACCCGGCCTGAACCTACAATTTAATAATAAAAACACATTAAT ATCTTAGTAAAAATGTTACAAATCAATAGACGGAAAAATAATGAATAACACTTACCCATCACC CTTAGGGACTATGATGATCCTGCCATATCGATCATAATGCACTACCTCGTCATCACTATTCG AAGCATGTGTATCAGAGGCATGTGAAGACGGTGTAGGCGGGTCAGAGCTACTGCCTCGTA GGCGAAGGCCTGCAATAGATGGAGTCGATAATGAAGATGGTTGTGATCCCTGTGACTACA ACATAGCTGGATGTGACCCAAGTGGATGTGATAATGCTGGCTGTGACCCGAGTGGCTGTG ACATGGATGGATGCGATCCATGTGGCTGTGATATGTAGGGATGTGATCCATATGGATGTGA TGTAGATGGCTGCGATGCAGATGGCTGTGAGGCAGCTGGACTGTATGTCGAACATATAGT CCTATGGCCCTGTGATGGAAGACCTGGTGTCTGAACGAAGGTGTATGATTCGTGATGCTGT GGAAACTCAGTATAGCCGTGTGGTGGAGGATAAGACATAGGCATCTCTGAAAAGGGTGGA CAAGAGGGACTATTATTTTCTACCCTCCTCTTTCCCTTCCTACCCTTTTCTCGACCCTGAGA ACTAGTAGGGTCATTGTTACCTTGACCCTTGCCTGCCATCTGTATGATATAATGCACATTTA GATTGAAACATATAAGAAACTAGCTATAAAACAAGAGTGCTTTAAAAAACCAACTTTTTAATC 84 CTCATCGACGTATTGTTCCTCGTCCGAGAATTCTTCGTCCTCATTTGTTTGAGCTTCATCAG TTGATTCTTCGTCCTCATTTTCTTTAATTGTTACTTCATTTATATCACCTTCTTCCAATATGCA TTCAGGATGTTCCAAATCATTTTCTAACTGATCGTCCACTATTTGGTGAATATTAGAAATATC ATTTTGATATG CAATATTTAACACATTCTCGACTTCCACCCTACCTACATGCTTAGTTTTTAT TACAACCCACCAATCGGACTTATTCCGCCGCAATGGATAAGGAGCATAATACACTTGCCTA ACGTTATGTGCAATTATGAAAG GATCATAGCGATCATACTCCCTCGTATGATTAACCTCAAT TATGTTGTATTGGTGGTGTACACTTGTACCTCTTGTTGGATTTGGGTCAAACCACTTGCATA TAAAGAGTATCAATTTCTTATATGGCCAACCTGTATATTCTAGTTGTAATATTTCTTTGACCA CACCATAATAATCAATATCTCCAACTTGGTTGCCATCACCACCTTGAACCCACACCCCGCT GTTGTTACTATTTTTATTTTTAGAGCCATCCTTTGTATGAAACTTATAACCATTCACTACGTA CTTAGACATTGTTGTGACCTGAAGCCCAG GTCCCCAAGATATATCTTTCAAAAATTGATTTA CAC CATTATTTG GATTATTTACCTACATAGTGTTAAAAATATTCATAAGTTAG CATAACTTATA AATCAATTTTTATACATTCATTACATATATATATATATATATATATAACTAGTGTATATATATAT ACAAACTGTTTGAACACGTATCAAATCTCGTATATACAACATCATGGCCAAATTGACCTACG AAGTGACTGTGACACATCAAATATTTTTAGTAGTTG CATCAATATGTAGTCACAGTAAATTTT ACATTTTGATAACTAATAAATCAATACTTACTTGAGAAATGGTACAACTTCG GAACAATTTAG CAACACATGAAGTGTAGCTGACTTGTACTCCATATCACTCAAACTTCTCTTTCTAACATCCTT AGAACATCGGCCTGGTTGATTGAATATAGATATTGGTGGATATAATGGATCATTCACATATT CGACCGTGTGCCTATTGGGCCTATTCCTAGAACATGGCACGTTATTCTCAAAATAATAAGAA CAAAAATATGCAGTTTTCTTTGCAAGATAGGCTTCGCATATAGATCCTTCAATCCTATTCCCT GCTTAACAAATTGTTTGCATTTGCCAATTGTCCTACATAATGTCATGTTAGCCAAGAACATTC AAATAAAATAGAATATTACATCAAACTTATAATATTACCTCTCAAAGGGATACATCCATCTGC ATTGAACATGCCCTCCAAGTCGTGCCTCGTGTACAAG GTGTATTGGAAG GTGTTCCATTAC ATCAAAGAAACCACATGGGAATATTTTTTCCATCTTACTAGAAATTACACGAATGTTCTGGT CCATCCGAAGTAGGTTTTCTTCCCTTAATGTGGTAGAACACAAGCCTTTGAAAAACAAATTA ATCTTTATGATGGGTTTCCAGATTCTTTCAGGCAAACCACAAAATGCAATAGGTACTAAGGT CTCCATGAAAACATGGCAGTCATGACTTTTCAAATGGCTCAACTTCCCTACCTCCATATCTA TTTTTTTCAAGATTCGACG CATAACCCTCAGGCATCTTCAATTTCGTAACCCAATCACAAATT TGTCGTCTTTCCTCCAAAATGAATGTGTAACTTGCTTTGGACTTGAACACCTTACCATTGTTT GCTGTCTGCAAGTATAATTCAGGCCGCCTGCAATATTCTTGTAAGTCCATTCTAGCCTTCG GGGTATCTTTTGTCTTACCTTTAACATCCATCACTATGTTGAACAAATTGTCAAAATAATTCT TCTCTATATG CATGACATCAAGGTTGTGTCGGAGAAGATTATCCTTCCAATAAGGCAACTCC CAAAATATACTTTGTTTCGTCCAATTATGATTAACACCATATCCGAG GAATCTATAAGGTGG AGCCTCAGTAACTTTACTGAAGTTCTGGACCCTCTCCCAAATTTTCTCACCTGAAAGTATCG GAGGTGGAGAATCATATTCCACTTTATTCTTTTTGAATG CATTTTTCATCCTTCTAAACTCAT GATCATCAGGCAAGAATTGACGGTGACAATCAAACCATGATTACTTTCGGCCATGTTTCAAA GTGAACGCTTTACTATTTTTCATACAGTAAGGATAAGCTAGCTTTCCAG CAGTCATCCACCC AGACAACATTCCATACGCAGGAAAATCGTTAATAGTCCACATTAAATTAG GACGCAAATTGA AATTCTG CTTGGTTGATATGTCATATGTTTCAACACCATCATACCACAATTGTTTTAGCTCAT CAATCAAAGGTTACAAATATAAATAAATCAAACCTTTTGGATTACGTG GACTGAG GATAATA TAATTTCAG AATATATATG GACTAGTCATATACAACTAAGGTGGTAG ATTATAAG GTATAAGA AAGACAGGCTAACATGAGTATGGTGTCGCAGATATAGAAAAAGGCGTGAAGCCATCCGCA CACAGACCTAACCGAATGTTCCTTGATTCACTAGCAAAATCTG GATATGTCCTATCAAAGTG TTTCCAAGCTTCTCCATCTGAAAGATGACACATAACACCGGGTGGTCTTCTATTTTCAAAGT GCCATCTCATATGAG GAGCAGAACTCATCGACGCATATAACCTTTTTAACCTAGGTATAAGA AGTAAATAATGCATCGCCTTGACAACGGCCATATTCCCACTGGAAAGCCTCTTGAAACGAG GATTTTCGCAAAATTTACAACTGTCTAAAGTTGCATCATCTTTATAATATAACATG CAACCAT CTTCACAACAATCAATTCTCATTGACGAAAGTCCTAACTTAGAAACCAATCTCTTTGCCTCAT AGAAATCACCAGGTAAGTTGATATTAGGGTCAACTAGTTCACTCATAAGGTCAATGAAAGA GTCCATGGCTGCTTGAGAAATATTCCAATCAGATTTGATACTTAGTAATCTAACTGCAACAG ACAGCTCAGAGTGCAGACTTCCTTCACGTAGTAGATGACTAGCTTCCTCTAGTGTTCATAAA AACATTTTGCGTCTTCATTAG GAGTTTGTTCAATATTTTCATTGGGCTCACCCCCGAAGTGC ATCCCAAAAG CATCCGCAACCATATCCTGAATTCTAGAATCAAGATTTGTATTCTCCACCGA 85 CCTACTACTTTCACCAACAACCATGTTACGAAATATCCCACGGCTACCATCGATCTCTCCAT GATTAGTCCACACAAAGTAATTCTCTATAAACCCCTTCCTATAAAGATGAAGCTTAATTTCCT CCGATTTTTTAAATTTCATACAATCGCACCTGATACAAGGTCACCAAATTACTCCTTCACTTT GGTATGGTGGAAGTGACATTGCATGTCTAATAAAGTCATCAACCCCTTCTACAAAATCCTCC CGCAATCCCCGCCGATTAGGATAATTCCTATTGTACATCCAAGTACATGTTCCATCTATACA AATAAAACAAGAACAAATTAATTTATTCTACAATTATAAATTAATTATATCTTTTTTAGTTAATT CAAGATAATTATTGTTTCCTAATTATACCAATTTATATCCTAAAAGTTCAATTCACACCCAAAA GGTCCAATTCATATCTTAAAAGTTTAATTCATATCCTAAAAGTTTAATTCACAAGAACAAATC CTAAAAACTAAAATTTCAATTCATATCCTACGAGTTTAACCATAAACGAACTAAACTAAAGAA ATTCAACCCATACCCTAAAAGTTCGATTCACAAGAACAAATTAATTTATTCTACAATTATAAA TTAATTATATTTTTTTTAGTTAATTCAAGATAATTATTTTTTTCTAATTACACCAATTTATATCC TAAAAGTTCAATTCATATCCAAAAGGTCCAATTCATATCTTAAAAGTTCAATTCATATCCTAA AAGTTCAATTCACTAGAACAAATCCTAAAAACTAAAATTTCAATTCATATCCTACGAGTTTAA ACATAAACTAACTAAACTAAAAAATTTCAACCCATACCCTAAAAGTTTGATTCACAAGAACAA ATCATAAACCCTAGATTCTAACTAAACTATTCAAGAAAATACAAAGTTAATAATTCAATTCTA ACTAGACTATTCAAGACAATACAAACTCAAAATTGAAATACTCATCAATTAAAACTAATTCAT AACTAATTGACTAACTAACAAAACTAATTAGTTAATAAAACTAATTAACAAAACTAATTAAAAC AAGACCTAAACCCTAATCCTCAATAAAATGCAATGTTCAAATAATTGAAATACTAATCAATTG AAACTAATTCATAACTAATTAACAAAACCTAGAAATAATAAATAAATGGGTTGTAATTCAAAC GTAGAATTÜTAGGAGATGGAGAAGGAGAGGGGCGGCAGTGGCAGTGGCAGTGGCAGTG GCAGCGGCGATGGCGATGGCGACGGCGCGGCGACGGTGATGGCTGGGCAGTGGCGACG CGGGGTGGGGAATGAGATHßJGTGAGGGAAÄUUÄGAAGGAGAGGGGAAGGTHTGAGT GAGAAAAATAGAGAAG GAGAGGGGAAGATAAGAGAGAAATGGGGGTTCCCCCGTTTTTCA ATTCTGATTTCAGAATTACCGACCAAAGTTGGTCAGTAATTTTGGTCGGTACATTAAGTGTT GACCGTTTGACCAAAAACCGACCAACTTCGGTCGGTTTTÜTTTTTAAAATTAAACTTTTTTT TTTGGTGTGTTTTTTTCTTAAAATATTATAAACTATAAAAAATATATTATAAACTACAAGCATT TATTTTATTTAACAATACAATTATTATAAATAATTATAAACTATAAGTATAATATTTACAAATAA TTATATTAACTATTTAATTTTAATAAATTATAATAGCATCTATCTAAGTAAATTTTCTAAGTTAT AATTAAGTATGTGAGTAATTTCTCACATACACACATACACTATATTGTAATTGATGCTAATTA CTTCTTTTTTCATTCGTTCATCACTAATAATGCATGACATAGATTAATCGATATATAGGTCGA GACGTTTTGATGAATCATCGATTAATATTCATCGATACATCTAAGTAAGTTATAAGTCGATGA ATCAATTTACAAATAGATATATTTGATGATAAAGTATATATACTAATTAGTATCTTCCCAAGTC TATCCCTAAAAGAACCCGACCCTATGGTCCTAGCGCTTCGTGTTCTTATATATATACGGCTA TACCTATATATATATACACACACACACACACACACAAATACACTTCACTGTAATACTTTAACT ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA SEK ID No:7 (BAC bitisik sekansina karsilik gelen NtIPMSZ (toplam BAC uzunlugu 10082pb'dir)) TAAAACACGCTTCGTTGTACTACTTTAACTACATATATAGCATATTATATATAGTATATGTTA GTGTATTCATTATTTGTATTACAAAAGTGTTAACGAATTACATTTATATTATTTAGATAGTAAA TATAAAAGTAATTCGAAAGTTTGACCAATGTTGACGTAATAACCGACCAACTTTGGTCGGTT AITTTACAGAAAATATCAATTACCGACCAAAGTTGGTCGGTAAATACTTTCCCTGCATTAAC CGACCAACGTTGGTCGATAATTTTAAATATAAATTCTTAAATATTATAAAATATTTTAAATAAT AAAATAATTATTAAAATTTTAAAAATTGGGTCCAGATTACCGACCAACGTTGGTCGGTAATC CAAAATTTTCTTGTCTGACCAGCTAGGTCAATTCGTTGACCAATTTTGCCGACCAACGTTGG TCGGTATTTAGTTCAAAAAAAATGTAAAATTTTTTGTTTCCAGTTTTCGTCCAAGCTGGACGG TTTTTGGTCGCTTTTTHTTTACCGACCAACGTTGGTCGGAAATATTTGGTCAGTTTTTATCA GATTTTTAGTAGTGTCAAACACTTTAAAACTCGTTTTATCCCTTAGAATTTCAGTACCTCCAT TGTATTGAATCAACCCCAACCCTCCATTÜTCTCATTTACATTAGGCGCATTGATGTACCTCT TTCCTTTTAAGGAATATATTTTGTAACATGGTGAATATTTTGTGCAGTGGCCACCATGCATT GAAAGCCAAAATGGCTGAGGTAAGATACATAATCTATAGTACGATATACTACAAATATTATA 86 GTATATGGACTTGGATCAAATCATTTTATTTTTGTTACAGCTTGGATATGACTTTGATGGAAA AGAACTTGATGACCTCTTTCGTCGATTCAAGTCACTGGCTGAGAGGAAAAAGGTGATTAAG TTGCTGATCTTTCATAGTGCAATGGTCAAACTTGTGATCGCACCTTTTCGTTCCTAGTGTTT GTTCATATTTTTTGAGTTAATTTTAAGTATGATCACTAATTTCTATTATAATAATAAAATTTAAT TTTATTTATTCACATTAAAATGACTGAACTAACAATTAAAAATATTTGAAAAACATATGAAAAA TTACGGCCAAAGAAAAATTTCTTTGACTCTCAAACATCCAAGCATCACCACATAGTAATAAA TGAAAAAATTATTTTTTATCACATTAAAGTAACTGAATTTTACTTACTATTCATAATAAAAGAA AACCACTAAACTTTACGCACTATAGTGGGAAAACCTATCCATATTCAAGGTGACTTTAAGTA CTGGTCTAATAGGTAGATTTTTGTGATTTTACTGTTATAGTGGATAAAATTAAGTAACTTTTT TTGATAAATTAGCAGAATAGCCTGAGTGACATCTCACTAATTCGGCTTTGACATCTCGGTCC CCTTACTCCACAGTTTCAACCAAACACTTGAACTTGTATAAAATATTAGTTTTAAACACCTCT GATACTGTGTGTTGTCCACTCGCGCTGATATAAATGACACATCAGAGTCACCTCAGATACA TTTAATGCCACGTCATTATCTATTTTTACAAAAAATATTTTTTTAATAAAAATATCAAACTCAT CCCTTTTTCTCCAAAAAAAGAAAACAAACCTTAGTTCTCTCTCCACCGTTCCATATCTGCCT CTTCCACCCATCACCGCCACTACCAAACACTGCACCCTTCCTCTTCCATGAGAAAACACTC AATCAAACCACTTTATCTTTTTTTTTGTCCTAAATTTCTCCATTACTACAATCTATTCAACCAC CCATGGAAGTTCTGTTGCCACCATCGCCAGCAACCACTCCAAAACCACCACTATATCTCCT CTTCTCTTCATATTCATGTCACCCTTTCAAAACCTAGACATTGAACGAGTTTAAGAAAATTTA TCCTTCAATTTTCTTTCTAGCCAAACACCCAAAGAAAAACCCAAAAATTGAAAAAGAAAGAG AAGAAATTTTTACTTAATATTTGGTACCTCAAAATTCTTATTAACCCCTCTAGCTACGGCAAA ATTTATAAAACTAACAAAATCAAGCTTCGACGTCTTCAACAACCGATGACGACCCAATTTTT GGCTTAAACACTATTTTCAAGCTTCAATGTCTCTTAATTCTCCGACGTCTTTATTGTCTTCTT CAGTTATTTTGAGAAAAAACAAAAATTAAACAACTTTGTTCCTTGACTAGCTGCTCTGCTAAG CTCTATTAGTTTGATGTTGTTATGCTACACCTTTTTGTTTTTTATCATAGTCCAGTTGATTGCT AAGATTGTAAGAGAAATAATGTAATGTTATTTGAGAAAACTCTACTTGAGAAACAAAAATTTA ATATTAGAGGGTGTGGAGCGTGCCAATTTCAATGGCGTTTTTAAGGGATTTGGGGGTAAGA AGAAGCGGATGGGATAGAGGGGCGAGATAATGGCTAGCATTGI I I I IAAI I I I I IAAI I I I I TATTTTTCTCTTATATTATTTTCTAATCAAATTTTGTATAGTTACTTGCTTTTAGGAGTGTGCA ATCACTTATTTTGCTTGACTCAACAAAACAAAGGCCGTATAAGCTTGGTCAATGGTCATATG GGTTTAAAACTAATGTCTTATACAAGTTCAAGTACCTGATTGAAACTATGTGGAGTAGGGGG ATCGTAATAGCAAAGCCGAATAAGTCGAGGTGTCTCTTAGTCTAAAGTAGCCTTATTTTATA GTGAGTAAAGTTATGTCATTATATTTATATATGAAATTAACCCTATAGGTTTTCCAGTTCTTT GGTGAAGCTTACCTAATTAAAATTTTACCTGTGTCGGTATAATGAATATGTATGTCCGCCTA TTTATCTTCCCTACATCTATTTTTCAGAAAATTACAGATGATGACTTGAGAGCACTTGTATCA GATGACGTTTTCCAGCCTCAAGTTTCCTGGCAACTTGGAGATGTACAGGTACATGTAAATA CTATTTCATGTGTTTTTGCCTAAGTTGCTCTGACACGGCAGTTTAGGTGACACGCCCGTGT CGGCAAGACACTAGTATGAGTGTGGATGTGAGATCCGTACCGGATCTGGTCAAATAATTTT GGGTACTTTGACCGCAGCGTACGAAAAAATTAGAGATAAGATACAATTTGATTCCCGAAAT CAGAACCAAAGCTAGGGTGAATTTGAACAAAATAGCATACATTATCTAGGAAATCAATCCTT TACTTATCTACAACTCGAGAATAAAAAATAAATCCACACATTACAAGTTATACGTAAGTATTC CACAAAATTTCTCGTAATTTAGATATATTTTTATATTTTTATTTAATTGAATTATTTTTAGTCGG ATCCCCGCACCCGTATCCGTATTAGGATCAGTATCCCAAAATCTTAGAATTTACATCTCGAA GGATCCGACCTCTAGATCTGCACCTGTATCGGATACCCGTACCCGTATCTGAGCAACTTAG GTTTTTGCTAGTCTCACTTAGTTGTGGATTGAAAAGGAATTAATGTTCACCTAAATCTAATGA TTTGCTGTTTATTGTACAGATTACTTGTGGAAATGTTGGCCGCTCTACAGCAAATGTTAAGC TTATTGACAGCGATGGTCAAGAGCACACTGCCTTTTCTGTTGGAACAGGACCTGTTGATGC AGCTTACAAGGCAGTTGACCTCATTGTAAAGGTTTATAATGAAACTGAAAACTCTCATAATG TTTGTATCTTGTCACACTAGTAGGATAGGTAATTTAAGTTTTATATACGCTGAAGGTATAAAA ATATTTACTCAATCAGAGCGCTTACAAGACAATTGCAGGTAACTCTATGAGTAGCTTAGACT AAAAGTTTTAATTATTTAATTATATTTATGCATGCCTCAACACGTTTACTCACCTCTTAGCCTA ATTTTTGTTACATGGGATCGTTCTACATTTTGAGTAGCTGAGAGATTTGAACTTAGGACCTT TATTTTCTCTAACACTATGTTATATTGCCAGTGGAACAGGAGCGCATATGGACATTGTCGTT TCAAGTGTCCAAGCCTATGTTGAGGCGTTGAACAAAATATTCAGTTACAAAAAAACAGGTCT 87 CGTGAACAAATTTGAAGGCAGTGCGCAATCGTAAAAGTGATGGTGTGTGCTCCAGAAACAA AAGCTTAAATGCTGCTTAGTGCTCGATGATCATAAATTTATGCTCTATTCATGCATGCATTAC TGAAGTTAATTAAGAAGTAATCTTAATTGTATAAGATGTAAACATGTTTCTATTCATGCATTA CTATGAAATTAATTACAATTTCTGAGCCAATTTHWTATTTGGTTCTTAAAATTTATACAAATC TCTTTATTTGTATTTGACTAACAGATTTTCGGGAATTAGGGCAAGTAGTCCAATCAGAATCA CATTAAGCTTGGAGAGTAAAATCAAAATCTGCACTCCTGAACAAACCTTGACTCAAAGTACC TTTAACATATTTTAAAACATGAAAAGGAGCAGCCATATGAGAAGCAGCCATATGAGAAGCA GCCATGTGCGGTCCTCACATTGCTTGAGCCTGCAGGTATTCTGTAGCTGCACAATTTGATC TGCAGCTGCACTTCAGCTTCTACGATCGCACAATTCATGTGCAGTCCGCACTTCTGGCAAG GCTTCAGTCTTGTTCATTTTGCACGCTCTCTGAACTTTTTGTATTCTTTTCAGTGCAACTATG TTCTGCGGCCACACAAATTGTGTGCGGTCTGCAATTCTCTTCAATCACTTCTAGGCTTCTAC ATTAGATCTATGGCCGTAGAGAGAATTATATGGTCCGCACTTTCCTCTACGGCCACAGAAA TACITTTGCGGACCGCACTTCTGCTCTACTGCGCTCCTTCTTGCCTTGTGAGCCGGAACAC TCCTTTTTGAGTTGAATTTCTTCATTAGAGTACAAATTTCCAACATTCCTGTAATTTGCAGAC TTTTATTAGTTTTGGGAACATAAATCAATACTTTTGGACTAAAACTAAAGCAAGAAGGTACTA ATAAGTGGTCAAAATCCACACTTATCACCAATCCATACCCAAAATAACATCAAAATCTACCA TATTAAGTAACAAAAGATTAACCCTAGTCTCGTAGCCCCAATAGTGACAAAACAAGAACAAT AGACACAGTCTACCACAATAGAATCCCCAACGGGTGTAGACACATAAGTAGGAGTATTGAG AGAATCATGAGACATATCCAAATATGAAGAAAAGTAGGATGACACATACGAATATGTAGAAC CCAGATCAAATCAAACTAATGCCTCTCTATGACAGATCAGAATGATACCTGTGATAACTGCA TCTGAAGCAACTGCCTCAGTCCTACCAAGGAAAGAATAACAACGAGCTCGGCCTCCTCCTC TATGATGACCTCTACCCGCCTGTCCTCCACCTCCAGCTAGCTGTGCAGGTGAAGTAGCAAC TGGAGCGGGAACTGTAGCCTTAGTACCTTGCTGAGGTCCATCCATCTTAAGTCTGGGACAA TCTCTCACCTTGTCCCTAGTATCATCACACTCTAAATAACCTCTATGCGAGCGTTGCTGCTG GTACTGAGTTTGCCCGTGACGATTGGAATGACCACTCTAGGAACCTCATGCAGAAGGCAC ACTGAAATATGTCCGGTACGAGTGCTCTAAGATCCATGGCTAGCTGGAGCACCACAGGAA ATGTGAGGTGCATACTGAACTAGTCGACTGACAAAGCCTCTGCCATAAAGGGTCTAAGCTG TATAGTAAAAACCACTAAATCCTCCAGAACCACGAGGCTTCTTATCCTCCCTATCCTCCCTC TCCTGACAGCGGATACGCTCTAACATCCTAGCAATCTCCACAACCTGATGAAATGCAATCT CAGTCTCTAACTCCCGTGCCATACCATATCTGAGGCTAAAGGCGAGTCCCTCAATAAATCT ACGAACTCTCTCTCTATCAGTGGAAACCAAGGAAGGTGCATGACGAGATAACTCCGTAAAC CTCATAGCATACTCGGACACAGTCATGCTCCCCTGGCGCAACTGCTCAAACTCATTGCACA ACTCATCCCTGCAGGTCTAAGCTCCATCAAGAAAAGATCAGAGAATAGGGACCATGTAAAT GGTGTTGCGCCAACTATCATACTCGCCTCATAAATCTACCACCATATGTATGCCGAACCCG TCAACTGGAAAAGTAGTAAGGTTGACCCCCCTCGACTCCACCAAACCTATGGTACGTAGAA TGCGATGATACTAATCCAATAAACTTTGTGCATCCTCAGAAGTCCCTCCACTAAACTAGGGA GGATGAAACTTCAGTAACCTCTCCAAACACCTCTGTCCCTCAGCCGAGACAACTGGCCCTA CCTCGGGCTGAACTGCCGTTATTGGCTGCACCAACACAACACCCAGTGTCTGGTAAGCAT GAGTCGGCTACTCTGGTGTGCGGGCTGCGTGAGTTTGAGCTCCTCCCCCAGTATATGAAG TAGCTGGTGCAACCAGAATCAACTCTTCCTCGGCCAAACTCACAAACATACTCATGAAGTA TGCCAAGGTCTCCTAGAGCGCCAGTGTAGGAATAGGCTGCTCAGGTGCACGCTCAACCTG CTCGGGCTCCTAATCCTCAACTGGAICTGTTGGAGATCCACCGTTGCTACTCTAGCTATAG CATGTGCCCCTCCTCGGCCTCTACCTCGGCCCTGGCCTCTTGCGACTCTAATAGCGGGCA CTTGTGCCTGCTTAGCTAATTTGGTAGAGCGTGTCTTCGCCATCTATGGGAGAATAGAAGA GTAAAGGTTCAAACTTTGGAATAACAAATCGACATGATAAAGAATGAAGGAAGGTGATGTTT CCTAACAGTTCGGTAGCCTCTCAAAGAIAAGTACAAATGTCTTTGTACCGATCGGCAAGATT ATACTAAACCTGCTCATGACAACTCGTAGAACTTATGAACCTAGAGCTATAATACCAACTTG TCATGATCCAAATCTCACCATAGGGGTCTTGATGGAACCTAGTCTATAAAACTAGGTAAGTC GACCACTTAACAATATTTAAATCAGCAAAACATGATATAATAAGGCAGAGTTTAATATGAAA GCAGAAAATAGAGTTAACATCAGCCAAAATGGCAATACTCAAATATTTCCCCAGAATTAGGT AGTACAAAGTCATGAGCTCTGATAGAATACATAAGGATGTCTTAAATTACAATACTGTTTGA ATATGAAAATAACAATATAAATATAGGGAAGGGACTCCAAGGGAATGCGCCGGTCATGCAG GTCTACCTTGAATCCTTGCGGTCAATGTAAGCCTCACTGCCTAGGTCCGCTGCCTCCAACA 88 CCTAAATCTACACAAAATATGTAGAATTATAGTATGAGTACACTACTATCGATACCAGTAAGT ATCAAGACTAACCTCGGTGAAGTAGTGATGAGGTTCAAGTCATTTGATACTCACTAGTCAAA TAAGCTGTACAATATATCAAAGACTAGAAATAGAATGTATAATAGAAAATAATATCAACAATC TCTTTGGAACATATGATAACAACTCAATGCAAGTAAAGGTTCATCTTGACAAAAAGTTATCA AATAGAAACACAAACGTATGATACCTCGTAACACAATAACAATATCCATCTGCATCACTCAG CCCTGACAAAATAACAATACCTAAACTTATCTCTTCGTCCTGACACAATAACAATATCCATCT GTATCGCTCTGCCCTGATATAATAACAATATCCATCTGTATTACTCCGCCCTGACATAACAA CAATATCCACCCGTGTCGTTCCACCCTGACACAATAACAATATCCATCTGTTTCGCTCGGC CTTGACACAATAACAATATCCATATGTATCGCTCAGAACTGTCACAATAACAATCACAATCG TACGACAGAAACCTCGTGCCAACACCCAAACAATCCGCCAACATGTCCATATGTGTCACAA TTATAACAAAACAATAATGTCAAGTTTCATCAAATACTAGCTCACAATTTATCAACAAGGTGC ACAAGGACATGATAACAATAAAAATGTGGATGGGTATTCAACATATAAAGCATGACTACGAC TAATTCAATTGAAAAGATTATGTTCATGTAGTCACAAAGTGATTAAGTATGTTTCATGTAGAG GACATTTCCAAATTAAGGCAIATTAATAGCCTAAGGTCTAATCTAGTCATAAGCCGTATATA ACGCCCATGTACACGCTCGTCACCTCATGTACACGTCGCTTTTCACATAACACGAATAATAA TTAAGGACAAATCATAAGGGGTATTCCCCCACCCCACAAGATTAGGCAAGATACTTACCTC AAATAAGGCAAATCAATACTTTAAAAAGCCCTTGCCTATCGAATCGGCCTCCGAAAGGGTC AAATATAGCCTAAAAACAACTCAATAATATCAAATACGACTATAGAAATTGATTTCAAGTAAG AAAGCTCTGATCTTTATCAAATATCAAAAATTCACTCCGAACTCGCCTCCCGGAACCCGATA AAATTTACAAATCTCGAGTACCCATTCGAATACGAGTTCAAATGTGCAAGTTTTATCCAAATT GGACTCCGAATCGGGGTTCAAATCTCTATTTTTUHTTTAGAATAGTTHTTCCAAAATTCCC AATTTTCTCACTTTGATTAACCAATAAAAAGCCAAATTCAAGATGGAATCATGAACAATAATC AAATCCGAGTAAAGAACACTTACCCAATCCAAGTGGGTGAAAATCGCCTAAAGGATTTCCT CAATTCGAGCTTTAAATCTCAAAATATGATAAAATAAGTCAAACCTTCAATTAAAATACTCTA CTCAGTGATÜTCGCTTCTGCGTACCATCCCATCGCATCTGCAATGCCGCTÜTGTGAGCC CACTCTCGCATATGCGAAGTTCAGTGGCTCCCCGATCCTCTGCTTCTCTGATACTATTCTC GCTTCTACGGAGTCGCTTCTGCACCCAAACTAGCATACCTGCGCCCAAAGTTCCGTACCTA CGGACAATGCTGCCTTCCTCTTCCCTTCGCATCTGTAGCCCTTTTGTCTGCATCTGCAGAC TCAAACTCGCTAGTGCGAGAACACTAGAATCTGAAGTGCTACCATAATATCAAAATAATCCA AAACACACCCGAGGCCTCGGGACCCCATGTAATCATACCAATCAATCCAAAAATATAACAC GGACCTACTCGAGTCCGCAAATCACATAGAATAACATCAAAACCATAAATCACACATCAATT CAAGTTTAATGAACTAACTAACTTCCAAACTTTCAACACTCACGCCAAAACATATCTAAACTA CTTAGAATGACCTTAAATTTCACACACAAGTCTCAAATTACATAATTAACCTATTCCAACTTT CAGAATAACAATCCAGACCCGACAGCCTCAATGTCAACTCCCGGTAAAACCTATGAACCTT CCAAACCTTTAAATTTCCAACATTCGCCAAATAGAGCCAAATAAACCTAGGAACCTCCAAAT CTAAATCCGGACATACGCCTAAGTCTAAAATCACAATACAAATCTATTGGAACCATCAAAAT ACCATTCCAGAATCATHTÄTATAAAAGTCAAACATCGGTCAACTCCTATAACTTAAGCTTGC ATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCCCTATAGTG AGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGT TACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAG GCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATG CGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGTGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTAC AATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCCGACACCCCGCCAACACCCGCTGAC GCGAACCCCTTGCGGCCGCATCGAATATAACTTCGTATAATGT SEK ID No:8 (Trikoma özgü ekspresyonu tahrik etmek için kullanilan promotör sekans. Bu promotör Nicotini'a tabacumdan izole edilmistir ve cis-abienol sentezine dahil olan kopalil- sentazi kodlayan genin 1,5kb yukari yönüne .) agcttctg caaatctcccaacattatcaccttctgccg cctctgaaagcaagtag ctaagcattaattaagaatg accacacaaaataa atagtagtagtaaagtagccgaactacatataattagacccatcatataggttttctagccaatacttttccaattaag attaggtttccttttt aaaaatttgcacaattcttagagagatatctaatagtgcaaaacacagaaatatatatccaaactaccttttctctctccttaaacattttatt 89 taactaacacggcactagttgaaacaatcaggggatatttgtaaaggtaataaatgactggttgatttttaaacgttagatatgttgaaat aaattcaatttgaaaaaacgactaataattaaagctggaacgctacgtattcaacactaagaaaatataatgtgctatttgacaatatat gaagtcaagaaataagaactggcattatatatgttttcaagtaggtttaggctatggcaaaatactaataagcaagcacttaattttg cgg tacaaaataaagttttgtattgttaaataagaagatatatcacgtaacaaaatagagagtattg cctatagttaatttgcatcgctcgtccttt gtgag catttcaataggcttatgatcacacataaatttgtgtgtgaattgctttagaaaaattacataatttgaatttgaggtcttaatatgtgtt caatccagaggagtaggcaccttagctcgagcgatatcgcgtgacaccgcttcgacaacatatttcataaatatgtatgtataaatatta agaaaaataaaaatattgagtataaatataaaagatgacattgcacttctttaaatattgataccgcttacaaaacttctttgcgcgcacg ccattgattcaatctatcatagttcttgtaaatgttatttcagatctttaatttaaaatattttaataaagtcaatcatttttaacatctagatttctcg tttttactttttgtttattatatcacattttggacatagcactaagtcggtataactaattgtgacttgtg caagttaagaaaatacaatgcaatg ctgctgaaacaacag agcaactcgtttccagtaaaaatctaaagtttactactttcacaaaaactaataaaagttttagagtg cgtttgac aatttatttcatg caaagattcgagaacaatcaacacagaattaggctgaagtgtctaagagaatttaatatttgcccttcatcaagagg caatatataaataagcctgcgccattgcaacaactcaaaccatttccaatattgcctcacaagtcagtagtgcctttcctctctcaaacgtt cattgtctttatctcccttccccaattctcattggaagaataaaacaaaaattaaattagaaaatg SEK ID No:9 (RNAi mekanizmasi araciligiyla NtIPMSZ gen ekspresyonunun baskilanmasini tetiklemek için kullanilan sentetik yapi. NthMSZ birinci intron arti birinci eksonun bir fragmanindan olusmaktadir. birinci intron frafmani eksondan sonra ters olarak tekrarlanmaktadir. Bu yapinin saç tokasi yapisinda translasyonu ve birlesmesi teorik olarak bir çift sarmalli RNA ile sonuçlanmaktadir.) gctaagcttgtcgaccatggaaattctctgaccctg attatgLtggtatttttgacaccagtcttcgcgatggcgaacaggccgct ggtgctaccatg actagtaaagaaaaactgggcattgcacgtcagttggctaagcttggtgttgatgttattgaggccggtttt ccttttgcctctgaagctgagttcgagcttgtaaagttgatagcacaggaaattggtaacctttaatqtttaaccqttcacatttctaa tatttacttatttqtaacatqtcqtcacqtqttaatttcattctttttatqaaccaaacatqcatqcaaaaatatttttaqatatttqqacqchaq tqaqatttqaaactaqqaccqtttqcctqatacaatattaaaatatqtaaccattttatqtacaaqtttaaactqttqataqtaqcatatttttta cttttatttaaqtatactatattccaacaqgtaaGTTAACggatttcctgLtgctatcaactttacaaqctcgaactcagcttcam gcaaaaggaaaaccggcctcaataacatcaacaccaagcttagccaactgacgtgcaatgtccagtttttctttactagtcat ggtagcaccagcggcctgttcgccatcgcgaagactggtgtcaaaaataccaacataatcagggtcagagaatttggcgc gccaaügacc Kalin ve alti çizili: ekson 1,21-229 Kalin: birlesme siniri Italik: birlesme alani Italik ve alti çizili: intron 1 SEK ID NO:10 (NthMSiA nükleotit sekansi) ATGTCTTCTCTCTGTTCAAACTCTG CAACTTCTCTTAGTTGTAATAACTCCTTCCAATCCAAA AATCCTCTTCTTCACACCATCTTTAACTTCTTTCCTTCAATCAAACCACACTCTTGTTTCCCA TATACAGTTATCCGGTGCTCAATTCAAAAGCGACCTGAATATATACCGAGTAAAATCTCCGA CCACAAATACGTACGCATTTTCGACAC GACTCTCCGCGATG GAGAG CAATCCCCGGGCGC TACGATGACTACGAAAGAAAAATTAGATGTTGCCCGTAAATTAGCGAAACTCGGAGTTGAC ATAATCGAAGCTGGGTTTCCAGCTTCATCTGAAGCTGATTTTGAAG CTGTGAGATTAATAGC AGAGGAAATTGGTAATAATAGCGACGGTGATTATGTGCCGGTGATTTGTGGATTAGCGAGG TG CAATAAGAGGGATATTGATAAAGCGTGGGAAG CTGTGAAGTGTGCGAAGAGACCTAGG GTTCATACGTTTATAGCGACGAGTGAGATACATATGAAGTATAAGTTGAAGATGAGTAAAGA AGAAGTAGTG GAGAAAGCG CG GAGTATGGTTGCTTATGCGAGGAGTTTG GGATGTGAGGA TGTTGAATTTAGCCCTGAAGATGCTGGAAGGTCTGAGCGTGAGTTCCTTTACCATATCCTT GGAGAAGTTATCAAAGCTGGTG CAACAACCCTTAACATACCTGATACTGTTG GATACACTG TG CCCACTGAATTTGGACAATTAATTGCtgacataaaagccaataccccaggaattgaaaatgtgatcatttctaca cactgccagaatgatcttggactttctactg ccaacactttag ctggagcttgtgcaggggcaagacaagtagaagtgaccatcaatg 90 gcattggtgaaagagctggaaatg cttctctggaggaggttgtaatggccttaaaatgtcgtggagagcaagtactaggtggcctgtat acaggaattaatacacaacatatactcatgtcaagcaagatggtagaggagtacaccgggcttcatgtgcagccacacaaggccat tgttggagctaatgcttttgctcatgaaagtggcatccatcagGATGGAATGTTAAAACACAAAGATACATATGAG ATTATATCTCCTGAAGATATTGGGCTTAGTCGTGCTAATGAAGCCGGTATTGTCCTTGGGAA GCTCAGTG GG CGCCATG CATTGAAATCCAAAATGCTTGAGCTTGGATATGACATTGAG GGA AAAGAACTGGAGGACCTCTTCTGGCGATTTAAGTCGGTGGCTGAGAAGAAAAAGAAAATTA CAGATGATGACATAATAGCACTGATGTCAGATGAAGTTTTCCAGCCTCAAGTTGTTTGGCAA CTTGCAGATGTACAGATTGCCTGTGGAAGTCTTGGCCTCTCTACAGCAACTGTTAAGCTTA TTGACAGTGATGGTCAAGAGCATGTTGCTTGTTCTGTTGGAACCGGACCAGTTGATG CAGC TTATAAGGCAGTTGACCTCATTGTAAAG GTACCTATAACACTCCTCGAGTATTCCATGAATG CAGTCACAGAAG GTATAGATGCCATAGCCTCAACCAGAGTATTAATCCGCGGGGAGGATG ACCATGCTATAACCAATGGTTCAATTGGACCGACTCATCACCGTATATTTAGTGGAACTGGA GCTGATATGGACGTTGTCATCTCTAGTGTCCGAGCCTATATTGGTGCATTGAACAAAATGTT GAGTTTCGGGAAGCTGGTTTCGAGGTACAAGAAGCCTGAAG GTAGTGTG GTAGTATAA SEK lD NO:11 (NtIPMS1A amino asit sekansi) MSSLCSNSATSLSCNNSFQSKNPLLHTIFNFFPSIKPHSCFPYTVIRCSIQKRPEYIPSKISDHKY VRI FDTTLRDGEQSPGATMTTKEKLDVARKLAKLGVDI I EAGFPASSEADFEAVRLlAEElGNNS DGDYVPVICGLARCNKRDIDKAW EAVKCAKRPRVHTFIATSEI HMKYKLKMSKEEVVEKARSM VAYARSLGCEDVEFSPEDAG RSEREFLYH I LG EVIKAGATTLN I PDTVGYTVPTEFGQLIADI KAN TPG I ENVI ISTHCQN DLGLSTANTLAGACAGARQVEVTI NGIG ERAG NASLEEVVMALKC RGEQ VLGGLYTGINTQHILMSSKMVEEYTGLHVQPHKAIVGANAFAHESGIHQDGMLKHKDTYEHSPE DIGLSRAN EAGIVLGKLSGRHALKSKMLELGYDIEGKELEDLFWRFKSVAEKKKKITDDDIIALMS DEVFQPQVVWQLADVQIACGSLGLSTATVKLIDSDGQEHVACSVGTGPVDAAYKAVDLIVKVPI TLLEYSMNAVTEGIDAIASTRVLIRGEDDHAITNGSIGPTHHRIFSGTGADMDWISSVRAYIGAL NKMLSFGKLVSRYKKPEGSVVV SEK ID NO:12 (NtIPMS1BV1 nükleotit sekansi) ATGGCGTCTATCACCATAAACCATTCATTTTCCCGTAACCCTAACATCTCATTCCATCCCCA AAATCCTCTCATTCAAACCCAAGCTCTCTTCAATTTCAAACCATCAATCTCCAAATGTTCCCC TATTATCCACTGCGCAATCCGCCGTCGACCCGAATATACCCCGAGCCACATTCCCGACCC GAACTACATTCGCATCTTCGACACCACTCTCCGCGACGGCGAACAATCCCCAGGCGCCAC AATGAC CACAAAAGAAAAACTCGACGTTGCGCGTCAGTTAGCTAAGCTTGGTGTTGACATA ATTGAAGCCGGTTTTCCTGCTTCTTCTGAAG CTGATCTCGAAGCTGTGAAATTAATAGCGAA GGAAGTTG GAAATGGTGTGAATGAAGAGGGACATGTTCCGGTAATTTGTGGACTTGCGAG GTGTAATAAGAGGGATATTGATAAGGCTTGGGAGGCTGTGAAGTATGCGAAAAAACCGAG GATTCATACGTTTATTGCGACTAGTGAGATACATATGAAGTTTAAGTTGAAGATGAGTAGAG ATGAAGTTGTGGAGAAAGCTAGGAGTATGGTTGCTTATG CTAG GAGTATTGGTTGTGAG GA TGTTGAATTTAG CCCAGAAGATGCTGGAAGATCCGATCCAGAGTTCCTCTATCATATCCTTG GAGAGGTCATCAAAGCTGGGG CAACAACCCTTAACATCCCTGATACTGTTGGATACACTGT TCCCAGCGAATTTGGAAAATTGATTGCTGATATAAAGGCCAATACCCCAGGAATTG GAGAT GTGATCATCTCAACACACTGCCAGAACGATCTTGGGCTTTCTACTGCCAACACCTTAGCTG GAGCATGCGCAGGTGCAAGACAAGTAGAAGTGACCATCAACGGAATCGGTGAAAGAGCTG GAAATGCTTCTTTGGAG GAGGTTGTAATGGCCTTAAAATGTCGTGGAGAGCAAGTACTAGG TG GCCTGTATACAGGAATTAATACACAACATATACTCATGTCAAGCAAGATGGTAGAGGAG TACACCGGGCTTCATGTGCAGCCACACAAGGCCATTGTTGGAGCTAATGCGTTTGCTCATG AAAGTGGCATCCATCAGGATGGAATGTTAAAACACAAAGATACATATGAGATTATATCTCCT GAAGATATTGGGCTTAACCGAGTTAATGAATCTGGCATCGTCCTTGGGAAACTCAGTGGGC GTCATGCTTTGCAAGCCAAAATGCTCGAGCTTGGATACGATATTGAGGGAAAAGAACTTGA GGACCTCTTTTGGCGATTCAAATCTGTGGCCGAGAAGAAAAAGAAAATTACAGATGATGAC CTGATAGCATTAATGTCAGATGAAGTTTTCCAGCCTCAATTTGTTTGGCAACTTGAAAATGT 91 ACAGGTTACATGTGGAAGTCTTGGCCTTTCTACGGCAACTGTTAAG CTCATTGACGCTGAT GGTCAAGAG CATGTTTCTTGTTCTGTTG GAACGGGGCCAGTTGATGCGGCTTATAAGGCA GTTGATCTCATTGTAAAGGTACCTGTAG CACTCCTTGAATATTCCTTGAATGCAGTCACGGA AGGTATAGATGCCATAGCTTCAACCAGAGTTTTAATTCGTGGGGAGAATGGCCATACATCA ACCCATG CTTTAACTG GAGAGACTGTACACCGTTCTTTTAGTGGAACCGGAGCAGATATGG ATATTGTTATCTCCAGTGTCCGAGCCTATATTG GTGCATTGAATAAGATGTTGAGTTTCAGA AAGCTGGTATCGAAACACAGCAAACCTGAAGG CAGTGCAGTCGTATAG SEK ID NO:13 (NtIPMS1Bv1 amino asit sekansi) MASITINHSFSRNPNISFHPQNPLIQTQALFNFKPSISKCSPIlHCAIRRRPEYTPSHIPDPNYIRIF DTTLRDG EQSPGATMTTKEKLDVARQLAKLGVDIIEAGFPASSEADLEAVKLIAKEVGNGVNEE GHVPVICG LARCNKRDIDKAWEAVKYAKKPRI HTFIATSEIHMKFKLKMSRDEVVEKARSMVAY ARSlGCEDVEFSPEDAGRSDPEFLYHlLG EVlKAGATTLNIPDTVGYTVPSEFGKLIADIKANTPGI GDVIISTHCQNDLGLSTANTLAGACAGARQVEVTI NGIGERAGNASLEEWMALKCRGEQVLG GLYTGINTQHILMSSKMVEEYTGLHVQPHKAIVGANAFAHESGIHQDGMLKHKDTYEIISPEDIG LNRVNESGIVLGKLSGRHALQAKMLELGYDIEGKELEDLFWRFKSVAEKKKKITDDDLIALMSDE VFQPQFVWQLENVQVTCGSLG LSTATVKLIDADGQEHVSCSVGTGPVDAAYKAVDLIVKVPVA LLEYSLNAVTEGI DAlASTRVLIRGENGHTSTHALTGETVHRSFSGTGADMDIVISSVRAYIGALN KMLSFRKLVSKHSKPEGSAVV SEK ID NO:14 (NtIPMS1BV2 nükleotit sekansi) ATGGCGTCTATCACCGCAAAC CATACATTTTCCCGTAACCCTAACATCTCATTGCATCCCCA AAATCCTCTCATTCAAACCCAAGCTCTCTTCAACTTCAAATCATCAATCCCCAAATGTTCCC CTATTATCTG CTGCGCAATCCGCCGTCGACCCGACTATACCCCGAGCCACATTCCCGACC CGAAATACATCCGCATCTTCGACACCACTCTCCGCGACGGCGAACAATCTCCAGGCGCCA CAATGACCACAAAAGAAAAACTCGACGTTGCGCGTCAGTTAGCTAAG CTTGGTGTTGACAT AATTGAAGCCGGTTTTCCTGCTTCTTCTGAAGCTGATCTCGAAGCTGTGAAATTAATAGCGA AGGAAGTTGGAAATGGTGTGTATGAAGAGGGACATGTTCCGGTAATCTGTGGACTTGCGA GGTGTAATAAGAGGGATATTGATAAGGCTTGGGAGG CTGTGAAGTATGCGAAAAAACC GA GGATTCATACGTTTATTGCGACTAGTGAGATACATATGAAGTTTAAGTTGAAGATGAGTAGA GATGAAGTTGTGGAGAAAGCTAGAAGTATGGTTGCTTATGCTAGGAGTATTGGTTGTGAGG ATGTTGAATTTAGCCCTGAAGATGCTGGAAGATCTGATCCTGAGTTCCTCTATCATATCCTT GGAGAGGTCATCAAAGCTG GGGCAACAACCCTTAACATCCCTGATACTGTTGGATACACTG TTCCCAGTGAATTTGGAAAATTGATCGCTGATATAAAGGCCAATACCCCAG GAATTGGAGA TGTGATCATCTCAACGCACTGCCAGAACGATCTTGGGCTTTCTACTGCCAACACCTTAGCT GGAGCATGTGCAG GTGCAAGACAAGTAGAAGTGACCATCAATGGAATCG GTGAAAGAG CT GGAAATGCTTCTTTGGAGGAGGTTGTAATGGCCTTAAAATGTCGTGGAGAGCAAGTACTAG GTGGCCTGTATACAGGAATTAATACACAACATATACTCATGTCAAG CAAGATGGTAGAGGA GTACACCGGGCTTCATGTGCAGCCACACAAGGCCATTGTTGGAG CTAATGCTTTTGCTCAT GAAAGTGGCATCCATCAGGATGGAATGTTAAAACACAAAGATACATATGAGATTATATCTCC TGAAGATATTGGGCTTAACCGAG CTAATGAATCTGGTATCGTCCTCGGGAAACTCAGTGGG CGTCATG CTTTGCAAGCCAAAATGCTCGAGCTTGGATACGATATTGAGGGAAAAGAACTTG AGGACCTCTTTTGGCGATTCAAATCTGTGGCTGAGAAGAAAAAGAAAATTACAGATGATGA CCTGATAGCATTGATGTCAGATGAAGTTTTCCAGCCTCAATTTGTTTGGCAACTCGAAAATG TACAGGTTACATGTGGAAGTCTTGGCCTTTCTACGGCAACTGTTAAGCTCATTGACGCTGA TG GTCAAGAG CATGTTTCTTGTTCTGTTGGAACGGGGCCAGTTGATGCGGCTTACAAGGCA GTTGATCTCATTGTAAAGGTACCTGTAG CACTACTTGAATATTCCTTGAATGCAGTCACGGA AGGTATAGATGCCATAGCTTCAACCAGAGTTTTAATTCGTGGGGAGAATGGACATACATCA ACCCATG CTTTAACTG GAGAGACTGTACACCGTTCGTTTAGTGGAACCGGAGCAGATATGG ATATTGTTATCTCTAGTGTCCGAGCCTATATTGGAGCATTGAATAAGATGCTGAGTTTCAGA AAGCTGGTGTCGAAACACAG CAGACCTGAAGGCAGTGCAGTCGTATAG 92 SEK ID NO:15 (NtIPMS1Bv2 amino asit sekansi) MASITANHTFSRNPNISLHPQNPLIQTQALFNFKSSIPKCSPIICCAIRRRPDYTPSHIPDPKYIRIF DTTLRDG EQSPGATMTTKEKLDVARQLAKLGVDIIEAGFPASSEADLEAVKLIAKEVGNGVYEE GHVPVICG LARCNKRDIDKAWEAVKYAKKPRI HTFIATSEIHMKFKLKMSRDEVVEKARSMVAY ARSIGCEDVEFSPEDAGRSDPEFLYHILG EVIKAGATTLNIPDTVGYTVPSEFGKLIADIKANTPGI GDVIISTHCQNDLGLSTANTLAGACAGARQVEVTI NGIGERAG NASLEEWMALKCRGEQVLG GLYTGlNTQHILMSSKMVEEYTGLHVQPHKAIVGANAFAHESGIHQDGMLKHKDTYEIISPEDIG LNRANESGIVLGKLSGRHALQAKMLELGYDIEGKELEDLFWRFKSVAEKKKKITDDDLIALMSDE VFQPQFVWQLENVQVTCGSLG LSTATVKLIDADGQEHVSCSVGTGPVDAAYKAVDLIVKVPVA LLEYSLNAVTEGI DAIASTRVLlRGENGHTSTHALTGETVHRSFSGTGADMDIVISSVRAYIGALN KMLSFRKLVSKHSRPEGSAVV 93 TABLO1 Sükroz esterlerinin yapisi Sükroz esterinin genel yapisi, Sekil 5'te gösterilmektedir ve R1, R2, R3, R4 ve R5 gruplarinin kombinasyonlari tarif edilmektedir. R5 R3 R1 R2 R4 Adi - 02 04i 04i 04i 02012 - 02 04i 04i 05& 02013 - 02 04i C4i 05i 02013 - 02 04i 04i 06& 02014 - C2 04i 04i 06i 02014 - 02 04i 05& 04i 02013 - C2 C4i 05& 05& 02014 - 02 04I 05& 05i 02014 - 02 04i 05& 06& 02015 - 02 04i 05& 06i 02015 - 02 04i 05i 04i 02013 - 02 04i 05i 05& 02014 - 02 04I 05i 05i 02014 - 02 04i 05i 06& 02015 - 02 04I 05i 06i 02015 - 02 04i 06& 04i 02014 - 02 04I 06& 05& 02015 - 02 04i 06& 05i 02015 - 02 04i 06& 06& 02016 - 02 04i 06& 06i 02016 - 02 04i 06i 04i 02014 - 02 04i 06i 05& 02015 - 02 04i 06i 05i 02015 - 02 04i 06i 06& 02016 - 02 04i 06i 06i 02016 - - C4i C4i C4i 012 - - 04i 04i 05& 013 - - 04i 04i 05i 013 - - 04i 04i 06& 014 - - 04i 04i 06i 014 - - 04I 05& 04i 013 - - 04i 05& 05& 014 - - 04i 05& 05i 014 - - 04I 05& 06& 015 - - 04i 05& 06i 015 - - 04I 05I 04i 013 - - 04i 05i 05& 014 - - 04i 05i 05i 014 - - 04i 05i 06& 015 - - 04I 05I 06I 015 - - 04i 06& 04i 014 - - 04i 06& 05& 015 - - C4i 06& 05i 015 - - 04i 06& 06& 016 - - 04i 06& 06i 016 - - 04i 06i 04i 014 04i 04i 04i 04I 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04I 04i 04i 04i 04i 04I 04i 04i 04i 04i 04I 04i C4i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04i 04I 04i 04i 04I 04i 04I 04i 04i 04i 04i 04i 04i C4i 04i 04i 04i CGI CGI CGI Cöi C4i 04I C4i C4i C4i C5ai Cöai C5ai Cöai Cöai Cöi C5i C5i Cöi CSI 06ai CGai Cöai CGai 06ai CGI Cöi Cöi Cöi C6i C4i C4i C4i C4i C4i C5ai Cöai Cöai Cöai C5ai CSI 05I CSI 05i Cöi Cöai Cöai 06ai Cöai Cöai C6i CGI C6i C6i Cöai C5i Cöai 06i C4i 05& 05i C6ai CGI C4i Cöai C5i Cöai Cöi C4i C5ai C5i C6ai CGI 04i Cöai CSi Cöai CGI C4i Cöai C5i Cöai C6i C4i Cöai C5i Cöai C6i C4i Cöai C5i Cöai C6i C4i 05ai CSI 06ai CGI 04i 05ai 05i Cöai C6i C4i CSai C5i C6ai 015 015 016 016 01202 01302 01302 01402 01402 01302 01402 01402 01502 01502 01302 01402 01402 01502 01502 01402 01502 01502 01602 01602 01402 01502 01502 01602 01602 0201202 0201302 0201302 0201402 0201402 0201302 0201402 0201402 0201502 0201502 0201302 0201402 0201402 0201502 0201502 0201402 0201502 0201502 0201602 0201602 0201402 0201502 0201502 0201602 94 04I 05& 05& 05& 05& 05& 05& C5& 05& 05& 05& C5& C5& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& C5& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& C5& C5& C5& 05& C5& 05& 05& 05& 05& C5& 05& 05& 05& 05& 05& 05& C5& 05& 05& C& 04i 04i 04i C4i 04I 05& C5& 05& 05& 05& C& C& C& 0& C& 06& 06& 06& 06& 06& 0& C& 0& 0& 0& cm CM C& 0& cm 05& 05& 05& 05& 05& C& 0& C& C& 0& 06& 06& 06& 06& 06& 0& C& C& C& C& C& cm 0& CN 05& 0& 06& 0& 0& 05& C& 06& C& CM 05& C& 06& C& C& 05& 0& 06& 0& cm 05& C& 06& 0& cm 05& C& 06& C& C& 05& 0& 06& 0& cm 05& 0& 06& 0& cm 05& C& 06& C& CM 05& C& 06& C& C& 05& 95 0201602 02013 02014 02014 02015 02015 02014 02015 02015 02016 02016 02014 02015 02015 02016 02016 02015 02016 02016 02017 02017 02015 02016 02016 02017 02017 013 014 014 015 015 014 015 015 016 016 014 015 015 016 016 015 016 016 017 017 015 016 016 017 017 01302 01402 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& C5& C5& 05& C5& C5& C5& 05& C5& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& C5& C5& C5& 05& C5& 05& C5& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05& 05i 05i 05i C5i C5i 04I 04i 04i 05& 05& 05& 05& 05& 05i 05i 05i C5i C5i C6& 06& C6& C6ai Cöai 06i 06i 06i 06i 06i 04I 04i 04i C4i C4i CSai 053i 05ai 05ai CSai C5i C5i C5i 05i C5i Cßai C6ai 06ai 06ai 06ai 06i 06i 06i 06i 06i 04i C4i C4i C4i C4i 0& 06& C& C& 05& 05i 06& C& C& 05& 0& C6& C& C& 05& C& C6& C& C& 05& C& 06& C& 0& 05& C& 06& C& C& 05& C& 06& C& C& 05& C& C6& C& 0& C5& 0& C6& 0& C& 05& C& 06& C& 0& 05& C& C6& C& 01402 01502 01502 01402 01502 01502 01602 01602 01402 01502 01502 01602 01602 01502 01602 01602 01702 01702 01502 01602 01602 01702 01702 0201302 0201402 0201402 0201502 0201502 0201402 0201502 0201502 0201602 0201602 0201402 0201502 0201502 0201602 0201602 0201502 0201602 0201602 0201702 0201702 0201502 0201602 0201602 0201702 0201702 02013 02014 02014 02015 02015 96 05I 05i 05i 05I 05i 05I 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05I 05i 05i 05i 05i 05I 05i 05i 05i 05I 05I 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05I 05i 05i 05I 05i 05I 05i 05i 05i 05I 05i 05i 05i 05i 05i 05i 05ai C5ai CSai C5ai 05ai C5i 05i C5i Cöi C5i Cöai Cöai Cöai Cöai Cöai C6i C6i CGI CGI CGI C4i 04i C4i 04I C4i Cöai C5ai 05ai C5ai CSai C5i Cöi CSI C5i C5i CGai Cöai Cöai Cßai Cöai CGI CGI CGI CGI CGI C4i 04I C4i 04i C4i CSai C5ai C5ai C4i C5& Cöi cem CGI C4i 05ai C5i Cöai C6i C4i C5ai Cöi C6ai CGI C4i C5ai C5i Cöai CGI C4i 05ai 05i 06ai CGI C4i C5ai C5i C6ai CGI C4i Cöai CSI Cöai C6i C4i Cöai CSI Cöai CGI C4i CSai C5i Cöai CGI C4i 05ai 05i Cöai Cöi C4i CSai C5i 02014 02015 02015 02016 02016 02014 02015 02015 02016 02016 02015 02016 02016 02017 02017 02015 02016 02016 02017 02017 013 014 014 015 015 014 015 015 016 016 014 015 015 016 016 015 016 016 017 017 015 016 016 017 017 01302 01402 01402 01502 01502 01402 01502 01502 97 CSI 05i C5i C5i C5i 05i 05i C5i Cöi C5i CSI C5i Cöi C5i Cöi C5i C5i C5i 05i 05i C5i CSI CSI Cöi C5i C5i Cöi C5i C5i 05i C5i Cöi CSI C5i C5i Cöi C5i CSI C5i C5i CSI 05i Cöai CGai Cöai Cöai 06ai Cöai Cöai C6ai Cöai Cöai Cöai C5& C5ai CSi C5i C5i C5i 05i C6ai CGai Cöai Cöai Cöai CGI Cöi CGI C6i CGI C4i C4i C4i C4i C4i C5ai C5ai C5ai Cöai C5ai Cöi C5i 05i C5i Cöi Cöai Cöai C6ai CGai Cöai CGI CGI CGI CSI CGI C4i C4i C4i C4i C4i CSai C5ai C5ai CSai 05ai C5i 06& CGI cm 05& C5i 06& CGI C4i 05ai CSI Cöai C6i C4i Cöai Cöi C6ai C6i C4i 05ai C5i Cöai CGI C4i C5ai C5i Cöai Cöi C4i C5ai 05i Cöai C6i C4i 05ai C5i Cöai C6i C4i CSai C5i Cöai C6i CM Cöai C5i Cöai CGI C4i Cöai 05i C6ai C6i C4i 01602 01602 01402 01502 01502 01602 01602 01502 01602 01602 01702 01702 01502 01602 01602 01702 01702 0201302 0201402 0201402 0201502 0201502 0201402 0201502 0201502 0201602 0201602 0201402 0201502 0201502 0201602 0201602 0201502 0201602 0201602 0201702 0201702 0201502 0201602 0201602 0201702 0201702 02014 02015 02015 02016 02016 02015 02016 02016 02017 02017 02015 98 06& C6& C6& C6& CG& 06& 06& C6& 06& C6& 06& C6& CG& C6& C6& C6& C6& 06& C6& 06& CG& C6& 06& 06& C6& C6& C6& CG& C6& 06& C6& CG& C6& C6& C6& CG& CG& C6& 06& C6& C6& 06& 06& C6& C6& 06& 06& 06& C6& C6& C6& C6& C6& C& C& C& C& 06& 06& 06& C6& 06& C& C& C& C& C& C& C& C& C& C& C5& 05& C5& 05& 05& C& C& C& C& C& C6& C6& CG& C6& C6& C& C& C& C& C& C& C& C& 04I cm C5& 05& 05& C5& C5& C& C& C& C& 05& C& CG& C& C& 05& C& CG& C& C& 05& C& CG& C& C& C5& C& 06& C& 04i C5& C& CG& C& C& C5& C& 06& C& cm C5& C& CG& C& C& 05& C& CG& C& C& C5& C& CG& C& cm 05& C& C6& C& C& 05& C& CG& 02016 02016 02017 02017 02016 02017 02017 02018 02018 02016 02017 02017 02018 02018 014 015 015 016 016 015 016 016 017 017 015 016 016 017 017 016 017 017 018 018 016 017 017 018 018 01402 01502 01502 01602 01602 01502 01602 01602 01702 01702 01502 01602 01602 01702 99 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& 06& C& C& C& C& 0& C& C& C& C& C& C& C& C& C& C& C& C& 0& 06& 06& 06& 06& 06& C& C& C& C& C& CM CM CM CM CM C5& C5& C5& 05& 05& 0& 0& C& C& 0& C6& 06& 06& 06& 06& C& C& C& C& C& CM CM CM CM CM C5& 05& 05& 05& 05& 0& C& C& C& C& 06& 06& 0& CM 05& 0& 06& 0& CM 05& C& 06& C& CM 05& C& 06& C& CM 05& C& 06& 0& CM 05& 0& 06& C& CM 05& C& 06& C& CM 05& C& 06& C& CM 05& C& 06& 0& CM 05& C& 06& C& CM 05& C& 06& C& CM 05& 100 01702 01602 01702 01702 01802 01802 01602 01702 01702 01802 01802 0201402 0201502 0201502 0201602 0201602 0201502 0201602 0201602 0201702 0201702 0201502 0201602 0201602 0201702 0201702 0201602 0201702 0201702 0201802 0201802 0201602 0201702 0201702 0201802 0201802 02014 02015 02015 02016 02016 02015 02016 02016 02017 02017 02015 02016 02016 02017 02017 02016 02017 06I 06i 06i 06I 06i 06I 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06I 06i 06i 06i 06i 06I 06i 06i 06i 06I 06I 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06i 06I 06i 06i 06I 06i 06I 06i 06i 06i 06I 06i 06i 06i 06i 06i 06i Cöai Cßai Cöai Cöi Cöi CGI CGI C6i C4i C4i C4i C4i C4i C5ai Cöai C5ai C5ai C5ai CSI C5i C5i CSi CSI 06ai Cöai Cöai C6ai Cöai C6i CGI C6i C6i CGI C4i C4i C4i C4i C4i C5ai CSai C5ai C5ai 05ai C5i C5i C5i C5i Cöi Cöai C6ai C6ai Cöai Cöai C5i CG& C6i C4i C5& C5i Cöai C6i C4i CSai C5i Cöai C6i C4i Cöai C5i C6ai C6i C4i C5ai C5i Cöai C6i 04I C5ai C5i C6ai C6i C4i CSai C5i Cöai CGI C4i C5& C5i C6ai CGI C4i C5ai CSI C6ai CGI C4i CSai C5i 06ai C6i 04i C5ai C5i Cöai C6i 02017 02018 02018 02016 02017 02017 02018 02018 014 015 C15 C16 016 015 016 016 017 017 015 016 016 017 017 016 017 017 018 018 016 017 017 018 018 01402 01502 01502 01602 01602 01502 01602 01602 01702 01702 01502 01602 01602 01702 01702 01602 01702 01702 01802 01802 101 102 02 - 06I 06I 04i 01602 02 - 06i 06i 05ai 01702 02 - 06i 06i 05i 01702 02 - 06I 06i 06ai 01802 02 06i 06i 06i 01802 02 02 06I 04i 04I 0201402 02 02 06i 04i 05& 0201502 02 02 06i 04i 05i 0201502 02 02 06i 04i 06& 0201602 02 02 06i 04i 06i 0201602 02 02 06i 05& 04i 0201502 02 02 06i 05& 05& 0201602 02 02 06i 05& 05i 0201602 02 02 06i 05& 06& 0201702 02 02 06I 05& 06i 0201702 02 02 06i 05i 04i 0201502 02 02 06i 05i 05& 0201602 02 02 06i 05i 05i 0201602 02 02 06i 05i 06& 0201702 02 02 06I 05i 06i 0201702 02 02 06i 06& 04i 0201602 02 02 06I 06& 05& 0201702 02 02 06i 06& 05i 0201702 02 02 06I 06& 06& 0201802 02 02 06I 06& 06i 0201802 02 02 06i 06i 04i 0201602 02 02 06i 06i 05& 0201702 02 02 06i 06i 05i 0201702 02 02 06i 06i 06& 0201802 02 02 06i 06i 06i 0201802 C2 astili ifade etmektedir; C3 bütirili ifade etmektedir; C4 propionili ifade etmektedir; CS valeril (pentanoil) ifade etmektedir; 05& 2-metiI-bütirili ifade etmektedir; CSi izovalerili ifade etmektedir; 05:1i izopentenoili ifade etmektedir; 0521 pentenoili ifade etmektedir 06 hekzanoili ifade etmektedir; 06(2) 2-metilvalerili ifade etmektedir; Cöai beta-metilvalerili ifade etmektedir; CGI 4- metilvalerili ifade etmektedir; - tipik olarak hidrojendir. TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims

ISTEM LER

1. Asagidakileri içeren bir rekombinant yapi içeren bir transjenik tütün bitki hücresi olup, (a) faal olarak bir trikoma özgü promotöre baglanan, bir izopropilmalat sentaz kodlayan bir polinükleotit ya da (b) faal olarak bir trikoma özgü promotöre baglanan, bir izopropilmalat sentaz geninin ekspresyonunu azaltan ya da inhibe eden bir polinükleotit içermekte olup, özelligi; (i) bir izopropilmalat sentaz kodlayan polinükleoititin SEK ID No:1 ya da SEK ID NO:10 ya da SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO:14 ile en az %80 sekans özdesligine sahip olmasi; ya da (ii) izopropilmalat sentazin SEK ID No:2 ya da SEK ID NO:11 ya da SEK lD NO:13 ya da SEK ID NO:15 ile en az %80 sekans özdesligine sahip olan bir polipeptit içermesi; opsiyonel olarak burada söz konusu promotörün SEK lD NO:8“de belirtilen sekansi ya da bunun bir varyantini burayla en az yaklasik %60 özdeslikte içermesi ya da bunlardan olusmasidir.

2. Bir transjenik tütün bitkisi olup, özelligi; Istem 1'e göre bitki hücresi içermesidir.

3. Bir tütün bitkisinin en azindan bir kismindaki sükroz esterlerinin miktarini ya da tipini modüle etmeye yönelik bir yöntem olup, özeligi; asagidaki adimlari içermesidir: (i) bitkideki izopropilmalat sentaz ekspresyonunu ya da aktivitesini bitkinin (a) bir trikoma özgü promotöre faal olarak baglanan, bir izopropilmalat sentaz kodlayan bir polinükleotit içeren ya da (b) faal olarak bir trikoma özgü promotöre baglanan bir izopropilmalat sentaz geninin ekspresyonunu azaltan ya da inhibe eden bir polinükleotit (b) içeren bir rekombinant yapi ile transforme edilmesi vasitasiyla modüle edilmesi; burada bir izopropilmalat sentaz kodlayan polinükleotitin SEK ID No:1 ya da SEK ID NO:10 ya da SEK ID NO: 12 ya da SEK ID NO:14 ile en az %80 sekans özdesligine sahip olmasi; ya da burada izopropilmalat sentazin SEK ID No:2 ya da SEK ID NO:11 ya da SEK ID NO:13 ya da SEK ID NO:15 ile en az %80 sekans özdesligine sahip olan bir polipeptit tarafindan kodlanmasi; (ii) opsiyonel olarak (i) adiminda elde edilen transjenik bitkinin en azindan bir parçasindaki bir ya da daha fazla sükroz esterinin miktarinin ölçülmesi ya da tipinin belirlenmesi; ve (iii) buradaki bir ya da daha fazla sükroz esterin miktarinin ya da tipinin izopropilmalat sentazin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmedigi bir kontrol bitkisi ile karsilastirildiginda degismis oldugu bir transjenik bitkinin tanimlanmasini içermesi ve burada söz konusu transjenik bitkinin görsel görünüsünün kontrol bitkisi ile büyük oranda ayni olmasidir.

4. istem 13'e göre bir yöntem olup, özelligi; söz konusu promotörün SEK ID NO:8,de belirtilen sekansi ya da bunun burayla en az yaklasik %60 özdesligi olan bir varyantini içermesi ya da bunlardan olusmasidir.

5. Biyokütle, tohum ya da yapraklari kapsayan bitki materyali olup, özelligi; istem 1'e göre hücreler içermesidir.

6. Bir tütün ürünü olup, özelligi; Istem 1'e göre tütün bitkisi hücresi ya da istem 5'e göre bitki materyali içermesidir.

7. Bir ya da daha fazla sükroz esteri içeren bir bilesim üretmeye yönelik bir yöntem olup, özelligi; asagidaki adimlari içermesidir: (i) Istem 2'ye göre bir transjenik tütün bitkisinin en azindan bir parçasinin, istem 5'e göre bitki materyalinin ya da Istem 6'ya göre tütün ürününün saglanmasi; (ii) buradan sükroz esterinin (esterlerinin) ekstrakte edilmesi; ve (iii) ekstrakte edilmis sükroz esterin (esterlerin) opsiyonel olarak izole edilmesi ya da saflastirilmasi.

8. istem 3 ya da istem 7'ye göre yöntem ya da istem 2”ye göre transjenik bitki olup, özelligi; sükroz esterlerinin bir ya da daha fazlasinin asagida gösterildigi sekilde yapiya sahip olmasi: burada R3'ün asetil ya da hidrojen, tercihen asetil olmasi; R1, R2 ve R4iten biri ya da daha fazlasinin 6 karbonu olan bir asil zinciri, tercihen betametilvaleril içermesi; ve R5'in bir asetil ya da hidrojen, tercihen hidrojen olmasidir.

9. Tütünün ya da bir tütün ürününün aromasini modüle etmeye yönelik bir yöntem olup, özelligi; asagidakileri içermesidir: (i) bir tütün ya da bir tütün ürününe, Istem 2'ye göre bir transjenik bitkiden ya da Istem 5`e göre bitki materyalinden bir bitki parçasinin, tercihen yapraklarinin eklenmesi.

10. Beta-metilvalerik asit üretmeye yönelik bir yöntem olup, özelligi; yöntemin asagidaki adimlari içermesidir: (i) Istem 2'ye göre bir transjenik bitkinin en azindan bir parçasinin, Istem 5'e göre bitki materyalinin ya da Istem 6'ya göre tütün ürününün saglanmasi; (ii) (i) adiminda saglanan materyalin ya da bunun bir ekstraktinin hidrolize edilmesi; ve (iii) beta-metilvalerik asidin opsiyonel olarak izole edilmesi ya da saflastirilmasi.